JP2004177493A - 共焦点顕微鏡およびディスク - Google Patents
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Abstract
【課題】取り扱いが簡単で、しかも良好な共焦点像や非共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡およびディスクを提供する。
【解決手段】光を透過する透過部５ａと光を遮光する遮光部５ｂをそれぞれ有するディスク５を光路上で回転させ、ディスク５を透過した光を試料に対して走査するとともに、試料からの光をディスク５を透過させて像として取得する共焦点顕微鏡に用いられるもので、遮光部５ｂは、特定の波長域の光を透過するフィルタ材料で構成される。
【選択図】 図２
【解決手段】光を透過する透過部５ａと光を遮光する遮光部５ｂをそれぞれ有するディスク５を光路上で回転させ、ディスク５を透過した光を試料に対して走査するとともに、試料からの光をディスク５を透過させて像として取得する共焦点顕微鏡に用いられるもので、遮光部５ｂは、特定の波長域の光を透過するフィルタ材料で構成される。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点法のセクショニング効果を利用して観察画像を取得する共焦点顕微鏡およびこの共焦点顕微鏡に用いられるディスクに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、回転ディスクを用いた共焦点法のセクショニング効果を利用することで、リアルタイムで高い解像度の観察像を得ることが可能なディスク回転型の共焦点顕微鏡が実用化されている。
【０００３】
この種の共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡の光路中に、ピンホール等の光通過部を設けた回転ディスクを挿入して回転させるもので、ピントのずれた面の画像を除去し、ピントのあった面の画像のみを抽出することにより、非常に高いコントラストを持つ共焦点像を取得できるようになっている。
【０００４】
一方、このような共焦点顕微鏡は、その性質上、高倍率観察時でさらに強調された像を得ることを目的として用いられる傾向にあり、この場合、像観察の前に、試料の位置合わせやピント合わせを必ず行なう必要がある。
【０００５】
しかし、共焦点顕微鏡は、共焦点像として、ピントのあった面の像のみしか抽出しないため、このままでは試料の位置合わせやピント合わせを行うのが非常に難しくなる。また、モニタを使用して像観察を可能にしたものは、一般に撮像手段としてＣＣＤカメラが用いられる。しかし、ＣＣＤカメラは、目視と比べてコントラストがよいため、ＣＣＤカメラを用いて共焦点観察をした場合、目視観察の場合に比べてピントの合った位置のさらに近傍まで動かさないと、モニタ上の像が暗いままであり、ピント合わせの作業がさらに難しくなってしまう。
【０００６】
そこで、特許文献１に開示されるように試料からの反射光をハーフミラーで２分し、このうち透過光を共焦点光路側のディスク上で結像させ、ピンホールを通った光をＣＣＤカメラで撮影すると共に、反射光を非共焦点光路側のリレーレンズを介して再結像させて他のＣＣＤカメラで撮影し、これら２台のカメラで撮影した観察像を１つのモニタ上に同時に表示させることで、ピント合わせやパターン認識を容易にできるようにしたものが考えられている。
【０００７】
ところが、特許文献１に開示されるものは、ディスクより試料側の光路にハーフミラーが設けられ、このハーフミラーにより試料からの反射光が共焦点光路と非共焦点光路に分岐されるため、ディスク面に結像される光量は小さくなってしまう。このため、それでなくとも明るい像の取得が難しいとされる回転ディスクを用いた共焦点像は、ますます暗いものなってしまうという問題を生じる。
【０００８】
また、非共焦点光路をディスクより試料側で分岐させるようになっているため、事前にハーフミラーと非共焦点光路を組み込んだ専用の共焦点顕微鏡が必要となり、このため一般的な共焦点顕微鏡を所持している場合は、後付けの装置により上述した非共焦点光路を付加するようなことは困難であった。
【０００９】
一方、従来、試料の位置合わせやピント合わせを行う場合、光路中から回転ディスクを退避させることにより、回転ディスクを透過しない非共焦点像を取得できるようにしたものも考えられている。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１１−４０６２９号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、非共焦点像を取得する度に回転ディスクを光路から退避させるのでは、このための操作が非常に煩わしく、使いづらいという問題を生じる。
【００１２】
一方、最近になって遺伝子研究の遺伝子分析などに、共焦点顕微鏡による蛍光観察が用いられるようになっている。このような蛍光観察を行う場合、さまざまな波長の光が用いられるが、これら波長の異なる光を使用した場合、ディスク上のエアリディスク直径が大きくなる。このため、それぞれの波長の光に対して共焦点効果を最大限確保しようとすると、ディスクのピンホール径あるいは光を通過する部分のスリット幅を、それぞれの波長に応じて異ならす必要があり、従来では、使用する光の波長に応じて、ピンホール径あるいは光を通過する部分のスリット幅の異なる最適なディスクに交換して対応するようにしている。
【００１３】
このような場合も、蛍光観察に使用する光の波長に応じて、その都度、最適なディスクに交換するのでは、このための作業が非常に煩わしく、使いづらいばかりか、ディスク交換の際に、機内にほこりやゴミなどが進入して観察像の劣化を招くという問題も生じる。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、取り扱いが簡単で、しかも良好な共焦点像や非共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡およびディスクを提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、光を透過する透過部と光を遮光する遮光部をそれぞれ有するディスクを光路上で回転させ、前記ディスクを透過した光を試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡に用いられるディスクにおいて、前記遮光部は、特定の波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴としている。
【００１６】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記透過部および遮光部は、それぞれ直線状をなし、これら直線状の透過部および遮光部が交互に並べられ縞状に形成されることを特徴としている。
【００１７】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記縞状に形成された透過部および遮光部は、複数のディスク片にそれぞれ形成されるとともに、これらディスク片を重ね合わせてなり、それぞれのディスク片の遮光部は、異なる特定波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴としている。
【００１８】
請求項４記載の発明は、請求項１または２記載のディスクを光路上で回転させ、光源からの光を前記ディスクを透過させて試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡であって、前記ディスクを透過した光路上に配置され、前記試料からの光のうち前記ディスクの前記透過部および遮光部を透過する波長域の光と前記透過部のみを透過する波長域の光を、それぞれ異なる光路に分離する光路分離手段と、前記光路分離手段で分離された光の像を同時に表示する表示手段とを具備したことを特徴としている。
【００１９】
請求項５記載の発明は、請求項３記載のディスクを光路上で回転させ、励起フィルタを通った特定波長の励起光を前記ディスクを透過させて試料に対し走査するとともに、試料より発せられる蛍光を前記ディスクを透過させ、前記蛍光の波長を選択する吸収フィルタを介して像として取得する共焦点顕微鏡であって、少なくとも前記励起フィルタおよび吸収フィルタを備えたユニットを複数個有するとともに、これらユニットを光路上で切換え、前記ディスクを構成する一方のディスク片の透過部および遮光部を透過し、他方のディスク片の透過部のみ透過するような波長域の光を選択することにより、各種の励起法の観察を可能にしたことを特徴としている。
【００２０】
この結果、本発明によれば、特定の波長域の光に対しては透過部と遮光部とも光を透過して共焦点効果に影響を及ぼさず、他の波長域の光に対しては透過部のみに光を透過し共焦点効果を得られるディスクを提供できる。
【００２１】
また、本発明によれば、ディスクを透過した光路上に、ディスクの透過部および遮光部を透過する波長域の光と、透過部のみを透過する波長域の光を分離する光路分離手段が設けられることで、既設の共焦点顕微鏡にに対して後付けで光路分離手段を有する装置を取り付けることができる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、励起法によって使用する光の波長域が異なっても、ディスクを交換することなく、最適な共焦点観察を行うことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２４】
図１は、本発明の第１の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は光源で、この光源１から出射した照明光の光路上には、コレクタレンズ２とビームスプリッタ３が配置されている。コレクタレンズ２は、光源１からの光を平行光に変換するものである。ビームスプリッタ３は、コレクタレンズ２で平行光になった光を９０度曲げるようにしている。
【００２５】
ビームスプリッタ３で９０度曲げられた反射光路には、ディスク５および結像レンズ６が配置されている。
【００２６】
ディスク５は、走査手段を構成する回転手段としてモータ４の回転軸に連結され、一定の回転速度で回転されるようになっている。
【００２７】
ディスク５は、図２（ａ）（ａ）に示すように、光が透過する直線状の透過部５ａと特定波長の光以外を反射（遮光）する直線状の遮光部５ｂが交互に並べられ縞状に形成されている。この場合、ディスク５は、ガラスなどの基板上前面に、例えばフィルタ材料を蒸着し、この状態で、電子ビームなどを用いて透過部５ａに相当する部分のフィルタ材料を除去して、遮光部５ｂのみを残すようにして形成される。ここでのフィルタ材料からなる遮光部５ｂは、例えば６００ｎｍ以上の光を透過し、それ以下、つまり６００ｎｍ以下の光は反射（遮光）する特性のものが用いられている。
【００２８】
図１に戻って、光源１、コレクタレンズ２、ビームスプリッタ３、ディスク５および結像レンズ６は、共焦点観察ユニットＡとして一体に構成されている。
【００２９】
ディスク５および結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し試料８を照射する。また、試料８から戻った光は、対物レンズ７を通って平行光となり結像レンズ６を通ってディスク５上で結像する。ディスク５から出た光は、ビームスプリッタ３を直進する。
【００３０】
ビームスプリッタ３の直進光路には、結像レンズ９および光路分離手段としてダイクロイックミラー１０が配置されている。ダイクロイックミラー１０は、例えば６００ｎｍ以上の波長の光を透過し、それ以下の波長の光を９０度曲げる（反射）するようになっている。
【００３１】
この場合、結像レンズ９およびダイクロイックミラー１０は、鏡筒Ｂとして一体に構成され、上述した共焦点観察ユニットＡに対して後付けにより、取り付けることができるようになっている。
【００３２】
ビームスプリッタ３を直進し、結像レンズ９を介してダイクロイックミラー１０に入射した光は、６００ｎｍ以上の波長の光については、透過し、撮像素子１１の撮像面に結像し、非共焦点像として撮像され、また、６００ｎｍ以下の波長の光については、反射し、撮像素子１２の撮像面で結像し、共焦点像として撮像される。
【００３３】
これら撮像素子１１および１２は、撮像した画像を電気信号に変換して出力するようになっている。
【００３４】
撮像素子１１および１２には、合成機１４が接続されている。この合成機１４は、撮像素子１１および１２より出力される電気信号を合成するものである。
【００３５】
合成機１４には、表示手段としてモニタ１３が接続されている。このモニタ１３は、左右２つの表示画面１３ａ、１３ｂを並べて有するもので、合成機１４で合成された電気信号により、表示画面１３ａに撮像素子１１で撮像された非共焦点画像、表示画面１３ｂに撮像素子１２で撮像された共焦点画像をそれぞれ表示するようになっている。
【００３６】
次に、以上のように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００３７】
光源１から照明光が出射すると、この照明光は、コレクタレンズ２を通って平行光となり、ビームスプリッタ３に入射する。そして、ビームスプリッタ３により９０度曲げられた光は、モータ４により回転しているディスク５に入射する。
【００３８】
この場合、ディスク５において、光源１からの照明光のうち、６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過する。
【００３９】
ディスク５を透過した光は、結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し試料８を照射する。
【００４０】
また、試料８から戻った光は対物レンズ７を通って平行光となり、結像レンズ６を通ってディスク５上で結像する。
【００４１】
この場合も、ディスク５に入射した光のうち、６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過する。
【００４２】
そして、ディスク５から出た光は、ビームスプリッタ３を直進し、結像レンズ９に入射する。また、結像レンズ９を通った光は、ダイクロイックミラー１０に入射する。
【００４３】
この場合、ダイクロイックミラー１０に入射した光のうち、６００ｎｍ以上の波長の光は、そのまま透過し、撮像素子１１で非共焦点像として撮像され、合成機１４を通ってモニタ１３の右側の表示画面１３ａに非共焦点画像として表示される。また、６００ｎｍ以下の波長の光については、９０度曲げられて、撮像素子１２で共焦点像として撮像され、合成機１４を通ってモニタ１３の左側の表示画面１３ｂに共焦点画像として表示される。
【００４４】
従って、このようにすれば、ディスク５として、光が透過する透過部５ａと特定波長の光以外を反射（遮光）する遮光部５ｂを有するものを用い、特定の光の波長域について、例えば６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過するように設定することにより、ディスク５を光路上に配した状態のまま、共焦点像および非共焦点像を同時に取得することができる。これにより、従来の非共焦点像を取得する度に回転ディスクを光路から退避させるものと比べ、このための作業を簡素化でき、取り扱いやすい共焦点顕微鏡を実現できる。
【００４５】
また、ディスク５から出た光を、鏡筒Ｂを構成するダイクロイックミラー１０により波長域ごとに分離し、共焦点像および非共焦点像として、それぞれモニタ１３に表示するようにしたので、従来のディスクより試料側の光路にハーフミラーを設け、このハーフミラーにより試料からの反射光を共焦点光路と非共焦点光路に分岐するものと比べ、ディスク５面に結像される光量を大きいまま確保できるので、明るく良好な共焦点像を取得することができる。
【００４６】
さらに、ディスク５から出た光を共焦点像と非共焦点像に分離するダイクロイックミラー１０を有する鏡筒Ｂは、ディスク５と撮像素子１１，１２との間の光路に配置されるため、常設される共焦点観察ユニットＡに対して後付けで鏡筒Ｂを取り付けることができる。このことは、従来から共焦点顕微鏡を所持している場合、新たに専用の共焦点顕微鏡を購入することなく、後付けで非共焦点像を取得するための機能を簡単に付加することができる。
【００４７】
なお、上述した第１の実施の形態のディスク５において、遮光部５ｂで光を透過する波長を例えば７００ｎｍ以下、それ以上の光を遮光とし、ダイクロイックミラー１０も、例えば７００ｎｍ以下の光を反射、７００ｎｍ以上の光を透過とすれば、モニタ１３の右側の表示画面１３ａに赤外光の共焦点像を表示し、モニタ１３の左側の表示画面１３ｂに可視光の非共焦点像を同時に表示することができる共焦点顕微鏡を提供できる。
【００４８】
また、ディスク５の遮光部５ｂで光を透過する波長を例えば４００ｎｍ以上、それ以下の光を遮光とし、ダイクロイックミラー１０も、例えば４００ｎｍ以下の光を反射、４００ｎｍ以上の光を透過とすれば、モニタ１３の右側の表示画面１３ａに可視光の非共焦点像を表示し、モニタ１３の左側の表示画面１３ｂに紫外光の共焦点像を同時に表示することができる共焦点顕微鏡を提供できる。
【００４９】
さらに、上述した第１の実施の形態では、ダイクロイックミラー１０を用いたが、ハーフミラーを用いて、結像レンズ９を透過した光を２分割し、それぞれの光路中に然るべき波長を透過するようなハイパスフィルタ、ローパスフィルタを配置するようにしても、同様な効果を期待できる。
【００５０】
さらに、上述した第１の実施の形態に用いられる対物レンズ７は、どのような対物レンズを使用してもよいが、軸上の色収差を除去した対物レンズを使用することが望ましい。
【００５１】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５２】
第１の実施の形態では、共焦点観察と非共焦点観察をディスクを交換することなく実現できる例を述べたが、この第２の実施では、励起法の異なる共焦点蛍光観察をディスクを交換することなく実現できるようにしたものである。
【００５３】
図３は、本発明の第２の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示している。図において、２１は光源で、この光源２１から出射した照明光の光路上には、コレクタレンズ２２、ターレット２３が配置されている。
【００５４】
コレクタレンズ２２は、光源２１からの光を平行光に変換するものである。ターレット２３は、回転体２３ａに複数のキューブ２４、２５、２６を保持したもので、回転体２３ａを各種励起法の観察に応じて回転操作することにより、キューブ２４、２５、２６を選択的に光軸上に配置できるようになっている。この場合、Ｕ励起法の観察では、キューブ２４が光軸上に配置され、Ｂ励起法の観察では、キューブ２５が光軸上に配置され、Ｇ励起法の観察では、キューブ２６が光軸上に配置されるようになっている。図示例では、Ｕ励起法の観察に用いられるキューブ２４が光軸上に配置されている。
【００５５】
キューブ２４は、励起フィルタ２４１、ダイクロイックミラー２４２、吸収フィルタ２４３をユニットとして構成したものである。
【００５６】
そして、コレクタレンズ２２を通って平行光となった照明光は、キューブ２４の励起フィルタ２４１に入射する。
【００５７】
ここで、励起フィルタ２４１には、図６（ａ）に示すように３６５ｎｍ付近の波長の光のみを透過するものが用いられる。また、ダイクロイックミラー２４２は、同図（ｂ）に示すように３６５ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。
【００５８】
励起フィルタ２４１を通った光は、ダイクロイックミラー２４２により９０度曲げられる。
【００５９】
ダイクロイックミラー２４２で９０度曲げられた反射光路には、ディスク２８および結像レンズ２９が配置されている。
【００６０】
ディスク２８は、走査手段を構成する回転手段としてモータ２７の回転軸に連結され、一定の回転速度で回転されるようになっている。
【００６１】
ディスク２８は、図４に示すように２枚のディスク片２８１、２８２から構成されている。これらディスク片２８１、２８２は、図５（ａ）（ｂ）に示すように、光を透過する直線状の透過部２８１ａ（２８２ａ）と特定波長の光以外を反射（遮光）する直線状の遮光部２８１ｂ（２８２ｂ）が交互に並べられ縞状に形成されている。この場合、ディスク片２８１は、透過部２８１ａの幅寸法が、例えば１５μｍ、遮光部２８１ｂの幅寸法が、例えば３００μｍからなり、このうち遮光部２８１ｂは、４５０ｎｍ以下の波長の光のみを透過するフィルタ材料で構成されている。また、ディスク片２８２は、透過部２８２ａの幅寸法が、例えば１０μｍ、遮光部２８２ｂの幅寸法が、例えば２００μｍからなり、このうち遮光部２８２ｂは、４５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過するフィルタ材料で構成されている。
【００６２】
そして、これらディスク片２８１、２８２は、それぞれの透過部２８１ａ（２８２ａ）および遮光部２８１ｂ（２８２ｂ）を設けた面同士を合わせた状態で重ねて接合されている。
【００６３】
図３に戻って、ディスク２８および結像レンズ２９を通った光は、対物レンズ３０の瞳上で結像し、励起光として試料３１を照射する。この場合、試料３１は、このときの励起光で励起される蛍光染料が付されている。
【００６４】
試料３１から発せられた蛍光は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。ディスク２８から出た光は、キューブ２４内のダイクロイックミラー２４２を直進して吸収フィルタ２４３に入射する。
【００６５】
吸収フィルタ２４３は、図６（ｃ）に示すように４２０ｎｍ以上の波長の光を透過するものが用いられる。
【００６６】
吸収フィルタ２４３の透過光路には、結像レンズ３２と対物レンズ３３が配置されている。結像レンズ３２を透過した光は、対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察を可能にしている。
【００６７】
なお、ターレット２３に保持されるキューブ２４以外のＢ励起法の観察に用いられるキューブ２５についても、励起フィルタ２５１、ダイクロイックミラー２５２、吸収フィルタ２５３をユニットとして構成している。ここで、励起フィルタ２５１は、図７（ａ）に示すように４８０ｎｍ付近の波長の光のみ透過するものが用いられる。ダイクロイックミラー２５２は、同図（ｂ）に示すように４８０ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。吸収フィルタ２５３は、同図（ｃ）に示すように５１５ｎｍ以上の波長の光のみを透過するものが用いられる。
【００６８】
また、Ｇ励起法の観察に用いられるキューブ２６についても同様で、励起フィルタ２６１、ダイクロイックミラー２６２、吸収フィルタ２６３をユニットとして構成している。ここで、励起フィルタ２６１には、図８（ａ）に示すように５５０ｎｍ付近の波長の光のみ透過するものが用いられる。ダイクロイックミラー２６２は、同図（ｂ）に示すように５５０ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。吸収フィルタ２６３は、同図（ｃ）に示すように５９０ｎｍ以上の波長の光のみを透過するものが用いられる。
【００６９】
次に、以上のように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００７０】
まず、Ｕ励起法の観察を行う場合は、ターレット２３を回転させてキューブ２４を光軸上に位置させる。
【００７１】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２４の励起フィルタ２４１に入射する。励起フィルタ２４１では、３６５ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２４２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００７２】
この場合、ディスク２８に入射した３６５ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａと遮光部２８１ｂとも透過し、ディスク片２８２では、透過部２８２ａを透過するが、遮光部２８２ｂで遮光される。
【００７３】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００７４】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約４３０ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００７５】
ディスク２８に入射した約４３０ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａを透過するが、遮光部２８２ｂで遮光され、ディスク片２８１では、透過部２８１ａと遮光部２８１ｂとも透過される。
【００７６】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２４内のダイクロイックミラー２４２を直進し、吸収フィルタ２４３に入射する。
【００７７】
吸収フィルタ２４３では、４２０ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００７８】
次に、Ｂ励起法で観察する場合は、ターレット２３を回転させてキューブ２５を光軸上に位置させる。
【００７９】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２５の励起フィルタ２５１に入射する。励起フィルタ２５１では、４８０ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２５２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００８０】
この場合、ディスク２８に入射した４８０ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光され、ディスク片２８２では透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過する。
【００８１】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００８２】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約５２５ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００８３】
ディスク２８に入射した約５２５ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過するが、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光される。
【００８４】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２５内のダイクロイックミラー２５２を直進し、吸収フィルタ２５３に入射する。
【００８５】
吸収フィルタ２５３では、５１５ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００８６】
次に、Ｇ励起法で観察する場合、ターレット２３をさらに回転させ、キューブ２６を光軸上に位置させる。
【００８７】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２６の励起フィルタ２６１に入射する。励起フィルタ２６１では、５５０ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２６２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００８８】
この場合、ディスク２８に入射した５５０ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光され、ディスク片２８２では透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過する。
【００８９】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００９０】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約６００ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００９１】
ディスク２８に入射した約６００ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過するが、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光される。
【００９２】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２６内のダイクロイックミラー２６２を直進し、吸収フィルタ２６３に入射する。
【００９３】
吸収フィルタ２６３では、５９０ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００９４】
ちなみに、例えば、対物レンズ３０として倍率６０×、ＮＡ１．４を使用した場合、ディスク片２８１の透過部２８１ａの幅１５μｍと、下式で示されるディスク面上のエアリディスク径Ｄ
Ｄ＝１．２２×λ／ＮＡ×対物レンズの倍率（ただし、λ：光の波長、ＮＡ：対物レンズのＮＡ）
の比は、表１で表わすことができる。
【００９５】
【表１】
【００９６】
また、ディスク片２８２の透過部２８２ａの幅１０μｍと、エアリディスク径Ｄの比は、表２で表わすことができる。
【００９７】
【表２】
【００９８】
一般に、透過部と反射部を縞状に形成したスリットパターンのディスクを用いた場合、透過部の幅とエアリディスク径の比が４０〜６０％の範囲の時、良好な共焦点像の観察ができるとされているが、表１から明らかなように、Ｕ励起の場合、透過部の幅が１０μｍであると、透過部の幅とエアリディスク径の比が６０％以上にもなり、良好な共焦点像が得られない。また、Ｂ励起、Ｇ励起の場合も、透過部の幅が１５μｍであると、透過部の幅とエアリディスク径の比が４０％以下となって、この場合も良好な共焦点像が得られない。
【００９９】
このことについて、上述した第２の実施の形態によれば、Ｕ励起法の場合は、ディスク片２８２の幅１０μｍの透過部２８２ａにより共焦点効果を出しており、この場合は、幅１５μｍの透過部２８１ａを有するディスク片２８１は、共焦点効果において何の効果も及ぼさないようにし、また、Ｂ励起法、Ｇ励起法の場合は、ディスク片２８１の幅１５μｍの透過部２８１ａで共焦点効果を出しており、この場合は、幅１０μｍの透過部２８２ａを有するディスク片２８２は、共焦点効果において何の効果も及ぼさないようにしたので、これらＵ励起を始め、Ｂ励起法、Ｇ励起法の観察の場合でも、その都度ディスク２８を交換するような必要がなくなり、取り扱いやすく、しかも、常に良好な共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡を実現できる。
【０１００】
なお、上述した第２の実施の形態では、ディスク２８として、異なるフィルタ材料を用い異なるパターンを形成した２枚のディスク片２８１、２８２を重ねるように構成したが、これに代えて、１枚のディスクに異なるフィルタ材料を重ねてパターンを形成するようにしたものでもよいし、１枚のディスクの表裏面にそれぞれ異なるフィルタ材料でパターンを形成するようにしてもよい。この場合、上述した実施の形態では、ＵＢＧの３種類の励起法に対応できるものについて述べたが、上述したように異なるフィルタ材料で形成されるパターンの層数を増やしていけば、対応できる励起法を３種類以上にできることは勿論である。
【０１０１】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態および第２の実施の形態では、ディスクに透過部、遮光部が縞上に形成されたものを用いたが、透過部分がピンホール状の形状をしたディスクを使用してもよい。
【０１０２】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１０３】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、取り扱いが簡単で、しかも良好な共焦点像や非共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡およびディスクを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられるディスクの詳細を説明する図。
【図３】本発明の第２の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図４】第２の実施の形態に用いられるディスクの概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態に用いられるディスクの詳細を説明する図。
【図６】第２の実施の形態のＵ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【図７】第２の実施の形態のＢ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【図８】第２の実施の形態のＧ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【符号の説明】
１…光源
２…コレクタレンズ
３…ビームスプリッタ
４…モータ
５…ディスク
５ａ…透過部
５ｂ…遮光部
６…結像レンズ
７…対物レンズ
８…試料
９…結像レンズ
１０…ダイクロイックミラー
１１…撮像素子
１１．１２…撮像素子
１３…モニタ
１３ａ．１３ｂ…表示画面
１４…合成機
２１…光源
２２…コレクタレンズ
２３…ターレット
２３ａ…回転体
２４、２５、２６…キューブ
２４１、２５１、２６１…励起フィルタ
２４２、２５２、２６２…ダイクロイックミラー
２４３、２５３、２６３…吸収フィルタ
２７…モータ
２８…ディスク
２８１、２８２…ディスク片
２８１ａ…透過部
２８１ｂ…遮光部
２８２ａ…透過部
２８２ｂ…遮光部
２９、３２…結像レンズ
３０、３３…対物レンズ
３１…試料
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点法のセクショニング効果を利用して観察画像を取得する共焦点顕微鏡およびこの共焦点顕微鏡に用いられるディスクに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、回転ディスクを用いた共焦点法のセクショニング効果を利用することで、リアルタイムで高い解像度の観察像を得ることが可能なディスク回転型の共焦点顕微鏡が実用化されている。
【０００３】
この種の共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡の光路中に、ピンホール等の光通過部を設けた回転ディスクを挿入して回転させるもので、ピントのずれた面の画像を除去し、ピントのあった面の画像のみを抽出することにより、非常に高いコントラストを持つ共焦点像を取得できるようになっている。
【０００４】
一方、このような共焦点顕微鏡は、その性質上、高倍率観察時でさらに強調された像を得ることを目的として用いられる傾向にあり、この場合、像観察の前に、試料の位置合わせやピント合わせを必ず行なう必要がある。
【０００５】
しかし、共焦点顕微鏡は、共焦点像として、ピントのあった面の像のみしか抽出しないため、このままでは試料の位置合わせやピント合わせを行うのが非常に難しくなる。また、モニタを使用して像観察を可能にしたものは、一般に撮像手段としてＣＣＤカメラが用いられる。しかし、ＣＣＤカメラは、目視と比べてコントラストがよいため、ＣＣＤカメラを用いて共焦点観察をした場合、目視観察の場合に比べてピントの合った位置のさらに近傍まで動かさないと、モニタ上の像が暗いままであり、ピント合わせの作業がさらに難しくなってしまう。
【０００６】
そこで、特許文献１に開示されるように試料からの反射光をハーフミラーで２分し、このうち透過光を共焦点光路側のディスク上で結像させ、ピンホールを通った光をＣＣＤカメラで撮影すると共に、反射光を非共焦点光路側のリレーレンズを介して再結像させて他のＣＣＤカメラで撮影し、これら２台のカメラで撮影した観察像を１つのモニタ上に同時に表示させることで、ピント合わせやパターン認識を容易にできるようにしたものが考えられている。
【０００７】
ところが、特許文献１に開示されるものは、ディスクより試料側の光路にハーフミラーが設けられ、このハーフミラーにより試料からの反射光が共焦点光路と非共焦点光路に分岐されるため、ディスク面に結像される光量は小さくなってしまう。このため、それでなくとも明るい像の取得が難しいとされる回転ディスクを用いた共焦点像は、ますます暗いものなってしまうという問題を生じる。
【０００８】
また、非共焦点光路をディスクより試料側で分岐させるようになっているため、事前にハーフミラーと非共焦点光路を組み込んだ専用の共焦点顕微鏡が必要となり、このため一般的な共焦点顕微鏡を所持している場合は、後付けの装置により上述した非共焦点光路を付加するようなことは困難であった。
【０００９】
一方、従来、試料の位置合わせやピント合わせを行う場合、光路中から回転ディスクを退避させることにより、回転ディスクを透過しない非共焦点像を取得できるようにしたものも考えられている。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１１−４０６２９号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、非共焦点像を取得する度に回転ディスクを光路から退避させるのでは、このための操作が非常に煩わしく、使いづらいという問題を生じる。
【００１２】
一方、最近になって遺伝子研究の遺伝子分析などに、共焦点顕微鏡による蛍光観察が用いられるようになっている。このような蛍光観察を行う場合、さまざまな波長の光が用いられるが、これら波長の異なる光を使用した場合、ディスク上のエアリディスク直径が大きくなる。このため、それぞれの波長の光に対して共焦点効果を最大限確保しようとすると、ディスクのピンホール径あるいは光を通過する部分のスリット幅を、それぞれの波長に応じて異ならす必要があり、従来では、使用する光の波長に応じて、ピンホール径あるいは光を通過する部分のスリット幅の異なる最適なディスクに交換して対応するようにしている。
【００１３】
このような場合も、蛍光観察に使用する光の波長に応じて、その都度、最適なディスクに交換するのでは、このための作業が非常に煩わしく、使いづらいばかりか、ディスク交換の際に、機内にほこりやゴミなどが進入して観察像の劣化を招くという問題も生じる。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、取り扱いが簡単で、しかも良好な共焦点像や非共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡およびディスクを提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、光を透過する透過部と光を遮光する遮光部をそれぞれ有するディスクを光路上で回転させ、前記ディスクを透過した光を試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡に用いられるディスクにおいて、前記遮光部は、特定の波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴としている。
【００１６】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記透過部および遮光部は、それぞれ直線状をなし、これら直線状の透過部および遮光部が交互に並べられ縞状に形成されることを特徴としている。
【００１７】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記縞状に形成された透過部および遮光部は、複数のディスク片にそれぞれ形成されるとともに、これらディスク片を重ね合わせてなり、それぞれのディスク片の遮光部は、異なる特定波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴としている。
【００１８】
請求項４記載の発明は、請求項１または２記載のディスクを光路上で回転させ、光源からの光を前記ディスクを透過させて試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡であって、前記ディスクを透過した光路上に配置され、前記試料からの光のうち前記ディスクの前記透過部および遮光部を透過する波長域の光と前記透過部のみを透過する波長域の光を、それぞれ異なる光路に分離する光路分離手段と、前記光路分離手段で分離された光の像を同時に表示する表示手段とを具備したことを特徴としている。
【００１９】
請求項５記載の発明は、請求項３記載のディスクを光路上で回転させ、励起フィルタを通った特定波長の励起光を前記ディスクを透過させて試料に対し走査するとともに、試料より発せられる蛍光を前記ディスクを透過させ、前記蛍光の波長を選択する吸収フィルタを介して像として取得する共焦点顕微鏡であって、少なくとも前記励起フィルタおよび吸収フィルタを備えたユニットを複数個有するとともに、これらユニットを光路上で切換え、前記ディスクを構成する一方のディスク片の透過部および遮光部を透過し、他方のディスク片の透過部のみ透過するような波長域の光を選択することにより、各種の励起法の観察を可能にしたことを特徴としている。
【００２０】
この結果、本発明によれば、特定の波長域の光に対しては透過部と遮光部とも光を透過して共焦点効果に影響を及ぼさず、他の波長域の光に対しては透過部のみに光を透過し共焦点効果を得られるディスクを提供できる。
【００２１】
また、本発明によれば、ディスクを透過した光路上に、ディスクの透過部および遮光部を透過する波長域の光と、透過部のみを透過する波長域の光を分離する光路分離手段が設けられることで、既設の共焦点顕微鏡にに対して後付けで光路分離手段を有する装置を取り付けることができる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、励起法によって使用する光の波長域が異なっても、ディスクを交換することなく、最適な共焦点観察を行うことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２４】
図１は、本発明の第１の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は光源で、この光源１から出射した照明光の光路上には、コレクタレンズ２とビームスプリッタ３が配置されている。コレクタレンズ２は、光源１からの光を平行光に変換するものである。ビームスプリッタ３は、コレクタレンズ２で平行光になった光を９０度曲げるようにしている。
【００２５】
ビームスプリッタ３で９０度曲げられた反射光路には、ディスク５および結像レンズ６が配置されている。
【００２６】
ディスク５は、走査手段を構成する回転手段としてモータ４の回転軸に連結され、一定の回転速度で回転されるようになっている。
【００２７】
ディスク５は、図２（ａ）（ａ）に示すように、光が透過する直線状の透過部５ａと特定波長の光以外を反射（遮光）する直線状の遮光部５ｂが交互に並べられ縞状に形成されている。この場合、ディスク５は、ガラスなどの基板上前面に、例えばフィルタ材料を蒸着し、この状態で、電子ビームなどを用いて透過部５ａに相当する部分のフィルタ材料を除去して、遮光部５ｂのみを残すようにして形成される。ここでのフィルタ材料からなる遮光部５ｂは、例えば６００ｎｍ以上の光を透過し、それ以下、つまり６００ｎｍ以下の光は反射（遮光）する特性のものが用いられている。
【００２８】
図１に戻って、光源１、コレクタレンズ２、ビームスプリッタ３、ディスク５および結像レンズ６は、共焦点観察ユニットＡとして一体に構成されている。
【００２９】
ディスク５および結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し試料８を照射する。また、試料８から戻った光は、対物レンズ７を通って平行光となり結像レンズ６を通ってディスク５上で結像する。ディスク５から出た光は、ビームスプリッタ３を直進する。
【００３０】
ビームスプリッタ３の直進光路には、結像レンズ９および光路分離手段としてダイクロイックミラー１０が配置されている。ダイクロイックミラー１０は、例えば６００ｎｍ以上の波長の光を透過し、それ以下の波長の光を９０度曲げる（反射）するようになっている。
【００３１】
この場合、結像レンズ９およびダイクロイックミラー１０は、鏡筒Ｂとして一体に構成され、上述した共焦点観察ユニットＡに対して後付けにより、取り付けることができるようになっている。
【００３２】
ビームスプリッタ３を直進し、結像レンズ９を介してダイクロイックミラー１０に入射した光は、６００ｎｍ以上の波長の光については、透過し、撮像素子１１の撮像面に結像し、非共焦点像として撮像され、また、６００ｎｍ以下の波長の光については、反射し、撮像素子１２の撮像面で結像し、共焦点像として撮像される。
【００３３】
これら撮像素子１１および１２は、撮像した画像を電気信号に変換して出力するようになっている。
【００３４】
撮像素子１１および１２には、合成機１４が接続されている。この合成機１４は、撮像素子１１および１２より出力される電気信号を合成するものである。
【００３５】
合成機１４には、表示手段としてモニタ１３が接続されている。このモニタ１３は、左右２つの表示画面１３ａ、１３ｂを並べて有するもので、合成機１４で合成された電気信号により、表示画面１３ａに撮像素子１１で撮像された非共焦点画像、表示画面１３ｂに撮像素子１２で撮像された共焦点画像をそれぞれ表示するようになっている。
【００３６】
次に、以上のように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００３７】
光源１から照明光が出射すると、この照明光は、コレクタレンズ２を通って平行光となり、ビームスプリッタ３に入射する。そして、ビームスプリッタ３により９０度曲げられた光は、モータ４により回転しているディスク５に入射する。
【００３８】
この場合、ディスク５において、光源１からの照明光のうち、６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過する。
【００３９】
ディスク５を透過した光は、結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し試料８を照射する。
【００４０】
また、試料８から戻った光は対物レンズ７を通って平行光となり、結像レンズ６を通ってディスク５上で結像する。
【００４１】
この場合も、ディスク５に入射した光のうち、６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過する。
【００４２】
そして、ディスク５から出た光は、ビームスプリッタ３を直進し、結像レンズ９に入射する。また、結像レンズ９を通った光は、ダイクロイックミラー１０に入射する。
【００４３】
この場合、ダイクロイックミラー１０に入射した光のうち、６００ｎｍ以上の波長の光は、そのまま透過し、撮像素子１１で非共焦点像として撮像され、合成機１４を通ってモニタ１３の右側の表示画面１３ａに非共焦点画像として表示される。また、６００ｎｍ以下の波長の光については、９０度曲げられて、撮像素子１２で共焦点像として撮像され、合成機１４を通ってモニタ１３の左側の表示画面１３ｂに共焦点画像として表示される。
【００４４】
従って、このようにすれば、ディスク５として、光が透過する透過部５ａと特定波長の光以外を反射（遮光）する遮光部５ｂを有するものを用い、特定の光の波長域について、例えば６００ｎｍ以下の波長の光は、透過部５ａを通る光のみを透過し、遮光部５ｂを透過しようとする光を遮光し、また、６００ｎｍ以上の波長の光は、透過部５ａおよび遮光部５ｂに入射するいずれの光も透過するように設定することにより、ディスク５を光路上に配した状態のまま、共焦点像および非共焦点像を同時に取得することができる。これにより、従来の非共焦点像を取得する度に回転ディスクを光路から退避させるものと比べ、このための作業を簡素化でき、取り扱いやすい共焦点顕微鏡を実現できる。
【００４５】
また、ディスク５から出た光を、鏡筒Ｂを構成するダイクロイックミラー１０により波長域ごとに分離し、共焦点像および非共焦点像として、それぞれモニタ１３に表示するようにしたので、従来のディスクより試料側の光路にハーフミラーを設け、このハーフミラーにより試料からの反射光を共焦点光路と非共焦点光路に分岐するものと比べ、ディスク５面に結像される光量を大きいまま確保できるので、明るく良好な共焦点像を取得することができる。
【００４６】
さらに、ディスク５から出た光を共焦点像と非共焦点像に分離するダイクロイックミラー１０を有する鏡筒Ｂは、ディスク５と撮像素子１１，１２との間の光路に配置されるため、常設される共焦点観察ユニットＡに対して後付けで鏡筒Ｂを取り付けることができる。このことは、従来から共焦点顕微鏡を所持している場合、新たに専用の共焦点顕微鏡を購入することなく、後付けで非共焦点像を取得するための機能を簡単に付加することができる。
【００４７】
なお、上述した第１の実施の形態のディスク５において、遮光部５ｂで光を透過する波長を例えば７００ｎｍ以下、それ以上の光を遮光とし、ダイクロイックミラー１０も、例えば７００ｎｍ以下の光を反射、７００ｎｍ以上の光を透過とすれば、モニタ１３の右側の表示画面１３ａに赤外光の共焦点像を表示し、モニタ１３の左側の表示画面１３ｂに可視光の非共焦点像を同時に表示することができる共焦点顕微鏡を提供できる。
【００４８】
また、ディスク５の遮光部５ｂで光を透過する波長を例えば４００ｎｍ以上、それ以下の光を遮光とし、ダイクロイックミラー１０も、例えば４００ｎｍ以下の光を反射、４００ｎｍ以上の光を透過とすれば、モニタ１３の右側の表示画面１３ａに可視光の非共焦点像を表示し、モニタ１３の左側の表示画面１３ｂに紫外光の共焦点像を同時に表示することができる共焦点顕微鏡を提供できる。
【００４９】
さらに、上述した第１の実施の形態では、ダイクロイックミラー１０を用いたが、ハーフミラーを用いて、結像レンズ９を透過した光を２分割し、それぞれの光路中に然るべき波長を透過するようなハイパスフィルタ、ローパスフィルタを配置するようにしても、同様な効果を期待できる。
【００５０】
さらに、上述した第１の実施の形態に用いられる対物レンズ７は、どのような対物レンズを使用してもよいが、軸上の色収差を除去した対物レンズを使用することが望ましい。
【００５１】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５２】
第１の実施の形態では、共焦点観察と非共焦点観察をディスクを交換することなく実現できる例を述べたが、この第２の実施では、励起法の異なる共焦点蛍光観察をディスクを交換することなく実現できるようにしたものである。
【００５３】
図３は、本発明の第２の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示している。図において、２１は光源で、この光源２１から出射した照明光の光路上には、コレクタレンズ２２、ターレット２３が配置されている。
【００５４】
コレクタレンズ２２は、光源２１からの光を平行光に変換するものである。ターレット２３は、回転体２３ａに複数のキューブ２４、２５、２６を保持したもので、回転体２３ａを各種励起法の観察に応じて回転操作することにより、キューブ２４、２５、２６を選択的に光軸上に配置できるようになっている。この場合、Ｕ励起法の観察では、キューブ２４が光軸上に配置され、Ｂ励起法の観察では、キューブ２５が光軸上に配置され、Ｇ励起法の観察では、キューブ２６が光軸上に配置されるようになっている。図示例では、Ｕ励起法の観察に用いられるキューブ２４が光軸上に配置されている。
【００５５】
キューブ２４は、励起フィルタ２４１、ダイクロイックミラー２４２、吸収フィルタ２４３をユニットとして構成したものである。
【００５６】
そして、コレクタレンズ２２を通って平行光となった照明光は、キューブ２４の励起フィルタ２４１に入射する。
【００５７】
ここで、励起フィルタ２４１には、図６（ａ）に示すように３６５ｎｍ付近の波長の光のみを透過するものが用いられる。また、ダイクロイックミラー２４２は、同図（ｂ）に示すように３６５ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。
【００５８】
励起フィルタ２４１を通った光は、ダイクロイックミラー２４２により９０度曲げられる。
【００５９】
ダイクロイックミラー２４２で９０度曲げられた反射光路には、ディスク２８および結像レンズ２９が配置されている。
【００６０】
ディスク２８は、走査手段を構成する回転手段としてモータ２７の回転軸に連結され、一定の回転速度で回転されるようになっている。
【００６１】
ディスク２８は、図４に示すように２枚のディスク片２８１、２８２から構成されている。これらディスク片２８１、２８２は、図５（ａ）（ｂ）に示すように、光を透過する直線状の透過部２８１ａ（２８２ａ）と特定波長の光以外を反射（遮光）する直線状の遮光部２８１ｂ（２８２ｂ）が交互に並べられ縞状に形成されている。この場合、ディスク片２８１は、透過部２８１ａの幅寸法が、例えば１５μｍ、遮光部２８１ｂの幅寸法が、例えば３００μｍからなり、このうち遮光部２８１ｂは、４５０ｎｍ以下の波長の光のみを透過するフィルタ材料で構成されている。また、ディスク片２８２は、透過部２８２ａの幅寸法が、例えば１０μｍ、遮光部２８２ｂの幅寸法が、例えば２００μｍからなり、このうち遮光部２８２ｂは、４５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過するフィルタ材料で構成されている。
【００６２】
そして、これらディスク片２８１、２８２は、それぞれの透過部２８１ａ（２８２ａ）および遮光部２８１ｂ（２８２ｂ）を設けた面同士を合わせた状態で重ねて接合されている。
【００６３】
図３に戻って、ディスク２８および結像レンズ２９を通った光は、対物レンズ３０の瞳上で結像し、励起光として試料３１を照射する。この場合、試料３１は、このときの励起光で励起される蛍光染料が付されている。
【００６４】
試料３１から発せられた蛍光は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。ディスク２８から出た光は、キューブ２４内のダイクロイックミラー２４２を直進して吸収フィルタ２４３に入射する。
【００６５】
吸収フィルタ２４３は、図６（ｃ）に示すように４２０ｎｍ以上の波長の光を透過するものが用いられる。
【００６６】
吸収フィルタ２４３の透過光路には、結像レンズ３２と対物レンズ３３が配置されている。結像レンズ３２を透過した光は、対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察を可能にしている。
【００６７】
なお、ターレット２３に保持されるキューブ２４以外のＢ励起法の観察に用いられるキューブ２５についても、励起フィルタ２５１、ダイクロイックミラー２５２、吸収フィルタ２５３をユニットとして構成している。ここで、励起フィルタ２５１は、図７（ａ）に示すように４８０ｎｍ付近の波長の光のみ透過するものが用いられる。ダイクロイックミラー２５２は、同図（ｂ）に示すように４８０ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。吸収フィルタ２５３は、同図（ｃ）に示すように５１５ｎｍ以上の波長の光のみを透過するものが用いられる。
【００６８】
また、Ｇ励起法の観察に用いられるキューブ２６についても同様で、励起フィルタ２６１、ダイクロイックミラー２６２、吸収フィルタ２６３をユニットとして構成している。ここで、励起フィルタ２６１には、図８（ａ）に示すように５５０ｎｍ付近の波長の光のみ透過するものが用いられる。ダイクロイックミラー２６２は、同図（ｂ）に示すように５５０ｎｍ付近の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過するようにしている。吸収フィルタ２６３は、同図（ｃ）に示すように５９０ｎｍ以上の波長の光のみを透過するものが用いられる。
【００６９】
次に、以上のように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００７０】
まず、Ｕ励起法の観察を行う場合は、ターレット２３を回転させてキューブ２４を光軸上に位置させる。
【００７１】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２４の励起フィルタ２４１に入射する。励起フィルタ２４１では、３６５ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２４２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００７２】
この場合、ディスク２８に入射した３６５ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａと遮光部２８１ｂとも透過し、ディスク片２８２では、透過部２８２ａを透過するが、遮光部２８２ｂで遮光される。
【００７３】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００７４】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約４３０ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００７５】
ディスク２８に入射した約４３０ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａを透過するが、遮光部２８２ｂで遮光され、ディスク片２８１では、透過部２８１ａと遮光部２８１ｂとも透過される。
【００７６】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２４内のダイクロイックミラー２４２を直進し、吸収フィルタ２４３に入射する。
【００７７】
吸収フィルタ２４３では、４２０ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００７８】
次に、Ｂ励起法で観察する場合は、ターレット２３を回転させてキューブ２５を光軸上に位置させる。
【００７９】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２５の励起フィルタ２５１に入射する。励起フィルタ２５１では、４８０ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２５２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００８０】
この場合、ディスク２８に入射した４８０ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光され、ディスク片２８２では透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過する。
【００８１】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００８２】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約５２５ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００８３】
ディスク２８に入射した約５２５ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過するが、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光される。
【００８４】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２５内のダイクロイックミラー２５２を直進し、吸収フィルタ２５３に入射する。
【００８５】
吸収フィルタ２５３では、５１５ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００８６】
次に、Ｇ励起法で観察する場合、ターレット２３をさらに回転させ、キューブ２６を光軸上に位置させる。
【００８７】
この状態から、光源２１から照明光が出射すると、照明光は、コレクタレンズ２２を通って平行光となり、キューブ２６の励起フィルタ２６１に入射する。励起フィルタ２６１では、５５０ｎｍ付近の波長の光のみが透過し、ダイクロイックミラー２６２で９０度曲げられた光は、モータ２７で回転しているディスク２８に入射する。
【００８８】
この場合、ディスク２８に入射した５５０ｎｍ付近の波長の光は、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光され、ディスク片２８２では透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過する。
【００８９】
このようにして、ディスク２８を透過した光は、結像レンズ２９を通って対物レンズ３０の瞳上で結像し試料３１を照射する。
【００９０】
これにより、試料３１に付された蛍光染料が励起される。そして、試料３１から発せられた蛍光（約６００ｎｍ付近の波長の光）は、対物レンズ３０を通って平行光となり結像レンズ２９を通ってディスク２８上で結像する。
【００９１】
ディスク２８に入射した約６００ｎｍ付近の波長の蛍光は、ディスク片２８２では、透過部２８２ａと遮光部２８２ｂとも透過するが、ディスク片２８１では、透過部２８１ａを透過するが、遮光部２８１ｂで遮光される。
【００９２】
ディスク２８を出射した光は、キューブ２６内のダイクロイックミラー２６２を直進し、吸収フィルタ２６３に入射する。
【００９３】
吸収フィルタ２６３では、５９０ｎｍ以上の波長の光のみが透過し、結像レンズ３２を通って対物レンズ３３上で結像し、観察者により蛍光の共焦点像の観察が行われる。
【００９４】
ちなみに、例えば、対物レンズ３０として倍率６０×、ＮＡ１．４を使用した場合、ディスク片２８１の透過部２８１ａの幅１５μｍと、下式で示されるディスク面上のエアリディスク径Ｄ
Ｄ＝１．２２×λ／ＮＡ×対物レンズの倍率（ただし、λ：光の波長、ＮＡ：対物レンズのＮＡ）
の比は、表１で表わすことができる。
【００９５】
【表１】
また、ディスク片２８２の透過部２８２ａの幅１０μｍと、エアリディスク径Ｄの比は、表２で表わすことができる。
【００９７】
【表２】
一般に、透過部と反射部を縞状に形成したスリットパターンのディスクを用いた場合、透過部の幅とエアリディスク径の比が４０〜６０％の範囲の時、良好な共焦点像の観察ができるとされているが、表１から明らかなように、Ｕ励起の場合、透過部の幅が１０μｍであると、透過部の幅とエアリディスク径の比が６０％以上にもなり、良好な共焦点像が得られない。また、Ｂ励起、Ｇ励起の場合も、透過部の幅が１５μｍであると、透過部の幅とエアリディスク径の比が４０％以下となって、この場合も良好な共焦点像が得られない。
【００９９】
このことについて、上述した第２の実施の形態によれば、Ｕ励起法の場合は、ディスク片２８２の幅１０μｍの透過部２８２ａにより共焦点効果を出しており、この場合は、幅１５μｍの透過部２８１ａを有するディスク片２８１は、共焦点効果において何の効果も及ぼさないようにし、また、Ｂ励起法、Ｇ励起法の場合は、ディスク片２８１の幅１５μｍの透過部２８１ａで共焦点効果を出しており、この場合は、幅１０μｍの透過部２８２ａを有するディスク片２８２は、共焦点効果において何の効果も及ぼさないようにしたので、これらＵ励起を始め、Ｂ励起法、Ｇ励起法の観察の場合でも、その都度ディスク２８を交換するような必要がなくなり、取り扱いやすく、しかも、常に良好な共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡を実現できる。
【０１００】
なお、上述した第２の実施の形態では、ディスク２８として、異なるフィルタ材料を用い異なるパターンを形成した２枚のディスク片２８１、２８２を重ねるように構成したが、これに代えて、１枚のディスクに異なるフィルタ材料を重ねてパターンを形成するようにしたものでもよいし、１枚のディスクの表裏面にそれぞれ異なるフィルタ材料でパターンを形成するようにしてもよい。この場合、上述した実施の形態では、ＵＢＧの３種類の励起法に対応できるものについて述べたが、上述したように異なるフィルタ材料で形成されるパターンの層数を増やしていけば、対応できる励起法を３種類以上にできることは勿論である。
【０１０１】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態および第２の実施の形態では、ディスクに透過部、遮光部が縞上に形成されたものを用いたが、透過部分がピンホール状の形状をしたディスクを使用してもよい。
【０１０２】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１０３】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、取り扱いが簡単で、しかも良好な共焦点像や非共焦点像を取得できる共焦点顕微鏡およびディスクを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられるディスクの詳細を説明する図。
【図３】本発明の第２の実施の形態が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図４】第２の実施の形態に用いられるディスクの概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態に用いられるディスクの詳細を説明する図。
【図６】第２の実施の形態のＵ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【図７】第２の実施の形態のＢ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【図８】第２の実施の形態のＧ励起法に用いられる励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの特性を示す図。
【符号の説明】
１…光源
２…コレクタレンズ
３…ビームスプリッタ
４…モータ
５…ディスク
５ａ…透過部
５ｂ…遮光部
６…結像レンズ
７…対物レンズ
８…試料
９…結像レンズ
１０…ダイクロイックミラー
１１…撮像素子
１１．１２…撮像素子
１３…モニタ
１３ａ．１３ｂ…表示画面
１４…合成機
２１…光源
２２…コレクタレンズ
２３…ターレット
２３ａ…回転体
２４、２５、２６…キューブ
２４１、２５１、２６１…励起フィルタ
２４２、２５２、２６２…ダイクロイックミラー
２４３、２５３、２６３…吸収フィルタ
２７…モータ
２８…ディスク
２８１、２８２…ディスク片
２８１ａ…透過部
２８１ｂ…遮光部
２８２ａ…透過部
２８２ｂ…遮光部
２９、３２…結像レンズ
３０、３３…対物レンズ
３１…試料
Claims (5)
- 光を透過する透過部と光を遮光する遮光部をそれぞれ有するディスクを光路上で回転させ、前記ディスクを透過した光を試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡に用いられるディスクにおいて、
前記遮光部は、特定の波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴とするディスク。 - 前記透過部および遮光部は、それぞれ直線状をなし、これら直線状の透過部および遮光部が交互に並べられ縞状に形成されることを特徴とする請求項１記載のディスク。
- 前記縞状に形成された透過部および遮光部は、複数のディスク片にそれぞれ形成されるとともに、これらディスク片を重ね合わせてなり、それぞれのディスク片の遮光部は、異なる特定波長域の光を透過するフィルタ材料で構成されることを特徴とする請求項２記載のディスク。
- 請求項１または２記載のディスクを光路上で回転させ、光源からの光を前記ディスクを透過させて試料に対して走査するとともに、試料からの光を前記ディスクを透過させて像として取得する共焦点顕微鏡であって、
前記ディスクを透過した光路上に配置され、前記試料からの光のうち前記ディスクの前記透過部および遮光部を透過する波長域の光と前記透過部のみを透過する波長域の光を、それぞれ異なる光路に分離する光路分離手段と、
前記光路分離手段で分離された光の像を同時に表示する表示手段と
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項３記載のディスクを光路上で回転させ、励起フィルタを通った特定波長の励起光を前記ディスクを透過させて試料に対し走査するとともに、試料より発せられる蛍光を前記ディスクを透過させ、前記蛍光の波長を選択する吸収フィルタを介して像として取得する共焦点顕微鏡であって、
少なくとも前記励起フィルタおよび吸収フィルタを備えたユニットを複数個有するとともに、これらユニットを光路上で切換え、前記ディスクを構成する一方のディスク片の透過部および遮光部を透過し、他方のディスク片の透過部のみ透過するような波長域の光を選択することにより、各種の励起法の観察を可能にしたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
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|---|---|---|---|
| JP2002341002A JP2004177493A (ja) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | 共焦点顕微鏡およびディスク |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002341002A JP2004177493A (ja) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | 共焦点顕微鏡およびディスク |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004177493A true JP2004177493A (ja) | 2004-06-24 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2002341002A Withdrawn JP2004177493A (ja) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | 共焦点顕微鏡およびディスク |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006235250A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Nikon Corp | 測定顕微鏡 |
| JP2015084059A (ja) * | 2013-10-25 | 2015-04-30 | 株式会社キーエンス | 顕微鏡装置 |
-
2002
- 2002-11-25 JP JP2002341002A patent/JP2004177493A/ja not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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