JP3468763B2 - 免疫反応測定用試薬および免疫反応測定法 - Google Patents

免疫反応測定用試薬および免疫反応測定法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、高感度で非特異反
応が少ない免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定用試薬
および免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定方法に関す
る。
【0002】
【従来の技術】各種生体成分から特定の被測定物質を検
出もしくは定量するために抗原抗体反応が利用されてい
る。例えば、試料中の抗原の測定に際し、該抗原に対応
する抗体をラテックスなどを担体として担持させ、その
免疫反応により生じた凝集の程度を検出することによ
り、試料中に含まれる抗原を検出あるいは定量する方法
がとられている。この凝集の程度を検出する方法として
は、凝集の有無を肉眼により目視観察し、判定する方法
と、反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定
する方法がある。
【0003】肉眼で判定する方法は、一般に不溶性担体
に担持された抗体と試料中の抗原との凝集の状態を肉眼
で判定し、試料中の抗原の有無の判定、あるいは半定量
分析として用いられている。光学的な測定方法は、試料
中の抗原の定量分析に用いられている。このほかに、抗
原抗体反応の検出を酵素反応を利用して発色として捕ら
える方法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法
(RIA)など各種方法が知られている。
【0004】上記各種の免疫反応の測定法において、測
定感度の向上あるいは、抗原抗体反応の促進を目的とし
て種々の添加剤が用いられている。例えば、特開昭59
−54968号公報には、赤血球凝集反応の促進剤とし
て、リン酸緩衝液に溶解したポリエチレングリコールを
使用する方法が開示されており、特公昭63−4506
6号公報には、リウマチ因子の測定において、凝集促進
剤としてポリエチレングリコールまたはポリビニルアル
コールを用いる方法が開示されており、さらに、特開平
2−173567号公報には、免疫反応測定に際し、反
応系にアルキル化多糖類を添加する方法が開示されてい
る。これらの添加剤は水溶性または親水性ポリマーであ
り、これらを加えることにより、疎水性相互作用により
進行する抗原抗体反応が促進される。例えば、上記のラ
テックスを担体として用いる方法では、抗原抗体反応が
促進された結果、ラテックス間の凝集反応が促進され
る。反応系に添加される水溶性または親水性ポリマーの
濃度は適宜決められる。例えば、ラテックス凝集反応を
用いる系では、反応時に水溶性または親水性ポリマーと
ラテックス懸濁液が混合されたときにラテックス溶液が
自己凝集を起こさない範囲で、上記水溶性または親水性
ポリマーの濃度が決定される。しかしこれらの添加剤を
加えることにより抗原抗体反応は促進されるが、担体自
身の非特異的凝集、および血液中のリウマチ因子のよう
な挾雑物質による抗原抗体反応以外の非特異反応もまた
促進されることがあり、測定系としてみた場合に、感度
が上昇しているとはいえない場合もある。さらに、ポリ
エチレングリコールの市販品は、290nm付近に吸収
を有する不純物を含有することが多い。そのため、使用
前に精製する必要があり、取り扱いが煩雑となる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の問題
点を解決するものであり、その目的とするところは、抗
原抗体反応以外の非特異反応が抑制され、かつ反応促進
効果の高い、免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定用試
薬および免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定方法を提
供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明の免疫測定用試薬
は、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
は抗原が担持されたポリスチレンビーズおよびポリビニ
ルピロリドンを含有し、そのことにより上記の目的が達
成される。
【0007】本発明の免疫測定法は、抗原または抗体で
ある被測定物質を該抗原または抗体に対する抗体または
抗原が担持されたポリスチレンビーズを用い、免疫反応
により測定する方法であって、該免疫反応の反応系にポ
リビニルピロリドンを存在させ、そのことにより上記の
目的が達成される。
【0008】本発明に用いられるポリビニルピロリドン
とは、N−ビニル−2−ピロリドンの重合体である。ポ
リビニルピロリドンの分子量は、1000以上2,00
0,000以下が適当である。分子量が大きすぎると水
に溶解させたときの粘度が高くなるため、取り扱いが困
難となる。水に溶解させたときの粘度が適当になるよう
にその他の促進剤と組み合わせて用いることも可能であ
る。
【0009】本発明により測定されるべき物質は特に限
定されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生
理活性物質はいずれも測定が可能である。被測定物質と
しては、タンパク、脂質などがあり、それには例えば、
各種抗原、レセプター、酵素などが挙げられる。具体的
には、C反応性タンパク(CRP)、繊維素分解産物
(FDP)、癌胎児性抗原(AFP)などの血液中タン
パク、B型肝炎ウイルス(HB)、C型肝炎ウイルス
(HC)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびこ
れらに対する抗体などの、感染症に関する抗原、抗体な
どが挙げられる。
【0010】本発明により被測定物質を測定する場合の
測定系としては、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫
測定法(RIA)などといったポリスチレンビーズを用
いた方法が利用され得る。例えば、酵素免疫測定法(E
IA)により、被測定物質を測定する場合には、被測定
物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
担持させたポリスチレンビーズを含有する溶液に、あら
かじめポリビニルピロリドンを添加しておくか、ポリビ
ニルピロリドンを含まないポリスチレンビーズ含有溶液
を使用し、免疫反応時にポリビニルピロリドンが該反応
系に存在するようにすればよい。より具体的には、検体
希釈液としてポリビニルピロリドンを添加しておく方
法;使用する試薬中にポリビニルピロリドンを加えてお
く方法などが挙げられる。反応時に含有されるポリビニ
ルピロリドンは、反応系に0.01〜5%(w/v)、
好ましくは、0.1〜3%(w/v)の割合で含まれる
ように調製を行う。本発明による測定では、反応の際の
pHは5〜10、特に、6〜8が好ましい。使用する緩
衝液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝
液、アンモニア緩衝液など、被測定物質を失活させるこ
となく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン
強度やpHを有するものであればよい。反応温度は0〜
50℃、特に20〜40℃が好ましい。
【0011】以下に実施例を挙げ本発明を説明する。
【0012】
【実施例】(実施例) 〔酵素免疫測定法によるB型肝炎表面抗原(HBs)抗
体の測定〕本実施例においては、次に挙げる試薬および
測定検体を使用した。後述の比較例においても特に指示
されない限り、同名の試薬については、同様のものを使
用した。
【0013】PBS(リン酸緩衝液):リン酸一ナトリ
ウム(2水和物)、リン酸二ナトリウム(2水和物)お
よび塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの
終濃度がそれぞれ0.02M、0.15M、pHが7.
2となるように精製水を加えて調製した。
【0014】1%BSA−PBS:PBSに試薬特級B
SA(ウシ血清アルブミン)を1%(w/v)となるよ
うに溶解させて調製した。
【0015】3%ポリエチレングリコール:1%BSA
−PBSにポリエチレングリコール6000(和光純薬
工業社製)を3%(w/v)となるように溶解させた。
【0016】3%デキストラン:1%BSA−PBSに
デキストラン(シグマ社製 平均分子量19500)を
3%(w/v)となるように溶解させた。
【0017】3%ポリビニルアルコール:1%BSA−
PBSにポリビニルアルコール(和光純薬工業社製 重
合度約500)を、3%(w/v)となるように、溶解
させた。
【0018】0.3%メチルセルロース(MC):1%
BSA−PBSにメチルセルロース(和光純薬工業社製
平均粘度400cps)を0.3%(w/v)となる
ように溶解させた。
【0019】1%ポリビニルピロリドン:1%BSA−
PBSにポリビニルピロリドン(BASF社製 コード
k−90 平均分子量1200000)を1%(w/
v)となるように溶解させた。
【0020】(I)HBs抗原担持ポリスチレンビーズ
の作製 1)HBs抗原液 ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラフィーにより
精製した精製HBs抗原を使用した。抗原はPBSに溶
解し、濃度をローリー法により測定した。
【0021】2)HBs陽性家兎血清 精製HBs抗原をフロイントのアジュバントとともに家
兎に免疫して得られた抗血清を正常ヒト血清を結合させ
たカラムで吸収操作をしてから用いた。
【0022】3)ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(ヤギ産生、生化
学工業製)を1%BSA−PBSで1000倍に希釈し
て使用した。
【0023】4)ペルオキシダーゼ基質 o−フェニレンジアミン(30mg錠剤、シグマ社製)1
錠を0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液(pH5.0)1
5mlで溶解し、さらに過酸化水素濃度0.03%(w/
v)となるように過酸化水素水を加え基質とした。基質
の調製は使用直前に行った。
【0024】5)HBs抗原のポリスチレンビーズへの
担持 PBSで1μg/mlに希釈したHBs抗原液10mlに、1/
4インチポリスチレンビーズ(積水化学工業(株)製)
50個を加え、攪拌後37℃で2時間インキュベートし
た。抗原溶液を吸引により除去し、20mlの生理食塩水
を加え、攪拌し洗浄した。3回洗浄後、1%BSA−P
BSを10ml加え、37℃で2時間インキュベートし、
ブロッキングを行った。次いで、1%BSA−PBSで
3回洗浄し、1%BSA−PBSを10ml加え、HBs
抗原担持ポリスチレンビーズを得た。
【0025】(II)HBs抗体の測定 第1抗体を含む検体として、100倍、200倍、およ
び400倍にそれぞれ希釈したHBs陽性血清100μ
l;対照として正常ウサギ血清100μl;および血清
自身の挾雑物質としてリウマチ因子(RF)1900単
位を含むRF陽性血清100μlのそれぞれを、1%ポ
リビニルピロリドン1000μl、および上記HBs抗
原担持ポリスチレンビーズ1個と試験管中で混合した。
これを37℃で60分間インキュベートした後、ビーズ
を1%BSA−PBS5mlで3回洗浄した。その後、第
2抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGを
1mlそれぞれに加え、37℃で1時間インキュベートし
た。ビーズを1%BSA−PBS5mlで3回洗浄し、試
験管にペルオキシダーゼ基質を1ml加え、室温で15分
間インキュベートした。これに1N硫酸を1ml加え、酵
素反応を停止させた。基質ブランクとして、第1抗体
(または正常血清またはRF陽性血清)、および第2抗
体のいずれをも加えない試験管を用意し、ペルオキシダ
ーゼ基質を1ml加え、室温で15分間インキュベート
し、次いで、1N硫酸1mlを加え酵素反応を停止させた
試験管を用意した。この基質ブランクを対照として分光
光度計で492nmの吸光度を測定した。その結果を表1
に示す。後述の比較例の結果も合わせて表1に示す。表
1中の数字は、吸光度を10000倍した値である。
【0026】(比較例)1%ポリビニルピロリドンの代
わりに1%BSA−PBS、3%ポリエチレングリコー
ル、3%デキストラン、3%ポリビニルアルコールおよ
び0.3%メチルセルロースをそれぞれ用いたこと以外
は、実施例と同様に行った。
【0027】
【表1】
【0028】表1より、デキストラン、ポリビニルアル
コールおよびメチルセルロースでは反応感度の上昇が少
なく、ポリエチレングリコールでは、HBsに対する反
応性は上昇しているが、血清中の挾雑物質であるRFに
対しても非特異的反応を起こしており、実質的に感度が
上昇していない。これに対し、本発明のEIA試薬を用
いると、挾雑物質との間の反応は起こっていないのに対
し、HBsとの反応性は上昇しており、特異的に感度が
上昇している。
【0029】
【発明の効果】本発明によれば、このように免疫学的凝
集反応を除く免疫反応を利用した被測定物質の測定にお
いて、非特異反応が抑制され、かつ、高感度に被測定物
質が測定され得る。本発明は、酵素免疫測定法(EI
A)、放射免疫測定法(RIA)などに、利用が可能で
ある。

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定用
    試薬であって、被測定物質である抗原または抗体に対す
    る抗体または抗原が担持されたポリスチレンビーズおよ
    びポリビニルピロリドンを含有する免疫反応測定用試
    薬。
  2. 【請求項2】 免疫学的凝集反応を除く免疫反応測定法
    であって、抗原または抗体である被測定物質を該抗原ま
    たは抗体に対する抗体または抗原が担持されたポリスチ
    レンビーズを用い、免疫反応により測定する方法であっ
    て、該免疫反応の反応系にポリビニルピロリドンを存在
    させることを包含する、免疫反応測定法。
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