JP2003517041A - 治療上有用な合成オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x）_n、（Ｇ _xＴ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（ここで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（配列）を含む組成物および方法であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、癌治療用オリゴヌクレオチド組成物に関する。

【０００２】 ［発明の背景］ 癌は、異型細胞の異所性網状蓄積であり、過剰な増殖、細胞死の不全、または
その２つの組合せの結果生じ得る。

【０００３】 増殖は、結果として１つの細胞を２つの細胞に分割する細胞周期による細胞進
行の極致である。細胞周期の５つの主要な期は、Ｇ₀、Ｇ₁、Ｓ、Ｇ₂およびＭで
ある。Ｇ₀期中、細胞は静止状態である。体内のほとんどの細胞が、常にこの段
階にある。Ｇ₁期中、細胞は、***するためのシグナルに応答し、ＲＮＡおよび
、ＤＮＡ合成に必要なタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ：初期Ｓ期、ＳＭ：中
間Ｓ期、およびＳＬ：後期Ｓ期）中、細胞は、それらのＤＮＡを複製する。Ｇ₂
期中、タンパク質が、細胞***のために合成される。***（Ｍ）期中、細胞は、
２つの娘細胞に***する。細胞周期進行における変化が、すべての癌で起こり、
遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイント
の抑止の結果起こり得る(Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents
8: 903, 1997)。

【０００４】 癌細胞と異なり、たいていの正常細胞は、細胞老化と呼ばれる過程により、無
限に増殖することはできない。細胞老化は、細胞の成長停止を引き起こすプログ
ラム細胞死応答である(Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995
)。ＤＮＡ損傷、結腸癌、乳癌および卵巣癌細胞のトポイソメラーゼ阻害剤への
曝露、ならびに鼻咽頭癌細胞のシスプラチンへの曝露は、老化の誘発によりこれ
らの細胞増殖を防止することが報告されている(Wang et al. Cancer Res. 58:51
09, 1998; Poele et al. Br. J. Cancer 80:9, 1999)。

【０００５】 合成オリゴヌクレオチドは、細胞中にインターナライズされるポリアニオン性
配列である(Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994)。核酸に(
Wagner, R. Nature: 372:333, 1994)、特定の細胞タンパク質に(Bates et al. J
. Biol. Chem. 274:26369, 1999)に、および特定の核タンパク質(Scaggiante et
al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)に、選択的に結合して癌細胞の増殖を抑
制する合成オリゴヌクレオチドが報告されている。

【０００６】 グアニン（Ｇ）および可変量のチミン（Ｔ）を含有する合成２７塩基配列（オ
リゴヌクレオチドＧＴｎ）（ここで、ｎは、１以上または７以下であり、塩基数
は、２０以上である）(Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998)は
、４５ｋＤａの核タンパク質に特異的に結合する配列によって癌細胞系の成長を
抑制することが報告されているのに対し、ＧＴｎ（ここで、塩基数は２０以下で
ある）は、癌細胞系に対して不活性であることが報告されている(Morassuitti e
t al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999)。３’アミノアルキル修飾
を有する１５および２９塩基の２つのＧＴリッチな合成オリゴヌクレオチドは、
ヌクレオリンに結合するＧ四分子を形成し、癌細胞系の増殖を抑制することが報
告されている(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999)。哺乳動物テロ
メア反復配列の配列と同一の配列を有する合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホロチ
オエートは、in vitroおよびin vivoにて、バーキットリンパ腫細胞の増殖を抑
制することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:1
89, 1997)。しかしながら、合成６塩基ＴＴＡＧＧＧ−ホスホジエステルは、抗
テロメラーゼ活性を有さないことが報告されている（米国特許第５，６４３，８
９０号）。

【０００７】 細胞死は、アポトーシスを促進する免疫媒介物質により、および細胞死を引き
起こす経路を直接開始するアポトーシス誘発物質により達成される(Muzio et al
. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997)。アポトーシスは、核ク
ロマチンの凝集、細胞収縮、核壊変、原形質膜の小疱形成、および膜結合アポト
ーシス体の形成を含む特有の形態学的変化を特徴とする活性細胞死プロセスであ
る(Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980)。アポトーシスの分子的特
徴は、内因性エンドヌクレアーゼの活性化の結果としての、細胞核ＤＮＡのオリ
ゴヌクレオソーム長断片への分解である(Wyllie A. Nature 284:555, 1980)。

【０００８】 カスパーゼ（システイン−アスパルチル−特異的プロテアーゼ）は、アポトー
シスの後期段階の実行に重要な酵素として含意されてきた。カスパーゼファミリ
ーは、少なくとも１４の関連システインアスパルチルプロテアーゼから構成され
る。すべてのカスパーゼは、保存ＱＡＣＸＧ（ここで、Ｘは、Ｒ、ＱまたはＧで
ある）ペンタペプチド活性部位モチーフを含有する(Cohen G. Biochim. Biophys
. Acta 1366:139, 1997)。多数のカスパーゼは、カスパーゼ特異的切断部位での
切断後に活性化される不活性プロ酵素として(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta
1366:139, 1997)、または活性化用調節分子との会合を要する不活性酵素として
(Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999)合成される。

【０００９】 カスパーゼは、アポトーシスでの役割のほかに、ＢおよびＴリンパ球の活性化
ならびに増殖、炎症中のサイトカイン成熟、赤血球新生中の前駆細胞の分化、な
らびに水晶体線維の発達に関与する(Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000)。
ＢおよびＴリンパ球に関して、カスパーゼ３は、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ
球のＣＤ４（＋）、ＣＤ８（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）およびＣＤ４５ＲＯ（＋
）サブセットの活性化中にプロセシングされる(Alam et al. J. Exp. Med. 190:
1879, 1999）。さらに、***促進因子およびインターロイキン−２によるＴリン
パ球の刺激は、カスパーゼ経路の活性化およびＰＡＲＰ切断に関連する(Wilheim
et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998)。サイトカインに関して、カスパーゼ
３活性は、活性化Ｔリンパ球によるＩＬ−２の放出に(Posmantur et al. Exp. C
ell Res. 244:302, 1998)、および炎症誘発性サイトカインインターロイキン−
１６のプロセシングおよび成熟に(Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 199
8)必要である。赤血球新生に関して、カスパーゼ活性化は、赤血球新生調節に関
与し、赤血球前駆体の成熟に極めて重要なＧＡＴＡ−１、核調節タンパク質を調
節することがわかっている(De Maria, et al. Nature 401:489, 1999)。

【００１０】 細胞溶解は、細胞の完全または部分的破壊であり、免疫系により媒介される。
活性化マクロファージおよび単球は、サイトカインを含むが、それらに限定され
ない生理活性分子を産生する。サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ
）−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−
アルファが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１１】 ＩＬ−１ベータは、細胞減少性薬剤、照射および自家骨髄移植にて薬剤を用い
たin vitroでの腫瘍細胞パージングに対する骨髄細胞の感受性を減少する(Dalma
u et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993)。

【００１２】 ＩＬ−６は、Ｂ細胞分化を誘発し、ＩｇＧ分泌を刺激し(Taga et al. J. Exp.
Med. 166:967, 1987)、細胞障害性Ｔ細胞分化を誘発し(Lee et al. Vaccine 17
:490, 1999)、巨核球成熟を促進し(Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:8953, 1989)、癌細胞のための抗増殖因子(Mori et al. Biochem. Biophy
s. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:
270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993: Novick et al. Cytoki
ne 4:6, 1992)およびプロ増殖因子 (Okamoto et al. Cancer Res. 57:141, 1997
; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer R
es. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2:1417, 1996)の両方として機
能する。

【００１３】 ＩＬ−１０は、マウス腫瘍モデルにおけるワクチンの有効性を高め(Kauffman
et al. J. Immunother. 22: 489, 1999)、また抗癌自己反応性Ｔ細胞応答を上方
制御する(Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995)。

【００１４】 ＩＬ−１２は、単独で、および他のサイトカインと組み合わせて、白血球の成
熟を促進し、インターフェロン−ガンマの分泌を誘発する。ＩＬ−１２は、特定
の細胞溶解性Ｔリンパ球の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化なら
びに抗血管新生タンパク質ＩＰ−１０およびＭｉＧの誘発を含むが、これらに限
定されない抗癌活性を有することが報告されている(Stine et al. Annals NY Ac
ademy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351,
1997)。

【００１５】 ＴＮＦ−アルファは、固形腫瘍の壊死をもたらし(Porter et al. Trends in B
iotech. 9:158, 1991)、癌細胞をガンマ照射誘発アポトーシスに対して敏感にし
(Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999)、抗悪性腫瘍剤の影響から骨髄前
駆細胞を保護する(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551,1993)。

【００１６】 しかしながら、細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、アポトーシスの誘発または
免疫系の刺激に関するものであろうと、ほとんどの従来技術の抗癌治療は、臨床
用途に適するに至らないことが判明している。これらの治療の多くは、効果がな
いか、または毒性があり、かなりの不都合な副作用を有し、結果として薬物耐性
または免疫感作の発生をもたらし、レシピエントを衰弱させる。

【００１７】 したがって、癌細胞にて細胞周期停止を誘導し、癌細胞の増殖を抑制し、癌細
胞にてカスパーゼを活性化し、癌細胞にてアポトーシスを誘発し、免疫系細胞に
よるサイトカイン産生を刺激する新規組成物および方法が引き続き必要である。

【００１８】 ［発明の概要］ 本発明は、（Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x）_n、（Ｇ _x Ｔ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（ここで、ｘお
よびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、
１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２
〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列
」）を含む組成物および方法であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停
止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならび
に免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発す
る組成物および方法を提供することにより、この要求を満たす。

【００１９】 配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを
含む動物に、上記動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。癌細胞
において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性化する、
およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン産生を
刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術における長い間切実
に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む動物の
ために重要な有益性を提供する。

【００２０】 したがって、本発明の目的は、ヒトを含む動物において、疾患を治療するのに
有効な組成物および方法を提供することである。

【００２１】 本発明の別の目的は、癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供するこ
とである。

【００２２】 本発明の別の目的は、細胞において老化を誘発する組成物および方法を提供す
ることである。

【００２３】 本発明の別の目的は、細胞において細胞周期停止を誘導する組成物および方法
を提供することである。

【００２４】 本発明の別の目的は、癌細胞において細胞周期停止を誘発する組成物および方
法を提供することである。

【００２５】 本発明の別の目的は、細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供すること
である。

【００２６】 本発明の別の目的は、癌細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供するこ
とである。

【００２７】 本発明の別の目的は、細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方法
を提供することである。

【００２８】 本発明の別の目的は、癌細胞においてアポトーシスを誘発する組成物および方
法を提供することである。

【００２９】 本発明の別の目的は、癌細胞においてＦａｓ非依存的にアポトーシスを誘発す
る組成物および方法を提供することである。

【００３０】 本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＮＦＲ１非依存的にアポトーシスを誘
発する組成物および方法を提供することである。

【００３１】 本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ５３／ｐ２１非依存的にアポトーシス
を誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３２】 本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ２１／ｗａｆ−１／ＣＩＰ非依存的に
アポトーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３３】 本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１５^ink4B非依存的にアポトーシスを
誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３４】 本発明の別の目的は、癌細胞においてｐ１６^ink4非依存的にアポトーシスを誘
発する組成物および方法を提供することである。

【００３５】 本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼ３非依存的にアポトーシスを
誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３６】 本発明の別の目的は、癌細胞においてＴＧＦ−ベータ１受容体非依存的にアポ
トーシスを誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３７】 本発明の別の目的は、癌細胞においてホルモン依存性に非依存的にアポトーシ
スを誘発する組成物および方法を提供することである。

【００３８】 本発明の別の目的は、癌細胞において薬剤耐性に非依存的にアポトーシスを誘
発する組成物および方法を提供することである。

【００３９】 本発明の別の目的は、細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方法
を提供することである。

【００４０】 本発明の別の目的は、癌細胞においてカスパーゼを活性化する組成物および方
法を提供することである。

【００４１】 本発明の別の目的は、自己免疫疾患を治療するための組成物および方法を提供
することである。

【００４２】 本発明の別の目的は、リンパ球増殖疾患を治療するための組成物および方法を
提供することである。

【００４３】 本発明の別の目的は、感染を治療するための組成物および方法を提供すること
である。

【００４４】 本発明の別の目的は、炎症を治療するための組成物および方法を提供すること
である。

【００４５】 本発明の別の目的は、ＴまたはＢ細胞活性化を調節するための組成物および方
法を提供することである。

【００４６】 本発明の別の目的は、前駆細胞成熟を調節するための組成物および方法を提供
することである。

【００４７】 本発明の別の目的は、赤血球新生を調節するための組成物および方法を提供す
ることである。

【００４８】 本発明の別の目的は、細胞における転写因子を調節するための組成物および方
法を提供することである。

【００４９】 本発明の別の目的は、細胞に対する他の治療薬の効果を増強する組成物および
方法を提供することである。

【００５０】 本発明の別の目的は、癌細胞に対する化学療法剤の効果を増強する組成物およ
び方法を提供することである。

【００５１】 本発明の別の目的は、照射の抗腫瘍性効果を増強する組成物および方法を提供
することである。

【００５２】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるサイトカイン産生を刺激する組成物
および方法を提供することである。

【００５３】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１ベータ産生を刺激する組成
物および方法を提供することである。

【００５４】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−６産生を刺激する組成物およ
び方法を提供することである。

【００５５】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１０産生を刺激する組成物お
よび方法を提供することである。

【００５６】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＩＬ−１２産生を刺激する組成物お
よび方法を提供することである。

【００５７】 本発明の別の目的は、免疫系の細胞によるＴＮＦ−α産生を刺激する組成物お
よび方法を提供することである。

【００５８】 本発明の別の目的は、調製するのが容易である組成物を提供することである。

【００５９】 本発明の別の目的は、レシピエントにとって最小限の毒性である組成物を提供
することである。

【００６０】 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下に開示される実施形
態の詳細な説明および上記特許請求の範囲を読んだ後に明らかになるであろう。

【００６１】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、（Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x）_n、（Ｇ _x Ｔ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（ここで、ｘお
よびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよびｂは、
１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択される２
〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（これ以降、「配列
」）を含む組成物であって、上記配列は、癌細胞における細胞周期停止の誘発、
増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細
胞によるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発する組成物を
提供する。

【００６２】 配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、癌を有する、ヒトを
含む動物に、ヒトを含む動物において癌を治療するのに有効な量で投与される。
癌細胞において細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、アポトーシスを誘発
する、およびカスパーゼを活性化する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイン
産生を刺激する、配列の予期せぬ、かつ驚くべき能力は、医療技術において長い
間切実に感じられてきた満たされてない要求に対処するものであり、ヒトを含む
動物のために重要な有益性を提供する。

【００６３】 本明細書中で使用する「配列」という言葉は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基を含む
２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’ＯＨ合成オリゴヌクレオチドを指す。

【００６４】 本明細書中で使用する「ＧＴ」、「ＡＧ」、「ＣＧ」、「ＧＧ」、「ＡＧＴ」
および「ＣＧＴ」という略語は、任意の順序で合成される指定塩基を含む配列を
指す。

【００６５】 本明細書で使用する「応答」という言葉は、癌細胞における細胞周期停止の誘
導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫
系細胞によるサイトカイン産生の刺激を指す。

【００６６】 本明細書中で使用する「治療上の処置」および「に有効な量」という語句は、
癌細胞において、細胞周期停止を誘導する、増殖を抑制する、カスパーゼを活性
化する、およびアポトーシスを誘発する、ならびに免疫系細胞によるサイトカイ
ン産生を刺激するのに有効な配列の量を指す。

【００６７】 本明細書中で使用する「懸濁(suspension)腫瘍モデル」および「固形腫瘍モデ
ル」という語句は、原発もしくは転移性癌腫または肉腫を指す。

【００６８】 本明細書中で使用する「化学療法」という語句は、国もしくは州政府の管理機
関により是認されているか、または、米国薬局方もしくは他の一般に認められて
いる薬局方にて列挙されている、ヒトを含む動物において癌を治療するためのい
ずれの薬剤を指す。

【００６９】 本明細書中で使用する「抗腫瘍性」という言葉は、癌細胞の発達、成熟、増殖
または展開を防止することを指す。

【００７０】 本明細書で使用する「増強する」という言葉は、各薬剤の加法的活性よりも大
きな相乗作用の程度を指す。

【００７１】 本明細書中で使用する「相乗作用」という言葉は、２つまたはそれ以上の薬剤
の協調作用を指す。

【００７２】 ヒトを含む動物への、有効量の本発明の配列の投与は、癌、慢性関節リウマチ
、リンパ球増殖性疾患およびぜん息を含むが、これらに限定されない疾患を防止
、治療または除去する治療上の処置である。癌としては、扁平上皮癌、線維肉腫
、類肉腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基
底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、およ
びそれら由来の転移が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７３】 配列の治療上の有効性は、塩基、糖もしくはリン酸骨格を化学的に修飾するこ
と、配列を化学的に補うか、または適切な配列を含有する細菌プラスミドを用い
て配列を生物工学的に増幅すること、生物学的もしくは化学的キャリアと配列の
複合体を形成すること、あるいは組織型もしくは細胞型指向性リガンドまたは抗
体に配列を連結することを含むが、これらに限定されない方法により増加されて
もよい。

【００７４】 １つまたはそれ以上の配列および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は
、配列および薬学的に許容可能なキャリアを均一かつ密接に会合させることによ
り調製される。薬学的に許容可能なキャリアとしては、液体キャリア、固体キャ
リアあるいはその両方が挙げられる。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キ
ャリアあるいはその両方であり、懸濁水溶液、油性乳濁液、油中水型乳濁液、水
中油中水型乳濁液、部位特異的乳濁液、長期滞留乳濁液、粘着性乳濁液、ミクロ
エマルションおよびナノエマルションが挙げられるが、これらに限定されない。
固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリアまたはその両方であり、ウ
イルスベクター系、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェ
ア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および配列を持続性放出することが可能な
生分解性または非生分解性の天然もしくは合成ポリマーが挙げられるが、これら
に限定されない。固体キャリアと配列の複合体を形成するのに用いる方法として
は、固体キャリアの表面への直接吸着、直接的な、または結合部分を介した固体
キャリアの表面への共有結合、および固体キャリアを作製するのに用いるポリマ
ーへの共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、配列は、ポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン）もしくはヒアルロン酸の
ような非イオン性またはイオン性ポリマーの添加により安定化され得る。

【００７５】 好ましい水性キャリアとしては、水、生理食塩水、および薬学的に許容可能な
緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアとして
は、鉱油および中性油、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定
されない。任意に、応答細胞に配列を呈するのに用いられる薬学的に許容可能な
キャリアに関係なく、賦形剤が含まれてもよい。これらの賦形剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、および静菌薬が挙げられるが、これらに限定されず、沈殿防止
剤および増粘剤も挙げることができる。

【００７６】 １つまたはそれ以上の配列は、単独で、または化学療法剤、免疫療法剤、抗菌
剤、抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない他の治療上の様式と併用して
、もしくは放射線治療と併用して、投与されてもよい。化学療法剤としては、代
謝拮抗物質、ＤＮＡ損傷剤、微小管不安定化剤、微小管安定化剤、アクチン脱重
合剤、成長抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ抑制剤、プリン抑
制剤、ピリミジン抑制剤、メタロプロテイナーゼ抑制剤、ＣＤＫ抑制剤、血管新
生抑制剤、および分化促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７７】 投与経路としては、経口、局所、皮下、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内
、関節内、動脈内、静脈内、皮内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、髄腔
内、前立腺内、体腔内配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕、およびエレクトロ
コーポレイション(electrocorporation)が挙げられるが、これらに限定されない
。

【００７８】 投与経路に依存して、一回用量についての容量は、好ましくは一回用量につき
約０．００１〜１００ｍｌ、より好ましくは一回用量につき約０．０１〜５０ｍ
ｌ、最も好ましくは一回用量につき約０．１〜３０ｍｌである。好ましくは、一
回用量につき投与される配列量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ま
しくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇで
ある。配列または配列および治療薬は、治療される疾患、レシピエントの状態お
よび投与経路に適切なスケジュールに基づいて、かつ適切な期間にわたって、単
一用量治療、複数用量治療、または連続的に注入され得る。さらに、配列は、治
療薬の投与前に、その投与と同時に、またはその投与後に投与され得る。

【００７９】 化学療法剤と組み合わせた配列は、化学療法剤の抗腫瘍性効果を増強するのに
有効な量で、癌を有する動物に投与される。好ましくは、一回用量につき投与さ
れる治療薬の量は、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｍ²または約０．０１〜１０
００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍ²または約０．０
１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｍ²または約０
．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療薬、一
回用量についての量、用量スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法
を用いて、実行者により決定されるべきであり、癌の型、癌の重度、癌の位置、
ならびにレシピエントの大きさ、重さおよび物理的状態のような他の臨床因子に
依存するであろう。さらに、in vitroアッセイは、配列投与ならびに配列および
治療薬投与のための最適範囲を同定する助けのために任意に用いてもよい。

【００８０】 以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、本発明の配列は
、構造の新たなファミリーを形成し、それらはアンチセンスＲＮＡ、アンチセン
スＤＮＡ、三重らせん体形成ＤＮＡ、テロメラーゼ抑制剤、転写活性化因子また
は転写抑制剤として機能しないと思われる。

【００８１】 以下の実施例は、本発明を、本発明をさらに説明するのに役立つであろうが、
その際に、本発明のいかなる限定をも構成しない。反対に、様々な他の実施形態
、変更およびそれらの均等物に対する方策がなされてもよく、本明細書中の説明
を読んだ後に、これらが、本発明の精神から逸脱することなく当業者に示唆され
るであろうことは明らかに理解されるべきである。

【００８２】 実施例１ 配列の調製 ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列は、ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標
）８９００自動化ＤＮＡ合成システム(PersSeptive Biosystems, Inc., Farming
han, MA)を用いて、HUKABEL Scientific Ltd, (Montreal, Quebec, Canada)によ
り、およびAbacus Segmented合成技術を用いて、Sigma-Genosys(Woodlands, TX)
により調製された。別記しない限りは、使用する配列は、ホスホジエステル配列
であった。別記しない限りは、使用する直前に、高圧滅菌した脱イオン水、また
は生理食塩水のような（しかし、それに限定されない）高圧滅菌した薬学的に許
容可能な緩衝液中に、配列を分散した。

【００８３】 実施例２ 細胞および試薬 すべての細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, M
D)から得られ、ＡＴＣＣが推奨する培地中で培養した。表１は、細胞系、それら
の由来、およびそれらの特性を示す。

【００８４】

【表１】

【００８５】 細胞を、６（１ｍｌ／ウェル）、２４（０．５ｍｌ／ウェル）または９６（０
．１ｍｌ／ウェル）ウェルの平底マイクロプレートにて播種し、５％ＣＯ₂雰囲
気中にて３７℃で維持した。別記しない限り、２．５×１０⁵細胞／ｍｌを、Ａ
、Ｃ、ＧおよびＴを含有する２〜４５塩基配列０μｇ／ｍｌ（対照）および１０
０μｇ／ｍｌ（処理）とともに、４８時間インキュベートした。

【００８６】 実施例３ 細胞増殖の測定 ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）還元(Mosman et al.
J. Immunol. Methods 65:55, 1983)を用いて、細胞増殖を測定した。ＭＴＴは
、マルチプレート分光光度計読取り装置(ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., W
inooski, VT)を用いて、５７０ｎｍの波長にて測定した。

【００８７】 実施例４ ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞増殖の抑制 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞は、異型多数薬剤耐性ヒト懸濁腫瘍細胞モデル
である。ジャーカット細胞を、２７塩基ＧＴおよびＣＴ配列（表２）とともにイ
ンキュベートした。

【００８８】

【表２】

【００８９】 表２に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖は、試験したＧＴ配列により抑制
されたが、試験したＣＴ配列によっては抑制されなかった。

【００９０】 ジャーカットＴ細胞を、３、６、９、１２、１４、１５、１８、２１および２
４塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表３）。

【００９１】

【表３】

【００９２】 表３に示すように、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ配列は
、２１および２４塩基ＧＴ配列と同程度に効果的に、ジャーカットＴ細胞増殖を
抑制した。

【００９３】 ジャーカットＴ細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ
配列とともにインキュベートした（表４）。

【００９４】

【表４】

【００９５】 表４に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を抑制した。
ＧＴ配列番号２５は、増殖を６０％抑制し、ＡＧＴ配列番号４９は、増殖を４５
％抑制した。ＰＨＡＲＭ／ＰＣＳ−４ソフトウェア(Microcomputer Specialists
, Philadelphia, PA)を用いたＧＴ配列番号２５およびＡＧＴ配列番号４９の相
対効力の比較により、ＧＴ配列番号２５の効力は、ＡＧＴ配列番号４９の効力の
３．４倍であることがわかった。ＡＧＴ配列番号４９ホスホロチオエートは、バ
ーキットリンパ腫細胞において、テロメラーゼ活性を抑制し、アポトーシスを誘
発することが報告されている(Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189
, 1997)。

【００９６】 テロメラーゼ活性を測定するために、２×１０⁵個のジャーカットＴ細胞から
の抽出物を、ＰＣＲテロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）(Roche, Laval,
Quebec, Canada)を用いてアッセイした。１〜１００μｇ／ｍｌの濃度にて、Ｇ
Ｔ配列番号２５−ホスホジエステルは、０〜１０％の抗テロメラーゼ活性を示し
たのに対し、ＡＧＴ配列番号４９−ホスホロチオエートは、３０〜７５％の抗テ
ロメラーゼ活性を示した。ＧＴ配列番号２５−ホスホロチオエートおよびＧＴ配
列番号４９−ホスホジエステルはいずれも、抗テロメラーゼ活性を示さなかった
。

【００９７】 ジャーカットＴ細胞を、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列とともにイ
ンキュベートした（表５）。

【００９８】

【表５】

【００９９】 表５に示すように、２、３、４、５、６および７塩基ＧＴ配列は、ジャーカッ
トＴ細胞増殖を抑制した。

【０１００】 実施例５ ＨＬ−６０ヒト前骨髄球白血病細胞増殖の抑制 ＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞は、ｐ５３突然変異ヒト懸濁腫瘍モデルである
。ＨＬ−６０細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表６）。

【０１０１】

【表６】

【０１０２】 表６に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＨＬ−６０細胞増殖を抑制した。

【０１０３】 実施例６ ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞増殖の抑制 ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞は、カスパーゼ３陰性、エストロゲン依存性のヒト固
形腫瘍モデルである。ＭＣＦ−７細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を、３および６
塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表７）。

【０１０４】

【表７】

【０１０５】 表７に示すように、６および７塩基ＧＴ配列は、ＭＣＦ−７細胞増殖を抑制し
た。

【０１０６】 実施例７ ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞増殖の抑制 ＰＣ−３前立腺癌細胞は、ｐ５３突然変異、アンドロゲン非依存性のヒト固形
腫瘍モデルである。ＰＣ−３細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を、３および６塩基
ＧＴ配列とともにインキュベートした（表８）。

【０１０７】

【表８】

【０１０８】 表８に示すように、３および６塩基ＧＴ配列は、ＰＣ−３細胞増殖を抑制した
。

【０１０９】 実施例８ ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞増殖の抑制 ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞は、ＴＧＦ−ベータ１受容体陰性、アンドロゲン非依
存性の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＬＮＣａＰ細胞（５×１０⁵細胞／ｍ
ｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表９）。

【０１１０】

【表９】

【０１１１】 表９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＬＮＣａＰ細胞増殖を抑制した。

【０１１２】 実施例９ ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞増殖の抑制 ＴＨＰ−１急性単球性白血病細胞は、ｐ５３欠損ヒト懸濁腫瘍モデルである。
ＴＨＰ−１細胞（１．６×１０⁶細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ配列とともにイン
キュベートした（表１０）。

【０１１３】

【表１０】

【０１１４】 表１０に示すように、６塩基ＧＴ配列は、ＴＨＰ−１細胞増殖を抑制した。

【０１１５】 実施例１０ ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制 ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ
欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。ＯＶＣＡＲ−３細胞（５×１０⁵細胞
／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配列とともに
インキュベートした（表１１）。

【０１１６】

【表１１】

【０１１７】 表１１に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列ならびに６塩基ＡＧＴ配
列は、ＯＶＣＡＲ−３細胞増殖を抑制した。

【０１１８】 実施例１１ ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞増殖の抑制 ＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌細胞は、ｐ５３突然変異、ｐ２１／ｗａｆ−１／Ｃｉｐ
欠失、ｐ１５^ink4B欠失、Ｐ１６^ink4欠失の転移性ヒト固形腫瘍モデルである。
ＳＫ−ＯＶ−３細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を、２、６および１８塩基ＧＴ配
列とともにインキュベートした（表１２）。

【０１１９】

【表１２】

【０１２０】 表１２に示すように、２、６および１８塩基ＧＴ配列は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞
増殖を抑制した。

【０１２１】 実施例１２ ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制 １つまたはそれ以上のリン酸基上の非架橋酸素原子を、硫黄原子で置換するこ
とによる天然のホスホジエステル配列の修飾は、生物学的液体および細胞におけ
るエンドヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド配列の安定性を増加させるこ
とが報告されている(Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991)。

【０１２２】 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１３）、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞（５
×１０⁵細胞／ｍｌ）（表１４）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０⁵細胞
／ｍｌ）（表１５）を、リン酸基上の非架橋原子として、酸素（ホスホジエステ
ル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ配列とともにインキ
ュベートした。

【０１２３】

【表１３】

【０１２４】

【表１４】

【０１２５】

【表１５】

【０１２６】 表１３、１４および１５に示すように、６塩基ＧＴ−ホスホジエステル配列は
、６塩基ＧＴ−ホスホロチオエート配列よりも効果的に、ジャーカットＴ、ＬＮ
ＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞増殖を抑制した。

【０１２７】 実施例１３ 混合ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列による細胞増殖の抑制 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表１６）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５
×１０⁵細胞／ｍｌ）（表１７）を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュ
ベートした。ここで、酸素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエー
ト）が、リン酸基上の非架橋原子であった。

【０１２８】

【表１６】

【０１２９】

【表１７】

【０１３０】 表１６および１７に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５の１つまたはそれ以
上のリン酸基上の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換することにより、ジャーカッ
トＴおよびＭＣＦ−７細胞増殖の抑制の著しい減少という結果を生じた。

【０１３１】 実施例１４ マウス癌細胞増殖の抑制 ＥＬ−４マウスリンパ腫Ｔ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。ＥＬ−４マウスリ
ンパ腫Ｔ細胞を、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基Ａ
ＣＧ配列とともにインキュベートした（表１８）。

【０１３２】

【表１８】

【０１３３】 表１８に示すように、６、１８、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５
塩基ＡＣＧ配列は、ＥＬ−４マウス細胞増殖を抑制しなかった。

【０１３４】 Ａ２０マウス白血病Ｂ細胞は、懸濁腫瘍モデルである。Ａ２０マウス白血病Ｂ
細胞を、６塩基ＧＴ配列とともにインキュベートした（表１９）。

【０１３５】

【表１９】

【０１３６】 表１９に示すように、６塩基ＧＴ配列は、Ａ２０マウスＢ白血病細胞増殖を抑
制した。

【０１３７】 実施例１５ イヌ癌細胞増殖の抑制 Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞およびＣＦ−５１イヌ乳腺癌細胞は、固形腫瘍モデル
である。Ｄ−１７イヌ骨肉腫細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）（表２０）およびＣ
Ｆ５１−イヌ乳腺癌細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）（表２１）を、６、９、１７
、２７および３３塩基ＧＴ配列、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列とともにインキュ
ベートした。

【０１３８】

【表２０】

【０１３９】

【表２１】

【０１４０】 表２０および２１に示すように、６、９、１７、２７および３３塩基ＧＴ配列
、ならびに１５塩基ＡＣＧ配列は、Ｄ−１７およびＣＦ−５１イヌ細胞増殖の両
方を抑制した。

【０１４１】 実施例１６ 癌細胞増殖の抑制 ６塩基ＧＴ配列番号２５によるヒト、マウスおよびイヌ癌細胞増殖の抑制を表
２２に要約する。

【０１４２】

【表２２】

【０１４３】 表２２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５による増殖の抑制に対して、ヒ
ト癌細胞は、イヌ癌細胞およびマウス癌細胞よりも感受性が高い。

【０１４４】 実施例１７ 増殖の抑制に対する２つの６塩基ＧＴ配列の相乗効果 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、最適下限濃度（５．０μｇ／ｍｌ）の６塩
基ＧＴ配列（表２３）とともにインキュベートした。

【０１４５】

【表２３】

【０１４６】 表２３に示すように、２つの６塩基ＧＴ配列の同時使用は、ジャーカットＴ細
胞増殖の抑制に対して相乗効果があった。

【０１４７】 実施例１８ 化学療法薬剤の抗腫瘍性効果の増強作用 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、５−フルオロウラシルまたはシスプラチン
０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下にて、１．０μｇ／ｍｌ
の６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１とともにインキュベー
トした（表２４）。５−フルオロウラシルは、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨害す
る代謝拮抗物質である。シスプラチンは、ＤＮＡを架橋して、ＤＮＡ前駆体を阻
害するアルキル化剤である。

【０１４８】

【表２４】

【０１４９】 表２４に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１
は、ジャーカットＴ細胞増殖に対して、５−フルオロウラシル０．１および１．
０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増強し、ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細
胞増殖に対するシスプラチン０．１および１．０μｇ／ｍｌの抗腫瘍性効果を増
強した。

【０１５０】 ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を、５−フルオロウラシル
またはタモキシフェン０、０．１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの存在下に
て、１．０μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５および２７塩基ＧＴ配列番号１
とともにインキュベートした（表２５）。タモキシフェンは、エストロゲン拮抗
物質である。

【０１５１】

【表２５】

【０１５２】 表２５に示すように、６塩基配列番号２５は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対して、
５−フルオロウラシル０．１μｇ／ｍｌおよびタモキシフェン０．１μｇ／ｍｌ
の抗腫瘍性効果を増強した。２７塩基配列番号１は、ＭＣＦ−７細胞増殖に対す
る５−フルオロウラシルまたはタモキシフェンの抗腫瘍性活性を増強しなかった
。

【０１５３】 実施例１９ ６塩基ＧＴ配列番号２５の反復による増殖の抑制 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＧ（ＧＴ）₁ＧＧ（配列番号２５
）の１、２、３および４反復とともにインキュベートした（表２６）。

【０１５４】

【表２６】

【０１５５】 表２６に示すように、ジャーカットＴ細胞増殖の抑制は、６塩基ＧＴ配列番号
２５を用いた場合６０％であり、１２塩基ＧＴ配列番号６８、１８塩基ＧＴ配列
番号６９および２４塩基ＧＴ配列番号７０を用いた場合、減少した。６塩基ＧＴ
配列番号２５の融点（Ｔｍ）は２．５℃であり、ＧＴ配列番号６８を用いた場合
５６．８℃に、ＧＴ配列番号６９を用いた場合７６．３℃に、ＧＴ配列番号７０
を用いた場合８６．３℃に増加した。

【０１５６】 実施例２０ バチルスカルメットゲラン（ＢＣＧ）由来配列による増殖の抑制 ＢＣＧ由来配列は、in vivoにて腫瘍成長を抑制すると報告されている(Kataok
a et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。さらに、Ａ−２（配列番号７２
）およびＢＣＧ Ａ−４（配列番号７４）は、ＩＭＣ細胞と予め混合して、ＣＤ
Ｆ−１マウスに注射すると、それぞれ８８％および３７％分ＩＭＣ腫瘍成長を抑
制することが報告されている。

【０１５７】 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＢＣＧ由来の４５塩基配列とともにインキ
ュベートした（表２７）。

【０１５８】

【表２７】

【０１５９】 表２７に示すように、ＢＣＧ由来配列は、ジャーカットＴ細胞増殖を２４％以
下で抑制した。

【０１６０】 実施例２１ 細胞周期停止の誘導 ＣＹＣＬＥＴＥＳＴ（商標）ＰＬＵＳ ＤＮＡ市販用キット(Becton Dickinso
n)を用いて、細胞周期段階を測定した。要するに、非イオン性界面活性剤中に細
胞膜を溶解し、トリプシンを用いて細胞骨格および核タンパク質を除去して、細
胞ＲＮＡをＲＮアーゼで消化して、核クロマチンをスペルミンで安定化すること
により、細胞からの核を得た。ヨウ化プロピジウムを細胞核に添加して、それら
の蛍光を、電子二重識別能力を装備したフローサイトメーター(FACSCalibur, Be
cton Dickinson, San Jose, CA)にて分析した。細胞周期のＧ₀／Ｇ１、初期Ｓ（
ＳＥ）、中間Ｓ（ＳＭ）、後期Ｓ（ＳＬ）またはＧ₂／Ｍ期における細胞の蓄積
を、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴソフトウェア(Verity Software House Inc., Topsham,
MA)を用いて分析した。

【０１６１】 指数関数的に成長するジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（表２８）およびＭＣＦ
−７ヒト乳癌細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）（表２９）を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ
を含有する２、６、１５、１８、２７および４５塩基配列とともに、２４時間イ
ンキュベートした。細胞を収集して、遠心分離し、細胞周期段階を測定した。

【０１６２】

【表２８】

【０１６３】 表２８に示すように、ジャーカットＴ細胞において、２、６および２７塩基Ｇ
Ｔ配列は、細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＣＧおよびＡＧＴ、
１８塩基ＧＴおよび４５塩基ＢＣＧ−Ａ−１配列は、細胞周期のＳＭ期における
停止を誘導し、６塩基ＡＧ配列は、細胞周期のＧ₀／Ｇ₁期における停止を誘導し
た。

【０１６４】

【表２９】

【０１６５】 表２９に示すように、ＭＣＦ−７細胞において、２および６塩基ＧＴ配列は、
細胞周期のＳＥ期における停止を誘導し、６塩基ＡＧＴ配列および１８塩基ＧＴ
配列は、細胞周期のＳＭ期における停止を誘導した。

【０１６６】 実施例２２ ＧＴ配列番号２５、ＡＣ配列番号７９およびＧＴ配列番号２５＋ＡＣ配列番号
７９による細胞周期停止の誘導

【０１６７】 ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を、６塩基ＧＴ
配列番号２５、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５
＋６塩基ＡＣ配列番号７９とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番
号２５およびＡＣ配列番号７９を、このオリゴヌクレオチド（１：１）を混合し
、６５℃にて１０分間、加熱することによりハイブリダイズした。対照として、
ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９を、６５℃にて１０分間、加熱した（
表３０）。

【０１６８】

【表３０】

【０１６９】 表３０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、細胞周期のＳＥ期の末期に
おける停止を誘導したのに対し、相補的６塩基ＡＣ配列番号７９は、細胞周期に
対する効果がなかった。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブリダ
イゼーションは、ＧＴ配列番号２５による細胞周期停止の誘導を無効にした。こ
れらのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはな
らないことを実証している。

【０１７０】 実施例２３ アポトーシスの誘発 原形質膜ホスファチジルセリンの再分布および核マトリックスタンパク質（Ｎ
ｕＭＡ）の放出は、アポトーシスを受けている細胞の特質である(Martin et al.
J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 199
3)。

【０１７１】 ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ(BD Pharmingen, San Diego, CA)を用いたフローサ
イトメトリーにより、アポトーシス中の原形質膜におけるホスファチジルセリン
の再分布を測定した。市販用ＥＬＩＳＡキット(Oncogen/Calbiochem, Cambridge
, MA)を用いて、上清へのＮｕＭＡ放出を測定した。

【０１７２】 ジャーカット白血病Ｔ細胞を、３、４、５、６および７ＧＴ塩基配列、５塩基
ＡＣＧＴ配列、６塩基ＡＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＣＧＴ配列、ならびに７塩基Ｇ
Ｇ配列５０μＭとともにインキュベートした。表３１は、アポトーシス（ホスフ
ァチジルセリン／アネキシンＶ染色（ＰＳ／Ａ−Ｖ）に関して陽性）の状態にあ
る細胞％および細胞から放出されるＮｕＭＡ％を示す。

【０１７３】

【表３１】

【０１７４】 表３１に示すように、３、４、５および６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＡＧＴ
配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発した。５塩基ＡＣＧＴおよび
６塩基ＣＧＴおよびＧＧ配列は、ジャーカットＴ細胞のアポトーシスを誘発しな
かった。

【０１７５】 実施例２４ 細胞内カルシウム（Ｃａ²⁺）_iの増加 細胞内カルシウム（Ｃａ²⁺）_iの増加は、アポトーシス誘発に関連があること
が報告されている(Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993)。（Ｃａ²⁺）_iは
、蛍光プローブＦｌｕｏ−３−ＡＭ(Cell Permaant, Molecular Probes, Inc.,
Eugene, OR)を用いて追跡される。Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ蛍光の増加は、（Ｃａ²⁺
）_iの増加を示す。

【０１７６】 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、２４時
間インキュベートした。遠心分離により、細胞を収集し、１％ＦＢＳを含有する
ＰＢＳ中に懸濁させ、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ １０μＭとともに、３７℃にて１時
間負荷した。４８８ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光（ＦＬ１検出器）にて、細胞
蛍光を測定した。プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Dickinson)を用いて、
ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてデータを分析した。

【０１７７】 図１に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５とともにジャーカットＴ細胞をイ
ンキュベーションすることにより、細胞蛍光の８８％増加をもたらし、（ＣＡ²⁺ ）_iの増加を示した。

【０１７８】 実施例２５ アポトーシスの誘発 アポトーシスは、Ｆａｓ（ＣＤ９５）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むが
、これらに限定されない細胞表面受容体に結合するリガンドによって開始され得
る。ＦａｓリガンドへのＦａｓ結合、およびＴＮＦ受容体１へのＴＮＦ結合が、
細胞内シグナル伝達を開始し、結果としてシステインアスパルチルプロテアーゼ
（カスパーゼ）の活性化を生じる。カスパーゼは、核ＤＮＡ断片化、核マトリッ
クスタンパク質（ＮｕＭＡ）の放出および細胞基質接触の損失に関連したアポト
ーシス実行の致死的タンパク質分解カスケードを開始する。

【０１７９】 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞（１×１０⁶／ｍｌ）を、６および２７ＧＴ塩
基配列とともにインキュベートした（表３２）。ＮｕＭＡは、実施例２３と同様
に測定した。

【０１８０】

【表３２】

【０１８１】 表３２に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５を用いた場合のＮｕＭＡ放出％
は、２７塩基ＧＴ配列番号１、２、３および４を用いた場合のＮｕＭＡ放出％よ
りも多かった。

【０１８２】 実施例２６ ６塩基ＧＴ配列番号２５および６塩基ＡＣ配列番号７９によるアポトーシスの
誘発 ジャーカットヒト細胞白血病Ｔ細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５、相補的６塩
基ＡＣ配列番号７９、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋６塩基ＡＣ配列番号７９
とともに、２４時間インキュベートした。ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号
７９を、この配列（１：１）を混合し、６５℃にて１０分間、加熱することによ
りハイブリダイズする。対照として、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９
を、６５℃にて１０分間、加熱した（表３３）。アポトーシスは、実施例２３と
同様に評価した。

【０１８３】

【表３３】

【０１８４】 表３３に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、ジャーカットＴ細胞のアポ
トーシスを誘発したのに対し、相補的ＡＣ配列番号７９は、アポトーシスに対す
る効果がなかった。さらに、ＧＴ配列番号２５およびＡＣ配列番号７９のハイブ
リダイゼーションは、ＧＴ配列番号２５のアポトーシス誘発を無効にした。これ
らのデータは、効果的であるためには、本発明の配列は、一本鎖でなくてはなら
ないことを実証する。

【０１８５】 実施例２７ チモテ菌(Mycobacterium phlei)由来のＧＴリッチおよびＡＣリッチな配列に
よる、増殖の抑制、細胞周期停止およびアポトーシスの誘発 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、チモテ菌のｍｕｒＡ遺伝子(ジーンバンク
：アクセッション番号Ｘ９９７７６）由来のＧＴリッチまたはＡＣリッチな配列
とともにインキュベートした。増殖の抑制は、実施例３と同様に、ＭＴＴの還元
により測定し、細胞周期停止は、実施例２１と同様に、ヨウ化プロピジウムを用
いたフローサイトメトリーにより検出し、アポトーシスは、実施例２３と同様に
、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリーにより評価した。

【０１８６】

【表３４】

【０１８７】 表３４に示すように、ＧＴリッチな配列番号８１、８２および８３は、ジャー
カットＴ細胞の増殖を抑制し、この細胞にて細胞周期停止を誘導し、この細胞の
アポトーシスを誘発したのに対し、ＡＣリッチな配列番号１５は、ジャーカット
Ｔ細胞の増殖を抑制せず、この細胞にて細胞周期停止も誘導せず、また、この細
胞のアポトーシスをも誘発しなかった。

【０１８８】 実施例２８ ＧＴ配列によるカスパーゼ活性化の調節 カスパーゼは、３つの主要なペプチド基質配列：１）Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｐ（ＹＶＡＤ、カスパーゼ−１、−４および−５）（配列番号８４）、２
）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ、カスパーゼ−２、−３および−
７）（配列番号８５）および３）Ｉｌｅ−（Ｌｅｕ）−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｉ
（Ｌ）ＥＸＤ、カスパーゼ−８および−１０）（配列番号８６）を認識する(Tho
rnberry et al. J. Biol. Chem. 272:17907, 1997)。タンパク質標的における配
列認識は、第１の例：カスパーゼ３によるカスパーゼ７の調節と同様に、または
第２の例：ラミンを含むが、これらに限定されない構造タンパク質標的の分解と
同様に、または第３の例：ＰＡＲＰを含むが、これらに限定されない酵素の活性
化と同様に、標的の限られた、かつ特異的なタンパク質分解という結果を生じる
。

【０１８９】 ＮＨ₂−ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ配列構築物は、５’−Ｃ₂アミドスペーサーア
ームを用いて合成したオリゴヌクレオチド、および標準アミド−カルボキシル水
溶性カルボヘキシイミド結合法(Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sc
i. Appl. 706:149, 1998)を用いて、ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８４
）、ＮＨ₂−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ（配列番号８５）およびＮＨ₂−ＩＥＧＤ−ＣＯ
ＯＨ（配列番号８７）からなる群から選択される化学的に保護されたペプチドへ
の、化学的に保護されたＧＴ配列または化学的に保護されたＡＣ配列の化学結合
により生成される。反応性カルボキシレートおよび反応性アミン基は、結合後に
脱保護される。

【０１９０】 ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、ＮＨ₂−ＤＥＶＤ−ＣＯＯ−ＧＴ、およびＮ
Ｈ₂−Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴを含むが、これらに限定されないペプチド
−ＧＴ（以降、ＰＧＴ）配列構築物は、カスパーゼ、癌転移関連酵素、コラゲナ
ーゼおよびメタロプロテイナーゼを含むが、これらに限定されない酵素により、
ＤおよびＧＴ配列間のカルボキシレート官能基にて切断される。かかる切断によ
り、ＰＧＴからカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出が生じる。その結果得られる細
胞内カスパーゼ活性の増加は、例えば、複数薬剤耐性癌細胞における化学療法剤
の治療上の効果または弱い抗原性刺激に対する免疫応答を高める。

【０１９１】 カスパーゼ活性化を測定するために、対照および処理細胞を洗浄し、固定し、
透過化処理し、製造者が推奨する条件を用いてカスパーゼの活性体を認識するＦ
ＩＴＣ−結合抗体(Pharmingen, San Diego, CA)とともにインキュベートした。
活性カスパーゼ３と関連する蛍光は、プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴ(Becton Di
ckinson)を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲにてフローサイトメトリーにより分
析する。あるいは、カスパーゼ活性化は、着色レポーター分子ｐ−ニトロアニリ
ドに結合したカスパーゼ特異的ペプチドの切断に基づくアッセイを用いて、比色
的に測定するが、それは４０５ｎｍの波長にて分光光度的に定量することができ
る。

【０１９２】 実施例２９ ＧＴ配列番号６６、８１、８２および８３、ならびにＡＧＣ配列番号６７によ
るカスパーゼ３の活性化 ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、３３塩基ＧＴ配列番号６６、１１塩基ＧＴ
配列番号８１（ＧＴ配列番号６６の塩基１〜１１）、１１塩基ＧＴ配列番号８２
（ＧＴ配列番号６６の塩基１２〜２２）、１１塩基ＧＴ配列番号８３（ＧＴ配列
番号６６の塩基２３〜３３）、および１５塩基ＡＣＧ配列番号６７とともに、７
２時間インキュベートした。活性カスパーゼ３（１７〜２２ｋＤａ）は、実施例
２８と同様に、ＦＩＴＣ結合抗体（クローン：Ｃ９２−６０５）を用いて測定し
た。

【０１９３】 図２Ａに示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号
８１、８２および８３各々は、不活性プロカスパーゼ３の活性カスパーゼ３への
プロセシングを誘発したのに対し、１５塩基ＡＣＧ配列番号６７は、不活性プロ
カスパーゼ３の活性カスパーゼ３へのプロセシングを誘発しなかった。

【０１９４】 カスパーゼ３活性化はまた、実施例２８と同様に、比色的に測定した。図２Ｂ
に示すように、３３塩基ＧＴ配列番号６６および１１塩基ＧＴ配列番号８１、８
２および８３処理細胞におけるカスパーゼ３活性化は、対象細胞における活性化
よりも、１０５％、７７％、１００％および６０％高いのに対して、１５塩基Ａ
ＣＧ配列番号６７処理細胞では、カスパーゼ３活性化は、対照細胞とほぼ同じで
あった。

【０１９５】 実施例３０ ６塩基ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ３活性の活性化 ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号とともに、７２時間イ
ンキュベートした。カスパーゼ３活性化は、実施例２８と同様に、比色的に測定
した。図３Ａに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５処理細胞におけるカスパー
ゼ３活性化は、対照細胞における活性化よりも３２３％高かった。

【０１９６】 実施例３１ ＧＴ配列番号２５によるカスパーゼ−７の活性化およびＰＡＲＰ切断 ジャーカットＴ細胞白血病細胞を、６塩基ＧＴ配列番号２５とともに、７２時
間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍ
Ｍジチオトレイトール、１．５ｎＭアプロチニン、１０ｍＭロイペプチンおよび
２．５μｍオルトバナジン酸ナトリウムを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．５）、を用いて溶解させて、溶解産物のタンパク質含有量を測定した(Bradf
ord J. Anal. Biochem. 72:248, 1976)。

【０１９７】 活性化されたカスパーゼ７およびＰＡＲＰ切断は、ウェスタンブロット解析に
より検出された。溶解産物を、Laemmli緩衝液(Laemmli U. Nature 15:680, 1970
)と混合し、振盪し、１００℃にて４分間加熱した。タンパク５０μｇを、各レ
ーンに添加し、１０％（カスパーゼ）または１７％（ＰＡＲＰ）ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて、約１．５時間、
１００Ｖの一定電圧で電気泳動することにより、タンパクを分離した。分離した
タンパクを、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。膜のポンソーレッド染色
により、均等なタンパク負荷をモニターした。

【０１９８】 １％トリス緩衝食塩水（２ｍＭトリス−ＨＣｌ、１３．７ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．６、および０．１％ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２
０）（ＴＢＳＴ）＋５％脱脂粉乳を含有する緩衝液を用いて、４℃にて一晩、膜
をブロックした。膜を洗浄して、マウスモノクローナルＩｇＧ抗カスパーゼ７抗
体(Pharmingen)（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１０００希釈）またはマウス
モノクローナルＩｇＧ抗ＰＡＲＰ抗体（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中にて１：１００
０希釈）(Pharmingen)とともに、室温にて１時間インキュベートした。カスパー
ゼ７またはＰＡＲＰに結合したＩｇＧを、ホースラディッシュペルオキシダ−ゼ
に結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＴＢＳＴ＋５％脱脂粉乳中にて１：１０００
希釈）(Parmingen)を用いて検出した。ブロットは、強化化学発光検出システム(
ELC, Amersham, Corp., Amersham, UK)を用いて発色させた。

【０１９９】 図３Ｂに示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５は、不活性プロカスパーゼ（３
０ｋＤa）の活性カスパーゼ７（１９〜２０ｋＤａ）へのプロセシング、および
活性ＰＡＲＰの不活性８５ｋＤa分解産物へのプロセシングを誘発した。

【０２００】 実施例３２ カスパーゼ活性化の正のフィードバック増幅 ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞を、ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）Ｇ
Ｇ、ＮＨ₂−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＧ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ₂−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−Ｇ
Ｇ（ＧＴ）ＧＧ、ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、
ＮＨ₂−ＤＶＥＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣ、およびＮＨ₂−ＩＥ
ＧＤ−ＣＯ−ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣとともに、７２時間インキュベー
トした。カスパーゼ３およびカスパーゼ７活性化を測定した。

【０２０１】 ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＧＴ、ＮＨ₂−ＤＥＶＤ−ＣＯ−ＧＴ、およびＮＨ₂
−ＩＥＧＤ−ＣＯＯ−ＧＴ各々は、活性カスパーゼ３への不活性カスパーゼ３の
プロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパーゼ７のプロセシング
を誘発するのに対し、ＮＨ₂−ＹＶＡＤ−ＣＯ−ＡＣＧ、ＮＨ₂−ＤＶＥＤ−ＣＯ
−ＡＣＧ、およびＮＨ₂−ＩＥＧＤ−ＣＯ−ＡＣＧは、活性カスパーゼ３への不
活性カスパーゼ３のプロセシング、および活性カスパーゼ７への不活性カスパー
ゼ７のプロセシングを誘発しない。

【０２０２】 以下の仮説によって拘束されることを望まないものであるが、カスパーゼ含有
細胞内での基本的カスパーゼ活性は、タンパク質分解／加水分解によるＮＨ₂−
ＸＸＸＤ−ＣＯＯ−ＧＴ構築物からのカスパーゼ活性化ＧＴ配列の放出を媒介す
ると思われる。このことが、放出されるカスパーゼ活性化ＧＴ配列による細胞内
のカスパーゼ活性の正の増幅（カスパーゼ３およびカスパーゼ７のレベル増加）
という結果を生じる。

【０２０３】 実施例３３ サイトカイン産生の誘発 別記しない限り、１×１０⁶細胞を、各試験配列１００μｇ／ｍｌともに、５
％ＣＯ₂中にて３７℃で４８時間インキュベートした。サイトカインＩＬ−６，
ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦ−アルファの産生を、
適切な市販用ＥＬＩＳＡ(BioSource, Camarillo CA)を用いて、培養上清１００
μｌ中で、ｐｇ／ｍｌにて測定した。ＩＬ−１２ＥＬＩＳＡは、ＩＬ−１２ｐ７
０複合体および遊離ｐ４０サブユニットの両方を測定する。結果は、対照細胞と
比較して、処理細胞によるサイトカイン産生の「倍」（×）増として表す。

【０２０４】 ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、２、３、６、９、１２、１４、１５
および１８塩基ＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−６の産
生を測定した（表３５）。

【０２０５】

【表３５】

【０２０６】 表３５に示すように、２、３、６、９、１２、１４、１５および１８塩基ＧＴ
配列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−６産生を増加させた。

【０２０７】 ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、Ａ
ＧＴおよびＣＧＴ配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２およ
びＩＬ−６の産生を測定した（表３６）。

【０２０８】

【表３６】

【０２０９】 表３６に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧＴおよびＧＣＴ配
列は、ＴＨＰ−１細胞のサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６産生を増加させ
た。

【０２１０】 表３７は、６塩基配列によるＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘発を要約する。

【０２１１】

【表３７】

【０２１２】 ＢＣＧ由来の配列Ａ−３（配列番号７３）、Ａ−４（配列番号７４）、Ａ−６
（配列番号７５）、Ａ−７（配列番号７６）、Ｍ３（配列番号７７）およびアル
ファ１（配列番号７８）は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することが報告されて
いる(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992)。ＴＨＰ−１ヒト急
性単球性白血病細胞を、４５塩基ＢＣＧ由来配列とともにインキュベートし、サ
イトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した（表３８）。

【０２１３】

【表３８】

【０２１４】 表３８に示すように、４５塩基ＢＣＧ由来配列は、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１
２およびＩＬ−６産生を最低限に増加させた。

【０２１５】 実施例３４ ホスホジエステルおよびホスホロチオエート配列によるＩＬ−１２産生の誘発 ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸
素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ
配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定した（表
３９）。

【０２１６】

【表３９】

【０２１７】 表３９に示すように、リン酸基上の非架橋酸素原子（ホスホジエステル）を硫
黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１２
産生の著しい減少という結果を生じた。

【０２１８】 ＴＨＰ−１ヒト急性単球性白血病細胞を、リン酸基上の非架橋原子として、酸
素（ホスホジエステル）または硫黄（ホスホロチオエート）を有する６塩基ＧＴ
配列番号２５とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１２の産生を測定
した（表４０）。

【０２１９】

【表４０】

【０２２０】 表４０に示すように、６塩基ＧＴ配列番号２５において非架橋酸素原子（ホス
ホジエステル）を硫黄原子（ホスホロチオエート）で置換することは、ＴＨＰ−
１細胞のＩＬ−１２産生の著しい減少という結果を示した。

【０２２１】 実施例３５ ヒト末梢血単核細胞におけるサイトカイン合成の刺激 末梢血単核細胞（これ以降、「ＰＢＭＣ」）は、全血の密度勾配遠心分離によ
り、フィコール・ハイパック(Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Que
bec, Canada)により、７人の健常者から単離した。ＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、Ａ
ＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにインキュベートし、サイトカ
インＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生を測定した
。

【０２２２】

【表４１】

【０２２３】 表４１に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配
列は、ヒトＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０
およびＩＬ−１２産生を増加させた。

【０２２４】 実施例３６ チンパンジー末梢血単核細胞によるサイトカイン合成 実施例３５と同様に、４匹の健常なチンパンジーから、ＰＢＭＣを単離した。
チンパンジーＰＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ
配列とともにインキュベートし、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴ
ＮＦ−アルファの産生を測定した（表４２）。

【０２２５】

【表４２】

【０２２６】 表４２に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配
列は、チンパンジーＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１２な
らびにＴＮＦ−アルファの産生を増加させた。

【０２２７】 実施例３７ アカゲザル末梢血単核細胞によるサイトカイン合成 実施例３５と同様に、４匹の健常なアカゲザルから、ＰＢＭＣを単離した。Ｐ
ＢＭＣを、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配列とともにイ
ンキュベートし、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの
産生を測定した（表４３）。

【０２２８】

【表４３】

【０２２９】 表４３に示すように、６塩基ＧＴ、ＡＧＴ、ＣＧＴ、ＡＧ、ＣＧおよびＧＧ配
列は、アカゲザルＰＢＭＣ細胞のサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴ
ＮＦ−アルファの産生を増加させた。

【０２３０】 実施例３８ ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍に対する６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラ
シル、および６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンの６塩基ＧＴ配列番号２
５の効果 ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、雌ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに、異種移植片とし
て皮下に移植する。マウスを、１０匹のマウスの６群に分ける。０日目に、群１
マウスには、生理食塩水を与え、群２マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与
え、群３マウスには、５−フルオロウラシルを与え、群４マウスには、タモキシ
フェンを与え、群５マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋５−フルオロウラシ
ルを与え、群６マウスには、６塩基ＧＴ配列番号２５＋タモキシフェンを与える
。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も
大きな腫瘍サイズを有し、群２、３および４マウスは、群１マウスよりも小さな
腫瘍サイズを有し、群５および６マウスは、群１、２、３および４マウスよりも
小さな腫瘍サイズを有する。

【０２３１】 実施例３９ ＬＮＣａＰヒト前立腺癌腫瘍に対する３および６塩基ＧＴ配列ならびに４５塩
基ＢＣＧ Ａ−３配列の効果 ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を、雄ヌードｎｕ／ｎｕマウスに、異種移植片と
して皮下に移植する。マウスを、１０匹の５群に分ける。０日目に、群１マウス
には、生理食塩水を与え、群２マウスには、３塩基配列番号８を与え、群３マウ
スには、６塩基ＧＴ配列番号２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号
４５を与え、群５マウスには、４５塩基ＢＣＧ Ａ−３配列番号６９を与える。
処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウスは、最も大
きな腫瘍サイズを有し、群５マウスは、群１マウスよりも小さな腫瘍サイズを有
し、群２、３および４マウスは、群１および５マウスよりも小さな腫瘍サイズを
有する。

【０２３２】 実施例４１ ＥＬ−４マウスＴリンパ腫に対する３、６、８および２７塩基の効果 ＥＬ−４マウスＴリンパ腫細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに移植する。マウス
を、１０匹の６群に分ける。０日目に、群１マウスには、生理食塩水を与え、群
２マウスには、３塩基ＧＴ配列番号８を与え、群３マウスには、６塩基配列番号
２５を与え、群４マウスには、６塩基ＡＧ配列番号４５を与え、群５マウスには
、１８塩基ＧＴ配列番号１８を与え、群６マウスには、２７塩基ＧＴ配列番号１
を与える。処理４週後に、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを測定する。群１マウス
は、最も大きな腫瘍サイズを有し、群２、３、４、５および６マウスは、群１マ
ウスよりも小さな腫瘍サイズを有する。

【０２３３】 実施例４２ ヒト結腸癌細胞系を、付着細胞培養物として維持する。指数関数的成長相にお
ける細胞を、０μｇ／ｍｌ〜１００μｌ／ｍｌの用量範囲にて、２〜２０塩基Ｇ
Ｔ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で２４〜７２時間処理する。細胞増殖の抑制をＭ
ＴＴ還元により測定し、細胞周期停止をフローサイトメトリーにより測定し、ア
ポトーシスをアネキシン−Ｖ結合またはＮｕＭＡ放出により測定する。ＧＴ、Ｇ
Ａ、ＧＣまたはＧＧ配列は、結腸癌細胞系において、増殖を抑制し、細胞周期停
止を誘導し、アポトーシスを誘発する。

【０２３４】 皮下ヒト結腸直腸癌細胞系を有するＳＣＩＤマウスを、生理食塩水、あるいは
in vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対して抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、
ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理する。in vitroでヒト結腸直腸癌細胞系に対し
て抗癌活性を有する２〜２０塩基ＧＴ、ＧＡ、ＧＣまたはＧＧ配列で処理したマ
ウスは、生理食塩水で処理したマウスと比較して、腫瘍サイズの有意な減少を示
す。

【０２３５】 本発明について、それらの特定の実施形態を参照して詳述してきたが、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変および変更がなされ得
ることは、当業者には明らかであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにイン
キュベートしたジャーカットヒトＴ白血病細胞の蛍光［Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ］。

【図２】 細胞計算的に（Ａ）および比色的に（Ｂ）測定した０μｇ／ｍｌ
および１００μｇ／ｍｌのＧＴ配列番号６６、６７、８１、８２および８３なし
でインキュベートしたジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼ３
の活性化。

【図３】 ジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞におけるカスパーゼの活性化
。（Ａ）０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５ととも
にインキュベートした細胞におけるカスパーゼ３の活性化、（Ｂ）０μｇ／ｍｌ
および１００μｇ／ｍｌの６塩基ＧＴ配列番号２５とともにインキュベートした
細胞におけるカスパーゼ７の活性化（ａ）およびＰＡＲＰ内容物（ｂ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7125 Ａ６１Ｋ 31/7125 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 29/00 29/00 31/00 31/00 35/00 35/00 35/02 35/02 35/04 35/04 37/02 37/02 37/04 37/04 43/00 １０５ 43/00 １０５ １２１ １２１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フィリオン，マリオ シー． カナダ ケベック エイチ７イー ３ワイ ６ ラバル ジャン ド ブレビューフ 1145 Ｆターム(参考） 4C084 AA13 AA19 MA02 NA14 ZB011 ZB071 ZB091 ZB261 ZB271 ZC751 4C086 AA01 AA02 AA03 BC43 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZB01 ZB07 ZB09 ZB26 ZB27 ZC75 4C206 AA01 AA02 FA23 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZB01 ZB07 ZB09 ZB26 ZB27 ZC75

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x）_n 、（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（ここで
   、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａおよび
   ｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選択さ
   れる２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（配列）を含
   む組成物。
2. 【請求項２】 前記配列が、２〜１５塩基である、請求項１に記載の組成物
   。
3. 【請求項３】 前記配列が、２〜１０塩基である、請求項２に記載の組成物
   。
4. 【請求項４】 前記配列が、２〜７塩基である、請求項３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 配列番号７〜１８、２３〜４７、５０〜６６、および８１〜
   ８３からなる群から選択される配列を含む組成物。
6. 【請求項６】 前記配列が、配列番号７、８、９、１０、２２〜６５、７０
   〜７５、７９および８０からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 【請求項７】 薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１および
   ５に記載の組成物。
8. 【請求項８】 化学療法剤をさらに含む、請求項１および５に記載の組成物
   。
9. 【請求項９】 前記化学療法剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤およびホル
   モン拮抗物質からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 （Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x
    ）_n、（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（こ
    こで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａお
    よびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選
    択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（配列）
    を含む組成物が、癌を有する動物に、癌細胞における細胞周期停止の誘発、増殖
    の抑制、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘発、ならびに免疫系細胞に
    よるサイトカインの産生からなる群から選択される応答を誘発するのに有効な量
    で投与される方法。
11. 【請求項１１】 前記配列が、２〜１５塩基である、請求項１０に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 前記配列が、２〜１０塩基である、請求項１１に記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 前記配列が、２〜７塩基である、請求項１２に記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 配列番号７〜１８、２３〜４７、５０〜６６、および８１
    〜８３からなる群から選択される配列を含む組成物が、癌を有する動物に、癌細
    胞における細胞周期停止の誘導、増殖の抑制、カスパーゼの活性化およびアポト
    ーシスの誘発、ならびに免疫系細胞によるサイトカインの産生からなる群から選
    択される応答を誘発するのに有効な量で投与される方法。
15. 【請求項１５】 前記配列が、配列番号７、８、９、１０、２２〜６５、７
    ０〜７５、７９および８０からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法
    。
16. 【請求項１６】 前記アポトーシスの誘発が、Ｆａｓ、ｐ５３／ｐ２１、ｐ
    ２１／ｗａｆ−１／ＣＩＰ、ｐ１５^ink4B、ｐ１６^ink4、薬剤耐性、カスパーゼ
    ３、ＴＧＦ−ベータ１受容体およびホルモン依存性からなる群から選択される細
    胞系特性に非依存性である、請求項１０および１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記サイトカインが、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ
    −１０、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−アルファからなる群から選択される、請求
    項１０および１４に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記癌が、原発癌腫、転移性癌腫、原発肉腫および転移性
    肉腫からなる群から選択される、請求項１０および１４に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記癌が、白血病、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸
    癌、卵巣癌および骨癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１０お
    よび１４に記載の方法。
21. 【請求項２１】 化学療法剤をさらに含む、請求項１０および１４に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 前記化学療法剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤およびホ
    ルモン拮抗物質からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 （Ｇ_xＴ_y）_n、（Ｔ_yＧ_x）_n、ａ（Ｇ_xＴ_y）_n、ａ（Ｔ_yＧ_x
    ）_n、（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、（Ｔ_yＧ_x）_nｂ、ａ（Ｇ_xＴ_y）_nｂ、ａ（Ｔ_yＧ_x）_nｂ（こ
    こで、ｘおよびｙは、１〜７の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ａお
    よびｂは、１つまたはそれ以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）からなる群から選
    択される２〜２０塩基３’−ＯＨ，５’−ＯＨ合成オリゴヌクレオチド（配列）
    を含む組成物が、癌を有する動物に、該癌を治療するのに有効な量で投与される
    方法。
24. 【請求項２４】 配列番号７〜１８、２３〜４７、５０〜６６、および８１
    〜８３からなる群から選択される配列を含む組成物が、癌を有する動物に、該癌
    を治療するのに有効な量で投与される方法。