JP2003510254A - 核酸単離方法およびキット - Google Patents
核酸単離方法およびキットInfo
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Abstract
Description
えばDNAおよびRNA)の単離および精製は、遺伝子研究、核酸プローブ診断
学、法医学DNA試験、およびその他の分野において重要な作業である。二本鎖
DNAからの一本鎖DNAの分離、および非結合核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブからの結合核酸プローブの分離は、これらの分野で重要な技術である。核
酸を調製するための様々な方法が技術分野で既知であるが、それぞれに限界があ
る。
性の化学薬品の使用を要し、容易に自動化できない。核酸の精製には固相抽出も
使用されている。例えばBoomら(米国特許番号第5,234,809号)は
、核酸を核酸源から単離する方法について述べており、そこでは反応容器中のチ
オシアン酸グアニジニウムなどの緩衝化カオトロピック剤にシリカ粒子懸濁液を
混合し、続いてサンプルを添加して完全に混合する。カオトロープの存在下で核
酸はシリカに吸収され、それは遠心分離によって液相から分離され、アルコール
−水混合物で洗浄されて、最終的に希水性緩衝液を使用して溶出される。シリカ
固相抽出は、核酸を溶出せずに残留カオトロープを除去するために、アルコール
洗浄のステップを必要とする。しかし引き続くステップで核酸の増幅または改質
のために使用される損傷を受けやすい酵素の阻害を防止するため、アルコールの
あらゆる痕跡を(加熱蒸発によって、または別の非常に揮発性で引火性の溶剤で
の洗浄によって)非常に注意深く除去しなくてはならない。
ン交換法では、高品質の核酸が製造される。しかしこれらからは高レベルの塩の
存在が帰結し、それらは核酸がさらに利用できるようになる前に、除去されなく
てはならない。
る。それはまた、表面に付着する核酸量の低下方法も提供する。一実施態様では
、方法は、ポリプロピレン粉末およびポリテトラフルオロエチレンフィブリルな
どの疎水性有機ポリマー材料に核酸を付着させて、このような疎水性材料から非
イオン性界面活性剤によって核酸を除去する(例えば溶出する)ことを伴う。別
の実施態様では、非イオン性界面活性剤を使用して疎水性表面を処理し、疎水性
表面への核酸の付着を低下させ、そして好ましくは防止する。
るためのアッセイで有用である。このようなアッセイは、疾病の予測および診断
、法医学、疫学、および公衆衛生において重要である。例えば単離したDNAを
ハイブリダイゼーションおよび/または増幅の対象とし、個人における感染性ウ
イルスまたは突然変異遺伝子の存在を検出し、個人が感染性または遺伝性疾患に
かかる確率を求められるようにする。スクリーニングする数百、数千個のサンプ
ル中の1個のサンプルで感染性ウイルスまたは突然変異を検出する能力は、例え
ばHIV感染、癌、または癌に対する羅病性などの疾病のリスクを持つ観察集団
の早期診断または疫学において、あるいは早期検出が診断と治療に役立つかもし
れない新生児の疾病スクリーニングにおいて、かなりの重要性を持つ。さらに方
法は、培養細胞または生化学反応から核酸を単離するために、基礎研究所でも使
用できる。核酸は制限酵素消化、ベース配列決定、および増幅などの酵素による
変性のために使用できる。
えばDNA、RNA、PNA)を含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入
して、標的核酸の少なくとも一部を固相に付着するステップと、非イオン性界面
活性剤を固相に適用して、付着した標的核酸の少なくとも一部を除去するステッ
プと、を含む。好ましくはサンプルは、例えば細胞を含む生物学的サンプルであ
る。特定の実施態様では、生物学的サンプル導入に先立って、方法は、細胞を溶
解して、細胞の内容物を核酸を含む溶解産物として放出するステップを含む。
マー固相に導入して、固相に核酸を付着するのを助けるステップをさらに含む。
好ましくはサンプルを導入するのに先立って、結合緩衝液が導入される。特定の
実施態様では、方法は、付着した核酸を有する固相を洗浄して、サンプルの非核
酸成分を除去するステップをさらに含む。このような洗浄は、典型的に添加され
た塩を含む洗浄緩衝液で実施される。
のフッ素化されたポリマーを含む。より好ましくは、それはポリエチレンまたは
ポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。非イオン性界面活性剤は、好まし
くはポリオキシエチレン界面活性剤であり、そしてより好ましくはポリオキシエ
チレン−コ−オキシプロピレン界面活性剤である。
本鎖DNAを含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入して、二本鎖DNA
の少なくとも一部を固相に付着するステップと、付着した二本鎖DNAを有する
固相を洗浄して(一本鎖DNAを含む)サンプルの非二本鎖DNA成分を除去す
るステップと、非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した二本鎖DNA
の少なくとも一部を除去するステップと、を含む。このようにして本発明の方法
は、様々なタイプの核酸の分離を含む。
好ましくは防止する)方法も提供する。方法は、非イオン性界面活性剤を疎水性
有機ポリマー表面に適用するステップと、表面を溶剤(水、またはその中に界面
活性剤が溶解するようなその他の溶剤)で洗浄するステップと、核酸を含むサン
プルを表面に接触させるステップと、を含む。
一部を固相から除去できる非イオン性界面活性剤を含むキットも提供する。好ま
しくはキットは、さらに通過レセプタクル(flow−through rec
eptacle)も含む。
プラスミド、比較的短いオリゴヌクレオチド、PNAとも称されるペプチド核酸
(Nielsenら著、Chem.Soc.Rev.、26、73〜78ページ
(1997)で述べられたような)などをはじめとするがこれに限定されるもの
ではない、多種多様な形状のDNAおよびRNAの双方を指す。
れた核酸を指す。これはオリジナルサンプル中のオリジナル溶剤以外の他のあら
ゆる材料を必ずしも除去することなく、所望の核酸を単純に濃縮することを含む
。これは例えばタンパク質、脂質、塩などの細胞成分のような、その他の材料か
ら所望の核酸を分離することも含む。より好ましくは単離した核酸は、実質的に
精製されている。「実質的に精製された」とは、例えばタンパク質、脂質、また
は塩などの細胞成分混入物の除去に関して少なくとも50%、好ましくは少なく
とも80%、そしてより好ましくは少なくとも95%純粋な核酸を指す。これら
の百分率は、標的核酸とその他の(非標的)核酸、およびサンプル中の溶剤以外
の例えばタンパク質、脂質、塩などの細胞成分などの混入物の総量に対する、標
的核酸(例えばDNA、RNA、PNA)の量を指す。したがって「実質的に精
製された」という用語は、概して、単離した核酸の引き続く使用に干渉できる化
合物が除去されるように、サンプルから細胞成分または反応混入物の大部分を分
離することを指す。
用、静電的相互作用、親和結合、または物理的捕捉などの弱い力をはじめとする
、多種多様な機序を通じた可逆結合を指す。この用語の使用は作用機序を暗示せ
ず、吸着性および吸収性の機序を含む。
たは合成起源の有機化合物でも良い、反復単位からできたポリマーを指す。これ
は、ホモポリマーおよびヘテロポリマー(例えばランダムでもブロックでも良い
共重合体、三元共重合体、四元共重合体など)を含む。疎水性ポリマーは、水の
表面張力よりも小さい(例えば約72ダイン/cm未満)、そして好ましくはナ
イロンの臨界表面張力よりも小さい(例えば約43ダイン/cm未満)臨界表面
張力を有する。この用語は、技術分野で周知の方法によって容易に調製できる、
繊維または粒子形態のポリマーを含む。このような材料は典型的に多孔性マトリ
ックスを形成するが、特定の実施態様では、固相は有機ポリマー材料の非多孔性
シートなどの固形表面も指す。
を指す。「非イオン性界面活性剤」とは、極性基が荷電していない界面活性剤分
子を指す。
性有機ポリマー材料に核酸が付着し、このような疎水性材料から非イオン性界面
活性剤によって核酸が効果的に除去できることが見いだされた。さらにプラスチ
ックシートなどの疎水性有機ポリマー表面を処理して、疎水性表面に対する核酸
の付着を低下させ、好ましくは防止するのに非イオン性界面活性剤が使用できる
。
、尿、唾液)、種々の組織、細胞培養物などの生物学的サンプルから核酸を単離
できる。サンプルのタイプは、本発明の限界ではない。生物学的サンプルは、生
物学または生化学起源のものである。本発明の方法で使用するのに適したものは
、哺乳類、植物、細菌、または酵母起源に由来することができる。生物学的サン
プルは、単細胞形態または組織形態であることができる。細胞または組織は、生
体外(in vitro)培養物に由来することができる。
物として細胞内容物を放出させる。ここでは溶解とは、外細胞膜、そして存在す
る場合は核膜を指す、細胞膜の物理的破壊である。これは煮沸、カオトロピック
剤処置、物理的破壊、または凍結/解凍などの標準技術を使用して実行できる。
典型的に細胞溶解産物から核酸を単離するためには、タンパク質を最初に除去す
ることが好ましい。これは、例えばアズラクトンビーズ(例えばミネソタ州セン
トポールの3M CompanyからEMPHAZE AB1ビーズとして市販
されるタイプ、またはPCT国際公開第94/00464号(3M Compa
ny)で開示されるタイプ)で処理して、あるいはタンパク質が正電荷を保持す
るように十分低いpHで、サンプルをカチオン交換膜またはカラムに通過させて
実施できる。
混入物から濃縮または分離して)核酸を単離しても良い。極めて不純なサンプル
から核酸を単離することもできるので、オリジナルのサンプルの純度は重要でな
い。例えば血液、唾液、または組織などの生物学的液体の不純なサンプルから、
核酸を除去することもできる。より高純度のオリジナルサンプルが所望されるな
らば、発明に従った単離に先立って、当業者に既知のあらゆる従来手段に従って
サンプルを処理しても良い。例えば核酸の単離に先立って、不溶物などの特定の
不純物を除去するようにサンプルを処理できる。
態、二本鎖形態、環状、プラスミドなどの形態でも良い。様々なタイプの核酸が
互いに分離できる(例えばDNAからRNA、または一本鎖DNAから二本鎖D
NA)。例えば本発明の方法を使用して、約10〜約50ベース長の小さなオリ
ゴヌクレオチドまたは核酸分子、約1000ベース〜約10,000ベース長の
はるかに長い分子、そして約50kb〜約500kbのさらに高分子量の核酸が
単離できる。態様によっては発明に従って単離した核酸が、好ましくは約10ベ
ース〜約100,000キロベースの範囲でも良い。
、多種多様な容積であっても良い。例えば適用される容積は、1L程度に大きく
ても1μL程度に小さくても良い。それはその中で非常に小さな容積(1μL未
満)が使用されるミクロ流体形式(いわゆる「基板上の実験室」lab on
a chip)で使用することもできる。ここで述べたようにして固相マトリッ
クスに適用された核酸は、いかなる量でも良く、その量は固相の量によって定ま
る。好ましくは固相に適用される核酸の量は、典型的に固相乾燥重量の約1/1
0,000〜約1/100(核酸重量/固相重量)未満である。固相に適用され
る核酸の量は、例えば100g程度に大きくてもあるいは1pg程度に小さくて
も良い。
約70%、そして最も好ましくは約90%の量、または元々固相に適用された所
望の核酸の量を越える。したがって本発明の方法は、サンプルからの所望または
標的核酸の高回収率を提供する。さらに発明に従って、極めて少量の核酸分子を
定量的に回収しても良い。回収率または収量は、手順それ自体でなく、主にサン
プルの質に左右される。発明は大容量からの濃縮を必要としない核酸調製品を提
供するので、発明により核酸損失のリスクが回避される。
ー固相材料に添加されるが、このレセプタクルは必ずしも必要ない。次に核酸が
、疎水性有機ポリマー固相材料に付着する。好ましくは、標的核酸を含有するサ
ンプルと共に、またはそれに先立って添加できる結合緩衝液を使用して、核酸の
結合を増強しても良い。このような緩衝液としては、典型的に核酸と相溶性で、
約3〜11のpHを有する標準生物学的緩衝液が挙げられる。例としては、AM
PSO(3−[(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸(#A7585、Sigma Chemical
Co、ミズーリ州63178セントルイス)、MES(2−[N−モルホリノ]
エタンスルホン酸)(#M5287、Sigma Chemical Co、ミ
ズーリ州63178セントルイス)。またはPBS(リン酸緩衝食塩水)(典型
的に約20ミリモル(mM)の塩濃度)が挙げられる。結合緩衝液は典型的に添
加された塩も含み、疎水性結合を促進する。例としては、例えば約400mMあ
るいは1モルまでの濃度のリン酸、過塩素酸、クエン酸、または硫酸のナトリウ
ム塩が挙げられる。好ましくは、次に例えば緩衝液で核酸/固相材料を洗浄して
、付着した核酸から、消化されたタンパク質、脂質、およびその他の不要な細胞
成分などの非結合材料を分離する。この洗浄緩衝液は、典型的に核酸適合性で、
典型的にpH範囲が約3〜約11の生物学的緩衝液である。望ましくない材料を
除去するのに適した洗浄緩衝液の例としては、結合緩衝液について上で列挙した
ものが挙げられる。このような緩衝液は、結合緩衝液について上で列挙したもの
などの添加された塩を含んでも含まなくても良い。これらの材料を除去した後、
例えば上で列挙したもの(添加された塩なしの)などの溶出緩衝液中にある非イ
オン性界面活性剤で(溶出などによって)固相材料から除去することで、核酸を
回収しても良い。この好ましい方法を使用することで、回収される核酸は実質的
に純粋で濃縮され、引き続く実験(例えばベース配列決定実験)で即座に使用す
るのに適する。
る多種多様な有機材料であっても良い。適切なポリマーの例としては、例えばポ
リオレフィンおよびフッ素化されたポリマーが挙げられる。固相材料は、使用に
先立って典型的に洗浄されて、塩およびその他の混入物が除去される。これは乾
燥状態で、あるいは即座に使用できる水性懸濁液中で保管できる。固相材料は好
ましくは、例えばピペット、シリンジ、または大型カラム、微量定量プレート、
またはミクロ流体装置などの通過レセプタクル中で使用されるが、このようなレ
セプタクルが関与しない懸濁方法を使用することもできる。
多様な材料を含むことができる。例えばそれは、遊離または固定でも良い粒子、
繊維、微孔質フィルム、または膜の形態であることができる。本発明の通過用途
のためには、このような材料は典型的に多孔性マトリックスの形態でも良い。好
ましくはこのような用途のためには、固相材料は、例えばグラム当たり1平方メ
ートル(m2/g)を超えるなどの比較的大きな表面積を有する。核酸付着防止
のための固体表面の前処理などの通過装置の使用が関与しない用途では、固相材
料が多孔性マトリックス中にあってもなくても良い。
良いフィブリルマトリックスを含む。フィブリルマトリックスおよび粒子の双方
を使用する場合、少なくともその片方は疎水性であり、所望の(すなわち標的)
核酸を結合できる。フィブリルマトリックスは、多種多様な繊維のいずれでも含
むことができる。典型的に繊維は、水性環境では不溶性である。例としては、ガ
ラス繊維と、特にポリプロピレンおよびポリエチレンマイクロファイバー、アラ
ミド繊維などのポリオレフィン繊維と、特にポリテトラフルオロエチレン繊維な
どのフッ素化されたポリマーと、天然セルロース系繊維とが挙げられる。核酸結
合に対して活性でも不活性でも良い、繊維の混合物も使用できる。好ましくはフ
ィブリルマトリックスは、厚さが少なくとも約15μmで約1mm以下であり、
より好ましくは約500μm以下のウェブを形成する。
料からできていても良いし、あるいは被覆された粒子などのように材料の組み合
わせからできていても良い。それらは膨潤性または非膨潤性であることができる
が、それらは好ましくは水および有機液体中で非膨潤性である。好ましくは粒子
が付着する場合、それは非膨潤性で疎水性の材料からできている。それらは標的
核酸への親和性で選択できる。いくつかの水膨潤性粒子の例は、米国特許番号第
4,565,663号(Erredeら)、第4,460,642号(Erre
deら)、および第4,373,519号(Erredeら)で述べられている
。水中で非膨潤性の粒子については、米国特許番号第4,810,381号(H
agenら)、第4,906,378号(Hagenら)、第4,971,73
6号(Hagenら)、および第5,279,742号(Markellら)で
述べられている。好ましい粒子は、ポリプロピレン粒子(例えば粉末)などのポ
リオレフィン粒子である。核酸結合に対して活性または不活性の粒子の混合物も
使用できる。
不溶性の非膨潤性材料である。コーティングは、それに核酸が付着するものであ
ってもなくても良い。このようにして被覆されたベース粒子は、無機物または有
機物であることができる。ベース粒子は有機基が共有結合する、シリカ、アルミ
ナ、チタニア、ジルコニアなどの無機酸化物を含むことができる。例えば異なる
鎖長の脂肪族(C2、C4、C8、またはC18基)などの共有結合する有機基
が使用できる。
79,742号(Markellら)、第4,906,378号(Hagenら
)、第4,153,661号(Reeら)、第5,071,610号(Hage
nら)、第5,147,539号(Hagenら)、5,207,915号(H
agenら)、および第5,238,621号(Hagenら)で述べられてい
る。ポリテトラフルオロエチレンマトリックス(PTFE)を含むものが特に好
ましい。
ら)で述べられた手順に従って調製できる。手短には、これは固形物の吸収能を
上回るのに十分な潤滑水の存在下でパテ状稠度を維持しながら、微粒子材料をポ
リテトラフルオロエチレン水性分散液に混合するステップと、約50℃〜約10
0℃の温度でパテ状塊を激しく混合して、ポリテトラフルオロエチレン粒子の最
初のフィブリル化を引き起こすステップと、パテ様塊を二軸圧延して、同一含水
量を保持しながらポリテトラフルオロエチレン粒子の追加的なフィブリル化を引
き起こすステップと、得られるシートを乾燥するステップと、を伴う。
フィブリルによって結合し多様な間隔で無作為に分散した、不均一な形の熱可塑
性ポリマーの等軸粒子によって特徴づけられる、微孔質構造を有する。粒子は互
いに間が開いており、その間に微細孔の網目状組織を提供する。粒子は、各粒子
から隣接する粒子に放射状に広がるるフィブリルによって相互に結合する。粒子
またはフィブリルの一方、または両方が、疎水性であって核酸を付着させても良
い。このような材料の好ましい例は、Hg表面積技術による測定で40m2/g
程度の高表面積を有し、約5μmまでの孔径を有する。
ることができる。これは均質な混合物を形成するのに十分な温度で、熱可塑性ポ
リマーを非混和液に溶融混合するステップと、溶液から製品を所望の形に成形す
るステップと、液体とポリマーの相分離を誘起するように成形製品を冷却するス
テップと、究極的にポリマーを固化して液体のかなりの部分を除去し、微孔質ポ
リマーマトリックスを残すステップと、を伴う。この方法および好ましい材料に
ついては、米国特許番号第4,726,989号(Mrozinski)、第4
,957,943号(McAllisterら)、および第4,539,256
号(Shipman)で詳細に述べられている。このような材料は熱誘起相分離
膜(TIPS膜)と称され、特に好ましい。
の間に使用する塩の濃度(ここで結合緩衝液と称する緩衝液の使用を通じて調節
できる)、または溶出ステップ中に使用する塩の濃度(ここで溶出緩衝液と称す
る緩衝液の使用を通じて調節できる)によって調節できる。所望するならば典型
的に約3〜約11のpH範囲内である結合および溶出緩衝液を使用して、異なる
形態の核酸を分離できる。固相次第では結合と溶出緩衝液の性質によって、異な
るタイプの核酸の結合が調節できる。リン酸塩などの高濃度の塩は、概してポリ
プロピレン微粒子などの固形担体の結合能を増大させる。場合によっては、これ
は異なる形態の核酸を分離するのに使用できる。
、十分な濃度の1つ以上の非イオン性界面活性剤を含む。核酸を遊離するのに好
ましい溶液は、水およびpHを維持するためにPBSなどの最小量の緩衝液、お
よび最小量の非イオン性界面活性剤を含む。この最小量は、どの非イオン性界面
活性剤が使用されるかによって決まる。PLURONIC F68では、この量
は約0.06mM以上である。概して効率的な溶出に必要な非イオン性界面活性
剤濃度は、その界面活性剤に対する臨界ミセル濃度(すなわち、例えば界面活性
剤分子の超顕微鏡的凝集などのミセルを作るのに必要な、水中界面活性剤の最小
濃度)よりも高くなくてはならない。核酸が固形担体から脱着するのに十分な時
間があれば、溶出流量は重要でない。
えばポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、カルボン
酸アミド界面活性剤などが挙げられる。市販される非イオン性界面活性剤として
は、n−ドデカノイルスクロース、n−ドデシル−β−D−グルコピラノシド、
n−オクチル−β−D−マルトピラノシド、n−オクチル−β−D−チオグルコ
ピラノシド、n−デカノイルスクロース、n−デシル−β−D−マルトピラノシ
ド、n−デシル−β−D−チオマルトシド、n−ヘプチル−β−D−グルコピラ
ノシド、n−ヘプチル−β−D−チオグルコピラノシド、n−ヘキシル−β−D
−グルコピラノシド、n−ノニル−β−D−グルコピラノシド、n−オクタノイ
ルスクロース、n−オクチル−β−D−グルコピラノシド、シクロヘキシル−n
−ヘキシル−β−D−マルトシド、シクロヘキシル−n−メチル−β−D−マル
トシド、ジギトニン、および商品名PLURONIC、TRITON、TWEE
Nの下に市販されるもの、ならびにKirk Othme Technical
Encyclopediaに列挙される市販されるその他の多くが挙げられる
。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレン界面活性剤である。より好ましい
界面活性剤は、ポリオキシエチレン−コ−オキシプロピレン界面活性剤である。
るステップが提供される。この実施態様では、固相材料から遊離された実質的に
精製された核酸を含有する、全溶出液または溶出溶液のアリコートのどちらかの
除去を伴う、回収率方法が考察された。このようなアリコートは、当業者に既知
の様々な分析および合成技術の対象にできる。
c.(マサチューセッツ州01730ベッドフォード)、Bio−Rad,In
c.(カリフォルニア州94547ハーキュリーズ)、Osmonics,In
c.(マサチューセッツ州01581ウェストバラ)、およびWhatman,
Inc.(ニュージャージー州07014クリフトン)などの会社が提供する標
準試験室フィルターホルダーおよびフィルター群が挙げられる。発明の方法は、
遠心分離、吸引、加圧をはじめとする手段によってフィルターを通る溶液移動を
容易にする(通過装置と称される)濾過装置内で実施できる。その他の装置とし
ては、微量定量プレートおよびミクロ流体装置が挙げられる。
スダーまたはスピンフィルターホルダーなどのフィルターホルダー、あるいは微
粒子材料を保持するための保持フリットが両端にあるカラム)、希釈なしまたは
溶液中の非イオン性界面活性剤、および核酸を結合、溶出する取扱説明書を含む
キットも提供する。好ましくは本発明は、その中に疎水性固相有機ポリマー材料
を有する通過レセプタクル、および非イオン性界面活性剤を含むキットを提供す
る。
る。しかし核酸との混合物中に非イオン性界面活性剤を含むJP 226868
2(Hitachi Ltd.)とは異なり、本発明の方法は、材料を界面活性
剤で前処理すること、好ましくは材料を洗浄してから材料を核酸に接触させるこ
とを伴う。
腺DNA(ミズーリ州14508セントルイスのSigma Chemical
Co.)であった。
イーデンプレーリーのATG Laboratoriesによって調製された。
これをpH6.8の10または400mMリン酸の緩衝液のどちらかに、約30
μg/mLの濃度で溶解した。
ルニア州94547ハーキュリーズのBio−Rad Co.から入手した。
ムおよびリン酸水素二カリウムから調製した。
ジー州07054パーシッパニーのBASF Corp.)。
、米国特許番号第4,906,378号実施例1の方法によって作った。
、米国特許番号第5,071,610号実施例1Aの方法によって作った。
市販される。
ン範囲の高表面積(グラム当たり40平方メートルまで)のポリマー膜である。
これらの実験で使用される膜は、ポリプロピレン(米国特許番号第4,726,
989号の実施例1〜4に従って作られた)またはポリエチレン(米国特許番号
第4,539,256号の実施例8Cに従って作られた)からできている。
ORE膜への導入の比較 HAPを以下のようにして従来のクロマトグラフィーカラムに導入した。真空
マニフォールド上に装着した標準2mLクロマトグラフィーカラム(カリフォル
ニア州94547ハーキュリーズのBio−Rad Co.)に、100mgの
HAPを入れた。これを3mLの500mMリン酸緩衝液、続いて5mLの50
mMリン酸緩衝液で洗浄した。これに引き続き50mMリン酸緩衝液中53μg
/mLのDNAを1mLカラムに加え、次にそれを2mLの50mMリン酸緩衝
液で洗浄し、1mLの300mMリン酸緩衝液で溶出した。各ステップからの濾
液を260nmでの吸光度(DNAの吸収極大)についてモニターした。
)の25mmディスク2個をシリンジフィルターホルダー中に配置して、高およ
び低濃度のリン酸緩衝液(3mLの500mMリン酸緩衝液、続いて5mLの5
0mMリン酸緩衝液)で洗浄した。これに続き50mMリン酸中22μg/mL
のDNAを2mLをディスクに適用し、それを次に2mLの50mMリン酸、続
いて2mLの300mMリン酸、続いて2mLの50mMリン酸、そして2mL
の1.0Mリン酸緩衝液で洗浄した。このときも260nmでの吸光度をモニタ
ーして、濾液中のDNAレベルを測定した。260nmでの吸光度として報告さ
れる結果は次のようであった。
度が300mMに上昇すると溶出された。しかしHAP添加EMPORE膜での
結果は予期しないものだった。DNAは低リン酸条件で付着したが、より高いリ
ン酸濃度でも溶出しなかった。引き続く実験からは400mMのリン酸で溶解し
ても、DNAがこの膜に付着することが示された。さらにX線回折調査からは、
膜に導入された際にHAPが変化しないことが示された。このような高リン酸濃
度ではDNAはHAP粒子でなく、EMPORE膜のポリテトラフルオロエチレ
ンフィブリルに結合性である。
ク1枚に、4mg/mLのPLURONIC F68を含有する約35μg/m
Lの50mMリン酸中のDNAを2mLを装入した。ディスクを4mg/mLの
PLURONIC F68を含有する2mLの50mMリン酸で洗浄し、続いて
4mg/mLのPLURONIC F68を含有する400mMリン酸の2mL
アリコートで2回洗浄した。濾液の260nm吸光度で測定されたように、DN
Aは完全に付着して50mMリン酸では溶出しなかったが、リン酸濃度を400
mMに上昇させると少なくとも90%が溶出した。
LのDNAを2mL装入して、2mLの50mMリン酸洗浄液で1回洗浄し、2
mLの400mMリン酸洗浄液で3回洗浄し、最後に4mg/mLのPLURO
NIC F68を含有する2mLの400mMリン酸洗浄液で2回洗浄した。こ
のときもDNAは膜に結合したが、膜が高濃度のリン酸緩衝液を含有するPLU
RONICで処理されるまでは、(より高いリン酸濃度でも)溶出しなかった。
260nmでの吸光度として報告される結果は次のようであった。
うに振る舞うが、不在の場合は、膜がDNAを溶出しないことを示す。
粉末ポリプロピレンから調製された、デラウェア州ウィルミントンのMonte
ll North America)およびC18添加EMPORE膜を使用し
た。双方の膜を、5mLのメタノール、続いて5mLの水、続いて5mLの40
0mMリン酸緩衝液で洗浄してプレコンディショニングした。チャレンジ(ch
allenge)溶液は、400mMリン酸緩衝液中におよそ60μg/mLの
子ウシ胸腺DNAであった。膜にこの溶液の1mLアリコートを2回適用し、続
いて1mLの400mMリン酸で4回洗浄し、そして1mLの50mg/mLP
LURONIC F68水溶液で4回洗浄した。濾液をDNAレベルについて2
60nmでモニターした。260nmでの吸光度として報告される結果は次のよ
うであった。
方に付着して、PLURONIC F68で脱着できることを示す。回収率はポ
リプロピレンでは90%近く、C18では約75%である。PLURONIC
L31、TWEEN 20、TERGITOL MN6、およびNONIDET
P40などのその他の非イオン性界面活性剤は、これらの条件下での核酸溶出
の促進において全てPLURONIC F68と同様に振る舞う。
性する。ほぼ室温に戻すと、DNAは非常にゆっくりdsDNAに戻る。以下の
実験では、10mMリン酸緩衝液中の50μg/mLのDNA溶液を二分した。
片方を10分間煮沸して室温に冷却し即座に試験する一方、別の半分は煮沸せず
にを直接試験した。ポリプロピレン添加EMPORE膜(MICROPRO 6
00ポリプロピレン粉末から調製した、ニューヨーク州タリータウンのMicr
o Powders,Inc.)のディスク(25mm径)をこれらの2種の溶
液でチャレンジ(challenge)して、濾液の260nmにおける吸光度
を測定して、どの程度のDNAが付着したかを求めた。
60nmにおける吸光度は煮沸前に1.014であり、煮沸直後には1.26で
あった。煮沸した(変性)および未変性溶液を使用してEMPORE膜をチャレ
ンジ(challenge)し、濾液の吸光度をモニターした。実施例3で述べ
たようにして、メタノール洗浄、続いて水、続いて10mMリン酸緩衝液によっ
て膜をコンディショニングした。260nmでの吸光度として報告される結果は
次のようであった。
)DNAより高い親和性を有する。この親和性の相違を使用して二本鎖DNAか
ら一本鎖DNAを分離できる。
の使用 以下の実験からプラスミドDNAがポリプロピレン添加EMPORE膜(MI
CROPRO 600ポリプロピレン粉末から調製される、ニューヨーク州タリ
ータウンのMicro Powders,Inc.)に付着でき、非イオン性界
面活性剤で溶出できることが示される。一例では溶出するプラスミドが、混入物
から分離される。
ノール、続いて5mLの水、続いてチャレンジ(challenge)緩衝液(
10または400mmリン酸、pH6.8)で洗浄してプライムした。シリンジ
の助けを借りて3mLのプラスミドDNA溶液を膜に通過させ、濾液を収集した
。次に10mMリン酸中の0.5%のPLUROINC F68(pH6.8)
の3mLを使用してプラスミドDNAを溶出した。次に開始チャレンジ(cha
llenge)溶液、濾液、および溶出液の260nmでの吸光度を測定した。
各溶液50μLを5μLの標準ゲルローディング染料(gel loading
dye)に混合した。次にアガロース電気泳動によって、この溶液5μLを分
析した。260nmでの吸光度として報告される結果は次のようであった。
チャレンジ(challenge)は全て付着し、濾液中には何も見られなかっ
た。膜をPLURONIC界面活性剤で溶出すると、ほぼ半分のプラスミドが回
収されたが、溶出プラスミドDNAの純度は、チャレンジ(challenge
)中とほぼ同じであった。10mM緩衝液中でチャレンジ(challenge
)すると、溶出液は、プラスミドを汚染していたより低分子量のバンドを含んだ
。溶出液は、今度は精製されたプラスミドを含有した。
出 ポリプロピレンTIPS膜(厚さ100μm、密度=0.153g/cm3)
から2.54cm径の円3個を切り取って、シリンジフィルターホルダー(マサ
チューセッツ州01581ウェストバラのMSI Inc.)に入れ、5mLの
メタノール、続いて5mLの水で洗浄した。pH7.2の100mMナトリウム
リン酸緩衝液中200μg/mLの子ウシ胸腺DNA溶液3mLをフィルターホ
ルダー内で重ねられたフィルターに通過させて、続いてリン酸緩衝液中10mg
/mLのPLURONIC F68非イオン性界面活性剤3mLを通過させた。
260nmでのUV吸光度を使用してこれらの溶液中のDNA量を求め、結果は
次のようであった。
ONIC F68溶液で溶出されることが示される。
ら2.54cm径の円を1個切り取って、シリンジフィルターホルダーに入れた
。膜を5mLのメタノール、続いて5mLの水で洗浄し、50mMのAMPSO
緩衝液(100mMの塩化ナトリウムを含有するpH9.0の(3−[(1,1
ジメチル−2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン
酸(#A7585、ミズーリ州63178セントルイスのSigma Chem
ical Co)緩衝液)中17μg/mLの子ウシ胸腺DNA、3mLでチャ
レンジ(challenge)した。次にフィルターを同一緩衝液中5mg/m
LのPLURONIC F68、3mLで溶出した。260nmでのUV吸光度
を使用してこれらの溶液中のDNA濃度を求た。
NIC F68で溶出できることが示された。
イオン洗剤がその中に溶解する同一緩衝液を使用して2回目の洗浄を行った。も
たらされた処理は、核酸が表面に付着するのを効果的にブロックした。2.54
cm径のポリプロピレンTIPS膜の円をフィルターホルダーに入れて、5mL
のメタノール、続いて5mLの水、5mLの100mM塩化ナトリウム添加AM
PSO緩衝液(20mM、pH9.0)中10mg/mLのPLURONIC
F68、そして最後に5mLの塩化ナトリウム添加AMPSO緩衝液で洗浄した
。次にそれを塩化ナトリウム添加AMPSO緩衝液中15μg/mLの子ウシ胸
腺DNAサンプル3mLで2回チャレンジ(challenge)した。260
nmでのUV吸光度を使用してDNA濃度を求めた。
液によるいくらかの希釈のために、チャレンジ(challenge)溶液より
も低い吸光度を有した。第2のサンプルは、チャレンジ(challenge)
とほぼ同量のDNAを有した。緩衝液がpH6.0の20mMのMES緩衝液(
2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸)(#M5287、ミズーリ州631
78セントルイスのSigma Chemical Co)であったこと以外は
、同一条件を使用してこの実験を繰り返した。結果は実質的に同じだった。これ
らの結果からは、PLURONIC F68などの非イオン洗剤が、核酸がそれ
に結合しないようにポリマー表面を不活性化できることが示される。この不活性
化は、非イオン性界面活性剤の溶剤である緩衝液でポリマー表面が洗浄された後
でさえ、持ちこたえる。
、5mLのメタノール、続いて5mLの蒸留水、続いてpH6.0の50mM
MES緩衝液5mLで洗浄した。同一MES緩衝液中の50μM/mLリボ核酸
(Sigma)2mLをフィルターの重なりに通過させた。次に重なりを2mL
のMES緩衝液で洗浄し、次にMES緩衝液中0.5%のPLURONIC F
68、2mLで溶出した。260nmでのUV吸光度によって、これら各段階の
RNA量をモニターした。
が、PLURONIC F68非イオン性界面活性剤によって、半分以上が溶出
した。
リゴマーでチャレンジ(challenge)し、次に非イオン性界面活性剤で
洗浄して溶出した。DNAオリゴマーは融解温度65.8℃の一本鎖DNAの2
2量体であり、テキサス州77380ウッドランズのGenosys Biot
echnologies,Inc.から購入した。それをここではOligo2
2と称する。3個の25mm径ポリプロピレンTIPS膜をシリンジフィルター
ホルダー内に重ねて5mLのメタノール、続いて5mLの水、そしてpH6.0
の50mM MES緩衝液5mLで洗浄した。次にフィルターの重なりをMES
緩衝液中38μg/mLのOligo22溶液2mLでチャレンジ(chall
enge)した。濾液を収集して、重なりを2mLのMES緩衝液、続いてME
S緩衝液中のPLURONIC F68非イオン性界面活性剤2mLで洗浄した
。チャレンジ(challenge)濾液および洗浄中のOligo22レベル
を260nmでのUV吸光度によってモニターした。
て、非イオン性界面活性剤によって溶出することが示された。
面活性剤による溶出 3個の1インチ径ポリプロピレンTIPS膜をフィルターホルダー内で重ねて
、5mLのメタノール、続いて5mLの蒸留水、続いてpH6.0の50mM
MES緩衝液5mLで洗浄した。次に同一MES緩衝液中の50μM/mLリボ
核酸(Sigma#R7125)2mLをフィルターの重なりに通過させた。次
に重なりを2mLのMES緩衝液で洗浄し、次にMES緩衝液中のモノステアリ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタン(Tween 60、#P1629、ミズー
リ州63178セントルイスのSigma Chemical Co.)2mL
で溶出した。これらの各段階のRNA量を260nmでのUV吸光度によってモ
ニターした。結果は次のようであった。
たが、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン非イオン性界面活性剤に
よって、半分以上が溶出した。
使用できないことが示される。
ウェストバロ)3個をシリンジフィルターホルダーに入れて、5mLの水、続い
てpH9.0の50mM AMPSO緩衝液5mLで洗浄した。次にフィルター
の重なりを2mLの50μg/mL RNA(Sigma Chemical
Co、ミズーリ州63178セントルイス)でチャレンジ(challenge
)し、次に2mLのAMPSO緩衝液、続いてAMPSO緩衝液中の0.5%P
LURONIC F68、2mLで洗浄した。260nmでのUV吸光度によっ
て、これらの各溶出液のRNA量をモニターした。pH6.0の50mM ME
S緩衝液を使用し、双方のpHでセルロースフィルター(Osmonics I
nc.)を使用して、この実験を繰り返した。
中にあり、残り(27μg)は最初の緩衝液洗浄中にあった。PLURONIC
F68洗浄液中にはRNAは見られなかった。pH9.0およびセルロースフ
ィルターで、同様の結果が得られた。これらの結果からは、核酸がこれらの親水
性膜に吸着されないことが示される。
Claims (32)
- 【請求項1】 標的核酸を含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入し
て、標的核酸の少なくとも一部を固相に付着するステップと、 非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した標的核酸の少なくとも一部
を除去するステップと、 を含むサンプルから核酸を単離する方法。 - 【請求項2】 サンプルが生物学的サンプルを含む、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項3】 生物学的サンプルが細胞を含む、請求項2に記載の方法。
- 【請求項4】 生物学的サンプルを導入するのに先立って、細胞を溶解して
細胞内容物を核酸を含む溶解産物として放出するステップを含む、請求項3に記
載の方法。 - 【請求項5】 生物学的サンプルが、全血、血清、尿、唾液、組織、または
細胞培養物を含む、請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 細胞が、哺乳類、細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞であ
る、請求項3に記載の方法。 - 【請求項7】 標的核酸がDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 【請求項8】 DNAが二本鎖DNAを含む、請求項7に記載の方法。
- 【請求項9】 DNAが一本鎖DNAを含む、請求項7に記載の方法。
- 【請求項10】 標的核酸がRNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 【請求項11】 標的核酸がPNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 【請求項12】 標的核酸がプラスミドDNAを含む、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項13】 添加された塩を含む結合緩衝液を疎水性有機ポリマー固相
に導入して、核酸を固相に付着させるのを助けるステップをさらに含む、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項14】 核酸を含むサンプルを導入するのに先立って、結合緩衝液
が導入される、請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 付着した標的核酸を有する固相を洗浄して、サンプルの非
核酸成分を除去するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 洗浄が、添加された塩を含む洗浄緩衝液によって洗浄する
ステップを含む、請求項15に記載の方法。 - 【請求項17】 疎水性有機ポリマー固相がポリオレフィンを含む、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項18】 ポリオレフィンがポリプロピレンを含む、請求項17に記
載の方法。 - 【請求項19】 ポリオレフィンがポリエチレンを含む、請求項17に記載
の方法。 - 【請求項20】 疎水性有機ポリマー固相がフッ素化されたポリマーを含む
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 フッ素化されたポリマーがポリテトラフルオロエチレンを
含む、請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン界面活性剤
の群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項23】 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−コ−オキ
シプロピレン界面活性剤の群より選択される、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 核酸がサンプルから実質的に精製された形態で収集される
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項25】 疎水性有機ポリマー固相が多孔性マトリックスの形態であ
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項26】 固相の表面積が、グラム当たり少なくとも約1平方メート
ルである、請求項24に記載の方法。 - 【請求項27】 二本鎖DNAを含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に
導入して、二本鎖DNAの少なくとも一部を固相に付着するステップと、 付着した二本鎖DNAを有する固相を洗浄して、サンプルの非二本鎖DNA成
分を除去するステップと、 非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した二本鎖DNAの少なくとも
一部を除去するステップと、 を含むサンプルから二本鎖DNAを単離する方法。 - 【請求項28】 洗浄が、添加された塩を含む洗浄緩衝液で洗浄するステッ
プを含む、請求項27に記載の方法。 - 【請求項29】 非イオン性界面活性剤を疎水性有機ポリマー表面に適用す
るステップと、表面を溶剤で洗浄するステップと、核酸を含むサンプルを表面に
接触させるステップと、を含む、疎水性有機ポリマー表面に付着する核酸の量を
減少させる方法。 - 【請求項30】 ポリマー表面が水で洗浄される、請求項29に記載の方法
。 - 【請求項31】 核酸が付着する疎水性有機ポリマー固相、および核酸の少
なくとも一部を固相から除去できる非イオン性界面活性剤を含むキット。 - 【請求項32】 通過レセプタクルをさらに含む、請求項31に記載のキッ
ト。
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