JP2003508347A - Compositions and methods for extending lifespan - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＥＦ−２キナーゼの特異的な抑制は、行動、発育および生殖に有害な影響を及ぼすことなく寿命を有意に延ばすという結果になる。さらに、該酵素の抑制は加齢速度を低下させ、性的に活動的な寿命の期間を２倍以上延ばすという結果になる。該酵素活性の抑制はタンパク質代謝回転の全体としての増大という結果となり、これは加齢速度の低下および寿命の延長と正の相関をなしていた。   (57) [Summary] Specific inhibition of EF-2 kinase results in significantly prolonged lifespan without adverse effects on behavior, development and reproduction. In addition, inhibition of the enzyme results in a reduction in the rate of aging and more than doubles the duration of sexually active lifespan. Inhibition of the enzyme activity resulted in an overall increase in protein turnover, which was positively correlated with decreased aging rate and extended lifespan.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （技術分野） 本発明は、加齢の生理学の分野に関し、寿命を延ばす組成物および方法の開発
に関する。とりわけ本発明は、加齢プロセスを遅延し、寿命を延ばす手段として
タンパク質代謝回転に関与する酵素の操作に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the field of physiology of aging and relates to the development of compositions and methods for prolonging life. In particular, the invention relates to the engineering of enzymes involved in protein turnover as a means of delaying the aging process and prolonging life.

【０００２】 （背景技術） 本明細書で種々の科学的および学問的な論文を括弧内に言及してある（番号に
より、または著者の名前および日付により）。これら論文は、本発明が関係する
技術分野の状態を記載するために本明細書に参照のため引用される。参照文献の
完全な引用は本明細書の最後に記載してある。BACKGROUND OF THE INVENTION Various scientific and academic articles are referred to herein in parentheses (by number or by author's name and date). These articles are incorporated herein by reference to describe the state of the art to which this invention pertains. Full citations for references are provided at the end of the specification.

【０００３】 障害を受けた細胞タンパク質の蓄積は、加齢を示す衰えの主たる誘因であると
提唱されている^１。タンパク質の合成速度および分解速度の両者の低下は欠陥の
あるかまたは修飾されたタンパク質の持続という結果となり、それゆえタンパク
質代謝回転の全体としての速度は加齢の速度に影響を及ぼし得る。それゆえ、タ
ンパク質代謝回転を制御する因子は加齢を制御するうえで重要である。Accumulation of damaged cellular proteins has been proposed to be the major contributor to age-related decline ¹ . A decrease in both the rate of protein synthesis and the rate of degradation results in the persistence of defective or modified proteins, and thus the overall rate of protein turnover can influence the rate of aging. Therefore, factors that control protein turnover are important in controlling aging.

【０００４】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） 最近発見されたプロテインキナーゼのクラス（αキナーゼ；１９９７年８月２
０日に出願の米国特許出願第０８／９１４,９９９に開示、参照のため本明細書
に引用する）の基本型の成員は、延長因子２キナーゼ（ＥＦ−２キナーゼ）であ
る。延長因子２（ＥＦ−２）は翻訳に必須の因子である。ＥＦ−２キナーゼは偏
在するプロテインキナーゼであり、ＥＦ−２をリン酸化し不活化することができ
る。ＥＦ−２のリン酸化はタンパク質合成の制御に関与していることが提唱され
ている。しかしながら、ＥＦ−２キナーゼおよびＥＦ−２のリン酸化の正確な生
理はこれまでにわかっていない。(Disclosure of the Invention) (Technical Problems to be Solved by the Invention) Recently discovered class of protein kinases (α kinase; August 2, 1997)
A prototypical member of U.S. patent application Ser. No. 08 / 914,999, filed 0, incorporated herein by reference) is the elongation factor 2 kinase (EF-2 kinase). Elongation factor 2 (EF-2) is an essential factor for translation. EF-2 kinase is a ubiquitous protein kinase that can phosphorylate and inactivate EF-2. It has been proposed that phosphorylation of EF-2 is involved in the regulation of protein synthesis. However, the exact physiology of EF-2 kinase and EF-2 phosphorylation has not been previously known.

【０００５】 （その解決方法） 本発明により、ＥＦ−２キナーゼ活性の低下が細胞においてタンパク質代謝回
転の全体としての上昇を引き起こすことが今や初めて見出されたのであり、この
ことにより行動、発育および生殖に有害な影響を及ぼすことなく寿命を有意に延
ばすという結果になる。さらに、この酵素の抑制およびそれと同時のタンパク質
代謝回転の上昇は、標準的な線虫の動物モデル系で寿命のうちの性的に活動的な
期間を２倍以上長くする結果となる。同酵素はヒトも含めて全ての動物に存在す
るので、細胞におけるタンパク質代謝回転の上昇、とりわけ該酵素の抑制による
上昇がヒトおよび動物において加齢の開始を遅延し、寿命を延長させ、性的に活
動的な期間を長くするであろうことは今や明らかに予測できることである。本発
明によってなされた知見は、被験体において加齢速度を低下させ、それによって
寿命、とりわけ寿命のうちの性的に活動的な期間を長くするのに有用な様々な方
法、キットおよび医薬組成物を可能にする。The Solution It has now been found for the first time by the present invention that a decrease in EF-2 kinase activity causes an overall increase in protein turnover in cells, which results in behavior, development and development. The result is significantly increased lifespan without deleterious effects on reproduction. Furthermore, inhibition of this enzyme and concomitant increase in protein turnover results in more than a two-fold increase in the sexually active period of life in a standard nematode animal model system. Since the enzyme is present in all animals, including humans, an increase in protein turnover in cells, especially by inhibition of the enzyme, delays the onset of aging in humans and animals, prolongs lifespan, and It will now be clearly predictable that it will prolong the active period. The findings made by the present invention are various methods, kits and pharmaceutical compositions useful for decreasing the rate of aging in a subject, thereby prolonging lifespan, especially sexually active periods of lifespan. To enable.

【０００６】 本発明の一つの側面によれば、被検体の寿命を延長し、被験体の加齢速度を遅
延し、被検体の寿命のうちの性的に活動的な期間を延ばす方法を提供する。これ
ら方法は被験体においてタンパク質代謝回転を上昇させることを含み、タンパク
質代謝回転の上昇は被験体の寿命を延ばすという結果となる。好ましくは、被験
体におけるタンパク質の代謝回転は被検体においてＥＦ−２キナーゼの活性を低
下させることによって達成される。一つの態様において、ＥＦ−２キナーゼ活性
の低下は被検体によって産生される機能性のＥＦ−２キナーゼの量を減少させる
ことにより行う。詳細には、機能性のＥＦ−２キナーゼの量の減少はＥＦ−２キ
ナーゼをコードする遺伝子の発現を低減させることにより行う。別のやり方とし
て、機能性のＥＦ−２キナーゼの量の減少は、ＥＦ−２キナーゼをコードする遺
伝子が機能不全であるかまたは非機能性のＥＦ−２キナーゼをコードするように
該遺伝子を変化させることにより行う。According to one aspect of the invention, there is provided a method of extending the life of a subject, delaying the aging rate of the subject, and extending the sexually active period of the subject's life. To do. These methods include increasing protein turnover in a subject, which results in increased lifespan of the subject. Preferably, protein turnover in the subject is achieved by reducing the activity of EF-2 kinase in the subject. In one embodiment, reducing EF-2 kinase activity is accomplished by reducing the amount of functional EF-2 kinase produced by the subject. Specifically, reducing the amount of functional EF-2 kinase is achieved by reducing the expression of the gene encoding EF-2 kinase. Alternatively, reducing the amount of functional EF-2 kinase alters the gene encoding EF-2 kinase such that it is dysfunctional or encodes a non-functional EF-2 kinase. By doing.

【０００７】 本発明の他の側面によれば、タンパク質合成を負に制御する酵素が機能不全で
あるか、非機能性であるか、または不在である、遺伝子操作した非ヒト生物を提
供する。好ましくは、該生物はげっ歯類または線虫であり、該酵素はＥＦ−２キ
ナーゼである。本発明の他の側面において、タンパク質合成を負に制御する酵素
を過剰発現する、遺伝子操作した非ヒト生物を提供する。この場合も好ましい酵
素はＥＦ−２キナーゼであり、好ましい生物はげっ歯類または線虫である。According to another aspect of the invention, there is provided a genetically engineered non-human organism in which the enzyme that negatively regulates protein synthesis is dysfunctional, non-functional, or absent. Preferably, the organism is a rodent or nematode and the enzyme is EF-2 kinase. In another aspect of the invention, there is provided a genetically engineered non-human organism that overexpresses an enzyme that negatively regulates protein synthesis. Again, the preferred enzyme is EF-2 kinase and the preferred organism is a rodent or nematode.

【０００８】 本発明の他の側面によれば、被検体の寿命を延長しまたは加齢を遅延するため
の医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、生物学的に適合性の媒体中に細胞タ
ンパク質の代謝回転を上昇させる薬物を含む。好ましくは、該医薬組成物はＥＦ
−２活性または遺伝子発現のインヒビターを含む。According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for extending the life of a subject or delaying aging. The pharmaceutical composition comprises a drug that increases cellular protein turnover in a biologically compatible medium. Preferably the pharmaceutical composition is EF
-2 inhibitors of activity or gene expression.

【０００９】 以下に詳記するように、種々の診断および予後アッセイおよびキットもまた本
発明に従って提供される。本発明の他の特徴および利点については、以下の図面
、詳細な説明および実施例を参照すれば理解されるであろう。As detailed below, various diagnostic and prognostic assays and kits are also provided according to the present invention. Other features and advantages of the present invention will be understood with reference to the drawings, detailed description and examples that follow.

【００１０】 本発明の詳細な説明 Ｉ．定義付け： 本発明に関連する種々の用語は、以上およびこの明細書および特許請求の範囲
の全体を通じて用いられる。Detailed Description of the Invention I. Definitions: Various terms relating to the invention are used above and throughout the specification and claims.

【００１１】 「コード配列」または「コード領域」は、配列が発現される際に、遺伝子産物
を産生するのに必要な配列情報を有する核酸分子を意味する。By “coding sequence” or “coding region” is meant a nucleic acid molecule that has the sequence information necessary to produce a gene product when the sequence is expressed.

【００１２】 用語「操作可能に連結された」または「操作可能に挿入された」は、コード配
列を発現できるように、核酸分子中のコード配列に対する適当な部位に、コード
配列の発現に必要な調節配列があることを意味する。これと同一の定義が、発現
ベクターにおける他の転写制御因子（例えば、エンハンサー）の配置に用いられ
ることもある。The term “operably linked” or “operably inserted” refers to the expression of a coding sequence at an appropriate site in the nucleic acid molecule such that the coding sequence is expressed so that the coding sequence can be expressed. Means that there are regulatory sequences. The same definition may be used for the placement of other transcription control elements (eg enhancers) in the expression vector.

【００１３】 転写および翻訳制御配列は、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニ
ル化シグナル、ターミネーターなど、宿主細胞においてコード配列の発現を規定
するＤＮＡ発現調節配列をいう。Transcriptional and translational control sequences refer to DNA expression control sequences that regulate the expression of coding sequences in host cells, such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, terminators and the like.

【００１４】 用語「プロモーター」、「プロモーター領域」または「プロモーター配列」は
、コード領域の５'若しくは３'側、またはコード領域内、あるいはイントロン内
に見出され得る遺伝子の転写調節領域を一般に意味する。典型的に、プロモータ
ーとは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼが結合し、下流(３'方向)コード配列
の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。典型的な５'プロモータ
ー配列は、その３'末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンド以上の検出
レベルにおける転写を開始するのに必要な最小数の塩基、または因子を含むため
に上流(５'方向)に伸張する。プロモーター配列内には、(好都合なことに、ヌク
レアーゼＳ１を用いたマッピングにより決定された)転写開始部位、およびＲＮ
Ａポリメラーゼの結合に必要なタンパク質結合ドメイン(共通配列)がある。The terms “promoter”, “promoter region” or “promoter sequence” generally mean the transcriptional regulatory region of a gene, which may be found 5 ′ or 3 ′ of the coding region, or within the coding region, or within an intron. To do. Typically, a promoter is a DNA regulatory region capable of binding RNA polymerase in a cell and initiating transcription of a downstream (3 'direction) coding sequence. A typical 5'promoter sequence has a transcription start site bound to its 3'end and contains the minimum number of bases or factors required to initiate transcription at detection levels above background, or upstream (5 Stretch in the'direction '. Within the promoter sequence is a transcription start site (conveniently determined by mapping with nuclease S1), and an RN
There is a protein binding domain (consensus sequence) required for A polymerase binding.

【００１５】 「ベクター」は、他の核酸断片を複製、または発現させるために、その核酸断
片を操作可能に挿入し得る、例えばプラスミド、ファージ、コスミド若しくはウ
ィルスなどのレプリコンをいう。“Vector” refers to a replicon such as a plasmid, phage, cosmid or virus into which another nucleic acid fragment can be operably inserted for replication or expression.

【００１６】 用語「核酸構築物」または「ＤＮＡ構築物」は、適当な調節配列に対して操作
可能に連結され、細胞を形質転換するためのベクター中に挿入されたコード配列
若しくは配列群を表すのにときどき用いられる。この用語は、用語「形質転換Ｄ
ＮＡ」または「導入遺伝子」と交換可能に使用し得る。そのような核酸構築物に
は、興味ある遺伝子産物に関するコード配列に加えて、選択マーカー遺伝子およ
び／またはレポーター遺伝子を含み得る。The term “nucleic acid construct” or “DNA construct” is used to describe a coding sequence or sequences operably linked to appropriate regulatory sequences and inserted into a vector to transform cells. Sometimes used. This term refers to the term "transformation D
It may be used interchangeably with "NA" or "transgene". Such nucleic acid constructs may include a selectable marker gene and / or a reporter gene in addition to the coding sequence for the gene product of interest.

【００１７】 用語「選択マーカー遺伝子」は、発現の際に、選択可能な表現型、例えば形質
転換した細胞において抗生物質耐性を与えるような産物をコードする遺伝子を意
味する。The term “selection marker gene” means a gene that upon expression encodes a product that confers a selectable phenotype, eg, antibiotic resistance in transformed cells.

【００１８】 用語「レポーター遺伝子」は、直接または間接のいずれかの標準的な方法によ
って容易に検出される産物をコードする遺伝子をいう。The term “reporter gene” refers to a gene that encodes a product that is readily detected by standard methods, either direct or indirect.

【００１９】 核酸構築物の「異種(非相同)」領域とは、天然の巨大分子との関連では見られ
ない巨大分子中において同定可能な核酸分子の断片(または断片群)をいう。従っ
て、異種領域が哺乳類遺伝子をコード化する場合に、その遺伝子は、生体源のゲ
ノムにおいて、哺乳類ゲノムＤＮＡと隣接しないＤＮＡに通常隣接されることと
なる。その他の例としては、コード配列それ自体が自然状態では見られない構築
体(例えば、ゲノムコード配列がイントロン、または天然遺伝子に比べて異なる
コドンを持つ合成配列を含むｃＤＮＡ)がコード配列である。対立変異(Allelic
variations)または天然に存在する突然変異イベントでは、ここに定義するＤＮ
Ａの異種領域を生じない。A “heterologous” region of a nucleic acid construct refers to a fragment (or group of fragments) of a nucleic acid molecule that is identifiable in a macromolecule that is not found in the context of the natural macromolecule. Thus, if a heterologous region encodes a mammalian gene, that gene will usually be flanked by DNA that is not flanked by mammalian genomic DNA in the genome of the biological source. In another example, a coding sequence is a construct in which the coding sequence itself is not found in nature (eg, a cDNA that includes an intron whose genomic coding sequence is, or a synthetic sequence with different codons compared to the natural gene). Allelic variation
variations) or naturally-occurring mutation events, the DN defined here
A heterogeneous region of A is not generated.

【００２０】 細胞内部に外来または異種ＤＮＡを導入する場合に、細胞は、そのような遺伝
子によって「形質転換」または「トランスフェクション」される。形質転換ＤＮ
Ａ(導入遺伝子)は、細胞のゲノム中に組み込まれ(共有結合的に連結され)る場合
もあり、組み込まれない場合もある。原核生物、酵母および哺乳類細胞において
、例えば形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム因子上において維持
され得る。真核細胞に関しては、安定な形質転換細胞は、形質転換ＤＮＡが染色
体中に組み込まれ、染色体の複製を通じて娘細胞に遺伝されるものである。この
安定性は真核細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の個体群から成る細胞株または
クローンを作り出す能力で実証される。「クローン」は、有糸***によって単一
細胞、または共通の祖先から派生した細胞の個体群(集団)をいう。「細胞株(セ
ルライン)」は、インビトロにおいて多くの世代に対して、安定に増殖する能力
を持つ最初の細胞のクローンをいう。生殖細胞を安定に形質転換した場合には、
その形質転換は、その生殖細胞から生じるある世代の動物から次の世代へと受け
継がれ得るものである。この例において、導入遺伝子は遺伝性があるとされる。A cell is “transformed” or “transfected” by such a gene when it introduces foreign or heterologous DNA into the cell. Transformation DN
A (transgene) may or may not be integrated (covalently linked) into the genome of the cell. In prokaryotes, yeast and mammalian cells, for example, transforming DNA can be maintained on episomal factors such as plasmids. Regarding eukaryotic cells, stable transformed cells are those in which the transforming DNA is integrated into the chromosome and is inherited by daughter cells through chromosome replication. This stability is demonstrated by the ability of eukaryotic cells to produce cell lines or clones consisting of a population of daughter cells containing the transforming DNA. A "clone" refers to a single cell, or a population of cells derived from a common ancestor by mitosis. "Cell line" refers to a clone of the first cell that has the ability to grow stably for many generations in vitro. When germ cells are stably transformed,
The transformation can be inherited from one generation of animals resulting from the germ cells to the next. In this example, the transgene is said to be heritable.

【００２１】 用語「被検体(被験体)」または「患者」は細胞、組織若しくは生体を意味する
。生体には、ヒトおよび動物を含むいずれかの生体があり得る。The term “subject” or “patient” means a cell, tissue or organism. The living body can be any living body including humans and animals.

【００２２】 用語「タンパク質代謝回転」は技術常識であり、生きている細胞、組織および
生体において起こる調整されたタンパク質の合成および分解を意味する。The term “protein turnover” is a common knowledge and refers to the synthesis and degradation of regulated proteins that occur in living cells, tissues and organisms.

【００２３】 ＩＩ．説明 Caenorhabditis elegansモデル系をもちいることで、本発明者はｅＥＦ−２キ
ナーゼ活性の喪失がタンパク質合成速度および分解速度を増加させ、寿命を伸ば
すことを決定した。逆にいえば、ｅＥＦ−２キナーゼの過剰な発現が、遺伝子導
入線虫の寿命を縮める。機能性のｅＥＦ−２キナーゼを欠く変異体は、形態上、
協調性、生殖能力においてほとんど正常であるが、発生が遅く、種々の律動的挙
動の割合が変わり、既述のclk寿命延長変異体を暗示する^３、４。タンパク質合
成速度もまた、長期生存age-1(hx546)およびclk-1(qm30)変異体に見られるよう
に増加し、このことは別個のものと考えられるage/dafおよびclk機構の両者がタ
ンパク質合成速度に影響することによって部分的に共同して作用し得ることを示
唆する。この可能性は、efk-1および、age-1(hx546)またはclk-1(qm30)の二重突
然変異の突然変異体がいずれの単一突然変異体よりも長くは生存できないことと
一致する。飢餓線虫においては、ｅＥＦ−２キナーゼ活性もまた低下することに
も注目される。これは、ｅＥＦ−２キナーゼ活性の低下を介するタンパク質合成
の上方調節が、カロリー制限による寿命の延長に寄与することを示す。II. Description By using the Caenorhabditis elegans model system, the present inventors have determined that loss of eEF-2 kinase activity increases protein synthesis and degradation rates and prolongs lifespan. Conversely, overexpression of eEF-2 kinase shortens the lifespan of transgenic nematodes. Mutants lacking a functional eEF-2 kinase are morphologically
Almost normal in coordination and fertility, but slow in development and altered in the proportion of various rhythmic behaviors, suggesting the clk life-prolonging mutants described above ^3,4 . The rate of protein synthesis was also increased as seen in the long-lived age-1 (hx546) and clk-1 (qm30) mutants, which appear to be distinct and that both age / daf and clk mechanisms are protein-dependent. We suggest that they may act in part in concert by affecting the rate of synthesis. This possibility is consistent with efk-1 and age-1 (hx546) or clk-1 (qm30) double mutant mutants not being able to survive longer than either single mutant. . It is also noted that in starved nematodes, eEF-2 kinase activity is also reduced. This indicates that up-regulation of protein synthesis via reduced eEF-2 kinase activity contributes to longevity due to calorie restriction.

【００２４】 本発明に関して得られたこの実験結果は、タンパク質代謝回転の上昇が加齢を
遅延し、寿命を延長し得るという始めての直接的な証拠であると考えられる。ど
のような特定の作用機構によって制限されることを意図するものではないが、こ
の証拠に基づき、タンパク質代謝回転（およびそれに作用する酵素）と寿命との
相互関係に関するモデルは以下のものである：ｅＥＦ−２キナーゼはｅＥＦ−２
をリン酸化し、タンパク質代謝回転を下方調節する。タンパク質代謝回転の低下
は、損傷を受けたタンパク質の蓄積を加速させ、寿命を短くする。したがって、
カロリー制限の間のｅＥＦ−２キナーゼの下方調節は、観察される寿命の延長に
直接寄与する。同様に、C.elegansのage-1およびclk-1変異体の両方において観
察されるタンパク質合成の増加は、変異体の寿命の延長に直接寄与し得る。The experimental results obtained with the present invention are considered to be the first direct evidence that increased protein turnover can delay aging and prolong life. Based on this evidence, although not intended to be limited by any particular mechanism of action, a model for the interrelation between protein turnover (and the enzymes that act on it) and longevity is: eEF-2 kinase is eEF-2
Phosphorylates and down-regulates protein turnover. Reduced protein turnover accelerates the accumulation of damaged proteins and shortens their lifespan. Therefore,
Down-regulation of eEF-2 kinase during caloric restriction directly contributes to the observed longevity extension. Similarly, the increased protein synthesis observed in both C. elegans age-1 and clk-1 mutants could directly contribute to the increased lifespan of the mutants.

【００２５】 注目すべきことは、ｅＥＦ−２キナーゼが線形動物からヒト^８で保存され、線
形動物（実施例１）およびマウス（実施例２）において生存に不可欠なものでは
なく、ｅＥＦ−２に関して高度に特異的であることである^６，７。これらの性質
はｅＥＦ−２キナーゼを、心身に有害な、いくつかの老化衰退の結果を回避する
ための治療薬の設計に関する有用な標的とする。改良されたタンパク質の維持は
加齢進行と有意に闘うことが予想される。Of note is that eEF-2 kinase is conserved in linear animals to humans ⁸ and is not essential for survival in linear animals (Example 1) and mice (Example 2), and for eEF-2 It is highly specific ^6,7 . These properties make eEF-2 kinase a useful target for the design of therapeutic agents to avoid some of the aging effects that are harmful to the body and mind. Improved protein maintenance is expected to significantly combat aging progression.

【００２６】 本発明は、一般に、加齢の遅延、およびさらに種々の年齢に関連する疾患、例
えばアルツハイマー疾患およびパーキンソン疾患の開始を延期するために用いる
ことができる。したがって、被検体の寿命を延長させ、被検体の加齢速度を遅延
させ、被検体の寿命のうちの性的に活性な期間を延ばす方法が提供される。これ
らの方法は被検体におけるタンパク質代謝回転を上昇させることを含み、タンパ
ク質代謝回転の上昇は被検体の寿命を延ばす。調査目的では、「被検体（対象）
」とは、細胞、組織、微生物または動物であり得る。臨床診断および治療目的で
は、「被検体」とはヒトまたは動物であり得る。The present invention can be used to delay the aging in general, and also postpone the onset of various age-related diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Thus, there is provided a method of extending the life of a subject, delaying the aging rate of the subject, and extending the sexually active period of the life of the subject. These methods include increasing protein turnover in a subject, where increasing protein turnover extends the life of the subject. For the purpose of the survey, "subject (target)
The “can be a cell, tissue, microorganism or animal. For clinical diagnostic and therapeutic purposes, a "subject" can be a human or animal.

【００２７】 好ましくは、被検体におけるＥＦ−２キナーゼの活性を低下させることにより
被検体におけるタンパク質代謝回転を上昇させる。これは本発明によって記載さ
れる証拠に基づくものである。ＥＦ−２キナーゼ活性は種々の方法で低下させる
ことができる。例えば、ＥＦ−２キナーゼの酵素活性は、この酵素を阻害剤に曝
露することによって低下させることができる。別法では、被検体が産生する機能
的なＥＦ−２キナーゼの量を減少させる方法を用いてもよい。具体的には、ＥＦ
−２キナーゼをコードする遺伝子の発現を低減することによって機能的なＥＦ−
２キナーゼの量を減少させることができる。別法では、ＥＦ−２キナーゼをコー
ドする遺伝子を機能不全であるかまたは非機能性のＥＦ−２キナーゼをコードす
るように変化させることによって機能的なＥＦ−２キナーゼの量を減少させるこ
とができる。ＥＦ−２キナーゼ遺伝子発現の遺伝的操作を用いて、本来的に延命
され、延命された子孫を生じさせることができる遺伝的に操作された生物への、
非ヒト生物の生殖系列の形質転換において有利にすることができる。哺乳類を含
む非ヒト生物を遺伝的に操作する方法は当分野に周知である。Preferably, the protein turnover in the subject is increased by reducing the activity of EF-2 kinase in the subject. This is based on the evidence described by the present invention. EF-2 kinase activity can be reduced in various ways. For example, the enzymatic activity of EF-2 kinase can be reduced by exposing the enzyme to inhibitors. Alternatively, a method of reducing the amount of functional EF-2 kinase produced by the subject may be used. Specifically, EF
EF-functional by reducing the expression of the gene encoding the -2 kinase
The amount of 2 kinases can be reduced. Alternatively, one can reduce the amount of functional EF-2 kinase by altering the gene encoding EF-2 kinase to encode a dysfunctional or non-functional EF-2 kinase. it can. Using a genetic manipulation of EF-2 kinase gene expression to a genetically engineered organism that is naturally prolonging and is capable of giving rise to prolonged progeny,
It can be advantageous in germline transformation of non-human organisms. Methods of genetically engineering non-human organisms, including mammals, are well known in the art.

【００２８】 本発明はまた、種々の目的に関して有用であることが予想される、ＥＦ−２キ
ナーゼを過剰発現するか、あるいは低減発現するトランスジェニック（または別
の方法で遺伝的に操作された）動物を提供する。これは以下により詳細に説明さ
れている。実施例２に記載のＥＦ−２キナーゼノックアウトマウスによって例証
されるように、これらの動物は寿命が変化していることが予想される（低減発現
またはノックアウト動物では延長され、過剰発現動物では減少する）。The present invention is also transgenic (or otherwise genetically engineered) that over-expresses or down-expresses EF-2 kinase, which is expected to be useful for a variety of purposes. Provide the animals. This is explained in more detail below. These animals are expected to have altered lifespan, as demonstrated by the EF-2 kinase knockout mice described in Example 2 (prolonged in reduced expression or knockout animals and decreased in overexpressed animals). ).

【００２９】 本明細書中で用いる用語「動物」とは、ヒトを除くすべての脊椎動物を含む。
また、これは胚および胎児期を含む、すべての発生段階の個体を含む。本発明に
おいて用いるのに好ましい動物の例には、げっ歯類、最も好ましくはマウスおよ
びラット、ならびにネコ、イヌ、イルカおよび霊長類が含まれるが、これらに限
定されない。The term “animal” as used herein includes all vertebrate animals except humans.
It also includes individuals at all stages of development, including embryonic and fetal. Examples of preferred animals for use in the present invention include, but are not limited to, rodents, most preferably mice and rats, and cats, dogs, dolphins and primates.

【００３０】 「トランスジェニック動物」とは、細胞下レベルでの計画的遺伝操作、例えば
標的化された組換えまたはマイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感
染によって直接的にあるいは間接的に、変更されたか、あるいは受け入れられた
遺伝情報を保持する１個またはそれ以上の細胞を含む任意の動物である。用語「
トランスジェニック動物」とは、古典的交配またはインビトロ受精を含むことを
意味せず、１個またはそれ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子、すなわち「導入遺伝
子」によって変更されているか、あるいはそれを受け入れている動物を含むこと
を意味する。本明細書中で用いる用語「導入遺伝子」とは、哺乳類の体細胞およ
び生殖細胞の両者あるいはいくつかの体細胞のみに導入された任意の外来性遺伝
子配列を意味する。この分子は、規定の遺伝的位置に特異的に標的化されている
か、あるいはランダムに染色体内に組み込まれるか、あるいは染色体外複製ＤＮ
Ａとなり得る。用語「生殖系列のトランスジェニック動物」とは、導入遺伝子が
生殖系列細胞に導入され、それにより、導入遺伝子を子孫に伝達する能力を有す
るトランスジェニック動物を表す。このような子孫が実際に導入遺伝子を有する
場合には、これらもまたトランスジェニック動物である。“Transgenic animal” means altered directly or indirectly by planned genetic manipulation at the subcellular level, such as targeted recombination or microinjection or infection with recombinant virus, Alternatively, any animal that contains one or more cells that carry the accepted genetic information. the term"
A "transgenic animal" is not meant to include classical mating or in vitro fertilization, and one or more cells may be modified by, or accept, a recombinant DNA molecule, or "transgene." It is meant to include living animals. As used herein, the term “transgene” means any foreign gene sequence introduced into both mammalian somatic cells and germ cells or only some somatic cells. This molecule is either specifically targeted to a defined genetic location, or randomly integrated into the chromosome, or extrachromosomally replicating DN.
Can be A. The term "germline transgenic animal" refers to a transgenic animal in which the transgene has been introduced into germline cells, thereby having the ability to transfer the transgene to offspring. If such offspring do in fact carry the transgene, then they too are transgenic animals.

【００３１】 本発明の導入遺伝子は、これらに制限されないが、ＥＦ−２キナーゼ遺伝子の
完全コーディング領域、またはその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはＥＦ−２
コーディング領域の部分またはすべてを含むキメラ遺伝子を含む。導入遺伝子中
で用いられるコーディング配列は、作成されるトランスジェニック動物と同種の
起源であるのが好ましいが、不可欠ではない。ノックアウト動物に関しては、コ
ーディング配列または調節配列を操作し、コードされる酵素を機能不全にしたり
、または非機能性とする。The transgene of the present invention includes, but is not limited to, the complete coding region of the EF-2 kinase gene, or its complementary DNA (cDNA), or EF-2.
It includes chimeric genes that include part or all of the coding region. The coding sequence used in the transgene is preferably, but not necessarily, of cognate origin from the transgenic animal being created. For knockout animals, the coding or regulatory sequences are engineered to render the encoded enzyme dysfunctional or non-functional.

【００３２】 トランスジェニック、非ヒト哺乳類を得る方法は当分野に既知である。一般的
な議論に関しては、例えば Joyner, "Gene Targeting," IRL Press, Oxford, 19
93; Hogan et al. (Eds.), "Manipulating the Mouse Embryo - A Laboratory M
anual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1
994; および Wasserman & Depamphilis, "A Guide to Techniques in Mouse Dev
elopment," Academic Press, San Diego CA, 1993 を参照。外来性ＤＮＡを生殖
系列に導入する一方法は遺伝子構築物を初期胚（例えば４細胞期前）の生殖核に
マイクロインジェクションすることによるものである（Wagner et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78, 5016, 1981; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82, 4438, 1985）。この方法によってＮＲ２Ｂトランスジェニックマウ
スを作成する詳細な手法は Tsien et al., Cell 87, 1317-26, 1996 に記載され
ている。Methods for obtaining transgenic, non-human mammals are known in the art. For general discussion, see Joyner, "Gene Targeting," IRL Press, Oxford, 19
93; Hogan et al. (Eds.), "Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory M
anual, "Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1
994; and Wasserman & Depamphilis, "A Guide to Techniques in Mouse Dev.
See elopment, "Academic Press, San Diego CA, 1993. One method of introducing exogenous DNA into the germline is by microinjecting the genetic construct into the germinal nucleus of the early embryo (eg, 4 cell stage ago). (Wagner et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78, 5016, 1981; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82, 4438, 1985). The detailed procedure for generating NR2B transgenic mice by this method is described in Tsien et al., Cell 87, 1317-26, 1996.

【００３３】 生殖系列のトランスジェニック哺乳類を作成する別の方法では、胚幹細胞を用
いる。ゲノムの転写活性領域における相同組換え（Thomas et al., Cell 51, 50
3, 1987; Capecchi, Science 244, 1288, 1989; Joyner, et al., Nature 338,
153, 1989）によって、ＤＮＡ構築物を胚幹細胞に導入することができる。適当
な構築物をまた、ＤＮＡが媒介するトランスフェクション、例えばエレクトロポ
レーションによって胚幹細胞に導入することができる（Ausubel, et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1999）。胚幹細胞の
培養および胚幹細胞からのトランスジェニック哺乳類の作成方法に関する詳細な
手法は Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A practical Approach,
ed. E. J. Robertson (IRL Press, 1987) に見出すことができる。Another method of making germline transgenic mammals uses embryonic stem cells. Homologous recombination in the transcriptionally active region of the genome (Thomas et al., Cell 51, 50
3, 1987; Capecchi, Science 244, 1288, 1989; Joyner, et al., Nature 338,
153, 1989), the DNA construct can be introduced into embryonic stem cells. Appropriate constructs can also be introduced into embryonic stem cells by DNA-mediated transfection, eg electroporation (Ausubel, et al., Curre.
nt Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1999). Detailed procedures for culturing embryonic stem cells and producing transgenic mammals from embryonic stem cells are described in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A practical Approach,
ed. EJ Robertson (IRL Press, 1987).

【００３４】 生殖系列トランスジェニック動物を作成する他の方法は現在開発中である。例
えば、外来性ＤＮＡのレシピエントである卵のかわりに、現在、***が遺伝的に
操作されている。Other methods of making germline transgenic animals are currently under development. For example, sperm are now being genetically engineered instead of eggs, which are recipients of foreign DNA.

【００３５】 前記の生殖系列の形質転換方法のいずれかにおいて、構築物は、線状構築物、
環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これは宿
主ゲノムへ組み込まれた導入遺伝子として包含され、遺伝し得る。導入遺伝子は
また、染色体外プラスミドとして受け継がれることを可能にするように構築され
てもよい。用語「プラスミド」は一般に、宿主細胞内で自己複製可能なＤＮＡ分
子を意味する。In any of the above germline transformation methods, the construct is a linear construct,
It can be introduced as a circular plasmid, or a viral vector, which can be included and inherited as a transgene integrated into the host genome. The transgene may also be constructed to allow it to be inherited as an extrachromosomal plasmid. The term "plasmid" generally refers to a DNA molecule that is capable of autonomous replication in a host cell.

【００３６】 トランスジェニック動物はまた、インビボ、エクスビボ、またはインビトロに
おいて、ＥＦ−２キナーゼ遺伝子を含む組換えウイルスベクターでニューロンを
感染させることによって得ることができる。適当なウイルスベクターには、いく
つか挙げるならば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよび単
純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。このようなベクターの選択および使用
は当分野に周知である。Transgenic animals can also be obtained by infecting neurons in vivo, ex vivo, or in vitro with a recombinant viral vector containing the EF-2 kinase gene. Suitable viral vectors include retroviral vectors, adenoviral vectors and herpes simplex viral vectors, to name a few. Selection and use of such vectors are well known in the art.

【００３７】 本発明の別の態様では、被検体の寿命を延長させるか、あるいは加齢速度を遅
延させるための医薬製剤が提供される。この製剤は、生物学的に適合性の媒体中
における細胞内のタンパク質代謝回転を上昇させる薬物を含む。好ましくは、こ
の製剤はＥＦ−２活性または遺伝子発現の阻害剤を含む。医薬製剤は、特に経口
、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内および腹腔内を含む、当分野に既知の種々の適
当な経路で投与される。投与様式は活性物質およびそれが含まれる医薬製剤の性
質に依存するであろう。In another aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical formulation for extending the life of a subject or delaying the rate of aging. The formulation comprises a drug that increases intracellular protein turnover in a biologically compatible medium. Preferably, the formulation comprises an inhibitor of EF-2 activity or gene expression. The pharmaceutical formulations are administered by a variety of suitable routes known in the art including, inter alia, oral, intranasal, intraocular, intravenous, intramuscular and intraperitoneal. The mode of administration will depend on the nature of the active agent and the pharmaceutical formulation in which it is contained.

【００３８】 医薬製剤は、適当な媒体、例えば水、緩衝化サリン、エタノール、ポリオール
（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールな
ど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油状物、界面活性剤、懸濁化剤また
はそれらの適当な混合物とともに投与するのに都合よく製剤化される。選択され
た媒体中の特定組成物の濃度は、デリバリービヒクルおよびその中に配分された
活性物質の具体的性質とともに、媒体の疎水性または親水性に依存するであろう
。溶解度の限度は当業者であれば容易に測定することができる。Pharmaceutical formulations may be in a suitable vehicle such as water, buffered saline, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.), dimethylsulfoxide (DMSO), oils, surfactants, suspensions. Conveniently formulated for administration with the agents or suitable mixtures thereof. The concentration of the particular composition in the chosen vehicle will depend on the hydrophobic or hydrophilic nature of the vehicle, as well as the specific nature of the delivery vehicle and active agent distributed therein. The limit of solubility can be easily determined by those skilled in the art.

【００３９】 本明細書中で用いられる「生物学的に許容される媒体」には、上の段落に例示
したような医薬調製物投与の所望の経路に適当であり得る任意かつすべての溶媒
、分散媒体などが含まれる。医薬的に活性な物質に対するこのような媒体の使用
は当分野に既知である。任意の慣用的媒体または物質が投与される組成物と不適
合性である場合を除き、医薬調製物におけるその使用を考慮する。As used herein, “biologically acceptable medium” means any and all solvents that may be suitable for the desired route of administration of the pharmaceutical preparation as exemplified in the paragraph above. Dispersion media and the like are included. The use of such media for pharmaceutically active substances is known in the art. Except when any conventional vehicle or substance is incompatible with the composition to be administered, its use in pharmaceutical preparations is considered.

【００４０】 医薬調製物は、容易な投与および一様な投与のため、単位投与剤型で製剤化す
る。本明細書中で用いる単位投与剤型とは、処置を受けている患者に適当な、物
理的に区分された単位の医薬調製物を意味する。各投与量は、選択された医薬的
担体と組み合わせて、所望の保護効果を生じさせるように計算された量の活性成
分を含むべきである。適当な単位投与量を測定する手法は当業者に周知である。
単位投与量は、患者の体重に比例して増加あるいは減少させることができる。The pharmaceutical preparations are formulated in a unit dosage form for easy and uniform administration. As used herein, unit dosage form means a physically discrete unit of the pharmaceutical preparation appropriate for the patient undergoing treatment. Each dosage should contain the amount of active ingredient calculated to produce the desired protective effect in combination with the selected pharmaceutical carrier. Techniques for determining the appropriate unit dose are well known to those of skill in the art.
The unit dose can be increased or decreased in proportion to the patient's body weight.

【００４１】 本発明ではまた、種々のスクリーニングアッセイおよび診断／予後アッセイお
よびキットが提供される。例えば、（ａ）コントロールサンプルおよび試験サン
プルである細胞を提供すること；（ｂ）該試験サンプルを試験化合物に曝露する
こと；（ｃ）該コントロールサンプルおよび試験サンプルの細胞におけるタンパ
ク質代謝回転速度を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプル
におけるタンパク質代謝回転率速度の上昇が、該試験化合物が被検体の寿命を延
長させるかまたは加齢を遅延させる指標であることを含む、試験化合物が被検体
の寿命を延長させるか、または加齢を遅延させるかどうかを測定する方法を提供
する。The invention also provides various screening assays and diagnostic / prognostic assays and kits. For example, (a) providing cells that are a control sample and a test sample; (b) exposing the test sample to a test compound; (c) measuring protein turnover rates in cells of the control sample and the test sample. However, an increase in protein turnover rate in the test sample relative to the control sample is an indicator that the test compound prolongs the life of the subject or delays aging, Provided is a method of determining whether to extend the life of a specimen or delay aging.

【００４２】 別の具体例では、(ａ)コントロールサンプルおよび試験サンプルである活性Ｅ
Ｆ−２キナーゼを提供すること；(ｂ)該試験サンプルを試験化合物に曝露するこ
と；並びに(ｃ)該コントロールサンプルおよび該試験サンプルにおけるＥＦ−２
キナーゼ活性を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプルにお
けるＥＦ−２キナーゼ活性の低下が、試験化合物が被験体のＥＦ−２キナーゼ活
性を低下させることにより被検体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させる
指標であることを含む、試験化合物がＥＦ−２キナーゼ活性を低下させることに
より、被検体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定する
ための無細胞法を提供する。In another embodiment, (a) a control sample and a test sample, active E
Providing F-2 kinase; (b) exposing the test sample to a test compound; and (c) EF-2 in the control sample and the test sample.
The decrease in EF-2 kinase activity in the test sample compared to the control sample, which is measured for kinase activity, increases the lifespan of the subject by the test compound decreasing the EF-2 kinase activity of the subject, or A cell-free method for measuring whether a test compound reduces the EF-2 kinase activity, thereby prolonging the lifespan of a subject or delaying aging, including being an index for delaying aging I will provide a.

【００４３】 別の具体例として、試験化合物が該被験体のＥＦ−２キナーゼ活性を低下させ
ることによって、寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定す
るための細胞に基づく方法を提供する。該方法は、ａ）コントロールサンプルお
よび試験サンプルである、活性なＥＦ−２キナーゼを含む細胞を提供すること；
ｂ）該試験サンプルを試験化合物に曝露すること；ならびにｃ）該コントロール
サンプルおよび該試験サンプルにおけるＥＦ−２キナーゼ活性を測定し、該コン
トロールサンプルと比較した該試験サンプルにおけるＥＦ−２キナーゼ活性の低
下が、試験化合物が該被験体のＥＦ−２キナーゼ活性を低下させることにより該
被験体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させる指標であることを含む。In another embodiment, a cell-based method for determining whether a test compound reduces EF-2 kinase activity in the subject, thereby extending lifespan or delaying aging. provide. The method comprises: a) providing a control sample and a test sample, cells containing active EF-2 kinase;
b) exposing the test sample to a test compound; and c) measuring the EF-2 kinase activity in the control sample and the test sample and reducing the EF-2 kinase activity in the test sample compared to the control sample. Is that the test compound is an index for prolonging the life span or delaying aging of the subject by decreasing the EF-2 kinase activity of the subject.

【００４４】 さらに別の具体例として、試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼをコ
ードする遺伝子の発現を低減させることにより寿命を延長させるかまたは加齢を
遅延させるかどうかを測定する方法を提供する。該方法は、(ａ)ＥＦ−２キナー
ゼをコードする遺伝子由来の発現調節エレメントの１つ以上に、操作可能に連結
されたレポーターコード配列を有するＤＮＡ構築物を含む発現系であって、さら
にレポーター遺伝子産物を産生するためのレポーターコード配列の発現を可能に
する構成要素を含んでいる発現系を提供すること；(ｂ)コントロールサンプルお
よび試験サンプルである発現系を提供すること；(ｃ)該試験サンプルを試験化合
物に曝露すること；並びに、(ｄ)該コントロールサンプルおよび該試験サンプル
におけるレポーター遺伝子産物の量を測定することを含む。該コントロールサン
プルと比較して該試験サンプルにおけるレポーター遺伝子産物の量の減少は、試
験化合物が該被験体のＥＦ−２キナーゼ活性を低下させることによって被験体の
寿命を延長するかまたは加齢を遅延させることを示す。In yet another embodiment, there is provided a method of determining whether a test compound reduces lifespan or delays aging by reducing expression of a gene encoding EF-2 kinase in a subject. To do. The method comprises (a) an expression system comprising a DNA construct having a reporter coding sequence operably linked to one or more of the expression control elements derived from the gene encoding EF-2 kinase, further comprising a reporter gene Providing an expression system comprising components that enable expression of a reporter coding sequence to produce a product; (b) providing an expression system that is a control sample and a test sample; (c) the test. Exposing the sample to a test compound; and (d) determining the amount of reporter gene product in the control sample and the test sample. A decrease in the amount of reporter gene product in the test sample as compared to the control sample increases the lifespan of the subject or delays aging by the test compound decreasing the EF-2 kinase activity of the subject. Indicates that

【００４５】 本発明の他の態様では、被験体の寿命を測定する予後方法を提供する。該方法
は、(ａ)動物モデル系において、タンパク質の代謝回転と動物の寿命との間の正
(ポジティブ)の相関関係を示す検量線を確立すること；(ｂ)該被験体におけるタ
ンパク質代謝回転を測定すること；(ｃ)該被検体におけるタンパク質代謝回転と
該検量線に示されている該動物モデルにおけるタンパク質代謝回転とを比較する
こと；並びに、(ｄ)該被験体の寿命の予後決定を行うことを含む。In another aspect of the invention, a prognostic method of measuring the lifespan of a subject is provided. The method comprises (a) a positive model between protein turnover and animal longevity in an animal model system.
Establishing a calibration curve showing a (positive) correlation; (b) measuring protein turnover in the subject; (c) protein turnover in the subject and the calibration curve Comparing with protein turnover in an animal model; and (d) making a prognosis of the subject's lifespan.

【００４６】 被検体の寿命を決定する別の予後方法は、(ａ)動物モデル系において、ＥＦ−
２キナーゼ活性と動物の寿命との間の負(ネガティブ)の相関関係を示す検量線を
確立すること；(ｂ)被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性を測定すること；(ｃ)
該被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性と該検量線で示されている該動物モデル
におけるＥＦ−２キナーゼ活性とを比較すること；並びに、(ｄ)該被験体の寿命
の予後決定を行うことを含む。Another prognostic method for determining the lifespan of a subject is (a) EF- in an animal model system.
Establishing a calibration curve showing a negative correlation between 2 kinase activity and animal longevity; (b) measuring EF-2 kinase activity in a subject; (c)
Comparing EF-2 kinase activity in the subject with EF-2 kinase activity in the animal model represented by the calibration curve; and (d) performing a prognosis of the subject's lifespan. Including.

【００４７】 上記の各方法を実行するためのキットを提供する。これらのキットは、１種以
上の方法を実行するための生物学的分子、細胞、システムおよび／または試薬、
ならびに該方法を実行するためのキット使用説明書を含む。このようなキットの
組み立ておよび使用は、当業者には公知である。Kits for performing each of the above methods are provided. These kits include biological molecules, cells, systems and / or reagents for performing one or more methods,
And instructions for using the kit to carry out the method. Assembly and use of such kits is known to those of skill in the art.

【００４８】 以下の実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。これらは説明のみを企
図するものであり、本発明を限定するものではない。The present invention will be described in more detail by the following examples. These are intended to be illustrative only and not limiting of the invention.

【００４９】 実施例１延長因子２キナーゼは、調節タンパク質の代謝回転によって線虫(Caenorhabditi s elegans)の寿命に影響を及ぼす ｅＥＦ−２ホスホリル化のインビボ機能を調査するために、ｅＥＦ−２キナー
ゼをコードするC.elegansのefk-1遺伝子の分子遺伝学的分析を行った。Example 1 Elongation Factor 2 Kinases Enhance eEF-2 Kinases to Investigate the In Vivo Function of eEF-2 Phosphorylation That Influences Longevity in Caenorhabditi s elegans by Regulating Protein Turnover A molecular genetic analysis of the encoding C. elegans efk-1 gene was performed.

【００５０】材料および方法 系統および遺伝子操作： 記載する通り^２５、系統C.elegansを２０℃で成長させ、維持する。この実験
に用いた系統は、野生型Ｎ２,daf-16(mgDf50),age-1(hx546),clk-1(qm30),efk-1
(ev640),clk-2(qm37),daf-16(mgDf50);efk-1(ev640),age-1(hx546);efk-1(ev640
),clk-1(qm30),efk-1(ev640)、Ｎ２Ｅｘ[pＣefk-1pＲＦ４(rol-6(su1006))]、Ｎ
２Ｅｘ[ｐ_efk-1ＥＦＫ−１：：ＧＦＰｐＲＦ４]、Ｎ２Ｅｘ[Ｆ４２Ａ１０ｐＲＦ
４](サイモン・フラスター大学のDavid Baillieより提供頂いたＢＣ４９０９(sE
x134))およびefk-1(ev640)Ｅｘ[ｐＣefkｐＲＦ４]であった。efk-1(ev640)は、
トロント大学のJoseph CulottiおよびLijia Zhangによって作成されたefk-1のTc
1挿入対立遺伝子である。記載する通り^２６、生殖細胞系形質転換を行った。プ
ラスミドＤＮＡ ５０μｇ／ｍｌおよび共形質転換マーカーであるｐＲＦ４ＤＮ
Ａ ５０μｇ／ｍｌをすべての被検トランスジェニック系に共注入した。コスミ
ドを１０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。 Materials and Methods Strains and genetic engineering: Strains C. elegans are grown and maintained at 20 ° C as described ²⁵ . The strains used in this experiment were wild type N2, daf-16 (mgDf50), age-1 (hx546), clk-1 (qm30), efk-1.
(ev640), clk-2 (qm37), daf-16 (mgDf50); efk-1 (ev640), age-1 (hx546); efk-1 (ev640
), clk-1 (qm30), efk-1 (ev640), N2Ex [pCefk-1pRF4 (rol-6 (su1006))], N
2Ex [p _efk-1 EFK-1 :: GFPpRF4], N2Ex [F42A10pRF
4] (BC4909 (sE provided by David Baillie of Simon Fruster University)
x134)) and efk-1 (ev640) Ex [pCefkpRF4]. efk-1 (ev640) is
Efk-1 Tc created by Joseph Culotti and Lijia Zhang at the University of Toronto
1 is an insertion allele. Germline transformation was performed as described ²⁶ . Plasmid DNA 50 μg / ml and co-transformation marker pRF4DN
A 50 μg / ml was co-injected into all transgenic lines tested. Cosmid was injected at a concentration of 10 μg / ml.

【００５１】 分子操作： ＰＣＲ増幅産物の自動配列分析によって、efk-1遺伝子座内のTc1挿入サイト
を決定した。efk-1特異的入れ子プライマーを、Tc1特異的プライマー(Ｌｌ-２お
よびＲｌ−２^２７)を組み合わせて用いた。使用したefk-1プライマーは： ＣＥＦＫ１：5'ＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＣＣ3'(配列番号:２)
ＣＥＦＫ２：5'ＴＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧ3'(配列番号:３)
ＣＥＦＫ３：5'ＡＡＴＣＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧ3'(配列番号:４)
ＣＥＦＫ４：5'ＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧ3'(配列番号:５)
であった。コスミドＦ４２Ａ１０は、efk-1遺伝子を含むものであり、サンガー
・センター・クローン・コレクションから入手し、C.elegansゲノム・シーケン
シング・コンソーシアムで維持した。プラスミド構築は、標準的分子生物学の方
法を用いて行った。遺伝子(ｐCefk-1)のレスキューゲノムクローンは、efk-1遺
伝子を含むコスミドＦ４２Ａ１０からの９．５ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
ト（コスミド上の９９２０位〜１９３７６位）をｐＵＣ１９ベクター内へサブク
ローニングすることによって構築した。このフラグメントは、Ｆ４２Ａ１０上の
１０８８５位〜１４１２６位に及ぶＥＦＫ−１をコードする領域、efk-1プロモ
ーターを含む５Ｋｂの上流配列および転写終結シグナルを含む約１Ｋｂの下流配
列を含む。efk-1転写物は、ＳＬ２へスプライスされるので、上流遺伝子がこの
プラスミド上に場所を提供されることが可能であり、たとえタンパク質予測プロ
グラムが候補コーディング領域の同定を失敗しても、すべてのフレームに幾つも
の停止コドンがあり、該領域に対するＥＳＴは同定されなかった。ｄｓＲＮＡｉ
は、表現型模写体に反してefk-1(ev640)の機能喪失表現型を方向付けた^２８。Ｅ
ＦＫ−１のカルボキシ末端に位置するｐCefk-1クローンからの１Ｋｂのフラグメ
ントを除去し、ＧＦＰベクターサブクローンから誘導されたＧＦＰコーディング
領域を含む０．７Ｋｂのフラグメントと置き換えることによって、ＧＦＰレポー
ター融合(ｐ_efk-1ＥＦＫ−１：：ＧＦＰ)を作成した。この置換によって、ｅＥ
Ｆ−２キナーゼの最後の８６個のアミノ酸を除去するＧＦＰのフレーム内翻訳融
合が作成された。Molecular Manipulation: The Tc1 insertion site within the efk-1 locus was determined by automated sequence analysis of PCR amplification products. The Efk-1-specific nested primers were used in combination Tc1 specific primers (Ll-2 and Rl-2 ^27). The efk-1 primer used was: CEFK1: 5'GCTTCCAACTCATCGAGGCACC3 '(SEQ ID NO: 2)
CEFK2: 5'TAGTCCAACTAACTCACCAGG3 '(SEQ ID NO: 3)
CEFK3: 5'AATCTCGTGACGAGTCAGTGG3 '(SEQ ID NO: 4)
CEFK4: 5'CATTGAGGATTGAAGAAAGGG3 '(SEQ ID NO: 5)
Met. Cosmid F42A10, which contains the efk-1 gene, was obtained from the Sanger Center Clone Collection and maintained in the C. elegans Genome Sequencing Consortium. Plasmid construction was performed using standard molecular biology methods. The rescue genomic clone of the gene (pCefk-1) was constructed by subcloning the 9.5 Kb HindIII fragment from cosmid F42A10 (position 9920 to 19376 on the cosmid) containing the efk-1 gene into the pUC19 vector. This fragment contains the EFK-1 coding region spanning positions 10885 to 14126 on F42A10, 5 Kb of upstream sequence containing the efk-1 promoter and about 1 Kb of downstream sequence containing the transcription termination signal. Since the efk-1 transcript is spliced into SL2, it is possible for the upstream gene to be provided with a place on this plasmid, and even if the protein prediction program fails to identify candidate coding regions, all There were several stop codons in frame and no EST for that region was identified. dsRNAi
Directed a loss-of-function phenotype of efk-1 (ev640), contrary to the phenotypic replica ²⁸ . E
By removing the 1 Kb fragment from the pCefk-1 clone located at the carboxy terminus of FK-1 and replacing it with a 0.7 Kb fragment containing the GFP coding region derived from the GFP vector subclone, the GFP reporter fusion (p _efk-1 EFK-1 :: GFP) was prepared. By this replacement, eE
An in-frame translational fusion of GFP was created that removes the last 86 amino acids of F-2 kinase.

【００５２】 インシトゥハイブリダイゼーション： コスミドＦ４２Ａ１０を含むC.elegansトランスジェニック系統ＢＣ４９０
９(ｓEx134)に対し、全胚インシトゥハイブリダイゼーションを用いて、早期発
達中のｅＥＦ−２キナーゼｍＲＮＡ発現のパターンを分析した。ハイブリダイゼ
ーションシグナルを得るためにefk-1の遺伝子投与量を増やすことが必要であっ
た。SeydouxおよびFireの方法^２９にしたがって、efk-1プローブを用いるハイブ
リダイゼーションを行った。プラスミドｐＣｅｆｋ−１を用い、ジゴキシゲニン
１１−ＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム）で標識したefk-1アンチセンスプロ
ーブを調製した。ハイブリダイゼーション後、基質としてＮＢＴ／Ｘ−ホスフェ
ートを用い、アルカリホスファターゼに複合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて
プローブを視覚化した。In situ hybridization: C. elegans transgenic line BC490 containing cosmid F42A10
9 (sEx134) was analyzed for patterns of eEF-2 kinase mRNA expression during early development using whole embryo in situ hybridization. It was necessary to increase the gene dosage of efk-1 to obtain hybridization signals. Hybridization with the efk-1 probe was performed according to Seydoux and Fire method ²⁹ . An efk-1 antisense probe labeled with digoxigenin 11-UTP (Boehringer Mannheim) was prepared using the plasmid pCefk-1. After hybridization, the probe was visualized using anti-digoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase with NBT / X-phosphate as substrate.

【００５３】寿命の分析 寿命の分析は、上で記載^{３、９〜１７}の通り２０℃で行なった。菌株を、寿命
を決定する前に少なくとも２世代、２０℃で増殖させた。寿命の分析は、各々の
菌株を調べる目的で、少なくとも３つの独立したトライアルについて行なった。
各アッセイは１００匹の動物を用いて始め、寿命分析において、産卵をｔ＝０と
した。動かなかったり、ポンプしなかったり、またはつついても反応しない場合
には、動物は死んだものとしてスコアした。プレートの外へはって出たり、それ
らの生殖腺が産卵口から体外に突出した「破壊された」表現型であったり、また
はふ化する卵を体内に蓄積するといった産卵に欠陥のある動物は、スコアから除
いた。我々は、統計学的分析を行なうために、エクセル２０００（マイクロソフ
ト）ソフトウェアを用いた^３０。 Lifetime Analysis Lifetime analysis was performed at 20 ° C. as described above 3, ^9-17 . Strains were grown at 20 ° C. for at least 2 generations before determining lifespan. Lifespan analyzes were performed on at least 3 independent trials for the purpose of examining each strain.
Each assay started with 100 animals, and spawning was t = 0 in the lifespan analysis. Animals were scored as dead if they did not move, did not pump, or did not respond to poking. Animals that are deficient in spawning, such as protruding out of the plate, having a "disrupted" phenotype with their gonads protruding out of the body from the spout, or accumulating hatching eggs in the body, Removed from the score. We used Excel 2000 (Microsoft) software to perform statistical analysis ³⁰ .

【００５４】ｅＥＦ−２キナーゼアッセイ 野生型および多数の変異体C.elegans抽出物におけるｅＥＦ−２キナーゼ活性
の分析を以下の通り行った。十分にえさを与えた線虫をＭ９培地を有するプレー
トから洗い出し（wash）、培地の最終的の容量を５０ｍＬに調節し、そのチュー
ブを−８０℃で保存した。抽出物を調製するために、５０ｍＬの緩衝液（これは
、１００ｍＭのヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、７ｍ
Ｍのｂ−ＭＥ、２−錠剤／１０ｍＭの完全プロテアーゼインヒビターカクテル（
ベーリンガーマンハイム製）を含有する）を、線虫を含有するＭ９培地（５０μ
Ｌ）に加えた。虫を、出力レベルが３であって循環効率が２０％である、Ｂｒａ
ｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ装置を用いて８回音波処理を行なった。デブリを３
０秒間、４℃で遠心分離（１６，０００×ｇ）を行なうことによってペレットし
た。次いで、等プロテイン濃度を含むようにその抽出物を調節し、ｅＥＦ−２キ
ナーゼアッセイに用いた。その反応混合物は、緩衝液中に抽出物（５μＬ）およ
び精製したラビットの網状赤血球ｅＥＦ−２（０．５μｇ）を含み、該緩衝液は
５０ｍＭのヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ ０．６）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５
ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＣａＣｌ_２、０．５μｇのカルモジュリン、６０μ
ＭのＡＴＰおよび２μＣｉの［ｇ−^３３Ｐ］−ＡＴＰ（Easytides，ＮＥＮ；比
活性は２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌに等しい）を含み、反応容量を総計４０μＬとす
る。反応は３０℃で５分間行ない、氷−水浴中でインキュベートすることによっ
て停止させた。５×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を加え、反応混合物を５分間加熱
した。試料を７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによっ
て分析した。ゲルをフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏ−Ｍａｘ ＭＲ−１）に３日
間曝露させた。 EEF-2 Kinase Assay Analysis of eEF-2 kinase activity in wild type and a number of mutant C. elegans extracts was performed as follows. Well-fed nematodes were washed from plates with M9 medium, the final volume of medium was adjusted to 50 mL and the tubes stored at -80 ° C. To prepare the extract, 50 mL of buffer (100 mM Hepes-KOH, pH 7.4), 300 mM NaCl, 7 m
M b-ME, 2-tablets / 10 mM complete protease inhibitor cocktail (
(Containing Boehringer Mannheim)) and M9 medium (50 μm) containing nematodes.
L). Insects, Bra with an output level of 3 and a circulation efficiency of 20%
Sonication was performed 8 times using a Nson Sonifier device. 3 debris
Pellet by performing centrifugation (16,000 xg) for 0 seconds at 4 ° C. The extract was then adjusted to include isoprotein concentrations and used in the eEF-2 kinase assay. The reaction mixture contained extract (5 μL) and purified rabbit reticulocyte eEF-2 (0.5 μg) in buffer, which was 50 mM Hepes-KOH (pH 0.6), 10 mM. Magnesium acetate, 5
mM DTT, 100 μM CaCl ₂ , 0.5 μg calmodulin, 60 μ
M of ATP and 2 μCi of [g- ³³ P] -ATP (Easytides, NEN; specific activity equal to 2000 Ci / mmol) are included, and the total reaction volume is 40 μL. The reaction was carried out at 30 ° C. for 5 minutes and stopped by incubation in an ice-water bath. 5x Laemmli sample buffer was added and the reaction mixture was heated for 5 minutes. Samples were analyzed by 7.5% SDS-PAGE and autoradiography. The gel was exposed to film (Kodak Bio-Max MR-1) for 3 days.

【００５５】タンパク質合成および分解分析 タンパク質合成アッセイにおいて、線虫を、先ず２０℃でE.Coli（菌株ＯＰ−
５０）をシードしたＮＧＭプレート上で増殖させた^２５。次いで、線虫をアミノ
酸、^３Ｈ−ロイシンを用いて補足したＮＰ−培地中、２０℃で標識化し、ＯＰ−
５０細菌を加熱殺菌した。遠心分離することによって、指定した時に動物を収集
し、１００ｍｇ／ｍＬのシクロヘキサミドを含有するＭ−９緩衝液中で３回洗浄
し、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ｐＨは、
７．４）中、１００℃で１０分間溶解させた。ミクロ遠心分離機中、４℃で５分
間、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）することによって、不溶なデブリを除いた
。取り込まれていない^３Ｈ−ロイシンをスピン透析によって除き、続いてＴＣＡ
沈降を行なった。そのＴＣＡにより沈降したプロテインを、２０ｍＭのＮａＯＨ
に再溶解した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ Ｒａｄクーマシーブルー色素結合ア
ッセイによって決定した。タンパク質（マイクログラム）当り、取りこまれた^３ Ｈ−ロイシンの量を、液体シンチレーションカウント法によって決定した。タン
パク質の分解アッセイについては、線虫を増殖し、上で記載の通り、^３Ｈ−ロイ
シンを用いて５時間標識化した。次いで、虫をＭ９で３回洗浄し、アミノ酸で補
足したＮＰ培地中で再び懸濁し、ＯＰ−５０細菌を加熱殺菌し、２０℃でインキ
ュベートした。指定した時に虫を収集し、タンパク質（マイクログラム）当りの
取りこまれた^３Ｈ−ロイシンの量を上で記載の通り決定した。 Protein Synthesis and Degradation Analysis In a protein synthesis assay, nematodes were first treated at 20 ° C. with E. Coli (strain OP-
50) were grown on seeded NGM plates ²⁵ . The nematodes were then labeled at 20 ° C. in NP-medium supplemented with the amino acid, ³ H-leucine, and OP-
50 bacteria were heat sterilized. Animals were harvested at designated times by centrifugation, washed 3 times in M-9 buffer containing 100 mg / mL cyclohexamide, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% SDS ( pH is
In 7.4), the solution was dissolved at 100 ° C. for 10 minutes. Insoluble debris was removed by centrifugation (14,000 rpm) in a microcentrifuge at 4 ° C. for 5 minutes. Unincorporated ³ H-leucine was removed by spin dialysis, followed by TCA.
Settling was performed. The protein precipitated by the TCA was treated with 20 mM NaOH.
Redissolved in. Protein concentration was determined by the Bio Rad Coomassie Blue dye binding assay. The amount of ³ H-leucine incorporated per microgram of protein was determined by liquid scintillation counting. For protein degradation assays, nematodes were grown and labeled with ³ H-leucine for 5 hours as described above. The worms were then washed 3 times with M9, resuspended in NP medium supplemented with amino acids, heat killed OP-50 bacteria and incubated at 20 ° C. Insects were collected at the indicated times and the amount of ³ H-leucine incorporated per protein (microgram) was determined as described above.

【００５６】結果および説明 イン シトゥーハイブリダイゼーションは、早期発達中の間に、efk-1が体壁（
body wall）筋肉の前駆体で発現することを示す。成体においては、P_efk-1EFK-1
：：GFPトランスジーンから発現した融合タンパク質は細胞質であって、該線虫
の全てにおいて一様に発現すると考えられる。そのEFK-1：：GFPレポータータン
パク質を、寿命に遅れて（少なくとも約２５日）検出することができる。 Results and Description In situ hybridization revealed that during early development, efk-1
body wall) is expressed in muscle precursors. In adults, P _efk-1 EFK-1
The fusion protein expressed from :: GFP transgene is cytoplasmic and is considered to be uniformly expressed in all of the nematodes. The EFK-1 :: GFP reporter protein can be detected late in life (at least about 25 days).

【００５７】 我々は、C.elegans ｅＥＦ−２キアーゼ遺伝子（ev640対立遺伝子）（これは
触媒的ドメインをコードするエキソンを破壊しており、全ての検出可能なｅＥＦ
−２キナーゼ活性を除いている）のＴｃ−１トランスポゾン挿入片を単離した（
図１Ａ、Ｂ）。翻訳の負の調節因子の欠如から予想される通り、プロテイン合成
の全体の速度は、efk-1突然変異体において上昇する（図１Ｃ）。我々は、efk-1
突然変異体におけるタンパク質分解の速度の上昇は、合成と分解との密な連関と
一致することも見出した（図１Ｄ）。efk-1突然変異体における総タンパク質代
謝回転速度の上昇は、通常の形態、協調性または生殖能力に影響を及ぼさなかっ
た。しかしながら、ｅＥＦ−２キナーゼ活性の低下は、発生並びに、歩行運動、
咽頭のポンピング、遊泳および排便のわずかに改変した速度（図２Ａ）、先に記
載したclk突然変異体^３、４に特有の表現型を中位に示した。しかしながら、clk
突然変異体と違って、efk-1(ev640)突然変異体は母性的にレスキューされない。
efk-1遺伝子を含む（harboring）染色体外アレイは、増殖の速度およびトランス
ジェニックなローラバックグラウンド中でアッセイすることができる全ての行動
上の表現型をレスキューするものであり、このことはこれらの表現型がefk-1(ev
640)突然変異体によって与えられることを証明する。We have found that the C. elegans eEF-2 chiase gene (ev640 allele), which disrupts the exon encoding the catalytic domain, causes all detectable eEF to be detected.
Tc-1 transposon insert excluding the -2 kinase activity) was isolated (
1A, B). The overall rate of protein synthesis is increased in the efk-1 mutant, as would be expected from the lack of a negative regulator of translation (Fig. 1C). We are efk-1
We also found that the increased rate of proteolysis in the mutant was consistent with a tight link between synthesis and degradation (Fig. ID). Increased total protein turnover rate in efk-1 mutants did not affect normal morphology, coordination or fertility. However, decreased eEF-2 kinase activity is associated with developmental and locomotor activity,
Slightly modified rates of pharyngeal pumping, swimming and defecation (FIG. 2A) showed a moderate phenotype specific to the clk mutants ³ and ⁴ described above. However, clk
Unlike the mutant, the efk-1 (ev640) mutant is not maternally rescued.
An extrachromosomal array harboring the efk-1 gene rescues all the behavioral phenotypes that can be assayed in the rate of proliferation and transgenic roller backgrounds. The phenotype is efk-1 (ev
640) Prove that given by the mutant.

【００５８】 寿命の延長は、clk突然変異体^３，４に特有の別の表現型であり、従って、我
々はずっとefk-1の生存度についてアッセイした。efk-1突然変異体は、長期間生
存する表現型を示すものであり、ここで３つの独立したトライアルを平均すると
、平均寿命は野生型よりも約３９％より長い。興味深いことに、efk-1遺伝子の
量を増加させた染色体外アレイを含む野生型の線虫は、短期の寿命を示す（図２
Ｂ）。Extended lifespan is another phenotype unique to clk mutants ³ , ⁴ and therefore we have always assayed for efk-1 viability. The efk-1 mutant exhibits a long-lived phenotype, where the average lifespan of three independent trials is about 39% longer than the wild type. Interestingly, wild-type nematodes containing extrachromosomal arrays with increased abundance of the efk-1 gene show a short life span (FIG. 2).
B).

【００５９】 C.elegans遺伝子の２群、clk遺伝子（これは、律動的な行動^３、４に影響を及
ぼす）およびage/daf遺伝子（これは、持続形成プログラム（dauer formation
program）^９〜１５に影響を及ぼす）は、異なる機構で寿命に影響を及ぼすも
のと考えられる。我々は、両方のクラスの代表的な突然変異体、clk-1(qm-30)お
よびage-1(HX546)中でのそれぞれのタンパク質合成の速度を測定した。我々は、
タンパク質合成の速度が両方の突然変異体において上昇することを見出した（図
３Ａ）。age-1(HX-546)は、寿命の延長が最大であること、および調べた突然変
異体のうちタンパク質合成の速度が最大であることの両方を有することを示した
（図３Ａ）。age-1(HX546）およびclk-1(qm-30)中で観察されるタンパク質合成
の増大は、タンパク質代謝回転速度の上昇が両クラスの突然変異体における寿命
の延長の通常の機構であることを示唆している。このことは、age-1；efk-1およ
びclk-1；efk-1の2重突然変異体の寿命の分析によって更に支持される。efk-1は
、age-1およびclk-1のいずれの寿命をも延長せず、このことより、age-1およびc
lk-1の両方の寿命延長の機構に遺伝的に関与している（図３Ｂ）。しかしながら
、age-1 clk-1二重突然変異体は、いずれかの単一の突然変異体よりも有意に長
く生存する。従って、age-1およびclk-1突然変異体の両方において観察される寿
命の延長は、単にタンパク質回転代謝によるものではあり得ない。我々は、age-
1およびできればclk-1突然変異体^１８によって与えられる寿命の延長に必要なフ
ォークヘッド（forkhead）ファミリー転写因子^{１６、１７}をコードしたdaf-16が
efk-1によって与えられる寿命の延長を防止することをも見出した（図３Ｃ）。Two groups of C. elegans genes, the clk gene (which affects rhythmic behaviors ³ , ⁴ ) and the age / daf gene (which is a dauer formation
program) ⁹ to ¹⁵ ) is considered to affect the life with different mechanisms. We measured the rate of respective protein synthesis in representative mutants of both classes, clk-1 (qm-30) and age-1 (HX546). we,
We found that the rate of protein synthesis was increased in both mutants (Fig. 3A). age-1 (HX-546) was shown to have both the longest prolongation of lifespan and the highest rate of protein synthesis among the mutants examined (Fig. 3A). The increased protein synthesis observed in age-1 (HX546) and clk-1 (qm-30) is due to the increased protein turnover rate being the normal mechanism of lifespan extension in both classes of mutants. It suggests. This is further supported by analysis of the longevity of age-1; efk-1 and clk-1; efk-1 double mutants. efk-1 does not extend the lifespan of either age-1 or clk-1, which indicates that age-1 and c
Both of lk-1 are genetically involved in the mechanism of life extension (FIG. 3B). However, the age-1 clk-1 double mutant survives significantly longer than either single mutant. Thus, the extended life span observed in both age-1 and clk-1 mutants cannot be solely due to protein turnover metabolism. We are age-
1 and preferably daf-16 encoding forkhead family transcription factors ¹⁶ and ¹⁷ required for extended life span conferred by clk-1 mutant ¹⁸
It was also found to prevent the extension of lifespan provided by efk-1 (Fig. 3C).

【００６０】 カロリー制限、すなわち栄養欠乏状態をともわないカロリー摂取の減少は、多
数の生体の寿命を増加させることが示されている^{１９、２０}。げっし類の場合に
は、それら食事制限は、タンパク質代謝回転の速度を上昇させることも観察され
ている^{２０、２１}。その正確な機構は明白ではないが、タンパク質代謝回転の上
昇が、食事制限による寿命の延長の主要な機構であると示唆されている^２０。上
記の実験において、２４時間食物なしで飼育したC.elegansにおいて、ｅＥＦ−
２キナーゼ活性が有意に低下し（図３Ｄ）、このことは食事制限の間にタンパク
質代謝回転の上昇が、ｅＥＦ−２キナーゼによる下方調節によって介され得るこ
とを示唆していることは注目される。同様の機構が哺乳動物においても機能し得
る。実際に、カロリー制限された月齢２２カ月のラット由来の肝臓抽出物中にお
けるｅＥＦ−２のレベルが年齢が同じ無制限に食物を与えたラットよりも低いこ
とが分かった^２２。Calorie restriction, or reduction of caloric intake with malnutrition, has been shown to increase longevity in many organisms ^19,20 . In the case of rodents, their dietary restriction has also been observed to increase the rate of protein turnover ^20,21 . The exact mechanism is not clear, but elevated protein turnover has been suggested to be the major mechanism of life extension by dietary restriction ²⁰ . In the above experiment, eEF- was used in C. elegans fed without food for 24 hours.
It was noted that 2 kinase activity was significantly reduced (FIG. 3D), suggesting that increased protein turnover during dietary restriction may be mediated by down-regulation by eEF-2 kinase. . Similar mechanisms may work in mammals. Indeed, it was found that the level of eEF-2 in liver extracts from calorie-restricted 22-month-old rats was lower than that of age-matched, unfed rats ²² .

【００６１】 実施例２ｅＥＦＫ−２ノックアウトマウスの産生 ｅＥＦ−２キナーゼノックアウトマウスを産生するために、標準的な方法を用
いた（Mansour,S.L.らによる（1988）Nature 336：348-352；Lee,E.Y.らによる
（1992）Nature 359：288-294；Jacks,T.らによる（1992）Nature 359：295-3
00）。要するに、マウスｅＥＦ−２キナーゼ触媒的ドメインの部分をネオマイシ
ン選択マーカーによって置き換えた標的マーカーを製造した。この標的ベクター
を肺幹細胞中にトランスフェクトし、１つのｅＥＦ−２キナーゼ対立遺伝子が破
壊されたセルラインを同定した。これらの細胞を肺盤胞中に注入し、その肺盤胞
を偽妊娠のマウスの卵管にインプラントした。ヘテロ接合性のキメラをサザン分
析によって確認した。そのホモ接合性のノックアウトはそのキメラを育種するこ
とによって産生した。従って、これまでに我々はいくつかの雄性および雌性のホ
モ接合性のノックアウトマウスを手に入れた。２つのホモ接合性の親からの子孫
を手に入れた。Example 2 Generation of eEFK-2 Knockout Mice Standard methods were used to generate eEF-2 kinase knockout mice (Mansour, SL et al. (1988) Nature 336: 348-352; Lee, EY et al. (1992) Nature 359: 288-294; Jacks, T. et al. (1992) Nature 359: 295-3.
00). Briefly, a target marker was prepared in which part of the mouse eEF-2 kinase catalytic domain was replaced by a neomycin selectable marker. This targeting vector was transfected into lung stem cells to identify cell lines in which one eEF-2 kinase allele was disrupted. These cells were infused into pulmonary cysts, which were then implanted into the oviducts of pseudopregnant mice. Heterozygous chimeras were confirmed by Southern analysis. The homozygous knockout was produced by breeding the chimera. Therefore, so far we have obtained several male and female homozygous knockout mice. Progeny from two homozygous parents were obtained.

【００６２】 予備分析は、ｅＥＦ−２キナーゼノックアウトマウスまたはそれらの子孫につ
いてはいかなる異常も示さなかった。それらは、野生型のマウスと区別すること
ができる正常な形態を有している。ホモ接合性のｅＥＦ−２キナーゼノックアウ
ト雄性を、ホモ接合性ノキナーゼキナーゼノックアウト雌性とかけ合わせた場合
には、正常なサイズの同腹の１０子を得た。これらの観察から、我々は、線虫の
場合と同様に、ｅＥＦ−２キナーゼはマウスにおける生存、発育または生殖に必
須ではないと結論付ける。Preliminary analysis did not show any abnormalities in eEF-2 kinase knockout mice or their progeny. They have a normal morphology that can be distinguished from wild type mice. When homozygous eEF-2 kinase knockout males were crossed with homozygous nokinase kinase knockout females, 10 litters of normal size were obtained. From these observations, we conclude that, as in the case of nematodes, eEF-2 kinase is not essential for survival, development or reproduction in mice.

【００６３】 参考文献[0063] References

【数１】 [Equation 1]

【数２】 [Equation 2]

【数３】 [Equation 3]

【００６４】 本発明は、上に記載し、例示した実施態様に限定されるわけではなく、添付の
特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく変更および修飾が行われ得る。The present invention is not limited to the embodiments described and illustrated above, but changes and modifications can be made without departing from the scope of the appended claims.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 Ａ．Ｔｃ１挿入は対立遺伝子ｅｖ６４９においてC. elegansのｅ
ＥＦ−２キナーゼ触媒ドメインを中断する。無地の灰色の方形はｅＥＦ−２エク
ソンを示し、各エクソンのヌクレオチドでの長さを上に括弧に入れてある。イン
トロンの位置は実線で示してあり、ヌクレオチドの長さを括弧に入れてある。エ
クソンＩＶは転写物の５０％に含まれる。両ｍＲＮＡはトランススプライスされ
て３つのＳＬ２変異体となり、そのうちの一つ（５'ＧＧＴＴＴＡＡＡＡＣＣＣ
ＡＧＴＴＡＣＣＡＡＧ３'）（配列番号１）は以前に記載されていないものであ
る。ｅＥＦ−２キナーゼの触媒ドメインは強調してあり、Ｔｃ１挿入部位を示し
てある。 Ｂ．ｅｆｋ−１エクソンIIへのＴｃ１トランスポゾンの挿入はｅＥＦ−２キナ
ーゼ活性を中断する。１．対立遺伝子ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）は開始コドンか
ら３０４ｂｐにＴｃ１挿入を有する。ｅｆｋ−１特異的プライマーおよびＴｃ１
特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅は、野生型（レーン１）には存在しないｅ
ｆｋ−１変異体において５１５ｂｐ断片を生成する（レーン２）。配列分析はト
ランスポゾンの挿入部位を触媒ドメイン内のＥＦＫ−１コドン１０１の後に位置
付けている。２．ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）はｅＥＦ−２キナーゼ活性が欠失し
ている。野生型Ｎ２（レーン１）、ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）（レーン２）、ｅ
ｆｋ−１遺伝子の染色体外マルチコピーアレイを有するｅｆｋ−１（ｅｖ６４０
）（レーン３）およびｅｆｋ−１遺伝子の染色体外マルチコピーアレイを有する
野生型Ｎ２（レーン４）を、^３２Ｐ−ＡＴＰの存在下、ｅＥＦ−２タンパク質と
ともにインキュベートした。 Ｃ．タンパク質合成速度はｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）で上昇する。タンパク質
合成の測定は、ＴＣＡ−沈降タンパク質への^３Ｈ−ロイシンの導入を測定するこ
とにより行った（方法を参照）。タンパク質合成速度は測定線の勾配により計算
する。Ｎ２と比較して標準化した速度は、Ｎ２が１、ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）
が１.６４である。 Ｄ．タンパク質分解速度はｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）で増大する。野生型タン
パク質およびｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）タンパク質を^３Ｈ−ロイシンで５時間標
識し、ついで非放射性アミノ酸で追跡した。ＴＣＡ沈降タンパク質のカウントを
所定時間に測定した。FIG. 1 A. The Tc1 insertion is a C. elegans e at allele ev649
It disrupts the EF-2 kinase catalytic domain. The solid gray squares represent eEF-2 exons, with the length in nucleotides of each exon bracketed above. The position of the intron is indicated by the solid line and the length of the nucleotide is in parentheses. Exon IV is contained in 50% of transcripts. Both mRNAs were trans-spliced into three SL2 mutants, one of which (5'GGTTTAAAACCC
AGTTACCAAG3 ') (SEQ ID NO: 1) has not previously been described. The catalytic domain of eEF-2 kinase is highlighted and the Tc1 insertion site is indicated. B. Insertion of the Tc1 transposon into efk-1 exon II disrupts eEF-2 kinase activity. 1. The allele efk-1 (ev640) has a Tc1 insertion 304 bp from the start codon. efk-1 specific primer and Tc1
PCR amplification with specific primers is not present in wild type (lane 1) e
Generate a 515 bp fragment in the fk-1 mutant (lane 2). Sequence analysis has positioned the transposon insertion site within the catalytic domain after EFK-1 codon 101. 2. efk-1 (ev640) lacks eEF-2 kinase activity. Wild type N2 (lane 1), efk-1 (ev640) (lane 2), e
efk-1 (ev640) with extrachromosomal multicopy array of fk-1 gene
) (Lane 3) and wild type N2 with extrachromosomal multicopy array of the efk-1 gene (lane 4) were incubated with eEF-2 protein in the presence of ³² P-ATP. C. The rate of protein synthesis increases with efk-1 (ev640). Measurement of protein synthesis was performed by measuring the incorporation of ³ H-leucine into the TCA-precipitated protein (see methods). The protein synthesis rate is calculated by the slope of the measurement line. The standardized speed compared with N2 is N2 is 1, efk-1 (ev640)
Is 1.64. D. The rate of protein degradation is increased with efk-1 (ev640). Wild type and efk-1 (ev640) proteins were labeled with ³ H-leucine for 5 hours and then chased with non-radioactive amino acids. Counts of TCA precipitated protein were measured at predetermined times.

【図２】 Ａ．ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）変異体は、一般に遅くなった成長
および幾つかの律動的な挙動に対して変化したタイミングを示す。ｅｆｋ−１（
ｅｖ６４０）Ｅｘ［ｐＣｅｆｋ−１］は、ｅｆｋ−１遺伝子の染色体外マルチコ
ピーアレイを有するｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）のトランスジェニック株である。
挙動を少なくとも５０匹の動物でアッセイし、記載されたように（Lakowski, 19
96）各動物のスコアを５〜１０の試行で得た。スコアは±標準偏差を示す。平均
的なスコアは他のｃｌｋ変異体と同様に一層長い成長および遅くなった律動的挙
動を示すが、ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）個体間でかなりの変動があることに注意
。ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）が産んだ卵の総数は野生型と同等であったが、野生
型の繁殖力があったのが８日間であったのに対してｅｖ６４０の繁殖力があった
のは１０日間であった。 Ｂ．ｅｆｋ−１遺伝子の量と寿命との間の逆相関関係。３つの独立した実験か
ら計算した平均寿命（日）：Ｎ２、１８±２；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）、２５
±３；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）、３１±２；ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）、２８±４
；Ｎ２ Ｅｘ［ｐＣｅｆｋ−１ ｐＲＦ４］（ｅｆｋ−１のマルチコピー遺伝子ア
レイを有する野生型）、１３±２。最大の寿命の値は、Ｎ２、３２±３；ｅｆｋ
−１（ｅｖ６４０）、３７±４；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）、４７±３；ｃｌｋ−
２（ｑｍ３７）、３９±５；Ｎ２ Ｅｘ［ｐＣｅｆｋ−１ ｐＲＦ４］、２３±５
であった。ｅｆｋ−１過剰発現株もまた同時発現マーカーとしてトランスジーン
ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６（ｓｕ１００６））を含むので、本発明者らはまたｐＲＦ
４トランスジーンのみを有する野生型動物の寿命をアッセイしたところ、野生型
と同様であることが確認された：Ｎ２ Ｅｘ［ｐＲＦ４］の平均寿命は１７±３
、最大寿命は３１±４。平均寿命および最大寿命に対するＰ値は、全ての場合に
＜０.０５であった。FIG. 2 A. The efk-1 (ev640) mutants generally exhibit altered timing for slower growth and some rhythmic behavior. efk-1 (
ev640) Ex [pCefk-1] is a transgenic strain of efk-1 (ev640) having an extrachromosomal multicopy array of the efk-1 gene.
Behavior was assayed in at least 50 animals and as described (Lakowski, 19
96) A score for each animal was obtained in 5-10 trials. Scores show ± standard deviation. Note that the average score shows longer growth and slower rhythmic behavior like the other clk mutants, but there is considerable variability among efk-1 (ev640) individuals. The total number of eggs produced by efk-1 (ev640) was the same as that of the wild type, but the fertility of the wild type was 8 days, whereas the fertility of ev640 was It was 10 days. B. Inverse correlation between the amount of efk-1 gene and longevity. Life expectancy (days) calculated from 3 independent experiments: N2, 18 ± 2; efk-1 (ev640), 25
± 3; clk-1 (qm30), 31 ± 2; clk-2 (qm37), 28 ± 4
N2 Ex [pCefk-1 pRF4] (wild type with multicopy gene array of efk-1), 13 ± 2; The maximum lifetime value is N2, 32 ± 3; efk
-1 (ev640), 37 ± 4; clk-1 (qm30), 47 ± 3; clk-
2 (qm37), 39 ± 5; N2 Ex [pCefk-1 pRF4], 23 ± 5.
Met. Since the efk-1 overexpressing strain also contains the transgene pRF4 (roll-6 (su1006)) as a co-expression marker, we also pRF.
Lifespan of wild-type animals with only the 4 transgene was assayed and confirmed to be similar to wild-type: N2 Ex [pRF4] has an average lifespan of 17 ± 3.
The maximum life is 31 ± 4. P-values for average life and maximum life were <0.05 in all cases.

【図３】 Ａ．タンパク質合成速度はｃｌｋ−１（ｑｍ３０）変異体および
ａｇｅ−１（ｈｘ５４６）変異体で増大する。タンパク質合成の測定は、ＴＣＡ
−沈降タンパク質への^３Ｈ−ロイシンの導入を測定することにより行った。 Ｂ．ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）は長く生き長らえたａｇｅ−１（ｈｘ５４６）
変異体およびｃｌｋ−１（ｑｍ３０）変異体の寿命を延ばさない。３つの独立し
た実験から計算した平均寿命（日）：Ｎ２、１８±２；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０
）、２５±３；ａｇｅ−１（ｈｘ５４６）、３３±３；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）
、３０±４；ａｇｅ−１（ｈｘ５４６）；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異体
、３２±３；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異体、３
１±３。最大の寿命の値は、Ｎ２、３１±３；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）、３５
±３；ａｇｅ−１（ｈｘ５４６）、４８±４；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）、３９±
４；ａｇｅ−１（ｈｘ５４６）；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異体、４９±
４；ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異体、３８±５で
あった。平均寿命および最大寿命に対するＰ値は、全ての場合に＜０.０５であ
った。 Ｃ．ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）によって付与される寿命の延長にはｄａｆ−１
６が必要である。３つの独立した実験から計算した平均寿命（日）：Ｎ２、１８
±３；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）、２５±４；ｄａｆ−１６（ｍｇＤｆ５０）、
１６±３；ｄａｆ−１６（ｍｇＤｆ５０）；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異
体、１７±４。最大の寿命の値は、Ｎ２、３０±３；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）
、３８±４；ｄａｆ−１６（ｍｇＤｆ５０）、２６±３；ｄａｆ−１６（ｍｇＤ
ｆ５０）；ｅｆｋ−１（ｅｖ６４０）二重変異体、２８±４であった。平均寿命
および最大寿命に対するＰ値は、全ての場合に＜０.０５であった。 Ｄ．２４時間断食した動物はｅＥＦ−２キナーゼ活性の有意の低下を示す。方
法に記載したようにして、充分に食餌を与えた（レーン１）および２４時間断食
した（レーン２）同調した初期成体培養から抽出物を調製した。リン酸化された
ｅＥＦ−２に対応するバンドを矢印の先で示す。FIG. 3 A. Protein synthesis rates are increased in clk-1 (qm30) and age-1 (hx546) mutants. Protein synthesis is measured by TCA
-By measuring the incorporation of ³ H-leucine into the precipitated protein. B. efk-1 (ev640) is a long-lived age-1 (hx546)
It does not extend the lifespan of the mutant and the clk-1 (qm30) mutant. Mean life span (days) calculated from 3 independent experiments: N2, 18 ± 2; efk-1 (ev640)
), 25 ± 3; age-1 (hx546), 33 ± 3; clk-1 (qm30).
, 30 ± 4; age-1 (hx546); efk-1 (ev640) double mutant, 32 ± 3; clk-1 (qm30) efk-1 (ev640) double mutant, 3
1 ± 3. The maximum lifetime value is N2, 31 ± 3; efk-1 (ev640), 35
± 3; age-1 (hx546), 48 ± 4; clk-1 (qm30), 39 ±
4; age-1 (hx546); efk-1 (ev640) double mutant, 49 ±
4; clk-1 (qm30) efk-1 (ev640) double mutant, 38 ± 5. P-values for average life and maximum life were <0.05 in all cases. C. efk-1 (ev640) provides a lifetime extension of daf-1
6 is required. Life expectancy (days) calculated from 3 independent experiments: N2, 18
± 3; efk-1 (ev640), 25 ± 4; daf-16 (mgDf50),
16 ± 3; daf-16 (mgDf50); efk-1 (ev640) double mutant, 17 ± 4. The maximum lifetime value is N2, 30 ± 3; efk-1 (ev640)
, 38 ± 4; daf-16 (mgDf50), 26 ± 3; daf-16 (mgD
f50); efk-1 (ev640) double mutant, 28 ± 4. P-values for average life and maximum life were <0.05 in all cases. D. Animals fasted for 24 hours show a significant reduction in eEF-2 kinase activity. Extracts were prepared from synchronized early adult cultures fed well (lane 1) and fasted for 24 hours (lane 2) as described in Methods. The band corresponding to phosphorylated eEF-2 is indicated by the tip of the arrow.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/99 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 ＺＮＡ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/48 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 335 Ｇｅｏｒｇｅ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐ． Ｏ．Ｂｏｘ 2688，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗ ｉｃｋ、ＮＪ 08903、Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 アレクセイ・ジー・リャゾノフ アメリカ合衆国ニュージャージー州プリン ストン (72)発明者 ケクタリオス・タバーナラキス アメリカ合衆国ニュージャージー州ニュ ー・ブランズウィック (72)発明者 モニカ・ドリスコル アメリカ合衆国ニュージャージー州ハイラ ンド・パーク (72)発明者 カレン・パバー アメリカ合衆国ニュージャージー州ハイラ ンド・パーク (72)発明者 ブラッドリー・ネフスキー アメリカ合衆国ニュージャージー州ハイラ ンド・パーク、アパートメント・２ビー、 サウス・ファースト・アベニュー405番 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA29 AA40 CB17 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 CA01 CA04 CA11 DA02 DA05 EA04 FA02 GA11 HA11 4B050 CC03 CC04 CC07 DD07 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QQ01 QQ02 QQ08 QQ13 QQ27 QR08 QR32 QR59 QR62 QR77 QR80 QS05 QS25 QS36 QX02 4C084 AA02 AA13 AA17 DC32 NA14 ZB212 ZC202 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61P 43/00 111 C12N 9/12 C12N 9/12 9/99 9/99 C12Q 1/02 15/09 ZNA 1/48 Z C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/48 33/50 Z G01N 33/15 33/68 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/68 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT , BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM) , GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS , LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71) Applicant 335 George Street, P.P. O. Box 2688, New Brunswick, NJ 08903, U.S.E. S. A. (72) Inventor Alexei G. Ryazonov Princeton, NJ, USA (72) Inventor Kectarios Tabanarakis, New Brunswick, NJ, USA (72) Inventor, Monica Doriskol, Highland Park, NJ, USA (72) Inventor Karen Paber Highland Park, NJ, USA (72) Inventor Bradley Nevsky Highland Park, NJ, USA, Apartment 2B, South First Avenue 405F Term (reference) 2G045 AA28 AA29 AA40 CB17 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 CA01 CA04 CA11 DA02 DA05 EA04 FA02 GA11 HA11 4B050 CC03 CC04 CC07 DD07 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QQ01 QQ02 QRQ08 QQ13 QQ27 QR05 QR32 QRQ QR QR QR QR QR QR QR QR QR 4C084 AA02 AA13 AA17 DC32 NA14 ZB212 ZC202

Claims (36)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 被験体のタンパク質代謝回転を上昇させ、このタンパク質代
謝回転の上昇により被験体の寿命の延長を生じさせることを含む、被験体の寿命
を延ばす方法。1. A method of extending the lifespan of a subject, comprising increasing protein turnover in the subject, the increase in protein turnover resulting in an extension of the lifespan of the subject. 【請求項２】 前記被験体のタンパク質代謝回転の上昇が該被験体内のＥＦ
−２キナーゼ活性を低下させることにより行われる、請求項１に記載の方法。2. An increase in protein turnover in the subject is due to EF in the subject.
The method according to claim 1, which is carried out by decreasing the activity of the -2 kinase. 【請求項３】 前記ＥＦ−２キナーゼ活性が、前記被験体により産生される
機能的なＥＦ−２キナーゼの量を減少させることにより低下されている、請求項
２に記載の方法。3. The method of claim 2, wherein the EF-2 kinase activity is reduced by reducing the amount of functional EF-2 kinase produced by the subject. 【請求項４】 前記機能的なＥＦ−２キナーゼの量が、該ＥＦ−２キナーゼ
をコードする遺伝子の発現を低減させることにより減少されている、請求項３に
記載の方法。4. The method of claim 3, wherein the amount of the functional EF-2 kinase is reduced by reducing the expression of the gene encoding the EF-2 kinase. 【請求項５】 前記ＥＦ−２キナーゼをコードする遺伝子を、機能不全であ
るかまたは非機能性のＥＦ−２キナーゼをコードするように改変することにより
、機能的なＥＦ−２キナーゼの量が減少されている、請求項３に記載の方法。5. The amount of functional EF-2 kinase is modified by modifying the gene encoding the EF-2 kinase so as to encode a dysfunctional or non-functional EF-2 kinase. The method of claim 3, wherein the method is reduced. 【請求項６】 被験体のタンパク質代謝回転を上昇させ、このタンパク質代
謝回転の上昇により該被験体の寿命の延長を生じさせることを含む、被験体の一
生のうちの性的に活発な時期の長さを延ばす方法。6. A sexually active period of a subject's life, comprising increasing protein turnover in a subject, and increasing this protein turnover results in an extension of the subject's lifespan. How to extend the length. 【請求項７】 前記被験体のタンパク質代謝回転の上昇が該被験体内のＥＦ
−２キナーゼ活性を低下させることにより行われる、請求項６に記載の方法。7. The increase in protein turnover in the subject is due to EF in the subject.
7. The method according to claim 6, which is carried out by reducing the -2 kinase activity. 【請求項８】 前記ＥＦ−２キナーゼ活性が、被験体により産生される機能
的なＥＦ−２キナーゼの量を減少させることにより低下されている、請求項７に
記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the EF-2 kinase activity is reduced by reducing the amount of functional EF-2 kinase produced by the subject. 【請求項９】 前記機能的なＥＦ−２キナーゼの量が、該ＥＦ−２キナーゼ
をコードする遺伝子の発現を減少させることにより減少されている、請求項８に
記載の方法。9. The method of claim 8, wherein the amount of the functional EF-2 kinase is reduced by reducing the expression of the gene encoding the EF-2 kinase. 【請求項１０】 前記ＥＦ−２キナーゼをコードする遺伝子を、機能不全で
あるかまたは非機能的性のＥＦ−２キナーゼをコードするように改変することに
より、機能的なＥＦ−２キナーゼの量が減少されている、請求項８に記載の方法
。10. An amount of functional EF-2 kinase by modifying the gene encoding said EF-2 kinase to encode a dysfunctional or non-functional EF-2 kinase. 9. The method of claim 8, wherein is reduced. 【請求項１１】 被験体のタンパク質代謝回転を上昇させ、このタンパク質
代謝回転の上昇により該被験体の寿命の延長を生じさせることを含む、被験体の
加齢速度を低下させる方法。11. A method of reducing the aging rate of a subject, comprising increasing protein turnover in the subject, and increasing this protein turnover results in an extension of the lifespan of the subject. 【請求項１２】 前記被験体のタンパク質代謝回転の上昇が該被験体内のＥ
Ｆ−２キナーゼ活性を低下させることにより行われる、請求項１１に記載の方法
。12. An increase in protein turnover in the subject is due to E in the subject.
The method according to claim 11, which is carried out by reducing F-2 kinase activity. 【請求項１３】 前記被験体により産生される機能的なＥＦ−２キナーゼの
量を減少させることにより該ＥＦ−２キナーゼ活性が低下されている、請求項１
２に記載の方法。13. The EF-2 kinase activity is reduced by reducing the amount of functional EF-2 kinase produced by the subject.
The method described in 2. 【請求項１４】 前記ＥＦ−２キナーゼをコードする遺伝子の発現を低減さ
せることにより機能的なＥＦ−２キナーゼの量が減少されている、請求項１３に
記載の方法。14. The method of claim 13, wherein the amount of functional EF-2 kinase is reduced by reducing the expression of the gene encoding said EF-2 kinase. 【請求項１５】 前記ＥＦ−２キナーゼをコードする遺伝子を、機能不全で
あるかまたは非機能性のＥＦ−２キナーゼをコードするように改変することによ
り、機能的なＥＦ−２キナーゼの量が減少されている、請求項１３に記載の方法
。15. The amount of functional EF-2 kinase is modified by modifying the gene encoding EF-2 kinase to encode a dysfunctional or non-functional EF-2 kinase. 14. The method of claim 13, which is reduced. 【請求項１６】 ａ）コントロールサンプルおよび試験サンプルである細胞
を提供すること； ｂ）該試験サンプルを試験化合物に曝露すること； ｃ）該コントロールサンプルおよび該試験サンプルの細胞におけるタンパク質
代謝回転速度を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプルにお
けるタンパク質代謝回転速度の上昇が、該試験化合物が被験体の寿命を延長させ
るかまたは加齢を遅延させる指標であることを含む、試験化合物が被験体の寿命
を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定する方法。16. A) providing cells that are a control sample and a test sample; b) exposing the test sample to a test compound; c) determining the protein turnover rate in cells of the control sample and the test sample. The test compound is tested, including an increase in the protein turnover rate in the test sample measured and compared to the control sample is an indicator that the test compound prolongs the life of the subject or delays aging. A method of measuring whether the body extends lifespan or delays aging. 【請求項１７】 試験化合物が被験体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅
延させるかどうかを測定するアッセイを行うためのキットであって、細胞内のタ
ンパク質代謝回転速度を決定するための試薬および該アッセイを行うための細胞
のキット構成要素の使用説明書、および場合によりアッセイを行うための培養細
胞を含むキット。17. A kit for carrying out an assay for determining whether a test compound prolongs the lifespan or delays aging of a subject, which is a reagent for determining the intracellular protein turnover rate. And a kit containing instructions for using the kit components of the cells to perform the assay, and optionally cultured cells to perform the assay. 【請求項１８】 ａ）コントロールサンプルおよび試験サンプルである活性
なＥＦ−２キナーゼを提供すること； ｂ）該試験サンプルを試験化合物に曝露すること；ならびに ｃ）該コントロールサンプルおよび該試験サンプルにおけるＥＦ−２キナーゼ
活性を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプルにおけるＥＦ
−２キナーゼ活性の低下が、試験化合物が被験体のＥＦ−２キナーゼ活性を低下
させることにより被験体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させる指標であ
ることを含む、試験化合物がＥＦ−２キナーゼ活性を低下させることにより被験
体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定するための無細
胞方法。18. A) providing an active EF-2 kinase that is a control sample and a test sample; b) exposing the test sample to a test compound; and c) EF in the control sample and the test sample. -2 kinase activity was measured and EF in the test sample compared to the control sample
Test compound is EF-, wherein the decrease in -2 kinase activity is an indicator that the test compound decreases the EF-2 kinase activity of the subject, thereby prolonging the lifespan of the subject or delaying aging. 2 A cell-free method for determining whether to extend the lifespan or delay aging of a subject by reducing the activity of 2 kinases. 【請求項１９】 試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性を低下
させることにより寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定す
るアッセイを行うための、該ＥＦ−２キナーゼおよび該アッセイを行うために、
該ＥＦ−２キナーゼを使用する説明書を含むキット。19. The EF-2 kinase and the EF-2 kinase for performing an assay to determine whether a test compound reduces life span extension or aging by reducing EF-2 kinase activity in a subject. To perform the assay
A kit comprising instructions for using the EF-2 kinase. 【請求項２０】 ａ）コントロールサンプルおよび試験サンプルである、活
性なＥＦ−２キナーゼを含む細胞を提供すること； ｂ）該試験サンプルを試験化合物に曝露すること；ならびに ｃ）該コントロールサンプルおよび該試験サンプルにおけるＥＦ−２キナーゼ
活性を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプルにおけるＥＦ
−２キナーゼ活性の低下が、試験化合物が該被験体のＥＦ−２キナーゼ活性を低
下させることにより該被験体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させる指標
であることを含む、試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性を低下さ
せることにより寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定する
ための細胞に基づく方法。20. a) providing cells containing an active EF-2 kinase that are a control sample and a test sample; b) exposing the test sample to a test compound; and c) the control sample and the EF-2 in the test sample measured EF-2 kinase activity and compared with the control sample
Test compound, wherein the decrease in -2 kinase activity is an index that the test compound decreases the EF-2 kinase activity of the subject, thereby prolonging the life span of the subject or delaying aging. A cell-based method for determining whether to extend lifespan or delay aging by reducing EF-2 kinase activity in a subject. 【請求項２１】 試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性を低下
させることにより寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させるかどうかを測定す
るアッセイを行うための、活性なＥＦ−２キナーゼを含む細胞および該アッセイ
を行うために該細胞を使用するための説明書を含む、キット。21. An active EF-2 kinase for assaying whether a test compound reduces life span extension or aging by reducing EF-2 kinase activity in a subject. A kit comprising cells comprising and instructions for using the cells to perform the assay. 【請求項２２】 ａ）ＥＦ−２キナーゼをコードする遺伝子由来の発現調節
エレメントの１つ以上に、操作可能に連結されたレポーターコード配列を有する
ＤＮＡ構築物を含む発現系であって、さらにレポーター遺伝子産物を産生するた
めのレポーターコード配列の発現を可能にする構成要素を含んでいる発現系を提
供すること； ｂ）コントロールサンプルおよび試験サンプルである該発現系を提供すること
； ｃ）該試験サンプルを試験化合物に曝露すること；ならびに ｄ）該コントロールサンプルおよび該試験サンプルにおけるレポーター遺伝子
産物の量を測定し、該コントロールサンプルと比較した該試験サンプルにおける
レポーター遺伝子産物の量の減少が、該試験化合物が被験体のＥＦ−２キナーゼ
活性を低下させることにより被験体の寿命を延長させるかまたは加齢を遅延させ
る指標であることを含む、該試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼをコ
ードする遺伝子の発現を低減させることにより寿命を延長させるかまたは加齢を
遅延させるかどうかを測定する方法。22. An expression system comprising: a) a DNA construct having a reporter coding sequence operably linked to one or more expression control elements derived from a gene encoding EF-2 kinase, the reporter gene further comprising: Providing an expression system comprising components that allow expression of a reporter coding sequence to produce a product; b) providing the expression system which is a control sample and a test sample; c) the test sample Exposing the test compound to a test compound; and d) measuring the amount of the reporter gene product in the control sample and the test sample, and decreasing the amount of the reporter gene product in the test sample compared to the control sample is the test compound. Test by decreasing the EF-2 kinase activity of the subject. Increasing lifespan by reducing the expression of a gene encoding EF-2 kinase in a subject, or aging, which is an indicator of prolonging body life or delaying aging, How to measure whether to delay. 【請求項２３】 前記発現系が前記ＤＮＡ構築物で形質転換した細胞である
、請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein the expression system is a cell transformed with the DNA construct. 【請求項２４】 前記ＥＦ−２遺伝子発現調節エレメントがプロモーターで
ある、請求項２２に記載の方法。24. The method according to claim 22, wherein the EF-2 gene expression regulatory element is a promoter. 【請求項２５】 試験化合物が被験体におけるＥＦ−２キナーゼをコードす
る遺伝子の発現を低減させることにより寿命を延長させるかまたは加齢を遅延さ
せるかどうかを測定するアッセイを行うための、請求項２４に記載のＤＮＡ構築
物および、場合により発現系、ならびにアッセイを行うための説明書を含むキッ
ト。25. A method for conducting an assay to determine whether a test compound reduces lifespan or delays aging by reducing expression of a gene encoding EF-2 kinase in a subject. A kit comprising the DNA construct according to 24 and optionally an expression system and instructions for performing the assay. 【請求項２６】 ａ）動物モデル系において、タンパク質代謝回転と動物の
寿命の間の正の相関関係を示す検量線を確立すること； ｂ）被験体におけるタンパク質の代謝回転を測定すること； ｃ）該被験体におけるタンパク質代謝回転と該検量線で示されている該動物モ
デルにおけるタンパク質代謝回転とを比較すること；ならびに ｄ）該被験体の寿命の予後決定を行なうことを含む、被験体の寿命を決定する
ための予後方法。26. a) establishing a standard curve showing a positive correlation between protein turnover and animal longevity in an animal model system; b) measuring protein turnover in a subject; c. ) Comparing protein turnover in the subject with protein turnover in the animal model represented by the calibration curve; and d) subjecting the subject to prognosis of longevity. Prognostic method for determining lifespan. 【請求項２７】 ａ）動物モデル系において、ＥＦ−２キナーゼ活性と動物
の寿命の間の負の相関関係を示す検量線を確立すること； ｂ）被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性を測定すること； ｃ）該被験体におけるＥＦ−２キナーゼ活性と該検量線で示されている該動物
モデルにおけるＥＦ−２キナーゼ活性とを比較すること；ならびに ｄ）該被験体の寿命の予後測定を行うことを含む、被験体の寿命を測定するた
めの予後方法。27) a) establishing a calibration curve showing a negative correlation between EF-2 kinase activity and animal longevity in an animal model system; b) measuring EF-2 kinase activity in a subject. C) comparing the EF-2 kinase activity in the subject with the EF-2 kinase activity in the animal model represented by the calibration curve; and d) performing a prognostic measurement of the life span of the subject. A prognostic method for measuring the life span of a subject, comprising: 【請求項２８】 生物学的に適合性の媒体中に細胞性タンパク質の代謝回転
を上昇させる薬物を含む、被験体の寿命を延長させるかまたは加齢速度を遅延さ
せるための医薬製剤。28. A pharmaceutical formulation for prolonging the life or slowing the rate of aging of a subject comprising a drug that increases cellular protein turnover in a biologically compatible medium. 【請求項２９】 前記薬剤がＥＦ−２キナーゼ活性のインヒビターである、
請求項２８に記載の医薬製剤。29. The agent is an inhibitor of EF-2 kinase activity,
The pharmaceutical preparation according to claim 28. 【請求項３０】 前記薬剤がＥＦ−２キナーゼ遺伝子発現のインヒビターで
ある、請求項２８に記載の医薬製剤。30. The pharmaceutical preparation according to claim 28, wherein the agent is an inhibitor of EF-2 kinase gene expression. 【請求項３１】 タンパク質合成を負に制御する酵素が機能不全であるか、
非機能性であるか、または存在していない、遺伝子操作され た非ヒト生物。31. Whether the enzyme that negatively regulates protein synthesis is dysfunctional,
A genetically engineered non-human organism that is non-functional or non-existent. 【請求項３２】 前記酵素がＥＦ−２キナーゼである、請求項３１に記載の
生物。32. The organism of claim 31, wherein the enzyme is EF-2 kinase. 【請求項３３】 げっ歯類および線虫からなる群から選択される、請求項３
１に記載の生物。33. The method of claim 3 selected from the group consisting of rodents and nematodes.
1. The organism according to 1. 【請求項３４】 タンパク質合成を負に制御する酵素を過剰発現する、遺伝
子操作された非ヒト生物。34. A genetically engineered non-human organism that overexpresses an enzyme that negatively regulates protein synthesis. 【請求項３５】 前記酵素がＥＦ−２キナーゼである、請求項３４に記載の
生物。35. The organism of claim 34, wherein the enzyme is EF-2 kinase. 【請求項３６】 げっ歯類および線虫からなる群から選択される、請求項３
４に記載の生物。36. The method of claim 3 selected from the group consisting of rodents and nematodes.
The organism according to 4.