PT1618130E - Vacina terapêutica contra o cancro - Google Patents

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PT1618130E
PT1618130E PT47260955T PT04726095T PT1618130E PT 1618130 E PT1618130 E PT 1618130E PT 47260955 T PT47260955 T PT 47260955T PT 04726095 T PT04726095 T PT 04726095T PT 1618130 E PT1618130 E PT 1618130E
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Survac Aps
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Description

ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Vacina terapêutica contra o cancro"
Campo do invento 0 presente pedido descreve fragmentos de ML-IAP (livina) e uma vacina terapêutica compreendendo um ou mais fragmentos do polipéptido ML-IAP. A vacina pode ser utilizada para o tratamento profiláctico, mitigante e/ou curativo de, por exemplo, cancros e doenças auto-imunes.
Antecedentes do invento
Está perfeitamente estabelecido que os epitopos peptidicos derivados de antigénios associados a tumores humanos (TAA de "Tumor-Associated Antigens") podem ser reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CTL de "Cytotoxic T Lymphocytes") no contexto de moléculas do MHC1 e que a maioria - se não a totalidade - dos tumores expressa estes antigénios. Por conseguinte, estão em curso esforços clínicos promissores no sentido de visar estes TAA em estratégias como a vacinação e a terapia adoptiva com células T, de modo a gerar respostas CTL antitumorais eficazes nos doentes2-5.
No caso do melanoma, que é o tumor para o qual foi caracterizado o maior número de TAA definidos por CTL, induziram-se respostas CTL poderosas contra antigénios por vacinação, e alguns doentes experimentaram uma remissão completa da doença6,7.
Contudo, a imunosselecção de variantes com perda de antigénio ("antigen loss variants") pode ser um obstáculo sério para o potencial curativo da maioria dos epitopos CTL conhecidos em oncologia clinica, e a selecção de tumores mutantes deficientes em antigénios é uma limitação reconhecida das estratégias terapêuticas quando se estão a visar antigénios que não detêm um papel no crescimento do cancro5,27,28 . A razão para isto é o facto de a maior parte dos péptidos caracterizados serem derivados de polipéptidos que não são essenciais para a sobrevivência da célula tumoral. Assim, se forem induzidas respostas CTL poderosas contra 2 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ estes antigénios peptídicos através de medidas terapêuticas como a vacinação, é muito provável que as células tumorais deficientes na expressão do antigénio visado escapem às respostas imunitárias produzidas8,9.
Existe pois a necessidade de dispor de vacinas terapêuticas mais eficazes e de métodos melhorados para o tratamento do cancro e de doenças auto-imunes.
Sumário do invento A aplicação terapêutica de antigénios tumorais cuja expressão é essencial para a sobrevivência das células tumorais representa uma estratégia para o tratamento do cancro, ao impedir a emergência de variantes com perda de antigénio devido a imunosselecção, particularmente durante a imunoterapia. Contudo, a identificação de fragmentos específicos compreendendo boas propriedades antigénicas é dificil. A familia de proteínas inibidoras da apoptose (IAP de "Inhibitor of Apoptosis Protein")12 constitui um exemplo de antigénios tumorais cuja expressão é essencial para a sobrevivência das células tumorais. A inibição da apoptose não só reforça a sobrevivência das células cancerosas, como impede que as células cancerosas escapem à imunovigilância e às terapias citotóxicas. Várias IAP diferentes foram já descritas. Os seus diferentes padrões de expressão sugerem um papel específico do órgão na promoção da sobrevivência celular durante o desenvolvimento e a homeostasia tecidular. Enquanto X-IAP, C-IAPl e C-IAP2 são expressas de forma relativamente ubíqua, a survivina é expressa apenas em tecidos fetais e tumorais. 0 polipéptido inibidor da apoptose ML-IAP possui um padrão de expressão bastante selectivo, uma vez que é detectado predominantemente nos melanomas e em alguns outros tecidos13,14. A única outra IPA com uma expressão bem documentada no melanoma é a survivina. 3 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ Ο ML-IAP pode ser detectado na maioria das linhas celulares de melanoma testadas, mas não nos melanócitos normais14. As linhas celulares de melanoma com niveis elevados de ML-LAP são mais resistentes à apoptose induzida por drogas do que os melanócitos normais primários. Deste modo, o ML-IAP poderia ser um factor celular critico e niveis de expressão acrescidos de ML-IAP confeririam resistência a estímulos apoptóticos, contribuindo assim para a patogénese e a progressão de melanomas malignos. 0 polipéptido ML-IAP inibe a apoptose e a morte celular induzida por receptores de morte, podendo esperar-se que a acção de agentes quimioterapêuticos seja dificultada pela expressão de ML-IAP.
Por conseguinte, uma expressão elevada de ML-IAP torna as células de melanoma resistentes a estímulos apoptóticos e, desta forma, contribui potencialmente para a patogénese desta malignidade. 0 presente pedido demonstra que as células T infiltrantes do ambiente do tumor ou que circulam no sangue periférico de doentes com melanoma reconhecem especificamente péptidos derivados de ML-IAP. Assim, o ML-IAP é, por um lado, importante para a sobrevivência da célula cancerosa e, por outro, um alvo para as células imunológicas efectoras.
Num aspecto, o presente invento refere-se a um fragmento de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) que consiste em pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP e é seleccionado entre o grupo constituído por SEQ ID N.° 245, SEQ ID N.° 297, SEQ ID N.° 298, SEQ ID N.° 301, em que o referido fragmento de polipéptido consiste no máximo em 15 aminoácidos consecutivos.
Noutro aspecto preferido, o presente pedido refere-se a uma vacina terapêutica compreendendo ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e/ou um ou mais fragmentos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) capazes de provocar uma resposta de células T especificas, incluindo uma resposta envolvendo a activação de células T citotóxicas e/ou de células T auxiliares (Th) . A composição de vacina 4 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ compreende ainda preferencialmente um adjuvante e/ou um transportador.
Ainda noutro aspecto, é disponibilizada uma composição farmacêutica compreendendo ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e/ou um ou mais fragmentos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) capazes de provocar uma resposta de células T especificas, incluindo uma resposta envolvendo a activação de células T citotóxicas e/ou de células T auxiliares (Th), e um composto bioactivo seleccionado entre o grupo constituído por um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico. A composição farmacêutica pode compreender ainda um adjuvante e/ou um transportador.
Ainda noutro aspecto adicional do pedido, é fornecido um kit de partes compreendendo ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e/ou um ou mais fragmentos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) capazes de provocar uma resposta de células T especificas, incluindo uma resposta envolvendo a activação de células T citotóxicas e/ou de células T auxiliares (Th), e um composto bioactivo seleccionado entre o grupo constituído por um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico, em que o um ou mais fragmentos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) capazes de provocar uma resposta de células T especificas e o composto bioactivo seleccionado entre o grupo constituído por um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico podem ser administrados em simultâneo ou sequencialmente por qualquer ordem. 0 kit de partes pode compreender opcionalmente um manual contendo informações sobre o regime posológico ou a administração do fragmento de ML-IAP e do composto bioactivo.
Ainda noutro aspecto do invento, é disponibilizada a utilização de um fragmento de ML-IAP, no fabrico de uma composição de vacina capaz de produzir uma resposta de células T específicas num indivíduo ao qual a composição de vacina foi administrada.
Noutro aspecto ainda do invento, é disponibilizada a utilização de um fragmento de ML-IAP em combinação com um agente bioactivo, no fabrico de uma composição farmacêutica 5 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ destinada ao tratamento de um cancro e/ou de uma doença auto-imune num indivíduo necessitado do referido tratamento.
Ainda noutro aspecto adicional do invento, é fornecido um método para activar e expandir as células T específicas para ML-IAP ou seus fragmentos, em que o referido método compreende as etapas de co-cultura das células T com ML-IAP, e/ou pelo menos um seu fragmento, activando assim as células T, e isolamento das células T específicas para ML-IAP activadas e/ou das células T específicas para o fragmento de ML-IAP activadas.
Noutro aspecto adicional do invento, é fornecido um método para tratar um indivíduo diagnosticado com um cancro, ou em risco de desenvolver um cancro, em que o referido método compreende as etapas de administração ao referido indivíduo de pelo menos uma célula T específica para ML-IAP isolada e activada e/ou de pelo menos uma célula T específica para um fragmento de ML-IAP isolada e activada.
Breve descrição das figuras
Figura 1
Resposta de células T contra o péptido ML-IAP28o (QLCPICRAPV), medida num ensaio ELISPOT, em PBL ("Peripheral Blood Lymphocyte"; linfócito de sangue periférico) dos doentes com melanoma FM3 (Figura IA) ou FM72 (Figura 1B) e em TIL ("Tumor-Infiltrating Lymphocyte"; linfócito infiltrante do tumor) dos doentes com melanoma PM9 (Figura 1C) ou FM72 (Figura 1D) . Os linfócitos T foram estimulados uma vez com péptido antes de serem plaqueados a 3xl05 células por poço, em duplicado, sem ou com o péptido. 0 número médio de "spots" específicos para o péptido (após subtracção dos "spots" sem péptido adicionado) foi calculado para cada doente utilizando um dispositivo de varrimento CCD ("Charge-Coupled Device") e um sistema computacional (Figura 1E).
Figura 2
Resposta de células T contra os péptidos ML-IAP28o (QLCPICRAPV), MLIAP245 (RLQEERTCKV) , MLIAP23o (VLEPPGARDV) e 6 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ MLIAPgo (RLASFYDWPL) , medida num ensaio ELISPOT, em amostras de TIL de nove doentes e em amostras de PBL de dois doentes. Os linfócitos T foram estimulados uma vez com péptido antes de serem plaqueados a 3xl05 células por poço, em duplicado, sem ou com o péptido. 0 número médio de "spots" específicos para o péptido (após subtracção dos "spots" sem péptido adicionado) foi calculado para cada doente utilizando um dispositivo de varrimento CCD e um sistema computacional.
Figura 3
Resposta de células T contra o péptido ML-IAP245-253 (RLQEERTCK) , medida num ensaio ELISPOT, em PBL de 14 doentes com melanoma. Os linfócitos T foram estimulados uma vez com péptido antes de serem plaqueados em triplicado, sem ou com o péptido. 0 número médio de células específicas para o péptido (após subtracção dos "spots" sem péptido adicionado) foi calculado para cada doente como sendo o número de células que formam "spots" por 105 células CD8 positivas, após subtracção do número de "spots" do fundo que se formaram sem adição de péptido, utilizando o analisador ImmunoSpot® Series 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EUA).
Figura 4
Detecção in situ de CTL reactivos a ML-IAP. Utilizou-se a microscopia confocal de varrimento laser para detectar CTL que reagem com um anticorpo anti-CD8 conjugado com Cy3 (canal vermelho) e com uma construção HLA-A2/ML-IAP28o multimérica conjugada com isotiocianato de fluoresceína (canal verde) (primeira e segunda colunas) ou com uma construção HLA-A2/ML-IAP245 multimérica conjugada com isotiocianato de fluoresceína (última coluna), em tumores primários de dois doentes com melanoma positivo para HLA-A2.
Figura 5
Capacidade citolítica de CTL específicos para ML-IAP. Os CTL reactivos a ML-IAP245 foram isolados de PBL dos doentes com melanoma CmeIE22 utilizando esferas magnéticas revestidas com péptido, antes de serem plaqueados a 2xl03 células por poço, em duplicado, juntamente com células T2 submetidas ou 7 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ não a "peptide pulsing" com ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (Figura 5A). Os CTL reactivos a ML-IAP280 foram isolados de um gânglio linfático infiltrado por melanoma do doente CmeI72, utilizando esferas magnéticas revestidas com péptido. Estas células foram analisadas quanto a lise especifica de células T2 com (quadrados) ou sem (triângulos) péptido ML-IAP28o (QLCPICRAPV) (Figura 5B). Lise por células T isoladas via ML-IAP28o da linha celular de melanoma autólogo FM93 (triângulos), da linha celular negativa para HLA-A2 FM56 (círculos pretos) e da linha celular que é alvo de células "killer" naturais K562 (círculos brancos) (Figura 5C) .
Descrição detalhada do invento
As concretizações preferidas do presente pedido estão descritas abaixo.
Fragmentos de ML-IAP e composições de vacinas terapêuticas compreendendo estes fragmentos ou ML-IAP completo
Em concretizações preferidas, o presente pedido refere-se a fragmentos de ML-IAP e a composições de vacinas terapêuticas compreendendo um ou mais fragmentos de ML-IAP e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição de vacina pode compreender adicionalmente um transportador e/ou um composto adjuvante. Uma composição de vacina compreendendo ML-IAP completo (SEQ ID N.° 1) é também disponibilizada. gldtcrawdh lasfydwplt wthakwfpsc svpasgypel qlrrlqeert
Os fragmentos de resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP preferidos de acordo com o presente pedido estão indicados abaixo. Os fragmentos podem ser seleccionados a partir da sequência de resíduos de aminoácidos de ML-IAP completo indicada aqui abaixo como SEQ ID N.° 1: mgpkdsakcl hrgpqpshwa agdgptqerc gprslgspvl fpgmgseeir lqswkrgddp epedaapvap eppgardvea plteeeeeeg agffhtghqd fvhsvqeths saqepggvsp vdgqilgqlr aevppellaa qf llrskgrd ptprrevqse ckvcldravs N.0 1) . agatlsrgpa kvrcffcyrgg qllgswdpwe aeaqrawwvl
ivfvpcghlv caecapglql cpicrapvrs rvrtfls (SEQ ID 8 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ Não é possível prever de imediato que fragmentos de um dado polipéptido, como ML-IAP, constituirão bons antigénios ou alvos eficazes para respostas CTL espontâneas. Deste modo, é crítico identificar péptidos que sejam adequados como antigénios. 0 presente pedido proporciona métodos para testar fragmentos de ML-IAP, isto é, testes para a afinidade de ligação a moléculas HLA, para a resposta CTL provocada e/ou para quaisquer outras propriedades antigénicas, de modo a identificar aqueles fragmentos de ML-IAP que constituem bons antigénios. Além disso, o invento disponibiliza péptidos ML-IAP úteis. A ligação de péptidos ao MHC (complexo de histocompatibilidade principal) é uma etapa crucial na geração de uma resposta de células T. Assim, uma forma normalmente usada de identificação de epitopos CTL é a utilização de algoritmos sofisticados, que incorporam informações sobre a contribuição de todas as cadeias laterais do péptido para a ligação global de um péptido particular, numa tentativa de melhorar a previsão de epitopos CTL. No entanto, primeiro, foi referido que não existe uma correlação forte entre a ligação efectiva do péptido ao MHC e a ligação prevista a partir de algoritmos computacionais (20). Segundo, a ligação do péptido ao MHC é um de vários factores diferentes que determinam a imunogenicidade de um dado péptido. Estes incluem o nível de expressão da proteína de origem relevante, o processamento, o transporte TAP, o nível de expressão da molécula MHC de classe I na superfície celular, o repertório TCR, a sensibilidade CTL, a imunossupressão e as citocinas (23). Deste modo, existem muitos factores que determinam uma resposta CTL contra um dado péptido. Além disso, muitos epitopos imunodominantes nas respostas CTL a proteínas próprias podem frequentemente ser subdominantes ou crípticos, em vez de determinantes dominantes. A identificação de epitopos CTL de uma dada proteína é, por conseguinte, um processo complicado.
Fragmentos compreendendo uma sequência de 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP O presente pedido descreve, numa concretização preferida, fragmentos de ML-IAP compreendendo pelo menos 9 9 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ resíduos de aminoácidos consecutivos e composições de vacinas contendo fragmentos de ML-IAP compreendendo pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos, incluindo os fragmentos indicados abaixo:
mgpkdsakc (SEQ ID N.° 2); gpkdsakcl (SEQ ID N.° 3); pkdsakclh (SEQ ID N. 0 4); kdsakclhr (SEQ ID N.° 5); dsakclhrg (SEQ ID N.° 6); sakdhrgp (SEQ ID i N. 0 kclhrgpqp (SEQ ID N. 0 9) ; lhrgpqpsh (SEQ ID N. 0 ii) ; rgpqpshwa (SEQ ID N. ° 13) ; pqpshwaag (SEQ ID N. ° 15) ; pshwaagdg (SEQ ID N. 0 17) ; hwaagdgpt (SEQ ID N. 0 19) ; aagdgptqe (SEQ ID N. 0 21) ; gdgptqerc (SEQ ID N. ° 23) ; gptqercgp (SEQ ID N. ° 25) ; tqercgprs (SEQ ID N. 0 27) ; ercgprslg (SEQ ID N. 0 29) ; ogprslgsp (SEQ ID N. ° 31) ; prslgspvl (SEQ ID N. 0 33) ; slgspvlgl (SEQ ID N. ° 35) ; gspvlgldt (SEQ ID N. 0 37) ; pvlgldtcr (SEQ ID N. 0 39) ; lgldtcraw (SEQ ID N. 0 41) ; ldtcrawdh (SEQ ID N. 0 43) ; tcrawdhvd (SEQ ID N. 0 45) ; rawdhvdgq (SEQ ID N. 0 47) ; wdhvdgqil (SEQ ID N. 0 49) ; hvdgqilgq (SEQ ID N. 0 51) ; dgqilgqlr (SEQ ID N. 0 53) ; qilgqlrpl (SEQ ID N. 0 55) ; lgqlrplte (SEQ ID N. 0 57) ; qlrplteee (SEQ ID N. 0 59) , rplteeeee (SEQ ID N. 0 61) ; lteeeeeeg (SEQ ID N. 0 63) ; eeeeeegag (SEQ ID N. 0 65) ; eeeegagat (SEQ ID N. 0 67) ; eegagatls (SEQ ID N. 0 69) ; gagatlsrg (SEQ ID N. 0 71) ; gatlsrgpa (SEQ ID N. 0 73) ; tlsrgpafp (SEQ ID N. 0 75) ; srgpafpgm (SEQ ID N. 0 77) ; 7); akclhrgpq (SEQ IE ) N. ° 8); clhrgpqps (SEQ ID N. 0 10) ; hrgpqpshw (SEQ ID N. 0 12) ; gpqpshwaa (SEQ ID N. 0 14) ; qpshwaagd (SEQ ID N. 0 16) ; shwaagdgp (SEQ ID N. 0 18) ; waagdgptq (SEQ ID N. 0 20) ; agdgptqer (SEQ ID N. 0 22) ; dgptqercg (SEQ ID N. 0 24) ; ptqercgpr (SEQ ID N. 0 26) ; qercgprsl (SEQ ID N. 0 28) ; rcgprslgs (SEQ ID N. 0 30) ; gprslgspv (SEQ ID N. 0 32) ; rslgspvlg (SEQ ID N. 0 34) ; lgspvlgld (SEQ ID N. 0 36) ; spvlgldtc (SEQ ID N. 0 38) ; vlgldtcra (SEQ ID N. 0 40) ; gldtcrawd (SEQ ID N. 0 42) ; dtcrawdhv (SEQ ID N. 0 44) ; crawdhvdg (SEQ ID N. 0 46) ; awdhvdgqi (SEQ ID N. 0 48) ; dhvdgqilg (SEQ ID N. 0 50) ; vdgqilgql (SEQ ID N. 0 52) ; gqilgqlrp (SEQ ID N. 0 54) ; ilgqlrplt (SEQ ID N. 0 56) ; gqlrpltee (SEQ ID N. 0 58) ; lrplteese (SEQ ID N. 0 60) ; ptteeeeee (SEQ ID N. 0 62) ; teeeeeega (SEQ ID N. 0 64) ; eeeeegaga (SEQ ID N. 0 66) ; eeegagatl (SEQ ID N. 0 68) ; egagatlsr (SEQ ID N. ° 70) ; agatlsrgp (SEQ ID N. ° 72) ; atlsrgpaf (SEQ ID N. 0 74) ; lsrgpafpg (SEQ ID N. 0 76) ; rgpafpgmg (SEQ ID N. ° 78) ; 10 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
gpafpgmgs (SEQ ID N.0 79); pafpgmgse (SEQ ID N. ° 80 ); afpgmgsee (SEQ ID N.0 81) ; fpgmgsel (SEQ ID N.0 82); pgmgselr (SEC ID N. ° 83); gmgseelrl (SEQ ID N.° 84); mgseelrla (SEQ ID N. ° 85) ; gseelrlas (SEQ ID N. ° 86) ; seelrlasf (SEQ ID N. 0 87) ; eelrlasfy (SEQ ID N. ° 88) ; elrlasfyd (SEQ ID N. 0 89) ; Irlasfydw (SEQ ID N. 0 90) ; rlasfydwp (SEQ ID N. 0 91) ; lasfydwpl (SEQ ID N. 0 92) ; asfydwplt (SEQ ID N. 0 93) ; sfydwplta (SEQ ID N. 0 94) ; fydwpltae (SEQ ID N. ° 95) ; ydwpltaev (SEQ ID N. 0 96) ; dwpltaevp (SEQ ID N. ° 97) ; wpltaevpp (SEQ ID N. 0 98) ; pltaevppe (SEQ ID N. ° 99) ; ltaevppel (SEQ ID N. 0 100) ; taevppell (SEQ ID N. ° 101) ; aevppella (SEQ ID N. 0 102) ; evppellaa (SEQ ID N. 0 103) ; vppellaaa (SEQ ID N. 0 104) ; ppellaaag (SEQ ID N. 0 105) ; pelaaagf (SEQ ID N. 0 106) ; ellaaagff (SEQ ID N. 0 107) ; llaaagffh (SEQ ID N. 0 108) ; laaagffht (SEQ ID N. 0 109) ; aaagffhtg (SEQ ID N. 0 110) ; aagffhtgh (SEQ ID N. 0 ui); agffhtghq (SEQ ID N. 0 112) ; gffhtghqd (SEQ ID N. 0 113) ; ffhtghqdk (SEQ ID N. 0 114) ; fhtghqdkv (SEQ ID N. 0 115) ; htghqdkvr (SEQ ID N. ° 116) ; tghqdkvrc (SEQ ID N. 0 117) ; ghqdkvrcf (SEQ ID N. 0 118) ; hqdkvrcff (SEQ ID N. 0 119) ; qdkvrcffc (SEQ ID N. 0 120) ; dkvrcffcy (SEQ ID N. 0 121) ; kvrcffcyg (SEQ ID N. ° 122) ; vrcffcygg (SEQ ID N. 0 123) ; rcffcyggl (SEQ ID N. ° 124) ; cffcygglq (SEQ ID N. 0 125) ; ffcygglqs (SEQ ID N. ° 126) ; fcygglqsw (SEQ ID N. 0 127) ; cygglqswk (SEQ ID N. ° 128) ; ygglqswkr (SEQ ID N. 0 129) ; gglqswkrg (SEQ ID N. ° 130) ; glqswkrgd (SEQ ID N. 0 131) ; lqswkrgdd (SEQ ID N. 0 132) ; qswkrgddp (SEQ ID N. 0 133) ; swkrgddpw (SEQ ID N. 0 134) ; wkrgddpwt (SEQ ID N. 0 135) ; krgddpwth (SEQ ID N. 0 136) ; rgddpwtha (SEQ ID N. 0 137) ; gddpwthak (SEQ ID N. 0 138) ; ddpwthakw (SEQ ID N. 0 139) ; dpwthakwf (SEQ ID N. 0 140) ; pwthakwfp (SEQ ID N. 0 141) ; wthakwfps (SEQ ID N. 0 142) ; thakwfpsc (SEQ ID N. 0 143) ; hakwfpscq (SEQ ID N. 0 144) ; akwfpscqf (SEQ ID N. 0 145) ; kwfpscqf1 (SEQ ID N. 0 146) ; wfpscqf11 (SEQ ID N. 0 147) ; fpscqfllr (SEQ ID N. 0 148) ; pscqfllrs (SEQ ID N. 0 149) ; scqfllrsk (SEQ ID N. 0 150) : cqfllrskg (SEQ ID N. 0 151) ; qfllrskgr (SEQ ID N. 0 152) ; fllrskgrd (SEQ ID N. 0 153) ; llrskgfdf (SEQ ID N. ° 154) ; Irskgrdfv (SEQ ID N. 0 155) ; rskgrdfvh (SEQ ID N. ° 156) ; skgrdfvhs (SEQ ID N. 0 157) ; kgrdfvhsv (SEQ ID N. ° 158) ; grdfvhsvq (SEQ ID N. 0 159) ; rdfvhsvqe (SEQ ID N. 0 160) ; dfvhsvqet (SEQ ID N. 0 161) ; fvhsvqeth (SEQ ID N. 0 162) ; vhsvqeths (SEQ ID 11
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
Ν. 0 163) ; hsvqethsq (SEQ ID N. 0 164) svqethsql (SEQ ID Ν. 0 165) ; vqethsqll (SEQ ID N. 0 166) ; qethsqllg (SEQ ID Ν. 0 16 7) ethsqllgs (SEQ ID N. 0 168) ; thsqllgsw (SEQ ID Ν. 0 169) ; hsqllgswd (SEQ ID N. 0 170) ; sqllgswdp (SEQ ID Ν. 0 171) ; qligswdpw (SEQ ID N. 0 172) ; llgswdpwe (SEQ ID Ν. 0 173) ; Igswdpwee (SEQ ID N. 0 174) ; gswdpweep (SEQ ID Ν. 0 175) ; swdpweepe (SEQ ID N. 0 176) ; wdpweeped (SEQ ID Ν. 0 177) ; dpweepeda (SEQ ID N. 0 178) pweepedaa (SEQ ID Ν. 0 179) ; weepedaap (SEQ ID N. 0 180) eepedaapv (SEQ ID Ν. 0 181) ; epedaapva (SEQ ID N. 0 182) ; pedaapvap (SEQ ID Ν. 0 183) ; edaapvaps (SEQ ID N. 0 184) ; daapvapsv (SEQ ID Ν. 0 185) ; aapvapsvp (SEQ ID N. 0 186) ; apvapsvpa (SEQ ID Ν. 0 187) ; pvapsvpas (SEQ ID N. 0 188) vapsvpasg (SEQ ID Ν. 0 189) ; apsvpasgy (SEQ ID N. 0 190) psvpasgyp (SEQ ID Ν. 0 191) svpasgype (SEQ ID N. 0 192) ; vpasgypel (SEQ ID Ν. 0 193) pasgypelp (SEQ ID N. 0 194) asgypelpt (SEQ ID Ν. 0 195) sgypelptp (SEQ ID N. 0 196) ; gypelptpr (SEQ ID Ν. 0 191) ypelptprr (SEQ ID N. 0 198) pelptprre (SEQ ID Ν. 0 19 9) ; elptprrev (SEQ ID N. 0 200) } lptprrevq (SEQ ID Ν. 0 201) ptprrevqs (SEQ ID N. 0 202) tprrevqse (SEQ ID Ν. 0 203) prrevqses (SEQ ID N. 0 204) rrevqsesa (SEQ ID Ν. 0 20 5) revqsesaq (SEQ ID N. 0 206) evqsesaqe (SEQ ID Ν. 0 201) ; vqsesaqep (SEQ ID N. 0 20 8) qsesaqepg (SEQ ID Ν. 0 209) sesaqepgg (SEQ ID N. 0 210) esaqepggv (SEQ ID Ν. 0 211) saqepggvs (SEQ ID N. 0 212) aqepggvsp (SEQ ID Ν. 0 213) qepggvspa (SEQ ID N. 0 214) epggvspae (SEQ ID Ν. 0 215) pggvspaea (SEQ ID N. 0 216) ggvspaeaq (SEQ ID Ν. 0 211) gvspaeaqr (SEQ ID N. 0 218) vspaeaqra (SEQ ID Ν. 0 219) spaeaqraw (SEQ ID N. 0 220) paeaqraww (SEQ ID Ν. 0 221) aeaqrawwv (SEQ ID N. 0 222) eaqrawwvl (SEQ ID Ν. 0 223) aqrawwvle (SEQ ID N. 0 224) qrawwvlep (SEQ ID Ν. 0 225) rawwvlepp (SEQ ID N. 0 226) awwvleppg (SEQ ID Ν. 0 221) wwvleppga (SEQ ID N. 0 228) wvleppgar (SEQ ID Ν. 0 229) vleppgard (SEQ ID N. 0 23 0) leppgardv (SEQ ID Ν. 0 231) eppgardve (SEQ ID N. 0 232) ppgardvea (SEQ ID Ν. 0 233) pgardveaq (SEQ ID N. 0 234) gardveaql (SEQ ID Ν. 0 23 5) ardveaqlr (SEQ ID N. 0 236) rdveaqlrr (SEQ ID Ν. 0 231) ; dveaqlrr1 (SEQ ID N. 0 23 8) veaqlrrlq (SEQ ID Ν. 0 239) ; eaqlrrlqe (SEQ ID N. 0 240) aqlrrlqee (SEQ ID Ν. 0 241) ; qlrrlqeer (SEQ ID N. 0 242) Irrlqeert (SEQ ID Ν. 0 243) ; rrlqeertc (SEQ ID N. 0 244) rlqeertck (SEQ ID Ν. 0 245) ; lqeertckv (SEQ ID N. 0 246) ; qeertckvc (SEQ ID 12 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ N. 0 247) ; eertckvcl (SEQ ID N. 0 248) ; ertckvcld (SEQ ID N. 0 249) ; rtckvcldr (SEQ ID N. 0 250) ; tckvcldra (SEQ ID N. 0 251) ; ckvcldrav (SEQ ID N. 0 252) ; kvcldravs (SEQ ID N. 0 253) ; vcldravsi (SEQ ID N. 0 254) ; ddravsiv (SEQ ID N. 0 255) ; ldravsivf (SEQ ID N. 0 256) ; dravsivfv (SEQ ID N. 0 257) ; ravsivfvp (SEQ ID N. 0 258) ; avsivfvpc (SEQ ID N. 0 259) ; vsivfvpcg (SEQ ID N. 0 260) ; sivfvpcgh (SEQ ID N. 0 261) ; ivfvpcghl (SEQ ID N. 0 262) ; vfvpcghiv (SEQ ID N. 0 263) ; fvpcghlvc (SEQ ID N. 0 264) ; vpcghlvca (SEQ ID N. 0 265) ; poghlvcae (SEQ ID N. 0 266) ; cghlvcaec (SEQ ID N. 0 267) ; ghivcaeca (SEQ ID N. 0 268) ; hlvcaecap (SEQ ID N. 0 269) ; lvcaecapg (SEQ ID N. 0 2 70) ; vcaecapgl (SEQ ID N. 0 271) ; caecapglq (SEQ ID N. 0 272) ; aecapglql (SEQ ID N. 0 273) ; ecapglqlc (SEQ ID N. 0 2 74) ; capglqlcp (SEQ ID N. 0 275) ; apglqlcpi (SEQ ID N. 0 2 76); pglqlcpic (SEQ ID N. 0 277) ; glqlcpier (SEQ ID N. 0 2 78) ; Iqlcpicra (SEQ ID N. 0 279) ; qlcpicrap (SEQ ID N. 0 2 8 0); lcpicrapv (SEQ ID N. 0 281) ; cpicrapvr (SEQ ID N. 0 282) ; picrapvrs (SEQ ID N. 0 283) ; icrapvrsr (SEQ ID N. 0 284) ; crapvrsrv (SEQ ID N. 0 285) ; rapvrsrvr (SEQ ID N. 0 286) ; apvrsrvrt (SEQ ID N. 0 287) ; pvrsrvrtf (SEQ ID N. 0 2 8 8); vrsrvrtf1 (SEQ ID N. 0 289) ; rsrvrtfls (SEQ ID N. 0 290 ) ·
Numa concretização do presente invento, o fragmento preferencialmente não é a SEQ ID N.° 35.
Fragmentos compreendendo uma sequência de 10 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP O presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 10 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 10 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakcl (SEQ ID N.° 291), assim como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 10 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N.° 3 a SEQ ID N.° 289 (isto é, um fragmento indicado 13
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 290) e adicionando o residuo de aminoácido C-terminal da SEQ ID N.° N+l ao residuo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Numa concretização do presente pedido, o fragmento preferencialmente não é a SEQ ID N.° 299.
Fragmentos compreendendo uma sequência de 11 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP O presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 11 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 11 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakclh (SEQ ID N.° 292), assim como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 11 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N.° 3 a SEQ ID N.° 288 (isto é, um fragmento indicado acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 289) e adicionando os 2 resíduos de aminoácidos mais C-terminais da SEQ ID N.° N+2 ao resíduo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Fragmentos compreendendo uma sequência de 12 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP O presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 12 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 12 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakclhr (SEQ ID N.° 293), assim como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 14 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 12 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N.° 3 a SEQ ID N.° 287 (isto é, um fragmento indicado acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 288) e adicionando os 3 resíduos de aminoácidos mais C-terminais da SEQ ID N.° N+3 ao resíduo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Fragmentos compreendendo uma sequência de 13 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP 0 presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 13 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 13 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakcihrg (SEQ ID N.° 294), assim como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 13 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser geralmente obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N,° 3 a SEQ ID N.° 286 (isto é, um fragmento indicado acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 287) e adicionando os 4 resíduos de aminoácidos mais C-terminais da SEQ ID N.° N+4 ao resíduo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Fragmentos compreendendo uma sequência de 14 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP 0 presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 14 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 14 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakclhrgp (SEQ ID N.° 295), assim 15 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 14 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser geralmente obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N.° 3 a SEQ ID N.° 285 (isto é, um fragmento indicado acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 286) e adicionando os 5 resíduos de aminoácidos mais C-terminais da SEQ ID N.° N+5 ao resíduo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Fragmentos compreendendo uma sequência de 15 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP 0 presente pedido refere-se também a fragmentos compreendendo ou consistindo em 15 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), como sejam, por exemplo, os 15 resíduos de aminoácidos mais N-terminais da SEQ ID N.° 1, isto é, mgpkdsakclhrgpq (SEQ ID N.° 296), assim como a composições de vacinas compreendendo estes fragmentos. Fragmentos adicionais compreendendo ou consistindo em 15 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP podem ser geralmente obtidos da seguinte forma: seleccionando qualquer um dos fragmentos acima definidos pela SEQ ID N.° 3 a SEQ ID N.° 284 (isto é, um fragmento indicado acima definido pela SEQ ID N.° N, em que N é um número inteiro superior a 2 e inferior a 285) e adicionando os 6 resíduos de aminoácidos mais C-terminais da SEQ ID N.° N+6 ao resíduo de aminoácido C-terminal do fragmento seleccionado na etapa i).
Consequentemente, para qualquer um dos fragmentos de ML-IAP indicados acima compreendendo ou consistindo em 10 a 15 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP, N é um número inteiro compreendido entre 3 e preferencialmente menos de 290, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 9, 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 16 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43 , 44, . 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58 , 59, . 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73 , 74, . 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88 , 89, . 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98, , 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 219, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 278, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 15 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP), 285 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 14 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP), 286 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 13 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP), 287 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 12 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP), 288 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 11 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP), 289 (fragmentos compreendendo ou consistindo em 10 OU menos resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP).
Por conseguinte, em concretizações preferidas, o
presente pedido refere-se a fragmentos de ML-IAP compreendendo ou consistindo em mais de 9 resíduos de aminoácidos consecutivos. Tais fragmentos podem compreender por exemplo 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo 11 resíduos de aminoácidos, por exemplo 12 resíduos de aminoácidos, por exemplo 13 resíduos de aminoácidos, por exemplo 14 resíduos de aminoácidos, por exemplo 15 resíduos de aminoácidos, por exemplo 16 resíduos de aminoácidos, por 17
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT exemplo 17 resíduos de aminoácidos, por exemplo 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo 23 resíduos de aminoácidos, por exemplo 26 resíduos de aminoácidos, por exemplo 29 resíduos de aminoácidos, por exemplo 32 resíduos de aminoácidos, por exemplo 35 resíduos de aminoácidos, por exemplo 38 resíduos de aminoácidos, por exemplo 41 resíduos de aminoácidos, por exemplo 44 resíduos de aminoácidos, por exemplo 47 resíduos de aminoácidos, por exemplo 50 resíduos de aminoácidos, por exemplo 53 resíduos de aminoácidos, por exemplo 56 resíduos de aminoácidos, por exemplo 59 resíduos de aminoácidos, por exemplo 62 resíduos de aminoácidos, por exemplo 65 resíduos de aminoácidos, por exemplo 68 resíduos de aminoácidos, por exemplo 71 resíduos de aminoácidos, por exemplo 74 resíduos de aminoácidos, por exemplo 77 resíduos de aminoácidos, por de aminoácidos, por exemplo 19 resíduos de aminoácidos, por exemplo 22 resíduos de aminoácidos, por exemplo 25 resíduos de aminoácidos, por exemplo 28 resíduos de aminoácidos, por exemplo 31 resíduos de aminoácidos, por exemplo 34 resíduos de aminoácidos, por exemplo 37 resíduos de aminoácidos, por exemplo 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo 43 resíduos de aminoácidos, por exemplo 46 resíduos de aminoácidos, por exemplo 49 resíduos de aminoácidos, por exemplo 52 resíduos de aminoácidos, por exemplo 55 resíduos de aminoácidos, por exemplo 58 resíduos de aminoácidos, por exemplo 61 resíduos de aminoácidos, por exemplo 64 resíduos de aminoácidos, por exemplo 67 resíduos de aminoácidos, por exemplo 70 resíduos de aminoácidos, por exemplo 73 resíduos de aminoácidos, por exemplo 76 resíduos de aminoácidos, por exemplo 79 resíduos exemplo 18 resíduos de aminoácidos, por exemplo 21 resíduos de aminoácidos, por exemplo 24 resíduos de aminoácidos, por exemplo 27 resíduos de aminoácidos, por exemplo 30 resíduos de aminoácidos, por exemplo 33 resíduos de aminoácidos, por exemplo 36 resíduos de aminoácidos, por exemplo 39 resíduos de aminoácidos, por exemplo 42 resíduos de aminoácidos, por exemplo 45 resíduos de aminoácidos, por exemplo 48 resíduos de aminoácidos, por exemplo 51 resíduos de aminoácidos, por exemplo 54 resíduos de aminoácidos, por exemplo 57 resíduos de aminoácidos, por exemplo 60 resíduos de aminoácidos, por exemplo 63 resíduos de aminoácidos, por exemplo 66 resíduos de aminoácidos, por exemplo 69 resíduos de aminoácidos, por exemplo 72 resíduos de aminoácidos, por exemplo 75 resíduos de aminoácidos, por exemplo 78 resíduos de aminoácidos, por 18
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT exemplo 80 resíduos de aminoácidos, por exemplo 83 resíduos de aminoácidos, por exemplo 86 resíduos de aminoácidos, por exemplo 89 resíduos de aminoácidos, por exemplo 92 resíduos de aminoácidos, por exemplo 96 resíduos de aminoácidos, por exemplo 99 resíduos de aminoácidos, por exemplo 102 resíduos de aminoácidos, por exemplo 105 resíduos de aminoácidos, por exemplo 108 resíduos de aminoácidos, por exemplo 111 resíduos de aminoácidos, por exemplo 114 resíduos de aminoácidos, por exemplo 117 resíduos de aminoácidos, por exemplo 120 resíduos de aminoácidos, por exemplo 123 resíduos de aminoácidos, por exemplo 126 resíduos de aminoácidos, por exemplo 129 resíduos de aminoácidos, por exemplo 132 resíduos de aminoácidos, por exemplo 135 resíduos de aminoácidos, por exemplo 138 resíduos de aminoácidos, por exemplo 141 resíduos de aminoácidos, por de aminoácidos, por exemplo 82 resíduos de aminoácidos, por exemplo 85 resíduos de aminoácidos, por exemplo 88 resíduos de aminoácidos, por exemplo 91 resíduos de aminoácidos, por exemplo 95 resíduos de aminoácidos, por exemplo 98 resíduos de aminoácidos, por exemplo 101 resíduos de aminoácidos, por exemplo 104 resíduos de aminoácidos, por exemplo 107 resíduos de aminoácidos, por exemplo 110 resíduos de aminoácidos, por exemplo 113 resíduos de aminoácidos, por exemplo 116 resíduos de aminoácidos, por exemplo 119 resíduos de aminoácidos, por exemplo 122 resíduos de aminoácidos, por exemplo 125 resíduos de aminoácidos, por exemplo 128 resíduos de aminoácidos, por exemplo 131 resíduos de aminoácidos, por exemplo 134 resíduos de aminoácidos, por exemplo 137 resíduos de aminoácidos, por exemplo 140 resíduos de aminoácidos, por exemplo 143 resíduos exemplo 81 resíduos de aminoácidos, por exemplo 84 resíduos de aminoácidos, por exemplo 87 resíduos de aminoácidos, por exemplo 90 resíduos de aminoácidos, por exemplo 93 resíduos de aminoácidos, por exemplo 97 resíduos de aminoácidos, por exemplo 100 resíduos de aminoácidos, por exemplo 103 resíduos de aminoácidos, por exemplo 106 resíduos de aminoácidos, por exemplo 109 resíduos de aminoácidos, por exemplo 112 resíduos de aminoácidos, por exemplo 115 resíduos de aminoácidos, por exemplo 118 resíduos de aminoácidos, por exemplo 121 resíduos de aminoácidos, por exemplo 124 resíduos de aminoácidos, por exemplo 127 resíduos de aminoácidos, por exemplo 130 resíduos de aminoácidos, por exemplo 133 resíduos de aminoácidos, por exemplo 136 resíduos de aminoácidos, por exemplo 139 resíduos de aminoácidos, por exemplo 142 resíduos de aminoácidos, por 19
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT exemplo 144 resíduos de aminoácidos, por exemplo 147 resíduos de aminoácidos, por exemplo 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo 153 resíduos de aminoácidos, por exemplo 156 resíduos de aminoácidos, por exemplo 159 resíduos de aminoácidos, por exemplo 162 resíduos de aminoácidos, por exemplo 165 resíduos de aminoácidos, por exemplo 168 resíduos de aminoácidos, por exemplo 171 resíduos de aminoácidos, por exemplo 174 resíduos de aminoácidos, por exemplo 177 resíduos de aminoácidos, por exemplo 180 resíduos de aminoácidos, por exemplo 183 resíduos de aminoácidos, por exemplo 186 resíduos de aminoácidos, por exemplo 189 resíduos de aminoácidos, por exemplo 192 resíduos de aminoácidos, por exemplo 195 resíduos de aminoácidos, por exemplo 198 resíduos de aminoácidos, por exemplo 201 resíduos de aminoácidos, por exemplo 204 resíduos de aminoácidos, por de aminoácidos, por exemplo 146 resíduos de aminoácidos, por exemplo 149 resíduos de aminoácidos, por exemplo 152 resíduos de aminoácidos, por exemplo 155 resíduos de aminoácidos, por exemplo 158 resíduos de aminoácidos, por exemplo 161 resíduos de aminoácidos, por exemplo 164 resíduos de aminoácidos, por exemplo 167 resíduos de aminoácidos, por exemplo 170 resíduos de aminoácidos, por exemplo 173 resíduos de aminoácidos, por exemplo 176 resíduos de aminoácidos, por exemplo 179 resíduos de aminoácidos, por exemplo 182 resíduos de aminoácidos, por exemplo 185 resíduos de aminoácidos, por exemplo 188 resíduos de aminoácidos, por exemplo 191 resíduos de aminoácidos, por exemplo 194 resíduos de aminoácidos, por exemplo 197 resíduos de aminoácidos, por exemplo 200 resíduos de aminoácidos, por exemplo 203 resíduos de aminoácidos, por exemplo 206 resíduos exemplo 145 resíduos de aminoácidos, por exemplo 148 resíduos de aminoácidos, por exemplo 151 resíduos de aminoácidos, por exemplo 154 resíduos de aminoácidos, por exemplo 157 resíduos de aminoácidos, por exemplo 160 resíduos de aminoácidos, por exemplo 163 resíduos de aminoácidos, por exemplo 166 resíduos de aminoácidos, por exemplo 169 resíduos de aminoácidos, por exemplo 172 resíduos de aminoácidos, por exemplo 175 resíduos de aminoácidos, por exemplo 178 resíduos de aminoácidos, por exemplo 181 resíduos de aminoácidos, por exemplo 184 resíduos de aminoácidos, por exemplo 187 resíduos de aminoácidos, por exemplo 190 resíduos de aminoácidos, por exemplo 193 resíduos de aminoácidos, por exemplo 196 resíduos de aminoácidos, por exemplo 199 resíduos de aminoácidos, por exemplo 202 resíduos de aminoácidos, por exemplo 205 resíduos de aminoácidos, por 20
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT exemplo 207 resíduos de aminoácidos, por exemplo 210 resíduos de aminoácidos, por exemplo 213 resíduos de aminoácidos, por exemplo 216 resíduos de aminoácidos, por exemplo 219 resíduos de aminoácidos, por exemplo 222 resíduos de aminoácidos, por exemplo 225 resíduos de aminoácidos, por exemplo 228 resíduos de aminoácidos, por exemplo 231 resíduos de aminoácidos, por exemplo 234 resíduos de aminoácidos, por exemplo 237 resíduos de aminoácidos, por exemplo 240 resíduos de aminoácidos, por exemplo 243 resíduos de aminoácidos, por exemplo 246 resíduos de aminoácidos, por exemplo 249 resíduos de aminoácidos, por exemplo 252 resíduos de aminoácidos, por exemplo 255 resíduos de aminoácidos, por exemplo 258 resíduos de aminoácidos, por exemplo 261 resíduos de aminoácidos, por exemplo 264 resíduos de aminoácidos, por exemplo 267 resíduos de aminoácidos, por de aminoácidos, por exemplo 209 resíduos de aminoácidos, por exemplo 212 resíduos de aminoácidos, por exemplo 215 resíduos de aminoácidos, por exemplo 218 resíduos de aminoácidos, por exemplo 221 resíduos de aminoácidos, por exemplo 224 resíduos de aminoácidos, por exemplo 227 resíduos de aminoácidos, por exemplo 230 resíduos de aminoácidos, por exemplo 233 resíduos de aminoácidos, por exemplo 236 resíduos de aminoácidos, por exemplo 239 resíduos de aminoácidos, por exemplo 242 resíduos de aminoácidos, por exemplo 245 resíduos de aminoácidos, por exemplo 248 resíduos de aminoácidos, por exemplo 251 resíduos de aminoácidos, por exemplo 254 resíduos de aminoácidos, por exemplo 257 resíduos de aminoácidos, por exemplo 260 resíduos de aminoácidos, por exemplo 263 resíduos de aminoácidos, por exemplo 266 resíduos de aminoácidos, por exemplo 269 resíduos exemplo 208 resíduos de aminoácidos, por exemplo 211 resíduos de aminoácidos, por exemplo 214 resíduos de aminoácidos, por exemplo 217 resíduos de aminoácidos, por exemplo 220 resíduos de aminoácidos, por exemplo 223 resíduos de aminoácidos, por exemplo 226 resíduos de aminoácidos, por exemplo 229 resíduos de aminoácidos, por exemplo 232 resíduos de aminoácidos, por exemplo 235 resíduos de aminoácidos, por exemplo 238 resíduos de aminoácidos, por exemplo 241 resíduos de aminoácidos, por exemplo 244 resíduos de aminoácidos, por exemplo 247 resíduos de aminoácidos, por exemplo 250 resíduos de aminoácidos, por exemplo 253 resíduos de aminoácidos, por exemplo 256 resíduos de aminoácidos, por exemplo 259 resíduos de aminoácidos, por exemplo 262 resíduos de aminoácidos, por exemplo 265 resíduos de aminoácidos, por exemplo 268 resíduos de aminoácidos, por 21 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ exemplo 270 resíduos de aminoácidos, por exemplo 271 resíduos de aminoácidos, por exemplo 272 resíduos de aminoácidos, por exemplo 273 resíduos de aminoácidos, por exemplo 274 resíduos de aminoácidos, por exemplo 275 resíduos de aminoácidos, por exemplo 276 resíduos de aminoácidos, por exemplo 277 resíduos de aminoácidos, por exemplo 278 resíduos de aminoácidos, por exemplo 279 resíduos de aminoácidos, por exemplo 280 resíduos de aminoácidos, por exemplo 281 resíduos de aminoácidos, por exemplo 282 resíduos de aminoácidos, por exemplo 283 resíduos de aminoácidos, por exemplo 284 resíduos de aminoácidos, por exemplo 285 resíduos de aminoácidos, por exemplo 286 resíduos de aminoácidos, por exemplo 287 resíduos de aminoácidos, por exemplo 288 resíduos de aminoácidos, por exemplo 289 resíduos de aminoácidos, por exemplo 290 resíduos de aminoácidos, por exemplo 291 resíduos de aminoácidos, por exemplo 292 resíduos de aminoácidos, por exemplo 293 resíduos de aminoácidos, por exemplo 294 resíduos de aminoácidos, por exemplo 295 resíduos de aminoácidos, por exemplo 296 resíduos de aminoácidos, em que o resíduo de aminoácido mais N-terminal de cada um dos fragmentos referidos acima é por exemplo o resíduo 1 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 2 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 3 da SEQ ID N.0 1, por exemplo o resíduo 4 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 5 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 6 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 7 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 8 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 9 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 10 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 11 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 12 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 13 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 14 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 15 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 16 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 17 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 18 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 19 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 20 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 21 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 22 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 23 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 24 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 25 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 26 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 27 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 28 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 29 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 30 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 22 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 31 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 32 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 33 da SEQ ID N.0 1, por exemplo o resíduo 34 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 35 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 36 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 37 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 38 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 39 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 40 da SEQ ID N.0 1, por exemplo o resíduo 41 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 42 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 43 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 44 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 45 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 46 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 47 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 48 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 49 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 50 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 51 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 52 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 53 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 54 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 55 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 56 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 57 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 58 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 59 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 60 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 61 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 62 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 63 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 64 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 65 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 66 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 67 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 68 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 69 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 70 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 71 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 72 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 73 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 74 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 75 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 76 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 77 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 78 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 79 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 80 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 81 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 82 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 83 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 84 da SEQ ID N. ° 1, por exemplo o resíduo 85 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 86 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 87 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 88 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 89 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o 23 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ resíduo 90 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 91 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 92 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 93 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 94 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 95 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 96 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 97 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 98 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 99 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 100 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 101 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 102 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 103 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 104 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 105 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 106 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 107 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 108 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 109 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 110 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 111 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 112 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 113 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 114 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 115 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 116 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 117 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 118 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 119 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 120 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 121 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 122 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 123 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 124 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 125 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 126 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 127 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 128 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 129 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 130 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 131 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 132 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 133 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 134 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 135 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 136 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 137 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 138 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 139 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 140 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 141 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 142 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 143 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 144 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 145 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 146 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 147 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 148 da SEQ ID N.° 1, por 24 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
exemplo ο resíduo 149 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 150 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 151 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 152 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 153 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 154 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 155 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 156 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 157 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 158 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 159 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 160 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 161 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 162 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 163 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 164 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 165 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 166 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 167 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 168 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 169 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 170 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 171 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 172 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 173 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 174 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 175 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 176 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 177 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 178 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 179 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 180 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 181 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 182 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 183 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 184 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 185 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 186 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 187 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 188 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 189 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 190 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 191 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 192 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 193 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 194 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 195 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 196 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 197 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 198 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 199 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 200 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 201 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 202 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 203 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 204 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 205 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 206 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 207 da SEQ ID 25 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ Ν.° 1, por exemplo ο resíduo 208 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 209 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 210 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 211 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 212 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 213 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 214 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 215 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 216 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 217 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 218 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 219 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 220 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 221 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 222 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 223 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 224 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 225 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 226 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 227 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 228 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 229 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 230 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 231 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 232 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 233 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 234 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 235 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 236 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 237 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 238 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 239 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 240 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 241 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 242 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 243 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 244 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 245 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 246 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 247 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 248 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 249 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 250 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 251 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 252 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 253 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 254 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 255 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 256 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 257 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 258 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 259 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 260 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 261 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 262 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 263 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 264 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 265 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 266 da 26 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ SEQ ID Ν.° 1, por exemplo ο resíduo 267 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 268 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 269 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 270 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 271 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 272 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 273 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 274 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 275 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 276 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 277 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 278 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 279 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 280 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 281 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 282 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 283 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 284 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 285 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 286 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 287 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 288 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 289 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 290 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 291 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 292 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 293 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 294 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 295 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 296 da SEQ ID N.° 1, por exemplo o resíduo 297 da SEQ ID N.0 1, na condição de o comprimento de um dado fragmento, medido como o número de resíduos de aminoácidos, ser mais curto que ou igual ao resultado obtido subtraindo de 297 (o número de resíduos na sequência de ML-IAP completo) a posição (número) na SEQ ID N.° 1 do resíduo de aminoácido N-terminal do fragmento em causa.
Os fragmentos de ML-IAP especialmente preferidos estão indicados abaixo na Tabela 1 e encontram-se caracterizados pelo seu valor C50 (μΜ) , que é a concentração de péptido necessária para obter metade da ligação máxima a HLA-A2. A gama de valores referida no índice inferior indica a posição do primeiro aminoácido na sequência. 27 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Tabela 1
Fragmento de ML-IAP Sequência C50 (μΜ) ML-IAP245 RLQEERTCKV (SEQ ID N.° 297) 1 ML-IAP280 QLCPICRAPV (SEQ ID N.° 298) 20 ML-IAP90 RLASFYDWPL (SEQ ID N.° 299) 0,2 ML-IAP154 LLRSKGRDFV (SEQ ID N. 0 300) 10 ML-IAP230 VLEPPGARDV (SEQ ID N. 0 301 ) >100 ML-IAPgg PLTAEVPPEL (SEQ ID N. 0 302) >100 ML-IAP261 SIVFVPCG Não ligante ML-IAP34 SLGSPVLGL (SEQ ID N.° 35) 1 ML-IAP54 QILGQLRPL (SEQ ID N.° 55) 1 ML-IAP99 LTAEVPPEL (SEQ ID N.° 100) 0,9 ml-iap83 GMGSEELRL (SEQ ID N.° 84) 30 ML-IAP200 ELPTPRREV (SEQ ID N.° 200) Não ligante
Fragmentos do polipéptido ML-IAP muito preferidos
Num aspecto, o presente pedido refere-se a um fragmento de polipéptido capaz de produzir uma resposta de células T especificas, em que o referido fragmento compreende um péptido consistindo em pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1), em que o referido péptido é seleccionado entre o grupo constituído por rlqeertck (SEQ ID N. 0 245), qilgqlrpl (SEQ ID N. 0 55 ) , ltaevppel (SEQ ID N. 0 100), gmgseelrl (SEQ ID N. 0 84 ) , elptprrev (SEQ ID N. 0 200) , rlqeertckv (SEQ ID N.° 297 ) , qlcpicrapv (SEQ ID N. 0 298), llrskgrdfv (SEQ ID N.° 300 ) , vleppgardv (SEQ ID N. 0 301) e pltaevppel (SEQ ID N. 0 302); e em que 0 referido fragmento de polipéptido compreende no máximo 100 aminoácidos.
Preferencialmente, o fragmento de polipéptido compreende no máximo 90, mais preferencialmente no máximo 80, ainda mais preferencialmente no máximo 70, mais preferencialmente ainda no máximo 60, ainda mais preferencialmente no máximo 70, mais preferencialmente ainda no máximo 60, ainda mais preferencialmente no máximo 50, mais preferencialmente ainda no máximo 40, ainda mais preferencialmente no máximo 30, mais preferencialmente ainda no máximo 20, ainda mais 28
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT preferencialmente no máximo 18, mais preferencialmente ainda no máximo 16, ainda mais preferencialmente no máximo 15, mais preferencialmente ainda no máximo 14, ainda mais preferencialmente no máximo 13, mais preferencialmente ainda no máximo 12, por exemplo no máximo 11, por exemplo no máximo 10, por exemplo no máximo 9 aminoácidos. É preferido que o fragmento de polipéptido compreenda pelo menos 9, por exemplo pelo menos 10, por exemplo pelo menos 11, por exemplo pelo menos 12, por exemplo pelo menos 13, por exemplo pelo menos 14, por exemplo pelo menos 15 aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1). Assim, o fragmento de polipéptido poderá consistir em 9, por exemplo 10, por exemplo 11, por exemplo 12, por exemplo 13, por exemplo 14, por exemplo 15 aminoácidos consecutivos da SEQ ID N.° 1, compreendendo as (SEQ ID N.° 245), (SEQ ID N.° 55), (SEQ ID N.° 100), (SEQ ID N.° 84), (SEQ ID N.° 200), (SEQ ID N.° 297), (SEQ ID N.° 298), (SEQ ID N.° 300), (SEQ ID N.° 301) ou (SEQ ID N.° 302).
Caracterização funcional de fragmentos de ML-IAP preferidos
Os fragmentos de ML-IAP especialmente preferidos de acordo com o presente pedido são fragmentos de ML-IAP capazes de provocar uma resposta de células T específicas, que poderá ser uma resposta de células T citotóxicas ou uma resposta de células T auxiliares, mas que preferencialmente é uma resposta de células T citotóxicas. É possível utilizar vários métodos de ponta diferentes para identificar os fragmentos de polipéptido capazes de provocar uma resposta de células T específicas. Contudo, é difícil prever se um dado péptido será ou não capaz de provocar uma resposta de células T específicas. Apesar de modelos computacionais conseguirem prever epitopos funcionais, normalmente são necessárias evidências experimentais para verificar se um epitopo previsto é efectivamente um epitopo funcional. Mesmo os fragmentos que se associam a moléculas MHC com uma afinidade elevada não dão necessariamente origem a uma resposta de células T conforme determinada, por exemplo, pelo ensaio ELISPOT (ver abaixo) ou num indivíduo. 29
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
Assim, numa concretização do presente pedido, é preferido que os fragmentos de ML-IAP sejam capazes de associação com uma molécula MHC, ainda mais preferido que o fragmento seja capaz de associação com uma molécula MHC de classe I. As moléculas MHC de classe I preferidas são as moléculas MHC de classe I frequentes, por exemplo, as moléculas MHC de classe I descritas abaixo. A associação entre ML-IAP e uma molécula MHC poderá ser determinada, por exemplo, utilizando o ensaio de montagem descrito abaixo. 0 fragmento de ML-IAP preferido descrito no pedido poderá ser caracterizado por possuir um valor C50, medido como a concentração (μΜ) do fragmento de polipéptido necessária para obter metade da ligação máxima a uma molécula MHC, preferencialmente uma molécula MHC de classe I, no intervalo compreendido entre 500 e 1000, por exemplo no intervalo compreendido entre 200 e 500, por exemplo no intervalo compreendido entre 100 e 200, por exemplo no intervalo compreendido entre 50 e 100, por exemplo no intervalo compreendido entre 25 e 50, por exemplo no intervalo compreendido entre 10 e 25, por exemplo no intervalo compreendido entre 5 e 10, por exemplo no intervalo compreendido entre 1 e 5, por exemplo no intervalo compreendido entre 0,1 e 1; por exemplo no intervalo compreendido entre 0,05 e 0,1; por exemplo inferior a 0,05. A referida molécula MHC de classe I poderá ser qualquer molécula MHC de classe I, por exemplo uma molécula HLA-A, tal como HLA-A2. As moléculas MHC de classe I preferidas são as moléculas MHC de classe I frequentes, por exemplo, as moléculas MHC de classe I descritas abaixo.
Os fragmentos de ML-IAP mais preferidos incluem os fragmentos de ML-IAP em que o valor C5o é inferior a 1000 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 200 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 100 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 75 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 50 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 40 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 31 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 25 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 10 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 5 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 1 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior 30 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ a 0,5 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 0,2 μΜ, ainda mais preferencialmente inferior a 0,1 μΜ, mais preferencialmente ainda inferior a 0,05 μΜ, em que o valor C50 é a concentração do péptido necessária para obter metade da ligação máxima a uma molécula MHC, preferencialmente uma molécula MHC de classe I. A referida molécula MHC de classe I poderá ser qualquer molécula MHC de classe I, por exemplo uma molécula HLA-A, tal como HLA-A2. As moléculas MHC de classe I preferidas são as moléculas MHC de classe I frequentes, por exemplo, as moléculas MHC de classe I descritas abaixo. É preferido que o valor C5o seja determinado de acordo com o ensaio de montagem descrito abaixo.
Por conseguinte, numa concretização do presente invento, os fragmentos preferidos de ML-IAP poderão ser seleccionados entre o grupo constituído por ML-IAP280, ML-IAP83»· ML-LAP154, ML-IAP245, ML-IAP54 e ML-IAP99. Os fragmentos mais preferidos de ML-IAP poderão ser seleccionados entre o grupo constituído por ML-IAP245, ML-IAP54 e ML-IAP99.
Ensaio de montagem
Os ensaios de montagem para a ligação de péptidos sintéticos a moléculas MHC de classe I marcadas metabolicamente com [35S]-metionina podem ser efectuados da forma descrita abaixo. O perito entenderá que o protocolo pode ser adoptado para qualquer péptido e para qualquer molécula MHC de classe I. Anteriormente, foi demonstrado que a concentração do péptido que resulta em metade da ligação máxima, num ensaio de montagem para a ligação de péptidos a moléculas MHC de classe I, é uma boa aproximação de Ka15.
Resumidamente, as células deficientes em TAP foram marcadas metabolicamente com [35S]-metionina (Amersham, Freiburg, Alemanha). As células foram submetidas a lise em 0,5 ml de tampão de lise [NaCl 150 mM, TrisHCl 50 mM, NP-40 a 0,5% (Fluka, Buchs, Suíça), EDTA 5 mM, pH 7,5] contendo Mega-9 a 0,5% (Sigma, St. Louis, EUA), na presença de inibidores de proteases (PMSF 2 mM, iodoacetamida 5 mM, 2 pg/ml de pepstatina, 2 pg/ml de leupeptina), com ou sem péptido sintético (para consultar uma lista de péptidos de controlo positivos, ver a Tabela 2). 31 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Após 20 min de incubação, os núcleos das células foram removidos por centrifugação (5 min, 10 000 g) e adicionaram-se 50 μΐ (10% v/v) de organismos Staphylococcus aureus acabados de lavar (Pansorbin, Calbiochem, Nottingham, Reino Unido). No dia seguinte, o Pansorbin foi removido por centrifugação (12 min, 16.000 g) , adicionou-se o anticorpo monoclonal apropriado a uma concentração final de 10 pg/ml e incubou-se durante 90 min, seguido de adição de proteína A-Sepharose (75 μΐ; 10% v/v) e incubação durante 1 h. As esferas foram lavadas 4 vezes e armazenadas a -20°C até à análise por electroforese.
Para a ligação do péptido a HLA-B*2705 e H-2Kk, utilizou-se um ensaio de montagem modificado como previamente descrito por nós39. Quando transfectadas em células T2, B*2705 e Kk são invulgarmente estáveis na ausência de péptido adicionado. Para contornar isto, introduziu-se uma etapa de aquecimento suave para destabilizar preferencialmente as moléculas MHC que permanecem vazias após a incubação com o péptido. Resumidamente, os lisados celulares foram incubados com o péptido durante 2 h a 4°C, permitindo a ligação do péptido a moléculas de classe I vazias. Em seguida, os lisados celulares foram aquecidos (60°C durante 5 min para T2-B*2705 ou 55°C durante 2 min para T2-Kk) . Adicionou-se depois Pansorbin às amostras como no ensaio de montagem convencional.
Electroforese
No caso de um ensaio de montagem com o anticorpo monoclonal dependente da conformação e específico para moléculas HLA de classe I W6/32, as amostras foram eluídas em tampão de redução (ureia 9,5M; NP-40 a 2%, 2-mercaptoetanol a 5%, Ampholines a 2%; intervalo de pH 3,5-9,5 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia)) e focadas durante 16 h a 880 V em géis de focagem isoeléctrica (IEF) de poliacrilamida a 5,5%20'39.
As amostras dos ensaios de montagem com anticorpos específicos para alelos foram eluídas mediante fervura (5 min) em tampão de redução contendo SDS (TrisHCl 50 mM pH 6,8; SDS a 2%, 2-mercaptoetanol a 5%, glicerol a 10%, azul de 32 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ bromofenol a 2,5%) e submetidas a electroforese em géis de SDS-PAGE a 12% (lha 200 V). Todos os géis foram fixados em ácido acético a 10% contendo metanol a 5% e secos em papel 3 MM (Whatman, Maidstone, Reino Unido). As bandas das cadeias pesadas das moléculas MHC foram quantificadas utilizando o programa Imagequant do sistema Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EUA) . A intensidade da banda está directamente relacionada com a quantidade de complexo MHC de classe I ligado ao péptido que foi recuperada durante o ensaio. O valor C5o (μΜ) , que é a concentração do péptido necessária para obter metade da ligação máxima a MHC, pode assim ser determinado. As afinidades de ligação dos péptidos analisados são determinadas de acordo com a sua eficiência de estabilização das moléculas HLA de classe I. A afinidade de ligação é representada como a concentração do péptido necessária para obter metade da estabilização máxima da molécula HLA apropriada. As análises anteriores mostraram que os valores C50 medidos neste ensaio ajustam-se bem à constante de dissociação (Kd) do complexo31. A previsão de epitopos pode ser efectuada utilizando um algoritmo adequado, preferencialmente um algoritmo baseado no livro "MHC Ligands and Peptide Motifs" de H.G. Rammensee, J.Bachmanna e S.Stevanovic. Contudo, esta previsão de epitopos não é fiável e, por conseguinte, é preferido no presente invento que os fragmentos de ML-IAP sejam identificados utilizando ensaios ELISPOT e/ou ensaios de ligação conforme aqui descritos noutros pontos. Um método de previsão de epitopos é utilizando o algoritmo de previsão de epitopos SYFPEITHI. Explicações adicionais sobre o algoritmo podem ser encontradas em HG Rammensee, Bachmann, NPN Emmerich, OA Bachor & S Stevanovic (1999) SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50:213-219. A base de dados SYFPEITHI pode ser encontrada no site da Internet: http://syfpeithi.bmi-heidelberq.com/scripts/ MHCServer.dll/home.htm. O algoritmo calcula a força de ligação prevista a um tipo HLA definido para uma sequência de aminoácidos. Um fragmento de ML-IAP preferido possui uma força de ligação prevista a uma dada molécula HLA, calculada utilizando o referido algoritmo, de pelo menos 10, preferencialmente pelo 33 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ menos 12, mais preferencialmente pelo menos 15, ainda mais preferencialmente pelo menos 16, por exemplo pelo menos 18, por exemplo pelo menos 20.
Contudo, os fragmentos ainda mais preferidos descritos no pedido são os fragmentos de ML-IAP capazes de provocar uma resposta de células T específicas conforme determinada por um ensaio ELISPOT, por exemplo, o ensaio ELISPOT aqui descrito abaixo. Alguns fragmentos de ML-IAP, embora não se liguem a moléculas MHC com uma afinidade elevada, ainda poderão provocar uma resposta de células T conforme determinada por ELISPOT. Outros fragmentos de ML-IAP poderão ser capazes de se ligar a moléculas MHC com uma afinidade elevada e provocar uma resposta de células T determinada por ELISPOT. Ambos os tipos de fragmentos são fragmentos preferidos de acordo com o invento.
Deste modo, os fragmentos preferidos descritos no pedido são fragmentos de ML-IAP capazes de provocar uma resposta de células T específicas conforme medida por um ensaio ELISPOT, em que são medidos mais de 50 "spots" específicos para os fragmentos por 108 células, mais preferencialmente por 107 células, ainda mais preferencialmente por 106 células, mais preferencialmente ainda por 105 células, por exemplo por 104 células.
Assim, numa concretização descrita no pedido, os fragmentos de ML-IAP preferidos poderão ser seleccionados entre o grupo constituído por ML-IAP245 (SEQ ID N.° 297), ML-IAP28o (SEQ ID N.° 298) e ML-IAP230 (SEQ ID N.° 301). Os fragmentos adicionais preferidos são péptidos compreendendo ou, ainda mais preferencialmente, consistindo na SEQ ID N.° 245.
ELISPOT
Estimulação de PBL com antigénio
Obteve-se sangue periférico de doentes com melanoma antes da vacinação e após uma série de vacinações. De modo a identificar os percursores das células T específicas para o péptido, os linfócitos de sangue periférico (PBL) foram utilizados directamente no ELISPOT (denominado ELISPOT 34
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT directo). Contudo, para ampliar a sensibilidade do ensaio ELISPOT, os PBL foram estimulados uma vez in vitro antes da análise17,18. No dia 0, os PBL ou os gânglios linfáticos esmagados foram descongelados e plaqueados em 2 ml/poço, a uma concentração de 2 χ 106 células, em placas de 24 poços (Nunc, Dinamarca), em meio X-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), soro humano inactivado pelo calor a 5% e L-glutamina 2 mM, na presença de péptido a uma concentração de 10 μΜ. Dois dias mais tarde, adicionou-se 20 Ul/ml interleucina-2 (IL-2) recombinante (Chiron, Ratingen, Alemanha) às culturas. As células cultivadas foram testadas quanto a reactividade no ensaio ELISPOT no dia 8.
Ensaio ELISPOT O ensaio ELISPOT utilizado para quantificar as células efectoras que libertam interferão-γ especifico para os epitopos peptidicos foi adaptado de Lalvani et al.37 e de Scheibenbogen et al.38. Resumidamente, placas de 96 poços com fundo de nitrocelulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore) foram revestidas durante a noite, a 4°C, com 7,5 pg/ml de anticorpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Suécia) em 75 μΐ de PBS estéril. Subsequentemente, os poços foram lavados seis vezes com PBS, e a ligação não especifica foi bloqueada com meio X-vivo durante 2 horas a 37°C. As células ou PBL acabados de isolar, que haviam sido estimulados uma vez in vitro, foram adicionados, em duplicado, a diferentes concentrações celulares (de 106 a 105 células por poço para os PBL não estimulados e de 3xl05 - 3xl04 células por poço para os PBL que tinham sido estimulados uma vez in vitro) em 100 μΐ de meio X-vivo. Os péptidos foram depois adicionados a cada poço para uma concentração final de 2 μΜ e incubados durante a noite a 37°C.
No dia seguinte, o meio foi eliminado e os poços foram lavados (seis vezes) com PBS contendo Tween a 0,05% (PBS/Tw), antes da adição de anticorpo secundário biotinilado (7-B6-1-Biotin, Mabtech) a 0,5 pg/ml em 75 μΐ de PBS contendo BSA a 1% e NaN3 a 0,02% (PBS/BSA). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. Os poços foram lavados (seis vezes) com PBS/Tw. Em seguida, adicionaram-se 75 μΐ de conjugado avidina-enzima (AP-Avidin, Calbiochem) diluído de 1:2000 em PBS/BSA a cada poço e incubou-se durante 1 hora. O 35 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ substrato da enzima NBT/BCIP foi preparado fresco de acordo com as instruções dos fabricantes (Gibco, código 18280-016), adicionaram-se 75 μΐ a cada poço e incubou-se durante 5-10 min. A reacção foi terminada mediante lavagem com água corrente após o surgimento de "spots" violeta escuro. Os "spots" foram depois contados utilizando o sistema Alphalmager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA), e a frequência de CTL específicos para o péptido pôde ser calculada como o número de células que formam "spots". É preferido que o ensaio ELISPOT seja efectuado utilizando PBL derivados de um indivíduo que não foi previamente imunizado com ML-IAP ou com um seu fragmento. Mais preferencialmente, o referido indivíduo não foi sujeito a nenhum tipo de imunoterapia contra uma doença neoplásica. Assim, é por exemplo preferido que o indivíduo não tenha sido previamente imunizado com células tumorais. Os PBL de indivíduos que foram sujeitos a imunoterapia, em particular a imunoterapia compreendendo ML-IAP, poderão fornecer um resultado positivo contra um dado péptido num ensaio ELISPOT, apesar de os PBL de uma pessoa imunologicamente virgem não terem dado um resultado positivo.
Ainda noutra concretização descrita no pedido, os fragmentos de ML-IAP preferidos são fragmentos capazes de activar o crescimento de células T in vitro. Em particular, os fragmentos de ML-IAP preferidos induzem a expansão de CTL específicos para antigénios, utilizando células dendríticas (DC) carregadas com os referidos fragmentos. Um método de expansão de CTL específicos para antigénios está descrito abaixo. Por conseguinte, os fragmentos de ML-IAP muito preferidos incluem os fragmentos em que mais de 105 CTL específicos para antigénios, mais preferencialmente 106, ainda mais preferencialmente 107 CTL específicos para antigénios podem ser recolhidos após 4 ciclos de estimulação, partindo de 104 PBMC como descrito abaixo.
Expansão de CTL específicos para antigénio utilizando DC carregadas com antigénio A geração de células dendríticas (DC) foi efectuada da forma descrita40. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram plaqueadas em placas de 85 mm (placas 36 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ bacteriológicas, Primaria ou de cultura de tecidos, Falcon, N.° de catálogo 1005, 3038 ou 3003; Becton Dickinson, Hershey, EUA), a uma densidade de 50xl06 células por placa, em 10 ml de meio de cultura completo e incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 1 h. Após um controlo microscópio da aderência, a fracção não aderente foi removida e adicionaram-se 10 ml de meio completo novo aquecido (RPMI 1640 (Prod. N.° 12-167, Bio Whittaker, Walkersville, EUA) suplementado com gentamicina (Refobacin 10, Merck, Darmstadt, Alemanha) a uma concentração final de 20 pg/ml, glutamina a uma concentração final de 2 mM (Prod. N.° 17-605, Bio Whittaker) e plasma humano inactivado pelo calor (56° durante 30 min) a 1% (dia 0). As fracções não aderentes foram centrifugadas e plaqueadas mais uma vez em placas de cultura de tecidos de 85 mm novas para readerência. A fracção não aderente destas placas de replaqueamento foi eliminada após lh de aderência. Todas as fracções aderentes foram cultivadas até ao dia 1, depois o meio de cultura foi removido cuidadosamente para não remover as células fracamente aderentes e adicionou-se novo meio de cultura contendo GM-CSF (concentração final de 800 U/ml) e IL-4 (concentração final de 1000 U/ml). As citocinas foram novamente adicionadas no dia 3 em 3 ml de meio fresco (contendo 8000 U de GM-CSF e 10 000 U de IL-4) por placa. No dia 5, todas as células não aderentes foram colhidas, contadas e replaqueadas em meio completo fresco (contendo as citocinas na mesma dose descrita acima) em placas de 6 poços, a uma densidade de 5xl05 células/poço em 3 ml de meio. No dia 6, adicionaram-se 750 μΐ de meio condicionado de monócitos (MCM) para induzir a maturação das DC, e no dia 7 ou 8 colheram-se as células.
Todas as preparações de DC estavam grandemente enriquecidas em DC maduras, com >90% apresentando um fenótipo caracteristico por citometria de fluxo (HLA-DR+++, CD86+++, CD40+, CD25+, CD14-). Mais de 80% das células expressavam o antigénio CD83 como marcador das DC maduras. O MCM foi preparado da seguinte forma: prepararam-se placas bacteriológicas (85 mm, Falcon 1005) revestidas com Ig imediatamente antes da utilização. Como imunoglobulina, utilizou-se Sandoglobm' (Novartis). O revestimento foi efectuado com 10 ml de imunoglobulina (10 pg/ml) diluida (com 37 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ PBS sem cálcio ou magnésio, Bio Whittaker) durante 10 min à temperatura ambiente. Após o procedimento de revestimento, as placas foram lavadas duas vezes com PBS sem cálcio nem magnésio (Bio Whittaker). Plaquearam-se 50xl06 PBMC nestas placas em meio completo sem citocinas e incubou-se a 37°C e 5% de C02 durante 20 h. Em seguida, o meio condicionado de monócitos foi colhido, centrifugado a 1.360 g durante 10 min (22°C), filtrado em condições estéreis (filtros de 0,22 pm; Millipore, Molsheim, França) e congelado em aliquotas a -20 °C. 5xl0b células DC/poço foram sujeitas a "peptide pulsing" com péptido restrito a moléculas HLA a uma concentração de 50 pg/ml, por exemplo um fragmento de ML-IAP, durante 2 h a 37°C. Cerca de 104 PBMC/poço e 5 χ 103 DC autólogas carregadas com antigénio/poço foram co-cultivadas em placas de fundo redondo de 96 poços, em 200 μΐ de meio MCM/poço suplementado com plasma autólogo a 5%. No dia 7, as PBMC foram reestimuladas com DC carregadas com antigénio. Após um total de 4 a 5 ciclos de estimulação, a cultura celular foi enriquecida em linfócitos T CD8+ a partir das PBMC por eliminação das células CD4+, CDllb+, CD16 + , CD19 + , CD36+ e CD56+ via separação magnética de células, utilizando um dispositivo midiMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha). A população resultante consistiu em >90% de células T CD8+.
Para a expansão de CTL específicos, como os CTL específicos para tumores, as células T enriquecidas em CD8 foram transferidas para frascos de 25 cm2 revestidos com os anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD28 como previamente descrito41. Resumidamente, os frascos de 25 cm2 (Falcon, Heidelberg, Alemanha) foram revestidos com anticorpo monoclonal anti-CD3 humano (OKT3, Ortho Pharmaceutical Corp., Raritan, NJ) e anticorpo monoclonal anti-CD28 humano (L293, Becton Dickinson) a uma concentração de 1 pg/ml em PBS/tampão HEPES 100 mM (pH 9). Após incubação durante a noite a 4°C, os frascos revestidos foram lavados duas vezes com PBS. As células T CD8+ foram colocadas nos frascos pré-revestidos e lavados, a uma densidade de 5 χ 105 células/ml em 10 ml de meio MCM suplementado com soro AB humano a 10% (PAA Laboratories GmbH, Coelbe, Alemanha) e 100 UI IL-2/ml 38
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT (EuroCetus, Amsterdam, Países Baixos). As células foram reestimuladas com os anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD28 uma vez por semana, e o meio de cultura e a IL-2 (100 Ul/ml) foram mudados duas vezes por semana. Parte dos CTL ricos em CD8 foram expandidos por meio de reestimulação semanal com PBL ou DC carregadas com antigénio.
Em algumas concretizações descritas no pedido, os fragmentos de ML-IAP preferidos são fragmentos que podem ser apresentados por uma molécula MHC especifica. Assim, os fragmentos de ML-IAP muito preferidos poderão ser fragmentos capazes de provocar uma resposta de células T específicas, num indivíduo com um tipo de tecido especifico. As moléculas MHC preferidas de acordo com o invento estão indicadas abaixo.
Em particular, os péptidos indicados abaixo são péptidos preferidos para utilização num indivíduo com o tipo de tecido especificado: HLA-A1 MLIAP85 G s E E L R L A S (SEQ ID N. 0 86) MLIAP50 H V D G Q I L G Q (SEQ ID N. O 51) MLIAP120 D K V R c F F C Y (SEQ ID N. o 121) MLIAP213 A Q E P G G V S P (SEQ ID N. 0 213) MLIAP230 V L E P P G A R D (SEQ ID N. 0 230) MLIAP86 S E E L R L A S F Y (SEQ ID N. 0 303) MLIAP166 V Q E T H S Q L L G (SEQ ID N. o 304) MLIAP100 T A E V P P E L L A (SEQ ID N. o 305) MLIAP119 Q D K V R C F F C Y (SEQ ID N. 0 306) HLA-A3 MLIAP245 R L Q E E R T C K (SEQ ID N. O 245) MLIAP218 G V S P A E A Q R (SEQ ID N. O 218) MLIAP288 P V R S R V R T F (SEQ ID N. O 288) MLIAP106 E L L A A A G F F (SEQ ID N. 0 107) MLIAP242 Q L R R L Q E E R (SEQ ID N. 0 242) MLIAP253 K V C L D R A V S (SEQ ID N. 0 253) 39 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ MLIAP253 K V C L D R A V S I (SEQ ID N. O 307) MLIAP244 R R L Q E E R T C K (SEQ ID N. O 308) MLIAP153 F L L R S K G R D F (SEQ ID N. O 309) MLIAP106 E L L A A A G F F H (SEQ ID N. O 310) MLIAP255 C L D R A V S I V F (SEQ ID N. 0 311) MLIAP55 I L G Q L R P L T E (SEQ ID N. O 312) MLIAP126 F C Y G G L Q S W K (SEQ ID N. O 313) HLA-A24 MLIAP80 A F P G M G S E E L (SEQ ID N. O 314) MLIAP14 7 W F P S C Q F L L (SEQ ID N. O 147) HLA-B7/HLA- B35 MLIAP193 V P A S G Y P E L (SEQ ID N. O 193) MLIAP81 F P G M G s E E L (SEQ ID N. O 82) MLIAP2 G P K D S A K C L (SEQ ID N. o 3) MLIAP31 G P R S L G S P V (SEQ ID N. o 32) MLIAP276 A P G L Q L c P I (SEQ ID N. o 276) MLIAP31 G P R S L G s P V L (SEQ ID N. 0 315) MLIAP19 0 A P S V P A s G Y (SEQ ID N. 0 190) HLA-B27 MLIAP32 P R S L G S P V L (SEQ ID N. 0 33) MLIAP236 A R D V E A Q L R (SEQ ID N. 0 236) MLIAP289 V R S R V R T F L (SEQ ID N. 0 289) MLIAP23 7 R D V E A Q L R R (SEQ ID N. 0 237) MLIAP76 S R G P A F P G M (SEQ ID N. 0 77) MLIAP122 V R C F F C Y G G L (SEQ ID N. 0 316) MLIAP244 R R L Q E E R T C K (SEQ ID N. 0 317) MLIAP249 E R T c K V C L D R (SEQ ID N. 0 318) Um péptido (SEQ ID N.0 245 muito ) · preferido é MLIAP245 R L Q E : E R T c Noutra concretização descrita no pedido, OS fragment preferidos de ML-IAP sao fragmentos que poderão produzir uma resposta de células T especificas sem conduzir à produção de 40 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ anticorpos. Os epitopos conducentes apenas a uma resposta de células T, mas não a uma resposta de IgG, foram descritos na /· , o q p n técnica anterior ' Métodos de identificação de fragmentos
Num aspecto, o presente pedido refere-se também a métodos de selecção de um péptido compreendendo um fragmento de ML-IAP para utilização numa composição de vacina, compreendendo as etapas de: i) disponibilização de um indivíduo que não tenha sido sujeito a imunoterapia
ii) disponibilização de fragmentos de ML-IAP iii) teste das respostas de células T específicas contra os fragmentos de ML-IAP no referido indivíduo iv) selecção dos fragmentos de ML-IAP em que a referida resposta de células T corresponde a, ou é melhor que, um critério de selecção predeterminado. A resposta de células T poderá ser testada de acordo com qualquer método adequado. É, no entanto, preferido que o teste da referida resposta de células T compreenda um ensaio ELISPOT. 0 ensaio ELISPOT é, de preferência, o ensaio descrito acima.
Preferencialmente, são seleccionados os fragmentos que dão origem a mais de 50 "spots" específicos para o péptido por 106 células num ensaio ELISPOT, preferencialmente o ensaio ELISPOT descrito acima.
Composições de vacinas e suas utilizações O presente pedido descreve, numa concretização, uma composição imunogénica, tal como uma composição de vacina, capaz de produzir, por exemplo, uma resposta de células T específicas. A composição de vacina compreende ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e/ou um ou mais dos seus fragmentos. De preferência, as composições de vacinas compreendem ML-IAP isolado e/ou um ou mais dos seus fragmentos isolados. O termo "péptido ML-IAP", tal como aqui utilizado, refere-se a ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e seus fragmentos conforme aqui descritos noutra 41 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ secção. Qualquer um dos fragmentos de ML-IAP descritos acima poderá ser incluído na referida vacina, em particular os fragmentos de ML-IAP preferidos descritos acima poderão ser incluídos numa vacina.
Assim, as composições de vacinas descritas no pedido poderão compreender mais de um fragmento de ML-IAP diferente, por exemplo 2, por exemplo 3, por exemplo 4, por exemplo 5, por exemplo 6, por exemplo 7, por exemplo 8, por exemplo 9, por exemplo 10, por exemplo um número de fragmentos no intervalo compreendido entre 5 e 10, por exemplo no intervalo compreendido entre 10 e 15, por exemplo no intervalo compreendido entre 15 e O CM por exemplo no intervalo compreendido entre 20 e 30, por exemplo no intervalo compreendido entre 30 e 40, por exemplo no intervalo compreendido entre 40 e 60, por exemplo no intervalo compreendido entre 60 e 100, por exemplo no intervalo compreendido entre : 100 e 200 fragmentos de ML- IAP diferentes. A composição de vacina poderá compreender pelo menos 1, mais preferencialmente pelo menos 2, ainda mais preferencialmente pelo menos 3, mais preferencialmente ainda pelo menos 4, por exemplo pelo menos 5, por exemplo pelo menos 6, por exemplo 7 fragmentos de ML-IAP diferentes, cada um deles capaz de se associar a uma molécula HLA diferente seleccionada entre o grupo constituído por HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B27 e HLA-B44.
Numa concretização descrita no pedido, os fragmentos de ML-IAP diferentes são seleccionados de modo que uma composição de vacina compreenda fragmentos capazes de se associar a moléculas MHC diferentes, por exemplo moléculas MHC de classe I diferentes, isto é, os fragmentos de ML-IAP são restritos a moléculas HLA específicas. Preferencialmente, uma composição de vacina compreende fragmentos capazes de se associar às moléculas MHC de classe I mais frequentes. As moléculas MHC de classe I preferidas estão aqui indicadas noutro local. Por este motivo, as composições de vacinas preferidas compreendem fragmentos diferentes capazes de se associar a pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3, ainda mais preferencialmente pelo menos 4 moléculas MHC de classe I preferidas. 42 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Noutra concretização descrita no pedido, a composição de vacina compreende um ou mais fragmentos capazes de se associar a uma molécula MHC de classe I e um ou mais fragmentos capazes de se associar a uma molécula MHC de classe II. As preparações de vacinas peptidicas que podem ser utilizadas de acordo com o presente invento poderão, assim, compreender um péptido ML-IAP restrito à classe I e/ou um péptido ML-IAP restrito à classe II e/ou péptidos de fusão compreendendo ambos os péptidos. Por esse motivo, uma composição de vacina deste tipo é preferencialmente capaz de produzir uma resposta de células T citotóxicas especificas e/ou uma resposta de células T auxiliares especificas. A composição de vacina pode compreender adicionalmente um adjuvante e/ou um transportador. Os exemplos de adjuvantes e transportadores úteis estão apresentados abaixo. Assim, o ML-IAP, ou o seu fragmento, presente na composição pode estar associado a um transportador como uma proteína ou uma célula apresentadora de antigénio, por exemplo, uma célula dendrítica (DC) capaz de apresentar o péptido ML-IAP ou um seu fragmento a uma célula T.
Os adjuvantes são qualquer substância cuja mistura na composição de vacina aumenta ou modifica de outra forma a resposta imunitária a ML-IAP ou um seu fragmento. Os transportadores são elementos estruturais, por exemplo um polipéptido ou um polissacarídeo, aos quais o ML-IAP, ou o seu fragmento, é capaz de estar associado.
Os adjuvantes podem, por exemplo, ser seleccionados entre o grupo que consiste em: A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04), sílica, alúmen, A1(0H)3, Ca3(P04)2í caulino, carbono, hidróxido de alumínio, dipéptidos muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, também designado por nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoíl-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, também designado por MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) numa emulsão esqualeno/Tween 80.RTM. a 2%, lipopolissacáridos e os seus vários derivados, incluindo o lípido A, adjuvante completo de Freund (FCA), 43
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT adjuvante incompleto de Freund, adjuvante 65 da Merck, polinucleótidos (por exemplo, os ácidos poli(IC) e poli(AU)), cera D de Mycobacterium tuberculosis, substâncias encontradas em Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis e membros do género Brucella, lipossomas ou outras emulsões lipidicas, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN (ver Patente US 58767 e 5,554,372), derivados de lipido A, derivados da toxina colérica, derivados de HSP, derivados de LPS, GMDP ou matrizes de péptidos sintéticos, interleucina 1, interleucina 2, Montanide ISA-51 e QS-21. Os adjuvantes preferidos para uso no invento incluem Montanide ISA-51 e QS-21.
Montanide ISA-51 (Sepplc, Inc.) é um adjuvante à base de óleo mineral análogo ao adjuvante incompleto de Freund, que tem de ser administrado como uma emulsão. QS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) é uma saponina extremamente purificada e solúvel em água que se comporta como uma solução aquosa. Os adjuvantes QS-21 e Montanide ISA-51 podem ser disponibilizados em frascos estéreis de utilização única.
Os adjuvantes preferidos adicionais que podem ser utilizados em composições de vacinas compreendendo ML-IAP, e/ou um ou mais dos seus fragmentos, consistem, por exemplo, em qualquer substância que promova uma resposta imunitária. Frequentemente, o adjuvante de eleição é o adjuvante completo ou incompleto de Freund ou organismos B. pertussis mortos, utilizado em combinação, por exemplo, com antigénio precipitado por alúmen. Uma discussão geral sobre adjuvantes é fornecida em Goding, Monoclonal Antibodies: Principies & Practice (2nd edition, 1986) nas páginas 61-63. Goding ressalva, contudo, que quando o antigénio de interesse possui um peso molecular baixo ou é fracamente imunogénico, o acoplamento a um transportador imunogénico é recomendado. Os exemplos destas moléculas transportadoras incluem a hemocianina de lapa californiana, a albumina sérica de bovino, a ovalbumina e a imunoglobulina de galinha. A utilidade de vários extractos de saponinas como adjuvantes em composições imunogénicas foi também sugerida. Recentemente, foi proposta a utilização do factor estimulador de colónias 44 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), uma citocina bem conhecida, como adjuvante (WO 97/28816).
As funcionalidades desejáveis dos adjuvantes que podem ser utilizados de acordo com o presente invento estão indicadas na tabela abaixo.
Tabela 1. Modos de acçao do adjuvante
Acção Tipo de adjuvante Benefício 1.Imunomodulação Geralmente moléculas Regulação positiva da ou proteínas pequenas resposta imunitária. que modificam a rede de citocinas Selecção de Thl ou Th2 2.Apresentação Geralmente moléculas ou Resposta em anticorpos complexos anfipáticos neutralizantes que interagem com o acrescida. Maior duração imunogénio na sua conformação nativa da resposta 3.Indução de CTL • Partículas que podem Processamento citosólico ligar ou rodear o da proteína originando imunogénio e que péptidos restritos à podem perturbar ou fundir-se com as membranas celulares classe I correctos • Sem emulsões para Processo simples se ligação directa do péptido(s) promíscuo(s) péptido a moléculas MHC-1 da superfície celular for(em) conhecido(s) 4.Direccionamento • Adjuvantes particulados Utilização eficaz do que ligam o imunogénio. Adjuvantes que saturam células de Kupffer adjuvante e imunogénio • Adjuvantes do tipo Como acima. Também hidrato de carbono poderá determinar o que visam receptores tipo de resposta se de lectina em direccionamento for macrófagos e DC selectivo 5. Geração de • Sem emulsão para curto Eficiência depósitos prazo Microsferas ou Potencial para vacina de nanosferas para longo prazo dose única
Fonte: Cox, J.C. & Coulter, A.R. (1997). Vaccine 15, 248-56. 45
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Uma composição de vacina descrita no pedido poderá compreender mais de um adjuvante diferente. Além disso, o invento engloba uma composição terapêutica compreendendo qualquer substância adjuvante, incluindo qualquer uma das referidas acima ou suas combinações. Está também contemplado que o ML-IAP, ou um ou mais dos seus fragmentos, e o adjuvante podem ser administrados separadamente em qualquer sequência apropriada.
Um transportador poderá estar presente independentemente de um adjuvante. A função do transportador pode ser, por exemplo, aumentar o peso molecular de fragmentos de ML-IAP em particular, de modo a aumentar a sua actividade ou imunogenicidade, conferir estabilidade, aumentar a actividade biológica ou aumentar a semivida sérica. Além disso, um transportador poderá ajudar na apresentação de ML-IAP, ou dos seus fragmentos, às células T. 0 transportador poderá ser qualquer transportador adequado conhecido pelo perito, por exemplo, uma proteína ou uma célula apresentadora de antigénio. Uma proteína transportadora poderá ser, embora não esteja limitada a estes exemplos, a hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas como a transferrina, a albumina sérica de bovino, a albumina sérica humana, a tiroglobulina ou a ovalbumina, imunoglobulinas, hormonas como a insulina ou o ácido palmítico. Para a imunização de seres humanos, o transportador tem de ser um transportador fisiologicamente aceitável, aceitável para os seres humanos e seguro. Contudo, o toxóide tetânico e/ou o toxóide diftérico são transportadores adequados numa concretização do invento. Em alternativa, o transportador poderá consistir em dextranos, por exemplo Sepharose.
Numa concretização, a composição de vacina poderá compreender células dendríticas. As células dendríticas (DC) poderão ser preparadas e utilizadas num procedimento terapêutico de acordo com qualquer protocolo apropriado, por exemplo como descrito abaixo. 0 perito compreenderá que o protocolo pode ser adoptado para utilização em doentes com diferentes tipos de moléculas HLA e diferentes doenças. 0 péptido no procedimento descrito abaixo pode ser qualquer fragmento de ML-IAP, como sejam os fragmentos de ML-IAP aqui 46 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ descritos, em particular os fragmentos de ML-IAP preferidos aqui descritos.
Vacinas baseadas em DC e procedimentos terapêuticos utilizando DC
Doentes de cancro, por exemplo, doentes com melanoma metastático de estádio IV, com doença progressiva participaram num ensaio de vacinação à base de DC, por exemplo, depois de não terem respondido à quimioterapia. Todos os doentes forneceram consentimento informado para participar na vacinação experimental e para doar sangue para a monitorização imunológica. A tipagem HLA serológica revelou que os doentes eram HLA-A2. As células dendriticas (DC) foram submetidas a "peptide pulsing" com 50 pg/ml de péptido restrito a moléculas HLA durante lha 37°C, e 5 x 106 células foram administradas subcutaneamente nos dias 1 e 14, e subsequentemente a cada 4 semanas, com leucaferese adicional após 5 vacinações.
Todas as preparações de vacinas estavam grandemente enriquecidas em DC maduras, com > 90% apresentando um fenótipo caracteristico por citometria de fluxo (HLA-DR+++, CD86++ + , CCD40 + , CCD25 + , CD14-) . Mais de 80% das células expressavam o antigénio CD83 como marcador das DC maduras. O péptido utilizado no ensaio de vacinação foi sintetizado em condições de boas práticas de fabrico por Clinalfa (pureza >98%). A geração de DC para uso clinico e controlo de qualidade foi efectuada da forma descrita40. As PBMC foram plaqueadas em placas de 85 mm (placas bacteriológicas, Primaria ou de cultura de tecidos, Falcon, N.° de catálogo 1005, 3038 ou 3003; Becton Dickinson, Hershey, EUA), a uma densidade de 50χ106 células por placa, em 10 ml de meio de cultura completo e incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 1 h. Após um controlo microscópio da aderência, a fracção não aderente foi removida e adicionaram-se 10 ml de meio completo novo aquecido (RPMI 1640 (Prod. N.° 12-167, Bio Whittaker, Walkersville, EUA) suplementado com gentamicina (Refobacin 10, Merck, Darmstadt, Alemanha) a uma concentração 47 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ final de 20 yg/ml, glutamina a uma concentração final de 2 mM (Prod. N.° 17-605, Bio Whittaker) e plasma humano inactivado pelo calor (56° durante 30 min) a 1% (dia 0).
As fracções não aderentes foram centrifugadas e plaqueadas mais uma vez em placas de cultura de tecidos de 85 mm novas para readerência. A fracção não aderente destas placas de "replaqueamento" foi eliminada após lh de aderência. Todas as fracções aderentes foram cultivadas até ao dia 1, depois o meio de cultura foi removido cuidadosamente para não remover as células fracamente aderentes e adicionou-se meio de cultura novo contendo GM-CSF (concentração final de 800 U/ml) e IL-4 (concentração final de 1000 U/ml). As citocinas foram novamente adicionadas no dia 3 em 3 ml de meio fresco (contendo 8000 U de GM-CSF e 10 000 U de IL-4) por placa. No dia 5, todas as células não aderentes foram colhidas, contadas e replaqueadas em meio completo fresco (contendo as citocinas na mesma dose descrita acima) em placas de 6 poços, a uma densidade de 5xl05 células/poço em 3 ml de meio. No dia 6, adicionaram-se 750 μΐ de meio condicionado de monócitos (MCM) para induzir a maturação das DC e no dia 7 ou 8 colheram-se as células. O MCM foi preparado da seguinte forma: prepararam-se placas bacteriológicas (85 mm, Falcon 1005) revestidas com Ig imediatamente antes da utilização. Como imunoglobulina, utilizou-se Sandoglobin(TM) (Novartis) . O revestimento foi efectuado com 10 ml de imunoglobulina (10 yg/ml) diluída (com PBS sem cálcio ou magnésio, Bio Whittaker) durante 10 min à temperatura ambiente. Após o procedimento de revestimento, as placas foram lavadas duas vezes com PBS sem cálcio nem magnésio (Bio Whittaker) . Plaquearam-se 50xl06 PBMC nestas placas em meio completo sem citocinas e incubou-se a 37°C e 5% de C02 durante 20 h. Em seguida, o meio condicionado de monócitos foi colhido, centrifugado a 1.360 g durante 10 min (22°C), filtrado em condições estéreis (filtros de 0,22 ym; Millipore, Molsheim, França) e congelado em alíquotas a _20 oq 16,38,42
Vacinas peptídicas
As composições de vacinas poderão ser preparadas e administradas utilizando qualquer protocolo convencional 48 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ conhecido por um perito. Um exemplo não limitativo de preparação de uma composição de vacina de acordo com o invento é fornecido abaixo, bem como um exemplo não limitativo de administração dessa vacina. 0 perito compreenderá que o protocolo pode ser facilmente adaptado a qualquer uma das composições de vacinas aqui descritas.
Os péptidos ML-IAP podem, por exemplo, ser sintetizados, por exemplo, nas instalações da Biomolecular Core Facility da Universidade da Virgínia, com um grupo terminal amida NH2 livre e um grupo terminal ácido COOH livre. Cada um dos péptidos foi disponibilizado como um péptido liofilizado, que foi depois reconstituído em água estéril e diluído com solução de lactato de Ringer (LR, Baxter Healthcare, Deerfield, Ilinóis, EUA) como tampão, para uma concentração final de lactato de Ringer a 67-80% em água. Estas soluções foram depois filtradas em condições estéreis, colocadas em frascos de vidro borossilicato e submetidas a uma série de estudos de controlo de qualidade, incluindo confirmação da identidade, esterilidade, segurança geral e pureza, de acordo com as directrizes da Food and Drug Administration (FDA) , conforme definido em IND 6453. Os testes de estabilidade dos péptidos não demonstraram nenhuma diminuição da pureza ou da concentração do péptido quando estas soluções de péptidos foram armazenadas a -20°C durante 3 anos.
Em circunstâncias práticas, os doentes receberão uma vacina compreendendo cerca de 100 pg de um péptido ML-IAP restrito a moléculas HLA de classe I, com ou sem um péptido auxiliar ML-IAP restrito a moléculas HLA de classe II. Os doentes são vacinados com, por exemplo, apenas cerca de 100 pg do péptido restrito a moléculas HLA de classe I em adjuvante, ou são vacinados com, por exemplo, cerca de 100 pg do péptido restrito a moléculas HLA de classe I mais 190 pg do péptido auxiliar restrito a moléculas HLA de classe II. A dose superior do péptido auxiliar foi calculada para fornecer quantidades equimolares dos epitopos citotóxicos e auxiliares. Adicionalmente, os doentes podem ser vacinados com um péptido mais comprido compreendendo as sequências de aminoácidos de ambos os péptidos. 49
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Os péptidos acima, em 1 ml de solução aquosa, podem ser administrados quer como uma solução/suspensão com cerca de 100 pg de QS-21 quer como uma emulsão com cerca de 1 ml do adjuvante Montanide ISA-51.
Os doentes são imunizados, por exemplo, no dia 0 e nos meses 1, 2, 3, 6, 9 e 12 com os péptidos mais o adjuvante, num total de sete imunizações. Com raras excepções, as vacinações são administradas no mesmo braço para cada vacina. Os péptidos foram administrados por via subcutânea.43,44
Moléculas MHC
Numa concretização descrita no pedido, os fragmentos de ML-IAP preferidos são fragmentos capazes de se associar a uma molécula MHC. Como moléculas MHC diferentes possuem afinidades diferentes para um dado péptido, fragmentos de ML-IAP diferentes poderão ser preferidos em diferentes concretizações do invento. O invento refere-se também a composições compreendendo fragmentos de ML-IAP diferentes que têm preferencialmente afinidade para moléculas MHC diferentes.
As moléculas MHC preferidas de acordo com o presente invento são moléculas MHC de classe I e moléculas MHC de classe II, mais preferencialmente moléculas MHC de classe I.
As moléculas MHC de classe I preferidas são as moléculas MHC de classe I mais frequentes. Numa concretização do presente invento, as moléculas MHC de classe I preferidas poderão ser seleccionadas entre o grupo constituído por HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B27 e HLA-B44.
As composições preferidas de acordo com o presente invento compreendem pelo menos 1, mais preferencialmente pelo menos 2, ainda mais preferencialmente pelo menos 3, mais preferencialmente ainda pelo menos 4, por exemplo pelo menos 5, por exemplo pelo menos 6, por exemplo 7 fragmentos de ML-IAP diferentes, cada um deles capaz de se associar a uma molécula HLA diferente seleccionada entre o grupo constituído por HLA-A2, HLA-Al, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B27 e HLA-B44. 50 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ A título exemplificativo, uma composição preferida poderá compreender um péptido ML-IAP capaz de se associar a uma molécula HLA-A2 e um péptido ML-IAP capaz de se associar a uma molécula HLA-A1 e um péptido ML-IAP capaz de se associar a uma molécula HLA-A3 e um péptido ML-IAP capaz de se associar a uma molécula HLA-A24.
Métodos ex vivo para obtenção e cultura de células T
Numa concretização, o pedido descreve um método para activar e expandir células T específicas para ML-IAP ou seus fragmentos, assim como as células T obtidas por estes métodos. Preferencialmente, os métodos referem-se a células T citotóxicas específicas para fragmentos de ML-IAP. Os métodos compreendem preferencialmente as etapas de co-cultura das células T com ML-IAP, ou pelo menos um seu fragmento, activando assim as células T, e opcionalmente o isolamento das células T específicas para ML-IAP activadas ou das células T específicas para um fragmento de ML-IAP activadas. A co-cultura de células T com ML-IAP ou seus fragmentos poderá ser efectuada por qualquer método convencional. Por exemplo, é possível utilizar métodos envolvendo células apresentadoras de antigénio, como sejam as células dendríticas (DC) . O método poderá pois compreender a geração e carga de células dendríticas (DC) derivadas de monócitos com fragmento(s) de ML-IAP e a co-cultura das referidas DC com monócitos de sangue periférico (PBMC) compreendendo células T ou células T purificadas a partir de PBMC. Opcionalmente, as células T específicas para ML-IAP poderão depois ser isoladas. Preferencialmente, as células T específicas para ML-IAP são células T citotóxicas.
Um método preferido para a geração e carga de DC derivadas de monócitos e para a co-cultura de DC com monócitos de sangue periférico (PBMC) está descrito acima na secção "Expansão de CTL específicos para antigénio utilizando DC carregadas com antigénio".
Contudo, diferentes tipos de células apresentadoras de antigénio (APC) poderão ser utilizados no invento. 51 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Num exemplo, é disponibilizado um método para imunização in vitro com células de Drosophila como APC. Desse modo, o método poderá compreender a geração de células de Drosphila melanogaster expressando uma ou mais moléculas HLA diferentes, a carga das referidas células de Drosophila melanogaster com fragmento(s) de ML-IAP e a co-cultura das referidas células de Drosphila com monócitos de sangue periférico (PBMC) compreendendo células T ou com células T purificadas a partir de PBMC. Desse modo, células T especificas para ML-IAP poderão ser geradas. Preferencialmente, as referidas células T são células T citotóxicas. Opcionalmente, as células T poderão ser subsequentemente isoladas. Uma vantagem da utilização de células de Drosophila melanogaster é o facto de elas serem não viáveis a 37°C.
As células de Drosophila melanogaster foram utilizadas como APC45,46 . Estas células são veículos eficientes para a apresentação de péptidos no contexto de moléculas HLA de classe I, especialmente para imunização de novo de CTL CD8+. A linha de células de Drosophila Schneider S2 (American Type Culture Collection CRL 10974, Rockville, MD) foi submetida a transdução com HLA-A2.1, CD80 (B7-1) e CD54 (molécula de adesão intracelular 1), utilizando um vector plasmídico pRmHa-3. As células de Drosophila foram crescidas em meio de Schneider (106 células/ml) contendo soro fetal bovino a 10% e CuS04 a 27°C, que é a temperatura óptima para estas células de insecto. As células foram colhidas, lavadas e ressuspensas em meio X-press (Bio Whittaker, Walkersville, MD) contendo 100 pg/ml do epítopo peptídico restrito a moléculas HLA.
As células T CD8+ foram obtidas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por selecção positiva com um novo anticorpo monoclonal (Acm) anti-CD8, capturado com uma esfera magnética acoplada a anticorpo de ovelha anti-ratinho (Dynal, Lake Success, Nova Iorque)47.
Após incubação a 27°C com o epitopo peptídico restrito a moléculas HLA durante 3 horas, as células de Drosophila foram incubadas com as células T CD8+ a 37°C, numa razão de 1:10, em meio RPMI 1640 contendo soro autólogo a 10%. Dois dias 52 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ mais tarde, adicionaram-se 20 UI de IL-2 e 30 UI de IL-7 ao meio de crescimento. Prosseguiu-se a incubação durante 1 semana, após o que as células de Drosophila foram substituídas por PBMC irradiadas autólogas (30 Gy) e pelo péptido restrito a moléculas HLA. Este passo foi repetido para um ciclo adicional de estimulação e, em seguida, as células T CD8+ foram testadas quanto a citotoxicidade por um ensaio de libertação de 51Cr durante 4 horas. A preparação final continha pelo menos 92% de células T CD8 + , com 4% ou menos de células CD16+ (killer naturais) e 4% ou menos de células T CD4+. O presente pedido refere-se também a métodos para o tratamento de uma condição clínica num indivíduo necessitado desse tratamento, compreendendo a (re)infusão de células T específicas para ML-IAP no. Além disso, o invento refere-se à utilização de células T específicas para ML-IAP na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma condição clínica, num indivíduo necessitado desse tratamento, e a medicamentos para o tratamento de uma condição clínica compreendendo células T específicas para ML-IAP como ingrediente activo.
Os métodos para (re)infusão de células T num indivíduo são conhecidos na técnica. Um exemplo de um método adequado está aqui descrito abaixo.
Ainda noutra concretização, é disponibilizado um método para obtenção de células T a partir de um indivíduo e reinfusão das células T após imunização ex vivo. A leucaferese foi efectuada para obter aproximadamente 1 x IO10 células mononucleares de sangue periférico (PBMC). Após três ciclos (3 semanas) de imunização in vitro, efectuaram-se testes micológicos e bacteriológicos formais para verificar a esterilidade antes de as células serem administradas. Não subsistiram células de Drosophila na preparação de CTL após o procedimento de imunização. As células de Drosophila são viáveis a 27°C, mas são não viáveis a 37°C. Adicionalmente, efectuaram-se dois ciclos de imunização com mudança do meio de cada vez, após a imunização inicial com as 53 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ células de mosca. Finalmente, utilizou-se a reacção em cadeia da polimerase para detectar a presença de ADN residual de Drosophila na preparação final de CTL antes da reinfusão. 0 ADN de Drosophila revelou-se uniformemente ausente por este método sensível.
Para infusão no doente, os CTL foram ressuspensos em 200 ml de solução salina a 0,9% contendo albumina sérica humana a 5%, numa bolsa de transferência (catálogo Baxter [McGaw Park, Ilinóis] N.° 4R-2014, saco de plástico para infusão de células sanguíneas), e foram administrados intravenosamente ao longo de um período de 1 hora, na unidade de transplante de células-tronco. Enfermeiros com experiência recolheram os sinais vitais de 15 em 15 minutos e monitorizaram os doentes quanto a sinais de toxicidade ou reacções de hipersensibilidade imediata.
Terapia de combinação 0 presente pedido descreve, além disso, composições farmacêuticas e kits de partes para utilização em terapia de combinação. 0 termo "terapia de combinação", como aqui utilizado, designa o tratamento de um indivíduo necessitado desse tratamento por mais de um método diferente. Assim, a terapia de combinação poderá, num aspecto, envolver a administração de uma composição farmacêutica ou de um kit de partes compreendendo uma composição de vacina como descrita acima e um medicamento anticanceroso. Os medicamentos anticancerosos poderão ser quaisquer uns dos medicamentos descritos abaixo, por exemplo, um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico.
Em particular, a terapia de combinação poderá envolver a administração a um indivíduo de um agente quimioterapêutico e/ou de um agente imunoterapêut ico em combinação com um ou mais elementos entre i) ML-IAP ou um seu fragmento, ii) uma célula apresentadora de antigénio apresentando ML-IAP e iii) uma célula T específica para o péptido ML-IAP activada. Contudo, a terapia de combinação também poderá envolver a radioterapia, a terapia génica e/ou a cirurgia. 54 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ A terapia de combinação poderá, assim, incluir a administração, simultânea ou sequencial por qualquer ordem, de por exemplo: i) ML-IAP e/ou seus fragmentos + pelo menos um quimioterapêutico agente ii) ML-IAP e/ou seus fragmentos + pelo menos um imunoterapêutico agente iii) Célula apresentadora de e/ou seus fragmentos quimioterapêutico antigénio + pelo apresentando menos um ML-IAP agente iv) Célula apresentadora de e/ou seus fragmentos imunoterapêutico antigénio + pelo apresentando menos um ML-IAP agente v) Células T activadas quimioterapêutico + pelo menos um agente Vi) Células T activadas imunoterapêutico + pelo menos um agente e vi ii) Combinações adicionais incluem i) e ); i) e iii); i) e iv) , i) e v) ; i) e iv); ii) e v); ii) e vi); iii) e vi ii); iii) e e vi); ii) ) ; iii) e vi) iv) ; v) e iii); ; iv) e v) ; iv) e vi); i) e iv) e qualquer um de v) e vi) . 0 agente quimioterapêutico pode ser, por exemplo, metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitrosoureias não contendo açúcares, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina, carmustina e poliferposano, MM1270, BAY 12-9566, inibidor da farnesil-transferase RAS, inibidor da farnesil-transferase, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, Cl-994, TNP-470, Hycamtin/topotecano, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/mitoxantrona, Metaret/suramina, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/valrubicina, Metastron/derivado de estrôncio, Temodal/temozolomida, Evacet/doxorrubicina lipossómica, Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeloda/ 55 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ capecitabina, Furtulon/doxifluridina, Cydopax/paclitaxel oral, taxóide oral, SPU-077/cisplatina, HMR 1275/ flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inibidor do oncogene RAS, BMS-182751/platina oral, UFT (Tegafur/uracilo), Ergamisol/levamisol, Eniluracilo/776C85/intensificador de 5FU, Campto/levamisol, Camptosar/irinotecano, Tumodex/ Raltitrexed, Leustatin/cladribina, Paxex/paclitaxel, Doxil/ doxorrubicina lipossómica, Caelyx/doxorrubicina lipossómica, Fludara/fludarabina, Pharmarubicin/epirrubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/bis-naftalimida, LU 103793/dolastain, Caetyx/doxorrubicina lipossómica, Gemzar/gemcitabina, ZD0473/ Anormed, YM 116, sementes de iodo, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP, D4809/dexifosamide, Ifes/Mesnex/ ifosfamida, Vumon/teniposido, Paraplatin/carboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepeside/etoposido, ZD 9331, Taxotere/docetaxel, profármaco da guanina-arabinósido, análogo de taxano, nitrosoureias, agentes de alquilação como melfalano e ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginase, bussulfano, carboplatina, clorambucilo, citarabina HC1, dactinomicina, daunorrubicina HC1, fosfato sódico de estramustina; etoposido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiureia (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferão alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo do factor de libertação LHRH), lomustina (CCNU), mecloretamina HC1 (mostarda de azoto), mercaptopurina, mesna, mitotano (ο,ρ'-DDD), mitoxantrona HC1, octreotido, plicamicina, procarbazina HC1, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina, eritropoietina, hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona (metil-GAG; metilglioxal-bis(guanilhidrazona) , MGBG), pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), teniposido (VM-26) e sulfato de vindesina. Além disso, o agente quimioterapêutico poderá ser qualquer um dos agentes quimioterapêuticos mencionados na Tabela 3 da Patente US 6,482,843, colunas 13 a 18. 0 agente imunoterapêutico pode ser, por exemplo, Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART MI 95, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, I0R-T6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, 56 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gllomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf/r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, anticorpo ANA, anticorpo SMART 1D10, anticorpo SMART ABL 364 e ImmuRAIT-CEA. Além disso, o agente imunoterapêutico poderá ser qualquer citocina ou interferão.
As composições terapêuticas ou composições de vacinas do invento também podem ser utilizadas em combinação com outras estratégias anticancro, e estas terapias de combinação são eficazes na inibição e/ou eliminação do crescimento e metástase do tumor. Os métodos do presente invento podem ser vantajosamente utilizados com outras modalidades de tratamento, incluindo, sem limitações, a radiação, a cirurgia, a terapia génica e a quimioterapia. A "terapia de combinação" pode incluir a introdução de ácidos nucleicos heterólogos em células adequadas, um processo geralmente conhecido por terapia génica. Por exemplo, a terapia génica poderá envolver a introdução de genes supressores de tumores ou de genes promotores da apoptose em células tumorais. Em alternativa, sequências de ácidos nucleicos que inibem a expressão de oncogenes ou de genes que inibem a apoptose poderão ser introduzidos nas células tumorais. Além disso, genes que codificam enzimas capazes de conferir às células tumorais sensibilidade a agentes quimioterapêuticos poderão ser introduzidos. Por conseguinte, numa concretização, o presente invento fornece um método compreendendo a etapa de tratamento do cancro por introdução de um vector génico que codifica uma proteína capaz de converter enzimaticamente um profármaco, isto é, um composto não tóxico, num composto tóxico. No método descrito no pedido, a sequência de ácido nucleico terapêutica é um ácido nucleico que codifica um produto, em que o produto causa morte celular por si ou na presença de outros fármacos. Um exemplo representativo de um ácido nucleico terapêutico deste tipo é um ácido nucleico que codifica a timidina-cinase do vírus Herpes simplex. Exemplos adicionais incluem a timidina-cinase do vírus Varicella zoster e o gene bacteriano da citosina-desaminase, que pode converter a 5-fluorocitosina no composto 5-fluorouracilo extremamente tóxico. 57 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Indicações clínicas que podem ser tratadas com o presente invento
As composições de vacinas ou as composições terapêuticas/farmacêuticas aqui descritas poderão ser utilizadas para tratar várias condições clínicas diferentes. Além disso, o presente pedido descreve métodos de tratamento das referidas condições clínicas num indivíduo necessitado de tratamento, métodos de diagnóstico das referidas condições clínicas e a utilização de ML-IAP ou seus fragmentos para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma condição clínica num indivíduo necessitado de tratamento, assim como medicamentos para o tratamento de uma condição clínica compreendendo ML-IAP ou seus fragmentos como ingrediente activo.
Numa concretização preferida descrita no pedido, a condição clínica é um cancro. 0 termo "cancro", como aqui utilizado, pretende englobar qualquer cancro, doença neoplásica e doença pré-neoplásica. 0 referido cancro poderá ser seleccionado, por exemplo, entre o grupo constituído pelo carcinoma do cólon, cancro da mama, cancro pancreático, cancro dos ovários, cancro da próstata, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, sarcoma endotelial, linfangiossarcoma, linfangioendotelioma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma das vias biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro cervical, cancro do testículo, carcinoma do pulmão, carcinoma do pulmão de pequenas células, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioblastomas, neurinomas, craniofaringiomas, schwannomas, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma do acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias e linfomas, leucemia linfocítica aguda e leucemia 58
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT mielóide aguda, policetimia vera, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença das cadeias pesadas, leucemias não-linfociticas agudas, leucemia linfocitica crónica, leucemia mielógena crónica, doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin, cancro do recto, cancros urinários, cancros uterinos, cancros orais, cancros da pele, cancro do estômago, tumores cerebrais, cancro do fígado, cancro da laringe, cancro do esófago, tumores mamários, leucemia linfóide aguda (LLA) infantil, LLA-timo, LLA de células B, leucemia mielóide aguda, leucemia mielomonocítica, leucemia megacariocítica aguda, linfoma de Burkitt, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, leucemia de células T, carcinoma do pulmão de pequenas células, grandes células, não-pequenas células, leucemia granulocítica aguda, tumores de células germinativas, cancro do endométrio, cancro gástrico, cancro da cabeça e do pescoço, leucemia linfóide crónica, leucemia de células pilosas e cancro da tiróide.
Em concretizações preferidas descritas no pedido, a condição clínica é um tipo de cancro que expressa com frequência ML-IAP ou um tipo de cancro em que as linhas celulares derivadas do referido tipo de cancro expressam com frequência ML-IAP. Por exemplo, as linhas celulares derivadas de melanomas malignos expressam com frequência ML-IAP14'26, enquanto as linhas celulares derivadas do cancro da mama muitas vezes não expressam ML-IAP26. É, contudo, muito preferido que a condição clínica seja um cancro que expressa ML-IAP. Numa concretização preferida, a condição clínica é um melanoma maligno.
Noutra concretização descrita no pedido, a condição clínica é uma doença auto-imune.
As doenças auto-imunes poderão ser livremente agrupadas naquelas essencialmente restringidas a órgãos ou tecidos específicos e aquelas que afectam o corpo inteiro. Os exemplos de perturbações específicas de órgãos (com o órgão afectado) incluem a esclerose múltipla (revestimento de mielina nos processos nervosos), diabetes mellitus de tipo I (pâncreas), tiroidite de Hashimoto (glândula tiróide), anemia perniciosa (estômago), doença de Addison (glândulas supra-renais), miastenia grave (receptores de acetilcolina na 59 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ junção neuromuscular), artrite reumatóide (revestimento das articulações), uveite (olho), psoríase (pele), sindrome de Guillain-Barré (células nervosas) e a doença de Graves (tiróide). As doenças auto-imunes sistémicas incluem o lúpus eritematoso sistémico e a dermatomiosite.
Outros exemplos de perturbações de hipersensibilidade incluem a asma, eczema, dermatite atópica, dermatite de contacto, outras dermatites eczematosas, dermatite seborreica, rinite, líquen plano, pênfigo, penfigóide bolhoso, epidermólise bolhosa, urticária, angioedemas, vasculites, eritemas, eosinofilias cutâneas, alopecia areata, aterosclerose, cirrose biliar primária e sindrome nefrótico. As doenças relacionadas incluem as inflamações intestinais, como a doença celíaca, a proctite, a gastroenterite eosinofílica, a mastocitose, a doença inflamatória do intestino, a doença de Crohn e a colite ulcerosa, assim como alergias relacionadas com alimentos. 0 indivíduo necessitado de tratamento poderá ser qualquer indivíduo, preferencialmente um ser humano. Os péptidos terão, em geral, afinidades diferentes para moléculas HLA diferentes. Por esse motivo, nas concretizações do presente invento em que a composição de vacina ou a composição farmacêutica compreende péptidos ML-IAP, é preferido que uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica que seja administrada a um dado indivíduo compreenda pelo menos um péptido capaz de se associar a moléculas HLA desse indivíduo particular.
Os métodos de acordo com o presente invento permitem a vacinação mesmo de indivíduos imunologicamente virgens, porque as composições de vacinas de acordo com o invento compreendem preferencialmente fragmentos de ML-IAP imunologicamente dominantes. Assim, numa concretização do presente invento, o indivíduo necessitado de tratamento não foi previamente submetido a imunoterapia contra uma doença neoplásica. Em particular, é preferido que o indivíduo não tenha sido previamente submetido a uma imunoterapia que incluísse a imunização com um componente compreendendo ML-IAP ou um seu fragmento. Assim, por exemplo, é preferido que o 60 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ referido indivíduo nao tenha sido imunizado com uma célula tumoral expressando ML-IAP.
Composições farmacêuticas
Por conseguinte, em concretizações preferidas, o pedido descreve composições farmacêuticas que compreendem ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e/ou variantes ou fragmentos destas moléculas como definidas acima, para o tratamento de doenças patológicas relacionadas com ML-IAP ou mediadas por si.
As composições terapêuticas farmacêutica e/ou veterinariamente úteis de acordo com o invento podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos, tal como por mistura de um ou mais excipientes ou veículos farmacêutica ou veterinariamente aceitáveis. Exemplos destes excipientes, veículos e métodos de formulação poderão ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA). Para formar uma composição farmacêutica ou veterinariamente aceitável apropriada para uma administração eficaz, estas composições compreenderão uma quantidade eficaz de um polipéptido, ácido nucleico, anticorpo ou composto modulador.
As composições terapêuticas ou de diagnóstico descritas no pedido são administradas a um indivíduo (mamífero humano ou animal) ou utilizadas em quantidades suficientes para tratar ou diagnosticar doenças relacionadas com a apoptose. A quantidade eficaz poderá variar de acordo com uma série de factores como a condição, o peso, o sexo e a idade do indivíduo. Outros factores incluem o modo de administração. O termo derivado funcional inclui uma molécula que contém grupos químicos adicionais que não fazem normalmente parte da molécula de base. Tais grupos funcionais poderão melhorar a solubilidade, semivida, absorção, etc. da molécula de base. Em alternativa, os grupos funcionais poderão atenuar efeitos secundários indesejáveis da molécula de base ou diminuir a toxicidade da molécula de base. Exemplos destes grupos funcionais estão descritos numa variedade de manuais, tal como Remington's Pharmaceutical Sciences. 61 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
As composições farmacêuticas e veterinárias adequadas para utilização da forma descrita no pedido incluem composições em que os ingredientes activos estão presentes numa quantidade eficaz para obter o objectivo pretendido. A determinação de uma dose eficaz encontra-se dentro das competências dos peritos. A dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada quer em ensaios de cultura de células, por exemplo, de células neoplásicas, quer em modelos animais, geralmente ratinhos, coelhos, cães ou porcos. 0 modelo animal também é utilizado para determinar uma gama de concentrações e uma via de administração desejáveis. Estas informações podem depois ser utilizadas para determinar as doses e as vias de administração úteis nos seres humanos e outros animais. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se aquela quantidade de composto, péptido, anticorpo ou ácido nucleico que melhora ou previne uma condição apoptótica disfuncional. A posologia exacta é seleccionada pelo médico individual em função do doente a tratar.
Os compostos identificados de acordo com os métodos aqui descritos, assim como os anticorpos terapêuticos, os ácidos nucleicos terapêuticos e os péptidos aqui contemplados poderão ser utilizados isoladamente, em posologias apropriadas definidas por testes de rotina, de modo a obter uma modulação óptima da actividade de livina. Além disso, a co-administração ou a administração sequencial destes e de outros agentes poderá ser desejável.
As composições farmacêuticas ou veterinárias podem ser fornecidas ao indivíduo por uma variedade de vias, tais como a via subcutânea, tópica, oral e intramuscular. A administração de composições farmacêuticas é obtida oral ou parentericamente. Os métodos de entrega parentérica incluem a administração tópica, intra-arterial (directamente no tecido), intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal ou intranasal. 0 presente invento também tem como objectivo disponibilizar formulações farmacêuticas tópicas, orais, sistémicas e parentéricas adequadas para utilização nos novos métodos de tratamento do presente invento. As composições contendo compostos, que foram identificados de acordo com este invento como sendo o ingrediente activo destinado a utilização na 62
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT modulação de uma proteína que medeia a apoptose, podem ser administradas numa ampla variedade de formas farmacêuticas terapêuticas, em veículos convencionais para administração. Por exemplo, os compostos podem ser administrados em formas farmacêuticas orais tais como comprimidos, cápsulas (ambos incluindo formulações de libertação controlada e formulações de libertação prolongada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, soluções, suspensões, xaropes e emulsões, ou por injecção. De modo idêntico, também podem ser administrados na forma intravenosa (bolus e infusão), intraperitoneal, subcutânea, tópica com ou sem oclusão ou intramuscular, em que todas elas utilizam formas bem conhecidas pelos peritos na técnica farmacêutica. Uma quantidade eficaz, embora não tóxica, do composto, ácido nucleico ou péptido pretendido pode ser empregue como um agente modulador da apoptose. A posologia diária dos produtos poderá variar ao longo de um intervalo amplo compreendido entre 0,001 e 1.000 mg por ser humano adulto/por dia. Para administração oral, as composições são preferencialmente disponibilizadas na forma de comprimidos divisíveis ou não divisíveis contendo 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 25,0 e 50,0 miligrama do ingrediente activo para o ajuste sintomático da posologia ao doente a tratar. Uma quantidade eficaz do fármaco é normalmente administrada num nível de dose compreendido entre cerca de 0,0001 mg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia. O intervalo é mais particularmente de cerca de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal por dia. Ainda mais particularmente, o intervalo varia entre cerca de 0,05 e cerca de 1 mg/kg.
Evidentemente, o nível de dose variará dependendo da potência do composto particular. Determinados compostos serão mais potentes do que outros. Além disso, o nível de dose variará consoante a biodisponibilidade do composto. Quanto mais biodisponível e potente for o composto, menor será a quantidade de composto que é necessário administrar através de qualquer via de entrega, incluindo, embora não limitada a, entrega oral.
As posologias dos moduladores da livina são ajustadas quando estes são combinados para obter os efeitos 63 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ pretendidos. Por outro lado, as posologias destes vários agentes poderão ser independentemente optimizadas e combinadas para obter um resultado sinérgico, em que a patologia é reduzida em maior extensão do que seria se qualquer um dos agentes fosse utilizado isoladamente. Os peritos utilizarão formulações para os nucleótidos diferentes das formulações para as proteínas ou os seus inibidores.
Terapias de combinação compreendendo a etapa de administração das composições de vacinas de acordo com o invento, em combinação com um agente quimioterapêutico e/ou um agente imunoterapêutico e/ou uma vacina contra o cancro, são também disponibilizadas.
Variantes e equivalentes funcionais de ML-IAP 0 presente pedido descreve também variantes e equivalentes funcionais dos fragmentos de ML-IAP indicados acima. A afinidade das várias moléculas HLA para um dado péptido depende da sequência do referido péptido. Na Tabela 2 abaixo, os aminoácidos presentes numa dada posição num péptido, que resultam na afinidade mais elevada do referido péptido para uma dada molécula HLA, estão descritos.
Assim, as variantes preferidas dos péptidos ML-IAP com afinidade elevada para uma molécula HLA particular estão indicadas abaixo, com uma indicação da posição em que preferencialmente ocorreu uma substituição para cada um dos fragmentos indicados acima. 0 resíduo de aminoácido preferido na respectiva posição da variante está indicado na tabela.
Por conseguinte, a título exemplificativo, uma variante preferida do péptido ML-IAP capaz de se ligar a HLA-B54 possui uma prolina na segunda posição. 64
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
Tabela 2. Motivos de resíduos âncora principais utilizados
Alelo Posição Posição Posição Posição Posição Posição c- de HLA 1 2 3 5 6 7 terminal HLA-A1 T, S D, E L Y HLA-A2 L, M V L, V HLA-A3 L, V, M F,Y K,Y,F HLA-AI1 V, I, F, Y m,l,f,y, I K, R HLA-A23 I,Y W, I HLA-A24 Y I,V F I,L,F HLA-A25 Μ, A, T I W HLA-A26 E, D V,T,I,L,F I,L,V Y,F HLA-A28 E, D V, A, L A, R HLA-A29 E Y,L HLA-A30 Y,L,F,V Y HLA-A31 L,M,F,Y, R HLA-A32 I,L W HLA-A33 Y,I,L,V R HLA-A34 V, L R HLA-A66 E, D T, V R, K HLA-A68 E, D T, V R, K HLA-A69 V,T,A V, L HLA-A74 T V, L HLA-B5 A,P F,Y I,L HLA-B7 P L,F HLA-B8 K K, R L HLA-B14 R, K L, V HLA-B15 Q,L,K,P, F, Y, W (B62 ) H,V,I,M, S, T HLA-B17 L, V HLA-B27 R Y,K,F,L NLA-B35 P I,L,M,Y HLA-B37 D, E I,L,M HLA-B38 H D, E F,L HLA-B39 R, H L,F HLA-B40 E F,I,V L, V, A, W, (B60,61) Μ, T, R 65 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Alelo de HLA POSiçãO 1 Posição 2 Posição 3 Posição 5 Posição 6 Posição 7 C- terminal HLA-B42 L, P Y,L HLA-B44 E F, Y, W HLA-B46 Μ, I,L,V Y, F HLA-B48 Q,K L HLA-B51 A, P, G F,Y,I, V HLA-B52 Q F,Y I,V HLA-B53 P W,F,L HLA-B54 P HLA-B55 P A, V HLA-B56 P A, V HLA-B57 A, T, S F, W, Y HLA-B58 A,T,S F, W, Y HLA-B67 P L HLA-B73 R P HLA-Cwl A, L L HLA-Cw2 A, L F, Y HLA-Cw3 A, L L, M HLA-Cw4 Y, P, F L, M,F,Y HLA-Cw6 L, I, V,Y HLA-Cw6 Y L,Y,F HLA-Cw8 Y L, I, HLA-Cwl6 A, L L, V
Os termos equivalentes funcionais e variantes são aqui utilizados como sinónimos. Tratando-se de polipéptidos, as variantes são determinadas com base no seu grau de identidade ou no seu grau de homologia com qualquer sequência predeterminada de sequências de aminoácidos consecutivos de um fragmento de ML-IAP, como, por exemplo, as SEQ ID N.° 2 -SEQ ID N. 0 290.
Deste modo, inicialmente, define-se uma sequência de resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP e, em seguida, definem-se as variantes e os equivalentes funcionais em relação a ela. Por conseguinte, as variantes possuem de preferência pelo menos 75% de identidade de sequência, por 66 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
exemplo pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 85% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 90% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 91% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 92% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 93% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 94% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 95% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 96% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência, por exemplo 99% de identidade : de sequência com a sequência de resíduos de aminoácidos consecutivos de ML- -IAP predeterminada. A identidade de sequência é determinada, numa concretização, mediante utilização de fragmentos de péptidos compreendendo pelo menos 9 aminoácidos contíguos e possuindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, por exemplo 85%, por exemplo 90%, por exemplo 95%, por exemplo 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N.° 2 - SEQ ID N.° 290, respectivamente, em que a percentagem de identidade é determinada com o algoritmo GAP, BESTFIT ou FASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, versão 7.0, utilizando ponderações predefinidas para as lacunas.
Os termos seguintes são utilizados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleótidos: "sequência predeterminada", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência predeterminada" é uma sequência definida utilizada como base para uma comparação de sequências; uma sequência predeterminada poderá ser um subconjunto de uma sequência mais comprida. O alinhamento óptimo de sequências para alinhar uma janela de comparação poderá ser efectuado pelo algoritmo de Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 para alinhamento local; pelo algoritmo de Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 para alinhamento global; pelo 67 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ método de busca de similaridades de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444; por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin) ou por inspecção, e o melhor alinhamento (isto é, que resulta na percentagem de homologia mais elevada ao longo da janela de comparação) gerado pelos vários métodos é seleccionado. O termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de aminoácidos são idênticas ao longo da janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado mediante comparação de duas sequências alinhadas de forma óptima ao longo da janela de comparação, determinação do número de posições nas quais existem resíduos de aminoácidos idênticos em ambas as sequências para obter o número de posições correspondentes, divisão do número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicação do resultado por 100 para obter a percentagem de identidade de sequência.
Conforme aplicado aos polipéptidos, um grau de identidade das sequências de aminoácidos é uma função do número de aminoácidos idênticos em posições partilhadas pelas sequências de aminoácidos. Um grau de homologia ou de similaridade das sequências de aminoácidos é uma função do número de aminoácidos, isto é, estruturalmente relacionados, em posições partilhadas pelas sequências de aminoácidos. O termo "identidade substancial" significa que duas sequências de péptidos, quando estão alinhadas de forma óptima, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando ponderações predefinidas para as lacunas, partilham pelo menos 75% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 85% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 95% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência ou mesmo pelo menos 99% de identidade 68 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ de sequência, em comparação com uma sequência predeterminada ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 9 resíduos de aminoácidos, por exemplo 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo 11 resíduos de aminoácidos, por exemplo 12 resíduos de aminoácidos, por exemplo 13 resíduos de aminoácidos, por exemplo 14 resíduos de aminoácidos, por exemplo 15 resíduos de aminoácidos, por exemplo 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo 30 resíduos de aminoácidos, por exemplo 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo 50 resíduos de aminoácidos, por exemplo 60 resíduos de aminoácidos, por exemplo 70 resíduos de aminoácidos, por exemplo 80 resíduos de aminoácidos, por exemplo 90 resíduos de aminoácidos, por exemplo 100 resíduos de aminoácidos, por exemplo 110 resíduos de aminoácidos, por exemplo 120 resíduos de aminoácidos, por exemplo 130 resíduos de aminoácidos, por exemplo 140 resíduos de aminoácidos, por exemplo 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo 175 resíduos de aminoácidos, por exemplo 200 resíduos de aminoácidos, por exemplo 225 resíduos de aminoácidos, por exemplo 250 resíduos de aminoácidos, por exemplo 275 resíduos de aminoácidos, por exemplo 297 resíduos de aminoácidos. Preferencialmente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem em termos de substituições de aminoácidos conservativas.
Uma sequência "não relacionada" ou "não homóloga" partilha menos de 40% de identidade, embora de preferência menos de 25% de identidade, com uma sequência de aminoácidos de ML-IAP do presente invento.
As substituições conservativas de aminoácidos referem-se, numa concretização, à permutabilidade de resíduos que possuem cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais hidroxialifáticas consiste em serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida consiste em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre consiste em cisteína e metionina. Os grupos 69 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ preferidos de substituições conservativas de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.
Adicionalmente, as variantes também são determinadas com base num número predeterminado de substituições conservativas de aminoácidos conforme definido abaixo. 0 termo "substituição conservativa de aminoácidos", como aqui utilizado, refere-se à substituição de um aminoácido (num grupo predeterminado de aminoácidos) por outro aminoácido (no mesmo grupo), em que os aminoácidos apresentam caracteristicas similares ou substancialmente similares.
Dentro do significado do termo "substituição conservativa de aminoácidos" como aqui aplicado, um aminoácido poderá ser substituído por outro dentro dos grupos de aminoácidos indicados abaixo:
Aminoácidos que possuem cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr e Cys)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro e Met)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala Vai, Leu, Ile)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais ácidas (Asp, Glu)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais amida (Asn, Gin)
Aminoácidos que possuem cadeias laterais hidroxi (Ser, Thr) 70 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 70 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ Aminoácidos (Cys, Met) Aminoácidos Ser, Thr) Aminoácidos Aminoácidos que possuem cadeias laterais contendo enxofre neutros, fracamente hidrofóbicos Pro, Ala, Gly, ácidos, hidrofilicos (Gin, Asn, Glu, Asp) e hidrofóbicos (Leu, lie, Vai)
Por conseguinte, uma variante ou um seu fragmento, conforme descritos no pedido, poderá compreender pelo menos uma substituição, por exemplo, uma pluralidade de substituições introduzidas independentemente umas das outras. É evidente a partir do que foi destacado acima que a mesma variante ou seu fragmento poderá compreender mais de uma substituição conservativa de aminoácidos, de mais de um grupo de aminoácidos conservativos conforme definidos acima. A adição ou eliminação de pelo menos um aminoácido poderá ser uma adição ou eliminação de preferencialmente 2 a 250 aminoácidos, por exemplo de 10 a 20 aminoácidos, por exemplo de 20 a 30 aminoácidos, por exemplo de 40 a 50 aminoácidos. Contudo, as adições ou eliminações de mais de 50 aminoácidos, como as adições de 50 a 100 aminoácidos, a adição de 100 a 150 aminoácidos, a adição de 150 a 250 aminoácidos, também estão compreendidas no presente invento. A eliminação e/ou a adição poderão ser -independentemente uma da outra - uma eliminação e/ou uma adição no interior de uma sequência e/ou no final de uma sequência.
Os fragmentos de polipéptido como descritos no pedido, incluindo quaisquer seus equivalentes funcionais, poderão, numa concretização, compreender uma sequência de resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP de menos de 250 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 240 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 225 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 200 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 180 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 160 resíduos de 71 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ aminoácidos, por exemplo menos de 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 140 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 130 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 120 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 110 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 100 residuos de aminoácidos, por exemplo menos de 90 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 85 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 80 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 75 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 70 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 65 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 60 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 55 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 50 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 45 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 30 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 25 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo menos de 15 residuos de aminoácidos, por exemplo 14 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo 13 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo 12 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo 11 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo 10 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1). A "equivalência funcional", tal como utilizada no presente invento, é estabelecida, de acordo com uma concretização preferida, por referência à funcionalidade correspondente de um fragmento predeterminado da sequência. A equivalência funcional pode ser estabelecida, por exemplo, por afinidades de ligação similares a moléculas HLA de classe I ou por potências similares demonstradas pelos ensaios ELISPOT.
Entender-se-á que os equivalentes funcionais ou as variantes de um fragmento de ML-IAP como aqui descritos apresentam sequências de aminoácidos que diferem gradualmente das sequências predeterminadas preferidas, à medida que o número e o âmbito de inserções, eliminações e substituições, incluindo substituições conservativas, aumentam. Esta diferença é medida como uma redução da homologia entre uma 72 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ sequência predeterminada preferida e a variante do fragmento de ML-IAP ou o equivalente funcional de ML-IAP.
Todos os fragmentos de ML-IAP compreendendo ou consistindo em residuos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP, assim como as suas variantes e equivalentes funcionais estão incluídos no âmbito deste invento, independentemente do grau de homologia que apresentam com uma sequência predeterminada. A razão para isto é o facto de algumas regiões dos fragmentos de ML-IAP serem muito provavelmente facilmente mutáveis, ou passíveis de ser totalmente eliminadas, sem qualquer efeito significativo, por exemplo, na actividade de ligação do fragmento resultante.
Uma variante funcional obtida por substituição poderá perfeitamente apresentar alguma forma ou grau da actividade de ligação nativa, e contudo ser menos homóloga, se os resíduos de aminoácidos substituídos contiverem cadeias laterais funcionalmente similares. Funcionalmente similar, neste contexto, refere-se a características dominantes das cadeias laterais, tais como hidrofóbicas, básicas, neutras ou ácidas, ou a presença ou ausência de um volume estéreo. Por conseguinte, numa concretização do invento, o grau de identidade não é uma medida principal do facto de um fragmento ser uma variante ou equivalente funcional de um fragmento predeterminado preferido de acordo com o presente invento. A homologia entre as sequências de aminoácidos pode ser calculada utilizando algoritmos bem conhecidos, como seja qualquer um dos algoritmos BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 e BLOSUM 90.
Os fragmentos que partilham homologia com fragmentos compreendendo ou consistindo em resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP devem ser considerados como estando no âmbito do presente invento quando são preferencialmente pelo menos cerca de 90% homólogos, por exemplo pelo menos 92% homólogos, por exemplo pelo menos 94% homólogos, por exemplo pelo menos 95% homólogos, por exemplo pelo menos 96% homólogos, por exemplo pelo menos 97% homólogos, por 73 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ exemplo pelo menos 98% homólogos, por exemplo pelo menos 99% homólogos com um fragmento de ML-IAP predeterminado. De acordo com uma concretização do invento, as percentagens de homologia indicadas acima são percentagens de identidade.
Os factores adicionais que poderão ser tomados em consideração ao determinar a equivalência funcional de acordo com o significado aqui utilizado são i) a capacidade dos anti-soros para detectar um fragmento de ML-IAP de acordo com o presente invento ou ii) a capacidade de um fragmento de ML-IAP funcionalmente equivalente para competir com um fragmento de ML-IAP predeterminado num ensaio. Um método para determinar uma sequência de aminoácidos imunogenicamente activos dentro de uma sequência de aminoácidos conhecida foi descrito por Geysen na patente US 5,595, 915 e está aqui incorporado através de referência.
Um outro método convenientemente adaptável para determinar as relações de estrutura e função de fragmentos de péptidos é descrito pela patente US 6,013,478, que está aqui incorporada através de referência. Métodos de análise da ligação de uma sequência de aminoácidos a um grupo receptor, como seja, por exemplo, um receptor de células T, são também conhecidos pelos peritos.
Além das substituições conservativas introduzidas em qualquer posição de um fragmento de ML-IAP preferido, também pode ser desejável introduzir substituições não conservativas numa ou mais posições desse fragmento. Uma substituição não conservativa conduzindo à formação de um fragmento funcionalmente equivalente, por exemplo, i) diferiria substancialmente em termos de polaridade, por exemplo, um resíduo com uma cadeia lateral não polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Vai, Ile, Leu, Phe ou Met) substituído por um resíduo com uma cadeia lateral polar, como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn ou Gin, ou por um aminoácido carregado, como Asp, Glu, Arg ou Lys, ou a substituição de um resíduo carregado ou polar por um resíduo não polar; e/ou ii) diferiria substancialmente no seu efeito sobre a orientação do esqueleto polipéptido, tal como a substituição de ou por Pro ou Gly de outro resíduo; e/ou iii) diferiria substancialmente em termos de carga eléctrica, por exemplo, a substituição de um resíduo 74 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ carregado negativamente, como Glu ou Asp, por um resíduo carregado positivamente, como Lys, His ou Arg (e vice-versa); e/ou iv) diferiria substancialmente em termos do volume estéreo, por exemplo, a substituição de um resíduo volumoso, como His, Trp, Phe ou Tyr, por um resíduo possuindo uma cadeia lateral mais pequena, por exemplo Ala, Gly ou Ser (e vice-versa).
As variantes obtidas por substituição de aminoácidos poderão, numa concretização preferida, ser feitas com base nos valores de hidrofobicidade e hidrofilicidade e na similaridade relativa dos substituintes presentes na cadeia lateral dos aminoácidos, incluindo carga, tamanho e factores similares. As substituições de aminoácidos exemplificativas que têm em consideração várias das características anteriores são bem conhecidas pelos peritos e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.
Numa concretização adicional, o presente invento refere-se a variantes funcionais compreendendo aminoácidos substituídos com valores hidrofílicos ou índices hidropáticos que estão entre +/- 4,9; por exemplo entre +/- 4,7; por exemplo entre + /- 4,5; por exemplo entre +/- 4,3; por exemplo entre +/- 4,1; por exemplo entre +/- 3,9; por exemplo entre +/- 3,7; por exemplo entre +/- 3,5; por exemplo entre +/- 3,3; por exemplo entre +/- 3,1; por exemplo entre +/- 2,9; por exemplo entre +/- 2,7; por exemplo entre +/- 2,5; por exemplo entre +/- 2,3; por exemplo entre +/- 2,1; por exemplo entre +/- 2,0; por exemplo entre +/- 1,8; por exemplo entre +/- 1,6; por exemplo entre +/- 1,5; por exemplo entre +/- 1,4; por exemplo entre +/- 1,3; por exemplo entre +/- 1,2; por exemplo entre +/- 1,1; por exemplo entre +/- 1,0; por exemplo entre +/- 0,9; por exemplo entre +/- 0,8; por exemplo entre +/- 0,7; por exemplo entre +/- 0,6; por exemplo entre +/- 0,5; por exemplo entre + / — 0,4; por exemplo entre + / — 0,3; por exemplo entre +/- 0,25; por exemplo entre +/- 0,2 do valor do aminoácido que foi substituído. A importância dos índices hidrofílico e hidropático dos aminoácidos no que diz respeito a conferirem uma função biológica interactiva numa proteína é bem compreendida na 75 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ técnica (Kyte & Doolittle, 1982 e Hopp, Patente U.S. N.° 4, 554, 101, em que cada uma delas está aqui incorporada através de referência.).
Os valores do índice hidropático dos aminoácidos conforme aqui utilizados são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5) (Kyte & Doolittle, 1982).
Os valores de hidrofilicidade dos aminoácidos são: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0.+-.l); glutamato (+3,0.+-.1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.+-.l); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (—1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (—2,5); triptofano (-3,4) (Patente U.S. 4,554,101).
Além dos compostos peptidilo aqui descritos, é possível formular compostos estereamente similares para mimetizar as porções-chave da estrutura peptidica, e estes compostos também poderão ser utilizados da mesma forma que os péptidos do invento. Isto poderá ser obtido por técnicas de modelação e de desenho químico conhecidas pelos peritos. Por exemplo, a esterificação e outras alquilações poderão ser empregues para modificar a extremidade amino de, por exemplo, uma estrutura peptidica de di-arginina para mimetizar uma estrutura tetrapeptidica. Entender-se-á que todas estas construções estereamente similares estão no âmbito do presente invento.
As variantes e os equivalentes funcionais de ML-IAP também incluem derivados de ML-IAP ou seus fragmentos, por exemplo, ML-IAP ou fragmentos de ML-IAP substituídos com um ou mais grupos funcionais químicos.
Os péptidos com alquilações N-terminais e esterificações C-terminais também estão abrangidos pelo presente invento. Os equivalentes funcionais também compreendem conjugados 76 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ glicosilados e conjugados covalentes ou de agregação formados com o mesmo ou com diferentes fragmentos de ML-IAP, incluindo dimeros ou grupos funcionais químicos não relacionados. Estes equivalentes funcionais são preparados pela ligação de funcionalidades a grupos encontrados no fragmento, incluindo em qualquer uma ou em ambas as extremidades N e C, por meios conhecidos na técnica.
Os equivalentes funcionais poderão, assim, compreender fragmentos de ML-IAP conjugados com amidas ou ésteres alifáticos ou acilo da extremidade carboxilo, alquilaminas ou resíduos contendo cadeias laterais carboxilo, por exemplo, conjugados com alquilaminas em resíduos de ácido aspártico; derivados O-acilo de resíduos contendo um grupo hidroxilo e derivados N-acilo do aminoácido amino-terminal ou de resíduos contendo um grupo amino, por exemplo, conjugados com Met-Leu-Phe ou proteínas imunogénicas. Os derivados dos grupos acilo são seleccionados entre o conjunto de grupos alquilo (incluindo alquilo normal em C3 a CIO), formando desse modo espécies alcanoílo, e de compostos carbocíclicos ou heterocíclicos, formando desse modo espécies aroílo. Os grupos reactivos são preferencialmente compostos bifuncionais conhecidos para utilização na reticulação de proteínas a matrizes insolúveis através dos grupos laterais reactivos.
Os equivalentes funcionais covalentes ou de agregação e seus derivados são úteis como reagentes em imunoensaios ou em procedimentos de purificação por afinidade. Por exemplo, um fragmento de ML-IAP de acordo com o presente invento pode ser insolubilizado por meio de ligação covalente a Sepharose activada com brometo de cianogénio, utilizando métodos conhecidos, ou adsorvido em superfícies de poliolefinas, com ou sem reticulação com glutaraldeído, para utilização num ensaio ou na purificação de anticorpos anti-fragmento de ML-IAP ou de receptores de superfície celular. Os fragmentos também poderão ser marcados com um grupo detectável, por exemplo, radioiodados pelo procedimento da cloramina T, ligados covalentemente a quelatos de terras raras ou conjugados com outro grupo fluorescente para utilização, por exemplo, em ensaios de diagnóstico. 77 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Os fragmentos de ML-IAP de acordo com o invento poderão ser sintetizados in vitro e in vivo. Numa concretização, os fragmentos de ML-IAP do invento são sintetizados por sintese automatizada. Qualquer uma das técnicas em fase sólida disponíveis comercialmente poderá ser utilizada, tal como o método de síntese em fase sólida de Merrifield, em que os aminoácidos são adicionados sequencialmente a uma cadeia de aminoácidos crescente (ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). 0 equipamento para a síntese automatizada de polipéptidos está disponível comercialmente de fabricantes como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, Califórnia, e pode ser geralmente posto em funcionamento de acordo com as instruções do fabricante. A síntese em fase sólida permite a incorporação de substituições de aminoácidos desejáveis em qualquer fragmento de ML-IAP de acordo com o presente invento. Entender-se-á que as substituições, eliminações, inserções ou qualquer subcombinação destas poderão ser combinadas para chegar a uma sequência final de um equivalente funcional. As inserções deverão ser entendidas como abrangendo as fusões amino-terminais e/ou carboxi-terminais, por exemplo, com uma proteína hidrofóbica ou imunogénica ou com um transportador, tal como qualquer polipéptido ou elemento estrutural capaz de actuar como transportador.
Oligómeros incluindo dímeros, entre os quais homodímeros e heterodímeros, de fragmentos de ML-IAP de acordo com o invento são também disponibilizados e encontram-se no âmbito do invento. Os equivalentes funcionais e as variantes de fragmentos de ML-IAP podem ser produzidos como homodímeros ou heterodímeros com outras sequências de aminoácidos ou com sequências de ML-IAP nativas. Os heterodímeros incluem dímeros contendo fragmentos de ML-IAP imunorreactivos, assim como fragmentos de ML-IAP que não precisam de ter ou de desempenhar qualquer actividade biológica.
Exemplos A secção seguinte serve para descrever em maior detalhe a maneira de utilizar o invento descrito acima, bem como 78 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ expor os melhores modos contemplados de realização dos vários aspectos do invento. Entende-se que estes exemplos não se destinam a limitar de nenhuma forma o verdadeiro âmbito deste invento, sendo antes apresentados com fins ilustrativos.
Exemplo 1
Materiais e métodos Péptidos
Todos os péptidos foram adquiridos de Research Genetics (Huntsville, AL, EUA) e fornecidos com uma pureza >80% conforme verificado por análise de HPLC e de espectrometria de massa. Todos os péptidos utilizados estão indicados na Tabela 1.
Ensaio de montagem para a ligação de péptidos a moléculas MHC de classe I
Os ensaios de montagem para a ligação de péptidos sintéticos a moléculas MHC de classe I marcadas metabolicamente com [35S]-metionina foram efectuados da forma descrita15,16. O ensaio de montagem baseia-se na estabilização da molécula de classe I após carga do péptido na linha celular deficiente no transportador do péptido T2. Subsequentemente, as cadeias pesadas da molécula MHC estável e correctamente enrolada são imunoprecipitadas, utilizando anticorpos dependentes da conformação. Após focagem isoeléctrica, os géis foram expostos a ecrãs PhosphorImager, e a ligação do péptido foi quantificada utilizando o programa Imagequant do sistema Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Califórnia).
Estimulação de PBL com antigénio
Para ampliar a sensibilidade do ensaio ELISPOT, os PBL foram estimulados uma vez in vitro antes da análise17,18. No dia 0, os PBL ou os gânglios linfáticos esmagados foram descongelados e plaqueados em 2 ml/poço, a uma concentração de 2 x 106 células, em placas de 24 poços (Nunc, Dinamarca) de meio X-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland) , soro humano inactivado pelo calor a 5% e L-glutamina 2 mM, na 79 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ presença de péptido a uma concentração de 10 μΜ. Dois dias mais tarde, adicionou-se 20 Ul/ml interleucina-2 (IL-2) recombinante (Chiron, Ratingen, Alemanha) às culturas. As células cultivadas foram testadas quanto a reactividade no ensaio ELISPOT no dia 12.
Ensaio ELISPOT O ensaio ELISPOT utilizado para quantificar as células efectoras que libertam interferão-γ especifico para os epitopos peptídicos foi efectuado da forma previamente descrita19. Resumidamente, placas de 96 poços com fundo de nitrocelulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) foram revestidas com anticorpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suécia). Os poços foram lavados, bloqueados com meio X-vivo, e as células foram adicionadas, em duplicado, a diferentes concentrações celulares. Os péptidos foram depois adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas durante a noite. No dia seguinte, o meio foi eliminado e os poços foram lavados antes da adição de anticorpo secundário biotinilado (7-B6-l-Biotin, Mabtech). As placas foram incubadas durante 2 horas, lavadas e adicionou-se o conjugado avidina-enzima (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) a cada poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora, e o substrato da enzima NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) foi adicionado a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5-10 min. A reacção foi terminada mediante lavagem com água corrente após o surgimento de "spots" violeta escuro. Os "spots" foram contados utilizando o sistema Alphalmager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA), e a frequência de CTL específicos para o péptido pôde ser calculada a partir dos números de células que formam "spots". Os ensaios foram todos efectuados em duplicado para cada antigénio peptídico.
Exemplo 2 O presente exemplo demonstra que ML-IAP é reconhecido como um antigénio tumoral em doentes com cancro, dado que ML-IAP é submetido a respostas de células T. 80 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ A sequência de aminoácidos do polipéptido ML-IAP foi pesquisada quanto a possíveis epitopos peptídicos nonaméricos e decaméricos para HLA-A2, utilizando os resíduos âncora principais com especificidade para HLA-A2 .
Sintetizaram-se doze péptidos deduzidos a partir de ML-IAP, que foram analisados quanto a ligação a HLA-A2 por comparação com o epitopo de controlo positivo com afinidade elevada para HLA-A2, oriundo do VIH-1, P0I476-484 (ILKEPVHGV) (Tabela 1) . A concentração de péptido necessária para obter metade da recuperação máxima da molécula MHC de classe I (valor C50) foi de 0,2 μΜ para o controlo positivo.
Cinco péptidos ML-IAP ligaram-se com uma afinidade elevada idêntica à manifestada pelo controlo positivo: MLIAP245, MLIAP90, MLIAP34, MLIAP54 e MLIAP99 (C50 = 1; 0,2; 1; 1 e 0,9 μΜ, respectivamente) (Tabela 1). Comparativamente, os péptidos MLIAP280, MLIAP83 e MLIAP154 ligaram-se com uma afinidade intermédia (C50 = 20, 30 e 10 μΜ, respectivamente), enquanto os péptidos MLIAP230 e MLIAPgs ligaram-se apenas fracamente a HLA-A2 (C50 >100 μΜ) . Dois dos péptidos analisados (MLIAP26i/· MLIAP200) não se ligaram a HLA-A2 (Tabela 1).
Utilizando o ensaio ELISPOT de secreção de IFN-γ, analisou-se a presença de respostas de células T específicas contra os péptidos que se ligam a HLA-A2, deduzidos a partir de ML-IAP, em células T de sangue periférico (n = 7) ou em TIL (linfócitos infiltrantes do tumor) (n = 22) de doentes com melanoma. A sensibilidade elevada deste ensaio permite a detecção fiável de um número tão reduzido quanto 10-100 células T específicas/1 milhão. Além disso, antes da análise, as células T foram estimuladas uma vez in vitro para ampliar a sensibilidade. Foi anteriormente demonstrado que este método é extremamente eficaz para identificar epitopos peptídicos reconhecidos por CTL em doentes com cancro ' '
Em contraste, outros ensaios ex vivo, como a coloração intracelular de IFN-γ ou a análise de tetrâmeros por citometria de fluxo, requerem frequências de células T específicas cerca de lOx superiores para que haja detecção. 81 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ
Na primeira série de experiências, analisou-se a reactividade das células T contra todos os 12 péptidos deduzidos a partir de ML-IAP. Com base nestes resultados preliminares, incluiu-se também o péptido com ligação fraca a HLA-A2 ML-IAP230/· além dos péptidos com melhores afinidades de ligação para análise subsequente. As respostas CTL mais fortes foram detectadas contra o péptido com ligação intermédia a HLA-A2 ML-IAP2go (QLCPICRAPV), e tais respostas foram detectáveis tanto nos TIL como nos PBL. A Figura 1 ilustra estas respostas espontâneas fortes detectadas nos TIL e nos PBL de três doentes com melanoma (Fig. 1 A-D); cada "spot" representa uma célula produtora de INF—γ reactiva ao péptido. 0 número médio de "spots" por péptido foi calculado utilizando um dispositivo de varrimento CCD ("Charge-Coupled Device") e um sistema computacional (Fig. 1E). Adicionalmente, foi possível detectar uma resposta contra ML-IAP28o numa das amostras de PBL e nos TIL de sete doentes (Fig. 2). Além disso, detectou-se uma resposta contra o péptido com ligação forte a HLA-A2 ML-IAP245 (RLQEERTCKV) em cinco das amostras de TIL e numa das amostras de PBL (Fig. 2). Para além disso, identificou-se reactividade contra o péptido com ligação forte a HLA-A2 ML-IAP90 (RLASFYDWPL) em sete amostras de TIL e nos PBL de dois doentes (Fig. 2) . De modo surpreendente, detectou-se uma resposta contra o péptido com ligação fraca a HLA-A2 MLIAP230 (VLEPPGARDV) em seis culturas de TIL e duas amostras de PBL, apesar de este péptido não ter sido capaz de estabilizar a molécula HLA-A2 (Fig. 2).
Onze das 22 amostras de TIL e três das sete amostras de PBL não mostraram qualquer resposta especifica para ML-IAP (resultados não apresentados). Deste modo, detectaram-se respostas de células T espontâneas contra ML-IAP em cerca de metade dos doentes examinados.
Por conseguinte, analisaram-se os fragmentos do polipéptido ML-IAP quanto à presença de motivos de ligação a HLA-A2 e - após uma identificação com êxito - os fragmentos foram utilizados para testar a reactividade de células T específicas em doentes com melanoma, utilizando o ensaio ELISPOT. Usando esta estratégia, identificaram-se com sucesso 82 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ respostas CTL fortes contra o péptido com ligação intermédia a HLA-A2 ML-IAP28o.
Respostas espontâneas mais fracas puderam ser detectadas contra três epitopos peptídicos adicionais: os péptidos com ligação forte a HLA-A2 MLIAP245 e MLIAP90 e o péptido com ligação muito fraca MLIAP230· Nesse sentido, vale a pena ter em atenção que a resposta CTL contra um dado péptido é determinada por muitos factores. Estes incluem o nível de expressão do polipéptido de origem relevante, o processamento, o transporte TAP, o nível de expressão da molécula MHC de classe I na superfície celular, o repertório TCR, a sensibilidade CTL, a imunossupressão e as citocinas23. Assim, a ligação do péptido à molécula de classe I é um de entre vários factores diferentes que determinam a imunogenicidade de um dado péptido. Adicionalmente, em contraste com os péptidos estranhos, quando os péptidos próprios são expressos na superfície celular com uma densidade elevada devido a uma afinidade de ligação elevada a moléculas MHC, parece ser induzida tolerância e as células T reactivas são eliminadas ou inactivadas .
Subsequentemente, muitos epitopos imunodominantes nas respostas CTL a polipéptidos próprios podem ser frequentemente subdominantes ou crípticos, em vez de serem determinantes dominantes. Isto poderá explicar a observação de que muitos epitopos de antigénios de melanoma humano, que são polipéptidos próprios não mutados, como gplOO e MART-1, possuem afinidades de ligação relativamente baixas para as moléculas MHC de classe I28. Dado que a eficácia da imunoterapia de tumores depende muito provavelmente da avidez dos CTL recrutados32, os epitopos de tumores de baixa afinidade poderiam ser TAA (antigénios associados a tumores) importantes, desde que sejam capazes de mobilizar o seu repertório CTL específico e sejam apresentados pelas células tumorais de uma forma suficientemente eficaz para serem reconhecidos pelos CTL.
Exemplo 3
Um dos epitopos restritos ao antigénio HLA-A2 identificado a partir de ML-IAP foi o péptido decamérico ML- 83 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ ΙΑΡ245 (RLQEERTCKV). Ο exemplo seguinte refere-se ao péptido nonamérico análogo ML-IAP245-253 (RLQEERTCK) . 0 péptido decamérico é apresentado pelas células de melanoma no contexto do antigénio HLA-A2. Para investigar se o péptido nonamérico também é gerado pela maquinaria processadora de antigénios e é subsequentemente apresentado no contexto do antigénio HLA-A3, analisaram-se os PBL de 14 doentes com melanoma positivo para o antigénio HLA-A3 quanto a respostas imunitárias espontâneas contra este péptido, por meio de um ensaio ELISPOT. Neste sentido, cinco dos doentes com melanoma albergaram uma resposta imunitária de mais de 200 células T com especificidade para ML-IAP245-253 (RLQEERTCK) por 106 células CD8+ (Figura 3).
Assim, as respostas imunitárias espontâneas contra este epitopo estão presentes em cerca de um terço dos doentes positivos para o antigénio HLA-A3. A caracterização de múltiplos epitopos do polipéptido ML-IAP com diferentes elementos de restrição de classe I amplia o potencial clinico deste antigénio-alvo de duas formas importantes: por um lado, aumenta o número de doentes elegíveis para a imunoterapia baseada em péptidos derivados de ML-IAP, pois embora o antigénio HLA-A2 seja uma das moléculas HLA de classe I expressas com maior frequência, ele só é expresso em cerca de 50% dos doentes com melanoma. O antigénio HLA-A3 é expresso em 30% dos doentes . A co-expressão é encontrada em cerca de 10% dos doentes. Deste modo, aproximadamente 70% dos doentes podem ser vacinados com os epitopos de ML-IAP identificados.
Por outro lado, o facto de visar colectivamente vários elementos de restrição é susceptível de diminuir o risco de escape imunológico por perda de um alelo HLA de classe I. A perda de um único alelo HLA de classe I é um componente significativo das alterações no MHC descritas em células cancerosas, ao passo que a perda total da expressão de HLA de classe I é um evento bastante raro. Embora a percentagem de doentes que expressam ambos os antigénios HLA-A2 e HLA-A3 seja de apenas 10%, a identificação de epitopos para outros 84
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT alelos HLA de classe I aumenta efectivamente esta percentagem de doentes com sobreposição alélica.
Exemplo 4
As células T reactivas a ML-IAP foram detectadas in situ da forma que se segue.
Os monómeros HLA-A2 e ML-IAP245/HLA-A2 foram multimerizados utilizando moléculas de dextrano, que foram conjugadas com ambos os compostos estreptavidina e isotiocianato de fluoresceína. Os complexos MHC multimerizados foram utilizados para corar material congelado e fixado com acetona da forma previamente descrita11'48, e as células especificas para os antigénios foram visualizadas utilizando um microscópio confocal de varrimento laser.
Analisaram-se secções de melanoma primário de seis doentes, e os CTL reactivos a ML-IAP280 e a ML-IAP245 puderam ser facilmente detectados in situ no microambiente do tumor, em dois dos doentes (Figura 4).
Exemplo 5
Para caracterizar a capacidade funcional dos CTL reactivos a ML-IAP, estas células foram isoladas por meio de esferas magnéticas revestidas com complexos HLA-A2/ML-IAP de uma forma semelhante à descrita em Schrama et ai., 2001 . As células especificas para ML-IAP245 foram isoladas directamente de PBL (Figura 5A) . As células reactivas a ML-IAP2so foram enriquecidas a partir de TIL de um gânglio linfático infiltrado por melanoma, após serem estimuladas uma vez in vitro com péptido. Estas células promoveram a lise de células T2 de uma maneira especifica ao péptido (Figura 4B) . Adicionalmente, testou-se a citotoxicidade dos CTL reactivos a ML-IAP280 contra a linha de melanoma autólogo FM72, a linha celular de melanoma positivo para HLA-A2 FM93 e a linha celular de melanoma negativo para HLA FM56. Esta análise revelou que as células T reactivas a ML-IAP280 promoveram a lise eficiente de ambas as linhas celulares de melanoma autólogo e de melanoma positivo para HLA. Em contraste, não foi observada nenhuma citotoxicidade contra a linha celular 85 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ de melanoma negativo para HLA-A2 FM56 ou a linha celular que é alvo de células "killer" naturais K562 (Figura 4C).
Os resultados apresentados acima demonstram que o polipéptido ML-IAP, que tem uma importância crucial para a sobrevivência de uma célula cancerosa, representa um antigénio tumoral novo. As proteínas inibidoras da apoptose (IAP), como o ML-IAP, podem ser utilizadas de forma vantajosa para fins de vacinação, pois a regulação negativa ou a perda da expressão destes polipéptidos (que caso contrário constitui uma forma de escape imunológico) prejudicaria o crescimento continuado do tumor. Péptidos úteis específicos são identificados.
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<210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens 92 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ <400> 1
Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gin Pro 15 10 15
Ser His Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gin Glu Arg Cys Gly Pro 20 25 30
Arg Ser Leu Gly Ser Pro Vai Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp 35 40 45
Asp His Vai Asp Gly Gin Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu Thr Glu 50 55 60
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala 65 70 75 80
Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp 85 90 95
Trp Pro Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110
Phe Phe His Thr Gly His Gin Asp Lys Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 115 120 125
Gly Gly Leu Gin Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr His Ala 130 135 140
Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp 145 150 155 160
Phe Vai His Ser Vai Gin Glu Thr His Ser Gin Leu Leu Gly Ser Trp 165 170 175
Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro Vai Ala Pro Ser Vai 180 185 190
Pro Ala Ser Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Vai Gin 195 200 205
Ser Glu Ser Ala Gin Glu Pro Gly Gly Vai Ser Pro Ala Glu Ala Gin 210 215 220
Arg Ala Trp Trp Vai Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Vai Glu Ala 225 230 235 240 93 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 93 Gin Leu Arg Arg Leu Gin Glu Glu 245
Arg Ala Vai Ser Ile Vai Phe Vai 260
Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gin Leu 275 280
Arg Thr 250 Cys Lys Vai Cys Leu 255 Asp Pro 265 Cys Gly His Leu Vai 270 Cys Ala Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Vai 285
Ser
Arg
Arg Ser Arg Vai Arg Thr Phe Leu 290 295 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Pro 1 Lys Asp Ser Ala Lys 5
Cys <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Pro Lys 1 Asp Ser Ala Lys Cys 5
Leu <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Lys Asp 1 Ser Ala Lys Cys Leu 5
His <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His 1 5 94
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly 1 5
<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro 1 5
<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gin 1 5
<210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gin Pro 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Cys Leu His Arg Gly Pro Gin Pro Ser 1 5 95
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 11 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu His Arg Gly Pro Gin Pro Ser His 1 5 <210 > 12 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Arg Gly Pro Gin Pro Ser His Trp 1 5 <210 > 13 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Gly Pro Gin Pro Ser His Trp Ala 1 5 <210> 14 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Pro Gin Pro Ser His Trp Ala Ala 1 5 <210 > 15 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Gin Pro Ser His Trp Ala Ala Gly 1 5 96
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 16 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gin Pro Ser His Trp Ala Ala Gly Asp 1 5 <210 > 17 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Pro Ser His Trp Ala Ala Gly Asp Gly 1 5 <210 > 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Hi s Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro 1 5 <210 > 19 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 His Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr 1 5 <210 > 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Trp Ala Ala 1 Gly Asp Gly Pro Thr Gin 5 <210> 21 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 97 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 21
Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gin Glu 1 5 <2 10> 22 <2 11> 9 <2 Λ CN1 \—1 PRT <2 13> Homo sapiens <4 Λ O O 22
Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gin Glu Arg 1 5 <210 > 23 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 23
Gly Asp Gly Pro Thr Gin Glu Arg Cys 1 5
<210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Asp Gly Pro Thr Gin Glu Arg Cys Gly 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Gly Pro Thr Gin Glu Arg Cys Gly Pro 1 5
<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 98 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 26
Pro Thr Gin Glu Arg Cys Gly Pro Arg 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Thr Gin Glu Arg Cys Gly Pro Arg Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Gin Glu Arg Cys Gly Pro Arg Ser Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Glu Arg Cys Gly Pro Arg Ser Leu Gly 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Arg Cys Gly Pro Arg Ser Leu Gly Ser 1 S <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 99
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 31
Cys Gly Pro Arg Ser Leu Gly Ser Pro 1 5 <210> 32 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Pro Arg Ser Leu Gly Ser Pro Vai 1 5 <210 > 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Pro Arg Ser Leu Gly Ser Pro Vai Leu 1 5 <210 > 34 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Arg Ser Leu Gly Ser Pro Vai Leu Gly 1 5 <210 > 35 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ser Leu Gly Ser Pro 1 1 5 <210> 36 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 100 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 36
Leu Gly Ser Pro Vai Leu Gly Leu Asp 1 5 <210 > 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu Asp Thr 1 5 <210 > 38 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser Pro Vai Leu Gly Leu Asp Thr Cys 1 5 <210 > 39 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Pro Vai Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg 1 5 <2 10 > 40 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 40
Vai Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 101
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 41 Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp 1 5 <210 > 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp Asp 1 5 <210 > 43 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp Asp His 1 5 <210 > 44 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Thr Cys Arg Ala Trp Asp His Vai 1 5 <210 > 45 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr Cys Arg Ala Trp Asp His Vai Asp 1 5 <210 > 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 102
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 46 Cys Arg Ala Trp Asp His Val Asp Gly 1 5 <210 > 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Arg Ala Trp Asp His Vai Asp Gly Gin 1 5 <210 > 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ala Trp Asp His Vai Asp Gly Gin Ile 1 5 <210 > 49 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Trp Asp His Val Asp Gly Gin Ile Leu 1 5 <210 > 50 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp His Vai Asp Gly Gin Ile Leu Gly 1 5 <210 > 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 103 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 51
His Vai Asp Gly Gin Ile Leu Gly Gin 1 5
<210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Vai Asp Gly Gin Ile Leu Gly Gin Leu 1 5
<210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53
Asp Gly Gin ile Leu Gly Gin Leu Arg 1 5
<210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54
Gly Gin Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro 1 5
<210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55
Gin Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu 1 5
<210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 104
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 56 Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu Thr 1 5 <210 > 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu Thr Glu 1 5 <210 > 58 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Gin Leu Arg Pro Leu Thr Glu Glu 1 5 <210 > 59 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gin Leu Arg Pro Leu Thr Glu Glu Glu 1 5 <210 > 60 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Arg Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu 1 5 <210 > 61 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 105
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 61
Arg Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210 > 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210 > 63 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Leu Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly 1 5 <210 > 64 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala 1 5 <210 > 65 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly 1 5 <210 > 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 106 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <4 Ο Ο > 66
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala 1 5 <210 > 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr 1 5 <210 > 68 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 69 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser 1 5 <210 > 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg 1 5 <210 > 71 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 107
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 71 Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly 1 5 <210 > 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro 1 5 <210> 73 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala 1 5 <210> 74 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala Phe 1 5 <210 > 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala Phe Pro 1 5 <210 > 76 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 108 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 76
Leu Ser Arg Gly Pro Ala Phe Pro Gly <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77
Ser Arg Gly Pro Ala Phe Pro Gly Met <2 10 > 78 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 78
Arg Gly Pro Ala Phe Pro Gly Met Gly 1 5 <210 > 79 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Gly Pro Ala Phe Pro C 1 5 <210 > 80 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80
Pro Ala Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu 1 5
<210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 109
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 81 Ala Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu 1 5 <210 > 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Phe pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu 1 5 <210 > 83 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg 1 5 <210 > 84 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu 1 S <210 > 85 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala 1 5 <210> 86 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 110 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 86
Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ser Gl 1 u Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe 5 <210> 88 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88
Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89
Glu Leu Arg Leu Alà Ser Phe Tyr Asp 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90
Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp 1 5
<210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 111 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 91
Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92
Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu 1 S <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93
Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94
Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu Thr Ala 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95
Phe Tyr Asp Trp Pro Leu Thr Ala Glu 1 ,5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 112
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 96 Tyr Asp Trp Pro Leu Thr Ala Glu Vai 1 5 <210 > 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Asp Trp Pro Leu Thr Ala Glu Vai Pro 1 5 <210 > 98 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Trp Pro Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro 1 5 <210 > 99 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Pro Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu 1 5 <210 > 100 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu 1 5 <210 > 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 113
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 101 Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu Leu 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu Leu Ala 1 5 <210 > 103 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Glu Vai Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala 1 5 <210 > 104 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Vai Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 <210 > 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly 1 5 <210 > 106 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens 114
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 106 Pro Gl u Leu Ala Ala Ala Gly Phe 1 5 <210 > 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe Phe 1 5 <210 > 108 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe Phe His 1 5 <210 > 109 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 109 Leu Ala Ala Ala Gly Phe Phe His Thr 1 5 <210 > 110 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Ala Ala Gly Phe Phe His Thr Gly 1 5 <210 > 111 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 115 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ <400> 111 Ala Ala Gly Phe Phe His Thr Gly His 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Ala Gly Phe Phe His Thr Gly His Gin 1 5 <210 > 113 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Gly Phe Phe His Thr Gly His Gin Asp 1 5 <210> 114 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Phe Phe His Thr Gly His Gin Asp Lys 1 5 <210 > 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Phe His Thr Gly His Gin Asp Lys Vai 1 5 <210 > 116 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 116
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 116 His Thr Gly His Gin Asp Lys Val Arg 1 S <210 > 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Thr Gly His Gin Asp Lys Val Arg Cys 1 5 <210 > 118 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Gly His Gin Asp Lys Vai Arg Cys Phe 1 5 <210 > 119 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 His Gin Asp Lys Vai Arg Cys Phe Phe 1 5 <210 > 120 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Gin Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys 1 5 <210> 121 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 117 ΕΡ 1 618 130/ΡΤ <400> 121 Asp Lys Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 1 5 <210 > 122 <211> 9 <212> PRT <213> Horao sapiens <400> 122 Lys Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr Gly 1 5 <210 > 123 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr Gly Gly 1 5 <210 > 124 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 124 Arg Cys Phe Phe Cys Tyr Gly Gly Leu 1 5 <210 > 125 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Cys Phe Phe Cys Tyr Gly Gly Leu Gin 1 5 <210> 126 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 118
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 126 Phe Phe Cys Tyr Gly Gly Leu Gin Ser 1 5 <210 > 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Phe Cys Tyr Gly Gly Leu Gin Ser Trp 1 5 <210 > 128 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Cys Tyr Gly Gly Leu Gin Ser Trp Lys 1 5 <210 > 129 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Tyr Gly Gly Leu Gin Ser Trp Lys Arg 1 5 <210 > 130 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Gly Gly Leu Gin Ser Trp Lys Arg Gly 1 5
<210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 119
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 131 Gly Leu Gin Ser Trp Lys Arg Gly Asp 1 5 <210 > 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Leu Gin Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp 1 5 <210 > 133 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gin Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro 1 5 <210 > 134 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp 1 5 <210 > 135 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 120
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 136 Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr His 1 5 <210 > 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr His Ala 1 5 <210 > 138 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gly Asp Asp Pro Trp Thr His Ala Lys 1 5 <210 > 139 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Asp Asp Pro Trp Thr His Ala Lys Trp 1 5 <210> 140 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Asp Pro Trp Thr His Ala Lys Trp Phe 1 5 <210 > 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 121
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 141 Pro Trp Thr 1 <210 > 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo <400> 142 Trp Thr His 1 <210 > 143 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 143 Thr Hi s Ala 1 <210 > 144 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 144 His Al a Lys 1 <2 10 > 145 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 145
Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe 1 5
<210 > 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 122 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 146
Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu 1 5 <210 > 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe 1 5 <210 > 148 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu Leu Arg 1 5 <210 > 149 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Pro Ser Cys Gin Phe Leu Leu Arg Ser 1 5
<210 > 150 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150
Ser Cys Gin Phe Leu Leu Arg Ser Lys 1 5 <210> 151 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 123 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 151
Cys Gin Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly 1 5 <210 > 152 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152
Gin Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg 1 5 <210 > 153 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153
Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp 1 5
<210 > 154 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154
Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe 1 5 <210 > 155 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155
Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe Vai 1 5 <210 > 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 124
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 156 Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe Val His 1 5 <210 > 157 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Ser Lys Gly Arg Asp Phe Val His Ser 1 5 <210 > 158 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Lys Gly Arg Asp Phe Vai His Ser Val 1 5 <210 > 159 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Gly Arg Asp Phe Vai His Ser Val Gin 1 5 <210 > 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Arg Asp Phe Val His Ser Val Gin Glu 1 5 <210 > 161 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 125
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <400> 161 Asp Phe Val His Ser Val 1 5 <210 > 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Phe Val His Ser Val Gin 1 5 <210 > 163 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Val His Ser Val Gin Glu 1 5 <210 > 164 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 His Ser Val Gin Glu Thr 1 5 <210> 165 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165
Ser Vai Gin Glu Thr His Ser Gin Leu 1 5 <2 10 > 166 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 166 sapiens
Val Gin Glu Thr His Ser Gin Leu Leu 1 5 126
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 167 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Gin Glu Thr His Ser Gin Leu Leu Gly 1 5 <210 > 168 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Glu Thr His Ser Gin Leu Leu Gly Ser 1 5 <210 > 169 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Thr His Ser Gin Leu Leu Gly Ser Trp 1 5 <210 > 170 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 His Ser Gin Leu Leu Gly Ser Trp Asp 1 5 <210> 171 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Ser Gin Leu Leu Gly Ser Trp Asp Pro 1 5 127
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
<210 > 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Gin Leu Leu 1 Gly Ser Trp 5 Asp Pro Trp <210 > 173 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Leu Leu Gly 1 Ser Trp Asp 5 Pro Trp Glu <210 > 174 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 174 Leu Gly Ser 1 Trp Asp Pro 5 Trp Glu Glu <210 > 175 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Gly Ser Trp 1 Asp Pro Trp 5 Glu Glu Pro <210 > 176 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Ser Trp Asp 1 Pro Trp Glu 5 Glu Pro Glu 128
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 177 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Trp Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp 1 5 <210 > 178 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala 1 B <210 > 179 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala 1 5 <210 > 180 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 181 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181
Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro Vai 1 5 129
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT 129 Pro Vai Ala <2 10 > 182 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 182
Glu Pro Glu Asp 1 <2 10 > 183 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 183
Vai Ala Pro
Pro Glu Asp Ala 1 <210 > 184 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sap <400> 184 Glu Asp Ala 1 Ala
Ala Pro Ser <2 10 > 185 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo sap <4 00 > 185
Asp Ala Ala Pro 1
Pro Ser Vai <210 > 186 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sap <400> 186
Ala Ala Pro Vai Ala Pro Ser Vai Pro 1 5 130
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 187 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Ala Pro Vai Ala Pro Ser Val Pro Ala 1 5 <210 > 188 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Pro Vai Ala Pro Ser Vai Pro Ala Ser 1 5 <210 > 189 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Vai Ala Pro Ser Vai Pro Ala Ser Gly 1 5 <210> 190 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Ala Pro Ser Vai Pro Ala Ser Gly Tyr 1 5 <210 > 191 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191
Pro Ser Vai Pro Ala Ser Gly Tyr Pro 1 5
131 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 192 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Ser Vai Pro Ala Ser Gly 1 5 <210 > 193 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Vai Piro Ala Ser Gly Tyr 1 5 <210 > 194 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Pro Ala Ser Gly Tyr Pro 1 5 <210> 195 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Ala Ser Gly Tyr Pro Glu 1 5 <210 > 196 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196
Ser Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro 1 5 132
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 197 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg 1 5 <210 > 198 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 198 Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg 1 5 <210 > 199 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu 1 5 <210> 200 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Vai 1 5 <210 > 201 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Vai 1 5 133
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 202 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Pro Thr Pro 1 Arg Arg Glu Vai Gin 5 <210 > 203 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Thr Pro Arg Arg Glu Vai Gin Ser 1 5 <210 > 204 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Pro Arg Arg Glu Vai Gin Ser Glu 1 5 <210> 205 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205
Arg Arg Glu Vai Gin Ser Glu Ser Ala 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206
Arg Glu Vai Gin Ser Glu Ser Ala Gin 1 5 134
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 207 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Glu Vai Gin Ser Glu Ser 1 5 <210 > 208 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 208 Vai Gin Ser Glu Ser Ala 1 5 <210 > 209 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Gin Ser Glu Ser Ala Gin 1 5 <210> 210 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Ser Glu Ser Ala Gin Glu 1 5 <210 > 211 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Glu Ser Ala Gin Glu Pro 1 5 135
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 212 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Ser Ala Gin Glu Pro Gly Gly Vai Ser 1 5 <210> 213 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Ala Gin Glu Pro Gly Gly Vai Ser Pro 1 5 <210 > 214 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Gin Glu Pro Gly Gly Vai Ser Pro Ala 1 5 <210> 215 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Glu Pro Gly Gly Vai Ser Pro Ala Glu 1 5 <210> 216 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Pro Gly Gly Val Ser pro Ala Glu Ala 1 5 136
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 217 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Gly Gly Vai Ser Pro Ala Glu Ala Gin 1 5 <210 > 218 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Gly Vai Ser Pro Ala Glu Ala Gin Arg 1 5 <210 > 219 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Vai Ser Pro Ala Glu Ala Gin Arg Ala 1 5 <210> 220 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Ser Pro Ala Glu Ala Gin Arg Ala Trp 1 5 <210 > 221 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221
Pro Ala Glu Ala Gin Arg Ala Trp Trp 1 5 137
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 222 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 222 Ala Glu Ala 1 <210 > 223 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 223 Glu Ala Gin 1 <210 > 224 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 224 Ala Gin Arg 1 <210> 225 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 225 Gin Arg Ala sapiens sapiens sapiens sapiens 1
Gin Arg Ala Trp Trp Vai 5
Arg Ala Trp Trp Vai Leu 5
Ala Trp Trp Vai Leu Glu 5
Trp Trp Vai Leu Glu Pro 5 <2 10 > 226 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 226 sapiens
Arg Ala Trp Trp Vai Leu Glu Pro Pro 1 5
138 ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 227 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Ala Trp Trp 1 Vai Leu Glu 5 <210 > 228 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Trp Trp Vai 1 Leu Glu Pro 5 <210 > 229 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Trp Vai Leu 1 Glu Pro Pro 5 <210> 230 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Vai Leu Glu 1 Pro Pro Gly 5 <210 > 231 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231
Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Vai 1 5 139
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 232 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Vai Glu 1 5 <210 > 233 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Pro Pro Gly Ala Arg Asp Vai Glu Ala 1 5 <210 > 234 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Pro Gly Ala Arg Asp Vai Glu Ala Gin 1 5 <210> 235 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Gly Ala Arg 1 Asp Vai Glu Ala Gin Leu 5 <210 > 236 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Ala Arg Asp Val Glu Ala Gin Leu Arg 1 5 140
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 237 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Arg Asp Vai Glu Ala Gin Leu Arg Arg 1 5 <210 > 238 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Asp Vai Glu Ala Gin Leu Arg Arg Leu 1 5 <210 > 239 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Vai Glu Ala Gin Leu Arg Arg Leu Gin 1 5 <210> 240 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 Glu Ala Gin Leu Arg Arg Leu Gin Glu 1 5 <210 > 241 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241
Ala Gin Leu Arg Arg Leu Gin Glu Glu 1 5 141
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 242 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Gin Leu Arg Arg Leu Gin Glu Glu Arg 1 5 <210 > 243 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 243 Leu Arg Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr 1 5 <210 > 244 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Arg Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys 1 5 <210> 245 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys 1 5 <210 > 246 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys Vai 1 5 142
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 247 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys Vai Cys 1 5 <210 > 248 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Glu Glu Arg Thr Cys Lys Vai Cys Leu 1 5 <210 > 249 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Glu Arg Thr Cys Lys Vai Cys Leu Asp 1 5 <210> 250 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Arg Thr Cys 1 Lys Vai Cys Leu Asp Arg 5 <210 > 251 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Thr Cys Lys Vai Cys Leu Asp Arg Ala 1 5 143
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 252 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Cys Lys Vai Cys Leu Asp Arg Ala 1 5 <210 > 253 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Lys Vai Cys 1 Leu Asp Arg Ala Vai 5 <210 > 254 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254
Vai Cys Leu Asp Arg Ala Vai Ser Ile 1 5 <210> 255 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255
Cys Leu Asp Arg Ala Vai Ser Ile Vai 1 5 <210> 256 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256
Leu Asp Arg Ala Vai Ser Ile Vai Phe 1 5 144
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 257 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Asp Arg Ala Val Ser Ile Vai Phe Vai 1 5 <210 > 258 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Arg Ala Val Ser Ile Val Phe Val Pro 1 5 <210 > 259 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Ala Val Ser Ile Val Phe Val Pro Cys 1 5 <2 10 > 260 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo sapiens <4 00 > 260
Vai Ser Ile Vai Phe Vai Pro Cys Gly 1 5 ' <2 10 > 261 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 261 sapiens
Ser Ile Vai Phe Vai Pro Cys Gly His 1 5 145
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <2 10 > 262 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo sapiens <4 00 > 262
Ile Vai Phe Vai Pro Cys Gly His Leu 1 5 <2 10 > 263 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 263
Vai Phe Vai Pro Cys Gly His Leu Vai 1 5 <210> 264 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264
Phe Vai Pro Cys Gly His Leu Vai Cys 1 5 <2 10 > 265 <2 11 > 9 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 265 sapiens
Vai Pro Cys Gly His Leu Vai Cys Ala 1 5 <210 > 266 <211> 9 <212> PRT <213> Homo <400> 266 Pro Cys Gly 1 sapiens
His Leu Vai Cys Ala Glu 5 146
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 267 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 Cys Gly His 1 Leu Vai Cys Ala Glu Cys 5 <210 > 268 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Gly His Leu 1 Val Cys Ala Glu Cys Ala 5 <210 > 269 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 His Leu Val Cys Ala Glu Cys Ala Pro 1 5 <210> 270 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Leu Val Cys Ala Glu Cys Ala Pro Gly 1 5 <210 > 271 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 271 Val Cys Ala 1 Glu Cys Ala Pro Gly Leu 5 147
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 272 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 272 Cys Ala Glu 1 <210 > 273 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 273 Ala Glu Cys 1 <210 > 274 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 274 Glu Cys Ala 1 <210 > 275 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 275 Cys Ala Pro 1 <210 > 276 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo <400> 276 Ala Pro Gly sapiens sapiens sapiens sapiens sapiens 1
Cys Ala Pro Gly Leu Gin 5
Ala Pro Gly Leu Gin Leu 5
Pro Gly Leu Gin Leu Cys 5
Gly Leu Gin Leu Cys Pro 5
Leu Gin Leu Cys Pro Ile 5 148
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 277 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277
Pro Gly Leu Gin Leu Cys Pro Ile Cys 1 5
<210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278
Gly Leu Gin Leu Cys Pro Ile Cys Arg 1 5
<210> 279 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 279
Leu Gin Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala 1 5
<210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 280
Gin Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro 1 5
<210> 281 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 281
Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Vai 1 5 149
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 282 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 282 Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Vai Arg 1 5 <210 > 283 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Pro II e Cys Arg Ala Pro Vai Arg Ser 1 5 <210 > 284 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Ile Cys Arg Ala Pro Vai Arg Ser Arg 1 5 <210 > 285 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Cys Arg Ala Pro Vai Arg Ser Arg Vai 1 5 <210 > 286 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286
Arg Ala Pro Vai Arg Ser Arg Vai Arg 1 5 150 ΕΡ 1 618 130/ PT <210> 287 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Ala Pro Vai Arg Ser Arg Vai Arg Thr 1 5 <210 > 288 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 288 Pro Vai Arg Ser Arg Vai Arg Thr Phe 1 5 <210 > 289 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Vai Arg Ser Arg Vai Arg Thr Phe Leu 1 5 <210> 290 <211 > 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Arg Ser Arg Vai Arg Thr Phe Leu Ser 1 5 <210 > 291 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys 1 5 10 151
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
<210> 292 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292
Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His 15 10 <210> 293 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg 1 5 10 <210> 294 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294
Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly 15 10 <210> 295 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295
Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 296 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296
Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gin 15 10 15 152
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <2 10 > 297 <2 11 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 297
Arg Leu Gin Glu 1
Thr Cys Lys Vai 10 <2 10 > 298 <2 11 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 298
Gin Leu Cys Pro 1
Arg Ala Pro Vai 10 <2 10 > 299 <2 11 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 299
Arg Leu Ala Ser 1
Asp Trp Pro Leu 10 <2 10 > 300 <2 11 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 300
Leu Leu Arg Ser 1
Arg Asp Phe Vai 10 <2 10 > 301 <2 11 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 301
Val Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Vai 15 10 153
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
<210> 302 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sap iens <400> 302 Pro Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu 1 5 10 <210 > 303 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sap iens <400> 303 Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr 1 5 10 <210 > 304 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sap iens <400> 304
Vai Gin Glu Thr His Ser Gin Leu Leu Gly 15 10 <210> 305 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305
Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu Leu Ala 15 10 <210> 306 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306
Gin Asp Lys Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 15 10 154
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 307 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Lys Vai Cys Leu Asp Arg Ala Vai Ser I le 1 5 10 <210 > 308 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Arg Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys 1 5 10 <210 > 309 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe 1 5 10 <210> 310 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe Phe His 1 5 10 <210 > 311 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311
Cys Leu Asp Arg Ala Vai Ser Ile Vai Phe 15 10 155
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT
<210> 312 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu Thr Glu 1 5 10 <210 > 313 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Phe Cys Tyr Gly Gly Leu Gin Ser Trp Lys 1 5 10 <210 > 314 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Ala Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu 15 10 <210> 315 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Gly Pro Arg Ser Leu Gly Ser Pro Vai Leu 1 5 10 <210 > 316 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316
Vai Arg Cys Phe Phe Cys Tyr Gly Gly Leu 15 10 156
ΕΡ 1 618 13 Ο/PT <210> 317 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Arg Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys 1 5 10 <210 > 318 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Glu Arg Thr Cys Lys Vai Cys Leu Asp Arg 1 5 10
Lisboa, 2013-06-25

Claims (23)

  1. ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento de polipéptido provocando uma resposta de células T e compreendendo um péptido, que consiste em pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP e é seleccionado entre o grupo constituído por: (i) RLQEERTCK (SEQ ID N. 0 245) , (ii) RLQEERTCKV (SEQ ID N. 0 297) , (iii) QLCPICRAPV (SEQ ID N. 0 298) , (iv) VLEPPGARDV (SEQ ID N. ° 301) ; em que o referido fragmento de polipéptido consiste no máximo em 15 aminoácidos consecutivos.
  2. 2. Fragmento de polipéptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fragmento de polipéptido (a) possui um valor C5o inferior a 1.000, em que o referido valor é medido como a concentração (μΜ) do fragmento de polipéptido necessária para obter metade da ligação máxima a uma molécula MHC de classe I, (b) provoca uma resposta de células T que representa mais de 50 "spots" específicos para o péptido por 101 2 3 células, medidos num ensaio ELISPOT efectuado após pré-estimulação in vitro; ou que representa mais de 50 "spots" específicos para o péptido por 106 células, medidos num ensaio ELISPOT efectuado (i) sem pré-estimulação in vitro; ou (ii) utilizando PBL de um indivíduo que não foi submetido a imunoterapia contra uma doença neoplásica, ou (c) é capaz de activar o crescimento de células T in vitro, de modo que mais de 103 CTL específicos para o antigénio podem ser recolhidos após quatro ciclos de estimulação, partindo de 104 PBMC. 1 Fragmento de polipéptido de acordo com a 2 reivindicação 2, em que o referido valor C50 é inferior a 3 100 . ΕΡ 1 618 13 Ο/PT 2/5
  3. 4. Fragmento de polipéptido de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que o referido valor C50 é inferior a 31.
  4. 5. Fragmento de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, em que o referido valor C5o é inferior a 5.
  5. 6. Fragmento de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido fragmento de polipéptido consiste no máximo em 10 aminoácidos consecutivos.
  6. 7. Método ex vivo de selecção de um péptido compreendendo um fragmento de ML-IAP para utilização numa composição de vacina, em que o referido método compreende as etapas de (i) fornecer um fragmento de polipéptido compreendendo um péptido, consistindo em pelo menos 9 resíduos de aminoácidos consecutivos de ML-IAP (SEQ ID N.° 1) e seleccionado entre 0 grupo constituído por RLQEERTCK (SEQ ID N. 0 245) , QILGQLRPL (SEQ ID N. 0 55) , LTAEVPPEL (SEQ ID N. 0 100) , GMGSEELRL (SEQ ID N. 0 84) , ELPTPRREV (SEQ ID N . 0 200 ) , RLQEERTCKV (SEQ ID N.° 297), QLCPICRAPV (SEQ ID N.0 298), LLRSKGRDFV (SEQ ID N.0 300), VLEPPGARDV (SEQ ID N . 0 301 ) e PLTAEVPPEL (SEQ ID N.° 302), em que o referido fragmento de polipéptido consiste no máximo em 15 aminoácidos, (ii) testar as respostas de células T específicas contra fragmentos de ML-IAP por meio de um ensaio ELISPOT, utilizando linfócitos de sangue periférico (PBL) isolados derivados de um indivíduo que não foi previamente imunizado com ML-IAP ou um seu fragmento, e (iii) seleccionar fragmentos de ML-IAP em que a referida resposta de células T corresponde a um critério de selecção predeterminado ou é melhor que este.
  7. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido critério de selecção predeterminado consiste em mais ΕΡ 1 618 130/PT 3/5 de 50 "spots" específicos para o péptido por 106 células no referido ensaio ELISPOT.
  8. 9. Fragmento de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para utilização como um medicamento.
  9. 10. Fragmento de polipéptido de acordo com a reivindicação 9, para utilização como medicamento para o tratamento do cancro ou de uma doença auto-imune relacionado ou mediado por ML-IAP.
  10. 11. Composição de vacina compreendendo pelo menos um fragmento de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, juntamente com um transportador e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
  11. 12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, compreendendo um adjuvante seleccionado entre o grupo constituído por Monatanide ISA-51 e QS-21.
  12. 13. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, compreendendo células dendríticas como transportador.
  13. 14. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, compreendendo mais de um fragmento de polipéptido diferente, em que o referido fragmento de polipéptido é seleccionado entre o grupo especificado na reivindicação 1.
  14. 15. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 12, compreendendo pelo menos dois fragmentos de polipéptido diferentes, em que o referido fragmento de polipéptido é seleccionado entre o grupo especificado na reivindicação 1, em que cada um deles é capaz de se associar a uma molécula HLA diferente seleccionada entre o grupo constituído por HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B2 7 e HLA-B44.
  15. 16. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de vacina de acordo com qualquer uma das ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 4/5 reivindicações 11 a 15 e um medicamento anticanceroso seleccionado entre o grupo constituído por um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico.
  16. 17. Kit de partes compreendendo (i) uma composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15 e (ii) um medicamento anticanceroso seleccionado entre o grupo constituído por um agente quimioterapêutico ou um agente imunoterapêutico.
  17. 18. Utilização de um ou mais fragmentos de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou de uma composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, ou de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, ou de um kit de partes de acordo com a reivindicação 17, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento do cancro ou de uma doença auto-imune relacionado ou mediado por ML-IAP num indivíduo.
  18. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que pelo menos um dos referidos fragmentos de polipéptido é restrito a uma molécula HLA presente no referido indivíduo.
  19. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que o referido indivíduo não foi previamente submetido a imunoterapia contra uma doença neoplásica.
  20. 21. Anticorpo capaz de reconhecimento específico de um fragmento de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  21. 22. Método de activação e de expansão de células T específicas para ML-IAP ou seus fragmentos, compreendendo as etapas de co-cultura das células T com um ou mais fragmentos de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  22. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o método compreende (a) a geração e a carga de células dendríticas (DC) derivadas de monócitos com o(s) referido(s) fragmento (s) ΕΡ 1 618 130/ΡΤ 5/5 de polipéptido e a co-cultura das referidas DC com monócitos de sangue periférico (PBMC) compreendendo células T ou (b) a geração de células de Drosphila melanogaster expressando uma ou mais moléculas HLA diferentes, a carga das referidas células de Drosophila melanogaster com o(s) referido(s) fragmento(s) de polipéptido e a co-cultura das referidas células de Drosphila com monócitos de sangue periférico (PBMC) compreendendo células T ou com células T purificadas a partir de PBMC.
  23. 24. Utilização de células T especificas para ML-IAP obtidas pelo método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento do cancro ou de uma doença auto-imune. Lisboa, 2013-06-25
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