JP2009133740A - イムノクロマトグラフィー用試験片 - Google Patents

Abstract

【解決課題】 検出感度を低下させること無く、種々の非特異因子に起因する非特異的反応を抑えることができるイムノクロマトグラフィー用試験片を提供すること。
【解決手段】 本発明は、少なくとも、被検出物と特異的に反応する特異的結合物が担持された不溶性担体と、メンブラン上に固定された被検出物と特異的に反応する特異的結合物から成るイムノクロマトグラフィー用試験片において、
前記不溶性担体が牛血清アルブミンでブロッキングされ、かつ、前記メンブランがカゼインでブロッキングされてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験片である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、イムノクロマトグラフィー分析に供するイムノクロマトグラフィー用キットを構成する試験片に関する。

抗原抗体反応の特異性を利用して試料中の被検物質を免疫学的に検出又は定量する免疫学的分析方法として、放射線免疫測定方法、酵素免疫測定法、凝集法など種々の測定法が用いられている。イムノクロマトグラフィー法は、毛細管現象によるメンブランを使用した検査方法であり、検出感度が高く、操作も簡単であるため、検査の迅速性を要するインフルエンザウィルス抗原特定検査、外来検査等での迅速な判定が求められる前立腺癌等の判定に用いられている。また、こうした医家向け以外にも、妊娠診断試薬等、一般ユーザー向けの診断試薬キットとしても使用されている。

以下に、インフルエンザウィルス抗原検出検査法を例にして、イムノクロマトグラフィーの原理を説明する。抗原抽出液に懸濁した検体を固相支持体の試料添加部に添加すると、不溶性担体保持部の抗体感作金コロイドが検体中のインフルエンザウィルス抗原と免疫複合体を形成する。この免疫複合体は、毛細管現象により固相支持体上を移動し、支持体上の各保持部分で固定された抗インフルエンザウィルス抗体に捕捉され、赤色を呈する。この赤色が目視で確認された場合は、試料中にインフルエンザウィルス抗原が存在することが認定できる。また、未反応の抗体感作金コロイドは、金コロイドに感作されている抗体と反応する抗体に捕捉され、赤色を呈する。これによって、反応が正常に進んだことがわかる。このようにイムノクロマトグラフィーによる検出は、検出方法が簡単で、大がかりな装置を必要としないので広く用いられている。

ところで、イムノクロマトグラフィー装置試験片では、試料中に混在する蛋白質等の非特異因子の吸着のため、被検物質が存在しない場合にも検出部位の発色が発生するという問題がある。この非特異的吸着（非特異的反応ともいう）は、検出時のＳ／Ｎを下げるばかりでなく、偽陽性の原因にもなりうる。こういった現状から測定感度を下げることなく非特異的吸着を抑えたイムノクロマトグラフィー装置の開発が望まれている。

かかる従来からの問題点であった非特異物質による発色を抑えるための方法として、例えば、ブロッキング剤として、タンニン（特許文献１参照）やアミノ酸類を配合（特許文献２参照）したイムノクロマトグラフィー装置が提案されている。

特開平０６−２８９０２５号公報 特開２００１−２８９８５２号公報

特許文献１に開示の発明は、タンニンを測定系に配合して、溶血が進んだ血液や潜血が存在する尿測定の際に非特異反応を抑えるものであり、非特異反応物質が、溶血ヘモグロビンである場合に限定されたものである。また、特許文献２に開示の発明は、展開剤中に両極性物質であるアミノ酸類を配合したものである。この発明は、非特異発色の一因である、不溶性担体と固相化抗体（抗原）との静電相互作用を抑えて、偽陽性反応を防止しようとするものである。しかしながら、非特異因子を充分に吸収できる量までアミノ酸を添加した場合に検出感度が低下してしまうといった問題があった。

本発明は、上記に鑑み、検出感度を低下させること無く、種々の非特異因子に起因する非特異的反応を抑えることができるイムノクロマトグラフィー用試験片を提供することを目的とする。

本発明者等は、鋭意検討を行い、検出系を構成する標識物質及びクロマト膜の各々に最適なブロッキング剤を適用することで、非特異物質の吸着による非特異反応を検出感度の低下を招くことなく達成できることを見出し本発明に想到した。

即ち、本発明は、少なくとも、被検出物と特異的に反応する特異的結合物が担持された不溶性担体と、メンブラン上に固定された被検出物と特異的に反応する特異的結合物から成るイムノクロマトグラフィー用試験片において、前記不溶性担体が牛血清アルブミンでブロッキングされ、かつ、前記メンブランがカゼインでブロッキングされてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験片である。

非特異物質の吸着を抑制する手段として、ブロッキング剤を適用すること自体は、上記背景技術からみても公知であるが、本発明は、一つの試験片に対して異なるブロッキング剤を適用するものであり、また、不溶性担体には牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）のみを、クロマト膜にはカゼインのみを選択し適用部位に応じた最適なブロッキング剤を明示するものである。このようにすることで、非特異物質の吸着を抑制し、検出感度を最大限に増大させている。

この点、メンブランだけをブロッキングした場合には、条件によっては被検出物と特異的に反応する特異的結合物が担持された不溶性担体の非特異的吸着が生じることがある。非特異的吸着に関係するのはメンブランだけではなく、特異的結合物が担持された不溶性担体側にも原因があるので、該不溶性担体表面もブロッキングすることにより、確実に非特異的吸着を防止することができる。また、不溶性担体側をカゼインでブロックし、メンブラン側をＢＳＡでブロックした、逆の形態にしても検出感度は低下する。更に、ＢＳＡとＢＳＡの組み合わせ、カゼインとカゼインの組み合わせのような同じブロッキング剤を組み合わせでも良好な感度は得られない。

以下、本発明に係るイムノクロマトグラフィー用試験片の構成について説明する。本発明において、「被検出物」とは、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）等の特異的な反応により、特異的結合物と複合体を形成し得るものであれば特に制限されない。例えば、細菌由来の抗原、ウイルス由来の抗原、あるいは腫瘍マーカー抗原等が挙げられる。

被検出物と結合する、不溶性担体に担持された特異的結合物は、被検出物と、抗体抗原反応等の特異的な反応により結合する物質であればよく、例えば、抗原、ハプテン、抗体等が挙げられる。本発明においては、特異的結合物は、抗原、抗体などの免疫化学的成分が好ましい。抗原としては、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）等の腫瘍マーカー、アデノウイルス、インフルエンザウィルス、Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルス由来蛋白質、β２−ミクログロブリン、ヒトアルブミン、ヒトヘモグロビン等の血液由来たん白質等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでも良く、また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良い。具体的には、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体、抗β２−ミクログロブリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒトヘモグロビン抗体等が挙げられる。１種類の抗原に対して使用する抗体は１種類以上であれば良いが、抗原認識部位が異なる２種類の抗体を用いることがより好ましい。また、被検出物は１種類に限定されず、２種類以上であっても良い。

不溶性担体としては、その表面上に特異的結合物及びＢＳＡを固定することができればよく、例えば、金コロイド等の金属コロイド、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等の不溶性粒状物質等が挙げられるが、金属コロイド、特に金コロイドが好ましい。金コロイドを不溶性担体として使用する場合、その粒径は、特異的結合物やＢＳＡ等の固定性、不溶性担体の分散性、イムノクロマトグラフィー用試験片とした時の試薬感度等の観点から、好ましくは１００ｎｍ以下であり、特異的結合物やＢＳＡを不溶性担体に担持する時の精製の容易性の観点から、好ましくは１０ｎｍ以上である。

ここで、不溶性担体のブロッキング剤であるＢＳＡの好適な添加量は、不溶性担体の表面積１ｃｍ^２当たり０．０１〜５０ｍｇであり、好ましくは、０．０１〜５ｍｇである。０．０１ｍｇ未満であると、試料中に混在する成分が不溶性担体に非特異的に吸着し、偽陽性化を起こしやすく、５０ｍｇを超えると、イムノクロマトグラフィー用試験片とした時の試薬感度が低下し、所望の効果が得られないと考えられる。

一方、メンブランは、毛細管現象により試料検体を吸収し流動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。

メンブランをブロッキングするブロッキング剤であるカゼインの配合量は、クロマト膜の表面積１ｃｍ^２当たり０．１〜１００ｍｇであり、好ましくは、０．１〜２０ｍｇである。０．１ｍｇ未満であると、試料中に混在する成分や特異的結合物が担持された不溶性担体がメンブランに非特異的に吸着し、偽陽性化を起こしやすく、１００ｍｇを超えると、イムノクロマトグラフィー用試験片とした時の試薬感度が低下する。

本発明において各部位にブロッキングを行う方法としては、不溶性担体のブロッキングについては、特異的結合物を不溶性担体に担持した後に行えばよい。特異的結合物の担持は、不溶性担体の溶液（懸濁液）に、特異的結合物（抗体、抗原）を添加して、特定の時間、攪拌または静置して不溶性担体に特異的結合物を吸着させるものであるが、特異的結合物の不溶性担体への担持後、溶液系にＢＳＡ溶液（例えば、ＢＳＡを含むリン酸緩衝液）を添加することで、不溶性担体がＢＳＡでブロッキングされた特異的結合物の懸濁液を得ることができる。あるいは、特異的結合物の不溶性担体への担持後、遠心分離を行い、不溶性担体に担持されていない特異的結合物を除去した後に、ＢＳＡ溶液（例えば、ＢＳＡを含むリン酸緩衝液）を添加することで、不溶性担体がＢＳＡでブロッキングされた特異的結合物の懸濁液を得ることができる。そして、試験片の作製においては、これをクロマトグラフィー媒体上に滴下、乾燥させるか、又は、適宜のパッドに懸濁液を塗布、乾燥させたものをクロマトグラフィー媒体に貼り着ければ良い。

また、メンブランのブロッキングについては、メンブランをカゼイン溶液（例えば、カゼインを含むリン酸緩衝液）に浸漬し乾燥させることで可能である。カゼイン溶液に浸漬後、界面活性剤を含む緩衝液等で洗浄しても良い。カゼインの添加量は、カゼイン溶液の濃度及び浸漬時間により調整できる。

尚、イムノクロマトグラフィー用試験片においては、特異的結合物が固定された不溶性担体が保持された不溶性担体保持部の他、被検出物−特異的結合物複合体を捕捉するための特異的結合物が固定されている判定部（テストライン）や、判定部を通過した不溶性担体を捕捉する吸収部等から成る。また、試験片基材であるイムノクロマトグラフィー媒体には、通常、水溶液を吸収しないバッキングシートが用いられる。

以上説明したように、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験片は、ブロッキング剤として、不溶性担体側にＢＳＡを用い、メンブラン側にカゼインを用いて、不溶性担体とメンブランの両方をブロッキングすることにより、検出感度の低下を招くことなく非特異的吸着を抑制できる。

以下に、本発明の好適な実施例を比較例と共に説明する。

〔実施例１〕
試験片の作製：以下の手順で、イムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。

Ａ．メンブランのブロッキング及び判定部の作製
メンブランとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５重量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにマウス由来抗ＰＳＡモノクローナル抗体を希釈した。この溶液１５０μLをメンブラン上に３００ｍｍ×１ｍｍとなるように塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。乾燥後、０．５重量％のカゼイン（和光純薬工業社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｌに室温で３０分間浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で一晩乾燥させた。尚、このときのブロッキング剤の添加量は、メンブランの表面積１ｃｍ^２当たり６．７ｍｇであった。

Ｂ．不溶性担体への抗体の担持、ブロッキング及び標識固定部の作製
金コロイド分散液（田中貴金属工業社製：Ａｕコロイド溶液−ＬＣ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈したマウス由来抗ＰＳＡモノクローナル抗体を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１０重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で抗ＰＳＡモノクローナル抗体を金コロイドで標識した標識物質を作製した。次に、この標識物質溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、不溶性担体保持部を作製した。このときのブロッキング剤の添加量は、ＢＳＡの添加量として、金コロイドの表面積１ｃｍ^２当たり０．５ｍｇであった。

Ｃ．試験片の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、上記で作製した判定部を有するメンブラン、溶性担体保持部、試料添加部であるサンプルパッド、展開した試料や不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片とした。

検出感度の測定試験
上記のように作製した実施例1のイムノクロマトグラフィー用試験片に関し、その検出感度を比較検討した。検出に当たって、１％ＢＳＡ、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を混合した展開液を作製し、これに被検物質（ＰＳＡ）濃度の異なる複数の試料を１００μＬずつ混合し、複数の展開液を調製した。そして、ＰＳＡ濃度の異なる展開液を試験片の試料添加に滴下して展開させ、１５分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「−」とした。表１に結果を示す。

〔実施例２〕
実施例１でメンブランをブロッキングするカゼインの濃度を１．５％にし、金コロイドをブロッキングするＢＳＡの量を２ｍｌにしたこと以外は、実施例１と同様の方法でイムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。このときのメンブランへのブロッキング剤の添加量はメンブラン１ｃｍ^２当たり２０．１ｍｇであり、金コロイドへのブロッキング剤の添加量は金コロイド１ｃｍ^２当たり１０ｍｇであった。検出感度の測定試験および判定は実施例１と同様の方法で行った。結果を表１に示した。

〔実施例３〕
実施例１でメンブランをブロッキングするカゼインの濃度を０．０５％にし、金コロイドをブロッキングするＢＳＡの濃度を１％にしたこと以外は、実施例１と同様の方法でイムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。このときのメンブランへのブロッキング剤の添加量はメンブラン１ｃｍ^２当たり０．７ｍｇであり、金コロイドへのブロッキング剤の添加量は金コロイド１ｃｍ^２当たり０．０５ｍｇであった。検出感度の測定試験および判定は実施例１と同様の方法で行った。結果を表１に示した。

〔実施例４〕
実施例１で、メンブランをブロッキングするカゼインの濃度を５％にしたこと以外は、実施例１と同様の方法でイムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。このときのメンブランへのブロッキング剤の添加量はメンブラン１ｃｍ^２当たり６７ｍｇであった（金コロイドへのブロッキング剤の添加量は実施例１と同じである）。検出感度の測定試験および判定は実施例１と同様の方法で行った。結果を表１に示した。

〔比較例〕
実施例におけるメンブランのブロッキング剤と金コロイドのブロッキング剤の組合せに代えて、種々のブロッキング剤の組合せでブロッキング処理を行ったことを除いては、実施例と同様にしてイムノクロマトグラフィー用試験片を作製し、実施例と同様に検体を測定した。ブロッキング剤の添加量は、実施例１と同量となるようにした。また、試験片の製造工程も実施例１と同様に行った。

表１から明らかなように、金コロイド側にＢＳＡを用い、メンブラン側にカゼインを用いた組み合わせでブロッキングされた実施例に係る試験片のみがＰＳＡ抗原を検出できた。金コロイド側をカゼインでブロッキングし、メンブラン側をＢＳＡでブロッキングする、所謂逆の形態にすると、検出は不可能であった。更に、ＢＳＡとＢＳＡの組み合わせ、カゼインとカゼインの組み合わせといった、同じたんぱく質の組み合わせでも非特異反応に起因すると思われる反応が現れ、良好な結果は得られなかった。また、ＢＳＡの代わりにゼラチンを用いた場合も特異的な検出が不可能であった。但し、メンブラン側のＢＳＡでのブロッキング量を多くした場合（実施例４）、感度においてわずかに劣る面がある。

Claims (3)

1. 少なくとも、被検出物と特異的に反応する特異的結合物が担持された不溶性担体と、メンブラン上に固定された被検出物と特異的に反応する特異的結合物から成るイムノクロマトグラフィー用試験片において、
   前記不溶性担体が牛血清アルブミンでブロッキングされ、かつ、前記メンブランがカゼインでブロッキングされてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験片。
2. 特異的結合物が担持された不溶性担体をブロッキングする牛血清アルブミンの添加量は、不溶性担体の表面積１ｃｍ^２当たり０．０１〜５０ｍｇである請求項１記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
3. メンブランをブロッキングするカゼインの添加量は、メンブランの表面積１ｃｍ^２当たり０．１〜１００ｍｇである請求項１記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。