CN116376896A - 一种提取血浆游离dna的试剂盒、制备方法及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法，包括：1．蛋白酶K：血浆样本中与蛋白酶K的质量/体积比为5：1‑10：1，蛋白酶K的浓度范围为10mg/mL‑30mg/mL；裂解缓冲液：1‑4.5M异硫氰酸胍、1‑6mM EDTA、20‑150mM Tris‑HCl、0.05%‑20%NP40，pH为4‑6；结合缓冲液：1‑4M异硫氰酸胍、1‑3M盐酸胍、20‑150mM Tris‑HCl、1‑6mM EDTA、0.05%‑30% Tween20、10%‑30% PEG 8000、10%‑35%异丙醇，pH为4‑6；漂洗缓冲液1：1‑3M盐酸胍、20‑150mM Tris‑HCl、0.05%‑30% Tween20、10%‑35%无水乙醇，pH为5‑7；漂洗缓冲液2：20‑150mM Tris‑HCl、1‑6mM EDTA、30%‑60%无水乙醇，pH为5‑8；洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。本发明操作简单快速，可进行微量提取，提取核酸纯度高，不含检测抑制剂，成本低。

Description

一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及了一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法。
背景技术
游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是一种血液或体液中游离于细胞之外的DNA。1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA进入血浆，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)，来源于胎儿的cfDNA等。1994年，Vasioukhin等和Sorenson等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血ctDNA中发现了RAS基因的突变，表明可以利用ctDNA发现肿瘤的特异性基因突变。随着新的研究结果的不断出现，cfDNA用于疾病早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。检测血浆或血清中cfDNA可视为一种"液体活检"，有利于开展各种相关诊断，并能避免有创的组织活检。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。
目前cfDNA检测对方法学要求极高，虽然目前cfDNA的检测方法都具有很高的敏感度和特异度，但是仍存在一些和传统病理学或细胞遗传学检测结果不一致的情况。由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果所以，优化提取和检测的方法，进一步提高检测cfDNA方法的灵敏度和特异性，缩短检测的时间，降低检测的成本，同时实现检测方法之间的标准化，都是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种粪便样本DNA核酸提取试剂盒，试剂盒主要包括以下组分：蛋白酶K、裂解缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、洗脱缓冲液。
蛋白酶K：
蛋白酶K属于丝氨酸蛋白酶SB超家族中的S8家族，由一条肽链组成，具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。蛋白酶K在pH 4-12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37-65℃。
蛋白酶K血浆样本中与蛋白酶K的质量/体积比为5：1-10：1，蛋白酶K的浓度范围为10mg/mL-30mg/mL。
优选的，待处理样本与蛋白酶K的体积比为10：1，所述蛋白酶K的浓度范围为20mg/mL。
裂解缓冲液：
裂解缓冲液包括：1-4.5M异硫氰酸胍、1-6mM EDTA、20-150mM Tris-HCl、0.05％-20％NP40，pH为4-6。
优选的，裂解缓冲液中的成分含量为：4M异硫氰酸胍，6mM EDTA，100mM Tris-HCl，10％ NP40，裂解液的pH为5.5。
本发明提供的裂解缓冲液在裂解血浆样本时，使样品中的核酸游离在裂解体系中，促进核酸与蛋白分离，从而释放核酸。
具体原理介绍如下：
异硫氰酸胍：白色结晶性粉末，异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，无RNA酶和DNA酶活性。在核酸提取中，异硫氰酸胍能够迅速破碎细胞或病毒释放核酸，抑制细胞释放出的核酸酶，保证核酸一级结构的完整性。
EDTA：即乙二胺四乙酸，其能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。
Tris-HCl：有助于在细胞裂解和提取过程中保持pH稳定，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利氢键的保持，防止核酸被破坏。
NP40：是一种温和的非离子型去垢剂，1％浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解从而释放核酸。
结合缓冲液
结合缓冲液，包括：1-4M异硫氰酸胍、1-3M盐酸胍、20-150mM Tris-HCl、1-6mMEDTA、0.05％-30％ Tween20、10％-30％ PEG 8000、10％-35％异丙醇，pH为4-8。
优选的，结合缓冲液中的成分含量为：4M异硫氰酸胍，2M盐酸胍，100m Tris-HCl，4mMEDTA，0.10％Tween20，10％PEG 8000，30％异丙醇，其pH为7.5。
具体原理介绍如下：
盐酸胍：是核酸酶的强抑制剂，但并不是强变性剂，它在核酸提取中的主要作用是使蛋白质变性并抑制酶活性。盐酸胍能够快速破坏细胞膜，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。
Tween20(吐温)：为非离子型表面活性剂，用来破坏细胞膜(裂解细胞)以释放细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接，使蛋白质发生结构上的变性，去除与核酸相互作用的蛋白质。
PEG 8000(聚氧乙烯8000)：在空气中易发生氧化降解，需尽量避免将其暴露在空气和或高温环境，活化后可以结合多肽或蛋白质，用于沉淀蛋白，原理是通过空间位置排斥，使蛋白质被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。
异丙醇：能够夺取RNA/DNA周围的水分，因此RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。
漂洗缓冲液1
漂洗缓冲液1，包括：1-3M盐酸胍、20-150mM Tris-HCl、0.05％-30％ Tween20、10％-35％无水乙醇，pH为5-8。
优选的，漂洗缓冲液1的组成成分为：2M盐酸胍，50mM Tris-HCl，10％ Tween20，35％乙醇，pH为8.0。
漂洗缓冲液2
漂洗缓冲液2，包括：20-150mMTris-HCl、1-6mMEDTA、30％-60％无水乙醇，pH为5-8。
优选的，漂洗缓冲液2的组成成分为：100mM Tris-HCl，4mM EDTA，60％乙醇，pH8.0。用于洗去残留的盐离子和胍盐，以免对核酸提取后的后续分子生物学实验产生不利影响。
洗脱缓冲液
洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。
第二方面，本发明提供一种提取血浆游离DNA的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
A.获取蛋白酶K；
B.裂解缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA和NP40，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至4-6；
C.结合缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、盐酸胍、Tris-HCl、EDTA、PEG 8000、异丙醇和Tween-20，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至4-8。
D.漂洗缓冲液1制备：在去离子水中加入所述盐酸胍，Tris-HCl、Tween20，无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至5-8。
E.漂洗缓冲液2制备：在去离子水中加入所述Tris-HCl、EDTA和无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至5-8。
F.洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。
第三方面。本发明提供一种提取血浆游离DNA的试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
A.样本裂解
血浆或样本：向离心管(自备)中加入1ml血清/血浆样本，若样本不足1ml，加入PBS溶液补至1ml体积，向以上溶液中加入100ul蛋白酶K，混匀，加入800ul裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒；
B.吸附结合
60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀，加入1800ul结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒，冰浴5分钟，正确连接负压装置，将连接管插到负压装置的插口上，将吸附柱***到连接管上，将延伸管***开盖的吸附柱中，将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900～-800mbar，缓慢吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0mbar时，小心移去延伸管；
C.漂洗
向吸附柱中加入500ul漂洗缓冲液1,开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750ul漂洗缓冲液2，开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750ul无水乙醇，开启并调节负压至-800～-900mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；当压力恢复至0mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管中，12,000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液；
D.洗脱
将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150ul洗脱缓冲液，室温放置3分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
与现有技术比，本发明达到的有益效果是：
(1)操作简单快速，可进行微量提取：试剂盒可与负压装置匹配使用，其操作简便，省去传统的离心步骤，直接利用负压装置抽提，能够快速高效提取血浆中的游离核酸，使得利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量。
(2)提取核酸纯度高，不含检测抑制剂：提取的核酸不含核酸酶及检测抑制剂，DNA保存时间长，后续运用于PCR、荧光定量PCR和二代测序等分子生物学实验，利于血浆样本核酸的保存和检测。
(3)成本低：试剂盒所有组分均为自主研发，并实现了量产，成本低，可满足分子生物学多领域研究和应用，具有广泛的应用前景和市场推广价值。
附图说明
图1为本发明提取试剂不同批次吸附柱富集效果图；
图2为本发明不同批次提取试剂提取效果图；
图3为本发明实验组试剂盒(康为)与对比组(凯杰)提取cfDNA浓度对比图；
图4为本发明实验组试剂盒(康为)与对比组(凯杰)提取cfDNA荧光定量对比图；
图5为本发明实验组试剂盒(康为)与对比组(凯杰)文库对比图；
图6为本发明实验组试剂盒(康为)与对比组(凯杰)测序mapped对比图；
图7为本发明实验组试剂盒(康为)与对比组(凯杰)测序rmdup对比图；
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。
实施例1.
本实施例提供一种血浆样本DNA核酸提取试剂盒及制备方法。该试剂盒包括蛋白酶K、裂解缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、洗脱缓冲液。
本实施例中，试剂盒各试剂组分如下：
蛋白酶K为20mg/mL；
裂解缓冲液：1-4.5M异硫氰酸胍、1-6mM EDT、20-150mM Tris-HCl 0.05％-20％NP40，pH为5.5；
结合缓冲液：4M异硫氰酸、2M盐酸胍、100m Tris-HCl、4mM EDTA、0.10％Tween20、10％PEG 8000、30％异丙醇，其pH为7.5；
漂洗缓冲液1：2M盐酸胍、50mM Tris-HCl、10％ Tween20、35％乙醇，pH为8.0；
漂洗缓冲液2：100mM Tris-HCl、4mM EDTA、60％乙醇，pH为8.0；
洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。
实施例2.血浆样本DNA提取方法(柱式法提取)
采用实施例1中制备的血浆提取试剂盒试剂进行血浆样本DNA核酸提取。
柱式法提取具体步骤如下：
1.样本裂解
血浆或样本：向离心管(自备)中加入1ml血清/血浆样本，若样本不足1ml，加入PBS溶液补至1ml体积。向以上溶液中加入100ul蛋白酶K，混匀。加入800ul裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒。
2.吸附结合
60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。加入1800ul结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡
15-30秒。冰浴5分钟。正确连接负压装置，将连接管插到负压装置的插口上。将吸附柱***到连接管上。将延伸管***开盖的吸附柱中。将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900～-800mbar，缓慢吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0mbar时，小心移去延伸管。
3.漂洗
向吸附柱中加入500ul漂洗缓冲液1,开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。向吸附柱中加入750ul漂洗缓冲液2，开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。向吸附柱中加入750ul无水乙醇，开启并调节负压至-800～-900mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。当压力恢复至0mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管中，12,000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液。
4.洗脱
将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150ul洗脱缓冲液，室温放置3分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
实施例3.测试不同吸附柱提取效果
实验材料：血浆样本；实施例1中制备的血浆样本提取试剂，其中吸附柱分别选用国产吸附柱1、国产吸附柱2和进口吸附柱
实验方法：取4等份(各1ml)新鲜血浆样本分装于干净的离心管中，分别加入100μl蛋白酶K，混匀，加入800μl裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒。60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。加入1800μl结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒。冰浴5分钟后连接负压装置，使用三种吸附柱进行核酸吸附，漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、无水乙醇分别进行漂洗后进行离心晾干，加入洗脱缓冲液洗脱。
4份样本分为三组，分别进行三种提取处理：(国产吸附柱组1)其中4份采用江苏康为世纪的国产吸附柱进行提取；(国产吸附柱组2)4份血浆样本采用美基生物的国产吸附柱进行提取；(进口吸附柱组)4份血浆样本采用thermo的吸附柱进行提取。
提取后的DNA使用Qubit2.0检测核酸样本浓度，结果如表1所示，国产吸附柱组提取效果基本相当，使用进口吸附柱提取组提取的核酸浓度略高。
表1.不同吸附柱提取效果比较
Figure BDA0004143827290000071
Figure BDA0004143827290000081
实施例4.测试不同批次试剂提取效果
实验材料：血浆样本；实施例1中制备的血浆样本提取试剂(不同批次)，其中吸附柱选用国产吸附柱1
实验方法：样本采取标准DNA Marker混合血清，使用两个生产批次的国产吸附柱1、提取试剂进行DNA富集分离。使用Qsep100TM全自动核酸蛋白分析***进行两个批次间的比较。不同批次间的富集分离结果高度一致。如图1和图2所示。
实施例5.血浆样本提取试剂盒提取能力测试
实验材料：3个志愿者提供的血浆样本。
实验组试剂：实施例1中制备的血浆样本提取试剂(采用国产康为吸附柱)
对比组试剂：凯杰游离核酸提取试剂盒(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)./ID:55114)
实验方法：将3个志愿者提供的血浆样本保存于血浆游离DNA保存管中(康为世纪，货号CWY055)
(A)实验组试剂-负压装置提取组：分别取两份新鲜血浆样本分装于干净的离心管中，分别进行5ml/8ml提取，
5ml提取：加入1ml蛋白酶K，混匀，加入4ml裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒。60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。加入9ml结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒。冰浴5分钟后连接负压装置，使用三种吸附柱进行核酸吸附，漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、无水乙醇分别进行漂洗后进行离心晾干，加入洗脱缓冲液洗脱。
8ml提取：加入1.6ml蛋白酶K，混匀，加入6.4ml裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒。60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。加入14.4ml结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒。冰浴5分钟后连接负压装置，使用三种吸附柱进行核酸吸附，漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、无水乙醇分别进行漂洗后进行离心晾干，加入洗脱缓冲液洗脱。
(B)对比组试剂-负压装置提取组：分别取两份新鲜血浆样本分装于干净的离心管中，分别进行5ml/8ml提取，采用凯杰的游离DNA提取试剂盒(目录号55114)按照说明书操作提取。
提取后的核酸用Qubit2.0进行DNA浓度检测，实验结果如表2所示，实验组-负压装置提取组和对比组-负压装置提取组相比，提取浓度略优，如图3所示。
后续荧光定量PCR检测KTB引物，实验组-负压装置提取组和对比组-负压装置提取组相比，实验结果如表3所示，实验组CT值略低，如图4所示。
提取完成后使用CW3045S/CW3026S康为建库提取试剂盒进行文库构建，投入用量20ul,华大MGI平台测序，表4为文库构建后Qubit2.0所测文库浓度，如图5所示，实验组提取试剂出库浓度略优于对比组提取试剂，测序结果mapped、rmdup数值也略优，如图6和图7所示。
而本实施例提供的实验组血浆核酸提取试剂和方法采用的柱式法，提取浓度相对较高，并且PCR检测Ct值略低，出库浓度略高，可以更好地满足后续核酸检测实验要求。
表2.血浆提取试剂盒提取浓度
Figure BDA0004143827290000101
表3.血浆提取试剂盒提取荧光定量对比
Figure BDA0004143827290000102
表4.血浆提取试剂盒提取文库对比
Figure BDA0004143827290000103
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于包括：蛋白酶K：血浆样本中与蛋白酶K的质量/体积比为5：1-10：1，蛋白酶K的浓度范围为10mg/mL-30mg/mL；裂解缓冲液：1-4.5M异硫氰酸胍、1-6mM EDTA、20-150mM Tris-HCl、0.05%-20%NP40，pH为4-6；结合缓冲液：1-4M异硫氰酸胍、1-3M盐酸胍、20-150mM Tris-HCl、1-6mM EDTA、0.05%-30% Tween20、10%-30%PEG 8000、10%-35%异丙醇，pH为4-8；漂洗缓冲液1：1-3M盐酸胍、20-150mM Tris-HCl、0.05%-30% Tween20、10%-35%无水乙醇，pH为5-8；漂洗缓冲液2：20-150mM Tris-HCl、1-6mMEDTA、30%-60%无水乙醇，pH为5-8；洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。
2.一种提取血浆游离DNA的试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A.获取蛋白酶K；
B.裂解缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA和NP40，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至4-6；
C.结合缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、盐酸胍、Tris-HCl、EDTA、PEG8000、异丙醇和Tween-20，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至4-8；
D.漂洗缓冲液1制备：在去离子水中加入所述盐酸胍，Tris-HCl、Tween20，无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至5-8；
E.漂洗缓冲液2制备：在去离子水中加入所述Tris-HCl、EDTA和无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至5-8；
F.洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。
3.一种提取血浆游离DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
A. 样本裂解
血浆或样本：向离心管（自备）中加入1 ml血清/血浆样本，若样本不足1 ml，加入PBS溶液补至1 ml体积，向以上溶液中加入100ul蛋白酶K，混匀，加入800ul裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒；
B.吸附结合
60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀，加入1800ul结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒，冰浴5分钟，正确连接负压装置，将连接管插到负压装置的插口上，将吸附柱***到连接管上，将延伸管***开盖的吸附柱中，将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900~-800 mbar，缓慢吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0 mbar时，小心移去延伸管；
C.漂洗
向吸附柱中加入500ul漂洗缓冲液1, 开启并调节负压至-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750 ul漂洗缓冲液2，开启并调节负压至-900~-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750ul无水乙醇，开启并调节负压至-800~-900 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；当压力恢复至0 mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管中， 12,000 rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液；
D. 洗脱
将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于新的1.5 ml离心管（CentrifugeTube）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150 ul洗脱缓冲液，室温放置3分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
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