JP2003516744A - Ｂｃｌ−ｇポリペプチド、それをコードする核酸および使用方法 - Google Patents

Ｂｃｌ−ｇポリペプチド、それをコードする核酸および使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Bcl-Gポリペプチド、およびそれをコードする核酸を提供する。Bcl-GポリペプチドにはBcl-GＬおよびBcl-GＳが含まれる。本発明はマウスBcl-Gも提供する。また、本発明は、Bcl-G核酸を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、Bcl-Gアンチセンス核酸および関連組成物も提供する。本発明は加えて、Bcl-G核酸とのハイブリダイゼーションまたは増幅に用いることができるBcl-Gオリゴヌクレオチドを提供する。抗Bcl-G特異的抗体も提供する。さらに、Bcl-G核酸またはBcl-G特異的抗体を含むキットも提供する。このようなキットおよび試薬は、癌患者の癌の診断、治療に対する反応性のモニタリング、または予後の予測に用いることができる。本発明は加えて、Bcl-Gポリペプチド、それをコードする核酸、またはBcl-Gポリペプチドの活性もしくは発現を修飾する化合物を用いる、アポトーシスの修飾のための方法を提供する。アポトーシスを修飾するための方法は、癌などの疾患の治療に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授
与された助成金番号GM60554の下で、米国政府の援助を受けてなされた。米国政
府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】 発明の背景 本発明は一般にプログラム細胞死の調節に関し、より詳細にはプログラム細胞
死を促進する分子に関する。
【０００３】 本質的にすべての自己再生組織では、有糸***誘発による細胞の産生とプログ
ラム細胞死に起因する細胞喪失との間にバランスがとられ、それによって細胞の
総数が生理的に適切な範囲に維持されている。しかし、病的状態では細胞産生と
細胞喪失との間のバランスが壊れることがある。例えば、癌では、細胞周期時間
の短縮に起因する細胞産生量の増加、またはプログラム細胞死経路の調節不全に
起因する細胞死量の減少が、腫瘍の成長を引き起こす。
【０００４】 プログラム細胞死に関しては、さまざまな刺激が細胞外または細胞内から生じ
、最終的には細胞のアポトーシスをもたらす経路を惹起する。大部分のシグナル
伝達経路に共通するように、アポトーシスを誘導する種々の異なる刺激は、特異
的な経路を経て細胞死のプロセスを惹起する可能性が高い。しかし、これらの初
期経路のすべてではないにせよ大部分は、Bcl-2ファミリーの蛋白質のメンバー
が一般にかかわる共通の点に収束する。
【０００５】 Bcl-2ファミリーの蛋白質はプログラム細胞死およびアポトーシスに関する進
化的に保存された経路における末端の段階を調節し、このファミリーのメンバー
の中には細胞死の抑制因子として働くもの（抗アポトーシス蛋白質）もあれば、
細胞死の促進因子として働くものもある（前アポトーシス蛋白質）。抗アポトー
シス蛋白質、例えばBcl-2の発現は、神経栄養因子の除去、種々のオキシダント
、グルコースの除去、ある種の神経栄養性ウイルスおよびアミロイドβペプチド
を含む、種々の刺激によって通常であれば誘発される神経細胞死を阻止する。さ
らに、Bcl-2はいくつかの腫瘍細胞で過剰発現され、一部には、細胞***と細胞
死との間のバランスを変化させることによって腫瘍成長の一因となっている可能
性がある。
【０００６】 Bcl-2ファミリーの蛋白質は、アポトーシスに関与する経路の極めて重要な調
節因子であり、細胞死の抑制または促進に作用する（リード（Reed）、Nature 3
87：773〜776（1997）；グリーン（Green）およびリード（Reed）、Science 281
：1309〜1312（1998）；リード（Reed）、Oncogene 17：3225〜3236（1998）；
リード（Reed）、Curr. Opin. Oncol. 11：68〜75（1999））。Bcl-2ファミリー
のメンバーは、Bcl-2およびBcl-XLを含む、アポトーシス抑制活性を有するもの
、ならびにBaxおよびBakを含む、前アポトーシス活性を有するものという2つの
群に分けることができる。
【０００７】 Bcl-2ファミリーのメンバーでは4つの異なるドメインが同定されており、BH1
〜BH4と命名されている。BH4ドメインは種々の細胞蛋白質との相互作用を媒介す
るドメインである（リード（Reed）、前記、1998）。BH1、BH2およびBH3ドメイ
ンは、BH3ドメインを有する他のBcl-2メンバーとの二量体化のための結合ポケッ
トを形成するほか、二量体化用結合ポケットと結合するリガンドとしても働く。
Bcl-2メンバーの二量体化機能は、前アポトーシスBcl-2メンバーのアポトーシス
抑制性Bcl-2メンバーとのヘテロ二量体化によって細胞アポトーシス経路の調節
が可能になるという点で、アポトーシスを調節するための重要な機構である。い
くつかのBcl-2メンバーはBH3ドメインのみを有し、このため、Bcl-2およびBcl-X L などの抗アポトーシス蛋白質のトランスドミナント阻害因子として働く（リー
ド（Reed）、前記、1998）。
【０００８】 Bcl-2メンバーのもう1つの機能は、イオンチャンネルの形成である。Bcl-2メ
ンバーはミトコンドリア膜に局在可能であり、ミトコンドリアの透過性を変化さ
せるイオン透過孔の形成は、アポトーシスの誘導のための重要なシグナル伝達機
構であると考えられている。このように、Bcl-2メンバーは、アポトーシス活性
の調節に、Bcl-2メンバーとの二量体化、ミトコンドリアにおけるイオン透過孔
の形成、およびシグナル伝達分子として働く非Bcl-2メンバーとの結合という少
なくとも3種類の機構を用いている。
【０００９】 これに対して、前アポトーシス蛋白質、例えばBaxの過剰発現は、増殖因子の
除去、電離放射線および抗Fas抗体を含む、種々のアポトーシス誘導因子によっ
て誘発された場合に細胞死を促進する。さらに、虚血、てんかん、脊髄損傷、な
らびにパーキンソン病およびアルツハイマー病などのある種の神経変性疾患に起
因する神経細胞死を含む、種々の刺激によって誘導された細胞死に伴ってBax発
現の上昇が起こる。
【００１０】 Bcl-2ファミリーの蛋白質のメンバーの異常発現はさまざまな病的状態と関連
があるが、これらの蛋白質が作用を媒介する機構はわかっていない。蛋白質の作
用は、機能がわかっている他の蛋白質との構造的関連性から推測されることがし
ばしばである。しかし、Bcl-2ファミリーの蛋白質の間には互いにある程度の構
造的相同性があるものの、他の蛋白質との間には実質的なアミノ酸配列相同性が
ないことが、Bcl-2およびBaxなどのBcl-2ファミリーの蛋白質がいかにして細胞
死を調節しているかを解明する取り組みをさらに妨げている。
【００１１】 このため、プログラム細胞死経路に関与する蛋白質を同定すること、および癌
の治療を含む治療的応用のためにプログラム細胞死を調節する方法を同定するこ
とに関する需要がある。本発明はこの需要を満たすとともに、ほかにも関連した
利点を提供する。
【００１２】 発明の概要 本発明によれば、Bcl-Gポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子が提供
される。本発明のポリペプチドおよびそれをコードする核酸は、Bcl-Gの発現ま
たは活性を変化させることによってアポトーシスを修飾するのに有用である。Bc
l-Gポリペプチドおよびそれをコードする核酸は、癌、特に前立腺癌、卵巣癌お
よび白血病の診断または治療に有益に用いることができる。さらに、Bcl-Gポリ
ペプチドおよびそれをコードする核酸は、Bcl-Gの活性または発現を変化させう
る作用物質の作製またはスクリーニングのために有用であり、これはさらに癌の
治療に用いることができる。Bcl-GポリペプチドにはBcl-GＬおよびBcl-GＳが含
まれる。
【００１３】 本発明はまた、Bcl-G核酸を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細
胞、Bcl-Gアンチセンス核酸および関連組成物も提供する。本発明は加えて、Bcl
-G核酸とのハイブリダイゼーションまたは増幅に用いることができるBcl-Gオリ
ゴヌクレオチドを提供する。抗Bcl-G特異的抗体も提供する。さらに、Bcl-G核酸
またはBcl-G特異的抗体を含むキットも提供する。このようなキットおよび試薬
は、癌患者の癌の診断、治療に対する反応性のモニタリング、または予後の予測
に用いることができる。本発明は加えて、Bcl-Gポリペプチド、それをコードす
る核酸、またはBcl-Gポリペプチドの活性もしくは発現を修飾する化合物を用い
る、アポトーシスの修飾のための方法を提供する。アポトーシスを修飾するため
の方法は、癌などの疾患の治療に用いることができる。
【００１４】 発明の詳細な説明 本発明に従って、Bcl-Gポリペプチドをコードする核酸またはその機能的ポリ
ペプチド断片が提供される。本明細書において用いられるように、「Bcl-G」と
いう用語は、上記のBcl-GがBH3ドメイン（配列番号：５または９）を含む、Bcl-
2蛋白質ファミリーのサブファミリーメンバーを意味する。ヒトBcl-G遺伝子は、
染色体12p12.3にマッピングされることが判明している（実施例II）。第12染色
体のこの領域は癌細胞、特に急性リンパ芽球性白血病（ALL）および他の固形腫
瘍細胞（バエンズ（Baens）ら、（1999）、Genomics 56：40〜50（1999）；ハッ
タ（Hatta）ら、Br. J. Cancer 75：1256〜1262（1997）；キベル（Kibel）ら、 Cancer Res. 58：5652〜5655（1998）；バシチェット（Baccichet）ら、Br. J. Haematol. 99：107〜114（1997）；アイサーニ（Aissani）ら、Leuk. Lymphoma
34：231〜239）。この領域は前立腺（約50％）、卵巣（約30％）、および白血病
（約30％）のサブセットにおいて欠失している。したがって、Bcl-Gは、腫瘍抑
制物質として機能することができる。さらに、Bcl-G核酸もしくはポリペプチド
の有無またはBcl-G核酸もしくはポリペプチド発現の変化は、癌、例えば前立腺
、卵巣癌および白血病の素因または進行のマーカーとして役立ちうる。このよう
に、本発明のBcl-G核酸および／またはポリペプチドは、癌をスクリーニングす
るために、および／または癌の治療にとっての薬剤候補物質を開発するために用
いることができる。本発明のBcl-G核酸および／またはポリペプチドはまた、本
明細書に開示のように、自己免疫、炎症、アレルギー、同種異系移植片拒絶、敗
血症、および炎症疾患を含むその他の疾患を抑制する薬剤を開発するためにも用
いることができる。
【００１５】 Bcl-2ファミリーの新規のメンバー、Bcl-Gが同定された（実施例を参照のこと
）。ヒトBCL-G遺伝子は、染色体12p12に存在するエキソン６個からなり、選択的
mRNAスプライシングを通して２つの蛋白質：それぞれアミノ酸327および252個（
長さ）からなるBcl-G（長）およびBcl-G（短）をコードする。Bcl-GLおよびBcl-
GSはその最初のアミノ酸226個が同一であるがその後は異なる。Bcl-2ファミリー
蛋白質において既に認識されているBcl-2相同性（BH）ドメインの中で、BH3ドメ
インはBcl-GLおよびBcl-GSの双方に認められるが、より長いBcl-GL蛋白質のみが
BH2ドメインを有する。Bcl-GL mRNAは、正常ヒト組織において広く発現されるの
に対し、Bcl-GS mRNAは精巣に限って認められた。細胞にBcl-GLまたはBcl-GSが
過剰発現されるとアポトーシスを誘導したが、Bcl-GSはBcl-GLよりはるかに強力
であった。Bcl-GSによるアポトーシス誘導はBH3ドメインに依存し、抗アポトー
シスBcl-XL蛋白質の同時発現によって抑制された。Bcl-XLはまた、Bcl-GSと共に
免疫沈降したが、BH3ドメインが欠失または変異しているBcl-GSの変異体とは免
疫沈降せず、Bcl-GLとも免疫沈降しなかった。Bcl-GSは、主にサイトゾルオルガ
ネラに局在するが、Bcl-GLはサイトゾル全体に広く分布した。この知見は、Bcl-
GLが潜伏状態にある可能性があり、より短いBcl-GSは構成的に活性であることを
示唆している。
【００１６】 本明細書において、本発明のBcl-Gまたはそのポリペプチド断片の改変物質と
して用いられる「生物学的に活性」または「機能的」という用語は、本明細書に
開示されるものを含むBcl-Gと類似の機能的特徴を示すポリペプチドを意味する
（実施例I〜IXを参照のこと）。本明細書に開示するように、Bcl-Gはアポトーシ
スを誘導する（実施例IVを参照のこと）。したがって、Bcl-Gの一つの機能は前
アポトーシス機能である。Bcl-Gの前アポトーシス機能は、抗アポトーシス蛋白
質Bcl-2の同時発現によって阻害される（実施例IV）。したがって、Bcl-Gのもう
一つの機能は、例えば、Bcl-2またはBcl-XL等を含むBcl-2ファミリーメンバーの
ような抗アポトーシス蛋白質による調節またはそれらとの相互作用である。Bcl-
Gは、Bcl-2ファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成するように機能して、それ
によってBcl-Gおよび／またはBcl-2ファミリーメンバーのアポトーシス活性を調
節することができる。例えば、Bcl-GSとBcl-XLとの相互作用はBH3ドメイン依存
的であることが判明し、このように、Bcl-GSの前アポトーシス活性は、そのBcl-
XLとの結合能に相関する（実施例VIを参照のこと）。
【００１７】 Bcl-Gはまた、本明細書においてイオンチャンネルとして機能することができ
ると予想される。さらに、Bcl-Gは、本明細書において、例えばミトコンドリア
に直接結合することによって、またはBcl-2もしくはBcl-XLのようなミトコンド
リアに会合する蛋白質との結合を通して、ミトコンドリアにターゲティングする
ように機能することができると予想される。Bcl-Gはまた、アデニンヌクレオチ
ド輸送体（ANT）、および電圧依存型陰イオンチャンネル（VDAC）のような他の
蛋白質に結合するように機能することができる。
【００１８】 Bcl-Gは、癌細胞においてしばしば欠失している領域における第12染色体上に
存在するため（実施例II）、本明細書において、Bcl-Gは腫瘍抑制物質として機
能すると予想される。Bcl-Gのもう一つの機能的活性は、本発明のBcl-Gに特異的
に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための免疫
原として作用することができることである。このように、Bcl-Gをコードする本
発明の核酸は、配列番号：2、4または42に記載するアミノ酸配列を含むBcl-G蛋
白質を特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコード
するであろう。そのような免疫活性は、当業者に既知の任意の方法によってアッ
セイすることができる。したがって、Bcl-G機能的断片には、Bcl-G特異的抗体を
作製するための免疫原として機能するポリペプチド断片、およびBcl-G特異的抗
体に特異的に結合する断片が含まれる。
【００１９】 Bcl-2ファミリー蛋白質は、アポトーシスの中心的な調節物質である（リード
（Reed, J.C.）、Nature 387：773〜776（1997）；アダムスおよびコリー（Adam
s and Cory）、Science 281：1322〜1326（1998）；グロス（Gross）ら、Genes Dev. 13：1899〜1911（1999）において概説される）。Bcl-2ファミリー蛋白質は
動物界全体を通じて保存されており、脊椎動物および無脊椎動物の双方において
相同体が同定されている。これらの蛋白質は、４個までの保存されたBcl-2相同
性（BH）ドメイン、すなわちBH1、BH2、BH3、およびBH4を含み、これらはそのア
ミノ酸配列類似性によって認識される。抗アポトーシスおよび前アポトーシスBc
l-2ファミリー蛋白質の双方が同定されている。これらの蛋白質は、カスパーゼ
ファミリー細胞死プロテアーゼの活性化に関係する蛋白質のミトコンドリアから
の放出のような現象に及ぼすその作用によって細胞の生存-死亡の決定を制御す
る（グロス（Gross）ら、Genes Dev. 13：1899〜1911（1999）；グリーンおよび
リード（Green and Reed）、Science 281：1309〜1312（1998）；クローマーお
よびリード（Kroemer and Reed）、Nature Medicine 6：513〜519（2000）にお
いて概説される）。多くのBcl-2ファミリー蛋白質は互いに物理的に相互作用す
ることができ、ホモおよびヘテロ二量体の複雑なネットワークを形成し、これら
の物理的相互作用は時に、ファミリーの前および抗アポトーシスメンバーの相反
する作用において重要な役割を有する。
【００２０】 Bcl-2ファミリーの前アポトーシスメンバーは、２つのグループに大きく分類
することができる。一つのグループは、ヒトにおけるBax、Bak、およびBokを含
み、特定の細菌毒素の孔形成ドメインと構造的類似性を共有し、インビトロで合
成膜に孔を形成することができる（シェンデル（Schendel）ら、Cell Death Dif fer. 5：372〜380（1998）；アントンソン（Antonsson）ら、Science 277：370
〜372（1997）；シュレンジンガー（Schlesinger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：11357〜11362（1997）；シミズ（Shimizu）ら、J. Biol. Chem. 16：1
2321〜12325（2000））。これらの蛋白質は、Bcl-2ならびにBcl-XL、Bcl-W、Bfl
-1、およびMcl-1のようなファミリーの他の細胞保護メンバーを含む、他のBcl-2
ファミリー蛋白質との結合能とは無関係に細胞障害作用を発揮する。前アポトー
シスBcl-2ファミリー蛋白質の第二のグループは、そのアミノ酸配列が広く異な
り、しばしば単一の類似性領域、BH3ドメインのみを含む。これらの「BH3のみ」
の蛋白質は、内因性または自律的細胞破壊活性を含まないように思われ、その代
わりに生存蛋白質のトランスドミナント阻害剤として機能する。Bcl-2およびBcl
-XLのような蛋白質の拮抗は、標的抗アポトーシス蛋白質上の疎水性ポケットに
対するそのBH3ドメインを通しての結合に依存する（ケレカーおよびトンプソン
（Kelekar and Thompson）、Trends Cell Biol. 8：324〜330（1998））。
【００２１】 マウスにおける遺伝子ノックアウト研究は、様々なBcl-2ファミリー遺伝子に
関して、特異的組織または特定の生理的または病理的状況において細胞の生存お
よび死亡を調節する役割が重複していないことを証明した（ベイス（Veis）ら、 Cell 75：229〜240（1993）；モトヤマ（Motoyama）ら、Science 267：1506〜15
10（1995）；クヌドソン（Knudson）ら、Science 270：96〜99（1995）；ブイレ
（Bouillet）ら、Science 286：1735〜8（1999）；イン（Yin）ら、Nature 400
：886〜891（1999））。このように、Bcl-2ファミリーの全てのメンバーを同定
して、アポトーシス調節に関与する細胞の内容を明らかにすることが重要である
。本明細書に開示するように、Bcl-2ファミリーの新規のメンバー、Bcl-Gがクロ
ーニングされて、特徴付けされた。
【００２２】 本明細書に記載の核酸分子は、そのような核酸分子を当業者に既知の多様な蛋
白質発現系に組み入れると、本発明の蛋白質を産生するために有用である。さら
に、そのような核酸分子またはその断片は、容易に検出可能な置換基によって標
識することができ、所定の試料における本発明のBcl-G遺伝子またはmRNA転写物
の存在および／または量をアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブ
として用いることができる。本明細書に記載の核酸分子およびその断片もまた、
本明細書に記載の本発明の蛋白質をコードする遺伝子を増幅するためのPCR反応
におけるプライマーおよび／または鋳型として有用である。
【００２３】 「核酸」という用語はまた、ポリヌクレオチドと呼ばれ、リボ核酸（RNA）ま
たはデオキシリボ核酸（DNA）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライ
マーを含み、一本鎖または二本鎖となりうる。DNAは、相補的DNA（cDNA）または
ゲノムDNAのいずれかとなりえて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその双方
を表しうる。核酸の例は、Bcl-GポリペプチドをコードするRNA、cDNA、または単
離されたゲノムDNAである。そのような核酸には、配列番号：１、３または41に
記載のヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含む核酸が含まれる
がこれらに限定されない。一般的に、本発明のゲノム配列には、Bcl-Gをコード
するエキソンの外側に存在するプロモーター、エンハンサーおよびイントロンの
ような調節領域が含まれるが、Bcl-Gをコードしない近位遺伝子は含まれない。
【００２４】 本明細書および請求の範囲における、DNA、RNA、ポリペプチド、または蛋白質
の改変物質として「単離された」および／または「精製された」という用語を用
いる場合、そのように命名されたDNA、RNA、ポリペプチドまたは蛋白質が人の手
によってそのような形で産生され、このようにその天然のインビボ細胞環境から
分離されていることを意味する。
【００２５】 本明細書において用いられるように、「実質的に同じヌクレオチド配列」とい
う用語は、それが中等度にストリンジェントな条件で対照ヌクレオチドとハイブ
リダイズするように参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有するDNAを
意味する。一つの態様において、参照ヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオ
チド配列を有するDNAは、配列番号：2、4または42のいずれかに記載のアミノ酸
と実質的に同じアミノ酸配列をコードする。もう一つの態様において、参照ヌク
レオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するDNAは、参照ヌクレ
オチド配列に関して少なくとも60％の同一性を有する。実質的に同じヌクレオチ
ド配列を有するDNAは、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、少なく
とも90％、または少なくとも95％の同一性を有しうる。
【００２６】 本明細書において用いられるように、核酸の「改変」はまた、参照配列に関し
て一つまたはいくつかのヌクレオチド付加、欠失、または置換を含みうる。核酸
の改変は、遺伝子コードの縮重のためにコードされたアミノ酸配列を変化させな
い置換が含まれうる。そのような改変は、故意になされた、または核酸複製の際
の変異として起こる変化に対応しうる。
【００２７】 列挙されたBcl-G配列の例としての改変には、マウス、サルおよびヒヒを含む
霊長類、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはその他の動
物種のような哺乳類種を含むその他の種の相同体に対応する配列が含まれる。ヒ
ト以外の種の対応するBcl-G配列は、PCRによって、またはゲノム、cDNAまたは発
現ライブラリーをスクリーニングすることのような、当業者に既知の方法によっ
て決定することができる。
【００２８】 本発明のBcl-Gのもう一つの例としての改変は、Bcl-Gヌクレオチド配列のスプ
ライシング異型に対応しうる。さらに、ヌクレオチド配列の改変は、例えば塩基
、糖、もしくは燐酸塩部分に対する改変を有する、または改変されたホスホジエ
ステル結合を有する一つまたはそれ以上の非天然型ヌクレオチドを含みうる。そ
のような改変は、核酸分子の安定性を増加させるために有利となりうる。
【００２９】 さらに、ヌクレオチド配列の改変は、例えば、放射標識、蛍光色素、強磁性物
質、発光タグのような検出可能な部分、またはビオチンのような検出可能な結合
物質を含みうる。そのような改変はBcl-G核酸分子の検出が望ましい応用におい
て有利となりうる。
【００３０】 本発明はまた、配列番号：１、３または41に示す核酸とは異なるが、同じ表現
型を有する核酸を含む。表現型が類似の核酸は、「機能的に同等な核酸」とも呼
ばれる。本明細書において用いられるように、「機能的に同等な核酸」という句
は、本明細書に開示の核酸と同じ1つ（または複数の）蛋白質産物を産生するた
めに実質的に同じように機能するわずかな非必然的配列変化を特徴とする核酸を
含む。特に、機能的に同等な核酸は、本明細書に開示の核酸によってコードされ
るものと同じである、または保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコード
する。例えば、保存的変化には、非極性残基の別の非極性残基による置換、また
は荷電残基の類似の荷電残基による置換が含まれる。これらの変化には、蛋白質
の三次構造を実質的に変化させない変化として当業者に認識される変化が含まれ
る。
【００３１】 遺伝子コードの縮重のために、特定のハイブリダイゼーション条件で本発明の
核酸と必ずしもハイブリダイズしないBcl-Gポリペプチドをコードする核酸が、
さらに提供される。本明細書において用いられるように、「縮重」という用語は
、参照核酸とは少なくとも一つのヌクレオチドが異なるが、参照核酸と同じアミ
ノ酸をコードするコドンを意味する。本発明のBcl-Gポリペプチドをコードする
核酸は、配列番号：2、4または42に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸
配列をコードするヌクレオチドからなりうる。
【００３２】 本発明は、Bcl-Gポリペプチドまたはその機能的断片をコードする単離された
核酸を提供する。本発明はまた、以下から選択される核酸を含む、Bcl-Gポリペ
プチドまたはその機能的断片をコードする単離された核酸を提供する： （a） 配列番号：２、４、もしくは42記載のアミノ酸配列をコードする核酸
、または （b） 上記の核酸が隣接して生物活性Bcl-Gをコードする、中等度にストリン
ジェントな条件で（a）の核酸とハイブリダイズする核酸、または （c） 上記の核酸が生物活性Bcl-Gをコードする、上記の（a）または（b）の
いずれかに関して縮重している核酸。
【００３３】 一つの態様において、好ましいBcl-Gポリペプチドには、Bcl-GLと呼ばれる長
い型とBcl-GSと呼ばれる短い型が含まれる。Bcl-GLは、BH3およびBH2ドメインを
含むがBcl-GSは、BH3ドメインのみを含む。Bcl-GSは、Baxと類似の前アポトーシ
ス活性を有することが判明した（実施例IIIを参照のこと）。
【００３４】 ハイブリダイゼーションは、染色体DNAにおいて天然に存在する結合と同様に
、水素結合による核酸の相補鎖、例えばセンス：アンチセンス鎖またはプローブ
：標的核酸の互いの結合を意味する。所定のプローブを標的-DNAとハイブリダイ
ズさせるために用いるストリンジェンシーレベルは、当業者によって容易に変化
させることができる。
【００３５】 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という句は、本明細書におい
て、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味するために用いられる。当業
者に既知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Tm ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と
温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリ
ンジェンシーで行われ、その後様々な、しかしより高いストリンジェンシーでの
洗浄を行う。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーについて言及する場
合、そのような洗浄条件に関連する。
【００３６】 本明細書において用いるように、「中等度にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション」という句は、標的核酸を相補的核酸に結合させる条件を意味する。
ハイブリダイズした核酸は一般的に、少なくとも約60％の同一性、少なくとも約
75％の同一性、より少なくとも約85％の同一性；または少なくとも約90％の同一
性を有するであろう。中等度にストリンジェントな条件は、50％ホルムアミド、
５×デンハート溶液、５×SSPE、0.2％SDSで42℃でのハイブリダイゼーションの
後、0.2×SSPE、0.2％SDS中で42℃での洗浄を行うことと同等の条件である。
【００３７】 「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という句は、0.018 M NaCl
において65℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼー
ションを可能にする条件を意味し、例えばハイブリッドが0.018 M NaCl中で65℃
で安定でない場合、本明細書において予想されるように、高ストリンジェンシー
条件で安定ではないであろう。高ストリンジェンシー条件は、例えば50％ホルム
アミド、５×デンハート溶液、５×SSPE、0.2％SDS中で42℃でのハイブリダイゼ
ーションの後に0.1×SSPE、および0.1％SDS中で65℃での洗浄によって提供され
うる。
【００３８】 「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という句は、10％ホルムア
ミド、５×デンハート溶液、６×SSPE、0.2％SDS中で22℃でのハイブリダイゼー
ション、１×SSPE、0.2％SDS中で37℃での洗浄と同等の条件を意味する。デンハ
ート溶液は１％フィコール、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）を含む。20×SSPE（塩化ナトリウム、燐酸ナトリウム、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA））は、３M塩化ナトリウム、0.2 M燐酸ナトリウム、お
よび0.025 M（EDTA）を含む。その他の適した中等度のストリンジェンシーおよ
び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は当業者に周
知であり、例えばサムブルック（Sambrook）ら、「分子のクローニング：実験マ ニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual） 」第二版、コールドスプ
リングハーバー出版、プレインビュー、ニューヨーク州（1989）；アウスユベー
ル（Ausubel）ら、上記、1999）に記載されている。ポリペプチドをコードする
核酸は、中等度にストリンジェントな条件または高ストリンジェンシー条件で、
実質的に完全な配列、または実質的な一部、例えば典型的に配列番号：1、3また
は41に記載の核酸配列の少なくとも15〜30ヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００３９】 本発明はまた、Bcl-G核酸分子、例えば配列番号：1、3または41に参照される
核酸分子と中等度にストリンジェントな条件でハイブリダイズするBcl-Gヌクレ
オチド配列の改変型を提供する。改変がBcl-Gヌクレオチド配列と少なくとも60
％の同一性を有するBcl-Gヌクレオチド配列の改変型も同様に提供する。本発明
はまた、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の
同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の
同一性、または少なくとも95％の同一性を有するBcl-Gヌクレオチド配列の改変
型も提供する。
【００４０】 任意の二つの核酸配列の同一性は、例えばBLAST 2.0コンピューターアライメ
ントに基づいてデフォルトパラメータを用いて当業者によって決定することがで
きる。BLAST 2.0検索は、タチアナ（Tatiana）ら、FEMS Microbiol. Lett. 174
：247〜250（1999）；アルツシュル（Altschul）ら、Nucleic Acids Res. 25：3
389〜3402（1997）に記載されるように、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b1
2.html.で利用できる。
【００４１】 Bcl-Gポリペプチドをコードする核酸を単離する一つの手段は、当技術分野で
周知の方法を用いて、天然または人工的にデザインされた核酸プローブによって
cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを調べることである。Bcl-G遺伝子
に由来する核酸プローブが、この目的のために特に有用である。Bcl-Gポリペプ
チドをコードするDNAおよびcDNA分子を用いて、哺乳類、例えばヒト、マウス、
ラット、ウサギ、ブタ等または他の動物起源から相補的ゲノムDNA、cDNA、もし
くはRNAを得ることができる、または当技術分野で周知の方法によってcDNAもし
くはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、関連するcDNAもし
くはゲノムクローンを単離することができる（例えば、サムブルック（Sambrook
）ら、上記、1989；アウスユベール（Ausubel）ら、上記、1999を参照のこと）
。
【００４２】 本発明はさらに、配列番号：1、3または41のいずれかに記載のBcl-Gコード部
分と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。本発明は
また、配列番号：1、3または41のいずれかに記載の配列と同じまたは実質的に同
じヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００４３】 本発明はまた、接触させることが高ストリンジェンシー条件で行われる、核酸
を含む試料を一つまたはそれ以上のBcl-Gオリゴヌクレオチドに接触させること
、およびオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を同定することによって
、哺乳類のBcl-Gをコードする核酸を同定する方法を提供する。本発明はさらに
、試料を二つまたはそれ以上のBcl-Gオリゴヌクレオチドと接触させる段階、核
酸分子を増幅する段階、および増幅を検出する段階によって、試料中のBcl-G核
酸分子を検出する方法を提供する。増幅は、例えばPCRを用いて行うことができ
る。本発明はさらに、プライマーが配列番号：1、3または41に記載の核酸配列に
由来する核酸配列を含む、Bcl-G核酸を増幅するための一本鎖核酸プライマーと
して機能するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４４】 本発明のさらなる態様に従って、選択的に、標識したBcl-Gコード核酸、また
はその断片をプローブとして用いて、ライブラリー、例えばcDNAまたはゲノムラ
イブラリー等を、新規Bcl-Gポリペプチドをコードするさらなる核酸配列に関し
て調べることができる。適したcDNAライブラリーの構築は当技術分野で周知であ
る。そのようなcDNAライブラリーのスクリーニングは当初、低ストリンジェンシ
ー条件で行われ、これは約42℃未満の温度、約50％未満のホルムアミド濃度、お
よび中等度から低い塩濃度を含む。
【００４５】 現在好ましいプローブに基づくスクリーニング条件は、温度約37℃、ホルムア
ミド濃度約20％、および塩濃度約５×塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（SS
C；20×SSCは、３M塩化ナトリウム、0.3 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.0を含む）
を含む。そのような条件によって、完全な同一性を必要とすることなく、プロー
ブ配列と実質的な程度の類似性を有する配列が同定されるであろう。「実質的な
類似性」という句は、少なくとも50％の同一性を有する配列を意味する。プロー
ブと少なくとも70％の同一性を有する配列を同定することができるが、プローブ
との同一性の程度が低い配列を区別するハイブリダイゼーション条件を選択する
。結果として、配列番号：1、3または41と実質的に同じヌクレオチド配列を有す
る核酸が得られる。
【００４６】 本明細書において用いられるように、核酸「プローブ」は、一本鎖核酸または
その類似体であり、配列番号：1、3または41のいずれかに記載の任意の連続塩基
と同じ、またはその相補鎖である、少なくとも14、少なくとも20、少なくとも50
、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、もしくは少
なくとも500連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する。さらに、本発明のBcl-G
の領域をコードする完全なcDNA、または配列番号：1、3もしくは41に対応する完
全な配列をプローブとして用いることができる。プローブは、後に述べるように
当技術分野で周知の方法によって標識することができ、例えば様々な診断キット
において用いることができる。
【００４７】 本発明はさらに、配列番号：1、3もしくは41に記載の15〜300連続ヌクレオチ
ドを含むBcl-Gオリゴヌクレオチド、またはそのアンチセンス鎖を提供する。本
明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、参照
ヌクレオチド配列から少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含む核酸分子を意味
し、少なくとも16個、17個、18個、19個、20個、もしくは少なくとも25個の隣接
ヌクレオチドを含むことができ、多くの場合、参照ヌクレオチド配列から少なく
とも30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個
、200個、225個、250個、275個、300個、325個、最大350個までの隣接ヌクレオ
チドまでを含む。参照ヌクレオチド配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖とな
りうる。
【００４８】 参照Bcl-Gヌクレオチド配列の少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含む本発
明のBcl-Gオリゴヌクレオチドは、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件でBcl-Gとハイブリダイズすることができ、このように、例えば試
料中のBcl-G DNAまたはRNAを検出するため、およびそのスプライシング異型を検
出するためのプローブとして；シークエンシングまたはPCRプライマーとして；
細胞におけるBcl-G RNAの転写を遮断するアンチセンス試薬として；またはBcl-G
核酸分子とのハイブリダイゼーションが望ましい当業者に既知の他の応用におい
て、都合よく用いることができる。
【００４９】 本明細書において用いられるように、Bcl-G核酸分子は、アルツシュル（Altsc
hul）ら、（Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402（1997）によって記載されるプ
ログラムBLASTN 2.0.9を用いて、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cg
i?Jform=0での検索によって利用できる、nr、dbest、dbsts、gss、およびhtgsデ
ータベースのような公共のデータベースに寄託された、発現された配列タグ（ES
T）、配列タグ部位（STS）、およびゲノム断片のようなBcl-Gヌクレオチド配列
（配列番号：1、3または41）と同一性を有するヌクレオチド配列からなる既知の
核酸分子を特に除外すると理解される。
【００５０】 特に、Bcl-G核酸分子は、下記のゲンバンク（gb）、EMBL（emb）、またはDDBJ
（dbj）アクセッション番号を有するヌクレオチド配列のいずれかからなる核酸
分子を特に除外する。同様に、Bcl-Gポリペプチド断片は、下記のゲンバンクア
クセッション番号を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸断片
を特に除外する。特に除外されるゲンバンクアクセッション番号には、AC005903
、AC007439、AW000827、AA399486、AW001213、AI478889、AA400686、AA398276、
AI240211、およびAA536718が含まれる。ゲンバンクアクセッション番号AC007537
として参照されるヒトBACも同様に、Bcl-G核酸から特に除外される。
【００５１】 単離された本発明のBcl-G核酸分子は、多様な診断および治療的応用において
用いることができる。例えば、本発明の単離されたBcl-G核酸分子を、上記のよ
うにプローブとして；Bcl-Gポリペプチドの組換え発現のための鋳型として；ま
たはBcl-Gに結合する細胞分子を同定するためのツーハイブリッドアッセイ法の
ようなスクリーニングアッセイ法において、用いることができる。
【００５２】 本発明のBcl-G核酸分子を産生するためのもう一つの有用な方法は、PCRおよび
Bcl-Gオリゴヌクレオチドを用いて核酸分子を増幅すること、および選択的にゲ
ル電気泳動によって得られた産物を精製することを含む。PCRまたはRT-PCRのい
ずれかを用いて、所望のヌクレオチド境界を有するBcl-G核酸分子を産生するこ
とができる。核酸配列に対する所望の改変はまた、一つまたはそれ以上の付加、
欠失、または置換を有する適当なオリゴヌクレオチドプライマーを選択すること
によって導入することができる。そのような核酸分子は、関係する任意の細胞、
組織、または種からの単一の遺伝子またはmRNAコピーと同じほど少量から開始し
て指数的に増幅させることができる。
【００５３】 本発明はこのように、試料中のBcl-G核酸を検出する方法を提供する。試料中
のBcl-G核酸を検出する方法は、望ましければ定性的または定量的のいずれかと
なりうる。例えば、Bcl-Gの存在、量、完全性、または構造は、アッセイ形式お
よびハイブリダイゼーションのために用いるプローブまたは応用のために選択し
たプライマー対に応じて望むように決定することができる。
【００５４】 単離されたBcl-G核酸分子との特異的ハイブリダイゼーションに基づくBcl-G核
酸を検出するための有用なアッセイ法は、当技術分野で周知であり、例えば、用
いるアッセイ形式に応じて、核酸分子の染色***置の変化、遺伝子コピー数の変
化、およびRNA量を検出するために用いることができるインサイチューハイブリ
ダイゼーションが含まれる。その他のハイブリダイゼーションアッセイ法には、
例えば、異なるRNAスプライシング異型の量および完全性を調べるために用いる
ことができるノザンブロットおよびRNアーゼ保護アッセイ法、ならびにDNAのコ
ピー数および完全性を調べるために用いることができるサザンブロットが含まれ
る。Bcl-Gハイブリダイゼーションプローブは、分析的方法によって検出可能な
、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光マーカー、ビオチン、または当技術分野
で既知のその他の検出可能な部分のような任意の適した検出可能な部分によって
標識することができる。
【００５５】 二つまたはそれ以上のBcl-GオリゴヌクレオチドによってBcl-G核酸を増幅する
ことに基づく試料中のBcl-G核酸を検出するための有用なアッセイ法も同様に当
技術分野で周知であり、例えば、定性的または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）；逆転写PCR（RT-PCR）；非変性ゲル電気泳動の際に電気泳動移動度の変化を
生じる一本鎖DNAの二次構造の変化に基づいてDNAにおける1つの点変異を容易に
同定することができる一本鎖構造多形（SSCP）分析；およびDNAの変異が電気泳
動ゲル上での変化した蛋白質産物によって決定される、蛋白質切断試験のような
PCR、転写、および翻訳をカップリングしたアッセイ法が含まれる。さらに、増
幅されたBcl-G核酸は、変異および変異のホットスポットを検出するためにシー
クエンシングすることができ、そのような変異を同定するために試料を大規模に
スクリーニングする特異的アッセイ法を開発することができる。
【００５６】 本発明はさらに、本発明のBcl-G核酸によってコードされる単離されたBcl-Gポ
リペプチドまたはその機能的断片を提供する。例えば、本発明は、Bcl-GL（配列
番号：２）またはBcl-GS（配列番号：４）と同じ、または実質的に同じアミノ酸
配列を含むポリペプチドを提供する。同様に、配列番号：１または３に記載の配
列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって
コードされるBcl-Gポリペプチドが提供される。さらに、配列番号：41に記載の
マウスBcl-Gヌクレオチド配列が提供される（実施例IXを参照のこと）。
【００５７】 本明細書において、ヒトにおけるBCL-2遺伝子ファミリーの新規のメンバー、
すなわちBCL-Gを記載する（実施例I〜VIIIを参照のこと）。BCL-G遺伝子はおそ
らく、二つの蛋白質産物、すなわちBcl-GLおよびBcl-GSをコードする。Bcl-2フ
ァミリー蛋白質は、４つまでの保存されたBHドメインを含む。より短いBcl-GS蛋
白質は、Bad、Hrk、Bik、Bim、Apr、およびEgl1を含むいくつかの他の前アポト
ーシスBcl-2ファミリー蛋白質と同様に、BH3ドメインのみを含む（ケレカーおよ
びトンプソン（Kelekar and Thompson）、Trends Cell Biol. 8：324〜330（199
8）；リード（Reed）、J. Oncogene 17：3225〜3236（1998）に概説されている
）。対照的に、より長いBcl-GL蛋白質は、BH2とBH3ドメインとを含む。BH1が存
在せずにBH2とBH3ドメインとが同時に存在するBcl-2ファミリー蛋白質の他の例
は知られていない。Bad蛋白質は当初、BH2ドメインを含むと示唆されていたが（
ヤン（Yang）ら、Blood 84（補則１）：373a〜380a（1994））、BH3ドメインを
含むことが示され、BH2領域を調べると、他のBH2ドメインとのアミノ酸配列の類
似性は非常に少ないことが判明している（オッチリー（Ottilie）ら、J. Biol. Chem. 272：30866〜30872（1997））。対照的に、Bcl-GLのBH2は、他のファミリ
ーメンバーのBH2ドメインと同一性または保存的アミノ酸置換を示す８残基中８
個の枝を含む。比較すると、Bad配列は同じ領域における同一または類似のアミ
ノ酸が８個中３個のみであることが判明する。このように、Bcl-GLは、アポトー
シス調節蛋白質のBcl-2ファミリー内の新規構造的異型を定義する。
【００５８】 選択的mRNAスプライシングによる異なる蛋白質イソ型の産生は、BCL-2、Bcl-X
、MCL-1、BAX、およびBIMを含むBCL-2ファミリー遺伝子の共通の特徴である（ツ
ジモトおよびクロチェ（Tsujimoto and Croce）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83：5214〜5218（1986）；オコナー（O'Connor）ら、EMBO J. 17：384〜395（19
98）；ボイズ（Boise）ら、Cell 74：597〜608（1993）；オルトバイ（Oltvai）
ら、Cell 74：609〜619（1993）；ビングル（Bingle）ら、J. Biol. Chem. 275
：22136〜22146（2000））。抗アポトーシスおよび前アポトーシス機能を有する
より短い蛋白質とより長い蛋白質、すなわちBcl-XLおよびBcl-XSをコードするBC
L-Xとは異なり、BCL-Gのより長いイソ型は、抗アポトーシス活性を示さなかった
。過剰発現させると、Bcl-GLは、アポトーシスの中等度で多様な増加を誘導し、
より短いBcl-GS蛋白質は一貫して強力な細胞障害活性を示した。この挙動は、BI
M遺伝子によってコードされる蛋白質を暗示し、これには、Bim-短（BimS）、Bim
-長（BimL）およびBim-超長（BimEL）が含まれる（オコナー（O'Connor）ら、EM BO J. 17：384〜395（1998））。より長い蛋白質BimLおよびBimELは、微小管と
会合してダイニン軽鎖（DLC）と複合体を形成して隔離され、このようにそれら
がミトコンドリアおよびその他のオルガネラの表面上でBcl-XLのような標的蛋白
質と相互作用できないようにする（プタラカス（Puthalakath）ら、Mol. Cell 3
：287〜96（1999））。対照的に、最も短いイソ型BimSは、DLCと会合しないため
に、Bcl-XL、Bcl-2、およびその他の生存蛋白質と自由に相互作用し、したがっ
て、細胞において過剰発現されるとはるかにより強力なアポトーシス活性を示す
。類推すると、より長いBcl-GL蛋白質は、同定されていない蛋白質との不活性複
合体において隔離することができる。
【００５９】 隔離蛋白質との相互作用の他に、前アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の活
性は、翻訳後改変を含む他のメカニズムによって抑制することができる。例えば
、Bad蛋白質は燐酸化によって不活化される。この蛋白質は、PKA、PKB（Akt）、
Rafl、およびPak1を含むいくつかの蛋白質キナーゼによって直接または間接的に
燐酸化することができ、このように、Bcl-2およびBcl-XLのような標的蛋白質と
二量体を形成できないようにする（リード（Reed, J.）、Oncogene 17：3225〜3
236（1998）の論評；ダッタ（Datta）ら、Genes Dev. 13：2905〜2927（1999）
）。Badの細胞内位置は、その燐酸化状態に応じて変化し、燐酸化Badはサイトゾ
ルに存在し、非燐酸化BadはミトコンドリアおよびBcl-2およびBcl-XLが存在する
他の細胞内オルガネラに会合する。この点において、Bcl-GL蛋白質は、Bcl-GSに
は認められないいくつかを含む蛋白質キナーゼA（PKA）および蛋白質キナーゼC
（PKC）の候補となる燐酸化部位を含む。しかし、Bcl-GLのインビボ燐酸化は、
予備実験において認められていない。
【００６０】 これまでに潜在的前アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を活性化することが
示されているもう一つの翻訳後改変は、蛋白質溶解である。特に、Bid蛋白質は
そのBH3ドメインを隠すアミノ酸56個までのN-末端ドメインを含み、他のBcl-2フ
ァミリー蛋白質との二量体形成能を減少させる。しかし、カスパーゼによる切断
後、N-末端ドメインの除去はBH3ドメインを暴露して、サイトゾルからミトコン
ドリアへのBidの転移に関連し、ここでチトクロームCの放出とアポトーシスを誘
導する（プタラカス（Puthalakath）ら、Cell 94：491〜501（1998）；ルオ（Lu
o）ら、Cell 94：481〜490（1998））。Bcl-GLは候補となるカスパーゼ認識部位
を含むが、Bidの有意な切断は、精製された活性カスパーゼを用いてインビトロ
で、またはアポトーシスのあいだに細胞において認められなかった。しかし、ま
だ調べていない特異的カスパーゼがBcl-GLを切断および活性化することができる
可能性がある。
【００６１】 膜に結合させる疎水性領域を保有していないが、Bcl-GS蛋白質は、細胞内オル
ガネラに構成的に会合していた。興味深いことに、BH3ドメインの除去はBcl-GS
のオルガネラターゲティングを妨害しなかったが、Bcl-XLの二量体形成を阻害し
た。このように、BH3ドメインは明らかにBcl-GSと細胞内オルガネラとの会合の
原因ではない。Bcl-GSのこのBH3非依存型ターゲティングは、BH3ドメインの除去
がミトコンドリアとの会合のみならず抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質と
の結合を排除することが認められている、Badのような、いくつかの他の「BH3の
み」のBcl-2ファミリー蛋白質とは異なる（ザ（Zha）ら、J. Biol. Chem. 272：
24101〜24104（1997））。
【００６２】 BCL-G遺伝子は染色体12p12に存在し、この領域は前立腺癌では〜50％欠失して
おり、卵巣癌では〜30％、急性リンパ球性白血病（ALLs）では〜30％欠失してい
た（キベル（Kibel）ら、J. Urol. 1：192〜196（2000）；アイサーニ（Aissani
）ら、Leuk. Lymphoma 34：231〜239（1999）；ハッタ（Hatta）ら、Br. J. Can cer 75：1256〜1262（1997））。BCL-G遺伝子の蛋白質産物の少なくとも一つが
前アポトーシス機能を阻害すると仮定すれば、BCL-Gは腫瘍抑制遺伝子を表す可
能性がある。しかし、これまで、BCL-Gのエキソンにおける体細胞変異は、これ
まで調べた腫瘍細胞株または原発腫瘍標本において双方のBCL-G対立遺伝子の欠
失を検出せず、欠失の証拠を示さなかった。したがって、BCL-G発現の喪失が、
腫瘍において、遺伝子のメチル化の変化または異常な転写もしくは転写後の調節
のような、遺伝子の構造およびDNA配列における体細胞の変化以外の手段によっ
て起こるか否かを調べるためにさらなる研究が必要である。
【００６３】 RT-PCRによるBcl-GLおよびBcl-GS mRNAの組織分布の研究から、Bcl-GL mRNAが
いくつかの正常な成人組織に存在するのに対し、Bcl-GSは精巣に限って検出され
ることが判明した。この知見は、Bcl-GS mRNAスプライシングの組織特異的調節
を示している。他のBcl-2ファミリーmRNAの組織特異的スプライシングは、これ
までに認められている。例えば、前アポトーシスBcl-XS蛋白質を産生するBcl-X
mRNAスプライシング現象は、広範囲のアポトーシス誘導に関連して、T細胞発生
の際に胸腺において、そして授乳後退行の際に乳腺において起こる（ボイズ（Bo
ise）ら、Cell 74：597〜608（1993）；ヘールマイヤー（Heermeier）ら、Mech. Dev. 56：197〜207（1996））。胎児発達の際、および正常な生理的反応または
環境障害に対する異常な病的な反応の一部としてアポトーシスが起こる、成人に
おける様々なシナリオの後に、Bcl-G転写物の異なるmRNAスプライシングパター
ンを評価するために、さらなる研究が行われている。
【００６４】 本明細書において用いられるように、「実質的に同じアミノ酸配列」という用
語は、参照アミノ酸配列に関して少なくとも約70％の同一性を有し、参照アミノ
酸配列によって定義される蛋白質の特徴である同等の機能的および生物活性を保
持するアミノ酸配列を意味する。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を
有する蛋白質は、参照アミノ酸配列に関して少なくとも約80％、より好ましくは
90％のアミノ酸同一性を有するであろう；約95％を超えるアミノ酸配列同一性が
特に好ましい。しかし、スプライシング異型として生じた、または保存的アミノ
酸置換もしくは縮重コドンの置換によって改変された、配列同一性の記述のレベ
ル未満を含むポリペプチドまたはコードする核酸も同様に、本発明の範囲に含ま
れると認識される。
【００６５】 Bcl-Gという用語には、その機能的断片またはポリペプチド類似体も同様に含
まれる。「機能的断片」という用語は、その一部が本明細書に定義するように、
対応する完全長の蛋白質の特徴である生物活性を有する限り、完全長のBcl-G蛋
白質の一部であるペプチド断片を意味する。このように、本発明はまた、本発明
のBcl-G蛋白質の機能的断片を提供し、これは本発明に記載のバイオアッセイ法
のような、結合および日常的な方法を用いて同定することができる。Bcl-Gのポ
リペプチド機能的断片は、BH3またはBH2ドメイン、例えば、配列番号：５もしく
は９に参照されるBH3ドメイン、または配列番号：６もしくは18に参照されるBH2
ドメインとなりうる。Bcl-GのBH3ドメインはBcl-2のBH3ドメインと33％同一であ
り、Bcl-XLのBH3ドメインと44％同一、そしてBaxのBH3ドメインと66％同一であ
る。
【００６６】 さらに、Bcl-Gポリペプチドの機能的断片は、Bax相同性領域となりうる。BH3
ドメインの上流の領域は、Bcl-GとBaxのあいだで70％同一であるアミノ酸残基12
個のモチーフを含む、Baxと高度の相同性を有する。したがって、そのようなBax
相同性領域は、可能性がある結合ドメインとしてBaxと同様に機能することがで
きる。Bcl-GのN-末端のアミノ酸150個は、公共のデータベースにおいて利用可能
な如何なる既知のアミノ酸配列とも類似ではない。したがって、Bcl-GのN-末端
領域は、Bcl-2ファミリーの他のメンバーと比較してBcl-Gに特異的である生物活
性を付与するBcl-G特異的機能的ドメインとして機能することができる。
【００６７】 本発明はまた、BH3（配列番号：５または９）、およびBH2（配列番号：６また
は18）からなる群より選択されるドメインを含むキメラ蛋白質を提供する。Bcl-
G機能的ドメインを含むキメラ蛋白質は、例えば、もう一つのポリペプチドと融
合させたBH2またはBH3のようなBcl-Gドメインを組換えにより発現することによ
って作製することができる。または、Bcl-G機能的ドメインは、もう一つのポリ
ペプチドとの融合体として発現させることができる。
【００６８】 本発明のもう一つの態様において、配列番号：２、配列番号：４、または配列
番号：42の配列を有する本発明のBcl-Gまたはその断片を含み、さらに異種蛋白
質からの一つまたはそれ以上の配列を含む、Bcl-G含有キメラ蛋白質が提供され
る。それに対してBcl-Gまたはその機能的断片が融合する異種蛋白質からの配列
は、例えば、キメラの回収を容易にするグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、
抗体、またはその他の蛋白質もしくはその機能的断片を含みうる。Bcl-Gまたは
その機能的断片が融合するさらなる蛋白質は例えば、キメラの同定を促進するル
シフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質、抗体、または他の蛋白質もしくはその機能的断
片が含まれるであろう。Bcl-Gまたはその機能的断片が融合されるなおさらなる
蛋白質には、例えばLexA DNA結合ドメイン、リシン、αサルシン、抗体、または
治療特性もしくはその他の生物活性を有する他の蛋白質が含まれるであろう。
【００６９】 そのようなキメラ蛋白質には、異なる２つの蛋白質からの配列が含まれるため
に、得られたキメラ蛋白質のアミノ酸配列は、典型的に天然に存在しない配列で
あろう。このように、本発明のこの態様に従って、キメラ蛋白質の配列が自然界
に存在しない、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：42の配列、また
はその断片を有する本発明のBcl-Gまたはその断片を含むキメラ蛋白質が提供さ
れる。
【００７０】 本発明のもう一つの態様において、本発明のBcl-Gポリペプチドおよびその断
片、本発明のBcl-G含有蛋白質、Bcl-G含有キメラ蛋白質、またはその組み合わせ
を含むヘテロオリゴマーが提供される。本明細書に開示されるように、Bcl-Gは
、Bcl-2ファミリーメンバーに結合するリガンドとして機能するBH3ドメインを含
む（実施例I）。Bcl-Gは、Bcl-2ファミリーメンバーに結合するように機能する
ことができる。このように、本発明のBcl-Gポリペプチド（配列番号：２、４ま
たは42）およびその断片、本発明のBcl-G含有蛋白質、Bcl-G含有キメラ蛋白質ま
たはその組み合わせを含み、さらに、Bcl-2、Bcl-XLのようなBcl-2ファミリーメ
ンバー、または他のBcl-2ファミリーメンバーを含むヘテロオリゴマーが提供さ
れる。
【００７１】 本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、Bcl-G
に関して用いる場合、二つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドまたはポリペプ
チドを意味すると解釈される。「ポリペプチド類似体」という用語には、一つま
たはそれ以上の残基が機能的に類似の残基に保存的に置換され、本明細書に記載
されるようにBcl-Gを機能的に模倣する能力を示す、本明細書に特に記載された
配列と実質的に同じアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含まれる。
Bcl-Gポリペプチドの「改変」はまた、Bcl-Gポリペプチドアミノ酸配列の保存的
置換を含む。コードされるアミノ酸の保存的置換には、例えば以下のグループに
属するアミノ酸が含まれる：（1）非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリ
ン、ロイシン、およびイソロイシン）；（2）極性中性アミノ酸（システイン、
メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびグルタミン）；（3）
極性酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）；（4）極性塩基性ア
ミノ酸（リジン、アルギニンおよびヒスチジン）；ならびに（5）芳香族アミノ
酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、およびヒスチジン）。他の
軽微な改変は、ポリペプチドが本明細書に記載したその機能の一部または全てを
保持している限り、Bcl-Gポリペプチドに含まれる。
【００７２】 本発明の機能的断片またはポリペプチド類似体のアミノ酸の長さは、アミノ酸
約５個から本発明のBcl-Gの完全長の蛋白質配列までとなりうる。特定の態様に
おいて、アミノ酸の長さには、例えば長さがアミノ酸少なくとも約10個、少なく
とも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約30個、少なく
とも約35個、少なくとも約40個、少なくとも約45個、少なくとも約50個、少なく
とも約75個、少なくとも約100個、少なくとも約150個、少なくとも約200個、少
なくとも約250個、またはそれ以上のアミノ酸から完全長のBcl-G蛋白質配列まで
が含まれる。機能的断片は、配列番号：2、4または42の隣接アミノ酸配列を含む
、Bcl-Gポリペプチドの隣接アミノ酸配列となりうる。
【００７３】 ポリペプチドの改変はまた、そのようなポリペプチドがBcl-G生物活性を示す
限り、その誘導体、類似体、および機能的模倣体を含みうる。例えば、誘導体は
、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ化のようなポリペプチドの化学修
飾、またはポリペプチドを誘導体化する任意の改変を含みうる。そのような誘導
体化分子には、例えば遊離のアミノ基が誘導体化されて塩酸アミン、p-トルエン
スルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセ
チル基、またはホルミル基を形成している分子が含まれる。遊離のカルボキシル
基は、塩、メチルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルまたはヒド
ラジドを形成するように誘導体化することができる。遊離のヒドロキシル期は、
O-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化することができる。
ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、N-im-ベンジルヒスチジンを形
成することができる。同様に、標準アミノ酸20個の一つまたはそれ以上の自然界
に存在するアミノ酸誘導体、例えば4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン
、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、またはカルボキシグルタメー
トを含むペプチドも、誘導体または類似体として含まれ、ペプチド結合によって
結合していないアミノ酸も含みうる。本発明のポリペプチドはまた、Bcl-G活性
が維持される限り、その配列が本明細書において示されるポリペプチドの配列と
比較して、残基の一つまたはそれ以上の付加および／または欠失を有する任意の
ポリペプチドが含まれる。
【００７４】 Bcl-Gポリペプチドの改変には、その機能的模倣体が含まれる。模倣体は、ポ
リペプチドの機能を模倣する化学部分を含む化学物質を含む。例えば、ポリペプ
チドが機能的活性を有する２つの荷電化学部分を含む場合、模倣体は、荷電した
化学機能が三次元空間において維持されるように、二つの荷電化学部分を空間的
方向および拘束された構造に配置する。このように、Bcl-Gの機能を提供する官
能基を配向させる模倣体は、Bcl-G誘導体の意味に含まれる。これらの改変は全
て、Bcl-Gポリペプチドまたは機能的断片がその機能を保持している限り「ポリ
ペプチド」という用語に含まれる。
【００７５】 本発明は、単離されたBcl-Gポリペプチドまたはその機能的断片を提供する。
本発明のBcl-Gポリペプチドは、当技術分野で周知の多様な方法、例えば本明細
書に記載の組換え型発現系、沈殿、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニ
ティクロマトグラフィー等によって単離することができる。その他の周知の方法
は、ドイチャー（Deutscher）ら（「蛋白質精製ガイド：酵素学的手法（Guide t o Protein Purification：Methods in Enzymology） 」、 182巻、アカデミック
出版（1990））に記載されている。または本発明の単離されたポリペプチドは、
周知の組換え方法を用いて得ることができる（例えば、サムブルック（Sambrook
）ら、上記、1989；アウスユベール（Ausubel）ら、上記、1999を参照のこと）
。本発明のポリペプチドの生化学的精製方法および条件は、当業者が選択するこ
とができ、例えば免疫学アッセイ法または機能的アッセイ法によって精製をモニ
ターすることができる。
【００７６】 本発明の1つ（または複数の）ポリペプチドを調製する手段の例は、当技術分
野で周知の方法を用いて、細菌細胞、酵母細胞、卵母細胞のような両生類細胞、
または哺乳類細胞のような適した宿主細胞においてBcl-Gをコードする核酸を発
現すること、および本明細書に記載されたように再度周知の精製方法を用いて、
発現されたポリペプチドを回収することである。本発明のポリペプチドは、本明
細書に記載されたように発現ベクターによって形質転換されている細胞から直接
単離することができる。本発明の組換えにより発現されたポリペプチドはまた、
グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）またはポリヒスチジンのような適当な
アフィニティタグとの融合蛋白質として発現させ、アフィニティ精製することが
できる。本発明のポリペプチド、生物学的機能的断片、およびその機能的同等物
は、化学合成によって産生することができる。例えば、合成ポリペプチドは、ア
プライドバイオシステムズインク、モデル430Aまたは431A自動ペプチドシンセサ
イザー（フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて、製造元によって提供
された化学を用いて作製することができる。
【００７７】 Bcl-Gポリペプチドは、アポトーシスの誘導または腫瘍抑制物質として機能す
ることを含む、Bcl-Gポリペプチドに関連する活性を増加させるために個体に投
与することができる。例えば、Bcl-Gポリペプチドは、下記のように、Bcl-Gポリ
ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて個体に治療的に投与する
ことができる。さらに、Bcl-Gポリペプチドまたはその機能的部分は、個体に直
接投与することができる。治療的ポリペプチドを投与する方法は、例えば薬学的
組成物として当業者に周知である。
【００７８】 特定の態様において、Bcl-Gポリペプチド、またはその機能的断片は、Bcl-Gポ
リペプチドまたは機能的断片が、アポトーシスを誘導するために、またはそうで
なければ腫瘍抑制物質として機能するように腫瘍にターゲティングされるように
、個体に投与することができる。Bcl-Gポリペプチドを細胞内標的に輸送する一
つの方法は、細胞膜に浸透することができる、またはインターナリゼーションに
よるような細胞内環境にポリペプチドを輸送して、それによって融合したBcl-G
ポリペプチドを細胞に流入させることができるBcl-Gポリペプチドまたは機能的
断片を細胞内ターゲティングペプチドに融合させることである。そのような細胞
内ターゲティングペプチドの一つの例は、細胞の100％までの形質導入を可能に
するHIV TATの形質導入ドメインとの融合体である（シュワルツ（Schwarze）ら
、Science 285：1569〜1572（1999）；ボチェロ-アクバニ（Vocero-Akbani）ら
、Nature Med. 5：29〜33（1999））。
【００７９】 そのような細胞内ターゲティングペプチドのもう一つの例は、アンテナペディ
アホメオ蛋白質インターナリゼーションドメイン（ホリンガー（Hollinger）ら
、J. Biol. Chem. 274：13298〜13304（1999））である。なおさらなる細胞内タ
ーゲティングペプチドは受容体媒介エンドサイトーシスを通して融合ポリペプチ
ドの結合およびインターナリゼーションを可能にする細胞表面受容体に特異的な
ペプチドである（エラビー（Ellerby）ら、Nature Med. 5：1032〜1038（1999）
）。特異的受容体相互作用を媒介するそのような細胞内ターゲティングペプチド
は、腫瘍を標的にするために都合よく用いることができる（エラビー（Ellerby
）ら、上記、1999を参照のこと）。または、本発明のBcl-Gポリペプチドは、望
ましければリポソーム、ミクロスフェア、またはその他のポリマーマトリクスに
組み入れることができる（グレゴリアディス（Gregoriadis）、「リポソーム技
術（Liposome Technology）」第I〜III巻、第二版、CRC出版、ボカラートン、フ
ロリダ州（1993））。
【００８０】 本発明はさらに、腫瘍発生ポリペプチドを実質的に純粋なBcl-G、またはその
腫瘍発生蛋白質結合断片に接触させることによって、腫瘍発生ポリペプチドの活
性を調節する方法を提供する。Bcl-Gは、Bcl-2のような腫瘍発生蛋白質に結合す
るように機能する。したがって、Bcl-G、またはBcl-2のような腫瘍発生蛋白質に
結合する機能的断片を用いて、腫瘍発生蛋白質の活性を調節することができる。
【００８１】 本発明はまた、許容可能な担体と、単離、精製されたBcl-G成熟蛋白質または
その機能的ポリペプチド断片とを単独、または互いに組み合わせて含む組成物を
提供する。これらのポリペプチドまたは蛋白質は、組換えにより誘導、化学合成
、または天然起源から精製することができる。本明細書に用いられるように、「
許容可能な担体」という用語は、燐酸緩衝生理食塩液、水、および油と水との乳
剤のような乳剤、および様々な種類の湿潤剤のような任意の標準的な薬学的担体
を含む。
【００８２】 本発明はこのように、薬学的に許容される担体と、Bcl-Gポリペプチド、Bcl-G
の機能的断片、Bcl-G調節化合物、および抗Bcl-G抗体からなる群より選択される
化合物とを含む治療組成物を提供する。本発明はさらに、薬学的に許容される担
体と、Bcl-Gポリペプチド、Bcl-Gの機能的断片、Bcl-G調節化合物、および抗Bcl
-G抗体からなる群より選択される化合物とを含む組成物の有効量を投与すること
によって、異常な細胞増殖を特徴とする病態を治療する方法を提供する。
【００８３】 mRNAの翻訳を防止するためにBcl-GポリペプチドをコードするmRNAの完全長ま
たは任意の部分と特異的に結合することができる配列を有するアンチセンス核酸
も同様に提供される。アンチセンス核酸は、Bcl-GポリペプチドをコードするcDN
Aの配列の任意の部分と特異的に結合することができる配列を有しうる。本明細
書において用いられるように、「特異的に結合する」という句は、核酸配列が相
補的核酸配列を認識できること、および相補的塩基対間の水素結合形成によって
それと二重らせん部分を形成できることを含む。アンチセンス核酸の例は、ヌク
レオチドの化学類似体を含むアンチセンス核酸である。
【００８４】 本発明は、Bcl-Gアンチセンス核酸を組換えにより発現させることによって、
またはこれらのポリペプチドをコードするmRNAの翻訳を阻害する合成アンチセン
ス核酸組成物（以降SANC）を用いることによって、Bcl-Gポリペプチドの発現レ
ベルを調節する手段を提供する。mRNAを認識して選択的に結合するようにデザイ
ンされた合成オリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス核酸化学構造は、配
列番号：1、3または41に記載のヌクレオチド配列を含む、Bcl-Gコード鎖の完全
長または一部と相補的となるように構築される。
【００８５】 SANCは、注射によって被験者に投与するために、または実験的細胞培養条件に
おいて、血流において安定となるようにデザインされる。SANCは、例えば、小さ
い疎水性のSANC化学構造をデザインすることによって、細胞膜を通して通過でき
るようにするSANCの物理的および化学的特性によって、またはSANCを認識して細
胞に輸送する細胞の特異的輸送系によって、細胞の細胞質に入るために細胞膜を
通過することができるようにデザインされる。さらに、SANCは、選択された細胞
集団内に限ってSANCに結合してこれを取り込む特異的細胞取り込みメカニズムに
よってSANCが認識されるようにターゲティングすることによって、特定の選択さ
れた細胞集団のみに投与するようにデザインすることができる。特定の態様にお
いて、SANCは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８６】 例えば、SANCは、上記のように、特定の細胞型に限って認められる受容体に結
合するようにデザインしてもよい。SANCはまた、配列番号：1、3または41に示す
配列内に含まれる配列に対応することができる標的mRNA配列を認識して特異的に
結合するようにデザインされる。SANCは、それに結合して例えばRNアーゼI消化
によってmRNAの分解を誘導することによって、または翻訳調節因子もしくはリボ
ソームの結合を妨害することによってmRNA標的配列の翻訳を阻害することによっ
て、または標的mRNAを分解もしくは化学修飾するリボザイム配列または反応性化
学基のような他の化学構造を含めることによって、標的mRNAを不活化するように
デザインされる。SANCは、mRNA標的に向けられる場合、そのような特性を示すこ
とができることが示されている（コーエン（Cohen）ら、TIPS 10：435（1989）
およびワイントラウブ（Weintraub）、Sci. American、１月（1990）、40頁）。
【００８７】 本発明はさらに、アンチセンスヌクレオチド配列がBcl-Gをコードする核酸分
子と特異的にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが細胞におけるBcl-G
の発現を減少または阻害する、アンチセンスヌクレオチド配列を細胞に導入する
ことによって、細胞におけるアポトーシスレベルを調節する方法を提供する。組
換えアンチセンス核酸またはSANCsを含むアンチセンス核酸の使用は、細胞死を
阻害するために都合よく用いることができる。
【００８８】 翻訳を防止するために、細胞に入ってBcl-GポリペプチドをコードするmRNAと
特異的に結合することによって、Bcl-Gポリペプチドの発現を減少させるために
有効な量の本発明のアンチセンス核酸と、細胞膜を通過することができる許容さ
れる疎水性担体とを含む組成物も同様に、本明細書において提供される。適した
疎水性担体は、例えば米国特許第5,334,761号、第4,889,953号、第4,897,355号
等に記載されている。細胞膜を通過することができる許容される疎水性担体はま
た、選択された細胞型に対して特異的な受容体に結合して、それによって選択さ
れた細胞型の細胞に取り込まれる構造を含んでもよい。例えば、構造は、腫瘍の
ような細胞型特異的受容体に結合することが知られている蛋白質の一部となりう
る。
【００８９】 アンチセンス核酸組成物は、本発明のポリペプチドをコードするmRNAの翻訳を
阻害するために有用である。合成オリゴヌクレオチド、またはその他のアンチセ
ンス化学構造は、Bcl-GポリペプチドをコードするmRNAに結合してmRNAの翻訳を
阻害するようにデザインされ、組織試料または被験者においてBcl-G関連遺伝子
の発現を阻害するための組成物として有用である。
【００９０】 本発明はまた、Bcl-Gの発現に適した条件でBcl-G核酸を含む細胞を培養するこ
とによって、Bcl-Gポリペプチドを発現させる方法を提供する。このように、適
した宿主細胞においてBcl-Gをコードする核酸配列を発現させることによって、
本発明のBcl-Gの組換え的産生方法が提供される。本明細書に記載のBcl-Gを産生
するために適した組換え型DNA発現系は、当技術分野で周知である（例えば、ア
ウスユベール（Ausubel）ら、上記、1999を参照のこと）。例えば、上記のヌク
レオチド配列は、さらなる操作のためにベクターに組み入れることができる。本
明細書において用いられるように、ベクターは、発現またはその複製のいずれか
のために異種DNAを細胞に導入するために用いられる別々のエレメントを含む組
換えDNAまたはRNAプラスミドまたはウイルスである。
【００９１】 本発明はまた、本発明のBcl-G核酸を含むベクターを提供する。適した発現ベ
クターは、当技術分野で周知であり、そのような核酸の発現を調節することがで
きるプロモーター領域またはエンハンサー領域のような調節配列またはエレメン
トに機能的に結合した核酸を発現することができるベクターが含まれる。適当な
発現ベクターには、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なベクタ
ー、およびエピソームとして留まるベクター、または宿主細胞ゲノムに組み入れ
るベクターが含まれる。
【００９２】 プロモーターまたはエンハンサーは、調節の特性に応じて、構成的または調節
的となりうる。調節配列または調節エレメントは、核酸と調節配列との物理的お
よび機能的関係によって核酸の転写が可能となるように、本発明の核酸と機能的
に結合している。
【００９３】 原核細胞または真核細胞における発現に適したベクターは、当業者に周知であ
る（例えば、アウスユベール（Ausubel）ら、上記、1999を参照のこと）。真核
細胞における発現にとって有用なベクターは、例えば、SV40初期プロモーター、
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）
ステロイド誘導型プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモ
ーター等を含む調節エレメント含みうる。本発明のベクターは、Bcl-G核酸分子
をサブクローニングおよび増幅するために、ならびにBcl-Gポリペプチドを組換
えにより発現させるために有用である。本発明のベクターは、例えばバクテリオ
ファージ、バキュロウイルス、またはレトロウイルスのようなウイルスベクター
；コスミドまたはプラスミド；および特に大きい核酸分子をクローニングする場
合には、細菌の人工染色体ベクター（BACs）および酵母の人工染色体ベクター（
YACs）を含みうる。そのようなベクターは市販されており、その使用は当技術分
野で周知である。当業者は特定の宿主細胞において発現にとって適当なプロモー
ターを知っている、または容易に決定するであろう。
【００９４】 本発明は、本発明のBcl-G核酸を含む組換え細胞をさらに提供する。組換え細
胞は、Bcl-G核酸分子を含むベクターを宿主細胞に導入することによって作製す
る。組換え細胞は形質導入、トランスフェクト、またはそうでなければ遺伝子改
変される。組換えBcl-G分子を発現するために用いることができる一例としての
宿主細胞には、哺乳類の初代培養細胞；COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293、およ
びPC12細胞のような確立された哺乳類細胞株；アフリカツメガエル（Xenopus)の
胚および卵母細胞のような両生類細胞；ならびにその他の脊椎動物細胞が含まれ
る。一例としての宿主細胞にはまた、ショウジョウバエ（Drosophila）のような
昆虫細胞、酵母菌（Saccharomyces serevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Sa
ccharomyces pombe）のような酵母細胞、またはピキア・パストリス（Pichia pa
storis）、および大腸菌（Escherichia coli）のような原核細胞が含まれる。
【００９５】 一つの態様において、本発明のBcl-Gポリペプチドをコードする核酸は、当技
術分野で周知の適したベクターを用いて、インビボまたはインビトロのいずれか
で哺乳類細胞に輸送することができる。Bcl-Gポリペプチド、またはその機能的
断片を哺乳類細胞に輸送するために適したベクターには、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス
のようなウイルスベクターと共に、プラスミドベクターのような非ウイルスベク
ターが含まれる。そのようなベクターは、Bcl-Gポリペプチドの治療量を提供す
るために有用である（例えば、1995年3月21日公表の米国特許第5,399,346号を参
照のこと）。Bcl-Gポリペプチドまたは核酸の治療的輸送は、腫瘍細胞にターゲ
ティングされ、それによって腫瘍細胞にアポトーシスを誘導した場合に特に有用
となりうる。さらに、本発明のBcl-Gのインビボ発現を制限または減少させるこ
とが望ましい場合、本発明の核酸のアンチセンス鎖の導入を考慮する。
【００９６】 ウイルスに基づく系は、多様な細胞に比較的高レベルの異種核酸を導入するこ
とができるという長所を提供する。Bcl-G蛋白質をコードする本発明の核酸を哺
乳類細胞に導入するための適したウイルスベクターは、当技術分野で周知である
。これらのウイルスベクターには、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター（ゲ
ラー（Geller）ら、Science 241：1667〜1669（1998））；ワクシニアウイルス
ベクター（ピシーニ（Piccini）ら、Meth. Enzymology 153：545〜563（1987）
）；サイトメガロウイルスベクター（モカルスキ（Mocarski）ら、「ウイルスベ クター（Viral Vectors） 」、グルツマンおよびヒュージズ（Y. Gluzman and S.
H. Hughes）編、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク、1988、78〜84頁）；モロニーマウス白血病ウイルスベクタ
ー（ダノス（Danos）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：6460〜6464（1998）
；ブラーゼ（Blaese）ら、Science 270：475〜479（1995）；オノデラ（Onodera
）ら、J. Virol. 72：1769〜1774（1998））；アデノウイルスベクター（バーク
ナー（Berkner）、Biotechniques 6：616〜626（1988）；コッテン（Cotten）ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6094〜6098（1992）；グラハム（Graham）
ら、Meth. Mol. Biol. 7：109〜127（1991）；リ（Li）ら、Human Gene Therapy 4：403〜409（1993）；ザブナー（Zabner）ら、Nature Genetics 6：75〜83（1
994））；アデノ随伴ウイルスベクター（ゴールドマン（Goldman）ら、Human Ge ne Therapy 10：2261〜2268（1997）；グリーリッシュ（Greelish）ら、Nature Med. 5：439〜443（1999）；ワン（Wang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96
：3906〜3910（1990）；スナイダー（Snyder）ら、Nature Med. 5：64〜70（199
9）；ヘルツォグ（Herzog）ら、Nature Med. 5：56〜63（1999））；レトロウイ
ルスベクター（ドナヒュー（Donahue）ら、Nature Med. 4：181〜186（1998）；
シャックルフォード（Shackleford）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9655
〜9659（1998）；米国特許第4,405,712号、第4,650,764号、および第5,252,479
号、ならびに国際公開公報第92/07573号、国際公開公報第90/06997号、第89/053
45号、第92/05266号、および第92/14829号）；ならびにレンチウイルスベクター
（カフリ（Kafri）ら、Nature Genetics 17：314〜317（1997））が含まれる。
【００９７】 例えば、本発明の一つの態様において、アデノウイルス-トランスフェリン／
ポリリジン-DNA（TfAdpl-DNA）ベクター複合体（ワグナー（Wagner）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6099〜6103（1992）；キュリエル（Curiel）ら、Hum . Gene. Ther. 3：147〜154（1992）；ガオ（Gao）ら、Hum. Gene. Ther. 4：14
〜24（1993））を用いて異種Bcl-G核酸を哺乳類細胞に形質導入する。本明細書
に記載の任意のプラスミド発現ベクターをTfAdpl-DNA複合体において用いてもよ
い。
【００９８】 核酸のBcl-Gポリペプチドの治療的投与にとって有用なベクターは、機能的に
結合した核酸の組織特異的または誘導型発現を提供する調節エレメントを含みう
る。当業者は、所望の組織におけるBcl-Gポリペプチドまたは核酸の発現を可能
にする適当な組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを容易に決定すること
ができる。多様な任意の誘導型プロモーターまたはエンハンサーを、Bcl-Gポリ
ペプチドまたは核酸の調節可能な発現のためにベクターに含めることができる。
そのような誘導型システムには、例えばテトラサイクリン誘導系（ゴッセンおよ
びビザード（Gossen and Bizard）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547〜55
51（1992）；ゴッセン（Gossen）ら、Science 268：1766〜1769（1995）；クロ
ンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）；重金属によって誘導されるメタ
ロチオネインプロモーター；エクジソンまたはムリステロンのような関連ステロ
イドに反応性の昆虫ステロイドホルモン（ノ（No）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：3346〜3351（1996）；ヤオ（Yao）ら、Nature 366：476〜479（1993）
；インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州）；グルココルチコイ
ドおよびエストロゲンのようなステロイドによって誘導されるマウス乳腺腫瘍ウ
イルス（MMTV）（リー（Lee）ら、Nature 294：228〜232（1981））；および温
度変化によって誘導される熱ショックプロモーターが含まれる。
【００９９】 治療的投与にとって特に有用な誘導系は、個体に投与された薬剤の所定のレベ
ルに反応したレベルの治療産物を輸送するように、そして薬剤の非存在下で治療
産物の発現がほとんどまたは全くないように調節することができる誘導型プロモ
ーターを利用する。そのような一つの系は、改変されたアデノウイルスベクター
においてミフェプロストンのような抗プロゲスチンによって誘導されるGal4融合
体を利用する（ブリエン（Burien）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：355〜
360（1999））。そのようなもう一つの誘導型は、薬剤ラパマイシンを利用して
、アデノ随伴ウイルスベクターにおいてFKBP12およびFRAPのラパマイシン結合ド
メインを含む転写活性剤の再構築を誘導する（エ（Ye）ら、Science 283：88〜9
1（1999））。誘導系の任意の組み合わせを、本明細書に記載の系を含む任意の
適したベクターと組み合わせることができると理解される。そのような調節可能
な誘導系は、治療産物の発現レベルが個体に投与される薬剤量によって制御可能
であることから、または望ましければ、治療産物の発現は、薬剤の投与を停止す
ることによって終了させることができることから、都合がよい。
【０１００】 本発明はさらに、Bcl-Gに対する特異的反応性を有する単離された抗Bcl-G抗体
を提供する。抗Bcl-G抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とな
りうる。本発明はさらに、Bcl-Gに対する特異的反応性を有するモノクローナル
抗体を産生する細胞株を提供する。
【０１０１】 本発明はこのように、Bcl-Gポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する
。本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、その最も広い意
味において、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共にそのような抗
体の抗原結合断片を含むように用いられる。本発明の抗Bcl-G抗体に関して、「
抗原」という用語は、天然もしくは合成Bcl-Gポリペプチドまたはその断片を意
味する。抗Bcl-G抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片は、Bcl-Gポリペプ
チドまたはそのペプチド部分に対して少なくとも約１×105 M-1の特異的結合活
性を有するという特徴を有する。このように、Bcl-Gポリペプチドに対する特異
的結合活性を保持する抗Bcl-G抗体のFab、F(ab')2、Fd、およびFv断片は、抗体
の定義に含まれる。Bcl-Gポリペプチドの特異的結合活性は、例えばBcl-Gポリペ
プチドに対する抗Bcl-G抗体の結合活性をBcl-Gポリペプチドでない対照ポリペプ
チドと比較することによって、当業者によって容易に決定することができる。ポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は当業者に周知であ
る（例えば、ハーロウおよびレーン（Harlow and Lane、「抗体：実験マニュア
ル（Antibodies：A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバー研究
所出版（1988）を参照のこと）。
【０１０２】 さらに、本明細書に用いられる「抗体」という用語には、自然界に存在する抗
体と共に、例えば一本鎖抗体、キメラ、双機能およびヒト化抗体と共にその抗原
結合断片を含む自然界に存在しない抗体が含まれる。そのような自然界に存在し
ない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えにより産生
することができ、または例えば、ヒューズ（Huse）ら（Science 246：1275〜128
1（1989））によって記載されるように、可変型重鎖および可変型軽鎖からなる
組み合わせライブラリーをスクリーニングすることによって産生することができ
る。例えば、キメラ、ヒト化、CDR移植、一本鎖、および二機能性抗体を作製す
るこれらおよびその他の方法は、当業者に周知である（ウィンターおよびハリス
（Winter and Harris）、Immunol. Today 14：243〜248（1993）；ワード（Ward
）ら、Nature 341：544〜546（1989）：ハーロウおよびレーン（Harlow and Lan
e）、上記、1988）；ヒルヤード（Hilyard）ら、「蛋白質の操作：実験アプロー チ（Protein Engineering：A Practical approach） 」、IRL出版、1992）；ボラ
ベック（Borrabeck）、「抗体の操作（Antibody Engineering）」、第二版（オ
ックスフォード大学出版、1995））。
【０１０３】 抗Bcl-G抗体は、天然供給源から調製することができ、または組換えにより産
生することができる、配列番号：2、4または42記載のアミノ酸配列を有する単離
されたBcl-Gポリペプチドもしくはその断片、またはBcl-Gポリペプチドのペプチ
ド部分のようなBcl-G免疫原を用いて作製することができる。Bcl-Gポリペプチド
のそのようなペプチド部分は、抗原性ペプチドを用いてBcl-G特異的抗体を作製
することができる場合、機能的抗原性断片である。非免疫原性または弱い免疫原
性Bcl-Gポリペプチドまたはその一部は、ウシ血清アルブミン（BSA）またはスカ
シ貝ヘモシアニン（KLH）のような担体分子にハプテンをカップリングさせるこ
とによって免疫原性にすることができる。様々なその他の担体分子、およびハプ
テンを担体分子にカップリングさせる方法は、当技術分野で周知である（例えば
、ハーロウおよびレーン（Harlow and Lane）、上記、1988を参照のこと）。免
疫原性Bcl-Gポリペプチド断片はまた、例えば、グルタチオンSトランスフェラー
ゼ（GST）、ポリヒスチジン等との融合蛋白質としてペプチドの一部を発現させ
ることによって作製することができる。ペプチド融合体を発現させる方法は当業
者に周知である（アウスユベール（Ausubel）ら、「分子生物学の現行プロトコ
ール（Current Protocols in Molecular Biology」（補則47）、ジョンウィリー
およびサンズ、ニューヨーク（1999））。
【０１０４】 本発明はさらに、試料をBcl-G特異的抗体に接触させること、および試料に対
する抗体の特異的結合の存在を検出し、それによって試料中にヒトBcl-Gが存在
することを決定することによって、試料中のヒトBcl-Gの存在を検出する方法を
提供する。Bcl-G特異的抗体は、試料中に存在するBcl-Gのレベルを検出するため
の診断方法および系において用いることができる。本明細書において用いられる
ように、「試料」という用語は、Bcl-G核酸またはポリペプチドを含む、または
含む可能性がある任意の体液、細胞、組織、臓器、またはその一部を意味すると
解釈される。この用語には、個体に存在する試料のみならず、個体から得られた
または個体に由来する試料が含まれる。例えば、試料は生検によって得られた標
本の組織学切片、または組織培養された、もしくは組織培養に適合された細胞と
なりうる。試料はさらに、未加工または実質的に純粋な核酸または蛋白質調製物
となりうる。
【０１０５】 Bcl-G特異的抗体はまた、本発明のBcl-Gの免疫アフィニティまたはアフィニテ
ィクロマトグラフィー精製のために用いることができる。さらに、本明細書にお
いて、Bcl-Gポリペプチドに対する抗体の結合を可能にする条件でBcl-Gポリペプ
チドに特異的に結合する抗体に細胞を接触させる段階、Bcl-Gポリペプチドに結
合した抗体の存在を検出する段階、およびそれによって細胞における本発明のポ
リペプチドの存在を検出する段階を含む、細胞における本発明のBcl-G蛋白質の
存在を検出する方法も考慮される。そのようなポリペプチドの検出に関して、抗
体は、インビトロ診断またはインビボ造影方法のために用いることができる。
【０１０６】 試料中の標的Bcl-Gポリペプチドをインビトロで検出するために有用な免疫学
的法には、検出可能な抗体を用いる免疫測定法が含まれる。そのような免疫測定
法には例えば、免疫組織化学、免疫蛍光、ELISA法、放射性免疫測定法、FACS分
析、免疫沈降、免疫ブロット分析、パンデックス微量蛍光ッ測定法、凝集アッセ
イ法、フローサイトメトリー、および血清診断アッセイ法が含まれ、それらは当
技術分野で周知である（ハーロウおよびレーン（Harlow and Lane、上記、1988
；ハーロウおよびレーン（Harlow and Lane）、「抗体使用：実験マニュアル（U
sing Antibodies：A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバー出版
、（1999））。
【０１０７】 抗体は当技術分野で周知の様々な手段によって検出可能とすることができる。
例えば、検出可能なマーカーは、直接結合させる、または例えばBcl-G特異的抗
体を認識する二次物質を用いて間接的に結合させることができる。有用なマーカ
ーには、例えば、放射性核種、酵素、ビオチンのような結合蛋白質、蛍光原、色
素原および化学発光標識が含まれる。
【０１０８】 本明細書において用いられるように、「標識」および「指示手段」という用語
は、検出可能なシグナルの産生に直接または間接的に関係する単一の原子および
分子を意味する。任意の標識または指示手段を、本発明の核酸プローブと結合さ
せて、蛋白質、ポリペプチド断片、または抗体分子を発現させることができる。
これらの原子または分子は、単独で、またはさらなる試薬と共に用いることがで
きる。そのような標識はそれら自身、臨床診断化学において周知である。
【０１０９】 標識手段は、変性することなく抗体または抗原に化学結合して、有用な免疫蛍
光追跡物質である蛍光色素（色素）を形成する蛍光標識試薬となりうる。免疫蛍
光分析技術の説明は、参照として本明細書に組み入れられる、デルカ（DeLuca）
の「免疫蛍光分析（Immunofluorescence Analysis）」、「ツールとしての抗体
（Antibody As a Tool）」、マルチャロニス（Marchalonis）ら編、ジョンウィ
リーおよびサンズ、189〜231頁（1982）に認められる。
【０１１０】 一つの態様において、指示基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、グル
コースオキシダーゼ等のような酵素である。もう一つの態様において、放射活性
元素を標識物質として用いる。基質への標識の結合、すなわち核酸プローブ、抗
体、ポリペプチド、および蛋白質の標識は、当技術分野で周知である。例えば、
本発明の抗体は培養培地において提供される放射標識アミノ酸の代謝的取り込み
によって標識することができる。例えば、ガルファー（Galfre）ら（Meth. Enzy mol.、 73：3〜46（1981））を参照のこと。活性化官能基によって蛋白質を結合
またはカップリングさせる従来の手段は、特に適用可能である。例えばアウラメ
アス（Aurameas）ら（Scand. J. Immunol. 8、補則7：7〜23（1978））、ロドウ
ェル（Rodwell）ら（Biotech. 3：889〜894（1984））、および米国特許第4,493
,795号を参照のこと。
【０１１１】 Bcl-Gポリペプチドの存在を検出することの他に、本発明の抗Bcl-G抗体は、生
存動物において、ヒトにおいて、または生体組織もしくはそこから単離した体液
において、Bcl-Gポリペプチドの活性を調節するために本明細書において用いる
ことが考慮される。「調節する」という用語は、化合物が作用物質として機能す
ることによって生物活性を増加することができること、または本発明のBcl-Gポ
リペプチドの拮抗物質として機能することによって、生物活性を阻害することが
できることを意味する。したがって、担体と、自然界に存在するリガンドまたは
その他のBcl-Gポリペプチドが本発明のBcl-Gポリペプチドに結合することを阻害
するために有効な量の、Bcl-Gポリペプチドに対する特異性を有する抗体とを含
む組成物が、本明細書において考慮される。例えば、配列番号：２、４または42
に記載のアミノ酸配列を含む、本発明のBcl-Gポリペプチドのエピトープに向け
られたモノクローナル抗体は、この目的にとって有用となりうる。
【０１１２】 本発明はさらに、Bcl-Gポリペプチドをコードする外因性核酸を発現すること
ができるヒト以外のトランスジェニック哺乳類を提供する。本明細書において用
いられるように、「外因性核酸」という句は、宿主に対して生得でない、または
その天然の環境以外において、例えば遺伝子操作されたDNA構築物の一部として
宿主に存在する核酸配列を意味する。自然界に存在するレベルのBcl-Gの他に、
本発明のBcl-Gポリペプチドは、トランスジェニック哺乳類において過剰発現ま
たは過小発現されうる、例えばノックアウト動物では過小発現されうる。
【０１１３】 正常な活性を示すことができないように変異したBcl-Gポリペプチドをコード
する核酸を発現することができるヒト以外のトランスジェニック哺乳類も同様に
提供される。したがって、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類は、天然型Bcl-
Gを発現しない、または天然型Bcl-Gの発現が減少している。本発明はまた、mRNA
とハイブリダイズして、それによってその翻訳を減少させるBcl-Gポリペプチド
をコードするmRNAと相補的なアンチセンスmRNAに転写されるように配置された、
Bcl-Gポリペプチドをコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸を含むゲノム
を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳類を提供する。核酸はさらに、発現
が特定の細胞型に誘導される、または制限されるように、誘導型プロモーターお
よび／または組織特異的調節エレメントを含みうる。
【０１１４】 Bcl-Gポリペプチドの生理的および行動学的役割を解明するために有用な動物
モデル系も同様に提供され、多様な技術を用いてBcl-Gポリペプチドの発現が変
化しているトランスジェニック動物を作製することによって産生される。そのよ
うな技術の例には、当業者に周知のマイクロインジェクション、レトロウイルス
感染症またはその他の手段によってBcl-Gポリペプチドをコードする核酸の正常
または変異体型を適当な受精胚に挿入して、トランスジェニック動物を作製する
ことが含まれる。例えばホーガン（Hogan）ら（「マウス胚の操作：実験マニュ
アル（Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual）」、コールドス
プリングハーバー研究所、（1986））を参照のこと。トランスジェニック動物モ
デル系は生物活性を活性化または阻害する作用物質または拮抗物質のような特異
的リガンドを同定するための化合物のインビボスクリーニングにとって有用であ
る。
【０１１５】 内因性遺伝子を組換えまたは変異Bcl-G遺伝子に置換することによって、Bcl-G
ポリペプチドの発現または構造の調節を変化させるために、トランスジェニック
動物において、Bcl-G遺伝子の変異体または正常型と天然の遺伝子座との相同的
組換えを用いることも同様に本明細書において考慮される。ヒト以外の遺伝子ノ
ックアウト哺乳類を含むヒト以外のトランスジェニック哺乳類を作製する方法は
、当業者に周知である（カペッチ（Capecchi）ら、Science 244：1288（1989）
；チマー（Zimmer）ら、Nature 388：150（1989）；シャストリー（Shastry）、 Experentia 51：1028〜1039（1995）；シャストリー（Shastry）、Mol. Cell Bi ochem. 181：163〜179（1998）；ならびに1997年4月1日に公表された米国特許第
5,616,491号、1998年5月12日に公表された第5,750,826号、および1999年11月9日
に公表された第5,981,830号を参照のこと）。
【０１１６】 本発明の核酸、アンチセンスを含むオリゴヌクレオチド、本発明の核酸を含む
ベクター、形質転換した宿主細胞、ポリペプチドおよびその組み合わせと共に本
発明の抗体を用いて、化合物が本発明のポリペプチドの可能性がある作用物質ま
たは拮抗物質として機能するか否かを決定するために化合物をスクリーニングす
ることができる。これらのスクリーニングアッセイ法は、本発明のポリペプチド
の機能および活性に関する情報を提供し、これによって、一つまたはそれ以上の
種類のポリペプチド、ペプチド、または蛋白質と特異的に相互作用することがで
きる化合物の同定およびデザインが可能となりうる。
【０１１７】 このように、本発明は、Bcl-Gポリペプチドに結合する化合物を同定する方法
を提供する。本発明の蛋白質は競合的結合アッセイ法において用いることができ
る。そのようなアッセイ法は、もしあるとすれば、化合物がBcl-Gポリペプチド
に結合することができるか否かを決定するために多くの化合物を迅速なスクリー
ニングを提供することができる。その後、結合することが判明した化合物につい
てより詳しいアッセイ法を行い、そのような化合物が本発明のBcl-Gポリペプチ
ドの調節物質、作用物質または拮抗物質として作用するか否かをさらに決定する
ことができる。本発明のBcl-Gポリペプチドに結合および／または調節する化合
物を用いて、本発明のBcl-Gポリペプチドによって媒介される多様な病態を治療
することができる。
【０１１８】 蛋白質結合ドメインと相互作用する細胞蛋白質を同定するための様々な結合ア
ッセイ法は当技術分野で既知であり、例えば、酵母のツーハイブリッドスクリー
ニングアッセイ法（例えば、米国特許第5,283,173号、第5,468,614号、および第
5,667,973号；アウスユベール（Ausubel）ら、上記、1999；ルバン（Luban）ら
、Curr, Opin. Biotechnol. 6：59〜64（1995）を参照のこと）および細胞抽出
物を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィー法が含まれる。様々なBcl-G
配列または欠失を含むポリペプチド断片を合成または発現することによって、Bc
l-G結合界面を容易に同定することができる。
【０１１９】 本発明のもう一つの態様において、本発明のBcl-Gポリペプチドの活性を調節
する化合物を同定するためのバイオアッセイ法が提供される。この方法に従って
、本発明のポリペプチドを、例えばBcl-Gシグナル伝達経路に反応性のレポータ
ー遺伝子構築物の存在下で、「未知」または試験物質と接触させ、「未知」また
は試験物質と接触後のポリペプチドの活性をモニターし、レポーター遺伝子構築
物を発現させる物質を、Bcl-Gポリペプチドの機能的ドメインとして同定する。
そのようなレポーター遺伝子アッセイ法および系は当業者に周知である（アウス
ユベール（Ausubel）ら、上記、1999）。さらに、Bcl-Gのプロモーター領域を用
いてレポーター遺伝子構築物を作製して、Bcl-G遺伝子プロモーター活性を増加
または減少させる化合物に関してスクリーニングすることができる。そのような
化合物はまた、Bcl-G発現を変化させるために用いることができる。
【０１２０】 本発明のもう一つの態様に従って、本発明のポリペプチドを組換えにより発現
する形質転換した宿主細胞を、試験化合物に接触させることができ、次に、1つ
（または複数の）その調節作用を、例えばレポーター遺伝子発現によって試験化
合物の存在下と非存在下でBcl-G媒介反応を比較することによって、または化合
物の存在に対する試験細胞もしくは対照細胞の反応を比較することによって評価
することができる。
【０１２１】 本明細書において用いられるように、本発明のポリペプチドの「活性を調節す
る」化合物またはシグナルは、本発明のポリペプチドの活性が化合物またはシグ
ナルの非存在下と比較して、化合物またはシグナルの存在下では異なるように、
Bcl-Gポリペプチドの活性を変化させる化合物またはシグナルを意味する。特に
、そのような化合物またはシグナルには、作用物質または拮抗物質が含まれる。
作用物質は、Bcl-G蛋白質発現または生物活性を活性化する化合物またはシグナ
ルを含む。または拮抗物質には、Bcl-G発現または生物活性を妨害する化合物ま
たはシグナルが含まれる。典型的に、拮抗物質の作用は、作用物質誘導蛋白質活
性化の遮断として認められる。拮抗物質には、競合的および非競合的拮抗物質が
含まれる。
【０１２２】 Bcl-Gポリペプチド発現を調節する化合物を同定するアッセイ法は、Bcl-G活性
を調節する化合物を細胞に接触させることに反応したBcl-Gポリペプチド量の変
化を検出することを含みうる。ポリペプチド発現の変化を検出するアッセイ法に
は、例えば、上記のように、免疫ブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学、お
よび免疫沈降アッセイ法のようなBcl-G特異的Bcl-G抗体による免疫測定法が含ま
れる。
【０１２３】 当業者によって理解されるように、Bcl-G活性を調節する化合物を同定するア
ッセイ方法は一般的に、対照との比較を必要とする。一つの種類の「対照」は、
「対照」細胞または培養が化合物に暴露されていないことを除き、化合物に暴露
された試験細胞または試験培養と実質的に同じように処理した細胞または培養で
ある。もう一つの種類の「対照」細胞または培養は、「対照」細胞または培養が
Bcl-Gポリペプチドを発現しないことを除き、試験細胞と同一である細胞または
培養となりうる。したがって、トランスフェクトした細胞の化合物に対する反応
を、同じ反応条件で同じ化合物に対する「対照」細胞または培養の反応、または
反応がないことと比較する。
【０１２４】 単純または複雑な有機分子、金属含有化合物、炭化水素、ペプチド、蛋白質、
ペプチド模倣体、糖蛋白質、リポ蛋白質、核酸、抗体等のような化学または生体
分子を含む、Bcl-Gポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニングにお
いて用いるための複数の化合物を産生する方法は、当技術分野で周知であり、例
えばヒューズ（Huse）の米国特許第5,264,563号；フランシス（Francis）ら、Cu rr. Opin. Chem. Biol. 2：422〜428（1998）；チエッツェ（Tietze）ら、Curr. Biol. 2：363〜371（1998）；ソフィア（Sofia）、Mol. Divers. 3：75〜94（1
998）；アイクラー（Eichler）ら、Med. Res. Rev. 15：481〜496（1995）等に
記載されている。多数の天然および合成化合物を含むライブラリーも同様に、販
売元から得ることができる。分子の組み合わせライブラリーは、周知の組み合わ
せ化学法を用いて調製することができる（ゴードン（Gordon）ら、J. Med. Chem . 37：1233〜1251（1994）；ゴードン（Gordon）ら、J. Med. Chem. 37：1385〜
1401；ゴードン（Gordon）ら、Acc. Chem. Res. 29：144〜154（1996）；ウィル
ソンおよびクザルニク（Wilson and Czarnik）編、「組み合わせ化学：合成と応 用（Combinatorial Chemistry：Synthesis and Application） 」、ジョンウィリ
ーおよびサンズ、ニューヨーク州（1997））。
【０１２５】 Bcl-G活性を調節する化合物は、Bcl-Gの任意の生物活性または機能を調節する
化合物を同定するために本明細書に開示の方法によってスクリーニングすること
ができる。例えば、Bcl-GとBcl-2ファミリーメンバーとの相互作用を変化させる
化合物を同定することができる。さらに、Bcl-Gに関連したイオンチャンネル活
性を調節する化合物を同定することができる。Bcl-2ファミリーメンバーによる
イオンチャンネルの形成は、細胞においてアポトーシスを誘導する一つのメカニ
ズムである（リード（Reed）ら、上記、1998）。したがって、Bcl-Gのイオンチ
ャンネル活性を調節する化合物を用いて、アポトーシスを変化させ、それによっ
てBcl-Gのアポトーシス活性を増加または減少させることができる。
【０１２６】 Bcl-Gの活性を調節する化合物をスクリーニングするためのもう一つのアッセ
イ法は、Bcl-Gを発現することによって酵母の表現型を変化させることに基づく
。例えば、酵母におけるBaxの発現は、致死的表現型を付与する（マツヤマ（Mat
suyama）ら、Mol. Cell 1：327〜336（1998））。Bcl-Gを発現する酵母は、Bcl-
Gの生物活性がBaxと類似しているために、Baxと類似の表現型を有しうる（実施
例III）。したがって、Bcl-Gを発現する酵母株を、細胞死を妨害する化合物に関
してスクリーニングすることができる。一つの態様において、Bcl-Gの発現は誘
導型となりえて（タオ（Tao）ら、J. Biol. Chem. 273：23704〜23708（1998）
）、Bcl-G発現が誘導されれば化合物をスクリーニングすることができる。Bcl-G
はまた、Bcl-2またはBcl-XLのような抗アポトーシス活性を有する他のBcl-2ファ
ミリーメンバーと共に酵母において同時発現することができる。例えば、BaxとB
cl-2またはBcl-XLとの同時発現は、Baxの致死活性を抑制した（タオ（Tao）ら、
上記、1998）。同様に、Bcl-GとBcl-2またはBcl-XLのような抗アポトーシスBcl-
2ファミリーメンバーとの同時発現を用いて、抗アポトーシスBcl-2ファミリーメ
ンバーの活性に拮抗して、致死表現型を回復する化合物をスクリーニングするこ
とができる。そのような化合物は、Bcl-GのBcl-2またはBcl-XLのような抗アポト
ーシスBcl-2ファミリーメンバーとの結合を阻害するように機能する。
【０１２７】 本発明のなおもう一つの態様において、Bcl-Gポリペプチドの活性化は、本明
細書に記載したアッセイ法によって同定された少なくとも一つの化合物の有効量
をポリペプチドに接触させることによって調節することができる。本発明はまた
、Bcl-GとBcl-G関連ポリペプチド（BAP）との会合を変化させる有効な物質を同
定する方法を提供する。方法は、Bcl-GとBAPポリペプチドとを会合させる条件で
Bcl-GとBAPポリペプチドとを化合物に接触させる段階；およびBcl-GとBAPポリペ
プチドの会合の変化を検出して、それによって化合物がBcl-GとBAPとの会合を変
化させるために有効な物質であることを同定する段階が含まれる。化合物は、例
えば、薬物またはポリペプチドとなりうる。BAPは例えば、Bcl-2またはBcl-XLの
ようなBcl-2ファミリーメンバーとなりうる。
【０１２８】 本明細書に開示のように、Bcl-Gは、前アポトーシス活性を有するBcl-2ファミ
リーの新規のメンバーである（実施例IIIを参照のこと）。したがって、Bcl-G活
性の調節は、細胞におけるアポトーシスのレベルを調節するために都合よく用い
ることができる。例えば、Bcl-Gの活性を増加させることを用いて細胞における
アポトーシスを促進することができる。Bcl-Gの活性は、例えばBcl-Gポリペプチ
ドまたはその機能的断片のレベルを増加させることによって増加させることがで
きる。Bcl-Gポリペプチドのレベルの増加は、例えばBcl-Gをコードする核酸を細
胞に輸送して、Bcl-Gポリペプチドを組換えにより発現させること、またはBcl-G
ポリペプチドもしくはその機能的断片を本明細書に開示の方法に従って標的に直
接輸送することによって行うことができる。さらに、Bcl-G活性は作用物質とし
て機能する調節物質を用いて増加させることができる。Bcl-G活性または発現を
増加させることによってアポトーシスを促進することは、例えば癌の治療のよう
な治療応用において有用である。
【０１２９】 本明細書に開示のように、Bcl-Gの減少または喪失は、前立腺癌の約50％、卵
巣癌の約30％、および白血病の約30％に関連している。Bcl-Gは腫瘍抑制物質と
して機能することができる。したがって、Bcl-Gポリペプチドを直接またはコー
ドされた核酸を用いて投与する方法は、癌を治療するために用いることができる
。さらに、多くの化学療法剤は、アポトーシスを増加させることによって機能す
る。したがって、本発明は、Bcl-G活性または発現を増加させることによって化
学療法を増強する方法をさらに提供する。このように、Bcl-Gの投与を用いて、
標準的な化学療法剤の作用を増強することができる。
【０１３０】 または、Bcl-G活性の調節を用いて、アポトーシスを減少させるためにBcl-G活
性を都合よく減少させることができる。例えば、Bcl-G活性または発現は、アン
チセンスBcl-G核酸を投与することによって減少させることができる。さらに、B
cl-G活性の拮抗物質は、本明細書に開示の方法によって同定することができ、こ
れを用いてBcl-G活性を減少させることができる。Bcl-G活性の減少を用いて、ア
ポトーシスを阻害することができる。アポトーシスの阻害は、例えば虚血疾患を
治療するために有用となりうる。例えばアンチセンス核酸または低分子化合物に
よるBcl-G活性の減少を用いて、脳卒中、心臓発作、自己免疫、外傷、神経細胞
死、およびクローン病を含む炎症疾患を治療することができる。例えば、Bcl-G
は、クローン病患者において同定された（実施例Iを参照のこと）。
【０１３１】 本発明はさらに、Bcl-G活性を調節する物質の有効な調節量をBcl-Gポリペプチ
ドに接触させることによって、Bcl-Gポリペプチドによって媒介される活性を調
節する方法を提供する。Bcl-G活性は、例えば、アポトーシス誘導活性、Bcl-2結
合活性または腫瘍抑制活性となりうる。本発明はさらに、細胞におけるアポトー
シスレベルを調節する方法を提供する。方法には、Bcl-Gをコードする核酸分子
を細胞に導入する段階；およびBcl-Gの発現が細胞におけるアポトーシスを調節
する、Bcl-Gを細胞において発現させる段階が含まれる。
【０１３２】 本発明はさらに、細胞においてBcl-GとBcl-G関連蛋白質との会合を有効に変化
させる、または細胞におけるBcl-Gの活性を有効に変化させる化合物を細胞に接
触させることによって、細胞におけるアポトーシスレベルを調節する方法を提供
する。Bcl-GとBcl-2との相互作用を阻害または変化させる物質にBcl-Gポリペプ
チドを接触させることによって、Bcl-GとBcl-2との相互作用を調節する方法も、
本発明によってさらに提供される。
【０１３３】 本明細書に開示されるように、Bcl-Gは、白血病、前立腺癌および卵巣癌を含
む様々な癌において欠失している領域における第12染色体上に存在する（実施例
IV）。したがって、Bcl-G核酸または抗体を用いる方法は、癌、例えば白血病、
前立腺癌または卵巣癌の素因または進行にとっての診断物質として用いることが
できる。Bcl-G発現または活性の変化は、患者の生存または治療に対する反応に
相関させることができ、相関を用いて、癌の進行または治療に対する反応をモニ
ターすることができる。
【０１３４】 本発明はさらに、被験者におけるBcl-Gのレベルの増加または減少を特徴とす
る病態を診断する方法を提供する。方法には、（a）被験者から試験試料を得る
段階；（b）条件が物質とBcl-Gとの特異的結合を可能にする、適した条件でBcl-
Gに結合することができる物質に試料を接触させる段階；および（c）対照試料に
おける特異的結合量と試験試料における特異的結合量とを比較して、試験試料に
おける特異的結合の量が対照試料と比較して増加または減少すれば病態が診断さ
れる段階が含まれる。物質は、例えば抗Bcl-G抗体、Bcl-G関連蛋白質（BAP）、
またはBcl-G核酸となりうる。
【０１３５】 本発明はまた、患者からの試験試料をBcl-G特異的抗体に接触させることによ
って癌を診断または癌治療をモニターする方法を提供する。本発明はさらに、患
者からの試験試料をBcl-G特異的抗体に接触させる段階を含む、癌患者の予後を
評価する方法を提供する。
【０１３６】 本発明はさらに、患者からの試験試料をBcl-Gオリゴヌクレオチドに接触させ
ることによって、癌を診断または癌治療をモニターする方法を提供する。本発明
はさらに、患者からの試験試料をBcl-Gオリゴヌクレオチドに接触させることに
よって、癌患者の予後を評価する方法を提供する。
【０１３７】 Bcl-G特異的抗体、Bcl-Gオリゴヌクレオチドまたは核酸を用いて癌を診断また
は癌治療をモニターする本発明の方法は、例えば、患者を、転移のリスクの予想
に関して、または治療に対する反応失敗のリスクに関して、高リスク群または低
リスク群に分類するために用いることができる。したがって、本発明の方法は、
癌患者における転移のリスクを決定するために、または癌患者の生存の予後的指
標として都合よく用いることができる。当業者は、第I期癌患者の生存の予後的
指標が、第IV期癌患者の指標とは異なりうることを認識するであろう。例えば、
第I期癌患者の予後は、癌の継続的な増殖および／または転移の可能性に向けら
れ得るのに対し、第IV期癌患者の予後は、癌を治療するための治療方法が有効で
あるか否かに向けることができる。したがって、Bcl-Gポリペプチドまたはコー
ドする核酸のレベルを測定または有無を決定することに向けられる本発明の方法
は、癌の有無もしくは進行、または治療に対する反応性にとっての予後的指標と
して都合よく用いることができる。
【０１３８】 本発明のもう一つの態様に従って、診断系、好ましくは、適した包装材料にお
いて少なくとも一つの本発明の核酸または抗体を含むキットの形での診断系が提
供される。核酸を含む診断キットは、本明細書に記載のBcl-Gコード核酸に由来
する。一つの態様において、例えば診断的核酸は配列番号：1、3または41のいず
れかに由来して、本発明のオリゴヌクレオチドとなりうる。本発明の診断系は、
ゲノムDNAまたはmRNAにおいてBcl-Gをコードする核酸の有無をアッセイするため
に有用である。
【０１３９】 適した診断系は、少なくとも一つの本発明の核酸または抗体を、個々に包装さ
れた1つ（または複数の）化学試薬として、少なくとも一つのアッセイ法にとっ
て十分な量で含む。本発明の核酸を含む診断キットにとって、キットは一般的に
二つまたはそれ以上の核酸を含むであろう。診断キットをPCRにおいて用いる場
合、キットは、PCRのプライマーとして作用しうる少なくとも２つのオリゴヌク
レオチドを含むであろう。当業者は、本発明の核酸プローブおよび／またはプラ
イマーを、本明細書に記載したように本発明の方法を実践するために、適当な緩
衝液および溶液と組み合わせてキットの形に容易に組み入れることができる。Bc
l-G抗体を含むキットは、アッセイ法、例えばELISAまたは他の免疫測定法を行う
ため、試料中のBcl-Gポリペプチドの発現レベルを決定するために適切な条件を
提供する反応混合物を含むことができ、既知量のBcl-Gポリペプチド、および望
ましければ抗Bcl-G抗体に特異的な二次抗体を含む対照試料を含むことができる
。
【０１４０】 本発明のキットの内容物、例えばBcl-G核酸または抗体は、好ましくは滅菌し
た混入物不含環境を提供するために包装材料に含まれる。さらに、包装材料は、
キット内の内容物が特定のBcl-G配列もしくはBcl-Gポリペプチドの有無を検出す
るため、または癌のようなBcl-Gの有無に関連した病態の有無もしくは素因を診
断するための双方において用いることができる。典型的に、試薬濃度または混合
すべき試薬と試料の相対量、試薬／試料混合の維持時間、温度、緩衝液条件等の
ような少なくとも一つのアッセイ方法パラメータを具体的な表現で説明した使用
説明書が含まれる。
【０１４１】 本発明の様々な態様の活性に実質的に影響を及ぼさない改変もまた、本明細書
に提供した本発明の定義内で提供されると理解される。したがって、以下の実施
例は本発明を説明するためであって、制限すると解釈されない。
【０１４２】 実施例I Bcl-Gの分子クローニング 本実施例では、Bcl-2の相同体であるBcl-Gのクローニングについて述べる。
【０１４３】 完全長Bcl-G遺伝子のクローニングのために、Bcl-2ファミリー蛋白質のBH2ド
メインおよびBH3ドメインと類似した配列に関してデータベースを検索すること
によってクローン病の患者3例の結腸粘膜から見いだされた短いEST（ゲンバンク
アクセッション番号AW000827）に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計
した。用いたプライマーは、プライマー1 およびプライマー2 である。完全長Bcl-G cDNAは、SMART（商標）RACE cDNA増幅キット（クロンテッ ク社、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて鋳型としてのヒト胎盤全RNA（
クロンテック）からクローニングした。5'-RACE産物の配列は自動シークエンサ
ーを用いて決定した。
【０１４４】 簡潔に述べると、Bcl-G cDNAのクローニングのために、ヒトBcl-2をクエリー
配列として用いて公開データベースのTBLAST検索を行うことにより、クローン病
の患者3例の結腸粘膜から、Bcl-2ファミリー蛋白質のBH2ドメインと類似した配
列をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含む短いEST（ゲンバン
ク AW000827）が示された。EST配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライ
マー を設計し、SMART（商標）RACE cDNA増幅キット（クロンテック社、パロアルト、
カリフォルニア州）および鋳型としてヒト胎盤全RNAを用いる5'-RACEに用いた。
5'-RACE産物を、TOPO（商標）TAクローニングキット（インビトロゲン社、カー
ルスバッド、カリフォルニア州）を用いてpCR2.1-TOPOベクター中にサブクロー
ニングし、それらのDNA配列を決定したところ、3種のリーディングフレームのす
べてにおいて、開始コドンが好ましいコザック配列内にあり、停止コドンを含む
5'非翻訳領域（UTR）がその前に位置する、完全なオープンリーディングフレー
ム（ORF）が明らかになった（ゲンバンクに寄託）。さらに2つのESTクローン、A
I478889およびAI240211がBLAST検索によって同定され、これらは3'-UTRを含む、
一部重複する部分Bcl-G cDNAに対応した。
【０１４５】 公開データベースの検索によって短いESTが1つ同定され、それを仮想的に翻訳
したところ、Bcl-2ファミリー蛋白質のBH2ドメインと類似性のあるポリペプチド
配列が明らかとなった。完全長cDNAを入手した結果、それぞれ327アミノ酸およ
び252アミノ酸の蛋白質のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む転写物と
考えられるものが2つ示され、Bcl-GＬおよびBcl-GＳと命名した（図5A）。予想
されるBcl-GＬ蛋白質およびBcl-GＳ蛋白質の最初の226アミノ酸は同一であり、
その後は差がみられた。Bcl-GＬおよびBcl-GＳの予想アミノ酸配列とBcl-2ファ
ミリー蛋白質との比較により、Bcl-GＬおよびBcl-GＳ（図5A、B）の両者にBH3ド
メイン（配列番号：9）の候補が存在すること、ならびにBH2ドメイン（配列番号
：18）がBcl-GＬには存在するがBcl-GＳには存在しないことが判明した（図5A、
C）。
【０１４６】 本発明のBcl-Gは、Bcl-GＬと命名した長い型とBcl-GＳと命名した短い型とい
う2つの形態として存在することが明らかとなった。Bcl-GＬのヌクレオチド配列
を図1に示す（配列番号：1）。Bcl-GＬ cDNAのコード領域のヌクレオチド配列、
およびコードされるアミノ酸の配列（配列番号：3）を図2に示す。Bcl-GＬは当
初、コアBH3ドメイン およびコアBH2ドメイン を含むものとして同定された。
【０１４７】 Bcl-Gの短い型であるBcl-GＳは、Bcl-G mRNAの見かけ上の選択的スプライシン
グの産物である。Bcl-GＳのヌクレオチド配列を図3に示す（配列番号：3）。Bcl
-GＳ cDNAのコード領域のヌクレオチド配列、およびコードされるアミノ酸配列
（配列番号：4）を図2に示す。Bcl-GＳはBH3ドメイン のみを含む。
【０１４８】 これらの結果は、Bcl-2ファミリーの新たなメンバーであるBcl-Gが、ヒト胎盤
およびクローン病患者の結腸粘膜で発現されることを示している。Bcl-Gは、BH2
ドメインおよびBH3ドメインを1つずつ含むBcl-GＬと命名した長い型、ならびにB
H3ドメインのみを1つ含むBcl-GＳと命名した短い型という2つの形態として存在
する。
【０１４９】 実施例II Bcl-Gの染色体12p12.3へのマッピング 本実験ではヒトBcl-Gの染色体マッピングについて述べる。
【０１５０】 Bcl-Gの染色体上の位置をマッピングするために、BLAST（アルツシュル（Alts
chul）ら、J. Mol. Biol. 215：403〜410（1990）；アルツシュル（Altschul）
ら、Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402（1997）を用いてゲンバンクデータベ
ースの検索を行った。190858bpのヒト12p12 BAC染色体配列RPCI11-267J23（ゲン
バンクアクセッション番号AC007537）が完全長Bcl-G遺伝子を含むことが明らか
になった。BACはLRP6遺伝子も含んでいた（エクソン1が89963bpから始まる）。D
12S358およびETV6／エクソン8に隣接した12p12.3〜12p13.1の間の600kbの領域は
、小児の急性リンパ球性白血病（ALL）および他の固形腫瘍細胞において高い頻
度で欠失していることが以前に明らかにされている（バエンズ（Baens）ら（199
9）Genomics 56：40〜50（1999）；ハッタ（Hatta）ら、Br. J. Cancer 75：125
6〜1262（1997）；キベル（Kibel）ら、Cancer Res. 58：5652〜5655（1998）；
バシチェット（Baccichet）ら、Br. J. Haematol. 99：107〜114（1997）；アイ
サーニ（Aissani）ら、Leuk. Lyhmphoma 34：231〜239）。Bcl-Gを含む領域の欠
失は、前立腺癌の約50％、卵巣癌の30％および白血病の30％で生じる。
【０１５１】 LRP6遺伝子は、12p12.3〜12p13.1の間の領域に位置する。LRP6を配向に関する
マーカーとして用いたところ、Bcl-Gはこの領域に位置づけられた。Bcl-Gのエク
ソン1はBACの40674bpから始まり、完全長Bcl-G cDNAの5' RACEによる増幅から得
られた新規DNA配列データから導き出された。Bcl-G遺伝子のゲノム構造を図5に
示す。Bcl-GＬには6つのエクソンがあり、第1のコドンは非コード性で第12番染
色体の30kbの領域にわたる。Bcl-GＳにも6つのエクソンがあるが、153bpの配列
がエクソン5の前に挿入されており、これは停止コドンを含む。BH3ドメインはBc
l-GＬおよびBcl-GＳのいずれにおいてもエクソン4に位置する。BH2ドメインはBc
l-GＬのエクソン5に位置する。Bcl-GＬおよびBcl-GＳのcDNAは、異なるスプライ
ス受容部位がエクソン5に関して用いられ、その結果として遠位部のリーディン
グフレームに変化が生じる、選択的mRNAスプライシング機構に起因すると考えら
れる（図5D）。
【０１５２】 Bcl-Gの染色体12p12.3への染色体マッピングを図6に示す。Bcl-Gは、小児ALL
および他の固形腫瘍で高い頻度で欠失していることが以前に明らかにされている
600kbの領域に位置する（バエンズ（Baens）ら、前記、1999）。したがって、Bc
l-GはALLで欠失している領域に位置しており、腫瘍抑制因子として、または腫瘍
抑制因子の活性に関するマーカーとして機能する可能性がある。
【０１５３】 実施例III Bcl-Gの発現 本実施例ではBcl-Gの発現に関して述べる。
【０１５４】 プラスミドの作製のために、別の隣接配列を含まずにBcl-GＬおよびBcl-GＳの
ORFを含むcDNAを、鋳型としてのヒト胎盤cDNA、および以下のプライマーを用い
るPCRによって作製した： （配列番号：27）、Bcl-GＬおよびBcl-GＳの両方に対するセンス； （配列番号：28）、Bcl-GＬに対するアンチセンス；および （配列番号：29）、Bcl-GＳに対するアンチセンス。この結果得られたPCR産物を
制限酵素で消化し、pEGFP-C1（クロンテック）のXhoI部位およびHindIII部位に
サブクローニングした。BH3ドメインを持たないBcl-GＳの変異体を、以下のプラ
イマーを用いる二段階PCR法によって作製した： プライマー1、 （配列番号：30）；プライマー2、 （配列番号：31）；プライマー3、 （配列番号：32）；およびプライマー4、 （配列番号：33）。この結果得られたPCR産物をXhoI／BamHIまたはBamHI／HindI
IIでそれぞれ消化し、pEGEP-C1中に連結した。L216E置換変異を作製するために
、クイックチェンジ（QuikChange）（商標）部位特異的変異誘発キット（Strata
gene）を製造者の指示に従って用い、DNA鋳型としてのpEGFP-C1／Bcl-GＳプラス
ミド、ならびに変異誘発プライマー： （配列番号：34）および （配列番号：35）を用いて、Bcl-GＳの部位特異的変異誘発を行った。
【０１５５】 Bcl-G mRNAの測定に関しては、Bcl-G mRNAをノーザンブロット法または逆転写
酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって検出した。RT-PCRに関しては、1
6種の異なる組織から作製した第1鎖のcDNAを含む多数組織cDNAパネル（クロンテ
ック）を用いた。PCRは、以下のプライマーを用いて、製造者の指示に従って行
った：（a）エクソン3に対応する、Bcl-GＳおよびBcl-GＬの両方に対する5'プラ
イマー、 （配列番号：36）；（b）エクソン5に対応する、Bcl-GＬに対する3'プライマー
、 （配列番号：37）；および選択的スプライシングを受けたエクソン5の区域に対
応する、Bcl-GＳに対する3'プライマー、 （配列番号：38）。ヒトG3PDHの発現は以下のプライマーを用いるPCRによって検
討した： （配列番号：39）（センス）；および （配列番号：40）（アンチセンス）。
【０１５６】 Bcl-GＬおよびBcl-GＳ mRNAの組織特異的発現に関しては、ノーザンブロット
法により、いくつかの正常ヒト組織中に約2kbpのBcl-G転写物が存在することが
示されたが、Bcl-GＬおよびBcl-GＳをコードするmRNAを分離することはできなか
った。このため、Bcl-GＬおよびBcl-GＳのエクソン5に関する配列に対して特異
的なプライマーを用いるRT-PCRアッセイ法をデザインした。Bcl-GＬ mRNAは肺、
膵臓、前立腺および精巣で明瞭に検出され、それよりも低いレベルでは他のいく
つかの組織で検出された（図7）。これに対して、Bcl-GＳ mRNAは精巣で特異的
に発現された。対照mRNAであるG3PDHのRT-PCR増幅により、各組織からのmRNAの
ローディング量はほぼ等しいことが示された。Bcl-GＬおよびBcl-GＳに対応する
増幅バンドを切り出してシークエンシングを行うことにより、このRT-PCR法の有
効性が確認された。
【０１５７】 実施例IV Bcl-GＳによる細胞死の誘導 本実験では、トランスフェクトしたPC-3細胞におけるBcl-GＳによる細胞死の
誘導について述べる。
【０１５８】 細胞培養、トランスフェクションおよびアポトーシスアッセイ法に関しては、
293T細胞およびCos-7細胞を、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM高グルコース
培地（イーバイン サイエンティフィック、サンタナ、カルフォルニア州）中で
培養した。PC-3細胞は10％FBSを含むRPMI 1640培地で培養した。細胞のトランス
フェクションはスーパーフェクト（SuperFect）（キアゲン、チャッツワース、
カルフォルニア州）を用いて行った。浮遊細胞および付着細胞（トリプシン処理
後）はいずれもトランスフェクション24時間後に回収し、固定した上で、アポト
ーシスを核断片化およびクロマチン凝縮に基づいて評価するために、4',6-ジア
ミジン-2'-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）を用いて染色した（ク
ーおよびリード（Xu & Reed）、Mol. Cell、1：337〜346（1998）；ザング（Zha
ng）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）、97：2597〜2602（2000）。
【０１５９】 Bcl-Gの生物学的機能を特徴づけるために、クローニングBcl-GＳ cDNAをpcDNA
3.1／Myc／His発現ベクター（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォル
ニア州）のXhoI／HindIII部位にクローニングすることによってBcl-GＳ構築物を
作製した。構築物の確実性はDNAシークエンシングによって確かめた。
【０１６０】 トランスフェクション実験に関しては、以下の種々のベクターをPC-3細胞にト
ランスフェクトした：対照ベクターpcDNA3.1／Myc／His；Bcl-GＳを発現するpcD
NA3.1／Myc／His／Bcl-GＳ；Bcl-2を発現するpRC／CMV／Bcl-2；およびBaxを発
現するpRC／CMV／Bax。ベクターは以下の通りにトランスフェクトした：pcDNA3.
1／Myc／His単独；pcDNA3.1／Myc／His／Bcl-GＳ単独；pcDNA3. l／Myc／His／B
cl-GＳ＋pRC／CMV／Bcl-2；pRC／CMV／Bax単独；またはpRC／CMV／Bax＋pRC／CM
V／Bcl-2。各ベクターの1μgを0.2μgのpEGFP-N2（クロンテック）と混ぜ合わせ
、スーパーフェクト（SuperFect）試薬（キアゲン、バレンシア、カルフォルニ
ア州）を製造者の指示に従って用いて、ベクターをPC-3前立腺癌細胞に一過的に
トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を蛍光顕微鏡下
で観察した。各トランスフェクションに関して、約100個の緑色蛍光蛋白質（GFP
）陽性（緑色）細胞を算定した。小疱形成および／またはアポトーシス小体を伴
う剥離細胞を死細胞として記録した。結果は3回の独立したトランスフェクショ
ンの平均とした。
【０１６１】 図8に示す通り、Bc1-GＳはPC-3細胞における細胞死を誘導した（「対照」を「
Bcl-GＳ」と比較されたい）。Bcl-GＳによる細胞死の誘導は、前アポトーシス活
性が知られていることから陽性対照として用いたBaxと同様であった（「Bcl-GＳ 」を「Bax」と比較されたい）。Bcl-GＳによる細胞死の誘導は、アポトーシス抑
制性のBcl-2とのコトランスフェクションによって完全に抑制された（「Bcl-GＳ ＋Bcl-2」を参照）。Bcl-GＳ誘導性細胞死のBcl-2による抑制は、Baxで認められ
たものと同様であった（「Bax＋Bcl-2」を参照）。
【０１６２】 Bcl-GＬの影響を評価し、さらにBcl-GＳのアポトーシスに対する影響を評価す
るために、Cos7、HEK293TおよびPC3を含むさまざまな細胞株に対して、Bcl-GＬ
またはBcl-GＳをコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトした。ほと
んどの実験では、首尾良くトランスフェクトされた細胞を簡便に同定しうるよう
に、Bcl-GＬおよびBcl-GＳをGFP融合物として発現させたが（図9A）、その代わ
りにFlag-エピトープタグを用いた場合にも同様の結果が得られた。短い方のBcl
-GＳ蛋白質の過剰発現は、DAPI染色（図9）および他の方法による評価で、アポ
トーシスを生じている細胞の割合の著明な上昇を再現性を伴って誘導した。これ
に対して、これらのトランスフェクションアッセイ法におけるBcl-GＬによるア
ポトーシス誘導には幅があり、その効率はより低かった。トランスフェクト細胞
からの可溶化物の免疫ブロット分析からは、Bcl-GＬの方が作用が弱かった理由
は蛋白質産生レベルが低いためではないことが示された（図9A）。実際には、Bc
l-GＬ蛋白質の細胞内での蓄積レベルはBcl-GＳのほぼ10倍であり、このことから
Bcl-GＳがはるかに強力なアポトーシス誘導因子である可能性が示唆された。同
じブロットを抗チューブリン抗体で分析することにより、蛋白質のローディング
量は各試料とも本質的には同じであることが確認され、これによって結果の有効
性が示された。別のトランスフェクション実験では、Bcl-GＬには、Bcl-2および
Bcl-XLと並べた比較で、細胞保護活性は認められなかった。
【０１６３】 実施例V Bcl-GＳのBH3ドメインはその前アポトーシス活性に必要である Bcl-GＳ蛋白質はBH3ドメインを1つ含むが、Bcl-2ファミリー蛋白質と相同性の
ある他の領域は持たない。構造研究から、BH3ドメインが両親媒性αヘリックス
であり、アポトーシス誘導性BH3ペプチドのαヘリックスの疎水性表面が、Bcl-X L などの生存蛋白質（survival protein）上のポケットと結合することが示され
ている（サットラー（Sattler）ら、Science、275：983〜986（1997））。この
ため、野生型Bcl-GＳ蛋白質のアポトーシス誘導活性を、BH3ドメインのない変異
体（ΔBH3）、または他の前アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質で相当するロイ
シンに対する要求性が極めて強いことを示した以前のBH3変異誘発実験との比較
に基づき、Bcl-GのBH3ドメイン内のロイシン216が荷電性のあるグルタミン酸に
変異するように選択された変異体と比較した（Wangら、Mol. Cell. Biol.、18：
6083〜6089（1998）；ケレカー（Kelekar ）ら、Mol. Cell. Biol.、17：7040〜
7046（1997））。
【０１６４】 野生型Bcl-GＳはCos-7、PC3、HEK293Tおよび他の細胞株で過剰発現させるとア
ポトーシスを強く誘導したが、Bcl-GＳ（ΔBH3）およびBcl-GＳ（L216E）はそう
ではなかった（図3B）。免疫ブロット分析により、Bcl-GＳ（ΔBH3）およびBcl-
GＳ（L216E）蛋白質が野生型Bcl-GＳ蛋白質の量を上回るレベルで産生されるこ
とは確認した。したがって、Bcl-GＳのBH3ドメインはその前アポトーシス活性に
とって極めて重要である。
【０１６５】 実施例VI Bcl-GＳはBH3依存的な様式でBC1-XLと会合する Bcl-2ファミリーの「BH3のみを持つ」メンバーの前アポトーシス活性は、Bcl-
XLなどの生存蛋白質と二量体を形成してその活性を抑制する能力に依存する（ケ
レカーおよびトンプソン（Kelekar & Thompson）による総説、Trends Cell Biol . 、8：324〜330（1998））。そこで、Bcl-GＬおよびBcl-GＳが他のBcl-2ファミ
リー蛋白質と会合しうるか否かを、免疫共沈降アッセイ法によって調べた。
【０１６６】 免疫共沈降および免役ブロット法に関して、免役ブロット法は以前に記載され
た通りに行った（クーおよびリード（Xu and Reed)、前記（1998）；ザング（Zh
ang）ら、前記（2000））。免疫共沈降に関しては、アポトーシスを防止するた
めに細胞を50mMベンゾカルボニルバリンアラニンアスパラギン酸フルオロメチル
ケトン（zVAD-fmk）中で培養した。細胞を溶解緩衝液（50mM Tris-HCl、pH7.4；
150mM NaCl；20mM EDTA；50mM NaF；0.5％NP-40；0.1mM Na3VO4；20μg／mlロイ
ペプチン；20μg／mlアプロチニン；1mMジチオトレイトール（DTT）；および1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF））中に懸濁した。可溶化液（0.2m
lを溶解緩衝液で1mlに希釈したもの）を15μlのプロテインG-セファロース（Sep
harose）4B（ジメド、南サンフランシスコ、カルフォルニア州）とインキュベー
トすることによって除去処理を行った、15μlのポリクローン抗GFP抗体（サンタ
クルズ、サンタ クルズ、カルフォルニア州）および15μlのプロテインGととも
に4℃で一晩インキュベートした。続いてビーズを1.5mlずつの溶解緩衝液で4回
洗った後、レムリ試料緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGE／免疫ブロット法を行った。
【０１６７】 Bcl-GＳの生存蛋白質Bcl-XLおよびBcl-2との会合は、一過性トランスフェクト
細胞からの可溶化物と用いた免疫共沈降では容易に検出されたが、前アポトーシ
ス蛋白質であるBax、Bak、BidまたはBadとの会合は全く検出されなかった（図10
A）。Bcl-GＳがBcl-2およびBcl-XLとは相互作用するが、BaxおよびBakとは相互
作用しないことも、酵母ツーハイブリッドアッセイ法で確認された。これに対し
て、長い方のBcl-GＬ蛋白質のBcl-2またはBcl-XLとの相互作用は免疫共沈降アッ
セイ法（図10A）では容易に検出されなかった。しかし、X線フィルムの露出時間
をはるかに長くすると、少量のBcl-XLがBcl-GＬ免疫複合体と会合して観察され
、このことからBcl-GＬがBcl-XLに対して低い親和性で結合すること、または全B
cl-GＬ蛋白質のうちごく一部しかBcl-XLとの結合能がないことが示唆された。野
生型Bcl-GＳとBcl-GＳ（ΔBH3）およびBcl-GＳ（L216E）蛋白質との比較による
評価では、Bcl-GＳのBcl-XLとの相互作用はBH3依存的であった（図10B、C）。す
なわち、Bcl-GＳの前アポトーシス活性はBcl-XLに対する結合能と相関する。
【０１６８】 実施例VII Bcl-GＳは細胞質オルガネラと会合する Bcl-2、Bcl-XLおよびBakなどの多くのBcl-2ファミリー蛋白質は、それらをミ
トコンドリア、小胞体の細胞内膜または核膜に係留しているカルボキシ末端付近
に疎水性の部分を含む（リード（Reed, J. C.）による総説、Nature、387：773
〜776（1997）；アダムスおよびコリー（Adams & Cory）、Science、281：1322
〜1326（1998）；グロス（Gross）ら、Genes Dev.、13：1899〜1911（1999））
。しかし、Bax、BidおよびBimなどのいくつかの前アポトーシスBcl-2ファミリー
蛋白質は細胞質中に認められており、それらと二量体化するBcl-2ファミリー蛋
白質が存在するミトコンドリアおよび他のオルガネラに移行するように誘導され
る必要がある（ウォルター（Wolter）ら、J. Cell Biol.、139：1281〜1292（19
97）；プタラカス（Puthalakath）ら、Mol. Cell、3：287〜96（1999）；リ（Li
）ら、Cell、94：491〜501（1998）；ルオ（Luo）ら、Cell、94：481〜490（199
8））。
【０１６９】 Bcl-GＬおよびBcl-GＳ蛋白質の細胞内位置を、GFPタグ蛋白質を発現する細胞
の共焦点顕微鏡分析によって検討した。GFP発現細胞はBio-Rad MRC 1024装置を
用いて共焦点顕微鏡によって画像化した（クーおよびリード（Xu & Reed）、前
記（1998）；ザング（Zhang）ら、前記（2000）；ザ（Zha）ら、Mol. Cell Biol . 、16：6494〜6508（1996））。GFP-Bcl-GＬ蛋白質はGFP対照蛋白質と同様に細
胞全体に広く存在した（図11A、B）。これに対して、Bcl-GＳは細胞質に点状パ
ターンで認められ（図11C）、オルガネラとの会合が示唆された。驚いたことに
、Bcl-GＳからBH3ドメインを除去してもこの点状分布は破壊されず（図5D）、こ
のことは細胞内ターゲティングのためにはBcl-GＳ蛋白質の他の領域で十分であ
ることを示す。細胞内分画実験からもこれらの観察所見が裏づけられ、Bcl-GＳ
およびBcl-GＳ（DB43）はオルガネラを含む重い膜画分と主に会合し、可溶性細
胞質区画では少量であることが示された。
【０１７０】 実施例VIII 卵巣組織ではヘテロ接合性の消失（LOH）がBcl-Gと関係している 本実施例では、卵巣癌組織におけるBcl-Gと関連したヘテロ接合性の消失（LOH
）について述べる。
【０１７１】 卵巣癌組織試料をBcl-Gにおける変異に関してSSCPで検討した。エクソン1には
変異は認められなかった。しかし、卵巣試料の約3分の1ではBcl-GのLOHの可能性
が示された。LOHはSSCPを用いた場合にバンド強度の変化として観察された。こ
の結果はPCRを用いても独立して確認された。具体的な変異を明らかにするため
にはLOH試料のシークエンシングを行う。
【０１７２】 これらの結果により、LOHが卵巣組織においてBcl-Gと関連しており、卵巣癌の
マーカーとして有用な可能性があることを示している。
【０１７３】 実施例IX マウスBcl-Gのクローニング 本実施例ではマウスBcl-Gのクローニングについて述べる。
【０１７４】 マウスBcl-Gをゲンバンクの検索によって同定した。1つのESTクローン（AA536
718）がマウスBcl-Gを含むことがわかった。マウスBcl-Gの完全配列を決定する
ために、このESTを米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）（A
TCC；マナッサス、バージニア州）から購入してシークエンシングを行った。
【０１７５】 マウスBcl-G cDNAのヌクレオチド配列は配列番号：41として参照されている。
Bcl-Gのアミノ酸配列は配列番号：42として参照されている。
【０１７６】 購入したESTクローンからPCRを用いてマウスBcl-Gを単離し、それをEGFP-C1ベ
クター中にクローニングした。用いたプライマーはMXSTA、 （配列番号：43）；NHREV、 （配列番号：44）であった。
【０１７７】 予備的な実験で、マウスBcl-GをCos-7細胞および293T細胞で過剰発現させた。
これらの予備的な実験では、アポトーシスは観察されなかった。
【０１７８】 本出願の全体を通じて、さまざまな刊行物に言及してきた。これらの刊行物の
開示内容は、本発明が属する技術分野の到達水準をより詳細に説明するために、
その全体が本出願に参照として組み入れられる。
【０１７９】 本発明を以上に提示した実施例を参照しながら説明してきたが、発明の精神を
逸脱することなくさまざまな変更を加えうることが理解される必要がある。した
がって、本発明は請求の範囲のみによって制限される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトBcl-GＬ cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：1）を示して
いる。
【図２】 ヒトBcl-GＬ cDNAのコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：
1のヌクレオチド196〜1179）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：2）
を示している。Bcl-GＬは、1つのBH3ドメイン（２１６LKYSGDQLE２２４；配列番
号：5）および1つのBH2ドメイン（３０７PWIQQHGGWE３１６；配列番号：6）を含
む。
【図３】 ヒトBcl-GＳ cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：3）を示して
いる。
【図４】 ヒトBcl-GＳ cDNAのコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：
3のヌクレオチド196〜954）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：4）を
示している。Bcl-GＳはBH3ドメイン（２１６LKYSGDQLE２２４；配列番号：5）の
みを含む。
【図５】 Bcl-G cDNAの配列解析を示している。図5AはBcl-GＬ蛋白質およ
びBcl-GＳ蛋白質の予想アミノ酸配列を示しており、BH2およびBH3ドメインを太
字で示し、残基番号も示している。予想される蛋白質は残基1〜226の範囲で同一
である。Bcl-GＳに特有なC末端領域はイタリック体で示している。図5Bは、Bcl-
GＬ（配列番号：9）および他のいくつかのBcl-2ファミリー蛋白質（それぞれ配
列番号：10〜17）のBH2ドメインを整列化したものである。同一または類似の残
基をそれぞれ黒およびグレーの枠で示している。図5Cは、Bcl-G（配列番号：18
）および他のいくつかのBcl-2ファミリー蛋白質（それぞれ配列番号：19〜26）
のBH3ドメインを整列化したものである。図5DはBCL-G遺伝子のエクソン-イント
ロン構成を示している。BCL-G遺伝子は第12番染色体の約30kbの領域にわたり6つ
のエクソンを含む。エクソン5の5'端の選択的スプライシングのためにBcl-GＬお
よびBcl-GＳ蛋白質が生じ、BACクローンRPCI 11-267J23（ゲンバンク AC007537
）におけるヌクレオチド位置63位、870位に対して63位、797位にスプライス受容
部位をそれぞれBcl-GＬおよびBcl-GＳに関して用いた。開始コドンおよび終止コ
ドンの位置を示すすともに、コード領域はグレーの区画、5'-UTRおよび3'-UTR非
コード配列は白抜きの区画として示した。Bcl-GＬおよびBcl-GＳのいずれにおい
てもBH3ドメインはエクソン4に位置し、一方、BH2ドメインはBcl-GＬのエクソン
5に位置する。
【図６】 Bcl-Gが染色体12p12.3にマッピングされることを示している。
【図７】 ヒト組織におけるBcl-GＳおよびBcl-GＬの発現を示している。Bc
l-GＬまたはBcl-GＳをコードする転写物の発現をRT-PCRによって評価した。種々
の成人組織からのRNA試料を用いて調製した第1鎖のcDNAを、エクソン5における
スプライス受容の使用に関する違いに基づき、Bcl-GＬおよびBcl-GＳに対して特
異的なプライマーを用いてPCR増幅した。プライマーはいずれの場合もイントロ
ンと隣接しており、そのためゲノムDNAの混入による増幅の可能性はなくせる。P
CR産物は2％アガロースゲルでサイズ分画し、臭化エチジウムで染色した後、UV
照射下で写真を撮影した。
【図８】 細胞死に対するBcl-GＳの影響を示している。PC-3細胞にpcDNA3.
1／Myc／His（対照）、pcDNA3.1／Myc／His／Bcl-GＳ（Bcl-GＳ）、pcDNA3.1／M
yc／His／Bcl-GＳ＋pRC／CMV／Bcl-2（Bcl-GＳ＋Bcl-2）、pRC／CMV／Bax（Bax
）またはpRC／CMV／Bax＋pRC／CMV／Bcl-2（Bax＋Bcl-2）をトランスフェクトし
た。トランスフェクションの24時間後に細胞を細胞死に関して評価した。
【図９】 Bcl-Gによるアポトーシスの誘導を示している。図9Aは、GFP、GF
P-Bcl-GＳもしくはGFP-Bcl-GＬをコードするプラスミドをCos-7細胞に単独で、
またはBcl-XLをコードするプラスミドとともにトランスフェクトした結果を示し
ている。アポトーシスはトランスフェクション24時間後のDAPI染色によって評価
した（平均＋標準偏差；n＝3）（上）。GFPおよびGFP-Bcl-G融合蛋白質のレベル
は、トランスフェクトCos-7細胞からの可溶化物（各レーン当たり20μg）および
抗GFP抗体の免疫ブロット法をECL検出を用いて行うことによって評価した（中）
。ローディング量が等しいことは抗チューブリン抗体をプローブとして同じ膜を
検索することによって確認した（下）。図9Bは、GFP、GFP-Bcl-GＳまたは変異型
蛋白質、Bcl-GＳ（ΔBH3）およびGFP-Bcl-GＳ（L216E）をコードするプラスミド
をCos-7細胞にトランスフェクトした結果である。アポトーシス細胞の割合は上
記から1日後に評価した（上）。蛋白質の発現は、抗GFP抗体（中）または抗チュ
ーブリン抗体（下）を用いて上記の通りの免疫ブロット法によって評価した。
【図１０】 Bcl-GＳおよびBclGLのBcl-XLとの相互作用を示している。293T
細胞に、GFP、GFP-Bcl-GＬ、GFP-Bcl-GＳ、GFP-Bcl-GＳ（DBH3）またはGFP-Bcl-
GＳ（L218E）をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトした。細胞を
1日後に可溶化し、抗GET抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫複合体（2mgの可
溶化物から調製）（上）および可溶化物（20μg蛋白質）（下）に対して、それ
ぞれ抗Bcl-XL抗体（上）および抗GFP抗体（下）を用いるSDS-PAGE／免疫ブロッ
ト分析を行った。
【図１１】 Bcl-GＬおよびBcl-GＳの細胞内分布に関する顕微鏡評価を示し
ている。GFP（A）、GFP-Bcl-GＬ（B）、GFP-Bcl-GＳ（C）およびGFP-Bcl-GＳ（
ΔBH3）（D）をコードするプラスミドをCos-7細胞にトランスフェクトした。細
胞を1日後に固定し、共焦点顕微鏡によって観察した。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】 本発明を以上に提示した実施例を参照しながら説明してきたが、発明の精神を
逸脱することなくさまざまな変更を加えうることが理解される必要がある。した
がって、本発明は請求の範囲のみによって制限される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Burnham Institute <120> BCL-G Polypeptides, Encoding Nucleic Acids and Methods of Use <140> JP 2001-544771 <141> 2000-12-13 <150> US 09/461,641 <151> 1999-12-14 <160> 44 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (196)..(1179)
<400> 1
aatgacatga cagccattcc gtggccaggg acaccactgc ccaagctgga gaccacgagg 60 attcagggac tgaagccagc atgggaattc ctggtttgag atcagagtcc tgagtacctc 120 gtgggaactt gggcactcat ccgcaggagg tctagacccc cagagaattc cttgagtcta 180 aggcacaggc ccaac atg tgt agc acc agt ggg tgt gac ctg gaa gaa atc 231 Met Cys Ser Thr Ser Gly Cys Asp Leu Glu Glu Ile 1 5 10 ccc cta gat gat gat gac cta aac acc ata gaa ttc aaa atc ctc gcc 279
Pro Leu Asp Asp Asp Asp Leu Asn Thr Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala 15 20 25 tac tac acc aga cat cat gtc ttc aag agc acc cct gct ctc ttc tca 327
Tyr Tyr Thr Arg His His Val Phe Lys Ser Thr Pro Ala Leu Phe Ser 30 35 40 cca aag ctg ctg aga aca aga agt ttg tcc cag agg ggc ctg ggg aat 375
Pro Lys Leu Leu Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Arg Gly Leu Gly Asn 45 50 55 60 tgt tca gca aat gag tca tgg aca gag gtg tca tgg cct tgc aga aat 423
Cys Ser Ala Asn Glu Ser Trp Thr Glu Val Ser Trp Pro Cys Arg Asn 65 70 75 tcc caa tcc agt gag aag gcc ata aac ctt ggc aag aaa aag tct tct 471
Ser Gln Ser Ser Glu Lys Ala Ile Asn Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser 80 85 90 tgg aaa gca ttc ttt gga gta gtg gag aag gaa gat tcg cag agc acg 519
Trp Lys Ala Phe Phe Gly Val Val Glu Lys Glu Asp Ser Gln Ser Thr 95 100 105 cct gcc aag gtc tct gct cag ggt caa agg acg ttg gaa tac caa gat 567
Pro Ala Lys Val Ser Ala Gln Gly Gln Arg Thr Leu Glu Tyr Gln Asp 110 115 120 tcg cac agc cag cag tgg tcc agg tgt ctt tct aac gtg gag cag tgc 615
Ser His Ser Gln Gln Trp Ser Arg Cys Leu Ser Asn Val Glu Gln Cys
125 130 135 140 ttg gag cat gaa gct gtg gac ccc aaa gtc att tcc att gcc aac cga 663
Leu Glu His Glu Ala Val Asp Pro Lys Val Ile Ser Ile Ala Asn Arg 145 150 155 gta gct gaa att gtt tac tcc tgg cca cca cca caa gcg acc cag gca 711
Val Ala Glu Ile Val Tyr Ser Trp Pro Pro Pro Gln Ala Thr Gln Ala 160 165 170 gga ggc ttc aag tcc aaa gag att ttt gta act gag ggt ctc tcc ttc 759
Gly Gly Phe Lys Ser Lys Glu Ile Phe Val Thr Glu Gly Leu Ser Phe 175 180 185 cag ctc caa ggc cac gtg cct gta gct tca agt tct aag aaa gat gaa 807
Gln Leu Gln Gly His Val Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Lys Asp Glu 190 195 200 gaa gaa caa ata cta gcc aaa att gtt gag ctg ctg aaa tat tca gga 855
Glu Glu Gln Ile Leu Ala Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly
205 210 215 220 gat cag ttg gaa aga aag ctg aag aaa gat aag gct ttg atg ggc cac 903
Asp Gln Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Asp Lys Ala Leu Met Gly His 225 230 235 ttc cag gat ggg ctg tcc tac tct gtt ttc aag acc atc aca gac cag 951
Phe Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Ser Val Phe Lys Thr Ile Thr Asp Gln 240 245 250 gtc cta atg ggt gtg gac ccc agg gga gaa tca gag gtc aaa gct cag 999
Val Leu Met Gly Val Asp Pro Arg Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Gln 255 260 265 ggc ttt aag gct gcc ctt gta ata gac gtc acg gcc aag ctc aca gct 1047
Gly Phe Lys Ala Ala Leu Val Ile Asp Val Thr Ala Lys Leu Thr Ala 270 275 280 att gac aac cac ccg atg aac agg gtc ctg ggc ttt ggc acc aag tac 1095
Ile Asp Asn His Pro Met Asn Arg Val Leu Gly Phe Gly Thr Lys Tyr
285 290 295 300 ctg aaa gag aac ttc tcg cca tgg atc cag cag cac ggt gga tgg gaa 1143
Leu Lys Glu Asn Phe Ser Pro Trp Ile Gln Gln His Gly Gly Trp Glu 305 310 315 aaa ata ctt ggg ata tca cat gaa gaa gta gac tga 1179
Lys Ile Leu Gly Ile Ser His Glu Glu Val Asp 320 325 <210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2
Met Cys Ser Thr Ser Gly Cys Asp Leu Glu Glu Ile Pro Leu Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Leu Asn Thr Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala Tyr Tyr Thr Arg 20 25 30 His His Val Phe Lys Ser Thr Pro Ala Leu Phe Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Arg Gly Leu Gly Asn Cys Ser Ala Asn 50 55 60 Glu Ser Trp Thr Glu Val Ser Trp Pro Cys Arg Asn Ser Gln Ser Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ile Asn Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser Trp Lys Ala Phe 85 90 95 Phe Gly Val Val Glu Lys Glu Asp Ser Gln Ser Thr Pro Ala Lys Val 100 105 110 Ser Ala Gln Gly Gln Arg Thr Leu Glu Tyr Gln Asp Ser His Ser Gln 115 120 125 Gln Trp Ser Arg Cys Leu Ser Asn Val Glu Gln Cys Leu Glu His Glu 130 135 140 Ala Val Asp Pro Lys Val Ile Ser Ile Ala Asn Arg Val Ala Glu Ile
145 150 155 160 Val Tyr Ser Trp Pro Pro Pro Gln Ala Thr Gln Ala Gly Gly Phe Lys 165 170 175 Ser Lys Glu Ile Phe Val Thr Glu Gly Leu Ser Phe Gln Leu Gln Gly 180 185 190 His Val Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Lys Asp Glu Glu Glu Gln Ile 195 200 205 Leu Ala Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly Asp Gln Leu Glu 210 215 220 Arg Lys Leu Lys Lys Asp Lys Ala Leu Met Gly His Phe Gln Asp Gly
225 230 235 240 Leu Ser Tyr Ser Val Phe Lys Thr Ile Thr Asp Gln Val Leu Met Gly 245 250 255 Val Asp Pro Arg Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Gln Gly Phe Lys Ala 260 265 270 Ala Leu Val Ile Asp Val Thr Ala Lys Leu Thr Ala Ile Asp Asn His 275 280 285 Pro Met Asn Arg Val Leu Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Asn 290 295 300 Phe Ser Pro Trp Ile Gln Gln His Gly Gly Trp Glu Lys Ile Leu Gly
305 310 315 320 Ile Ser His Glu Glu Val Asp 325 <210> 3
<211> 954
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (196)..(954) <400> 3
aatgacatga cagccattcc gtggccaggg acaccactgc ccaagctgga gaccacgagg 60
attcagggac tgaagccagc atgggaattc ctggtttgag atcagagtcc tgagtacctc 120 gtgggaactt gggcactcat ccgcaggagg tctagacccc cagagaattc cttgagtcta 180 aggcacaggc ccaac atg tgt agc acc agt ggg tgt gac ctg gaa gaa atc 231 Met Cys Ser Thr Ser Gly Cys Asp Leu Glu Glu Ile 1 5 10 ccc cta gat gat gat gac cta aac acc ata gaa ttc aaa atc ctc gcc 279
Pro Leu Asp Asp Asp Asp Leu Asn Thr Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala 15 20 25 tac tac acc aga cat cat gtc ttc aag agc acc cct gct ctc ttc tca 327
Tyr Tyr Thr Arg His His Val Phe Lys Ser Thr Pro Ala Leu Phe Ser 30 35 40 cca aag ctg ctg aga aca aga agt ttg tcc cag agg ggc ctg ggg aat 375
Pro Lys Leu Leu Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Arg Gly Leu Gly Asn 45 50 55 60 tgt tca gca aat gag tca tgg aca gag gtg tca tgg cct tgc aga aat 423
Cys Ser Ala Asn Glu Ser Trp Thr Glu Val Ser Trp Pro Cys Arg Asn 65 70 75 tcc caa tcc agt gag aag gcc ata aac ctt ggc aag aaa aag tct tct 471
Ser Gln Ser Ser Glu Lys Ala Ile Asn Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser 80 85 90 tgg aaa gca ttc ttt gga gta gtg gag aag gaa gat tcg cag agc acg 519
Trp Lys Ala Phe Phe Gly Val Val Glu Lys Glu Asp Ser Gln Ser Thr 95 100 105 cct gcc aag gtc tct gct cag ggt caa agg acg ttg gaa tac caa gat 567
Pro Ala Lys Val Ser Ala Gln Gly Gln Arg Thr Leu Glu Tyr Gln Asp 110 115 120 tcg cac agc cag cag tgg tcc agg tgt ctt tct aac gtg gag cag tgc 615
Ser His Ser Gln Gln Trp Ser Arg Cys Leu Ser Asn Val Glu Gln Cys
125 130 135 140 ttg gag cat gaa gct gtg gac ccc aaa gtc att tcc att gcc aac cga 663
Leu Glu His Glu Ala Val Asp Pro Lys Val Ile Ser Ile Ala Asn Arg 145 150 155 gta gct gaa att gtt tac tcc tgg cca cca cca caa gcg acc cag gca 711
Val Ala Glu Ile Val Tyr Ser Trp Pro Pro Pro Gln Ala Thr Gln Ala 160 165 170 gga ggc ttc aag tcc aaa gag att ttt gta act gag ggt ctc tcc ttc 759
Gly Gly Phe Lys Ser Lys Glu Ile Phe Val Thr Glu Gly Leu Ser Phe 175 180 185 cag ctc caa ggc cac gtg cct gta gct tca agt tct aag aaa gat gaa 807
Gln Leu Gln Gly His Val Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Lys Asp Glu 190 195 200 gaa gaa caa ata cta gcc aaa att gtt gag ctg ctg aaa tat tca gga 855
Glu Glu Gln Ile Leu Ala Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly
205 210 215 220 gat cag ttg gaa aga aag gac act gcc ttc atc ccc att ccc ttg gtt 903
Asp Gln Leu Glu Arg Lys Asp Thr Ala Phe Ile Pro Ile Pro Leu Val 225 230 235 gac acc agc atc cag ggt ttt cca cag gat ggt ttg atg gcc tgc att 951
Asp Thr Ser Ile Gln Gly Phe Pro Gln Asp Gly Leu Met Ala Cys Ile 240 245 250 tga 954 <210> 4
<211> 252
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4
Met Cys Ser Thr Ser Gly Cys Asp Leu Glu Glu Ile Pro Leu Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Leu Asn Thr Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala Tyr Tyr Thr Arg 20 25 30 His His Val Phe Lys Ser Thr Pro Ala Leu Phe Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Arg Gly Leu Gly Asn Cys Ser Ala Asn 50 55 60 Glu Ser Trp Thr Glu Val Ser Trp Pro Cys Arg Asn Ser Gln Ser Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ile Asn Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser Trp Lys Ala Phe 85 90 95 Phe Gly Val Val Glu Lys Glu Asp Ser Gln Ser Thr Pro Ala Lys Val 100 105 110 Ser Ala Gln Gly Gln Arg Thr Leu Glu Tyr Gln Asp Ser His Ser Gln 115 120 125 Gln Trp Ser Arg Cys Leu Ser Asn Val Glu Gln Cys Leu Glu His Glu 130 135 140 Ala Val Asp Pro Lys Val Ile Ser Ile Ala Asn Arg Val Ala Glu Ile
145 150 155 160 Val Tyr Ser Trp Pro Pro Pro Gln Ala Thr Gln Ala Gly Gly Phe Lys 165 170 175 Ser Lys Glu Ile Phe Val Thr Glu Gly Leu Ser Phe Gln Leu Gln Gly 180 185 190 His Val Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Lys Asp Glu Glu Glu Gln Ile 195 200 205 Leu Ala Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly Asp Gln Leu Glu 210 215 220 Arg Lys Asp Thr Ala Phe Ile Pro Ile Pro Leu Val Asp Thr Ser Ile
225 230 235 240 Gln Gly Phe Pro Gln Asp Gly Leu Met Ala Cys Ile 245 250 <210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 5
Leu Lys Tyr Ser Gly Asp Gln Leu Glu 1 5 <210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6
Pro Trp Ile Gln Gln His Gly Gly Trp Glu 1 5 10
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7
gtacttggtg ccaaagccca gg 22 <210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8
gacatgatgt ctggtgtagt aggcgagg 28 <210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 9
Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly Asp Gln Leu Glu Arg Lys 1 5 10 15 <210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 10
Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn 1 5 10 15 <210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 11
Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg 1 5 10 15 <210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 12
Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser 1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 13
Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser 1 5 10 15 <210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 14
Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly Asp Gly Val Gln Arg Asn 1 5 10 15 <210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 15
Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg 1 5 10 15 <210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16
Leu His Gln Ala Met Arg Ala Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg 1 5 10 15 <210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 17
Val His Leu Thr Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg 1 5 10 15 <210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 18
Trp Ile Gln Gln His Gly Gly Trp 1 5 <210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 19
Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp 1 5 <210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 20
Trp Ile Ala Gln Arg Gly Gly Trp 1 5 <210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 21
Trp Leu Arg Arg Arg Gly Gly Trp 1 5 <210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 22
Trp Ile Arg Gln Asn Gly Gly Trp 1 5 <210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 23
Trp Leu Val Lys Gln Arg Gly Trp 1 5 <210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 24
Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp 1 5 <210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 25
Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp 1 5 <210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 26
Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp 1 5 <210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 27
ggctcgagcg atgtgtagca ccagtgggtg tgacc 35 <210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 28
ccaagcttta agtctacttc ttcatgtgat atccc 35 <210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 29
ccaagcttta aaatgcaggc catcaaacc 29 <210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 30
ggctcgagcg atgtgtagca ccagtgggtg tgacc 35 <210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 31
ccggatccgg ctagtatttg ttcttcttca tctttc 36 <210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 32
ccggatccga cactgccttc atccccattc cc 32 <210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic primer <400> 33
ccaagcttta aaatgcaggc catcaaacc 29 <210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 34
gccaaaattg ttgagctgga gaaatattca ggagatcagt tgg 43 <210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 35
ccaactgatc tcctgaatat ttctccagct caacaatttt ggc 43 <210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 36
ctgagggtct ctccttccag ctccaagg 28 <210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 37
ggccgtgacg tctattacaa gggcagcc 28 <210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 38
caagggaatg gggatgaagg cagtgtc 27 <210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 39
tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26 <210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 40
catgtgggcc atgaggtcca ccac 24 <210> 41
<211> 987
<212> DNA
<213> Mus musculus <220>
<221> CDS
<222> (1)..(987)
<220>
<221> unsure
<222> (319)
<223> unknown nucleotide <400> 41
atg tgc agc acc agt gtg tat gac ctg gaa gac att ccc ctg gag gat 48
Met Cys Ser Thr Ser Val Tyr Asp Leu Glu Asp Ile Pro Leu Glu Asp 1 5 10 15 gat gat cca aac agc ata gag ttc aaa atc ctg gcc ttc tac gcc aga 96
Asp Asp Pro Asn Ser Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala Phe Tyr Ala Arg 20 25 30 cac cat gtc ttc aag aac acc ccg gct gtc ttc tcg ccc aag ctc tcc 144
His His Val Phe Lys Asn Thr Pro Ala Val Phe Ser Pro Lys Leu Ser 35 40 45 aga aca agg agt ctg tcc cag aaa gcc ctg ggg act tgg tca act gat 192
Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Lys Ala Leu Gly Thr Trp Ser Thr Asp 50 55 60 tcc tgg aca cag gta tca ttg cct tgc aga ggt tcc ccc tcc agc gaa 240
Ser Trp Thr Gln Val Ser Leu Pro Cys Arg Gly Ser Pro Ser Ser Glu 65 70 75 80 aag aac atc agc ttg ggc aag aag aag tct tct tgg aga aca ctc ttc 288
Lys Asn Ile Ser Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser Trp Arg Thr Leu Phe 85 90 95 agg gtg gcc gag aag gag gaa ggc ctg ccg ngc tcc cca aag gag atc 336
Arg Val Ala Glu Lys Glu Glu Gly Leu Pro Xaa Ser Pro Lys Glu Ile 100 105 110 cga gct cag ggt cct cag ggc ccc ttc ccg gta gag cgg cag agt ggc 384
Arg Ala Gln Gly Pro Gln Gly Pro Phe Pro Val Glu Arg Gln Ser Gly 115 120 125 ttc cac aac cag cac tgg ccc agg tct ctg agc agt gtg gag cag ccc 432
Phe His Asn Gln His Trp Pro Arg Ser Leu Ser Ser Val Glu Gln Pro 130 135 140 tgg aga gtg aag ttg tgg att cca aag tgg ctt gta ttg cca aca gag 480
Trp Arg Val Lys Leu Trp Ile Pro Lys Trp Leu Val Leu Pro Thr Glu
145 150 155 160 tgg ctg aaa ttg ttt act cct ggc cac cac cag atg tca tcc aca gcc 528
Trp Leu Lys Leu Phe Thr Pro Gly His His Gln Met Ser Ser Thr Ala 165 170 175 agg gag gaa gcc agc tca aag aga ggg tct cgg aga ttt ttg tac ttc 576
Arg Glu Glu Ala Ser Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Phe Leu Tyr Phe 180 185 190 agg ttt gaa gga cct tgg gac tct aag aat aaa gat ggt gaa gac caa 624
Arg Phe Glu Gly Pro Trp Asp Ser Lys Asn Lys Asp Gly Glu Asp Gln 195 200 205
ata ata agc aag att gtt gag ctg ctg aaa tcc tcg ggg gat cag ttg 672
Ile Ile Ser Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Ser Ser Gly Asp Gln Leu 210 215 220 gga aga gag ata aag aaa gac aag gct ttg atg agc agc ttc cag gac 720
Gly Arg Glu Ile Lys Lys Asp Lys Ala Leu Met Ser Ser Phe Gln Asp
225 230 235 240 ggg ctg tcc tac tca acg ttc aag acc atc aca gac ctg ttc ctg agg 768
Gly Leu Ser Tyr Ser Thr Phe Lys Thr Ile Thr Asp Leu Phe Leu Arg 245 250 255 gac gtg gac acc aga gga gaa tca gag gtc aaa gct cgg ggc ttc aag 816
Asp Val Asp Thr Arg Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Arg Gly Phe Lys 260 265 270 gct gcc ctt gca ata gac gcc atc gcc aag ctc acg gca tcg gac aac 864
Ala Ala Leu Ala Ile Asp Ala Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Asp Asn 275 280 285 cac cca atg aat aga atg ctg ggc ttc ggg acc aag tac cta aaa gag 912
His Pro Met Asn Arg Met Leu Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Leu Lys Glu 290 295 300 tac ttc tcc ccc tgg gtt cag cag aat ggc gga tgg gaa aaa ata ctt 960
Tyr Phe Ser Pro Trp Val Gln Gln Asn Gly Gly Trp Glu Lys Ile Leu
305 310 315 320 ggg atc tca cat gaa gaa gta gac tga 987
Gly Ile Ser His Glu Glu Val Asp 325 <210> 42
<211> 328
<212> PRT
<213> Mus musculus <220> <221> Variant <222> (107) <223> Xaa=any amino acid <400> 42 Met Cys Ser Thr Ser Val Tyr Asp Leu Glu Asp Ile Pro Leu Glu Asp 1 5 10 15 Asp Asp Pro Asn Ser Ile Glu Phe Lys Ile Leu Ala Phe Tyr Ala Arg 20 25 30 His His Val Phe Lys Asn Thr Pro Ala Val Phe Ser Pro Lys Leu Ser 35 40 45 Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Lys Ala Leu Gly Thr Trp Ser Thr Asp 50 55 60 Ser Trp Thr Gln Val Ser Leu Pro Cys Arg Gly Ser Pro Ser Ser Glu 65 70 75 80
Lys Asn Ile Ser Leu Gly Lys Lys Lys Ser Ser Trp Arg Thr Leu Phe 85 90 95 Arg Val Ala Glu Lys Glu Glu Gly Leu Pro Xaa Ser Pro Lys Glu Ile 100 105 110 Arg Ala Gln Gly Pro Gln Gly Pro Phe Pro Val Glu Arg Gln Ser Gly 115 120 125 Phe His Asn Gln His Trp Pro Arg Ser Leu Ser Ser Val Glu Gln Pro 130 135 140 Trp Arg Val Lys Leu Trp Ile Pro Lys Trp Leu Val Leu Pro Thr Glu
145 150 155 160 Trp Leu Lys Leu Phe Thr Pro Gly His His Gln Met Ser Ser Thr Ala 165 170 175 Arg Glu Glu Ala Ser Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Phe Leu Tyr Phe 180 185 190 Arg Phe Glu Gly Pro Trp Asp Ser Lys Asn Lys Asp Gly Glu Asp Gln 195 200 205 Ile Ile Ser Lys Ile Val Glu Leu Leu Lys Ser Ser Gly Asp Gln Leu 210 215 220 Gly Arg Glu Ile Lys Lys Asp Lys Ala Leu Met Ser Ser Phe Gln Asp
225 230 235 240 Gly Leu Ser Tyr Ser Thr Phe Lys Thr Ile Thr Asp Leu Phe Leu Arg 245 250 255 Asp Val Asp Thr Arg Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Arg Gly Phe Lys 260 265 270 Ala Ala Leu Ala Ile Asp Ala Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Asp Asn 275 280 285 His Pro Met Asn Arg Met Leu Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Leu Lys Glu 290 295 300 Tyr Phe Ser Pro Trp Val Gln Gln Asn Gly Gly Trp Glu Lys Ile Leu
305 310 315 320 Gly Ile Ser His Glu Glu Val Asp 325 <210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 43
gggctcgaga tgtgcagcac cagtgtgtat g 31
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic primer <400> 44
ccaagcttta agtctacttc ttcatgtgat atccc 35
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８４ 48/00 ４Ｃ０８５ 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８６ 48/00 43/00 １０５ ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/06 33/50 Ｚ 5/10 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ａ Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｅ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 BA13 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ43 QR08 QR14 QR32 QR38 QR42 QR55 QR82 QS12 QS25 QS34 QS39 QX01 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AA26X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA25 MA02 NA05 NA13 NA14 ZB211 ZB261 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA02 MA04 NA13 NA14 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA13 NA14 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Bcl-Gポリペプチド、またはその機能的断片をコードする単
    離された核酸。
  2. 【請求項２】 （a）配列番号：2、4もしくは42に示されたアミノ酸配列を
    コードする核酸、または （b）生物活性のあるBcl-Gを連続的にコードする、中程度にストリンジェント
    な条件下で（a）の核酸とハイブリダイズする核酸、または （c）生物活性のあるBcl-Gをコードする、上記の（a）もしくは（b）に関する
    核酸縮重物 から選択される核酸を含む、 Bcl-Gポリペプチド、またはその機能的断片をコードする単離された核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号：1、3または41のいずれかのBcl-Gコード部分と高
    ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、請求項2記載の核酸。
  4. 【請求項４】 核酸のヌクレオチド配列が配列番号：1、3または41のいずれ
    かに示されたものと実質的に同じである、請求項2記載の核酸。
  5. 【請求項５】 核酸のヌクレオチド配列が配列番号：1、3もしくは41のいず
    れかに示されたもの、またはその改変物と同じである、請求項2記載の核酸。
  6. 【請求項６】 cDNAである、請求項2記載の核酸。
  7. 【請求項７】 請求項2記載の核酸を含むベクター。
  8. 【請求項８】 請求項2記載の核酸を含む組換え細胞。
  9. 【請求項９】 配列番号：1、3もしくは41またはそのアンチセンス鎖の15〜
    300個の連続したヌクレオチドを含む、Bcl-Gオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項9記載のオ
    リゴヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項2記載の核酸によってコードされるmRNAと特異的に
    結合しうる、アンチセンス核酸。
  12. 【請求項１２】 請求項10記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含
    む、Bcl-G核酸配列の存在を検出するためのキット。
  13. 【請求項１３】 請求項2の核酸によってコードされる、単離されたBcl-Gポ
    リペプチド、またはその機能的断片。
  14. 【請求項１４】 Bcl-GＬ（配列番号：2）、Bcl-GＳ（配列番号：4）、また
    はマウスBcl-G（配列番号：42）と実質的に同じアミノ酸配列を含む、請求項13
    記載のBcl-Gポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 Bcl-GＬ（配列番号：2）、Bcl-GＳ（配列番号：4）、また
    はマウスBcl-G（配列番号：42）のアミノ酸配列を含む、請求項14記載のBcl-Gポ
    リペプチド。
  16. 【請求項１６】 機能的断片がBH3ドメインまたはBH2ドメインを含む、請求
    項13記載のBcl-Gポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 機能的断片が、配列番号：5、6、9および18からなる群よ
    り選択されるアミノ酸配列を含む、請求項16記載のBcl-Gポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号：1、3または41に示されたものと実質的に同じヌ
    クレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項13記載の
    Bcl-Gポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 配列番号：1または3に示された配列を含むヌクレオチド配
    列によってコードされる、請求項13記載のBcl-Gポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 Bcl-Gポリペプチドの発現のための方法であって、請求項8
    の細胞をBcl-Gの発現に適した条件下で培養することを含む方法。
  21. 【請求項２１】 請求項13記載のBcl-Gとの特異的反応性を有する、単離さ
    れた抗Bcl-G抗体。
  22. 【請求項２２】 モノクローナル抗体である、請求項21記載の抗体。
  23. 【請求項２３】 請求項22のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
  24. 【請求項２４】 ポリクローナル抗体である、請求項21記載の抗体。
  25. 【請求項２５】 ヒトBcl-Gの発現を抑制するのに有効な量の請求項11記載
    のアンチセンス核酸、およびBcl-Gを細胞に送達しうる許容される担体を含む、
    組成物。
  26. 【請求項２６】 Bcl-Gをコードする請求項2記載の外因性核酸を発現する、
    トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  27. 【請求項２７】 Bcl-Gをコードする核酸が変異しており、そのようにして
    発現されるBcl-Gが天然型のBcl-Gではない、請求項26記載のトランスジェニック
    非ヒト哺乳動物。
  28. 【請求項２８】 破壊されたBcl-G遺伝子を有する、変異型の非ヒト哺乳動
    物。
  29. 【請求項２９】 マウスである、請求項26記載のトランスジェニック非ヒト
    哺乳動物。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物Bcl-Gをコードする核酸を同定するための方法で
    あって、核酸を含む試料を、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条
    件下で、1つまたは複数の請求項9記載のオリゴヌクレオチドと接触させること、
    およびオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を同定することを含む方法
    。
  31. 【請求項３１】 試料中のBcl-G核酸分子を検出するための方法であって、
    試料を2つまたはそれ以上の請求項9記載のBcl-Gオリゴヌクレオチドと接触させ
    ること、核酸分子を増幅すること、および増幅を検出することを含む方法。
  32. 【請求項３２】 増幅がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項31
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】 試料中のヒトBcl-Gの存在を検出するための方法であって
    、 試料を請求項21記載の抗体と接触させること、および抗体の試料との特異的
    結合の存在を検出し、それによって該試料中のヒトBcl-Gの存在を検出すること
    を含む方法。
  34. 【請求項３４】 配列番号：1または3に示された核酸配列に由来する核酸配
    列を含む、Bcl-G核酸の増幅のための一本鎖核酸プライマー。
  35. 【請求項３５】 発癌性ポリペプチドの活性を修飾するための方法であって
    、発癌性ポリペプチドを実質的に純粋なBcl-G、またはその発癌性蛋白質結合断
    片と接触させることを含む方法。
  36. 【請求項３６】 Bcl-GのBcl-G関連ポリペプチド（BAP）との会合を変化さ
    せる有効作用物質を同定する方法であって、 （a）Bcl-GおよびBAPポリペプチドを、該Bcl-GおよびBAPポリペプチドを化合
    物と会合可能な条件下で接触させる段階；ならびに （b）該Bcl-GおよびBAPポリペプチドの会合の変化を検出し、それによって該B
    cl-GのBAPとの会合を変化させる有効作用物質である化合物を同定する段階 を含む方法。
  37. 【請求項３７】 化合物が薬剤である、請求項36記載の方法。
  38. 【請求項３８】 化合物がポリペプチドである、請求項36記載の方法。
  39. 【請求項３９】 Bcl-Gポリペプチドを介して活性を修飾するための方法で
    あって、Bcl-Gポリペプチドを、請求項36によって同定された作用物質の有効修
    飾量と接触させることを含む方法。
  40. 【請求項４０】 修飾される活性がBcl-GのBcl-2ファミリーのメンバーとの
    結合である、請求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】 細胞におけるアポトーシスのレベルを修飾するための方法
    であって、 （a）Bcl-Gをコードする核酸分子を細胞内に導入する段階、および （b）Bcl-Gの発現によって細胞におけるアポトーシスが修飾されるような、該
    細胞内で該Bcl-Gを発現させる段階 を含む方法。
  42. 【請求項４２】 細胞におけるアポトーシスのレベルを修飾する方法であっ
    て、アンチセンスヌクレオチド配列を細胞内に導入することを含み、アンチセン
    スヌクレオチド配列がBcl-Gをコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズし
    、ハイブリダイゼーションによって細胞におけるBcl-Gの発現が減少または抑制
    されるような方法。
  43. 【請求項４３】 薬学的に許容される担体、ならびにBcl-Gポリペプチド、B
    cl-Gの機能的断片、請求項36によって同定されたBcl-G修飾化合物、および抗Bcl
    -G抗体からなる群より選択される化合物を含む、治療的組成物。
  44. 【請求項４４】 異常な細胞増殖を特徴とする病態を治療する方法であって
    、請求項43記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
  45. 【請求項４５】 患者におけるBcl-Gレベルの上昇または低下を特徴とする
    病態を診断する方法であって、 （a）患者から被験試料を入手する段階、 （b）試料をBcl-Gと結合しうる作用物質と適切な条件下で接触させる段階であ
    って、条件が作用物質の該Bcl-Gとの特異的結合を許容するような段階；および （c）被験試料における特異的結合の量を対照試料における特異的結合の量と
    比較する段階であって、被験試料における該特異的結合の量が対照試料に比べて
    多いまたは少ないことによって病態が診断されるような段階 を含む方法。
  46. 【請求項４６】 作用物質が、抗Bcl-G抗体、Bcl-G関連蛋白質（BAP）、お
    よびBcl-G核酸からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
  47. 【請求項４７】 細胞におけるアポトーシスのレベルを修飾する方法であっ
    て、細胞を、細胞内でのBcl-GのBcl-G関連蛋白質との会合を有効に変化させる、
    または細胞内でのBcl-Gの活性を有効に変化させる化合物と接触させることを含
    む方法。
  48. 【請求項４８】 BH3（配列番号：5または9）およびBH2（配列番号：6また
    は18）からなる群より選択されるドメインを含む、キメラ蛋白質。
  49. 【請求項４９】 Bcl-GとBcl-2との間の相互作用を修飾する方法であって、
    Bcl-Gポリペプチドを請求項36記載の作用物質と接触させることを含む方法。
  50. 【請求項５０】 患者からの被験試料を請求項21記載の抗体と接触させるこ
    とを含む、癌の診断または癌治療のモニタリングの方法。
  51. 【請求項５１】 患者からの被験試料を請求項21記載の抗体と接触させるこ
    とを含む、癌患者の予後を評価する方法。
  52. 【請求項５２】 患者からの被験試料を請求項9記載のオリゴヌクレオチド
    と接触させることを含む、癌の診断または癌治療のモニタリングの方法。
  53. 【請求項５３】 患者からの被験試料を請求項9記載のオリゴヌクレオチド
    と接触させることを含む、癌患者の予後を評価する方法。
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