JP4439262B2 - 操作されたテンプレートおよび単一プライマー増幅におけるそれらの使用 - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮出願第60/323,455号(2001年9月19日出願)に対して優先権を主張する。
本開示は、標的核酸配列の増幅に有用な操作されたテンプレートに関する。より詳細には、その反対の末端に相補配列を含むように操作されたテンプレートが、入れ子式(nested)オリゴヌクレオチド伸長反応(NOER)により提供される。この操作されたテンプレートは、単一プライマー増幅(SPA)により操作されたテンプレート内で標的核酸を増幅することを可能にする。特に有用な実施形態において、この操作されたテンプレート由来の標的配列は、発現ビヒクルにクローン化されて、例えば、抗体ライブラリーのような、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーを提供する。
核酸増幅および増幅産物の検出の方法は、核酸配列の検出、同定、定量および配列解析において補助する。核酸増幅は、関連遺伝子由来の(例えば、抗体)ライブラリーの構築における重要な工程である。これらのライブラリーは、特定の所望の活性を有する抗体についてスクリーニングされ得る。核酸分析は、病原体の検出および同定、規定された表現型を生じる遺伝子変更の検出、遺伝的疾患または疾患に対する感受性の診断、疾患の発症における遺伝子発現および規定された刺激に応じた遺伝子発現の評価、ならびに種々のゲノムプロジェクトのために重要である。核酸増幅方法の他の適用としては、希少な細胞の検出、病原体の検出、および悪性疾患における変更された遺伝子発現の検出などが挙げられる。核酸増幅はまた、定性的分析(例えば、規定された核酸配列の存在の検出)および規定された遺伝子配列の定量(例えば、病原性配列の量の評価、ならびに遺伝子の増殖または欠失の決定、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞の形質転換などにおいて有用)のために有用である。核酸配列における配列変更の検出は、遺伝子分析に関連する場合、変異体遺伝子型の検出、薬物耐性をもたらす変異の検出、薬理ゲノム学(pharmacogenomics)などのために重要である。
核酸の新規な増幅方法がここで開示されており、この方法は、以下の工程:a)プライマーをテンプレート核酸配列にアニーリングする工程であって、このプライマーは、このテンプレートにアニーリングする第1の部分および所定の配列の第2の部分を有する、工程;b)ポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは、このプライマーの第1の部分がテンプレートにアニーリングする位置と、テンプレートの末端(このポリヌクレオチドは、第1末端および第2末端を有する)との間のテンプレートの部分にアニーリングしかつ相補的であり、ここでこの第1末端がプライマーを組み込む、工程;c)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを、テンプレートから分離する工程;d)入れ子式オリゴヌクレオチドを、工程(b)で合成されたポリヌクレオチドの第2末端にアニーリングする工程であって、この入れ子式オリゴヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの第2末端にアニーリングする第1の部分およびプライマーの第2部分と同じ所定の配列を有する第2部分を有する、工程;e)工程(b)で合成されたポリヌクレオチドを伸長して、所定の配列に相補的であるその末端部分を提供する工程;ならびにf)所定の配列を有する単一のプライマーを使用して伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程、を包含する。
本開示は、標的核酸配列を増幅させる方法を提供する。特に有用な実施形態において、標的核酸配列は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子である。本開示はまた、増幅産物が、適切な発現系においてクローン化され得、そして発現され得る方法を記載する。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、関連するファミリーの配列を増幅させ、複雑なライブラリー(例えば、抗体ライブラリー)を構築するために使用される。
(IgM重鎖可変領域遺伝子のレパートリーの増幅)
(第1鎖cDNAの合成および改変)
ヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用するが、本質的にはそのキット指示書に従って、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies)を使用して、オリゴdTプライマーとともに従来型の第1鎖cDNAを生成した。第1鎖cDNA生成物を、QIAGENスピンカラム(PCR Purification Kit)で浄化した。制限エンドヌクレアーゼEcoR Iによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、制限オリゴオリゴヌクレオチドを、その第1鎖cDNAに添加した。制限オリゴヌクレオチド(CMEcoR I)の配列は、5’TCC TGT GAG AAT TCC CCG TCG 3’(配列番号(Seq.ID No.)1)であった。この反応を、第1鎖cDNAおよび0.1μMオリゴヌクレオチドとともに開始した。このサンプルを、95℃で2分間加熱して、次いで、2分間、64℃で保持し、特異的なアニーリングが生じることを可能にした。適量の、10×制限緩衝液H((Roche Diagnostics)を、このサンプルに添加して、そして、37℃までさらに冷却した。制限エンドヌレアーゼEcoR I(New England Biolabs)を添加して、そして、30分間、37℃でインキュベートした。制限酵素を、20分間、65℃で熱インキュベートして、次いで、このサンプルを4℃まで冷却した。
EcoR Iで消化された第一鎖cDNAを、プライマー「TMX24VH3a」(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)とともに、第二鎖cDNA反応における最初のテンプレートとして使用した。このプライマーを、所定のTMX24配列、Xho I制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域において第一鎖cDNAにアニーリングする領域、を含むように設計した。この「TMX24VH3a」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG CTC GAG GAR GTG CAG CTG GTG GAG 3’(配列番号2)であった(ここで、Rは、塩基Aおよび塩基Gの等モル混合物を表わす)。このサンプルを、95℃にて1分間熱変性させ、次いで95℃にて5秒間、56℃にて10秒間、および68℃にて1分間というサイクルを20サイクル行った。これにより、第二鎖cDNAの線形増幅が可能になる。次いで、「TMX24CM0」と呼ばれる入れ子式オリゴを、氷上で、0.08μMの最終濃度になるまで加えた。この「TMX24CM0」の配列は、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG ACT AGT AAT TCT CAC AGG AGA CGA GGG GGA 3’(配列番号3)であった(この配列は、引き続くクローニング工程において使用されるSpe I制限エンドヌクレアーゼ部位を含む)。この入れ子式オリゴの3’末端は、逆連結(3’−5’ではなく、3’−3’)アデノシンの取り込みによる伸長を防止するように設計される。この第二鎖cDNAを、94℃にて5秒間熱変性させることによって、入れ子式オリゴをさらに伸長させ、次いでアニーリングおよび伸長のために、68℃にて10秒間および95℃にて5秒間、続いて68℃にて30秒間および4℃というサイクルを4サイクル行った。次いで、得られた第二鎖cDNAまたは作製したテンプレートを、QIAGENスピンカラム(PCR Purification Kit)を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを取り除き、そして下流プロトコルのための単純な緩衝液交換を可能にする。
操作されたテンプレートを、Advantage2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTPs、および単一プライマー(TMX24)(このプライマーは、5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG 3’(配列番号4)の配列を有する)を使用して、増幅した。このサンプルを、95℃にて1分間熱変性させ、次いで95℃にて5秒間および68℃にて1分間というサイクルを35サイクル行った。この後、さらに68℃にて3分間行って、4℃で維持した。
約450bpの増幅産物をゲル精製し、次いで、Xho IおよびSpe Iによって消化し、そしてpBluescript KS+(Stratagene)にクローニングした。個々のクローンを選択し、そしてそれらのDNA配列を決定した。分析した16個の全てのクローンは、IgM重鎖であり、これらの各々が、可変の長さを有する異なるCDR3配列を有し、それによって、抗体鎖の多種多様な集団がこの方法によって増幅されることが示された(表1を参照のこと)。
VH産物をベクターにクローニングして、それによってネイティブIgM CH1定常領域が再構築され得るように、CH1中のEcoR I以外の部位を、第一鎖cDNAエンドヌクレアーゼ消化のために利用した。当業者が理解するように、Taqポリメラーゼをこのプロトコルのために使用する場合、末端Aが、多数の新たな合成DNA鎖に加えられる。多様性を最大にするために、その末端Aの存在を、入れ子式オリゴヌクレオチドの設計において考慮した。しかし、過剰なAの存在は、EcoR I認識部位の欠損を生じさせる。IgM定常領域の分析により、この方法のために潜在的に使用され得る他のネイティブな制限部位(例えば、Dra III)が明らかとなった。CH1ドメインにおいてDra IIIのネイティブ制限部位を使用した結果は、その上流のEcoR I部位が未改変のままであり、その重鎖レパートリーをクローニングするためにこの部位を使用することができるということである。この重鎖のインサートは、Xho IおよびEcoR Iによって、適切なベクター(これは、EcoR IからCH2ドメインまでにわたって残っているIgM CH1ドメインを有する)にクローニングされる。
ヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用して、オリゴdTプライマーを用いて伝統的な第一鎖cDNAを作製した。基本的にはキットの説明書に従って、RT−PCR用のSuperScript First−Strand Synthesis System(Invitrogen Life Technologies)を使用して、これを行った。制限オリゴヌクレオチドをこの第一鎖cDNAに加えて、制限エンドヌクレアーゼDra IIIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成した。この制限オリゴヌクレオチド(CMDra III)の配列は、5’GAC GAA CAC GTG GTG TGC AAA G 3’(配列番号21)であった。反応を、第一鎖cDNAおよび1μMオリゴヌクレオチドを用いて開始した。このサンプルを、95℃まで2分間加熱し、次いで64℃にて2分間維持することで、特定のアニーリングが生じるのを可能にした。適切な量の10×制限緩衝液H(Roche Diagnostics)をこのサンプルに加え、37℃までさらに冷却した。制限エンドヌクレアーゼDra III(New England Biolabs)を加え、そして37℃にて30分間インキュベートした。この制限酵素を、65℃にて20分間熱不活化させ、次いでこのサンプルを4℃まで冷却した。
DraIIIで消化した第1鎖cDNAを、プライマー「TMX24VH1a」(終濃度0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)と一緒に用いて、第2鎖cDNA反応における元のテンプレートとして使用した。このプライマーを、所定のTMX24配列、XhoI制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域中で、第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。「TMX24VH1a」の配列は、5’GTGCTGGCCGTTGGAAGAGGAGTGCTCGAGCAGGTKCAGCTGGTGCAG3’(配列番号22)であり、ここで、Kは、GおよびTの塩基の等モル濃度混合物を表す。このサンプルを、94℃で1分間、熱変性させ、次いで94℃で5秒間、56℃で10秒間、および68℃で2分間のサイクルを20回繰り返した。このことは、第2鎖cDNAの線形増幅を可能にした。「TMX24CMnpt」と名付けられた入れ子式オリゴを、終濃度0.2μMまで氷上で添加した。図7に示される様に、「TMX24CMnpt」の配列(配列番号23)は、オリゴヌクレオチドの伸長を妨げるように設計された、改変された構造を有する3つの3’末端ヌクレオチドを含む。具体的には、この入れ子式オリゴは、ホスホロチオエートおよび2’OMeを有する、3つの末端改変ヌクレオチドを有し、この2’OMeは、伸長を妨げ、そしてエキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性に対して保護するように設計される。このオリゴの3’末端ヌクレオチドは、非ハイブリダイズ性である(cの代わりにg)。第2鎖cDNAをさらに、94℃で1分間の熱変性、68℃で2分間のアニーリングおよび伸長、その後4℃にすることによって、入れ子式オリゴから伸長した。次いで、得られた第2鎖cDNAまたは操作されたテンプレートを、QIAGEN遠心カラム(PCR Purification Kit)を用いて浄化した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝液交換を可能にする。この手順を、VHプライマーパネル(プライマーリスト参照)の停止(rest)まで反復および伸長して、免疫グロブリン生成物のライブラリーを調製した。これら生成物を適切なベクターにクローニングし得る。
操作されたテンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clonetech)およびその10×反応緩衝液、dNTPおよび単独プライマー(TMX24)(これは、配列5’GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG 3’(配列番号4)を有する)を使用して増幅した。これらのサンプルを、95℃で1分間、熱変性させ、次いで95℃で5秒間、および68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した。この後に、68℃でさらに3分、そして4℃で保持した。
約450bpの増幅産物をゲル精製し、そしてXhoIおよびEcoRIによって消化した。これらのインサートを、ネイティブEcoRI部位からCH2ドメインまで(またはその一部を含む)のIgM CH1ドメインの残存部分、および増幅されたフラグメントをクローニングするための適合性の制限部位を含む、任意の適切な発現ベクターにクローニングする。
(B型肝炎ポジティブなドナーのmRNA由来の、ファージミドディスプレイライブラリーの構築)
(IgG重鎖およびκ軽鎖のための第1鎖cDNA合成および改変)
B型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒト末梢血リンパ球(PBL)mRNAを使用して、オリゴdTプライマーを用いて伝統的な第1鎖cDNAを調製した。このことは、本質的にキットの指示書に従って、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)を使用して行った。IgGに対する制限オリゴヌクレオチド「CGApaL I」、またはκ軽鎖のための「CKSac I」を、2本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに添加した。この2本鎖DNA領域を、IgGについては制限エンドヌクレアーゼApaL Iによって、またはκ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼSacIによって消化し得る。「CGApaL I」配列は、5’CCA GCG GCG TGC ACA CCT TCC3’(配列番号39)である。「CKSac I」配列は、5’AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC3’(配列番号40)である。この反応を、第1鎖cDNA、1μMのオリゴヌクレオチドおよび適切な量の10×制限緩衝液A(Roche Diagnostics)に設定した。これらのサンプルを、95℃で2分間加熱し、次いで64℃で2分間保持して、特異的なアニーリングを生じさせ、そして37℃に冷ました。制限エンドヌクレアーゼApaL IまたはSac I(New England Biolabs)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。制限酵素を、Sac Iについては65℃で20分間、加熱不活性化し、次いでサンプルを4℃に冷却した。
Sac Iで消化した第1鎖cDNAを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク1特異的プライマー(終濃度0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を使用する、複数の第2鎖cDNA反応を設定した。これらのプライマーを、κ鎖について所定のTMX24κ配列 5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG3’(配列番号47)、XbaI制限部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域中で、第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列を、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)から誘導し、これらの配列は、ヒト抗体の公知の配列に基づいて設計され、そしてκ軽鎖遺伝子の全体のヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告されている。
cDNAの線形増幅を可能にした。κ鎖に対する「TMX24CKnpt」と名付けられた入れ子式オリゴを、終濃度0.2μMまで氷上で添加した。「TMX24CKnpt」は、所定の配列TMX24Kを含み、そしてこの配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG CTC GAG CTC AGG CCC TGA TGG GTG ACT TCG CT3’(配列番号61)であった。第2鎖cDNAをさらに、94℃で1分間の熱変性、68℃で2分間のアニーリングおよび伸長、その後4℃にすることによって、入れ子式オリゴから伸長した。得られた第2鎖cDNA(操作されたテンプレート)を、QIAGEN遠心カラム(PCR Purification Kit)を用いて浄化した。この工程は、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝液交換を可能にする。
操作されたテンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clonetech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、およびκ鎖に対するプライマー「TMX24K」を使用して増幅した。「TMX24K」の配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG 3’(配列番号62)である。これらのサンプルを、95℃で1分間、熱変性させ、次いで95℃で5秒間、および68℃で1分間のサイクルを、30回繰り返した。これは、68℃でさらに3分間、そして4℃で保持した。
κ鎖増幅産物をゲル精製し、次いでXbaIおよびSacIにより消化した。これらのインサートを、κ軽鎖定常領域の残存部分含む、適切な発現ベクターにクローニングした。このライゲーション産物を、E.coliにエレクトロポレーションによって導入し、そして37℃で一晩培養した。翌朝、DNAマキシプレップ(maxiprep)(QIAGEN)を実施して、軽鎖ライブラリーDNAを回収した。次いで、この軽鎖ライブラリーDNAを、次いで、Xho I/Age Iによって重鎖Fdフラグメント中にクローニングする工程において使用して、ライブラリー構築物を完成した。
ApaL I消化した第1鎖cDNAを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素および10×反応混合物(Applied Biosystems)を使用する、複数の第2鎖cDNA反応を構築した。これらのプライマーを、所定のTMX24配列、XhoI制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域において第1鎖cDNAにアニーリングされる領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計されたVBaseデータベースプライマーから誘導した。これらは、重鎖遺伝子のヒト抗体レパートリー全体をカバーすることが報告される。
操作したテンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTPおよびプライマー「TMX24」を使用して増幅した。これらのサンプルを、95℃で1分間熱変性させ、次いで、(95℃で5秒間および68℃で1分間)×30回のサイクルにかけた。次に、さらに3分間68℃にし、そして4℃で維持した。
増幅産物をプールし、次いでゲル精製した。DNAをQIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を用いて回収した。このDNAを、続いてXhoI制限酵素およびAgeI制限酵素で消化し、次いでゲル精製した。AgeI部位は、ApaL I部位の上流のIgG定常領域のCH1中に天然に存在する。DNAを、QIAquick Gel抽出キット(QIAGEN)を用いて回収した。
このライブラリーを、実質的に、Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, and Silverman, GJ (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されるように、固定化HBs Ag上で4回にわたってパニングした。第2回、第3回および第4回のパニング由来の個々のクローンを、HBs Ag上でELISAによってスクリーニングした。
B型肝炎ワクチン接種したドナー由来のヒトPBL mRNAを使用して、オリゴdTプライマーを用いて従来の第1鎖cDNAを生成した。これを、キットの指示書に従って、SuperScript First−Strand Synthesis for RT−PCR (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)を使用して行った。制限オリゴヌクレオチド「CLSma I」を、制限エンドヌクレアーゼSmaIによって消化され得る二本鎖DNA領域を作成するために、第1鎖cDNAに添加した。「CLSma I」配列は、5’GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG3’(配列番号78)であり、ここで、Yは、CおよびTの混合である。この反応を、第1鎖cDNA、1μMオリゴヌクレオチド、および適切な量の10×制限緩衝液A(Roche Diagnostics)を用いて構成した。このサンプルを、95℃まで2分間加熱し、次いで64℃で2分間維持して、特異的アニーリングを生じさせ、そして37℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼSmaI(New England Biolabs)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。制限酵素を、65℃で加熱不活化し、次いでサンプルを4℃まで冷却した。
SmaI消化した第1鎖cDNAを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を用いる、複数の第2鎖cDNA反応を構築した。これらのプライマーは、所定のTMX24L配列、XbaI部位およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク領域において第1鎖cDNAにアニールする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そしてλ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告される、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)から誘導する。λ軽鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例4において使用したものである。
操作されたテンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTPおよびプライマー「TMX24L」を使用して増幅した。TMX24Lの所定の配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG3’(配列番号82)である。これらのサンプルを、95℃で1分間熱変性させ、次いで、(95℃で5秒間および68℃で1分間)×30回のサイクルにかけた。その後さらに3分間68℃にし、そして4℃で維持した。
λ軽鎖増幅産物を、PCR purification kit (QIAGEN)によって清浄化し、そしてXbaIおよびScaIで消化した。挿入物を、ゲル抽出キット(QIAGEN)を使用してゲル精製し、そしてλ軽鎖定常領域の残りの部分を含む適切なベクター中にクローニングした。連結産物を、エレクトロポレーションによってE.coliに導入し、そして37℃で一晩増殖させた。次の朝、DNA maxi prep(QIAGEN)を実施して、λ軽鎖ライブラリーDNAを回収した。
上記で調製したλ軽鎖ライブラリーDNAを、以前に記載されたようにIgGκライブラリーについてもまた調製された重鎖Fdフラグメントの挿入のために、XhoIおよびAgeIによって連続的に消化した。次いで、連結産物を、エレクトロポレーションによってE.coliに導入し、そして37℃で一晩増殖させた。次の朝、DNA maxi prep(QIAGEN)を実施して、完全IgGλライブラリーDNAを回収した。
パニングおよびスクリーニングを、IgGκライブラリーについて以前に記載されたように実施した。
ELISAスクリーニングにより、HBsAgに対する特異的結合および非特異的タンパク質(オボアルブミン)に対する最少の結合を示すクローンを、DNA配列決定によって分析した。図8a〜eを参照のこと。HBsAgに対する合計38個の別個のIgGκFab(25個の重鎖および37個の軽鎖)および17個の別個のIgGλFab(13個の重鎖および16個の軽鎖)を、B型肝炎ワクチン接種したドナー由来のPBL mRNAから作成されたライブラリーから単離した。
(ヒトPBL mRNAからのファージディスプレイライブラリーの構築)
(軽鎖についての第1鎖cDNA合成および改変)
ドナー由来のヒトPBL mRNAを、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR (Invitrogen Life Technologies)を実質的にキットの指示書に従って使用して、オリゴdTプライマーを用いて、従来の第1鎖cDNAを生成した。κ軽鎖およびλ軽鎖を、別々に構成する。制限オリゴヌクレオチド「CKSac I」または「CLSma I」を、κ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼSacIによって、またはλ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼSmaIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに添加する。複数のλ定常領域(C1、C2、C3およびC6)が存在するので、このSmaI部位が、全ての機能的λ定常ドメイン(C1、C2、C3およびC6)間で保存されていることに留意することが重要である。「CKSac I」配列は、5’AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC 3’(配列番号179)であり、「CLSma I」配列は5’GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG 3’(配列番号180)であり、ここで、Yは、CおよびTの混合である。この反応を、第1鎖cDNAおよび1μMのオリゴヌクレオチドを用いて構成する。このサンプルを、95℃で2分間加熱し、次いで2分間64℃に維持して、特異的なアニーリングを生じさせる。適切な量の10×制限緩衝液A(Roche Diagnostics)をサンプルに添加し、そしてさらに37℃まで冷却する。制限エンドヌクレアーゼScaIまたはSmaI(New England Biolabs)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。この制限酵素を65℃で20分間加熱インキュベートし、次いでサンプルを4℃まで冷却する。
SacI消化したκ第1鎖cDNAまたはSmaI消化したλ第1鎖cDNAを元のテンプレートとして使用して、フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を用いる、複数の第2鎖cDNA反応を構築する。プライマーを、TMX24K配列(κについて)またはTMX24L配列(λについて)、XbaI制限部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子またはヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域において第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そして軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告されている、VBaseデータベースプライマー(www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html)から誘導する。κ軽鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例3において使用したものである。λ増幅において使用するためのプライマーの、以下の表を参照のこと。
操作されたテンプレートを、Advantage 2 ポリメラーゼミックス(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、ならびにκ鎖についてプライマー「TMX24K」またはλ鎖について「TMX24L」を使用して増幅する。「TMX24K」の配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG 3’(配列番号198)であり、そして「TMX24L」の配列は、5’GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG 3’(配列番号199)である。サンプルを、95℃で1分間熱変性させ、次いで(95℃で5秒間および68℃で1分間)×30回のサイクルにかける。その後、さらに3分間68℃にし、そして4℃で維持する。
κおよびλ増幅産物を、PCR精製キット(QUIAGEN)を使用して清浄化し、そして別々にゲル精製した。これらの産物を、XbaIおよびSacIで消化する。挿入物を、それぞれの軽鎖定常領域の残りの部分を含む適切なベクター中にクローニングする。連結産物を、エレクトロポレーションによってE.coli中に導入し、そして37℃で一晩増殖させる。次の朝、DNA maxiprepを実施して、軽鎖ライブラリーDNAを回収する。軽鎖ライブラリーDNA prepを、Xho I/EcoR Iによる重鎖Fdフラグメントの挿入についてのクローニングベクターとして使用して、ライブラリーの構築を完了する。
ドナー由来のヒトPBL mRNAを使用して、オリゴdTプライマーを用いて従来の第1鎖cDNAを生成する。これを、SuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR (Invitrogen Life Technologies)を実質的にそれらの指示書に従って使用して行う。制限オリゴヌクレオチドCMDra IIIを、制限エンドヌクレアーゼDraIIIによって消化され得る二本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに添加する。この反応を、第1鎖cDNAおよび1μMのオリゴヌクレオチドを用いて構成する。このサンプルを、95℃で2分間加熱し、次いで64℃で2分間維持して、特異的アニーリングを生じさせる。適切な量の10×制限緩衝液H(Roche Diagnostics)をこのサンプルに添加し、そして37℃までさらに冷却する。制限エンドヌクレアーゼDra III (New England Biolabs)を添加し、そして37℃で30分間インキュベートし、その後4℃で冷却する。
Dra III消化した第1鎖cDNAを元のテンプレートとして用い、フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を用いた複数の第2鎖cDNA反応を構築する。これらのプライマーは、TMX24配列、1つのXho I制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域中の第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計される。これらのアニーリング配列は、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そして上で実施例3に記載したように、重鎖遺伝子のヒト抗体レパートリー全体を網羅すると報告されているVBaseデータベースプライマー由来である。用いた重鎖フレームワーク1特異的プライマーは、実施例3に列挙したプライマーである。
操作したテンプレートを、Advantage 2 polymerase mix(Clontech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、およびプライマー「TMX24」を用いて増幅させる。このサンプルを、95℃で1分間熱変成させ、次いで(95℃で5秒間、および68℃で1分間)×30のサイクルにかけた。これに引き続き、68℃でさらに3分間置き、4℃にて維持する。
約500bpの増幅産物を、ゲル精製し、次いでXho IおよびEcoR Iにより消化する。この挿入物は、適切なベクターにクローニングされ、IgM CH1ドメインの残りの部分を包含する。Fabライブラリーを含む連結産物を、エレクトロポレーションにより、E.coliに導入する。
(IgEまたは組換えIgE Fc CH2〜4で免疫したマウスのmRNA由来のファージミド表示ライブラリーの構築)
(IgG重鎖およびκ軽鎖についての第1鎖cDNA合成および改変)
ヒトIgEまたは組換えヒトIgEで免疫したマウス由来のマウス脾臓mRNAを用い、オリゴdTプライマーを有する従来の第1鎖cDNAを生成した。これは、SuperScript First−Strand Synthesis for RT−PCR(Invitrogen Life Technologies)を、実質的に製造業者の指示に従って用いてなされた。制限オリゴヌクレオチド(IgG1に対して「mCG1Xcm I」、IgG2aに対して「mCG2aBsaJ I」、またはκ軽鎖に対して「mCKHpa I」)を、IgG1に対する制限エンドヌクレアーゼXcm I、IgG2aに対する制限エンドヌクレアーゼBsaJ I、またはκ軽鎖に対する制限エンドヌクレアーゼHpa Iによって消化され得る2本鎖DNA領域を生成するために、第1鎖cDNAに添加した。「mCG1Xcm I」配列は、5’CTAACTCCATGGTGACCCTGGGATG3’(配列番号200)である。「mCG2aBsaJ I」配列は、5’CAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAG3’(配列番号201)である。「mCKHpa I」配列は、5’CAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGG3’(配列番号202)である。第1鎖cDNAオリゴヌクレオチド(1μM)、および適切な量の10×NEB緩衝液(New England Biolab)または10×制限緩衝液A(Roche Diagnostics)を用いて、反応を構成した。このサンプルを95℃で2分間加熱し、次いで64℃で2分間維持して特異的アニーリングを生じさせ、そしてXcm IおよびHpa Iに対して37℃まで冷却し、BsaJ Iに対して60℃まで冷却した。この制限エンドヌクレアーゼXcm I、BsaJ I、またはHpa I(New England Biolabs)を添加し、各々、37℃で30分間、60℃で30分間、および37℃で10分間、インキュベートした。これらの制限酵素を、Xcm Iについては65℃で20分間、BsaJ Iについては80℃で20分間加熱して失活させ、次いでそのサンプルを、4℃まで冷却した。
TMX24mVHIIBshort(配列番号203)
5’GACGTGGCCGTTGGAAGAGGAGTGCTCGAGGTCCAACTGCAGCAGYC3’
mCG1(配列番号204)
5’CATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG3’
mCG1B(配列番号205)
5’CAACGTTGCAGGTGACGGTCTC3’
mCG2a(配列番号206)
5’CGAGGAGCCAGTTGTATCTCCAC3’
mCG2aB(配列番号207)
5’CCACATTGCAGGTGATGGACTG3’
TMX24mVKIVshort(配列番号208)
5’GACGACCGGCTACCAAGAGGAGTGTCTAGAGAAAWTGTGCTCACCCAGTCTC3’
mCK0(配列番号209)
5’CTGCTCACTGGATGGTGGGAAG3’
mCKB(配列番号210)
5’GAGTGGCCTCACAGGTATAGCTG3’
(軽鎖第2鎖の直線増幅および入れ子式オリゴ伸長)
Hpa I消化した第1鎖cDNAを元のテンプレートとして用い、フレームワーク1特異的プライマー(最終0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を用いた複数の第2鎖cDNA反応を構築した。これらのプライマーは、κに対するTMX24mK配列、およびXba I制限部位、およびマウス抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク1領域中の第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計される。これらのアニーリング配列は、κ軽鎖遺伝子のマウス抗体レパートリー全体を網羅するKabatデータベース由来である(http://immuno.bme.nwu.edu/)、マウス抗体の既知の配列に基づいて設計された。
操作されたテンプレートを、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clonetech)およびその10×反応緩衝液、dNTPならびにκ鎖に対するプライマー「TMX24mK」を使用して増幅した。「TMX24mK」の配列は:
κ増幅産物をゲル精製し、次いでXba IおよびBspE Iにより消化した。このインサートを、κ鎖定常領域の残存部分を含む、適切な発現ベクターにクローニングした。このライゲーション産物を、E.coliにエレクトロポレーションによって導入し、そして37℃で一晩培養した。翌朝、DNAマキシプレップ(maxiprep)を実施して、軽鎖ライブラリーDNAを回収した。この軽鎖ライブラリーDNAを、Xho I/Bln Iによって重鎖Fdフラグメント中にクローニングする、続く工程中で使用して、以下の「重鎖のクローニング」に記載されるライブラリーの構築を完了した。
Xcm IおよびBsaJ Iで消化した第1鎖cDNAを使用して、フレームワーク1に特異的なプライマー(終濃度0.4μM)、dNTP、AmpliTaq酵素およびその10×反応緩衝液(Applied Biosystems)を使用する、複数の第2鎖cDNA反応を設定した。これらのプライマーを、TMX24mH配列、Xho I制限部位およびマウス抗体重鎖遺伝子のフレームワーク1領域中に第1鎖cDNAにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、Kabatデータベース(http://immuno.bme.nwu.edu/)由来のマウス抗体の公知の配列に基づき設計して、重鎖遺伝子のマウス抗体レパートリー全体をカバーした。
操作されたテンプレートを、重鎖に対して、Advantage 2ポリメラーゼミックス(Clonetech)およびその10×反応緩衝液、dNTP、およびプライマー「TMX24mH」を使用して増幅した。「TMX24mH」の配列は:
重鎖増幅産物をゲル精製し、次いでXho IおよびBln Iにより消化した。これらのインサートを、IgG1およびIgG2aについての重鎖定常領域の残存部分を含む、κ鎖ライブラリーDNAにクローニングした。このライゲーションされた産物を、E.coliにエレクトロポレーションによって導入し、そして37℃で一晩培養した。翌朝、DNAマキシプレップ(maxiprep)を実施して、IgG1 κライブラリーDNAまたはIgG2a κライブラリーDNAを回収した。
ライブラリーを、本質的に以下に記載されるように、組換えIgE Fc CH2〜4に対して4回パニングした:Barbas III、CF Burton、DR、Scott、JK、およびSilverman、GJ(2001)Phage Display:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York。パニングの第二ラウンド、第三ラウンド、第四ラウンド由来の、個々のクローンを、組換えIgE Fc CH2〜4について、ELISAによってスクリーニングした。
Claims (8)
- 核酸を増幅する方法であって、以下:
a)プライマーをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第1部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第2部分を有する、工程;
b)該プライマーの第1部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第1末端および第2末端を有し、該第1末端は該プライマーを組み込んでいる、工程;
c)該テンプレートから、工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドの第2末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第2末端にアニールする第1部分、および該プライマーの第2部分と同一な所定の配列を有する第2部分を有し、該入れ子式オリゴヌクレオチドはその3’末端で伸長されない、工程;
e)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;ならびに
f)該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程が、異なる配列を有する入れ子式オリゴヌクレオチドのコレクションを提供する工程、および工程(b)において合成された前記ポリヌクレオチドと、該入れ子式オリゴヌクレオチドのコレクションとを接触させる工程を包含する、方法。
- 前記テンプレートが、前記プライマーにアニーリングする前に消化される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において合成された前記ポリヌクレオチドが、前記入れ子式オリゴヌクレオチドにアニーリングされる前に消化される、請求項1に記載の方法。
- 前記入れ子式オリゴヌクレオチドの3’末端が、工程(b)において合成された前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、請求項1に記載の方法。
- 前記入れ子式オリゴヌクレオチドの3’末端が、該3’末端の伸長を防ぐ改変された塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸を増幅する方法であって、以下:
a)プライマーを、制限エンドヌクレアーゼで消化されたテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第1部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第2部分を有する、工程;
b)該プライマーの第1部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第1末端および第2末端を有し、該第1末端は該プライマーを組み込んでいる、工程;
c)該テンプレートから、工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程;
d)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドの第2末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第2末端にアニールする第1部分、および該プライマーの第2部分と同一な所定の配列を有する第2部分を有する、工程;
e)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;ならびに
f)該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
を包含する、方法。 - 核酸を増幅する方法であって、以下:
a)プライマーをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第1部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第2部分を有する、工程;
b)該プライマーの第1部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第1末端および第2末端を有し、該第1末端は該プライマーを組み込んでいる、工程;
c)工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼで消化する工程;
d)該テンプレートから、工程(b)において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程;
e)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドの第2末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第2末端にアニールする第1部分、および該プライマーの第2部分と同一な所定の配列を有する第2部分を有する、工程;
f)工程(b)において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程;ならびに
g)該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
を包含する、方法。
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