JP2004135669A6

JP2004135669A6 - ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）及びリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生育を抑制する抗菌活性物質を生産するペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名される乳酸菌株、これを利用した抗菌特性を持つ抗菌物質製造方法、並びに生菌剤抗菌物質を機能性食品及び医薬品に利用する方法

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Publication number: JP2004135669A6
Application number: JP2003354432A
Authority: JP
Inventors: 明俊鄭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-15
Filing date: 2003-10-14
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2023-10-14

Abstract

【課題】ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名された乳酸菌株及びこれを利用した抗菌特性を持つ抗菌物質製造方法、その製造された乳酸菌生菌剤、並びに抗菌物質を機能性食品及び医薬品に利用する方法を提供する。
【解決手段】胃炎（潰瘍）原因菌であるヘリコバクターピロリ菌及び食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネス菌に対する感染予防及び除菌作用による治療効果を同時に呈する乳酸菌生菌剤及び抗菌活性物質を製造することができ、これによって特定原因菌に対する感染予防及び治療機能を備えた機能性食品や医薬品を生産・供給することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名され、ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）とリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生育を抑制する抗菌物質を生産する乳酸菌株、前記乳酸菌株を利用して所定の抗菌活性物質を製造する方法とその製造された抗菌物質、前記製造された抗菌物質を濃縮する方法とその方法によって濃縮された抗菌活性物質濃縮剤、前記抗菌活性物質濃縮剤を乾燥させる方法とその方法によって乾燥された抗菌活性物質濃縮剤乾燥物質及び前記抗菌活性物質濃縮液またはその乾燥物質を機能性食品及び医薬品に利用する方法に関する。

ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）は、幼児期以後に経口を通じて感染されるのが一般的であり、統計上、韓国内の成人の７０％以上が保菌者として推算されている。ヘリコバクターピロリ菌は人体内における胃炎及び胃ガン発生の原因菌としてよく知られている。ところが、従来は胃または十二指腸の炎症や潰瘍を治療するためには抗生剤、胃酸抑制剤及び胃粘膜保護剤など三つの薬剤を同時に投与する三剤療法が大衆化されており、一部ではそれによる治療効果も報告されている。しかし、このような従来の三剤療法は、腸内有益菌叢の破壊に起因する下痢や便秘症の発病、投与された薬剤に対する耐性菌株の登場による薬効能の低下及び反復的治療のための過量投与などの薬使用における副作用が発生し、そして、再発の可能性も高いといった問題点も指摘されてきた。

乳児は、乳離れさせる時期から感染が始まり、幼児期の後でも汁や飲料などを常時飲用する食習慣を持つ成人などでは経口感染の可能性が高く、しかも、成人保菌者の場合は、薬剤による除菌治療の後、日常生活で再び感染される危険に頻繁にさらされている。

このように、従来から行なわれてきた抗生剤などの薬剤を利用した除菌治療により胃炎を誘発させる病原菌を制御するのには限界があったため、感染後治療よりは事前に感染を予防できる方法が必要とされるに到った。

そこで、従来の抗生剤を含む医薬品のみに依存する感染制御方式とは違い、菌体、菌体破砕液、尿素分解酵素（Ｕｒｅａｓｅ）、ｐ５４蛋白質などを免疫原として生成させた抗体を利用したり、免疫卵を利用してヘリコバクターピロリ菌を制御しようとする研究がなされてきた。

一方、ヘリコバクターピロリ菌が胃腸管などに付着するのを防止するために、除菌性能のある乳酸菌やそれから生産された抗菌物質が添加された各種健康食品、発酵乳及び乳製品が紹介されるなど、医薬品でない機能性食品を使って感染予防や除菌または治療の目的を達成しようとする製品に対する研究・開発が推進されている。

また、乳酸菌は、免疫増強機能、腸内有益菌叢保持、整腸機能などを備えている他、ヘリコバクターピロリ菌が胃粘膜に付着するのを防止する役割と除菌作用を備えているので、胃炎予防及び病症改善作用を同時に発揮するとされている。

つまり、第一に、ヘリコバクターピロリ菌は尿素分解酵素（Ｕｒｅａｓｅ）活性を有し、胃酸中和能力を有しているため、有機酸だけの作用では目的とする胃炎予防及び除菌と関連した高い活性効果を期待することが難しく、第二に、ヘリコバクターピロリ菌は、胃粘膜上皮細胞に貼り付いて生育するので、胃粘膜上皮細胞との結合力に優れた細胞構造をもつ特定の乳酸菌が先にその付着部位を占めることによってヘリコバクターピロリ菌が胃粘膜に付着するのを防止し、生菌体及び死菌体については所定の目的を達成できるが、既に胃粘膜にヘリコバクターピロリ菌が付着されている感染者には除菌効果が高くないという問題がある。ところが、第三に、乳酸菌が生産する抗菌活性物質（抗菌ペプチド：ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ）、未確認（ｕｎ−ｋｎｏｗｎ）抗菌活性物質または免疫強化成分による制御機能を用いてヘリコバクターピロリ菌が胃粘膜に付着するのを防止（予防）すると同時に、除菌効果（治療）も達成でき、発酵過程及び物質回収技術により濃縮製造された高濃度の抗菌活性物質を利用する場合なら、ヘリコバクターピロリ菌による胃炎に対して良好な予防効果はもちろん、治療効果も期待することができる。

以上の如く、乳酸菌を利用した機能性食品にてヘリコバクターピロリ菌を制御するためには、上に述べた３つの要因を適切な条件で積極的に活用する必要がある。特に、乳酸菌が生産する抗菌活性物質（抗菌ペプチド：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ、バクテリオシン（Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）とも総称する）は、固有の分子量、アミノ酸塩基配列及び構造によって侵入できる微生物構造（細胞膜、グラム陰性菌での外膜構造）に特異性があるため、抗菌領域に明らかな選択性がある。したがって、乳酸菌が生産する抗菌物質を利用すると、抗生剤使用時に発生する有益菌叢破壊のような副作用がないし、その作用機作がターゲット微生物細胞膜にのみ選択的にリーク（ｌｅａｋ）を形成するので耐性発達の恐れもなく、食品への利用に非常に好適で安全な生体親和的な特性を示す。また、抗菌活性物質誘導及び高濃度発酵技術と物質分離技術を用いて高活性を備えた製品生産が可能であり、乳酸菌の生菌剤及び他の機能性素材などと併用可能な物性を備えているため、様々な用途に開発され得る利点がある。

一方、リステリアモノサイトゲネスは、主としてチーズなど乳加工品、食肉加工品及びその他冷蔵流通食品などに汚染されて低温流通中にも増殖して食中毒を引き起こす微生物であって、人体に無害な天然食品保存剤による除菌及び汚染防止が必要な病原性細菌である。

したがって、本発明は、上記の従来の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来の胃炎などを治療するための三剤療法などにおける問題点を解決し、感染後の治療はもちろん、感染予防の目的も達成できる抗菌物質を生成する所定の乳酸菌株を活用することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）及びリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生育を抑制する抗菌物質を生産するペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名された乳酸菌株及び生菌製剤、前記乳酸菌株を利用して所定の抗菌活性物質を製造する方法とその製造された抗菌活性物質、前記製造された抗菌活性物質を濃縮する方法とその方法によって濃縮された抗菌活性物質濃縮剤、前記抗菌活性物質濃縮剤を乾燥させる方法とその方法によって乾燥された抗菌活性物質濃縮剤乾燥物質及び前記抗菌活性物質濃縮液またはその乾燥物質を利用して製造された機能性食品及び医薬品を提供する。

本発明に係る乳酸菌株から製造された抗菌物質は、胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリ菌に対して特異的な生育阻害活性をもつと同時に、食中毒の原因菌であるリステリアモノサイトゲネス菌に対しても特異的な除菌活性をもつ。また、前記抗菌物質を発酵過程を経て濃縮乾燥させて製造された乾燥粉末は水溶性抗菌性成分の分離濃縮物であって、様々な食品、医薬品及び食品保存剤製造に好適な物性を備えており、これを応用して製造された機能性食品や医薬品を利用する場合にはヘリコバクターピロリ菌及びリステリアモノサイトゲネス菌に対する生育抑制及び除菌作用を発揮するので、感染に対する治療及び予防効果を達成できる効果がある。

本発明は、目的とする技術的課題を達成するために、胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリ菌と食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスの生育を同時に抑制できる所定の抗菌活性物質を生産する微生物乳酸菌であるペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名された乳酸菌を提供し、それを利用して乳酸菌生菌製剤及び所定の抗菌特性を持つ抗菌活性物質を製造する方法とその製造された抗菌活性物質を食品または医薬品に利用する方法を提供する。

具体的には、本発明で提供される乳酸菌株は、ヘリコバクターピロリ菌に対する生育抑制能とリステリアモノサイトゲネス菌に対する生育抑制能を持つ抗菌活性物質を生産することを特徴とするペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名された乳酸菌株である。

一方、前記ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株を利用してヘリコバクターピロリ菌とリステリアモノサイトゲネス菌の生育を抑制する抗菌活性物質を製造する方法は、（ａ）ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株を用意する段階；（ｂ）前記用意した乳酸菌株の重量に対して３〜５重量％のブドウ糖、０．１〜１重量％の酵母抽出物（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ）、１〜１．５重量％の肉エキス、０．１〜１重量％の蛋白質加水分解物、０．０１〜０．１重量％のクエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウムの中から選択された一つ以上のイオン結合性化合物を添加して水に溶解させる段階；（ｃ）前記添加物が含有された水溶液を殺菌する段階；及び、（ｄ）前記殺菌された水溶液に、前記（ａ）段階で用意した乳酸菌株を投入して嫌気的発酵管で培養する段階を含めてなることを特徴とする。

一方、前記（ｄ）段階の後に、前記製造された抗菌活性物質に対して高速遠心分離または濾過装置を利用して菌体を分離した後、濾液を濃縮する段階をさらに含むと、抗菌活性物質の活性度を向上させることができるので、好ましい。さらに具体的には、前記濾過装置を利用して濃縮する段階は、濾過段階では菌体と最大排除分子量を超過する物質を除去し、第２濾過段階で最小排除分子量未満の物質を連続的に除去して所定範囲の分子量を持つ抗菌物質だけを濃縮する２段濾過方法で行うと、一定範囲内の分子量を持つ抗菌物質だけを選択的に濃縮できるので、好ましい。

なおかつ、前記濃縮段階の結果物である抗菌活性物質濃縮液に対して、凍結乾燥方式または噴射式流動層乾燥方法によって乾燥させる段階をさらに施すと、商用化される最終製品の性状にしたがって様々な活用可能性を確保できるので、好ましい。

そして、本発明が提供するペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株から生産されるヘリコバクターピロリ菌及びリステリアモノサイトゲネスに対する抗菌特性を備える抗菌活性物質を食品または医薬品に添加することによって、ヘリコバクターピロリ菌とリステリアモノサイトゲネス菌に対する感染予防はもちろん、治療効果を達成できる機能性食品または医薬品を開発できるので、好ましい。

一方、前段階で分離されたペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８生菌体は、一般的な乳酸菌生菌剤製造方法によって凍結乾燥粉末化して前記抗菌物質乾燥物と共に使用してもよく、あるいは単独で使用してもよい。

以下、本発明を具体的な実施例及び添付図面を参照しつつ詳細に説明する。しかし、本発明に係る実施例は様々な形態に変形でき、後述する実施例によって本発明の範囲が限定されてはいけない。したがって、本発明の実施例は、当分野で通常の知識をもつ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものとして理解するとよい。

乳酸菌ＣＢＴ−８の菌学的性質の同定
本発明に係る乳酸菌株は、ＡＰＩ５０ＣＨＬを使用して糖化能を試験した結果、下記の表１のような結果が得られた。

また、前記乳酸菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を分析し、その分析結果は、別途の塩基配列目録を示した図１のようであった。前記分析された塩基配列目録の結果から、発生学的な系譜を把握するために、周知の菌株との１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を比較した結果、下記の表２のような結果が得られた。

一方、本発明に係る乳酸菌株のストレイン（ｓｔｒａｉｎ）とペディオコッカス類型のストレイン（ｓｔｒａｉｎ）であるペディオコッカスデキストリニクス（ＫＣＴＣ３５０６）、ペディオコッカスペントサセウス（ＫＣＴＣ３５０７）、ペディオコッカスパルブルス（ＫＣＴＣ３６１５）及びペディオコッカスイノピナツス（ＫＣＴＣ３６５３）などとのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った場合、本発明に係る乳酸菌株は、ペディオコッカスペントサセウスと９３％以上の遺伝的関連性を示していることを下記の表３と図１から確認することができた。

上記の表１による糖化能結果値と前記の表２による１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の類似性、そして前記表３及び図２に示したようなハイブリダイゼーション結果を総合的に同定したところ、本発明に係る乳酸菌株は、ペディオコッカスペントサセウスの変種として把握され、これに基づくその発生学的系譜（Ｐｈｙｌｏｇｎｅｔｉｃｔｒｅｅ）は、図３のように示される。

以上の如く、本発明に使用される微生物乳酸菌株は、糖化能及び遺伝学的分析によってペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）と同定されるものであって、これを具体的にペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名し、２００２年６月２５日付の大韓民国微生物寄託機関である韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託して菌株寄託番号ＫＣＴＣ１０２９７ＢＰを受けた。

抗菌ペプチドペディオシン（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）のアミノ酸配列
また、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８菌株の遺伝子塩基配列を分析した結果、１８０万個の塩基対を保有し、１４００個以上の遺伝子で構成されたことが確認されたし、これらの中から抗菌物質生産と関連した遺伝子群（ｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒ）を発見できた。ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８が生産する抗菌ペプチドは、４４個のアミノ酸からなるペディオシン（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）であって、この物質の分泌と関連した４種の蛋白質生産遺伝子（ｐｅｄＡ、ｐｅｄＢ、ｐｅｄＣ、ｐｅｄＤ）が確認された。なるペディオシン（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）のアミノ酸配列は、図４に示した。

乳酸菌ＣＢＴ−８の抗菌領域及び抗菌活性
本発明に係る乳酸菌であるペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８が有している抗菌領域と抗菌活性度を、ペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８の培養濾液を使って各指示菌の培養平板に対する生育阻害活性度を測定することによって確認した結果、下記の表４のような結果が得られた。

前記表４から判るように、本発明のペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８は、食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスと胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリの生育を強力に阻害する。

本発明に係る乳酸菌株を利用して最終応用段階である機能性食品や医薬品として活用するための濃縮された乾燥粉末を形成する段階は、（ａ）乳酸菌ＣＢＴ−８の選抜段階、（ｂ）乳酸菌培養段階、（ｃ）抗菌物質発酵段階、（ｄ）発酵液の濃縮及び乳酸除去段階、及び（ｅ）濃縮液の乾燥粉体化段階に順次的に進行（図４参照）されるが、以下ではこれらそれぞれの段階についてより詳細に説明する。

（ａ）乳酸菌ＣＢＴ−８の選抜段階
指示菌にヘリコバクターピロリを使用し、１０％ウマ血清（Ｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ）が添加されたコロンビア血液倍地（Ｃｏｌｏｍｂｉａｂｌｏｏｄａｇａｒ）平板培地で３７℃、１０％のＣＯ_２条件で培養し、リステリアモノサイトゲネス菌に対してはＡＴＰ培地で３７℃及び通性条件で培養した濾液を使用した生育阻害活性度測定を用いて、それぞれ８００Ａｕ／ｍｌ、８００Ａｕ／ｍｌ以上の抗菌活性を発揮する乳酸菌種を選抜した後、発酵生産培地条件で培養し接種液として使用する。

（ｂ）乳酸菌培養段階
重量比３〜５％範囲のブドウ糖、０．１〜１％範囲の酵母抽出物、１〜１．５％範囲の肉エキス、０．１〜１％範囲の蛋白加水分解物、０．０１〜０．１％範囲のクエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウムなどを含むイオン成分を水に溶解し、嫌気的発酵管で殺菌した後、前記選抜された乳酸菌種を培養する。

（ｃ）抗菌物質発酵段階
抗菌物質発酵工程の経時変化は図５に示し、図５において“Ｌ．ｍ”はリステリアモノサイトゲネスの抗菌活性度を表し、“Ｈ．ｐ”はヘリコバクターピロリの抗菌活性度を区別するための識別子として記載された。図５に示すように、発酵開始の後から１６時間経過する時、胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリに対しては最大１６００Ａｕ／ｍｌの阻害活性を示し、リステリアモノサイトゲネスに対しては１６００Ａｕ／ｍｌの阻害活性を示す抗菌活性物質が生産されることが判る。

（ｄ）発酵液の濃縮及び乳酸除去段階
前記発酵段階を終了した後、発酵液は、１５,０００ＲＰＭ以上の高速遠心分離器や菌体分離用限外濾過器により菌体から分離する。菌体の分離された発酵濾液は、排除分子量１０,０００程度の限外濾過膜（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ）にて１次濾過し、透過液に対して排除分子量１,０００程度のナノメータ濾過膜（Ｎａｎｏｍｅｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）によって分離抽出することによって分子量１,０００〜１０,０００範囲の活性分画だけを捕集して濃縮する。

前記濃縮液に対しては５倍量の無菌水を連続的に加え、ｐＨが６．０以上となるまでダイヤフィルトレーション（Ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して有機酸成分を完全除去し、有機酸が除去された最終濃縮液の体積は、発酵原液に対して１／１０の体積に調節する。発酵液から抗菌物質を分離・捕集し、乳酸除去する工程における抗菌活性物質の経時変化は下記の表５に示し、最終濃縮液の抗菌活性資料は図６に示した。また、図６は本発明に係る乳酸菌であるペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８の培養濃縮液に対する生育阻止環（Ｃｌｅａｒｚｏｎｅ）試験結果を示す写真である。

（ｅ）濃縮液の乾燥粉体化段階
前記濃縮液の重量に対して１〜１０％の乳糖、マルトデキストリン、マンニトール、脱脂粉乳を混合し溶解させ、８０℃の温度条件で攪拌しながら、２回３０分間熱処理することによってその他雑菌及び残存乳酸菌などを殺菌した後、凍結乾燥器に投入して乾燥させたり、あるいは噴射式流動層乾燥器を利用して乾燥した後、乾燥物を粉砕して粉末を製造する。その後、応用製品の用途に応じて追加添加される各種賦形剤及び希釈剤の種類とその添加量などを様々に変形させて使用する。

次に、本発明に係る乳酸菌を活用して胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリ菌と食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネス菌の生育を阻害する抗菌活性物質を製造する方法を実施例に上げてより具体的に説明する。

実施例１
まず、ブドウ糖２５ｋｇ、肉エキス５ｋｇ、酵母抽出物２．５ｋｇ、カゼインペプトン２．５ｋｇ、ソイペプトン２．５ｋｇ、リン酸二カリウム０．２５ｋｇ、クエン酸アンモニウム０．２５ｋｇ、酢酸ナトリウム０．２５ｋｇ、硫酸マグネシウム０．０５ｋｇ、硫酸マンガン０．０５ｋｇを、水５００Ｌに添加して溶解させて８００Ｌ容量の嫌気的発酵管に移送し、１２１℃で１５分間殺菌して常温に冷却した後、あらかじめ培養した種菌１０Ｌを接種して２０時間発酵する。

次いで、前記発酵液を６０Ｌ／ｈの流速で連続式遠心分離器に移送させながら菌体を分離し、培養濾液を排除分子量１０,０００の限外濾過器に通過させて透過液を回収し、再び排除分子量１,０００のナノメータフィルタに通過させて分子量１,０００〜１０,０００範囲の抗菌物質濃縮液を５０Ｌ獲得する。

その後、前記濃縮液に対して再び５倍量の無菌水を連続的に加え、排除分子量１,０００のナノメータフィルタに通過させて透過液と濃縮液を再分離する。この工程で残存有機酸、色素、不溶性成分などが完全に除去され、ヘリコバクターピロリ及びリステリアモノサイトゲネス菌に対して抗菌活性を有する分子量１,０００〜１０,０００範囲の抗菌物質分画が選択的に分離濃縮された。

前記分離濃縮された抗菌物質捕集液は、最終の体積を発酵原液の１／１０水準に濃縮すると、胃炎及び食中毒原因菌に対する抗菌活性もまた１０倍に濃縮される。抗菌物質分離濃縮液の重量に対して５〜５０％の範囲のマンニトール、乳糖などの水溶性賦形剤を使って凍結乾燥または噴射式流動層乾燥して水溶性粉末化する。この時、抗菌活性は、最終の粉末では１,６００〜１６,０００Ａｕ／ｇとなるように希薄比を調整することができる。

以上の本発明に係る乳酸菌株から製造された抗菌物質とその濃縮過程により製造された最終産物である抗菌活性物質は、食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスと胃炎原因菌であるヘリコバクターピロリの生育を強力に阻害し、腸疾患誘発菌であるサルモネラガリナルムとにきび症原因菌であるプロピオニバクテリウムアクネスなどにも同時に抗菌活性を示しているので、これを有害菌の感染予防や治療目的に製造された所定の食品または医薬品に活用でき、場合によっては製造から摂取までの消費過程に相当な期間が所要される食品などにおいて有害菌を遮断する食品保存剤としても活用できることを、下記の実験例１〜３を通じて具体的に調べてみる。

実験例１
本実験例１では本発明に係るペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８生菌と抗菌物質分離乾燥物との二つの試料に対して６週齢のスナネズミ（Ｇｅｒｂｉｌ）を使って病巣感染テスト（ＥＬＩＳＡＴｅｓｔ）を施し、抗体価の変化を観察した。

この時、各実験区は非投与対照区（Ａ群）、感染区（Ｂ群）、経口投与後感染区（Ｃ群）、感染後治療区（Ｄ群）、同時投与区（Ｅ群）の５つの実験区に区分して付着防止及び除菌効果を同時に観察した。実験動物は各実験区別に５匹ずつ構成した。この実験のための実験群は、下記の表６にしたがって構成した。

各実験群に対する期間別抗体価の変化は、下記の表７に示す。

次に、上記の表５及び表６に示したように、実験対照区と各実験区に対して個別的に具体的に進行された実験内容とその結果を説明する。

前記実験例１で、前記対照区（Ａ群）を除く他の実験群（Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ群）では、生菌の経口投与により感染を試みるヘリコバクターピロリ菌の濃度は１０^８細胞（ｃｅｌｌｓ）／０．３ｍｌを使用し、抗菌物質分離乾燥物は、抗菌活性度が５０Ａｕ／０．２ｍｌのものを使用した。

一方、ヘリコバクターピロリ菌の感染は、７日間経口投与後の抗体価を測定して感染を確認し（Ｂ群）、付着防止能を検討するための実験区（Ｃ群）では、抗菌物質分離乾燥物試料を３０日間経口投与後、その投与を中止しヘリコバクターピロリ菌の感染を試みた。

その結果、ヘリコバクターピロリ菌のスナネズミモデルにおけるヘリコバクターピロリ菌を経口投与終了してから約３週経過時に抗体価が３．４以上に上昇して感染が確認され（Ｂ群）、抗菌物質分離乾燥物試料を経口投与した後感染を試みた実験区（Ｃ群）では、抗体価上昇が現れず、付着防止及び感染防御効果があることを確認した。また、感染後の除菌効果を調べるための実験区（Ｄ群）では、３０日間の試料投与終了時点から抗体の減少が発生し始め、３週後には無処理区の対照区（Ａ群）の水準に減少した。そして、ヘリコバクターピロリ菌と抗菌物質分離乾燥物試料を同時に投与した実験区（Ｅ群）でも抗体上昇が発生されず、感染防御効果を確認することができた。

以上の実験から確認したヘリコバクターピロリ菌に対する感染防御（付着防止）及び除菌効果は、乳酸菌生菌試料でも同一傾向を示していることが確認され、結果として、乳酸菌及びその抗菌物質が同時に胃炎の予防と治療効果を発揮できることがわかる。乳酸菌は、胃粘膜上皮細胞に定着しやすい細胞構造を有するのでヘリコバクターピロリ菌の付着地点を競争的に先に占拠したり、胃内に定着及び棲息して抗菌物質などを分泌したりすることによって、ヘリコバクターピロリ菌に対する付着抑制及び除菌効果を呈し、抗菌物質もまた、胃内に残存して同じ効果を呈するので、以上の結果から、乳酸菌及び抗菌物質の単独使用または同時使用によってヘリコバクターピロリ菌に対する感染防御及び胃炎制御効果を発揮できることを確認した。

実験例２
本実験例２は、ヘリコバクターピロリ菌の保菌者に対する尿素呼気試験に関するものであり、胃内視鏡検査、尿素分解酵素（ｒａｐｉｄｕｒｅａｓｅ）検査、１３Ｃ−尿素呼気検査によってヘリコバクターピロリ菌の感染が確認され、少なくとも１ケ月以降の薬物治療履歴がなく、肝、胆道、膵臓系の慢性疾患者でない成人男女４０人を対象にして身体におけるヘリコバクターピロリ菌の除菌効果を検討した。

前記実験例２で利用される経口投与試料は、ペディオコッカスペントサセウスＣＢＴ−８生菌１０^１０個と抗菌活性が１０,０００Ａｕ／ｍｌである抗菌物質が含まれたパック（Ｐａｃｋ）を１日２回ずつ４週間服用させたし、試料服用前と後における１３Ｃ−尿素呼気検査によるＤＯＢ３０の数値を観察し、それを図７に示した。全ての測定値は、データベース統計プログラム（Ｄｂｓｔａｔｐｒｏｇｒａｍ）を利用して統計処理したし、一対ｔ−テスト（ｐａｉｒｅｄｔ−ｔｅｓｔ）を用いてｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意するものと判定した。その結果、試料服用の前と後の１３Ｃ−尿素呼気検査によるＤＯＢ３０の数値は平均２６から１５．３に減少して約４２％の減少が観察され（図７参照）、除菌作用が進行されていることが判明し、特別な副作用はないことが確認された。また、動物実験及び生体内実験（ｉｎ−ｖｉｖｏ）タイプの臨床実験結果からも、付着防止（感染防御による胃炎予防）及び治療効果（除菌作用による病症改善）が有意に確認された。

実験例３
本実験例３では、常用している乳製品の一つであるチーズにおけるリステリアモノサイトゲネスに対する除菌効果を検討するために、ヨーロッパ産（フランス産とイタリア産）チーズの表面にリステリアモノサイトゲネス１０^４／ｇ程度を人為的に汚染させ、本発明に係る抗菌物質濃縮粉体（商品名:１％ＳＡＦＥＬＡＣ、（株）セルバイオテク社製）溶液をチーズ表面に均一に噴霧した後、常温（２５℃）と冷蔵温度（４℃）下にそれぞれ放置しながら生菌数の変化を観察した。

この時、対照区としてはリステリアモノサイトゲネスを汚染させた後に前記抗菌物質濃縮粉体溶液で処理しなかったものを使用した。前記実験例３で使用されたチーズは２種類であって、その一つはフランス産チーズで、もう一つはイタリア産チーズだった、その結果をそれぞれ下記の表８に示した。

本実験例３における対照区１及び２の場合、常温条件ではリステリアモノサイトゲネスが実験期間中継続して増殖して１００倍程増殖し、冷蔵条件では増殖しなかったが生存状態を保持した。一方、抗菌物質濃縮粉体溶液を処理した実験区１及び２では、温度条件に関係なくリステリアモノサイトゲネスが益々減少して結果として死滅する傾向を示していることが確認された。したがって、製造及び流通期間中リステリアモノサイトゲネスによる汚染発生可能性の高い食品に対して、本発明に係る抗菌物質濃縮粉体溶液を食品保存剤として使用できることが確認された。

実施例２：ＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓＣＢＴ−８菌抗菌物質濃縮乾燥物を利用した機能性食品の製造
混合乳酸菌１３．３５％、無水結晶ブドウ糖３４．５％、オレンジ味８％、ＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓＣＢＴ−８菌抗菌物質濃縮乾燥物６％、ビタミンＣ２％、ステアリン酸マグネシウム０.１％、ＦＯＳ（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）１２％、フェルミザイム（Ｆｅｒｍｉｚｙｍｅ）０．１５％、アロエ１．４％、植物性粉末クリーム２％及び純水２２．５％を混合して胃腸及び腸機能の改善と病原菌の感染防止及び除菌を目的とする機能性食品を製造した。

以上で、本発明の最適実施例が開示された。ここでは特定の用語が使用されたが、これは単に当業者に本発明を詳細に説明するための目的で使用されたものであり、意味限定や特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するために使用されたわけではない。

本発明に係る乳酸菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を示す。本発明に係る遺伝学的同定を調べるためハイブリダイゼーション結果図である。本発明に係る乳酸菌株の発生学的系譜図である。本発明に係る乳酸菌株が生産する抗菌物質のアミノ酸配列を示す。本発明に係る抗菌活性物質の製造流れ図である。本発明に係る抗菌活性物質の発酵工程の経時変化グラフである。本発明に係る抗菌活性物質の生育阻止環試験結果を示す写真である。本発明に係る抗菌活性物質のＤＯＢ数値低下効果を示すグラフである。

Claims

ヘリコバクターピロリ菌に対する生育抑制能とリステリアモノサイトゲネス菌に対する生育抑制能を持つ抗菌活性物質を生産することを特徴とするペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株（菌株寄託番号ＫＣＴＣ第１０２９７ＢＰ号）。
ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株を利用してヘリコバクターピロリ菌とリステリアモノサイトゲネス菌の両方に抗菌活性を持つ抗菌活性物質を製造する方法において、
（ａ）ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株を用意する段階；
（ｂ）前記用意した乳酸菌の重量に対して３〜５重量％のブドウ糖、０．１〜１重量％の酵母抽出物、１〜１．５重量％の肉エキス、０．１〜１重量％の蛋白質加水分解物、０．０１〜０．１重量％のクエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウムのうち選択された一つ以上のイオン結合性化合物を添加して水に溶解させる段階；
（ｃ）前記添加物が含まれた水溶液を殺菌する段階；及び
（ｄ）前記殺菌された水溶液に、前記（ａ）段階で用意した乳酸菌株を投入して嫌気的発酵管で培養する段階；を含めてなることを特徴とする抗菌物質製造方法。
前記（ｄ）段階の後に、前記製造された抗菌物質に対して高速遠心分離または濾過装置を利用して濃縮を行う段階をさらに含めてなることを特徴とする請求項２に記載の抗菌物質製造方法。
前記濾過装置を利用して濃縮する段階は、第１濾過段階では最大排除分子量を超過する物質を除去し、第２濾過段階では最小排除分子量未満の物質を連続して除去して所定範囲の分子量を持つ抗菌物質だけを濃縮する２段濾過方法で行うことを特徴とする請求項３に記載の抗菌物質製造方法。
前記濃縮段階の結果物である抗菌物質濃縮液に対して凍結乾燥方式または噴射式流動層乾燥方法によって乾燥を行う段階をさらに含めてなることを特徴とする請求項３に記載の抗菌物質製造方法。
ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株を利用した乳酸菌生菌剤。
食品にペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株から生産されるヘリコバクターピロリ菌及びリステリアモノサイトゲネスに対する抗菌特性を持つ抗菌物質を添加することを特徴とする抗菌物質利用方法。
医薬品にペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８の乳酸菌株から生産されるヘリコバクターピロリ菌及びリステリアモノサイトゲネスに対する抗菌特性を持つ抗菌物質を添加することを特徴とする抗菌物質利用方法。