JP2003512071A5 - - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 ルシフェラーゼ活性を有し、野生型ルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有する組換えタンパク質であって、該酵素の配列においてＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基が、対応する野生型ルシフェラーゼと比較して変異しており、その結果このルシフェラーゼ酵素が、対応する野生型ルシフェラーゼと比較して異なる波長の光を発することができ、および／または対応する野生型ルシフェラーゼと比較して熱安定性が向上している、前記組換えタンパク質。
【請求項２】 前記野生型ルシフェラーゼ配列が、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ、Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ、Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ、ＰｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘまたはＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａからのルシフェラーゼのものである、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】 前記野生型ルシフェラーゼ配列が、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの酵素から得られる酵素の配列である、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】 前記野生型ルシフェラーゼ配列が、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ、Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａまたはＰｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏからのルシフェラーゼのものであり、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸またはグルタミン酸以外である、請求項１または請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】 前記野生型ルシフェラーゼ配列が、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａからのルシフェラーゼのものであり、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基がバリン以外である、請求項１または請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸またはバリン以外である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】 前記野生型ルシフェラーゼ配列が、Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘからのルシフェラーゼであり、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外である、請求項１または請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、セリンまたはスレオニンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基３５７に対応するアミノ酸残基がチロシンである、請求項８に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】 タンパク質がＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓからのルシフェラーゼと少なくとも８０％の類似性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】 野生型ルシフェラーゼと比較して、少なくとも１つの以下の変異を有するタンパク質であって、
（ａ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸３５４（Ｌｕｃｉｏｌａルシフェラーゼ中の３５６）に対応するアミノ酸残基が変異している；
（ｂ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の２１５位（Ｌｕｃｉｏｌａルシフェラーゼ中の２１７位）に対応するアミノ酸残基が、異なる疎水性アミノ酸である；あるいは
（ｃ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基２１４、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼの残基２１６に対応するアミノ酸残基；
（ｄ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基２３２、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼの残基２３４に対応するアミノ酸残基；
（ｅ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基２９５、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼの残基２９７に対応するアミノ酸残基；
（ｆ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中のアミノ酸１４、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａの残基１６、またはＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの残基１６に対応するアミノ酸残基；
（ｇ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中のアミノ酸３５、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａの残基３７、またはＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの残基３８に対応するアミノ酸残基；
（ｈ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａの残基１０６、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａの残基１０７もしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ遺伝子の残基１０８に対応するアミノ酸残基；
（ｉ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの残基２３６に対応するアミノ酸残基；
（ｊ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの残基４２２に対応するアミノ酸残基；
（ｋ）Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓの残基３１２に対応するアミノ酸残基、
が対応する野生型配列中に見出されるアミノ酸とは異なっており、ルシフェラーゼ酵素が、対応する野生型ルシフェラーゼのこの位置でのアミノ酸を有する酵素と比較して増大した熱安定性を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸３５４（Ｌｕｃｉｏｌａルシフェラーゼ中の３５６）に対応するアミノ酸残基が変異している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ中の残基２１４、またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼの残基２１６に対応するアミノ酸残基が、異なる疎水性アミノ酸に変異している、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のルシフェラーゼをコードしている核酸。
【請求項１５】 合成遺伝子を含む請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】 特定の発現宿主用にコドンの使用を最適化し、および／または独特の制限部位を導入した、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】 配列番号１のヌクレオチド９〜１６６１、またはそれと少なくとも９０％の類似性を有する配列を含む、請求項１４または請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】 請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】 請求項１８に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項２０】 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質を生成するための方法であって、請求項１９に記載の細胞の培養を含む、前記方法。
【請求項２１】 生物発光アッセイにおける、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２２】 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質を含むキット。
【請求項２３】 ルシフェリンをさらに含む請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】 サンプル中のＣｏＡの存在を判定するためのアッセイであって、ＣｏＡを含む疑いのあるサンプルに、前述の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のルシフェラーゼと共にルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を引き起こすのに必要とされる他の試薬を加えること、サンプルから発せられる光の波長を測定すること、及びこれをＣｏＡの存在または不在と関連付けること、を包含する、前記アッセイ。
【請求項２５】 糖尿病の診断に使用するための請求項２４に記載のアッセイ。