JP2003228004A - 共焦点蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高速で変倍を行うことができるとともに、小
型で、価格的にも安価にできる共焦点蛍光顕微鏡を提供
する。 【解決手段】 光源１からの光路上に光透過部と光遮蔽
部を有する回転ディスク４を回転可能に配置し、この回
転ディスク４の光透過部を透過した光を共焦点光学系５
を介して試料８に入射するとともに、試料８から発する
蛍光を試料像として回転ディスク４上に投影させ、回転
ディスク４に投影された試料像のうち光透過部を透過し
た部分を結像光学系９を介してＣＣＤカメラ１０に結像
させるとともに、この結像光学系９の光路上にＣＣＤカ
メラ１０に結像される像の結像倍率を可変する変倍光学
系１４を配置している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、回転ディスクを用
いた共焦点法のセクショニング効果を利用し、蛍光を観
察する共焦点蛍光顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】最近、遺伝子研究は、ますます盛んにな
っており、この遺伝子研究における遺伝子分析などに
は、蛍光観察が用いられている。

【０００３】このような蛍光観察において、蛍光をコン
トラストよく観察するものとして、共焦点法のセクショ
ニング効果を利用した共焦点蛍光顕微鏡が知られてい
る。この共焦点蛍光顕微鏡は、蛍光による細胞の微細３
次元観察などに用いられることが多く、高倍率での観察
を行っているものがほとんどである。

【０００４】図５は、このような共焦点蛍光顕微鏡のう
ち、ディスク回転タイプのものを一例として示してい
る。

【０００５】この場合、ハロゲン光源又は水銀光源等の
光源１から出射される光の光路上にコリメータレンズ
２、ダイクロイックミラー３が配置され、ダイクロイッ
クミラー３の反射光路上に回転ディスク４、共焦点光学
系５を形成する結像レンズ６、対物レンズ７を介して試
料８が配置されている。また、試料８からの光を透過す
るダイクロイックミラー３の透過光路上に結像光学系９
を介して撮像手段としてのＣＣＤカメラ１０が配置され
ている。このＣＣＤカメラ１０の画像出力端子には、図
示しないモニタが接続され、ＣＣＤカメラ１０で撮像さ
れた画像を表示する。

【０００６】ここで、ダイクロイックミラー３は、光源
１からの光のうち、蛍光を励起する波長の励起光を反射
し、また、試料８からの蛍光波長を透過するようになっ
ている。回転ディスク４は、微小な開口が多数配置され
ており、この微小な開口のみが光を通過させるようにし
ている。また、回転ディスク４は、回転軸１１ａを介し
てモータ１１に連結され、一定の回転速度で回転される
ようになっている。

【０００７】このような構成によれば、光源１から出射
された光は、コリメータレンズ２を通って、ダイクロイ
ックミラー３で励起光となる短い波長のみが反射され、
一定の速度で回転する回転ディスク４に入射され、この
回転ディスク４を通過した光が結像レンズ６を通り、対
物レンズ７によって結像され、試料８に入射する。試料
８は、この入射した励起光により蛍光が発生する。試料
８からの蛍光は、対物レンズ７を介し、結像レンズ６に
より回転ディスク４上に試料像として投影される。そし
て、この投影された試料像のうち焦点の合っている部分
は回転ディスク４の微小開口を通過し、さらにダイクロ
イックミラー３で蛍光である長い波長が結像光学系９の
方向に透過し、この結像光学系９を介してＣＣＤカメラ
１０で撮像される。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ところで、通常、顕微
鏡では、観察時に観察対象によって倍率を変えられるよ
うになっているが、この倍率を変える場合、対物レンズ
７を交換することで対処するようにしている。

【０００９】ところが、ディスク回転タイプの共焦点蛍
光顕微鏡の場合は、対物レンズ７の倍率を変えると、試
料８の回転ディスク４上への投影倍率が変化してしま
う。この場合、回転ディスク４上に形成される微小開口
は、投影倍率と対物レンズ７の開口数であるＮＡに大き
く依存するため、例えば、微小開口がピンホールである
周知のＮｉｐｋｏｗディスクのような場合、投影倍率を
Ｍ、対物レンズ７の開口数をＮＡ、光の波長をλとする
と、ディスクのピンホールの直径Ｒは Ｒ＝Ｋ・Ｍλ／ＮＡ …（１） ただし、Ｋ＝０．５〜１．０ となる関係を満たすようにし、また、微小開口がスリッ
トであるようなラインパターンディスクの場合も、スリ
ットの幅Ｌは、 Ｌ＝Ｋ・Ｍλ／ＮＡ …（２） ただし、Ｋ＝０．３〜０．８ となる関係を満たすようにする必要がある。

【００１０】このことから、対物レンズ７の倍率を変更
すると、対物レンズ７の交換に応じて適切なピンホール
やラインパターンとなるように回転ディスク４も交換す
るなど対応させる必要ある。しかし、これら対物レンズ
７と同時に回転ディスク４を交換するには、かなり大掛
かりな交換機構が必要となり、全体が大型化するばかり
か価格的にも高価になるという問題を生じる。

【００１１】そこで、従来、特開平９−２３０２４５号
公報に開示されるように、回転ディスクの前後に変倍光
学系を配置し、対物レンズの交換と同時に変倍光学系を
用いて変倍を行うことにより、回転ディスクの交換が不
要で、且つセクショニング効果を劣化させない方法が考
えられている。

【００１２】ところが、このような方法によると、回転
ディスクの前後に変倍光学系が設けられることで、対物
レンズの交換機構が大型で、価格的に高価なものとな
り、さらにレンズ交換のための時間がかかるという問題
がある。

【００１３】特に、最近、共焦点蛍光顕微鏡は、細胞な
どの蛍光を高いコントラストで詳細に比較的高倍率で観
察する用途だけでなく、ＤＮＡの解析等の分野にも使わ
れるようになっている。この分野では、図６に示すよう
に蛍光色素をつけたＤＮＡ１０１を多数並べたサンプル
１０２を一度に連続して観察するような方法がとられる
ことが多いが、このようなサンプル１０２の蛍光観察を
行うには、低倍で広い視野を観察する必要があるととも
に、微弱な蛍光を高速で観察するため高ＮＡも必要とな
り、このため高ＮＡ低倍率という特殊で高価な対物レン
ズが使用され、さらに、多数のＤＮＡ１０１の蛍光観察
中に異常が発見されたならば、その部分を拡大して詳細
に観察したいこともある。

【００１４】このような用途に、上述した共焦点蛍光顕
微鏡を適用すると、倍率の異なる特殊で高価な対物レン
ズが複数本必要となり、さらに経済的に不利になってし
まい、また、特開平９−２３０２４５号公報のもので
も、対物レンズの交換機構が大型となって、レンズ交換
に時間がかかり、しかも、価格的に高価となってしまう
ことに変りはない。

【００１５】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、高速で変倍を行うことができるとともに、小型で、
価格的にも安価にできる共焦点蛍光顕微鏡を提供するこ
とを目的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
光源と、光透過部と光遮蔽部を有し、且つ前記光源から
の光路上に回転可能に配置されたディスクと、前記ディ
スクの光透過部を透過した光を試料に入射するととも
に、該試料から発する蛍光を試料像として前記ディスク
上に投影する共焦点光学系と、前記ディスクに投影され
た試料像のうち前記ディスクの光透過部を透過した部分
を所定位置に結像させる結像光学系と、前記結像光学系
の光路上に配置され、前記所定位置に結像される像の結
像倍率を可変する変倍光学系とを具備したことを特徴と
している。

【００１７】請求項２記載の発明は、請求項１記載の発
明において、前記光源と前記ディスクとの間の光路に配
置され、前記光源からの光から蛍光を励起する波長の光
を選択して透過する第１のフィルタと、前記ディスクと
前記結像光学系との間の光路に配置され、前記試料から
の蛍光の波長を透過する第２のフィルタとをさらに有す
ることを特徴としている。

【００１８】請求項３記載の発明は、請求項１または２
記載の発明において、前記ディスクは、光を透過する直
線状に形成された透過部と光を遮蔽する直線状に形成さ
れた遮蔽部のそれぞれのパターンを交互に並べて配置し
たものであることを特徴としている。

【００１９】この結果、本発明によれば、結像光学系の
光路上に変倍光学系を配置し、観察対象により倍率を変
える場合、変倍光学系により結像倍率を任意に変えられ
るようにしたので、構成が簡単で小型化を実現でき、価
格的に安価にできる。

【００２０】また、変倍光学系は、セクショニング効果
を劣化させることがない位置に配置されており、変倍光
学系を操作することで、所望する変倍を行うことができ
るので、高コントラストの観察が可能であるとともに、
高速で変倍を行うことができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施の形態を図
面に従い説明する。

【００２２】図１は、本発明が適用される共焦点蛍光顕
微鏡の概略構成を示すもので、図５と同一部分には、同
符号を付している。

【００２３】この場合、コリメータレンズ２とダイクロ
イックミラー３の間の光路には、第１のフィルタとして
励起フィルタ１２が配置されている。また、ダイクロイ
ックミラー３の透過光路上のダイクロイックミラー３と
結像光学系９との間の光路には、第２のフィルタとして
吸収フィルタ１３が配置されている。さらに、結像光学
系９は、複数のレンズ９ａ、９ｂを有するとともに、こ
れらレンズ９ａ、９ｂの間の光路には、変倍光学系１４
が配置されている。この変倍光学系１４は、例えばズー
ム光学系や焦点距離の異なる複数のレンズの挿脱機構な
どにより構成されている。

【００２４】ここで、励起フィルタ１２は、図２（ａ）
に示すように光源１からの光から蛍光を励起する波長の
光を選択して透過し、その他の波長（蛍光の波長Ａを含
む）を遮断するような特性を有している。また、ダイク
ロイックミラー３は、図２（ｂ）に示すように励起フィ
ルタ１２を透過した波長の光は反射し、試料８からの蛍
光の波長Ａは透過するような特性を有している。さら
に、吸収フィルタ１３は、図２（ｃ）に示すように試料
８からの蛍光の波長Ａは透過し、その他の波長（励起光
を含む）を遮断するような特性を有している。

【００２５】この場合、これら励起フィルタ１２、ダイ
クロイックミラー３および吸収フィルタ１３のそれぞれ
の特性は、使用する蛍光色素により異なっており、例え
ば、ＦＩＴＣを観察する場合、励起最大波長が４９０ｎ
ｍ、蛍光最大波長が５２０ｎｍであることから、励起フ
ィルタ１２を透過する波長およびダイクロイックミラー
３で反射する波長は、４６０〜４９０ｎｍのものが、ダ
イクロイックミラー３および吸収フィルタ１３を透過す
る波長は、５１０ｎｍのものがそれぞれ使用されてい
る。

【００２６】図３（ａ）は、回転ディスク４の概略構成
を示すもので、光を透過する直線状に形成された透過部
４ａと光を遮蔽する直線状に形成された遮蔽部４ｂのそ
れぞれのパターンを交互に並べて配置し、これら透過部
４ａと遮蔽部４ｂの直線状のパターンのうち、観察視野
内でのディスクの回転により走査方向と平行になる部分
に、これら透過部４ａと遮蔽部４ｂの直線状パターンと
直交する方向に光を透過する直線状に形成された透過部
４ｃと光を遮蔽する直線状に形成された遮蔽部４ｄのそ
れぞれのパターンを交互に並べて配置した一定の幅Ｄを
有する領域４ｅを設けるようにしている。

【００２７】この場合、同図（ｂ）に示すように光を遮
蔽する直線状の遮蔽部４ｂ、４ｄの幅寸法は、光を透過
する直線状の透過部４ａ、４ｃの幅寸法より大きく、例
えば、１：９の比に設定されている。また、透過部４
ａ、４ｃの幅Ｌは、上述した式（２）により決定されて
いる。

【００２８】次に、このように構成された実施の形態の
作用を説明する。

【００２９】光源１から出射された光は、コリメータレ
ンズ２を通って平行光となり、励起フィルタ１２に入射
される。励起フィルタ１２では、光源１からの光のうち
蛍光を励起する波長の光を励起光として選択し、ダイク
ロイックミラー３に入射する。ダイクロイックミラー３
に入射した励起光は、ここで反射され、一定の速度で回
転する回転ディスク４に入射される。そして、回転ディ
スク４の光を透過する直線状の透過部４ａ、４ｃを透過
し、結像レンズ６を通り、対物レンズ７によって結像さ
れ、試料８に入射される。

【００３０】試料８では、入射された励起光により蛍光
を発生する。この試料８からの蛍光は、対物レンズ７を
通り、結像レンズ６により回転ディスク４上に試料像と
して投影される。そして、この投影された試料像のうち
焦点の合っている部分は回転ディスク４の透過部４ａ、
４ｃを透過し、さらにダイクロイックミラー３を蛍光波
長が透過し、吸収フィルタ１３に入射される。吸収フィ
ルタ１３では、励起光の波長を遮断し、試料８からの蛍
光波長のみを結像光学系９方向に透過する。そして、結
像光学系９側に透過された蛍光は、試料像として変倍光
学系１４を介してＣＣＤカメラ１０の撮像面に結像され
撮像される。

【００３１】この状態で、変倍光学系１４によりＣＣＤ
カメラ１０での試料像の結像倍率を任意に変更すること
ができる。これにより、例えば、図６で述べたＤＮＡの
解析分野に用いられるような場合で、微弱な蛍光を高速
で、しかも広視野で観察する必要がある場合は、変倍光
学系１４を低倍率に設定することで対応でき、一方、異
常部分の拡大検査を行う場合は、変倍光学系１４を高倍
率に設定することで対応できる。この場合、変倍光学系
１４は、回転ディスク４からＣＣＤカメラ１０に至る光
路に配置されるが、高コントラスト像を得るためのセク
ショニング効果は、回転ディスク４の前方の共焦点光学
系５によって決定されることから、変倍光学系１４の存
在がセクショニング効果を劣化させることにならない。

【００３２】従って、このようにすれば、回転ディスク
４からＣＣＤカメラ１０に至る光路に変倍光学系１４を
配置し、観察対象により倍率を変える場合、変倍光学系
１４によりＣＣＤカメラ１０での結像倍率を任意に変え
られるようにしたので、従来の対物レンズの倍率を変え
るのに、対物レンズと同時に回転ディスクを交換するた
め、大掛かりな交換機構が必要となるものと比べ、構成
が簡単で小型化を実現でき、価格的にも安価にできる。

【００３３】また、変倍光学系１４は、セクショニング
効果を劣化させることがない位置に配置されており、変
倍光学系１４を操作することで、所望する変倍に対応さ
せることができるので、高コントラストの観察が可能で
あるとともに、高速で変倍を行うことができる。

【００３４】さらに、ＤＮＡの解析等の分野に使われる
場合も、高ＮＡ低倍率という特殊で高価な対物レンズ
は、１個のみ用意すればよく、しかも、変倍光学系１４
を操作することで、低倍で広い視野を観察する広域の蛍
光観察と、多数のＤＮＡの蛍光観察中に異常が発見され
たならば、その部分を拡大して詳細に観察する部分拡大
観察を簡単に切換えて対処することができる。

【００３５】なお、本発明は、上記実施の形態に限定さ
れるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない
範囲で種々変形することが可能である。

【００３６】例えば、回転ディスク４は、直線状の遮蔽
部４ｂ（４ｄ）の幅寸法と直線状の透過部４ａ（４ｃ）
の幅寸法の比を１：９に設定されているが、この比は、
もっと小さくても大きくてもよい。例えば、非常に暗い
蛍光の場合は、非合焦成分が増えるが、１：３程度にす
ると、像を明るくできる。また、非常に明るい蛍光の場
合は、１：２０または１：５０にすると、非合焦成分が
ほとんどなくなり、焦点の合った像のみのセクショニン
グ画像を得ることができる。しかし、このときの像は暗
くなる。

【００３７】また、回転ディスク４のパターン形状も種
々考えられ、例えば、図４（ａ）に示すように、光を透
過する直線状に形成された透過部４ａと光を遮蔽する直
線状に形成された遮蔽部４ｂのそれぞれのパターンを交
互に並べて配置するとともに、これら透過部４ａと遮蔽
部４ｂの直線状のパターンのうち、観察視野内でのディ
スクの回転により走査方向と平行になる部分に、これら
透過部４ａと遮蔽部４ｂの直線状パターンと直交する方
向に沿って、中心角度を数度程度にした扇状の遮光領域
４ｆ、４ｇを形成するようにしたもの、あるいは、同図
（ｂ）に示すように、同図（ａ）と同様に交互に並べて
配置された光を透過する直線状に形成された透過部４ａ
と光を遮蔽する直線状に形成された遮蔽部４ｂの直線状
のパターンのうち、観察視野内でのディスクの回転によ
り走査方向と平行になる部分に、これら透過部４ａと遮
蔽部４ｂの直線状パターンと直交する方向に沿って、デ
ィスク周縁からの長さ寸法を順に変えるようにした透過
部４ｈおよび遮蔽部４ｉの複数の直線状パターンを有す
る扇状の領域を形成するようにしたものなどを用いるこ
とができる。

【００３８】さらに、回転ディスク４は、直線状パター
ンを有するものである必要はなく、光軸方向にセクショ
ニング効果をもたらすものであれば、どのような形状、
パターンのであってもよく、例えば、Ｎｉｐｋｏｗディ
スクのような螺旋状にピンホールを形成したディスクも
用いることができる。

【００３９】さらに、上述した実施の形態では、試料像
をＣＣＤカメラ１０で撮像するＣＣＤ撮像方式としてい
るが、試料像を目視により観察する目視タイプのもので
もよいし、観察光路にハーフミラーを配置し、ＣＣＤに
よる撮像光路と目視による観察光路を分けて両方設ける
ようにしてもよい。

【００４０】さらに、励起フィルタ１２、ダイクロイッ
クミラー３および吸収フィルタ１３を共通のユニット構
成とし、このユニットを顕微鏡の光路に対して差し替え
たり、あるいはターレットによる交換式にして、使用さ
れる蛍光色素によって使い分けるようにしてもよい。

【００４１】さらに、励起フィルタ１２と吸収フィルタ
１３の配置を入れ替え、ダイクロイックミラー３の反射
透過特性を逆のものとすれば、光源と観察の光学配置を
入れ替えることができる。

【００４２】さらに、上述した実施の形態では、対物レ
ンズ７と試料８の距離は一定の場合を述べたが、例え
ば、試料８を上下方向に移動できるＺステージを設け、
試料８と対物レンズ７の距離を変化させて次々に画像を
取り込めば、３次元観察を行うこともできる。

【００４３】さらに、上記実施の形態には、種々の段階
の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件
における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出でき
る。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から
幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようと
する課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄
で述べられている効果が得られる場合には、この構成要
件が削除された構成が発明として抽出できる。

【００４４】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、高速
で変倍を行うことができるとともに、小型で、価格的に
も安価にできる共焦点蛍光顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の共焦点蛍光顕微鏡の一実施の形態の概
略構成を示す図。

【図２】一実施の形態に用いられる励起フィルタ、ダイ
クロイックミラーおよび吸収フィルタの特性を示す図。

【図３】一実施の形態に用いられる回転ディスクの概略
構成を示す図。

【図４】本発明の他の実施の形態に用いられる回転ディ
スクの概略構成を示す図。

【図５】従来の共焦点蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。

【図６】ＤＮＡ解析に用いられるサンプルの一例を示す
図。

【符号の説明】

１…光源 ２…コリメータレンズ ３…ダイクロイックミラー ４…回転ディスク ４ａ、４ｃ、４ｈ…透過部 ４ｂ、４ｄ、４ｉ…遮蔽部 ４ｅ…領域 ４ｆ．４ｇ…遮光領域 ５…共焦点光学系 ６…結像レンズ ７…対物レンズ ８…試料 ９…結像光学系 ９ａ．９ｂ…レンズ １０…ＣＣＤカメラ １１…モータ １１ａ…回転軸 １２…励起フィルタ １３…吸収フィルタ １４…変倍光学系

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 EA01 FA02 GA01 GB01 HA01 HA15 JA02 KA02 KA05 LA03 MA16 2H052 AA08 AA09 AB24 AC04 AC15 AC27 AC29 AD31 AD34 AD35 AF14

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源と、 光透過部と光遮蔽部を有し、且つ前記光源からの光路上
   に回転可能に配置されたディスクと、 前記ディスクの光透過部を透過した光を試料に入射する
   とともに、該試料から発する蛍光を試料像として前記デ
   ィスク上に投影する共焦点光学系と、 前記ディスクに投影された試料像のうち前記ディスクの
   光透過部を透過した部分を所定位置に結像させる結像光
   学系と、 前記結像光学系の光路上に配置され、前記所定位置に結
   像される像の結像倍率を可変する変倍光学系とを具備し
   たことを特徴とする共焦点蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記光源と前記ディスクとの間の光路に
   配置され、前記光源からの光から蛍光を励起する波長の
   光を選択して透過する第１のフィルタと、 前記ディスクと前記結像光学系との間の光路に配置さ
   れ、前記試料からの蛍光の波長を透過する第２のフィル
   タとをさらに有することを特徴とする請求項１記載の共
   焦点蛍光顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記ディスクは、光を透過する直線状に
   形成された透過部と光を遮蔽する直線状に形成された遮
   蔽部のそれぞれのパターンを交互に並べて配置したもの
   であることを特徴とする請求項１または２記載の共焦点
   蛍光顕微鏡。