CZ20002201A3 - Transgenic animal model for cartilage degenerative disease - Google Patents

Abstract

The present invention provides animal model systems for cartilage-degenerative disease, which comprise transgenic animals which can express recombinant matrix-degrading enzymes (MDEs), particularly matrix metalloproteinases (MMPs), in a temporally and spatially regulated manner. The invention also provides methods for producing phenotypic indicators of cartilage-degenerative disease in a mammal and methods for determining the potential of a composition to counteract cartilage-degenerative disease. The invention also provides isolated nucleic acids encoding proMMP polypeptides that exhibit constitutive enzymatic activity and isolated proMMP polypeptides.

Description

(57) Anotace:(57)

Řešení poskytuje zvířecí modelové systémy pro degenerativní onemocnění chrupavky, které zahrnují transgenní zvířata, která mohou exprimovat rekombinantní, matrix-degradující enzymy (MDE), zejména matrix metaloproteinázy (MMP), dočasným a prostorově regulovaným způsobem. Dále poskytuje metody pro vyvolání fenotypových indikátorů degenerativních onemocnění chrupavky u zvířat a metody pro určení schopnosti látek působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Rovněž poskytuje izolované nukleové kyseliny kódující proMMP polypeptidy, které vykazují konstitutivní enzymatickou aktivitu a izolované enzymatické proMMP peptidy.The invention provides animal model systems for cartilage degenerative diseases that include transgenic animals that can express recombinant, matrix-degrading enzymes (MDEs), particularly matrix metalloproteinases (MMPs), in a temporary and spatially regulated manner. It also provides methods for inducing phenotypic indicators of cartilage degenerative diseases in animals and methods for determining the ability of agents to counteract cartilage degenerative diseases. It also provides isolated nucleic acids encoding proMMP polypeptides that exhibit constitutive enzymatic activity and isolated enzymatic proMMP peptides.

OO

CNCN

CNCN

IAND

OO

O oO o

CNCN

NN

O ·· ·· • · · ··· · · · • · · · · · · · » · ·· · · ··· · • · · · · · ·About · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

I · · ·· ·· ·· ·I · · · · · · · ·

ΤίττηΤίττη

Ζ^ο1Ζ ^ ο1

Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek.Transgenic animal model for cartilage degenerative disease.

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález se vztahuje k transgenním savcům, kteří dočasně a místně exprimují rekombinantni enzymy degradující matrix. Vynález se dále vztahuje k modelovým systémům zahrnujícím takováto transgenní zvířata pro studium degenerativních kloubních onemocnění, včetně systémů pro identifikaci terapeutických činidel a léčebných režimů.The present invention relates to transgenic mammals that temporarily and locally express recombinant matrix degrading enzymes. The invention further relates to model systems comprising such transgenic animals for the study of degenerative joint diseases, including systems for identifying therapeutic agents and treatment regimens.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Degenerativní onemocnění chrupavky, včetně onemocnění kloubů a plotének, jako např. osteoartritida, revmatická artritida a osteochondrodysplasie, jsou široce rozšířené, zejména v pokročilejším věku. Časné symptomy, společné těmto onemocněním, zahrnují progresivní ztrátu proteoglykanú v kloubu (projevující se ztrátou metachromazie (metachromasia)); degradace kolagenu; tvoření vláken (fibrillation) na povrchu chrupavek; a nakonec ztrátu chrupavky (která se dokáže radiologicky jako zúžení mezikloubního prostoru).Cartilage degenerative diseases, including joint and plate diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis and osteochondrodysplasia, are widespread, especially in advanced age. Early symptoms common to these diseases include the progressive loss of proteoglycans in the joint (manifesting the loss of metachromasia); collagen degradation; fibrillation on the cartilage surface; and finally the loss of cartilage (which can radiologically act as a narrowing of the joint space).

Jeden z prvních cílů, který je ovlivněný tímto onemocněním, je kolagen typu II, hlavní strukturální kolagen vyskytující se v kloubní chrupavce. Mezi produkcí kolagenu typu II a katabolickými enzymy, které degradují kolagen typu II během normální přeměny chrupavky a kosti, existuje rovnováha. Výsledkem porušení této rovnováhy můžou být patologické stavy, jako např. degenerativní kloubní onemocnění.One of the first targets that is affected by this disease is type II collagen, a major structural collagen found in articular cartilage. There is a balance between the production of type II collagen and catabolic enzymes that degrade type II collagen during normal cartilage and bone conversion. Disruption of this balance may result in pathological conditions such as degenerative joint diseases.

Mezi enzymy, které degradují složky extracelulární matrix, patří matrixové metaloproteázy (matrix metalloproteinases (MMPs)), rodina enzymu vyžadujících pro svojí aktivitu zinek, a agrekanázy (aggrecanase) (tabulka 1).Enzymes that degrade components of the extracellular matrix include matrix metalloproteinases (MMPs), a family of enzymes requiring zinc for their activity, and aggrecanase (Table 1).

Tabulka 1Table 1

matrix degradující enzymy enzyme degrading matrix substráty substrates kolagen collagen fO c H P (Ό «-< 0> >N fO C H P (Ό «- < 0> > N c O 1Z >1 1—i t? o Φ P o U ú. C O 1Z > 1 1 — i t? O Φ P O AT at. fibronektin fibronectin laminin i ί 1 laminin and ί 1 c P co O C P what O : jiné : other Γ. Metaloproteinázy Γ. Metalloproteinases Kolagenázy Collagenases MMP-1 (střevní kolagenázy) MMP-1 (intestinal collagenases) I . TI, III, VII, X I. T1, III, VII, X MMP-P (neutroli lni koiagenázy) MMP-P (neutrophil lineagease) I, II, 111 I, II, 111 MMP-1.3 (koiagenáza 3) MMP-1.3 (Coiagenase 3) I, II, III I, II, III Selat inázy Piglets inase MMP-3 (žel atináza A) MMP-3 (atinase A) TV, v, VII, IX TV, in, VII, IX MMP-? (zelatináza P‘ MMP-? (zelatinase P ‘ τ y y τ y y X X v in St romeo l.y·: i ny St romeo l.y ·: i ny MMP-3 (xtromeolysin 1 ) MMP-3 (xtromeolysin-1) aktivuje .MMP zymogeny activates .MMP zymogens MMP-7 (mat r i 1 ys i n} MMP-7 (mat r i 1 ys) i v i v ^M‘' I'·' *^c:‘ V· · ·; ^M '' I '''* ^c: ' V · · ·; IV, v, 1X IV, v, 1X akt ivuje MM P zymogeny activates MM P zymogens ΜΪ-JF··—11 ít : raeo ' yo i r. o! ΜΪ-JF ·· — 11 ith: raeo 'yo i r. O! r y r y aktivuj e serpiny activate serpins J i né Other Mí P -1Ϊ í me t 3 ί. o o i a s t ď · M P -1Ϊ í me t 3 ί. o o i a s t d · MM ť “ .. -í MM ' pr?MMř-2 proMMP-13 pr? MMř-2 proMMP-13 MMP-I3 MMP-I3 MMP-1-3 MMP-1-3 proMMP-2 proMMP-2 MMP-1. 7 MMP-1. 7 ί I. Ag rek.-mázy I. Ag rec. -ase

MMP jsou syntetizovány ve spojených kloubech chondrocyty, které jsou (u zralé kloubní chrupavky) zcela diferencovanými buňkami udržujícími specificky chrupavčitý matrix fenotyp. Nadměrná produkce MMP (vzhledem k endogenním inhibitorům MMP), která se objevuje při kloubních onemocněních, může vést k degradaci chrupavky. Například kolagen typu II je substrátem pro MMP-13 a MMP-1 (Knuper et al., J. Biol. Chem. 271:1544, 1996) a jak MMP-1, tak MMP-13 proteiny je možné detekovat imunohistochemicky v lidských osteoartritických pletivech. V některých případech je možné nalézt MMP-13 a jeho štěpné produkty ve větším množství než MMP-1 (Billinghurst et al.,MMPs are synthesized in the joints by chondrocytes, which (in mature articular cartilage) are completely differentiated cells maintaining a specifically cartilaginous matrix phenotype. Overproduction of MMPs (due to endogenous MMP inhibitors) that occurs in joint diseases can lead to cartilage degradation. For example, type II collagen is a substrate for MMP-13 and MMP-1 (Knuper et al., J. Biol. Chem. 271: 1544, 1996) and both MMP-1 and MMP-13 proteins can be detected immunohistochemically in human osteoarthritic meshes. In some cases, MMP-13 and its cleavage products can be found in greater amounts than MMP-1 (Billinghurst et al.,

J. Clin. Inves. 99:1534, 1997). MMP-13 tak může hrát důležitou roli v degradaci chrupavky spojené s osteoartritidou a dalšími ·· ···· 4 · ·· ·· ·· · ···· ··· • · 4 4 4 4 · · • · · · 4 · · · 4J. Clin. Inves. 99: 1534,1997). Thus, MMP-13 may play an important role in cartilage degradation associated with osteoarthritis and others. 4 4 4 4 · 4 · 4 · 4 · 4 4 · · · 4

4444 4 ·· · · · · 444 degenerativními kloubními onemocněními (Mitchell et al., J. Clin. Inves. 97:761, 1996) .4444 degenerative joint diseases (Mitchell et al., J. Clin. Inves. 97: 761, 1996).

Zvířecí modely pro syndromy související s osteoartritidou byly popsány u morčat (Watson et al., Arth. Rheum. 39:1327, 1996) a u STR/ORT ínbredního kmene myši (Das-Gupta et al., Int. J. Exp. Path. 74:627,1993). U morčat se spontánní osteoartritida vyvíjí dlouho (šest měsíců nebo déle) a jenom u některých sublinií SRT/ORT myší dochází vždy k vývoji degenerativního kloubního onemocnění. Délka a/nebo variabilita těchto modelů je tedy činí méně vhodnými pro studie spojené s vývojem nových léků.Animal models for osteoarthritis-related syndromes have been described in guinea pigs (Watson et al., Arth. Rheum. 39: 1327, 1996) and in the STR / ORT of an inbred mouse strain (Das-Gupta et al., Int. J. Exp. Path.). 74: 627, 1993). In guinea pigs, spontaneous osteoarthritis develops for a long time (six months or more), and only some sublimions of SRT / ORT mice always develop degenerative joint disease. Thus, the length and / or variability of these models makes them less suitable for new drug development studies.

Další modely osteoartrítidy zahrnují chirurgicky vyvolané destabilizace kloubu, např. protnutí předního křížového vazu a/nebo částečnou minisektomii (meniscectomy) u králíků a psu, která stimuluje degradaci chrupavky (Hulth et al., Acta Orthop. Scand. 41:522, 1970). Jiný model využívá injekce bakteriální kolagenázy do kloubu zvířete, čímž se indukuje biochemické protnutí vazu (Van der Kraan et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). Protože ale (i) je nezbytný chirurgický nebo jiný zákrok u každého zvířete (ii) zvířata jsou velká a drahá a/nebo (iii) průběh onemocnění není vždy stejný, nemužou být tyto modely snadno použitelné pro velké studie, včetně studií při vývoji léků.Other models of osteoarthritis include surgically induced joint destabilization, such as anterior cruciate ligament and / or partial menisectomy in rabbits and dogs that stimulate cartilage degradation (Hulth et al., Acta Orthop. Scand. 41: 522, 1970). Another model utilizes the injection of bacterial collagenase into the joint of an animal, thereby inducing biochemical ligament breakage (Van der Kraan et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). However, since (i) surgery or other surgery is necessary for each animal (ii) the animals are large and expensive and / or (iii) the course of the disease is not always the same, these models cannot easily be used for large studies, including drug development studies.

Transgenní zvířecí modely mohou principiálně poskytnout reprodukovatelný zvířecí model pro degenerativní kloubní onemocnění. Předchozí pokusy vytvořit transgenní zvířata exprimující MMP, jako např. MMP-1 a stromeolysin, nevedly ale k pozorovatelnému fenotypu kloubní degenerace u těchto transgenních zvířat. Mohlo se tak stát díky letalitě embryí, způsobené konstitutivní expresí těchto enzymů. Witty et al., Mol.Biol. Cell 6:1287, 1995 vytvořili transgenní zvířata, která konstitutivně tvoří MMP-1 a stromelysin v pletivech mléčné žlázy, ale tato zvířata nevykazují symptomy osteoartrítidy. D'Armíento et al., Cell 71:955, 1992 představil transgenní myši exprimující lidskou intersticiální kolagenázu v plicích. Liu et al., J. Cell Biol. 130:227, 1995 představili transgenní zvířata se zvýšenou expresí mutovaného kolagenu II typu, což vede k poruchám spojovacích tkání, ale ne k osteoartritidě. Žádný z těchto transgenních zvířecích systémů neposkytuje užitečný zvířecí modelIn principle, transgenic animal models can provide a reproducible animal model for degenerative joint disease. Previous attempts to create transgenic animals expressing MMPs, such as MMP-1 and stromeolysin, but did not lead to an observable phenotype of joint degeneration in these transgenic animals. This could be due to the lethality of embryos caused by the constitutive expression of these enzymes. Witty et al., Mol. Cell 6: 1287, 1995 produced transgenic animals that constitutively form MMP-1 and stromelysin in the mammary gland tissue, but these animals do not show symptoms of osteoarthritis. D'Armento et al., Cell 71: 955, 1992 introduced transgenic mice expressing human interstitial collagenase in the lung. Liu et al., J. Cell Biol. 130: 227, 1995 introduced transgenic animals overexpressing mutated type II collagen, resulting in connective tissue disorders but not osteoarthritis. None of these transgenic animal systems provide a useful animal model

pro osteoartritidu (Khokha et al., Cancer and Metastasis Rev. 14:97, 1995; Shapiro, Natrix Biol. 15:527, 1997).for osteoarthritis (Khokha et al., Cancer and Metastasis Rev. 14:97, 1995; Shapiro, Natrix Biol. 15: 527, 1997).

Mezi odborníky tedy existuje potřeba pro zvířecí modelový systém, který by napodoboval lidské degenerativní kloubní onemocnění, jako např. osteoartritidu, revmatickou artritidu a chondrodysplasii. Transgenní zvířata, obsahující regulovatelné heterologní geny, jejichž exprese by způsobovala degeneraci chrupavek, by byla zvláště vhodná jako reprodukovatelně experimentální kontrola v čase s možností ovlivňovat expresi transgenu a tak s možností regulovat samotný patologický syndrom. Takováto zvířata se můžou použít pro určení hladiny exprese transgenu nutné pro vyvolání onemocnění a (a to je důležité) můžou se použít pro hledání nových léků a optimalizaci léčebných režimů. Zvláště důležité je pak to, že takováto transgenní zvířata se můžou použít pro další určení role matrix degradujících enzymů v degradaci chrupavky a pro (v in-vivo testování) vyhledávání sloučenin, které mění tyto enzymy, nebo sloučenin, které inhibují vývoj degenerativních kloubních onemocnění.Thus, there is a need in the art for an animal model system that mimics human degenerative joint disease, such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, and chondrodysplasia. Transgenic animals containing controllable heterologous genes whose expression would cause cartilage degeneration would be particularly useful as a reproducibly experimental control over time with the possibility to influence the expression of the transgene and thus to control the pathological syndrome itself. Such animals can be used to determine the level of transgene expression necessary to induce the disease and (and importantly) can be used to find new drugs and optimize treatment regimens. Of particular importance is that such transgenic animals can be used to further determine the role of matrix degrading enzymes in cartilage degradation and to (in in vivo testing) screen for compounds that alter these enzymes or compounds that inhibit the development of degenerative joint diseases.

Přehled vynálezuSummary of the invention

Předkládaný vynález poskytuje transgenní ne-humání zvířata nebo jejich potomstvo, jejichž somatické a zárodečné (germline) buňky obsahují (ve stabilně integrované formě) jeden nebo více heterologních nebo rekombinantních genů, kódujících polypeptidy tvořící enzymaticky aktivní, matrix degradující enzymy (MDE matrix-degrading enzymes) zejména MMP. Mezi MMP použité ve vynálezu patří MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16 a MMP-17, nejlépe jeden nebo víc ze skupiny MMP-1, MMP-3, MMP-8 a MMP-13, a ještě lépe buď MMP-1, nebo MMP-13, nebo oba. Patří sem také enzymaticky aktivní varianty, fragmenty a kombinace těchto polypeptidů. Také se můžou použít jiné matrici degradující enzymy, včetně agrekanáz (aggrecanase). MDE mužou být odvozeny z jakéhokoliv druhu, nejlépe z člověka.The present invention provides transgenic non-human animals or their progeny whose somatic and germline cells contain (in a stably integrated form) one or more heterologous or recombinant genes encoding polypeptides forming enzymatically active matrix-degrading enzymes (MDE) ) especially MMP. MMPs used in the invention include MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16 and MMP-17, preferably one or more of MMP-1, MMP-3, MMP-8, and MMP-13, and more preferably either MMP-1 or MMP-13, or both. Also included are enzymatically active variants, fragments, and combinations of these polypeptides. Other enzyme degradation matrices, including aggrecanase, can also be used. MDEs can be derived from any species, preferably human.

V preferovaném případě jsou rekombinantní MDE kódující geny selektivně exprimovány v kloubních chondročytech transgenních zvířat • · · · · · ·· ·· • · · · · · · • · · · ·· • · · · · · • · · · « · · ··In a preferred case, the recombinant MDE coding genes are selectively expressed in articular chondrocytes of transgenic animals. · ··

a exprese se projeví patologickými symptomy charakteristickými pro kloubními degenerativní onemocnění.and expression results in pathological symptoms characteristic of joint degenerative diseases.

Vynález poskytuje transgenní zvířata nebo jejich potomstvo, jejichž somatické a zárodečné buňky obsahují stabilně integrovaný první rekombinantní gen kódující MDE nebo jeho enzymaticky aktivní odvozeninu, přednostně konstitutivně aktivní variantu proMMP-13 (označenou jako MMP-13*), zahrnující sekvenci popsanou v SEQ ID NO:4. Je vhodné, když je první rekombinantní gen pod řízenímu prvního regulovatelného promotoru a v optimálním případě první regulovatelný promotor obsahuje tet07 sekvenci, jako například promotor popsaný v SEQ ID NO:5. Transgenní zvíře může dále obsahovat druhý rekombinantní gen kódující polypeptid regulující první regulovatelný promotor a přednostně je to tTA polypeptid. V těchto případech je druhý rekombinantní gen pod řízením druhého regulovatelného promotoru, zejména takového, který obsahuje sekvence odvozené od kloubně specifického promotoru, nejlépe pro kolagen typuThe invention provides transgenic animals or progeny thereof, wherein the somatic and germ cells comprise a stably integrated first recombinant gene encoding MDE or an enzymatically active derivative thereof, preferably a constitutively active variant of MMP-13 (designated MMP-13 *), comprising the sequence described in SEQ ID NO. : 4. Suitably, the first recombinant gene is under the control of the first regulatable promoter, and optimally the first regulatable promoter comprises a tet07 sequence, such as the promoter described in SEQ ID NO: 5. The transgenic animal may further comprise a second recombinant gene encoding a polypeptide regulating the first regulatable promoter, and is preferably a tTA polypeptide. In these cases, the second recombinant gene is under the control of a second controllable promoter, in particular one that contains sequences derived from a joint-specific promoter, preferably for collagen type

II. Takový je např. promotor označený v SEQ ID NO:6. Selektivní exprese druhého rekombinantního genu v pletivech kloubu tak vede k regulované specifické expresi rekombinantního MDE v kloubu.II. Such is, for example, the promoter designated in SEQ ID NO: 6. Thus, selective expression of the second recombinant gene in joint tissues results in regulated specific expression of recombinant MDE in the joint.

V jiném aspektu poskytuje vynález izolované nukleové kyseliny kódující enzymaticky aktivní varianty MMP, zejména varianty lidského proMMP-13 a nejlépe MMP-13*. Vynález také zahrnuje rekombinantní klonovací vektory obsahující tyto nukleové kyseliny; buňky obsahující vektory; metody pro produkci polypeptidů odvozených od MMP-13 zahrnující pěstování buněk za podmínek vhodných pro expresi MMP-13; a izolované polypeptidy odvozené od MMP-13.In another aspect, the invention provides isolated nucleic acids encoding enzymatically active variants of MMPs, particularly variants of human proMMP-13 and most preferably MMP-13 ®. The invention also encompasses recombinant cloning vectors comprising these nucleic acids; cells containing vectors; methods for producing MMP-13-derived polypeptides comprising growing the cells under conditions suitable for MMP-13 expression; and isolated polypeptides derived from MMP-13.

V dalším aspektu vynález poskytuje metody pro vyvolání fenotypových změn charakteristických pro degenerativní onemocnění chrupavek u savců, tj. vystavení transgenních zvířat vynálezu podmínkám, které vedou k expresi MDE kódovaných transgeny. Preferuje se, když jsou transgenní zvířata (obsahující první rekombinantní gen kódující MMP-13* operačně připojený k tet07 promotoru a druhý rekombinantní gen kódující tTAprotein operačně připojený ke kolegenovému promotoru II typu) udržována v přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklnového analoga. Chce-li se indukovat exprese MMP-13*, odstraní se tetracyklin nebo tetracyklinový analog a MMP-13* je selektivně exprimován v kloubních pletivech; výsledkem jsou « · · · · · • ·In another aspect, the invention provides methods for inducing phenotypic changes characteristic of degenerative cartilage disease in mammals, i.e., exposing the transgenic animals of the invention to conditions that result in the expression of MDE encoded by the transgenes. Preferably, the transgenic animals (comprising the first recombinant gene encoding MMP-13 * operably linked to the tet07 promoter and the second recombinant gene encoding tTAprotein operably linked to the type II colleague promoter) are maintained in the presence of a tetracycline or tetracycline analog. To induce MMP-13 * expression, the tetracycline or tetracycline analog is removed and MMP-13 * is selectively expressed in the joint tissue; the result is «· · · · · · ·

fenotypové změny charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavek.phenotypic changes characteristic of cartilage degenerative disease.

V dalším aspektu vynález poskytuje metody pro určení eventuálního vlivu směsi působící proti degenerativním onemocněním chrupavky. Tyto metody jsou založeny na podávání známých dávek směsí transgenním zvířatům vynálezu buď před, nebo poté, co došlo k vývoji fenotypových znaků typických pro degenerativní onemocnění chrupavky; sledování ukazatelů po předem stanovený čas po podání směsi; a porovnání rozsahu ukazatelů u zvířat, kterým se podala směs ve srovnání s kontrolními transgenními zvířaty, kterým se směs nepodala. Jakýkoliv rozdíl v (i) povaze nebo rozsahu fenotypových znaků degenerativních onemocnění chrupavek, (ii) v čase nutném pro projevení ukazatelů nebo (iii) potřebě dalších opatření pro zlepšení stavu naznačují možnost, že směs působí proti degenerativním onemocněním chrupavky.In another aspect, the invention provides methods for determining the possible effect of a composition against anti-degenerative cartilage diseases. These methods are based on administering known doses of the compositions to the transgenic animals of the invention either before or after the development of phenotypic traits typical of cartilage degenerative disease; monitoring the indicators for a predetermined time after administration of the mixture; and comparing the range of endpoints in the animals treated with the composition compared to the control transgenic animals not treated with the composition. Any difference in (i) the nature or extent of the phenotypic traits of cartilage degenerative diseases, (ii) the time required for manifestation of indicators, or (iii) the need for further improvement measures indicate the possibility that the composition counteracts cartilage degenerative diseases.

Stručný popis obrázkůBrief description of the pictures

Obrázky 1A a 1B. (A) Schematická ilustrace struktury lidskéFigures 1A and 1B. (A) Schematic illustration of the human structure

MMP-13 (kolagenázy 3). První okénko (odpovídající krajnímu aminokonci) představuje pre-doménu (signální peptid) směřující vznikající proMMP-13 k sekreci. Druhé okénko představuje pro doménu, která se účastní na udržení latentního stavu enzymu. Vidět je konzervovaná sekvence (SEQ ID NO:1) uvnitř pro domény, která je důležitá pro zachování latence enzymu. Třetí okénko představuje 170 aminokyselinovou katalytickou doménu, která obsahuje konzervovanou oblast (je uvedená; SEQ ID NO:2) důležitou pro katalytickou aktivitu. Čtvrté okénko představuje doménu na karboxy konci velkou 200 aminokyselin. (B) Schéma sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO:3) kódující konstitutivně aktivní variantu lidského proMMP-13, označenou MMP-13* a aminokyselinovou sekvenci MMP-13* (SEQ ID N0:4). Resídua, která jsou mutovaná vzhledem k nemutovanému typu MMP-13 (zobrazena většími znaky) jsou GTC nukleotidy na pozici 299-301.MMP-13 (collagenase 3). The first window (corresponding to the extreme amino terminus) represents the pre-domain (signal peptide) leading to secretion of proMMP-13. The second window represents for the domain that participates in maintaining the latent state of the enzyme. See the conserved sequence (SEQ ID NO: 1) inside for domains that is important for maintaining latency of the enzyme. The third window represents a 170 amino acid catalytic domain that contains a conserved region (shown; SEQ ID NO: 2) important for catalytic activity. The fourth window represents the carboxy-terminus domain of 200 amino acids. (B) Scheme of the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) encoding a constitutively active variant of human proMMP-13, designated MMP-13 *, and the amino acid sequence of MMP-13 * (SEQ ID NO: 4). The residues that are mutated to the non-mutated type MMP-13 (shown by larger characters) are GTC nucleotides at position 299-301.

Obrázky 2Ά a 2B. Binární strategie použitá pro získání pro chondrocyty specifickéu, doxycyklinem (doxycyclíne, DOX) regulované exprese MMP-13*. (A) První schéma ukazuje krysí promotor kolagenu typu II regulující expresi tetracyklinového represoru - VP16 *····· · · · · · · · • · · · · · · · · «· • · ···· · · · • · · · · · · · · · « • · · 9 · · · « · ···· * 99 ·· ·· ··· aktivátorovy fúzní protein (TA) následovaný místem pro sestřih (splice) a polyadenylačním signálem z SV40 (tento konstrukt má označení CPE - TA). (B) Druhé schéma ukazuje Tet07 promotor (Gossen a Bujard, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547, 1992) ovládající expresi konstitutivně aktivního lidského MMP 13 proteinu, následovaný sestřihovým a polyadenylačním signálem z SV40 (tento konstrukt má označení Tet07 - MMP13*). Tyto dva nezávislé transgenní konstrukty byly současně vpraveny mikroinjekcí do oplodněných myších embryí, čímž vznikl dvojitý transgen nesoucí oba geny. Za přítomnosti DOX je exprese transgenu vypnuta; odstraní-li se DOX, exprese transgenu se zapne. Šipka označuje místo začátku transkripce, hvězdička ukazuje konstitutivně aktivní mutaci v transgenu MMP13.Figures 2Ά and 2B. The binary strategy used to obtain chondrocyte-specific, doxycycline (doxycycline, DOX) regulated expression of MMP-13 *. (A) The first diagram shows the rat promoter of type II collagen regulating the expression of the tetracycline repressor - VP16 - · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 99 activator fusion protein (TA) followed by splice site and polyadenylation signal from SV40 (this construct is called CPE - TA). (B) The second scheme shows the Tet07 promoter (Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547, 1992) controlling the expression of a constitutively active human MMP 13 protein, followed by a splicing and polyadenylation signal from SV40 (this construct is designated Tet07-MMP13 *). These two independent transgenic constructs were simultaneously introduced by microinjection into fertilized mouse embryos, resulting in a double transgene carrying both genes. In the presence of DOX, transgene expression is turned off; when DOX is removed, transgene expression is turned on. The arrow indicates the transcription start site, the asterisk indicates a constitutively active mutation in the MMP13 transgene.

Obrázky 3A a 3B. Promotor genu pro kolagen typu II cílí expresi na klouby zkušební transgenní myši exprimující beta-galaktosidázu pod řízením krysího promotoru kolagenu typu II. (A) Schéma CPE-lacZ konstruktu. Krysí promotor kolagenu typu II (první políčko) řídí expresi genu β-galaktosidázy (LacZ) (druhé políčko), pak následuje úsek pro β-globinovou úpravu sestřihem a polyadenylační signál (poslední políčka spojená symbolem pro sestřih). (B) Celkové barvení na beta-galaktosidázovou aktivitu E16 embryí. Transgenní embryo vlevo vykazuje zbarvení (šipky) ve srovnání s netransgenním embryem. (C) Větší detail lokte a přední tlapky u transgenního embrya; je vidět β-galaktosidázové zabarvení (šipky). Obrázky 3B a 3C výrazněji ilustrují vynález jsou li vyvedeny barevně, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.Figures 3A and 3B. The type II collagen gene promoter targets expression to the joints of a test transgenic mouse expressing beta-galactosidase under the control of the rat type II collagen promoter. (A) Scheme of CPE-lacZ construct. The rat type II collagen promoter (first box) controls expression of the β-galactosidase (LacZ) gene (second box), followed by a β-globin splicing region and a polyadenylation signal (the last boxes joined by a splicing symbol). (B) Total staining for beta-galactosidase activity of E16 embryos. The transgenic embryo on the left shows color (arrows) as compared to the non-transgenic embryo. (C) Greater detail of elbow and forepaw in transgenic embryo; β-galactosidase staining (arrows) is seen. Figures 3B and 3C illustrate the invention more clearly when illustrated in color, but a black and white embodiment is sufficient to understand the invention.

Obrázky 4A a 4B. Expresní profil TA a MMP13 RNA provedený pomocí RT-PCR. (A) Amplifikace TA cDNA z celkové RNA. (B)Figures 4A and 4B. Expression profile of TA and MMP13 RNA performed by RT-PCR. (A) Amplification of TA cDNA from total RNA. (B)

Amplifikace MMP13* cDNA z celkové RNA. Dráha 1: markéry molekulových hmotností 0Xl64/Hae III; dráha 2: PCR amplifikace transgenní (dráha 6) genomové DNA; dráha 3: PCR amplifikace ne-transgenní genomové DNA; dráha 4: netransgenní (wild type) myš s DOX; dráha 5: netransgenní myš bez DOX; dráhy 6-7: transgenní myš (asi 4 měsíce) s DOX; dráhy 8-9: transgenní myš (asi 4 měsíce) od narození bez DOX. Šipky la a 1b ukazují specifický fragment MMP13* dlouhý 648 bp a specifický fragment 859 bp dlouhý. Pro každou reakci se použily c-fos primery jako interní kontrola; sestřižená mRNA měla 187 bp • ♦ · · ♦ · · φ · · •9 9 9 99 9 9 • ·♦ · (šipka 3) a nesestřižená mRNA 303 bp (šipka 2). Obdobné fragmenty nebyly detekovatelné v odpovídajících drahách obsahujících RNA pro PCR, kde nebyla provedena reverzní transkripce (data nejsou doložena).Amplification of MMP13 * cDNA from total RNA. Lane 1: 0X164 / Hae III molecular weight markers; lane 2: PCR amplification of transgenic (lane 6) genomic DNA; lane 3: PCR amplification of non-transgenic genomic DNA; lane 4: non-transgenic (DOX) wild type mouse; lane 5: non-transgenic mouse without DOX; lanes 6-7: transgenic mouse (about 4 months) with DOX; lanes 8-9: transgenic mouse (about 4 months) from birth without DOX. Arrows 1a and 1b show a 648 bp MMP13 * specific fragment and a 859 bp specific MMP13 * fragment. For each reaction, c-fos primers were used as internal control; the truncated mRNA was 187 bp (arrow 3) and the uncut mRNA was 303 bp (arrow 2). Similar fragments were not detectable in the corresponding RNA-containing lanes for PCR where no reverse transcription was performed (data not shown).

Obrázky 5A a 5B. Fotografie ilustrující imunohistochemickou lokalizaci štěpných produktů kolagenu II typu v růstové ploténce (growth plate) a u kloubní chrupavky transgenní myši exprimující transgen z obrázku 2. Pletivo se obarvilo protilátkou, která je specifická proti štěpným produktům kolagenu II typu. (A) Pletivo získané z myší, na které působil doxycyklin, čímž se zabránilo expresi MMP-13*. (B) Pletivo získané z myší, na které nepůsobil doxycyklin (což umožnilo expresi MMP-13*) po dobu 30 dní ve věku 3 měsíců. Obrázky 5A a 5B výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.Figures 5A and 5B. Photographs illustrating the immunohistochemical localization of collagen II type cleavage products in the growth plate and articular cartilage of the transgenic mouse expressing the transgene of Figure 2. The mesh was stained with an antibody specific for collagen II type cleavage products. (A) Mesh obtained from doxycycline-treated mice to prevent MMP-13 * expression. (B) Mesh obtained from doxycycline-free mice (allowing MMP-13 * expression) for 30 days at 3 months of age. Figures 5A and 5B illustrate the invention more clearly when colored, but a black and white embodiment is sufficient to understand the invention.

Obrázky 6A, 6B a 6C. Barevná fotografie dokumentující barvení kloubní chrupavky a růstové ploténky čéšky u transgenní myši s dvěma transgeny Safraninem O. (A) Pletivo odvozené z myši, na kterou působil doxycyklin. (B) Pletivo odvozené z myši 7 dní poté, co se přestal aplikovat doxycyklin. (C) Pletivo odvozené z myši 14 dní poté, co se přestal aplikovat doxycyklin. Obrázky 6A-C výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.Figures 6A, 6B and 6C. A color photograph documenting staining of the articular cartilage and patella growth plate in a transgenic mouse with two Safranin O transgenes. (A) Mesh derived from doxycycline-treated mice. (B) Mouse-derived mesh 7 days after doxycycline was stopped. (C) Mice derived from the mouse 14 days after doxycycline was stopped. Figures 6A-C illustrate the invention more clearly when colored, but a black and white embodiment is sufficient to understand the invention.

Obrázky 7A, 7B, 7C a 7D. Podélný průřez zadními koleními klouby (A a B) a synoviem (C a D). (A a C) Věkem shodná kontrola z vrhu a (B a D) linie 6 bez působeni DOX. Zkratky: L, léze; AG, kloubní chrupavka; AG, angiogeneze; IH, infiltrační hyperplasie (infiltration hyperplasia); BM, kostní dřeň; a PL, čéškový vaz. Lokalizace stehenní kosti a čéšky jsou na obrázku vyznačené. Obrázky 7A-D výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.Figures 7A, 7B, 7C and 7D. Longitudinal cross-section through the rear knee joints (A and B) and synovium (C and D). (A and C) Age matched litter control and (B and D) line 6 without DOX. Abbreviations: L, lesions; AG, articular cartilage; AG, angiogenesis; IH, infiltration hyperplasia; BM, bone marrow; and PL, patella ligament. Localization of the femur and patella are indicated in the figure. Figures 7A-D illustrate the invention more clearly when colored, but a black and white embodiment is sufficient to understand the invention.

Detailní popis vynálezu.Detailed description of the invention.

Předkládaný vynález je založený na objevu, že regulovaná exprese matrix-degradujicích enzymu v chrupavce transgenní myši vyvolá charakteristické fenotypové změny spojené s matrix degenerativními onemocněními kloubů a meziobratlových plotének.The present invention is based on the discovery that the regulated expression of matrix-degrading enzymes in the cartilage of transgenic mice induces characteristic phenotypic changes associated with matrix degenerative joint and intervertebral disc diseases.

• · ···· •444• · ···· 444

Zvířecí modely vynálezu poskytují nové modelové systémy pro syndromy matrix degenerující choroby, které můžeou být použité pro detailní charakterizaci patologií lidských kloubů a meziobratlových plotének, a také pro výzkum nových léků a optimalizaci léčebných režimů.Animal models of the invention provide novel model systems for disease-degenerating matrix syndromes that can be used to characterize in detail the pathologies of human joints and intervertebral discs, as well as to research new drugs and optimize treatment regimens.

Transgenní zvíře vynálezu je zvíře s buňkami, které obsahují transgen, který byl zaveden buď do zvířete, nebo do předků zvířete v prenatálním (zárodečném) stavu. Transgenní zvíře se může například vytvořit vnesením příslušného genu do samčího pronuklea oplodněného oocytu, např. mikroinjekčně; pak se nechá oocyt vyvinout v pseudogravidním samičím pěstounském zvířeti. Daný gen může obsahovat příslušné promotorové sekvence, intronové sekvence a polyadenylační signální sekvence. Metody pro přípravu transgenních zvířat jsou uvedené např. v U.S. Patentech 4 736 866 a 4 870 009 a v Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986. Zvíře, o kterém se zjistil, že je transgenní, se může použít pro chov dalších zvířat nesoucích transgen. Transgenní zvíře nesoucí jeden transgen se může pářit s jiným transgenním zvířetem, které je nositelem jiného transgenu a dát tak vzniknout „dvojitě transgennímu zvířeti, které bude vlastnit oba transgeny. Nebo se případně oba transgeny můžou společně vnést mikroinjekcí, čímž také vznikne „dvojitě transgenní zvíře. Můžou také existovat zvířata s více než dvěma transgeny. Kromě toho se můžou pářit heterozygotní transgenní zvířata, tj. zvířata s pouze jednou kopií transgenu, s druhým heterozygotním zvířetem se stejným transgenem a získat tak homozygotní zvířata s dvěmi kopiemi transgenu.A transgenic animal of the invention is an animal with cells that contain a transgene that has been introduced into either the animal or the ancestors of the animal in a prenatal (germ) state. For example, a transgenic animal can be made by introducing a gene of interest into a male pronucleus of a fertilized oocyte, e.g., microinjection; then, the oocyte is allowed to develop in a pseudogravid female foster animal. A given gene may contain appropriate promoter sequences, intron sequences, and polyadenylation signal sequences. Methods for preparing transgenic animals are disclosed, for example, in U.S. Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009 and in Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986. An animal found to be transgenic can be used to breed other animals carrying the transgene. A transgenic animal carrying one transgene can mate with another transgenic animal that carries another transgene to give rise to a "double transgenic animal that owns both transgenes. Alternatively, both transgenes can be introduced together by microinjection, thereby also forming a "double transgenic animal." There may also be animals with more than two transgenes. In addition, heterozygous transgenic animals can be mated, i.e. animals with only one copy of the transgene, with a second heterozygous animal with the same transgene to obtain homozygous animals with two copies of the transgene.

Předkládaný vynález zahrnuje transgenní zvířata, přednostně savce, které exprimují z rekombinantního genu MDE, zejména MMP a nejlépe MMP s kolagenázovou aktivitou. MDE pro využití ve vynálezu zahrnují kompletně (without limitation) MMP a agrekanázy (aggrecanase). Užitečné MMP zahrnují bez omezení kolagenázy označené MMP-1, MMP-8 a MMP-13; stromelysiny (stromelysins) označené MMP-3, MMP-10 a MMP-11; želatinázy (gelatinases) označené MMP-2 a MMP-9; metalloelastázy označené MMP-12; a membránové MMP označené MMP-14, MMP-15, MMP-16 a MMP-17 (Matrisian, BioEssays, 14:455, 1992). Zde používaný termín matrix degradující aktivita se vztahuje k proteolytické degradaci složek matrix, včetně např. kolagenu, zejména kolegenu typu II a hlavně trojité helikální formě kolagenuThe present invention encompasses transgenic animals, preferably mammals, that express from a recombinant MDE gene, in particular MMPs and most preferably MMPs with collagenase activity. MDEs for use in the invention include MMP and aggrecanase without limitation. Useful MMPs include, but are not limited to, collagenases designated MMP-1, MMP-8, and MMP-13; stromelysins designated MMP-3, MMP-10 and MMP-11; gelatinases designated MMP-2 and MMP-9; MMP-12 labeled metalloelastases; and membrane MMPs designated MMP-14, MMP-15, MMP-16 and MMP-17 (Matrisian, BioEssays, 14: 455, 1992). As used herein, the term matrix degrading activity refers to the proteolytic degradation of matrix components, including, for example, collagen, particularly collagen type II, and especially the triple helical form of collagen

typu II (triple helical form of type II collagen). Jakýkoliv polypeptid, vykazující matrix degradujcící aktivitu, se může použít při praktikování vynálezu, včetně enzymaticky aktivních fragmentů výše zmíněných enzymů. Je vhodné, když dochází k expresi enzymatické aktivity MMP-13. Enzymatická aktivita MMP-13 zde používaná se vztahuje k proteolytické degradaci kolagenu II typu.Může se tedy použít jakýkoliv MMP-13 polypeptid nebo jeho fragment či odvozenina s MMP-13 enzymatickou aktivitu. Enzymy můžou být odvozené od jakéhokoliv zvířecího druhu, včetně například lidí, myší, krys, králíků, prasat, krav nebo nehumáních primátů, či jejich kombinace. Preferuje se, když je MMP-13 nebo jeho odvozenina lidského původu.type II (triple helical form of type II collagen). Any polypeptide having an activity-degrading matrix can be used in the practice of the invention, including enzymatically active fragments of the aforementioned enzymes. Preferably, the enzymatic activity of MMP-13 is expressed. The enzymatic activity of MMP-13 used herein relates to the proteolytic degradation of type II collagen. Thus, any MMP-13 polypeptide or fragment or derivative thereof with MMP-13 enzymatic activity may be used. The enzymes may be derived from any animal species, including, for example, humans, mice, rats, rabbits, pigs, cows or non-human primates, or combinations thereof. Preferably, MMP-13 or a derivative thereof is of human origin.

Normálně jsou MMP syntetizovány jako prekurzory (tj. jako zymogeny nebo proenzymy), jejichž enzymatická aktivita je latentní; proteolytické odstranění pro oblasti po sekreci vede k enzymaticky aktivnímu proteinu. V preferovaném případě vynálezu je možné obejít potřebu proteolytického zpracování použitím enzymových nebo proenzymových variant, které jsou enzymaticky aktivní i v nerozštípnutém stavu. Takovéto varianty se můžou produkovat běžnými technikami pro místní nebo náhodnou mutagenezi spojenou s analýzou kolagenázové enzymatické aktivity (viz dále). Tímto způsobem se můžou do proenzymové sekvence zavést modifikace (včetně např. inzercí, delecí nebo substitucí), zejména do pro-oblasti nebo v blízkosti místa štěpení pro-oblasti a získat tak konstitutivně aktivní polypeptidy, které nevyžadují pro aktivaci proteolytické zpracování. Nebo se případně může celá pro-oblast odstranit. Kromě toho se můžou použít rekombinantní geny, u kterých se sekvence kódující přírodní signální peptid nahradí heterolgoní sekvencí, která funguje jako signální peptid, tj. vyvolává sekreci. Použití genů kódujících jakékoliv takovéto modifikované MMP polypeptidy je obsaženo ve vynálezu.Normally, MMPs are synthesized as precursors (i.e., zymogens or proenzymes) whose enzymatic activity is latent; proteolytic removal for secretion regions results in an enzymatically active protein. In a preferred embodiment of the invention, it is possible to circumvent the need for proteolytic processing using enzyme or proenzyme variants that are enzymatically active even in the non-cleaved state. Such variants can be produced by conventional local or random mutagenesis techniques associated with collagenase enzyme activity analysis (see below). In this way, modifications (including, for example, insertions, deletions, or substitutions) can be introduced into the proenzyme sequence, particularly at or near the pro-region cleavage site, thereby obtaining constitutively active polypeptides that do not require proteolytic processing for activation. Alternatively, the entire pro-region may be removed. In addition, recombinant genes can be used in which a sequence encoding a natural signal peptide is replaced by a heterologous sequence that functions as a signal peptide, i.e., elicits secretion. The use of genes encoding any such modified MMP polypeptides is contemplated by the invention.

Upřednostňuje se, když je při používání vynálezu používán konstitutivně aktivní MMP-13. Zvláště je vhodné, když varianta MMP-13 obsahuje sekvenci zahrnující mutaci v sekvencí kódující PRCGVPDV oblast, SEQ ID N0:7, zejména substituci Pro'^;'^:! na Val; sekvence tohoto polypeptidu je znázorněna v SEQ ID NO:4 a tento polypeptid je označený jako MMP-13*. V jiném případě konstitutivně aktivní varianta MMP-13 obsahuje substituci Val'^iB za Gly.It is preferred that constitutively active MMP-13 be used in the practice of the invention. It is particularly preferred that the MMP-13 variant comprises a sequence comprising a mutation in the sequence encoding the PRCGVPDV region, SEQ ID NO: 7, particularly the Pro 'substitution ^; ' ^:! to Val; the sequence of this polypeptide is shown in SEQ ID NO: 4 and this polypeptide is designated MMP-13 *. Alternatively, the constitutively active variant of MMP-13 comprises a Val ' ^iB substitution for Gly.

Transgenní zvířata vynálezu přednostně vykazují MMP aktivitu regulovaně. Regulovaná exprese znamená dočasné a/nebo prostorové řízení. Dočasné řízení se vztahuje ke schopnosti potlačit expresi MMP aktivity do předem určené doby při vývoji transgenních zvířat, po které se může exprese MMP aktivovat a udržovat na této úrovni po dobu, která je žádoucí. Je dobré, když je exprese MMP potlačená během embryonálního vývoje a aktivovaná u dospělých zvířat. Prostorové řízení znamená schopnost selektivně exprimovat MMP v určitých pletivech. Upřednostňuje se, když se MMP aktivita exprimuje v kloubních pletivech a zejména v kloubních chondrocytech.The transgenic animals of the invention preferably exhibit MMP activity in a controlled manner. Regulated expression means temporary and / or spatial control. Temporary control refers to the ability to suppress the expression of MMP activity by a predetermined time in the development of transgenic animals for which MMP expression can be activated and maintained at that level for as long as desired. It is good if MMP expression is suppressed during embryonic development and activated in adult animals. Spatial control means the ability to selectively express MMPs in certain tissues. It is preferred that the MMP activity is expressed in joint tissues and in particular in joint chondrocytes.

Dočasné řízení exprese MMP se dosáhne použitím jednoho nebo více polypeptidů obsahujících represor transkripce, aktivátor transkripce, nebo zesilovač transkripce nebo jejich kombinaci ve spojení s použitým promotorem reagujícím na transkripční represor/aktivátor, který je operačně spojený se sekvencí kódující MMP. V určitých případech je dočasná kontrola exprese MMP dosažená (i) expresí (v transgenních zvířatech) represorového polypeptidu operačně spojeného s polypeptidem, který přímo nebo nepřímo aktivuje transkripci v eukaryotických buňkách, přičemž dochází k tvorbě fúzního polypeptidu represor-aktivátor; a (íi) spojeným využitím cílového promotoru operačně spojeného s MMP kódující sekvencí, jejíž transkripční aktivita reaguje na fúzní polypeptid represoraktivátor. Typicky jsou nukleotidové sekvence, kódující represorový polypeptid, přiligovány ve čtecím rámci k sekvencím kódujícím polypeptid transkripčniho aktivátoru, čímž vznikne chimérický gen kódující fúzní protein.Temporary control of MMP expression is achieved by using one or more polypeptides comprising a transcriptional repressor, transcriptional activator, or transcription enhancer, or a combination thereof, in conjunction with a transcriptional repressor / activator responsive promoter operably linked to an MMP coding sequence. In certain instances, transient control of MMP expression is achieved by (i) expressing (in transgenic animals) a repressor polypeptide operably linked to a polypeptide that directly or indirectly activates transcription in eukaryotic cells to form a repressor-activator fusion polypeptide; and (ii) coupled using a target promoter operably linked to an MMP coding sequence whose transcriptional activity responds to a repressoractivator fusion polypeptide. Typically, the nucleotide sequences encoding the repressor polypeptide are ligated in reading frame to sequences encoding the transcriptional activator polypeptide to form a chimeric gene encoding the fusion protein.

Mezi užitečné represorové polypeptidy patří všechny polypeptidy obsahující sekvence odvozené z bakteriálních represorú, včetně např. tetracyklinového represorú, LacR represorú, KRAB domény a lambda represorú (cro a cl) a další a také eukaryotické represory, včetně těch, které se účastní syntézy aminokyselin nebo cukrů. Mezi užitečné polypeptidové přímé aktivátory transkripce patří protein 16 herpes simplex viru (VP 16); kvasniční GAL 14; kvasniční STÁT; steroidové receptory, jako např. progesteronový a estrogenový receptor; a konstitutivní aktivátory, jako např. c-fos, c-jun a SP-1. Nebo muže být represorový polypeptid připojen k polypeptidu, který nepřímo aktivuje transkripci náborem transkripčniho aktivátoru fcfc ···· • · · · · » « · * · ·· · · · • ·· · · · · ♦ pro interakci s fúzním proteinem represor-aktivátor; mezi takovéto nepřímé aktivátorové proteiny patří protein vážící se k TATA boxu (TBP - TATA Box Binding Protein) a základní (basic) transkripční faktory, včetně základního transkripčního faktoru D.Useful repressor polypeptides include all polypeptides comprising sequences derived from bacterial repressors, including, e.g., tetracycline repressors, LacR repressors, KRAB domains, and lambda repressors (cro and cl), and others, as well as eukaryotic repressors, including those involved in amino acid or sugar synthesis. . Useful polypeptide direct transcriptional activators include herpes simplex virus 16 protein (VP 16); yeast GAL 14; yeast STATE; steroid receptors such as the progesterone and estrogen receptor; and constitutive activators such as c-fos, c-jun and SP-1. Alternatively, the repressor polypeptide may be linked to a polypeptide that indirectly activates transcription by recruiting the transcriptional activator fcfc for interaction with the repressor fusion protein. -activator; such indirect activator proteins include the TATA Box Binding Protein (TBP) and basic transcription factors, including basic transcription factor D.

Podle vynálezu se používá každý fúzní protein represoraktivátor ve spojení s cílovým promotorem, který reaguje na určitý fúzní protein a který reguluje transkripci sekvence kódující MDE. Promotor typicky obsahuje alespoň jednu operátorovou sekvenci reagující na represorovou část fúzního polypeptidů represoraktivátor, který je operačně připojený k nejméně jednomu promotoru (to at least a minimal promotér), který ovlivňuje transkripci v eukaryotických buňkách. Příkladem vhodných, na represor-citlivých operátorových sekvencí, můžou být sekvence odvozené z operonu tetracyklinové rezistence kódované u TnlO v E.coli, operonu lamda represoru a kvasničního GAL represorového operonu. Příkladem vhodných eukaryotických promotorů, ze kterých můžou být odvozeny minimální promotory, jsou například cytomegalovirus (CMV) IE promotor, promotor PtK-1 (thimidin kináza), HSP (heat shock protein) promotor a jakýkoliv eukaryotický promotor obsahující TATA box. Minimální promotorové sekvence mužou být odvozeny od těchto promotorů (i) tvorbou delečních mutantu využitím běžných metod a (ii) testováním schopnosti výsledné sekvence aktivovat transkripci u buněčné linie. U.S. Patent No. 5 650 298 uvádí fúzní protein represor-aktivátor, obsahující sekvence odvozené z tetracyklinového represoru sfúzovaného s VP16 sekvencemi, který je označen jako tTA a tTA-vnímavý promotor, označený.tet07, který obsahuje od TnlO odvozenou sekvenci spojenou s částí CMV IE promotoru.According to the invention, each repressoractivator fusion protein is used in conjunction with a target promoter that responds to a particular fusion protein and which regulates the transcription of the MDE coding sequence. A promoter typically comprises at least one operator sequence responsive to the repressor portion of a repressoractivator fusion polypeptide that is operably linked to at least one (to at least a minimal promoter) that affects transcription in eukaryotic cells. Examples of suitable repressor-sensitive operator sequences are those derived from the tetracycline resistance operon encoded by Tn10 in E. coli, the lamda repressor operon, and the yeast GAL repressor operon. Examples of suitable eukaryotic promoters from which minimal promoters can be derived are, for example, the cytomegalovirus (CMV) IE promoter, the PtK-1 promoter (thimidine kinase), the HSP (heat shock protein) promoter, and any eukaryotic promoter comprising a TATA box. Minimal promoter sequences can be derived from these promoters by (i) creating deletion mutants using conventional methods and (ii) testing the ability of the resulting sequence to activate transcription in a cell line. U.S. Pat. Patent No. No. 5,650,298 discloses a repressor-activator fusion protein comprising sequences derived from a tetracycline repressor fused to VP16 sequences, designated as tTA and a tTA-susceptible promoter, designated tet07, which comprises a Tn10-derived sequence linked to a portion of the CMV IE promoter.

Dočasná kontrola se může případně dosáhnout (i) expresí heterologního nebo rekombinantního polypeptidů (nebo polypeptidů) transkripčního aktivátoru v transgenním zvířeti a (ii) spojeným využitím cílového promotoru operačně připojeného k sekvenci kódující MMP, jejíž transkripční aktivita reaguje na heterologní nebo rekombinantní transkripční aktivátor. Mezi užitečné transkripční aktivátory patří modifikovaný ekdyzonový (ecdysone) receptor, u kterého je VP16 transkativační doména (připojená k transaktivační doméně glukokortikoidního receptoru z amino-konce) sfuzovaná s ligand vázající doménou a sekvencí ekdyzonového receptoru karboxy12 ··.. ·«Alternatively, the transient control may be achieved by (i) expressing a heterologous or recombinant polypeptide (or polypeptides) of a transcriptional activator in a transgenic animal, and (ii) associated using a target promoter operably linked to a MMP coding sequence whose transcriptional activity responds to a heterologous or recombinant transcriptional activator. Useful transcriptional activators include a modified ecdysone receptor in which the VP16 transcriptional domain (linked to the amino-terminal glucocorticoid receptor transactivating domain) is fused to the ligand-binding domain and the carboxy-12 ecdyzone receptor sequence.

• * * ♦ · · ♦ • « · · ·· « * ···**· • · » · · ♦ ♦ ·.· « ·< ♦· konce (No et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:3346, 1996); chimérický protein označený jako pGL-VP, obsahující aktivátorové sekvence VP16, aktivační sekvence GAL4 a ligand mutovaného lidského progesteronového receptoru vázající doménu (Wang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:8180, 1994; Wang et al., Gene Therapy 4:432,* * Konce · konce ♦ «konce konce konce konce konce konce ((((((((((((((((No No No No No No No (No et al. USA 93: 3346,1996); a chimeric protein designated pGL-VP, comprising VP16 activator sequences, GAL4 activating sequences, and a mutated human progesterone receptor ligand binding domain (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180, 1994; Wang et al., Gene Therapy 4: 432

1997); a chimérické proteiny obsahující transkripční aktivátory fúzované s estrogen (nebo jiný steroide) vázající doménou (Mattioni et al., Meth Cell Biol. 43:335, 1994). Ekdyzonový receptorový systém využívá receptor retinoidu X (RXR) pro tvorbu heterodimerů s chimérickým receptorem a reaguje na ekdozyn muristeron (analog ekdozynu) nebo dexamethazon (dexamethasone). Systém pGL-VP reaguje na mifepriston (mifepristone) (RU486). Chimérické receptory obsahující estrogen vázající doménu reagují na hydroxytamoxifen (analog estrogenu).1997); and chimeric proteins containing transcriptional activators fused to an estrogen (or other steroid) binding domain (Mattioni et al., Meth Cell Biol. 43: 335, 1994). The ecdysone receptor system utilizes the retinoid X receptor (RXR) to form heterodimers with a chimeric receptor and responds to ecdozyn muristerone (an analogue of ecdozyne) or dexamethasone (dexamethasone). The pGL-VP system reacts to mifepristone (mifepristone) (RU486). Chimeric receptors containing the estrogen-binding domain respond to hydroxytamoxifen (an estrogen analog).

Prostorové řízení exprese MDE se dosáhne použitím transkripčních promotorů, které zaměří transkripci selektivně do kloubních pletiv. Výraz specifická exprese v kloubech se zde používá ve významu exprese větší v kloubech, než v jiných buňkách; typicky je hladina exprese v nekloubních pletivech menší než 10^; hladiny exprese v kloubech. Preferuje se, když je exprese, v nekloubních pletivech nedetekovatelná. Užitečné promotorové sekvence, které vyvolají kloubně specifickou expresi sekvence, ke které jsou operačně připojené, zahrnují sekvence odvozené od promotoru kolagenu typu II. Je zřejmé, že kloubně specifický promotor vynálezu může obsahovat jednu nebo více kopií určitých sekvencí nebo sub-sekvencí a tyto sekvence můžou být v přímé nebo opačné orientaci relativně vůči sobě navzájem a relativně vůči sekvenci, jejíž exprese je řízena promotorem.Spatial control of MDE expression is achieved using transcriptional promoters that target transcription selectively into the joint tissues. The term specific expression in joints is used herein to mean expression greater in joints than in other cells; typically, the expression level in the non-articular tissues is less than 10 ^; expression levels in the joints. Preferably, the expression is undetectable in the non-articular tissues. Useful promoter sequences that induce joint-specific expression of a sequence to which they are operably linked include sequences derived from the type II collagen promoter. It will be appreciated that the joint-specific promoter of the invention may comprise one or more copies of certain sequences or sub-sequences, and these sequences may be in a direct or opposite orientation relative to each other and relative to a sequence whose expression is controlled by the promoter.

Koordinované prostorové a dočasné řízení exprese MDE se přednostně dosáhne (i) umístěním exprese fúzního polypeptidu represor-aktivátor nebo transkripčního aktivátorového polypeptidu pod řízení promotoru specifického pro kloub (ii) umístěním exprese MDE nebo odvozeniny MDE pod řízení promotoru odpovídajícího na fúzní polypeptid represor-aktivátor nebo transkripční aktivátorový polypeptid a (iii) tak, že jsou transgenní zvířata během fetálního vývoje a v časně po narození v podmínkách, kdy je exprese MDE potlačena.Coordinated spatial and temporal control of MDE expression is preferably achieved by (i) placing the expression of a repressor-activator fusion polypeptide or transcriptional activator polypeptide under joint-specific promoter control (ii) placing the expression of MDE or an MDE derivative under control of a promoter corresponding to a repressor-activator fusion polypeptide; a transcriptional activator polypeptide; and (iii) such that transgenic animals are during fetal development and early in birth under conditions where expression of MDE is suppressed.

»«·· ·· ·«»« ·· ·· ·

Metoda, kterou jsou transgenní zvířata udržována během fetálního vývoje a časně po narození v podmínkách, kdy nedochází k expresi MDE, závisí na tom, které určité transgeny jsou exprimované. Když se použije fúzní polypeptid represor-aktivátor, represe se dosáhne tak, že se zvířatům podává látka, která se váže na fúzní protein represor-aktivátor a výsledkem pak je represe transkripce cílového MDE genu. U zvířat obsahujících transgen kódující fúzní polypeptid represor-aktivátor obsahující tet represorové sekvence se represe dosahuje podáváním tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga v potravě nebo pitné vodě pro matku a po narození i pro potomstvo. Tetracyklin nebo analog tetracyklinu se také může podávat tak, že se chirurgicky subkutánně implantují pelety, které s postupujícím časem tyto látky uvolňují (Innovative Research of America, lne., Sarasota FL). V tomto případě vazba tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga na fúzní protein represor-aktivátor zabrání vazbě fúzního proteinu na analogický promotor a aktivaci transkripce. Tetracyklinová analoga jsou sloučeniny blízce příbuzné tetracyklinu, které se vážou k tet represoru s Ka nejméně 10‘^JM‘, nebo lépe s afinitou 10^?M'* či větší. Mezi účinná tetracyklinová analoga patří doxycyklin (doxycycline), anhydrytrotetracyklin (anhdryrotetracycline), chlortetracyklin (chlortetracycline) , epioxytetracyklin (epioxytetracycline) a další. Použité dávky jsou takové, aby se podstatně omezila exprese MMP. Typicky se tetracyklin nebo tetracyklinový analog podávají v pitné vodě pro zvířata v dávce asi 1 mg/ml. Když se mají MMP exprimovat, přestane se tetracyklin nebo jeho analog podávat.The method by which transgenic animals are maintained during fetal development and soon after birth under conditions that do not express MDE depends on which particular transgenes are expressed. When a repressor-activator fusion polypeptide is used, repression is accomplished by administering to the animal a substance that binds to the repressor-activator fusion protein resulting in repression of the transcription of the target MDE gene. In animals containing a transgene encoding a repressor-activator fusion polypeptide comprising tet repressor sequences, repression is accomplished by administering tetracycline or a tetracycline analogue in food or drinking water to the mother and to the offspring after birth. Tetracycline or a tetracycline analog can also be administered by surgically implanting subcutaneously pellets that release these substances over time (Innovative Research of America, Inc., Sarasota FL). In this case, binding of the tetracycline or tetracycline analog to the repressor-activator fusion protein prevents binding of the fusion protein to the analog promoter and activation of transcription. Tetracycline analogues are compounds closely related to tetracycline, which bind to the tet repressor with a Ka of at least 10 ^'J M, or preferably with an affinity of ^10? M '* or greater. Effective tetracycline analogs include doxycycline (doxycycline), anhydrytrotetracycline (anhdryrotetracycline), chlortetracycline (chlortetracycline), epioxytetracycline (epioxytetracycline) and others. The doses employed are such as to substantially reduce MMP expression. Typically, the tetracycline or tetracycline analog is administered in drinking water for animals at a dose of about 1 mg / ml. When MMP is to be expressed, tetracycline or an analogue thereof is discontinued.

V jiných případech se represe dosáhne tak, že se zvířeti nedostane látky, která je nutná pro aktivitu transkripčního aktivátorového polypeptidu. Například jestliže je transkripční aktivátor modifikovaný ekdyzonový receptor, jsou zvířata během fetálního a časně postnatálního vývoje bez ekdyzonu nebo ekdyzonového analoga. Ekdyzonová analoga jsou sloučeniny blízce příbuzné ekdyzonu, které se váží na modifikovaný ekdyzonový receptor s Ka nejméně 10'’M‘. Mezi užitečná ekdyzonová analoga patří například muristeron A (muristerone A). Když se požaduje exprese MDE, je zvířatům podán např, ekdyzon nebo muristeron A intraperitoneální injekcí v dávkách mezi asi 10 mg a asi 20 mg /zvíře. Obdobně • « · * · · použije-li se pGL-VP, aktivace se dosáhne podáním mefiprestonu (mefiprestone).In other cases, repression is accomplished by not providing the animal with a substance that is necessary for the activity of the transcriptional activator polypeptide. For example, if the transcriptional activator is a modified ecdysone receptor, the animals are free of ecdysone or an ecdysone analog during fetal and early postnatal development. Ecdysone analogs are compounds closely related to ecdysone that bind to a modified ecdysone receptor with a Ka of at least 10''M ‘. Useful ecdysone analogs include, for example, muristerone A (muristerone A). When MDE expression is desired, animals are administered, e.g., ecdysone or muristerone A by intraperitoneal injection at doses between about 10 mg and about 20 mg / animal. Similarly, when pGL-VP is used, activation is achieved by administration of mefiprestone (mefiprestone).

V preferovaném případě se vytvoří transgenní zvíře, jehož somatické a zárodečné buňky obsahují dva rekombinantní geny ve stabilní integrované formě: (i) první rekombinantní gen obsahuje sekvenci kódující MMP-13*, kde je sekvence operačně spojená s tetO7 promotorem; a (ii) druhý rekombinantní gen kóduje tTA protein operačně připojený k promotoru kolagenu typu II. V tomto případě jsou zvířata udržována během fetálního a časně postnatálního vývoje v přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, čímž dochází k represi genu. Později se tetracyklin nebo tetracyklinový analog odstraní a v kloubních pletivech dochází k selektivní expresi enzymatické aktivity MMP-13.In a preferred case, a transgenic animal is produced whose somatic and germ cells contain two recombinant genes in a stable integrated form: (i) the first recombinant gene comprises a sequence encoding MMP-13 *, wherein the sequence is operably linked to the tetO7 promoter; and (ii) the second recombinant gene encodes a tTA protein operably linked to a type II collagen promoter. In this case, the animals are maintained during fetal and early postnatal development in the presence of tetracycline or a tetracycline analog, thereby repressing the gene. Later, the tetracycline or tetracycline analog is removed and the joint tissues selectively express the enzymatic activity of MMP-13.

Zvířecí modely pro degenerativní onemocnění chrupavkyAnimal models for cartilage degenerative diseases

Předkládaný vynález poskytuje zvířecí modelové systémy, které reprodukovatelné vykazují fenotypové změny charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavky, jako například onemocnění kloubní nebo plotének. Tyto onemocnění zahrnují bez omezení osteoartrítidu, revmatickou artritidu, chondrodysplazii a degenerativní onemocnění meziobratlových plotének. Modelové systémy vynálezu vykazují jeden nebo více fenotypových indikátorů běžných pro tyto onemocnění, mezi které patří například ztráta proteoglykanu (detekované například tím, že se ztrácí barvení Safraninem 0) a štěpení kolagenu typu II v postižených pletivech. Systémy zahrnují transgenní zvířata popsaná výše, u kterých jsou v určeném čase během života transgenních zvířat exprimovány v chrupavkách rekombinantní nebo heterologní MDE, zejména MMP. Načasování objevení se indikátorů degenerace chrupavek je dáno aktivací exprese MDE a monitorováním účinku na chrupavky (viz níže). Preferuje se, když dochází k expresi jednoho nebo více MDE po narození, nejlépe tehdy, když zvířata dosáhnou dospělosti.The present invention provides animal model systems that reproducibly exhibit phenotypic changes characteristic of cartilage degenerative diseases, such as articular or plate diseases. These diseases include, but are not limited to, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, chondrodysplasia, and degenerative diseases of the intervertebral discs. The model systems of the invention exhibit one or more phenotypic indicators common to these diseases, including, for example, loss of proteoglycan (detected, for example, by loss of Safranin 0 staining) and cleavage of type II collagen in the affected tissues. The systems include the transgenic animals described above, in which recombinant or heterologous MDE, particularly MMPs, are expressed in cartilage at a specified time during the life of the transgenic animals. The timing of the appearance of cartilage degeneration indicators is determined by the activation of MDE expression and by monitoring the effect on cartilage (see below). Preferably, one or more MDEs are expressed after birth, preferably when the animals have reached maturity.

Exprese transgenú je typicky monitorována extrahováním mRNA z různých pletiv a jedním z následujících postupů: (i) reverzní transkripce s polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR) s použitím primerů homologních k transgenům; (ii) ochrana před RNasami (RNaseTransgene expression is typically monitored by extracting mRNA from various tissues and by one of the following: (i) reverse transcription with polymerase chain reaction (RT-PCR) using primers homologous to the transgenes; (ii) RNase protection

..... · ··'' ♦ »·· ·* - «φ • * φ φ · φ · • φ φ φφφ φ φ φφφφ» φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φφ «· protection); a (iii) Northern blot analýza (Northern blot analysis). Také se může provést in šitu hybridizace...... · · '♦ ♦ · * - - - * · · · · · · protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection protection) and (iii) Northern blot analysis. In situ hybridization can also be performed.

Fyziologické účinky exprese MDE na kloubní chrupavky se monitorují na testovaných zvířatech po usmrcení, obarvením parafinových odvápněných chrupavek (i) hematoxylinem a eosinem (s využitím konvenčních technik) a následovně dvojitým barvením (ii) Safraninem 0 a barvivém „fast green (Peter et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). Nebo se můžou zmrazené řezy obarvit pomocí protilátek, které jsou specifické pro fragmenty štěpení odvozené od kolagenu typu II (Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99:1534, 1997). Typicky vyvolá alespoň sedmidenní exprese MMP transgenu (transgenů) detekovatelnou ztrátu proteoglykanu a změny v morfologii růstové ploténky (growth plate morphology) (viz např. přiklad 5 dole).The physiological effects of MDE expression on articular cartilage are monitored in test animals after sacrifice, staining of paraffin decalcified cartilage (i) with hematoxylin and eosin (using conventional techniques), followed by double staining with (ii) Safranin 0 and fast green (Peter et al. (J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). Alternatively, frozen sections can be stained with antibodies that are specific for type II collagen-derived cleavage fragments (Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99: 1534, 1997). Typically, at least seven days expression of the MMP transgene (s) induces a detectable proteoglycan loss and changes in growth plate morphology (see, eg, Example 5 below).

V rámci tohoto vynálezu jsou zvířecí modely, u kterých exprese MDE, zejména MMP a hlavně enzymaticky aktivních forem MMP-13, vede ke ztrátě proteoglykanu a/nebo ke štěpení kolagenu typu II.Within the scope of this invention there are animal models in which the expression of MDE, in particular MMP, and in particular of enzymatically active forms of MMP-13, results in the loss of proteoglycan and / or cleavage of type II collagen.

Jiné fenotypové indikátory degenerativních onemocnění chrupavek, které mohou být monitorovány v transgenních zvířatech podle tohoto vynálezu, zahrnují například celkové pozorování změn ve funkci kloubů a histologické důkazy (i) tvoření vláken (fibrilation) a ztráty kloubní chrupavky a (ii) tvorba osteofytu.Other phenotypic indicators of cartilage degenerative diseases that can be monitored in the transgenic animals of the invention include, for example, an overall observation of changes in joint function and histological evidence of (i) fibrilation and articular cartilage loss and (ii) osteophyte formation.

Transgenní zvířata vynálezu jsou užitečným modelem pro syndromy patologických stavů, které vykazují narušení složení, morfologie a/nebo funkce chrupavky, včetně osteoartritidy; revmatické artritidy; degenerativní onemocnění meziobratlových plotének; chondriodysplasie včetně např. Kneistovy dysplasie (Kneist dysplasy), achondrogeneze (achondrogenesis) a hypofosfatie (hypophosphatasia); a proteoglykany vyvolané poruchy, jaké se objevují např. u brachymorfních (brachym.orphic) zvířat (Halí et al., Cartilage: Molecular Aspects, CRC Press, 1991, pp. 201-203).The transgenic animals of the invention are a useful model for pathological condition syndromes that exhibit impaired cartilage composition, morphology, and / or function, including osteoarthritis; rheumatoid arthritis; intervertebral disc degenerative diseases; chondriodysplasia including, but not limited to, Kneist dysplasia, achondrogenesis, and hypophosphatasia; and proteoglycan-induced disorders such as occur in brachymorphic (brachymorphic) animals (Halí et al., Cartilage: Molecular Aspects, CRC Press, 1991, pp. 201-203).

Transgenní zvířata vynálezu se můžou podrobit dalším zákrokům s cílem ovlivnit indikátory degenerace chrupavek a/nebo doplnit fenotyp nemocných zvířat dalšími fyziologickými efekty, jako např. těmi, které jsou spojeny s určitým onemocněním. Například se na transgenní zvířata může působit látkami vyvolávajícími záněty s cílem zvýšit degradací kolagenu a/nebo indukovat ztrátu proteoglykanu (viz např. příklad 6 dále). Kromě toho se proThe transgenic animals of the invention may undergo further interventions to influence the cartilage degeneration indicators and / or complement the phenotype of diseased animals with other physiological effects, such as those associated with a particular disease. For example, transgenic animals can be treated with inflammatory agents to increase collagen degradation and / or induce proteoglycan loss (see, eg, Example 6 below). In addition, the pro

« • · zopakování symptomů určitého onemocnění nebo syndromu může použít načasování a rozsah indukce MDE, ať už s nebo bez dalších zákroků.The recurrence of symptoms of a particular disease or syndrome may use the timing and extent of MDE induction, with or without further intervention.

Metody pro hodnocení látek, které ovlivňují degenerativní onemocnění chrupavky.Methods for evaluation of substances that affect cartilage degenerative diseases.

Předkládaný vynález zahrnuje metody pro objevování a hodnocení účinnosti léčiv a léčebných postupů proti degenerativním onemocněním chrupavky, zejména kloubním degenerativním onemocněním. V jedné formě vynálezu se transgenní zvířata chovají za podmínek, kdy exprese jednoho nebo více MDE vede ke vzniku jednoho nebo více fenotypových ukazatelů degenerativního onemocnění chrupavky. Jakmile dojde k objevení se symptomů, můžou se hodnotit látky, které mají působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Podávají se ve známých dávkách zvířatům, u kterých se objevily symptomy;The present invention encompasses methods for discovering and evaluating the efficacy of medicaments and treatments against degenerative cartilage diseases, particularly joint degenerative diseases. In one embodiment, transgenic animals are maintained under conditions where expression of one or more MDEs results in one or more phenotypic markers of cartilage degenerative disease. Once symptoms have occurred, substances can be evaluated to counteract degenerative cartilage disease. They are administered at known doses to animals that have experienced symptoms;

monitorováním fenotypových indikátoru po předem určenou dobu po podání testovaných látek; a porovnáním s rozsahem fenotypových indikátorů u zvířat, kterým se aplikovala látka, se zvířaty kontrolními. Kontrolní zvířata zahrnují transgenní zvířata stejného pohlaví a věku chovaná za stejných podmínek (tj. exprimující transgeny), kterým se ale neaplikuje testovaná látka. Jakékoliv statisticky významné odchylky v rozsahu nebo povaze fenotypových indikátorů naznačují možné působení testované látky proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Fenotypovými indikátory degenerativního onemocnění chrupavky se rozumí ztráta proteoglykanu, zúžení kloubní mezery (joint space narrowing), degradace kolagenu a odbourávání chrupavky.monitoring phenotypic indicators for a predetermined time after administration of test substances; and comparing the range of phenotypic indicators in the treated animals with the control animals. Control animals include transgenic animals of the same sex and age bred under the same conditions (ie, expressing transgenes) but not treated with the test substance. Any statistically significant variations in the extent or nature of the phenotypic indicators indicate the possible action of the test substance against degenerative cartilage disease. Phenotypic indicators of cartilage degenerative disease include proteoglycan loss, joint space narrowing, collagen degradation and cartilage degradation.

Schopnost látky působit proti degenerativním onemocněním chrupavky, zejména proti degenerativnímu onemocnění kloubů, se hodnotí jejím aplikováním transgennímu zvířeti ve známé dávce před a/nebo současně s indukcí exprese MDE u transgenního zvířete; monitorováním fenotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky po určenou dobu po aplikaci látky a indukci MDE; a porovnáním rozsahu fenotypových indikátorů a/nebo onemocnění u zvířete, kterému byla aplikována testovaná látka a zvířete kontrolního, kterému testovaná látka podána nebyla. Jakákoliv statisticky významná odchylka v rozsahu nebo povaze fenotypových • · * · ··« · · *· ··«· ·· · ♦ • #The ability of a substance to act against cartilage degenerative diseases, particularly joint degenerative diseases, is assessed by applying it to a transgenic animal at a known dose prior to and / or concurrently with inducing MDE expression in the transgenic animal; monitoring phenotypic indicators of cartilage degenerative disease for a specified period after drug administration and MDE induction; and comparing the range of phenotypic indicators and / or disease in the animal to which the test substance was administered and the control animal to which the test substance was not administered. Any statistically significant variation in the extent or nature of phenotypic phenotypes.

indikátorů a/nebo onemocnění naznačují možné působení testované látky proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.indicators and / or diseases indicate the possible action of the test substance against degenerative cartilage disease.

Další náznak schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky je její schopnost způsobit jakékoliv snížení rozsahu nebo trvání jiných ošetření, včetně např. dávky a doby podávání jiné terapeutické látky použité pro ulehčení symptomů onemocnění.Another indication of the ability of a substance to counteract degenerative cartilage disease is its ability to cause any reduction in the extent or duration of other treatments, including, eg, the dose and time of administration of another therapeutic agent used to alleviate the symptoms of the disease.

Sloučeniny, které se můžou testovat na jejich schopnost působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, se můžou nalézt např. mezi zdroji přírodních látek, fermentačními zdroji (včetně rostlin a mikroorganismů), kombinačními zdroji, zdroji sloučenin, syntetických sloučenin a sloučenin vzniklých jako výsledek cíleného návrhu a syntézy. Zdroje syntetických sloučenin jsou komerčně dostupné například od Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwal, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) a Microsource (New Milford, CT). Řídce se vyskytující chemické zdroje jsou dostupné od Aldrich Chemical Company, lne. (Milwaukee, WI). Zdroje přírodních látek ve formě extraktů z bakterií, hub, rostlin a zvířat jsou k dispozici například od Pan Laboratories (Bothell, WA) , nebo MycoSearch (NC), nebo je možné si je snadno připravit. Knihovny přírodních nebo synteticky připravených látek je navíc možné snadno modifikovat konvenčními chemickými, fyzikálními a biochemickými způsoby (Blondelle et al., TibTech 14:60, 1996)Compounds that can be tested for their ability to counteract degenerative cartilage disease can be found, for example, among natural source sources, fermentation sources (including plants and microorganisms), combination sources, compound sources, synthetic compounds and compounds resulting from targeted design and synthesis. Sources of synthetic compounds are commercially available, for example, from Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK); Comgenex (Princeton, NJ); Brandon Associates (Merrimack, NH); and Microsource (New Milford, CT). Sparse chemical sources are available from Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI). Sources of natural substances in the form of extracts from bacteria, fungi, plants and animals are available, for example, from Pan Laboratories (Bothell, WA) or MycoSearch (NC), or can be easily prepared. In addition, libraries of natural or synthetically prepared substances can be easily modified by conventional chemical, physical and biochemical methods (Blondelle et al., TibTech 14:60, 1996)

Transgenní zvířataTransgenic animals

Pojem transgenní zvířata se zde používá pro zvířata, do kterých byl vnesen jeden nebo více heterologních a/nebo rekombinantních genů. Transgeny můžou být z odlišného druhu, nebo z toho samého druhu jako transgenní zvíře, ale nevyskytují se přirozeně ve zvířeti v té podobě a/nebo na chromozomálním lokusu jako transgen. Transgeny můžou obsahovat cizorodé DNA sekvence, tj. sekvence normálně se nevyskytující v genomu hostitelského zvířete. Místo těchto sekvencí (nebo kromě nich) transgeny můžou obsahovat endogenní DNA sekvence, které byly přeskupeny nebo mutovány in vitro, s cílem ovlivnit normální in vivo expresi genu, nebo ovlivnit či eliminovat biologickou aktivitu endogenního genového produktu kódovaného genem.The term transgenic animals is used herein to refer to animals in which one or more heterologous and / or recombinant genes have been introduced. The transgenes may be from a different species, or from the same species as a transgenic animal, but do not naturally occur in the animal in the form and / or at the chromosomal locus as the transgene. Transgenes may contain foreign DNA sequences, i.e., sequences not normally found in the genome of the host animal. Instead of (or in addition to) these transgenes, they may contain endogenous DNA sequences that have been rearranged or mutated in vitro to affect normal in vivo gene expression, or to affect or eliminate the biological activity of an endogenous gene product encoded by the gene.

• ·• ·

• · ······· • ·· · ·· · · ·· ···• · ······· · ··· · · · · ···

Vynález se také týká DNA fragmentů, které jsou vneseny do preexistujícího genu, s cílem např. změnit modely exprese nebo poskytnout prostředky pro regulaci exprese genu (Watson et al., „The Introduction of Foreign Genes Into Mice. v Recombinant DNA, 2^nd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1992, str. 255-272; Gordon, J.W.,The invention also relates to DNA fragments which are introduced into a pre-existing gene in order, for example, to alter expression patterns or to provide means for regulating gene expression (Watson et al., "Introduction to Foreign Genes Into Mice." In Recombinant DNA, 2 ^nd Ed. , WH Freeman & Co., New York, 1992, pp. 255-272; Gordon, JW,

Intl. Rev. Cytol. 115:171, 1989; Jaenisch, Science 240:1468, 1989; Rossant, Neuron 2:323, 1990).Intl. Roar. Cytol. 115: 171 (1989); Jaenisch, Science 240: 1468,1989; Rossant, Neuron 2: 323 (1990).

Transgenní, nehumánní zvířata vynálezu se získají vnesením transgenů do zárodečné buňky nehumánních zvířat. Pro vnesení transgenu vynálezu se používají cílové embryonální buňky v různém vývojovém stadiu. V závislosti na stavu vývoje cílové embryonální buňky (buněk) se na to používají různé metody. Mezi tyto metody patří například mikroinjekce zygoty, integrace viru, transformace embryonálních kmenových buněk postupem popsaným dále a další metody.The transgenic, non-human animals of the invention are obtained by introducing transgenes into the germ cell of non-human animals. Target embryonic cells at different stages of development are used to introduce the transgene of the invention. Depending on the state of development of the target embryonic cell (s), different methods are used. Such methods include, for example, zygote microinjection, virus integration, embryonic stem cell transformation as described below, and other methods.

1. Preferovanou metodou pro vnesení transgenu do zvířecího genomu je mikroinjekce zygoty. Jako cílová buňka pro mikroinjekci transgenní DNA sekvencí se preferuje zygota, což je fertilizované vajíčko, u kterého nedošlo k pronukleární fúzi nebo následnému buněčnému dělení. Myší samčí pronukleus dosahuje velikosti asi 20 mikrometrů v průměru, což je velikost dostatečná pro reprodukovatelnou injekci 1-2 pikolitrú roztoku s transgenní DNA. Použití zygoty pro vnesení transgenu má výhodu v tom, že ve většině případů dojde k inkorporaci sekvence transgenní DNA do genomu hostitelského zvířete před prvním buněčným dělením (Brinster et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:4438, 1985). V důsledku toho všechny buňky vzniklých transgenních zvířat (zakladatelská zvířata - founder animals) stabilně ponesou inkorporovaný transgen na určitém genetickém lokusu, označený jako transgenní alela. Transgenní alela vykazuje Mendelovskou dědičnost, tj . polovina potomstva z křížení mezi transgenním zvířetem a netransgenním zvířetem bude dědit transgenní alelu v souladu s Mendelovskými pravidly náhodného uspořádání.A preferred method for introducing a transgene into an animal genome is by microinjection of a zygote. As a target cell for microinjection of the transgenic DNA sequence, a zygote, which is a fertilized egg that has not undergone prononuclear fusion or subsequent cell division, is preferred. The mouse male pronucleus reaches a size of about 20 microns in diameter, a size sufficient to reproducibly inject 1-2 picolitre solutions with transgenic DNA. The use of a zygote for transgene delivery has the advantage that in most cases the transgenic DNA sequence will be incorporated into the genome of the host animal before the first cell division (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438, 1985). As a result, all cells of the founder animals stably carry the incorporated transgene at a particular genetic locus, referred to as the transgenic allele. The transgenic allele shows Mendelian inheritance; half of the progeny from the cross between the transgenic animal and the non-transgenic animal will inherit the transgenic allele in accordance with Mendelian randomization rules.

2. Pro vnesení transgenu vynálezu do zvířete se také může použít integrace viru. Vyvíjející se embrya jsou pěscována in vitro do vývojového stádia blastocyt. Blastomery se můžou infikovat odpovídajícími retroviry (Jaenich, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 73:1260). Infekce blastomer se muže zvýšit enzymatickým odstraněním « · zóny pellucida. Transgeny se vnesou virálními vektory, které typicky nesou defekt pro replikaci, ale které zůstávají způsobilé pro integraci k viru připojené DNA sekvence (včetně sekvence transgenní DNA připojené k takovéto virové sekvenci) do hostitelského zvířecího genomu. Transfekce se snadno a účinně dosáhne kultivováním blastomer v monovrstvě buněk produkujících transgen obsahující virový vektor. Infekce je také možné dosáhnout použitím buněk v pozdějším vývojovém stádiu, například blastocel. V každém případě bude většina zakladatelských zvířat získaných integrací viru mozaikových pro transgenní alelu; to znamená, že transgen je inkorporován pouze do části všech buněk zakladatelského transgenního zvířete. Navíc může dojít k vícenásobné integraci viru do jednotlivého zakladatelského zvířete, čímž vznikne více transgenních alel, které segregují v budoucích generacích potomků. Vnesení transgenu do zárodečných buněk touto metodou je možné, ale dochází k němu pravděpodobně s nižší frekvencí. Jakmile je ale touto metodou vnesen transgen do zárodečné buňky, je možné získat potomstvo, kde bude transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj. jak v somatických, tak v zárodečných buňkách.2. Virus integration may also be used to introduce a transgene of the invention into an animal. Developing embryos are sampled in vitro to the blastocyte developmental stage. Blastomers can be infected with the corresponding retroviruses (Jaenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260). Blastomer infection can be increased by enzymatic removal of the pellucid zone. Transgenes are introduced by viral vectors that typically carry a replication defect but which remain capable of integrating a virus-linked DNA sequence (including a transgenic DNA sequence linked to such a viral sequence) into the host animal genome. Transfection is readily and efficiently achieved by culturing the blastomeres in the monolayer of cells producing the transgene containing the viral vector. Infection can also be achieved by using cells at a later developmental stage, for example blastocel. In any case, most of the founder animals will be obtained by integrating the mosaic virus for the transgenic allele; that is, the transgene is incorporated into only a portion of all cells of the founder transgenic animal. In addition, multiple integration of the virus into a single founder animal can occur, thereby creating more transgenic alleles that segregate in future generations of offspring. The introduction of the transgene into germ cells by this method is possible, but is likely to occur at a lower frequency. However, once the transgene is introduced into the germ cell by this method, it is possible to obtain progeny where the transgenic allele will be present in all animal cells, i.e. both somatic and germ cells.

3. Embryonální kmenové (embryonal stem, ES) buňky můžou také sloužit jako cílové buňky pro vnesení transgenu vynálezu do zvířat. ES buňky se získají z neuhnizděných (pre-implantation) embryí, která se kultivují in vitro (Evans et al., Nátuře 292: 154, 1981). ES buňky, které byly transformovány transgenem, se můžou kombinovat se zvířecím blastocytem; ES buňky poté osídlí embryo a přispějí ke vzniku zárodečné buňky výsledného zvířete (což je chiméra, tj. je složená z buněk odvozených ze dvou nebo více zvířat). Opět platí, že jakmile je transgen vnesen touto metodou do zárodečných buněk, můžeme získat potomky, u kterých je transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj. jak somatických tak zárodečných buňkách.3. Embryonic stem (ES) cells can also serve as target cells for introduction of the transgene of the invention into animals. ES cells are obtained from pre-implantation embryos that are cultured in vitro (Evans et al., Nature 292: 154, 1981). ES cells that have been transformed with a transgene can be combined with an animal blastocyte; The ES cells then populate the embryo and contribute to the formation of the germ cell of the resulting animal (which is a chimera, ie consisting of cells derived from two or more animals). Again, once the transgene is introduced into the germ cells by this method, we can obtain offspring in which the transgenic allele is present in all animal cells, i.e. both somatic and germ cells.

I když je počáteční vnesení transgenu Lamarkistická (neMendelovská) událost, můžou být transgeny vynálezu stabilně integrovány do zárodečných buněk a přenášeny do potomstva transgenního zvířete jako Mendelovské místo (Mendelian loci). Jiné transgenní techniky dají vzniknout mozaikovým transgenním zvířatům, u kterých některé buňky nesou' transgeny a jiné buňky ne. U • · · ·Although the initial introduction of the transgene is a Larkark (non-Mendelian) event, the transgenes of the invention can be stably integrated into the germ cells and transferred to the progeny of the transgenic animal as a Mendelian loci. Other transgenic techniques give rise to mosaic transgenic animals in which some cells carry transgenes and others do not. U • · · ·

• · · · ·· · ·· · • · »····· ····· ·· ·· ·· mozaikových transgenních zvířat, kde zárodečné buňky nenesou transgen, nedochází k přenosu transgenu do potomstva. Nicméně se dají mozaiková transgenní zvířata použít pro demonstraci fenotypu spojeného s transgeny.The mosaic transgenic animals where the germ cells do not carry the transgene do not transfer the transgene to the offspring. However, mosaic transgenic animals can be used to demonstrate the phenotype associated with transgenes.

V praxi vynálezu jsou zvířata udržovací linie křížena se zvířaty s takovým genetickým původem, kdy exprese transgenu vyvolá symptomy degenerativního onemocnění chrupavky. Potomstvo se zděděnými transgeny vynálezu se odliší od ostatních potomků ve vrhu, kteří nezdědili transgen, analýzou genetického materiálu z potomstva na přítomnost sekvencí nukleové kyseliny z transgenu vynálezu. Například biologické tekutiny, které obsahují polypeptidy výhradně kódované transgeny vynálezu, se můžou analyzovat imunoanalýzami na přítomnost těchto polypeptidů. Jednodušším a spolehlivějším způsobem identifikace potomstva je získání vzorku tkáně z „okraje zvířete, například z ocasu, a analýza vzorku na přítomnost sekvencí nukleových kyselin odpovídajících části nebo částem sekvence DNA transgenu vynálezu. Přítomnost takovýchto sekvencí nukleové kyseliny se může provést například hybridizační („Southern) analýzou s DNA sekvencemi odpovídajícími určité části transgenu, analýzou produktu PCR reakce s použitím DNA sekvence ze vzorku jako substrátu, oligonukleotidy odvozenými z DNA sekvence transgenu a podobně.In the practice of the invention, the animals of the maintenance line are crossed with animals of a genetic origin where expression of the transgene induces symptoms of cartilage degenerative disease. Progeny with inherited transgenes of the invention are distinguished from other offspring in the litter who have not inherited the transgene by analyzing the genetic material from the progeny for the presence of nucleic acid sequences from the transgene of the invention. For example, biological fluids containing polypeptides exclusively encoded by transgenes of the invention can be analyzed by immunoassays for the presence of these polypeptides. A simpler and more reliable way of identifying progeny is to obtain a tissue sample from the "edge of the animal, such as the tail," and analyze the sample for the presence of nucleic acid sequences corresponding to a portion or portions of the DNA sequence of the transgene of the invention. The presence of such nucleic acid sequences can be performed, for example, by hybridization ("Southern") analysis with DNA sequences corresponding to certain portions of the transgene, analysis of the PCR reaction product using the DNA sequence from the sample as substrate, oligonucleotides derived from the DNA sequence of the transgene, and the like.

Nukleové kyseliny, vektory, expresní systémy a polypeptidy.Nucleic acids, vectors, expression systems and polypeptides.

Předkládaný vynález zahrnuje izolované nukleové kyseliny kódující MDE, zejména MMP a enzymaticky aktivní fragmenty od nich odvozené, a také konstitutivně aktivní varianty MMP a enzymaticky aktivní fragmenty z nich odvozené. Vynález také zahrnuje dodatky výše uvedených nukleových kyselin; vektory obsahující nukleové kyseliny; buňky obsahující vektory; a izolované polypeptidy kódované nukleovými kyselinami.The present invention encompasses isolated nucleic acids encoding MDE, particularly MMPs and enzymatically active fragments derived therefrom, as well as constitutively active variants of MMPs and enzymatically active fragments derived therefrom. The invention also encompasses the above-mentioned nucleic acid additions; nucleic acid containing vectors; cells containing vectors; and isolated polypeptides encoded by nucleic acids.

Při práci s předkládaným vynálezem se použije mnoho technik běžných v molekulární biologii, mikrobiologii, rekombinantni DNA a proteinové biochemii, jako například techniky vysvětlené například v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spriong Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volume and II, • · · · · ·Many techniques common in molecular biology, microbiology, recombinant DNA, and protein biochemistry are used in the practice of the present invention, such as those explained, for example, in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spriong Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volume and II

99·· ··99 ·· ··

1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.);1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M. L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames &amp; Higgins eds.);

A Practical Guide to Molecular Cloning; série, Methods in Enzymology (Academie Press, lne.); a Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer - Verlag, N.Y.) atd.A Practical Guide to Molecular Cloning; series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc); and Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), etc.

Zde používaný termín „nukleová kyselina nebo „polynukleotidy se vztahuje k puriny a pyrimidiny obsahujícím polymerům jakékoliv délky, buď polyribonukleotidům nebo polydeoxyribonukleotidúm nebo směsi polyribo-polydeoxyribo nukleotidů. To zahrnuje jedno- a dvouřetězcové molekuly, např·. DNA-DNA, DNA-RNA a RNA-RNA hybridy a také „proteinové nukleové kyseliny (protein nucleid acids, PNA) vytvořené konjugací bází k aminokyselinové kostře. Patří sem také nukleové kyseliny obsahující modifikované báze.As used herein, the term "nucleic acid or" polynucleotides refers to purines and pyrimidines comprising polymers of any length, either polyribonucleotides or polydeoxyribonucleotides or mixtures of polyribo-polydeoxyribo nucleotides. This includes single- and double-stranded molecules, e.g. DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA hybrids as well as protein nucleid acids (PNAs) produced by conjugation of bases to the amino acid backbone. Also included are nucleic acids containing modified bases.

„Kódující sekvence nebo „protein kódující sekvence je polynukleotidová sekvence schopná transkripce na mRNA a/nebo schopná translace na polypeptid. Hranice ohraničující kódující sekvenci jsou typicky dané translačním startovacím kodonem na 5'-konci a translačním stop kodonem na 3'-konci.A "coding sequence" or "protein coding sequence" is a polynucleotide sequence capable of transcription into mRNA and / or capable of translation into a polypeptide. The boundaries flanking the coding sequence are typically given by a translation start codon at the 5'-end and a translation stop codon at the 3'-end.

Zde používaný pojem „komplementsekvence nukleové kyseliny se vztahuje k antimediátorové (antisense) sekvenci, která se účastní Watsnon-Crickova párování baží s originální sekvencí.As used herein, the term "nucleic acid complications" refers to an antisense (antisense) sequence that participates in Watsnon-Crick pairing with the original sequence.

Zde používaný pojem „izolovaná nukleová kyselina nebo polypeptid se vztahuje ke komponentům, které jsou získány z místa svého normálního výskytu (například jejich přirozeného výskytu, vyskytují-li se přirozeně). Izolovaná nukleová kyselina nebo polypeptid typicky obsahují méně než 50% (v lepším případě méně než 75?; a nejlépe méně než 90%) buněčných komponentů, se kterými byly původně sdružené.As used herein, the term "isolated nucleic acid or polypeptide" refers to components that are obtained from their normal site of occurrence (for example, their natural occurrence, if naturally occurring). The isolated nucleic acid or polypeptide typically comprises less than 50% (preferably less than 75%, and most preferably less than 90%) of the cellular components with which they were originally associated.

Nukleová nebo polynukleotidová sekvence, která je „odvozená od určené sekvence, se vztahuje k sekvenci, která odpovídá oblasti zmíněné sekvence. Pro sekvence nukleových kyselin to zahrnuje sekvence, které jsou homologní nebo komplementární k dané sekvenci a také „sekvenčně konzervativní varianty a „funkčně konzervativní varianty. Pro polypeptidové sekvence se to týká „funkčně konzervativních variant. Sekvenčně konzervativní varianty jsou ty, u kterých změna jednoho nebo více nukleotidu v daném kodónu nemá vliv na aminokyselinu kódovanou touto pozicí. Funkčně konzervativní • · ···· ·· · · ·· • · · · · · · · · · varianty jsou ty, u kterých byl daný aminokyselinový zbytek v polypeptidu změněn bez ovlivnění celkové konformace a funkce přirozeného polypetidu. Může se jednat například o záměnu aminokyseliny za jinou se stejnými fyzikálně chemickými vlastnostmi (jako například kyselá, zásaditá, hydrofobní a podobně). Mezi „funkčně konzervativní varianty patří také jakékoliv polypeptidy, které mají schopnost vyvolat protilátky specifické proti danému polypeptidu.A nucleic or polynucleotide sequence that is "derived from a designated sequence" refers to a sequence that corresponds to a region of said sequence. For nucleic acid sequences, this includes sequences that are homologous or complementary to a given sequence, as well as "sequence conserved variants" and "functionally conserved variants." For polypeptide sequences, this refers to &quot; functionally conserved variants. Sequence conserved variants are those in which a change in one or more nucleotides in a given codon does not affect the amino acid encoded by that position. Functionally conserved variants are those in which a given amino acid residue in a polypeptide has been altered without affecting the overall conformation and function of the natural polypeptide. For example, the amino acid may be replaced with another having the same physicochemical properties (such as acidic, basic, hydrophobic and the like). Functionally conserved variants also include any polypeptides having the ability to elicit antibodies specific to the polypeptide.

Nukleové kyseliny, zahrnující jakékoliv zde uvedené sekvence nebo jejich varianty, se můžou připravit konvenčními metodami. Například DNA se může syntetizovat chemicky např. použitím fosforamiditové metody využívající pevného povrchu (Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Socc 103:3185) nebo metodu popsanou v práci Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17708, nebo použitím jiné všeobecně známé metody. Může se toho také dosáhnout následným spojením řady oligonukleotidových kazet obsahujících páry syntetických oligonukleotidů.Nucleic acids, including any of the sequences disclosed herein, or variants thereof, can be prepared by conventional methods. For example, DNA can be synthesized chemically, e.g., using a solid surface phosphoramidite method (Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Socc 103: 3185) or the method described in Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17708, or using another generally known method. This can also be accomplished by sequentially joining a series of oligonucleotide cassettes containing pairs of synthetic oligonucleotides.

Díky degeneraci genetického kódu může být daná aminokyselinová sekvence nebo její část kódovaná mnoha ruz,nýni nukleotidovými sekvencemi. Mužou se tak vybrat kodóny pro optimální expresi v porokaryotních nebo eukaryotních systémech. Takovéto degenerované varianty jsou také zahrnuté v tomto vynálezu.Due to the degeneracy of the genetic code, a given amino acid sequence, or a portion thereof, can be encoded by many different nucleotides. Thus, codons can be selected for optimal expression in porocaryotic or eukaryotic systems. Such degenerate variants are also included in the invention.

Nukleové kyseliny se také mužou odborníkům známými způsoby modifikovat. Takovýmito modifikacemi můžou být například metylace, „čepičky, substituce jednoho nebo více přirozeně se vyskytujících nukleotidů jejich analogy, internukleotidové modifikace jako například modifikace s nenabitými vazbami (např. metyl fosfonáty, fosfotriestery, fosforamidy (phosphoramidates), karbamáty atd.) a s nabitými vazbami (např. fosforothioáty (phosphorothioates), fosforodithioáty (phosphorodithioates) atd.). Nukleové kyseliny můžou obsahovat jednu nebo více kovalentně připojených částí, jako např. proteiny (např. nukleázy, toxiny, protilátky, signální peptidy, poly-L-lysin atd.), interkalátory (např. akridin, psoralen atd.), chelátorv (např. kovy, radioaktivní kovy, železo, oxidační kovy atd.) a alkylační činidla (alkylators). Termín „nukleová kyselina také zahrnuje PNA. Nukleová kyselina může být upravena tvorbou metylového nebo etylového fosfotriesteru nebo alkyl • · 4 4 4 4 ·· ·· ·* • 4 4 4 · 4 · · *·Nucleic acids can also be modified by methods known to those skilled in the art. Such modifications may include, for example, methylation, capping, substitution of one or more naturally occurring nucleotides with their analogs, internucleotide modifications such as modifications with uncharged bonds (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.) and charged bonds ( eg phosphorothioates (phosphorothioates), phosphorodithioates (phosphorodithioates, etc.). The nucleic acids may comprise one or more covalently attached moieties such as proteins (e.g. nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), intercalators (e.g. acridine, psoralen, etc.), chelators (e.g. metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.) and alkylators. The term "nucleic acid" also includes PNA. The nucleic acid may be modified by the formation of a methyl or ethyl phosphotriester or an alkyl.

4 4 444 4 ·4,444 4 ·

4 4444 44 44,444 44 4

4··4· · · · · * · · · · fosforamidátovu vazbou. Sekvence nukleových kyselin předkládaného vynálezu můžou být také modifikovány značkou schopnou produkovat detekovatelný signál, ať už přímo nebo nepřímo. Značkami můžou'být například radioisotopy, fluorescenční molekuly, biotin a podobně.4 by phosphoramidate bond. The nucleic acid sequences of the present invention may also be modified by a label capable of producing a detectable signal, either directly or indirectly. The labels may be, for example, radioisotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.

Polypeptidy vynálezu se můžou exprimovat s použitím mnoha známých vektorů, jako např. pUC plasmidu, pET plasmidů (Novagen, lne., Madison, WI) nebo pRSET či pREP plasmidy (Invitrogen, San Diego, CA) a mnoha vhodných hostitelských buněk, s využitím metod uvedených nebo citovaných zde, nebo známých odborníkům v této oblasti. Konkrétní výběr vektor/hostitel není pro praxi vynálezu kritický. Rekombinantní klonovací vektory často budou obsahovat jeden nebo více replikačních systémů pro klonování nebo expresi; jeden nebo více markérů pro selekci v hostiteli, například resistenci na antibiotikum; a jednu nebo více expresních kazet. Vkládané kódující sekvence se můžou syntetizovat standardními metodami, izolovat z přírodních materiálů, připravit jako hybridy a podobně. Známými metodami se může provést ligování kódujících sekvencí k elementům regulujícím transkripci a/nebo k jiným aminokyseliny kódujícím sekvencím. Vhodné hostitelské buňky se můžou transformovat/transfekovat/infikovat jakoukoliv vhodnou metodou včetně elektroporace, absorpce zprostředkované CaCL·, infekce houbami, mikroinjekcemi, mikroprojektily nebo jinými zavedenými metodami.Polypeptides of the invention can be expressed using a variety of known vectors such as pUC plasmid, pET plasmids (Novagen, Inc, Madison, WI) or pRSET or pREP plasmids (Invitrogen, San Diego, CA) and many suitable host cells, using methods disclosed or cited herein, or known to those skilled in the art. The particular vector / host selection is not critical to the practice of the invention. Recombinant cloning vectors will often contain one or more replication systems for cloning or expression; one or more markers for selection in the host, for example antibiotic resistance; and one or more expression cassettes. The inserted coding sequences can be synthesized by standard methods, isolated from natural materials, prepared as hybrids, and the like. Ligation of coding sequences to transcriptional regulatory elements and / or other amino acid coding sequences can be performed by known methods. Suitable host cells can be transformed / transfected / infected by any suitable method including electroporation, CaCL-mediated absorption, fungal infection, microinjection, microprojectiles or other established methods.

Vhodné hostitelské buňky zahrnují bakterie, archebakterie, houby, kvasinky, rostlinné a živočišné buňky (zvláště savčí buňky). Zejména se používají E. coli, S. aureus, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensís, Schizosaccharomyces pombi, buňky SF9, buňky C129, buňky 293, Neurospora, buňky CHO, COS, HeLa a imortalizované savčí myeloidní a lymfoidní buněčné linie. Mezi preferované replikační systémy patří M13, ColEl, SV40, baculovirus, lambda, adenovirus, cytomegalovirus a další. Byl izolován velký počet regulačních oblastí inicializujících transkripci a terminaci, které jsou účinné v transkripci a translaci heterologních proteinů v různých hostitelích. Příklady těchto oblastí, metod izolací, způsobů manipulace atd. jsou známé (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey, 1977). Za podmínek • · · · · · • · ♦ • · • · * • · ···· ·Suitable host cells include bacteria, archebacteria, fungi, yeast, plant and animal cells (particularly mammalian cells). In particular, E. coli, S. aureus, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombi, SF9 cells, C129 cells, 293 cells, Neurospora, CHO, COS, HeLa cells and immortalized mammalian myeloid and lymphoid cell lines are used. Preferred replication systems include M13, ColE1, SV40, baculovirus, lambda, adenovirus, cytomegalovirus and others. A large number of regulatory regions initiating transcription and termination have been isolated that are effective in transcription and translation of heterologous proteins in various hosts. Examples of these fields, isolation methods, methods of manipulation, etc. are known (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey, 1977). Under the conditions · · · · * ♦ · · * * *

vhodných pro expresi se můžou hostitelské buňky použít jako zdroj rekombinantně získaných peptidů a polypeptidů.Suitable for expression, the host cells can be used as a source of recombinantly obtained peptides and polypeptides.

MDE předkládaného vynálezu, včetně funkčně konzervativních variant, se můžou izolovat z přirozených nebo heterologních organismů nebo buněk (včetně například baktérií, hub, hmyzích, rostlinných nebo savčích buněk), do kterých byly vneseny a následně exprimovány protein kódující sekvence. Tyto polypeptidy můžou být také produkovány v nebuněčných systémech pro syntézu proteinů, které můžou být následně obohacené mikrosomálními membránami - pro dosažení glykosylace a zpracování pre-prokolagenáz signálním peptidem (signál peptide processing of preprocollagenases). Polypeptidy můžou být kromě toho chemicky syntetizovány komerčně dostupnými automatizovanými postupy, včetně například uzavřené syntézy na pevné fázi (exclusive solid phase synthesis), metodami částečné pevné fáze, kondenzace fragmentů nebo klasickou syntézou s roztoky.The MDEs of the present invention, including functionally conserved variants, can be isolated from natural or heterologous organisms or cells (including, for example, bacteria, fungi, insects, plant or mammalian cells) into which protein coding sequences have been introduced and subsequently expressed. These polypeptides can also be produced in non-cellular protein synthesis systems, which can subsequently be enriched in microsomal membranes to achieve glycosylation and signal peptide processing of preprocollagenases. In addition, the polypeptides may be chemically synthesized by commercially available automated techniques, including, for example, exclusive solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation, or classical synthesis with solutions.

Metody pro purifikaci polypeptidu jsou odborníkům dobře známé a patří mezi ně například prepatativní disková gelová elektroforéza, isoelektrická fokusace, HPLC, HPLC s reversní fází, gelová filtrace, iontově výměnná a dělící chromatografie a protiproudné rozdělení (contercurrent distribution). Pro některé účely je výhodnější vyprodukovat polypeptid v rekombinantním systému, kde protein obsahuje další sekvenci -kotvu (tag)-, která usnadní purifikaci. Takovouto sekvencí muže být například polyhistidinová sekvence. Polypeptid se pak může purifikovat z hrubého lyzátů hostitelské buňky chromatografií na vhodné matrici na pevné fázi, nebo se jako purifikační činidlo můžou použít protilátky připravené proti těmto peptidům. Použitelné jsou i další purifikační metody.Methods for purifying the polypeptide are well known to those skilled in the art and include, for example, prepathic disk gel electrophoresis, isoelectric focusing, HPLC, reverse phase HPLC, gel filtration, ion exchange and partition chromatography, and contercurrent distribution. For some purposes, it is preferable to produce the polypeptide in a recombinant system, where the protein comprises an additional tag, which facilitates purification. Such a sequence may be, for example, a polyhistidine sequence. The polypeptide may then be purified from coarse host cell lysates by chromatography on a suitable solid-phase matrix, or antibodies prepared against these peptides may be used as the purifying agent. Other purification methods are also useful.

Konstrukce a analýza variant MMP a odvozenin, které vykazují enzymatickou aktivitu a přednostně konstitutivní enzymatickou aktivitu, se může dosáhnout rutinní aplikací konvenčních metod. Zaprvé, nukleová kyselina kódující MMP se modifikuje buď místní nebo náhodnou mutagenezí, nebo se použije v konstrukčním plánu jako jeden segment fúzního genu. Je dobré,když postup dá vzniknout modifikaci buď obsažené uvnitř sekvence kódující pro-oblast, nebo blízko štěpného místa pro oblastí; to zahrnuje úplné odstranění pro-oblasti. Nebo se mužou připravit sekvence kódující fúzní • » · · · · · · 4 4 ·4The construction and analysis of variants of MMPs and derivatives that exhibit enzymatic activity and preferably constitutive enzymatic activity can be achieved by routine application of conventional methods. First, the nucleic acid encoding the MMP is modified by either local or random mutagenesis, or is used in the design as a single segment of the fusion gene. It is good that the process results in a modification either contained within the pro-region coding sequence or near the cleavage site for the region; it involves complete removal of pro-areas. Alternatively, fusion coding sequences may be prepared

4 4 4 4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 94 9 44 4 4 93 9 4

4 4 4 4 4 4 4 44 4 4 4 4

4449 9 44 99 44 444 proteiny buď mezi enzymaticky aktivními MMP doménami a jinými polypeptidy, nebo mezi různými MMP. Modifikovaná nukleová kyselina se potom použije pro programování syntézy varianty MMP, buď v bezbuněčných systémech nebo v intaktních buňkách (včetně permeabilizovaných buněk), nebo v transgenním zvířeti. Přednostně se pro expresi variant MMP nebo odvozenin používají buď bezbuněčné systémy, nebo buněčné systémy. Rozsah štěpení pro-oblasti se hodnotí metabolickým značením a rozdělením MMP produktu pomocí SDS-PAGE. Nakonec se měří enzymatická aktivita MMP s použitím konvenčních testů, jako například kvantifikací štěpení přírodních substrátů nebo modelových peptidů, jak je uvedeno např. v Weingarten et al., Biochem. 24:6730, 1985; Woessner et. Al, J. Biol. Chem., 263:16918 a Knight et al., FEBS Letts., 296:263, 1992. V tomto případě se může rutinně připravit a testovat na MMP enzymatickou aktivitu velký počet variant MMP a jejich odvozenin, včetně např. funkčně konzervativních variant MMP-13*.4449 9 44 99 44 444 proteins either between enzymatically active MMP domains and other polypeptides, or between different MMPs. The modified nucleic acid is then used to program the synthesis of the MMP variant, either in cell-free systems or in intact cells (including permeabilized cells), or in a transgenic animal. Preferably, either cell-free systems or cell systems are used to express MMP variants or derivatives. The extent of cleavage of the pro-region is assessed by metabolic labeling and distribution of MMP product by SDS-PAGE. Finally, the enzymatic activity of MMPs is measured using conventional assays, such as quantification of cleavage of natural substrates or model peptides, as described, for example, in Weingarten et al., Biochem. 24: 6730 (1985); Woessner et. Al, J. Biol. Chem., 263: 16918 and Knight et al., FEBS Letts., 296: 263, 1992. In this case, a large number of MMP variants and their derivatives, including, for example, functionally conserved MMP variants, can be routinely prepared and tested for MMP enzymatic activity. -13*.

Popis preferovaných foremDescription of preferred forms

Následující příklady jsou zamýšlené jako některé demonstrace předkládaného vynálezu.The following examples are intended as some demonstrations of the present invention.

Příklad 1: Konstrukce genu kódujícího modifikovaný, konstitutuivně aktivní ProMMP-13Example 1: Construction of a gene encoding modified, constitutively active ProMMP-13

Následující experimenty se provedly s cílem vytvořit gen kódující prokolagenázu (procollagenase) odvozený od MMP-13, který je enzymaticky aktivní nedojde-li k rozštěpení pro-oblasti. Sekvence této varianty proMMP-13, označené jako MMP13* je uvedená v SEQ ID NO: 4 .The following experiments were performed to create a gene encoding MMP-13-derived procollagenase, which is enzymatically active in the absence of pro-region cleavage. The sequence of this variant for MMP-13, designated MMP13 *, is shown in SEQ ID NO: 4.

Místní mutagenese pro modifikování MMP-13 cDNALocal mutagenesis to modify the MMP-13 cDNA

Rozštěpením plazmidu pNot3A (Freije et al., J. Biol. Chem.Cleavage of plasmid pNot3A (Freije et al., J. Biol. Chem.

269:16766, 1994; GENBANK přístupové číslo X75308) enzymy Xbal a269: 16766 (1994); GENBANK accession number X75308) enzymes XbaI a

HindlII a purifikací vzniklého fragmentu o délce asi 1515 bp se získal fragment cDNA kódující proMMP. Tento fragment se nakloňoval • · ♦ · • · · · · « do Tet-rezistentního/Amp-citlivého pAlter plasmidu (Promega,HindIII and purification of the resulting fragment of about 1515 bp yielded a cDNA fragment encoding proMMP. This fragment was cloned into the Tet-resistant / Amp-sensitive pAlter plasmid (Promega,

Madison, WI), který byl rozštěpen enzymy Xbal a HindlII.Madison, WI), which was digested with XbaI and HindIII.

Místní mutageneze se provedla s použitím soupravy Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega, Madison, Wi). Stručně, fágemidová jednořetězcová DNA se vypurifikovala z kultur obsahujících pomocný fág R408 (Promega). Kromě ampicilinových - ne tetracyklinových (Amp repair - Tet knock-out) konverzních oligo (Promega) se k jednořetězcové DNA připojil fosforylovaný oligonukleotid se sekvencíLocal mutagenesis was performed using the Altered Sites II Kit in vitro Mutagenesis System (Promega, Madison, Wi). Briefly, phagemid single-stranded DNA was purified from cultures containing helper phage R408 (Promega). In addition to ampicillin - not tetracycline (Amp repair - Tet knock-out) conversion oligo (Promega), a phosphorylated oligonucleotide with sequence was added to single-stranded DNA

5'-AAGCCAAGATGCGGGGTTGTCGATGTGGGTGAATACAAT-3', SEQ ID NO:8; pak proběhla syntéza mutovaného řetězce. Reakční směs se potom použila pro transformaci E. coli kmene ES1001 mutS (bez reparace) a kultura se pěstovala v selektivním médiu s ampicilinem. Z izolovaných klonů se získala DNA, kterou se transformovaly buňky JM109, které se dále pěstovaly na LB miskách s ampicilinem (120 ug/ml).5'-AAGCCAAGATGCGGGGTTGTCGATGTGGGTGAATACAAT-3 ', SEQ ID NO: 8; then the mutated chain was synthesized. The reaction mixture was then used to transform E. coli strain ES1001 mutS (no repair) and the culture was grown in selective medium with ampicillin. DNA was transformed from the isolated clones to transform JM109 cells and further grown on ampicillin LB dishes (120 µg / ml).

Výše uvedeným postupem se dosáhlo substituce prolinu za valin na pozici 99. Modifikovaný MMP se označil jako MMP13* (SEQ ID NO:4).The above procedure achieved the substitution of proline for valine at position 99. The modified MMP was designated as MMP13 * (SEQ ID NO: 4).

Podobné technika místní metageneze se také použila pro záměnu valinu za glycin na pozici 98. Použil se nukleotid se sekvencí GAAAAAGCCAAGATGCGGGGGTCCTGATGTGGGTGAATAC-5', SEQ ID NO:9 obdobně, jak je uvedeno výše. Tímto postupem se nahradil valin za glycin na aminokyselinové pozici 98.A similar local metagenesis technique was also used to replace valine with glycine at position 98. A nucleotide with the sequence GAAAAAGCCAAGATGCGGGGGGTCCTGATGTGGGTGAATAC-5 ', SEQ ID NO: 9 was used similarly as above. This procedure replaced valine with glycine at amino acid position 98.

Po potvrzení výše uvedených mutací přímým sekvenováním se uvolnila cDNA kódující MMP13* z vektora pAlter-MMP13* pomocí enzymů ExoRI a HindlII.After confirming the above mutations by direct sequencing, cDNA encoding MMP13 * was released from the pAlter-MMP13 * vector using ExoRI and HindIII.

Příklad 2: Určení enzymatické aktivity MMP-13*Example 2: Determination of MMP-13 enzymatic activity

Materiál a metody cDNA kódující obě mutantní formy MMP-13 a nemutovanou MMP-13 se subklonovaly do vektora BS(SK-) (Stratagene), který obsahuje CMV promotor (Xhol - EcoRI) a SV40 splice poly(A)n (Xbal - Ncol). Duplicitní kultury Hela buněk (misky 10 cm) se transfekovaly 50 ug těchto plasmidú pomocí CaPO.j precipitační metody (Promega) . Po 5 hodinách se buňky vystavily 1 minutovému glycerolovému šoku; použil se roztok obsahující stejné množství 2x HBS + 303 glycerolu. TentoCDNA material and methods encoding both mutant forms of MMP-13 and unmutated MMP-13 were subcloned into the BS (SK-) vector (Stratagene) containing the CMV promoter (XhoI - EcoRI) and SV40 splice poly (A) n (XbaI - Ncol) ). Duplicate cultures of Hela cells (10 cm dishes) were transfected with 50 µg of these plasmids by CaPO 3 precipitation method (Promega). After 5 hours, cells were exposed to 1 minute glycerol shock; a solution containing the same amount of 2x HBS + 303 glycerol was used. This

postup je popsaný v technickém manuálu Profection Mammalianthe procedure is described in the Profection Mammalian technical manual

Transfection Systems (Promega).Transfection Systems (Promega).

Za 24 hodin po transfekci se kultivační médium (D-MEM s 10% fetálního hovězícho séra) vyměnilo za D-MEM bez séra s lOuM CGS-27023A, inhibitoru MMP (Ciba-Geigy). Předpokládá se, že pokud není přidán MMP inhibitor, je MMP produkovaný kulturou rozložen; přidáním MMP inhibitoru do kultivačního média vede tedy k detekovatelnému MMP13 proužku.24 hours after transfection, culture medium (D-MEM with 10% fetal bovine serum) was replaced with serum-free D-MEM with 10 µM CGS-27023A, an MMP inhibitor (Ciba-Geigy). It is believed that if no MMP inhibitor is added, the MMP produced by the culture is degraded; therefore, the addition of an MMP inhibitor to the culture medium results in a detectable MMP13 band.

Za 48 hodin po přidání bezsérového média s MMP inhibitorem se odebralo 10 ml supernatantu a asi 200x zkoncentrovalo (koncentrátory Centriprep-30 a Centricon-10, Amicon). Poté se ke každému vzorku přidalo stejné množství provozního pufru 2x Tris-gylycin SDS. Vzorky se potom nanesly na 4-16%, zabarvený beta kaseinový zymogram SDS polyakrylamidový gel (Novex). Po elektroforéze se gely 30 minut renaturovaly při laboratorní teplotě v renaturačním pufru (Novex) a následovala jejich inkubace přes noc při 37 °C ve vyvíjecím pufru pro zymogram (Novex).48 hours after the addition of serum-free medium with the MMP inhibitor, 10 ml of the supernatant was collected and concentrated approximately 200-fold (Centriprep-30 and Centricon-10 concentrators, Amicon). Then an equal amount of 2x Tris-glycine SDS running buffer was added to each sample. The samples were then loaded onto a 4-16% stained beta casein zymogram SDS polyacrylamide gel (Novex). After electrophoresis, the gels were renatured for 30 minutes at room temperature in renaturation buffer (Novex) and incubated overnight at 37 ° C in zymogram development buffer (Novex).

VýsledkyResults

Normálně jsou MMP syntetizovány jako prekurzory (tj. prokolagenázy nebo zymogeny), jejichž enzymatická aktivita je skrytá. Proteolytickým odstraněním proregionu po sekreci vznikne aktivní protein. Nutnost proteolytického zpracování je možné obejít použitím prokolagenázové varianty, která je aktivní i bez rozštěpení. Konstitutivně aktivní varianta MMP13 použitá jako transgen obsahuje substituci prolinu za valin v sekvenci kódující oblast PRCGVPDV (SEQ ID NO:7). Tato oblast je mezi MMP vysoce konzervovaná a důležitá pro řízení enzymové aktivity.Normally, MMPs are synthesized as precursors (i.e., procollagenases or zymogens) whose enzymatic activity is hidden. Proteolytic removal of the proregion upon secretion produces the active protein. The need for proteolytic processing can be overcome by the use of a procollagenase variant, which is active even without cleavage. The constitutively active variant of MMP13 used as a transgene comprises proline-to-valine substitution in the sequence encoding the PRCGVPDV region (SEQ ID NO: 7). This region is highly conserved among MMPs and important for controlling enzyme activity.

Aktivita pozměněného MMP13 proteinu se určila pomocí kaseinového zymogramu (údaje nejsou uvedené). HeLa buňky sekretují tři MMP druhy. Jeden se pohybuje stejně jako 92kDa MMP9 enzym, označovaný také jako želatináza B (gelatinaze B). Odštěpení prodomény MMP během aktivace enzymu vede ke ztrátě asi 10 kDa. Molekulová hmotnost druhého proužku odpovídá upravené formě želatinázy B. Jak stromelysin-1 (MMP3) tak stromelysin-2 (MMP10) mají 54 kDa a jeden nebo oba mohou odpovídat čtvrtému proužku.The activity of the altered MMP13 protein was determined using a casein zymogram (data not shown). HeLa cells secrete three MMP species. One moves like the 92kDa MMP9 enzyme, also referred to as gelatinase B (gelatinase B). Cleavage of the MMP prodomain during enzyme activation results in a loss of about 10 kDa. The molecular weight of the second band corresponds to a modified form of gelatinase B. Both stromelysin-1 (MMP3) and stromelysin-2 (MMP10) have 54 kDa and one or both may correspond to the fourth band.

• 9• 9

Pro-MMP13 by se měl pohybovat jako cca 60 kDa; je vidět v dráze 1 obsahující nerozštěpený rekombinantní MMP13. HeLa buňky se transfekovaly konstrukty exprimujícími jak rodičovské, tak mutantní formy MMP13. Detekovala se ale jenom --60 kDa proMMP13 forma u buněk exprimujících oba konstrukty, což naznačuje, že k autoproteolýze proenzymu na konečnou formu v exogenním systému zřejmě nedochází. Tyto výsledky ukazují, že substituce prolinu za valin nemá vliv na přirozenou aktivitu MMP13 nebo jeho substrátovou specifitu.Pro-MMP13 should be about 60 kDa; is seen in lane 1 containing uncleaved recombinant MMP13. HeLa cells were transfected with constructs expressing both parental and mutant forms of MMP13. However, only the -60 kDa proMMP13 form was detected in cells expressing both constructs, suggesting that autoproteolysis of the proenzyme to the final form does not appear to occur in the exogenous system. These results indicate that the substitution of proline for valine does not affect the natural activity of MMP13 or its substrate specificity.

Tato metoda umožňuje rychlé vyšetření variant MMP13, které si zachovají MMP13 aktivitu.This method allows rapid screening of variants of MMP13 that retain MMP13 activity.

Příklad 3: Konstrukce transgenních vektorůExample 3: Construction of transgenic vectors

Konstrukce MMP-13* připojených k tet07Construction of MMP-13 * attached to tet07

V dalším kroku se cDNA kódující MMP-13* operačně připojila k transkripční regulační sekvenci odvozené od tet07 promotoru následujícím postupem:In a next step, the cDNA encoding MMP-13 * was operably linked to the tet07 promoter-derived transcriptional regulatory sequence as follows:

BS(SK-) vektor (Stratagene) se rozštěpil enzymy KpnI a Notl. Syntetický duplexový oligonukleotid s následující sekvencí se rozštěpil enzymy KpnI a Notl a přiligoval do vektora:The BS (SK-) vector (Stratagene) was digested with KpnI and NotI. A synthetic duplex oligonucleotide with the following sequence was digested with KpnI and NotI and ligated into the vector:

5' -GGTACCACTAGTAAGCTTAGATCTCATATGGTCGACCCCGGGGAATTCCTGCAGGGATCC TCTAGAAGTACTCCATGGGTATACATCGATGCGGCCGC-3 ', SEQ ID NO:10.5 '-GGTACCACTAGTAAGCTTAGATCTCATATGGTCGACCCCGGGGAATATCTCTGCAGGGATCC TCTAGAAGTACTCCATGGGTATACATCGATGCGGCCGC-3', SEQ ID NO: 10.

BS(SK-) vektor modifikovaný výše uvedeným postupem se rozštěpil enzymy Xbal a Ncol. Do vektora se naligoval fragment (745 bp) obsahující SV40 sesazovací (splice) místo a polyadenylační signál, který se získal rozštěpením pcDNAI/Amp (Invitrogen, Carlsbad, CA) enzymy Xbal a Ncol.The BS (SK-) vector modified by the above procedure was digested with XbaI and NcoI. A vector (745 bp) containing the SV40 splice site and the polyadenylation signal, which was obtained by digesting pcDNAI / Amp (Invitrogen, Carlsbad, CA) with XbaI and NcoI, was ligated into the vector.

Výsledný vektor se zlínearizoval rozštěpením enzymy Xhol a EcoRI a následně se přiligoval 460 bp Xhol-EcoRI fragment obsahující promotorovou oblast tetO7 z pUHD 10-3 (Gossen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547, 1992). Tento vektor se následně rozštěpil enzymem Spěl, konce se zarovnaly Klenow polymerázou a dále se rozštěpil enzymem EcoRI. pAlter-MMP13* se roštěpil enzymem HíndlII, zarovnal Klenow polymerázou a rozštěpil enzymem EcoRI; tak se získal fragment kódující MMP-13*. Fragment MMP13* EcoRI se dále nakloňoval do vektora štěpeného EcoRI (viz výše).The resulting vector was linearized by digestion with XhoI and EcoRI, and then a 460 bp XhoI-EcoRI fragment containing the tetO7 promoter region from pUHD 10-3 was ligated (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547, 1992). This vector was subsequently digested with SpeI, the ends blunt-ended with Klenow polymerase and further digested with EcoRI. pAlter-MMP13 * was digested with HindIII, blunted with Klenow polymerase, and digested with EcoRI; to obtain a fragment encoding MMP-13 *. The MMP13 * EcoRI fragment was further cloned into an EcoRI digested vector (see above).

• · ftftftft ftft ftft ftft • ft ft ftftftft · • ft ftftftft ftft · • · ftft ftft ftftft ft ft • · ftftftft ftftft • ftftft · ftft ftft ftft ftftft• ftftftft ftft ftft ftft ftft ftftftft ftftftftft ftft ftftftft ftftft ftftftftftft ftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftftft

Transgen dlouhý 2792 bp, SEQ ID NO: 11 (obr. 2B), se uvolnil enzymy Xhol a Notl a purifikoval v CsCl gradientu před mikroinjekcí do oplodněných vajec.The 2792 bp long transgene, SEQ ID NO: 11 (FIG. 2B), was released by XhoI and NotI and purified in a CsCl gradient prior to microinjection into fertilized eggs.

Konstrukce promotor kolagenu typu II - tTa genConstruction of type II collagen promoter - tTa gene

Gen kódující fúzní protein tTa represor-aktivátor se operativně připojil k promotoru specifickému pro klouby (kolagen typu II).The gene encoding the tTa repressor-activator fusion protein was operably linked to a joint-specific promoter (type II collagen).

K modifikovanému BS(SK-) vektoru, obsahujícímu spojovací místo SV40 a polyadenylační signál, popsanému výše v příkladu 1 a rozštěpenému enzymy Ndel a Smál, se přiligoval 1897 bp dlouhý fragment obsahující promotor a zesilovač pro kolagen II. Tento fragment se získal štěpením plazmidu PBSAHl enzymem HindlII, zarovnáním pomocí Klenow polymerázy a štěpením Ndel.To the modified BS (SK-) vector containing the SV40 junction site and polyadenylation signal described above in Example 1 and digested with NdeI and SmaI, an 1897 bp fragment containing the promoter and enhancer for collagen II was added. This fragment was obtained by digesting the plasmid PBSAH1 with HindIII, alignment with Klenow polymerase, and digesting with NdeI.

Plasmid se potom rozštěpil enzymy EcoRI a BamHI a přiligoval k 1025 bp dlouhému fragmentu kódujícímu fúzní protein tetracyklin/VPl6 represor-aktivátor. Ten se enzymy EcoRI a BamHI uvolnil z plazmidu pUHG15-l (Gossen et al., viz výše). Plazmid se linearizoval rozštěpením BglII, defosforyloval telecí střevní fosfatázou a přiligoval k 1554 BamHI fragmentu zesilovače získanému z plazmidu PBSAHl.The plasmid was then digested with EcoRI and BamHI and ligated to the 1025 bp fragment encoding the tetracycline / VP16 repressor-activator fusion protein. This was released from EcoRI and BamHI from the plasmid pUHG15-1 (Gossen et al., Supra). The plasmid was linearized by digestion with BglII, dephosphorylated with calf intestinal phosphatase, and ligated to the 1554 BamHI enhancer fragment obtained from plasmid PBSAH1.

Nakonec se pomocí enzymu KpnI a Notl uvolnil z vektora 5276 bp dlouhý transgen, SEQ ID NO:12 (obr. 2A) , purifikoval na gelu a pomocí CsCl centrifugace, dialyzoval proti pufru použitému pro mikroinjekce (5 mM Tris-HCl pH 7,4 a 0,1 mM EDTA pH 8,0) a použil pro mikroinjekci.Finally, with the enzyme KpnI and NotI, a transgene, SEQ ID NO: 12 (Fig. 2A) was released from the 5276 bp vector, purified by gel, and dialyzed by means of CsCl centrifugation against the buffer used for microinjection (5 mM Tris-HCl pH 7.4). and 0.1 mM EDTA pH 8.0) and used for microinjection.

Gen promotor kolagenu typu II - β galaktosídázaGene promoter of type II collagen - β galactosidase

Reporterový gen, vhodný pro hodnocení exprese podmíněné promotorem kolagenu typu II v jednotlivých pletivech, se operačně připojil k promotoru kolagenu typu II.A reporter gene suitable for assessing expression caused by the type II collagen promoter in individual tissues was operably linked to the type II collagen promoter.

4179 bp dlouhý fragment BamHI-BglII, obsahující . β-galaktosidázový gen zfázovaný se spojovací sekvencí β-globinu a polyadenylačním signálem, se vyštěpil z plazmidu pUGH16-3 (Gossen et al., viz výše) a nakloňoval do BamHI místa nemodifikovaného BS(SK-) (Stratagene). Tento plasmid se rozštěpil EcoRI a HindlII a • ftftft ftft ftft ·« · • ♦ · ftft·· ftft·· • ft ftft ftft ftftft ft · ftftftft···· · ft · ftftftft ft·· • ftftft · ftft ftft ftft ftftft přiligoval k 655 bp dlouhému HindlII-EcoRI fragmentu s promotorovou sekvencí kolagenu typu II, která se vyštěpila z plazmidu popsaného výše. Plasmid se potom rozštěpil EcoRI a přiligoval k 2807 bp dlouhému EcoRI fragmentu, který se vyštěpil z plasmidu s promotorem kolagenu typu II popsanému výše. Pro ověření orientace každého inzertu se použilo mapování restrikčními enzymy. 7664 bp dlouhá sekvence transgenu (SEQ ID NO:13, obr. 3A) se uvolnila pomocí enzymů HindlII a Notl, purifikovala na gelu a pomocí CsCl centrifugace, dialyzovala proti pufru použitému pro mikroinjekce (5 mM Tris-HCl pH 7,4 a 0,1 mM EDTA pH 8,0) a použila pro mikroinjekcí myších embryí.A 4179 bp BamHI-BglII fragment containing. The β-galactosidase gene fused to the β-globin linker sequence and polyadenylation signal was excised from the plasmid pUGH16-3 (Gossen et al., supra) and cloned into the BamHI site of unmodified BS (SK-) (Stratagene). This plasmid was digested with EcoRI and HindIII and ftftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftftftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftft ftftft was ligated to a 655 bp HindIII-EcoRI fragment with the type II collagen promoter sequence cleaved from the plasmid described above. The plasmid was then digested with EcoRI and ligated to the 2807 bp EcoRI fragment which was excised from the collagen type II promoter described above. Restriction enzyme mapping was used to verify the orientation of each insert. The 7664 bp long transgene sequence (SEQ ID NO: 13, Fig. 3A) was released with HindIII and NotI enzymes, gel purified and CsCl centrifuged, dialyzed against the buffer used for microinjection (5 mM Tris-HCl pH 7.4 and 0). , 1 mM EDTA pH 8.0) and used for microinjection of mouse embryos.

VýsledkyResults

Obr. 2A a 2B ukazují schématické znázornění syntetických genů vytvořených s cílem dosáhnout regulované exprese MMP13 v chondryocytěch. Indukovatelné exprese transgenu se dosáhlo použitím tetracyklinem regulovatelného expresního systému (Gossen et al., viz výše; Furth et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91:93029306, 1994). U prvního konstruktu (obr. 2A) je exprese tetracyklinem řízeného VP16 transaktivátorového fúzního proteinu pod řízením promotoru kolagenu typu II. Tento konstrukt směruje expresi fúzního proteinu VP16 do chondryocytú. U druhého konstruktu (obr. 2B) je exprese cDNA kódující modifikovanou verzi MMP13 proteinu (MMP13*) pod řízením fúzního proteinu VP16. Při přítomnosti doxycyklinu, tetracyklinového analoga dodávaného v pitné vodě, se VP16 fúzní protein neváže k Tet07 promotoru syntetického genu MMP13* a gen je neaktivní. Při odstranění doxycyklinu transaktivátor stimuluje transkripci lidské MMP13* cDNA a produkci modifikovaného proteinu.Giant. 2A and 2B show a schematic representation of synthetic genes designed to achieve regulated expression of MMP13 in chondryocytes. Inducible expression of the transgene was achieved using a tetracycline-regulatable expression system (Gossen et al., Supra; Furth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 93029306, 1994). In the first construct (FIG. 2A), the expression of the tetracycline driven VP16 transactivator fusion protein is under the control of the type II collagen promoter. This construct directs expression of the VP16 fusion protein into chondryocytes. In the second construct (FIG. 2B), cDNA expression encoding a modified version of the MMP13 protein (MMP13 *) is under the control of the VP16 fusion protein. In the presence of doxycycline, a tetracycline analog supplied in drinking water, the VP16 fusion protein does not bind to the Tet07 promoter of the synthetic MMP13 * gene and the gene is inactive. Upon removal of doxycycline, the transactivator stimulates transcription of human MMP13 * cDNA and production of the modified protein.

Oba transgenní konstrukty, uvedené na obr. 2A a 2B, se kromě ověření aktivity MMP13* před mikroinjekcí testovaly v primárních hovězích chondryocytech a v zárodečných myších fibroplastech. Výsledky ukázaly schopnost promotoru kolagenu typu II indukovat expresi druhého konstruktu s buď Tet07-luciferázou nebo TetO7-MMP13* (data nejsou uvedena).Both transgenic constructs, shown in Figures 2A and 2B, were tested in primary bovine chondryocytes and germline mouse fibroplasts in addition to validating MMP13 * activity prior to microinjection. The results showed the ability of the type II collagen promoter to induce expression of a second construct with either Tet07-luciferase or TetO7-MMP13 * (data not shown).

Obrázek 3A je schematickou ilustrací transgenu použitého pro posouzení tkáňově specifické regulace vyvolané promotorem kolagenu ·· 4444 •4 4« 44Figure 3A is a schematic illustration of the transgene used to assess the tissue-specific regulation induced by the collagen promoter.

4 4444 44,444 4

4 4444 4 4 44,444 4 4 4

4 4 4 44 444 4 44 4 44 444 4 4

4 4444 44 44,444 44 4

4444 4 44 44 44 ··· typu II. Konstrukt nukleové kyseliny obsahuje: (i) sekvence odvozená z promotoru kolagenu typu II; (ii) sekvence kódující bakteriální β -galaktosidázu (Lac Z); a (iii) sekvence obsahující spojovací β-globinový spojovací a polyadenylační signál.4444 4 44 44 44 Type II. The nucleic acid construct comprises: (i) a sequence derived from a type II collagen promoter; (ii) a sequence encoding bacterial β-galactosidase (Lac Z); and (iii) a sequence comprising a β-globin splice and polyadenylation splice signal.

Příklad 4: Tvorba a charakterizace transgeních myší exprimujících tetracyklinem regulovaný LacZ nebo MMP-13* v kloubních pletivech.Example 4: Production and characterization of transgenic mice expressing tetracycline-regulated LacZ or MMP-13 * in joint tissues.

Pro získání transgenních myší exprimujících MMP-13* gen nebo LacZ (β -galaktosídázový) reporterový gen se provedly následující experimenty.The following experiments were performed to obtain transgenic mice expressing the MMP-13 * gene or the LacZ (β-galactosidase) reporter gene.

Materiál a metody:Material and methods:

Příprava a testování transgenních myší. Pro tvorbu myší exprimujících MMP-13* pod řízením tetracyklinu se do oplodněných myších embryí společně mikroinjekčně aplikovaly v ekvimolárních množstvích DNA fragment Xhol-Notl tetO7-MMP13* dlouhý asi 2784 bp (obr. 2B) a DNA fragment KpnI-Notl CPE-tTA dlouhý si 5265 bp (obr. 2A). Pro tvorbu myší exprimujících reporterový gen se do (FVB/N) oplodněných vajec injikoval HindlII-Notl LacZ fragment dlouhý 7641 bp (obr. 3A) , podle popisu (Hogan et al., Manipulation the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratories, 1966). (Velikost restrikčních fragmentu je menší než transgeny popsané v příkladu 3, protože endonukleázová štěpná místa jsou uvnitř transgenů).Preparation and testing of transgenic mice. To generate MMP-13 * expressing mice under the control of tetracycline, an approximately 2784 bp XhoI-NotI tetO7-MMP13 * DNA fragment and a KpnI-NotI CPE-tTA DNA fragment were microinjected together in equimolar amounts in fertilized mouse embryos. 5265 bp (FIG. 2A). To generate mice expressing the reporter gene, a 7641 bp HindIII-NotI LacZ fragment was injected into (FVB / N) fertilized eggs (Fig. 3A), as described (Hogan et al., Manipulation the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratories, 1966). . (The size of the restriction fragments is smaller than the transgenes described in Example 3 because the endonuclease cleavage sites are within the transgenes).

Zakládající zvířata (founders animals) se nejdříve identifikovala pomocí PCR následujícím postupem. Transgen kódující tTA se identifikoval použitím primerů odpovídajícímu tTA sekvenci (5'-CGAGGGCCTGCTCGATCTCC-3' , SEQ ID NO: 14) a primerů odpovídajícímu nepřepisovanému 3' konci (5' -GGCATTCCACCACTGCTCCC-3', SEQ IDNO:15). Výsledný PCR produkt měl velikost 584 bp. Transgen kódujíc MMP13* se identifikoval použitím primerů odpovídajícím sekvencím kódujícím MMP13* (5'-GAGCACCCTTCTCATGACCTC-3', SEQ ID NO: 16) a nepřepisovanému 3' konci. Výsledný PCR produkt měl velikost 731 bp.Founders animals were first identified by PCR as follows. The transgene encoding tTA was identified using primers corresponding to the tTA sequence (5'-CGAGGGCCTGCTCGATCTCC-3 ', SEQ ID NO: 14) and primers corresponding to the non-transcribed 3' end (5 '-GGCATTCCACCACTGCTCCC-3', SEQ IDNO: 15). The resulting PCR product was 584 bp in size. The transgene encoding MMP13 * was identified using primers corresponding to the sequences encoding MMP13 * (5'-GAGCACCCTTCTCATGACCTC-3 ', SEQ ID NO: 16) and the non-transcribed 3' end. The resulting PCR product was 731 bp in size.

Transgen kódující lacZ se identifikoval použitím primerů odpovídajícím signálu lokalizovanému v. jádře β-galaktosidázového • · ··· · genu (5'-GTTGGTGTAGATGGGCGCATCG-3', SEQ ID NO: 17) a (5'-GCGGGGTCTCAGGTTACAGCC-3', SEQ ID NO: 18). Výsledný PCR produkt měl velikost 673 bp.The transgen encoding lacZ was identified using primers corresponding to the signal located in the core of the β-galactosidase gene (5'-GTTGGTGTAGATGGGCGCATCG-3 ', SEQ ID NO: 17) and (5'-GCGGGGTCTCAGGTTACAGCC-3', NO: 18). The resulting PCR product was 673 bp in size.

Pro ověření výsledků PCR se provedla Southern blot analýza dolního konce DNA rozštěpené BamHI/NcoI nebo PvuII/NcoI a hybridízované k 3' netranslaťovanému konci za vysoce stringentních podmínek. Počet kopií transgenní DNA, která se integrovala do genomu, se určil porovnáním relativní intenzity hybridizačního signálu z transgenních myší se signálem získaným s použitím kontrolní DNA obsahující 10 a 100 genomových ekvivalentů obdobné DNA, která byla injikovaná.To verify the PCR results, Southern blot analysis of the lower end of the DNA digested with BamHI / NcoI or PvuII / NcoI and hybridized to the 3 'untranslated end under high stringency conditions was performed. The number of copies of the transgenic DNA that had been integrated into the genome was determined by comparing the relative intensity of the hybridization signal from the transgenic mice to the signal obtained using control DNA containing 10 and 100 genomic equivalents of similar DNA that was injected.

Počet kopií se určil s využitím Taqman kvantitativní PCR podle návodu výrobce (Perkin Elmer). Transgenní linie se získaly pářením zakladatelských zvířat s FVB/N nemutovaným typem myší a následující generace se identifikovaly pomocí PCR.The copy number was determined using Taqman quantitative PCR according to the manufacturer's instructions (Perkin Elmer). Transgenic lines were obtained by mating founder animals with non-mutated FVB / N mice, and subsequent generations were identified by PCR.

Všem myším byl podáván doxycyklin (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) připravený jako zásobní roztok s koncentrací 100 mg/ml v 501 etanolu a zředěný na konečnou koncentraci 1 mg/ml v kyselé pitné vodě, která se denně měnila (Schultze et al., Nátuře Biotech. 14:499, 1996).All mice were given doxycycline (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) prepared as a stock solution at 100 mg / ml in 501 ethanol and diluted to a final concentration of 1 mg / ml in acidic drinking water that changed daily (Schultze et al. al., Nature Biotech. 14: 499, 1996).

Barvení celého embrya na β-galaktosidázovou (lacZ) aktivitu. Samice nemutovaného typu se pářily s transgenními samci s CPE-lacZ konstruktem. Šestnáctý embryonální den (E16) se samice usmrtily a embrya se obarvila pro zjištění β-galaktosidázové aktivity podle popisu Hogan et al., 1996 (viz výše). Před fixací se odebraly z E16 embryí ocasy, které se analyzovaly na přenos transgenu pomocí PCR.Staining of whole embryo for β-galactosidase (lacZ) activity. Non-mutated females mated with transgenic males with the CPE-lacZ construct. On the 16th embryonic day (E16), the females were sacrificed and the embryos were stained for β-galactosidase activity as described by Hogan et al., 1996 (supra). Prior to fixation, tails were removed from E16 embryos and analyzed for transgene transfer by PCR.

Expresní analýza pomocí RT-PCR. Transgenní exprese se zjišťovala RT-PCR. Po homogenizaci pletiv v Trizolu (Life Technologies) se vyizolovala celková RNA. Syntéza prvního řetězce se provedla pomocí Superscript preamplification kit od Gibco/BRL. Stručně, 5 ug celkové RNA se upravilo působením Dnase I po dobu 15 minut pří laboratorní teplotě; následovala inaktivace přidáním 2 ul 25mM EDTA a zahřátím na 65 °C/15 minut. K RNA se potom přidalo 0,5 ug olígo dT a vlastní reverzní transkripce proběhla podle návodu výrobce. PCR analýza cDNA se provedla s použitím následujících ·« ·»·· souprav primerů (5'-3' sekvence): tet activator:Expression analysis by RT-PCR. Transgenic expression was determined by RT-PCR. Total RNA was isolated after tissue homogenization in Trizol (Life Technologies). First chain synthesis was performed using the Superscript preamplification kit from Gibco / BRL. Briefly, 5 µg of total RNA was treated with Dnase I for 15 minutes at room temperature; followed by inactivation by adding 2 µl of 25 mM EDTA and heating to 65 ° C / 15 minutes. 0.5 µg of oligo dT was then added to the RNA and reverse transcription was performed according to the manufacturer's instructions. PCR analysis of cDNA was performed using the following primer sets (5'-3 'sequence): tet activator:

CGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAG (SEQ ID NO:19) a CGGCCATATCCAGAGCGCCG (SEQ ID NO:20); MMP13*: GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG (SEQ ID NO:21) a CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC (SEQ ID NO:22). Výsledné PCR produkty jsou 859 a 648 bp velké. Pro ověření integrity mRNA a účinnosti rereverzní transkripce každá PCR reakce obsahovala také c-fos primerový set: 5'-AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCC-3' (SEQ ID NO:23) a 5'-AGGCCACAGACATCTCCTCTGG-3' (SEQ ID NO:24). PCR analýza se provedla s cDNA s využitím Taq-gold polymerázy (Perkin Elmer) - 10 minut 95 °C a pak 35 cyklů - 60 vteřin 96 °C, 90 vteřin 67 °C, 60 vteřin 72 °C. Konečná syntéza se provedla při 72 °C po dobu 12 minut. Reakční produkty se analyzovaly na 2% agarózovém gelu a vizualizovaly barvením ethidium bromidem.CGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAG (SEQ ID NO: 19) and CGGCCATATCCAGAGCGCCG (SEQ ID NO: 20); MMP13 *: GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG (SEQ ID NO: 21) and CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC (SEQ ID NO: 22). The resulting PCR products are 859 and 648 bp large. To verify the mRNA integrity and reverse transcription efficiency, each PCR reaction also contained a c-fos primer set: 5'-AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCC-3 '(SEQ ID NO: 23) and 5'-AGGCCACAGACATCTCCTCTGG-3' (SEQ ID NO: 24). PCR analysis was performed with cDNA using Taq-gold polymerase (Perkin Elmer) - 10 minutes 95 ° C and then 35 cycles - 60 seconds 96 ° C, 90 seconds 67 ° C, 60 seconds 72 ° C. The final synthesis was performed at 72 ° C for 12 minutes. Reaction products were analyzed on a 2% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining.

RT-PCR zárodečných fibroblastů. Tet07-lacZ samice se pářily s transgenními samci s oběma (CPE-tTA a TetO7-MMP13*) transgeny. Samice se utratily v den E15 a z embryí se připravily fibroblasty (Graham et al., Virology, 52:456, 1973; Lopata et al., Nucl. Acids Res., 12:5707, 1984). Fibroblasty se pěstovaly v DMME médiu (Gibco/BRL) s 103 FBS (fetální hovězí sérum). Fibroblasty se dále transfekovaly požadovaným expresním plasmidem kalcium fosfátovou precipitační metodou. Za 48 po transfekci se pomocí Trizolové metody (Gibco/BRL) získala celková RNA. Syntéza prvního pramene cDNA se provedla s využitím Superscript preamplífication systém (Gibco/BRL). Exprese MMP13* se identifikovala PCR s využitím primerů specifických pro lidskou MMP13 (GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG) (SEQ ID NO:21) a (CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC) (SEQ ID NO:22). Výsledný PCR produkt měl veli1kost 648 bp.RT-PCR of germline fibroblasts. Tet07-lacZ females mated with transgenic males with both (CPE-tTA and TetO7-MMP13 *) transgenes. Females were sacrificed on day E15 and fibroblasts were prepared from embryos (Graham et al., Virology, 52: 456, 1973; Lopata et al., Nucl. Acids Res., 12: 5707, 1984). Fibroblasts were grown in DMME medium (Gibco / BRL) with 10 3 FBS (fetal bovine serum). Fibroblasts were further transfected with the desired calcium expression plasmid by the phosphate precipitation method. At 48 post transfection, total RNA was obtained by the Trizol method (Gibco / BRL). First strand cDNA synthesis was performed using the Superscript preamplification system (Gibco / BRL). MMP13 * expression was identified by PCR using primers specific for human MMP13 (GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG) (SEQ ID NO: 21) and (CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC) (SEQ ID NO: 22). The resulting PCR product was 648 bp in size.

Imunohistochemie. Exprese MMP13* v dvojitě transgenních liniích se dále analyzovala imunohistochemicky s použitím protilátek specifických pro z MMP-13 odvozených štěpných fragmentů kolagenu typu II. Pro tento účel se klouby fixovaly 60 minut v 45 paraformaldehydu v PBS při neutrálním pH a laboratorní teplotě. Poté se dvakrát opláchly v PBS a inkubovaly přes noc v 0,lM Trís-HCl, pH 7,4 a částečně dekalcifikovaly v 0,2M EDTA při neutrálním pH. Vzorky se přenesly do TOC. média a Hacker/Bright kryostatem se nařezaly 6 mmImmunohistochemistry. Expression of MMP13 * in double transgenic lines was further analyzed by immunohistochemistry using antibodies specific for MMP-13 derived collagen type II cleavage fragments. For this purpose, the joints were fixed for 60 minutes in 45 paraformaldehyde in PBS at neutral pH and room temperature. They were then washed twice in PBS and incubated overnight in 0.1M Tris-HCl, pH 7.4 and partially decalcified in 0.2M EDTA at neutral pH. Samples were transferred to TOC. media and Hacker / Bright cryostat were cut 6 mm

9 tt · t · · • · • * • · « · ··«» · ·· ·· • · · • » ·» • · · · • · * ·· ··9 tt · t · • * • «t t t t t t t t t t t t t

9· ·* · zmrazené řezy. Řezy se obarvily protilátkami specifickými proti epitopu přítomnému v degradovanému produktu kolagenu typu II, konkrétně v TC^A degradačnim produktu, který je také určenou 3/4 částí (which is also designated the 3/4 piece). Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99:1534, 1997.Frozen slices. Sections were stained with antibodies specific to the epitope present in the degraded product of type II collagen, namely the TC ^A degradation product, which is also the designated 3/4 piece. Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99: 1534,1997.

VýsledkyResults

Tetracyklin a jeho analoga jsou známými inhibitory MMP aktivity. Porovnávali jsme hladiny DOX v séru při přídavku 1 mg/ml do pitné vody a in vitro IC₅₀. V MCA fluorescenčním testu se IC5o=59,l uM, zatímco hladiny v séru ukazovaly 2,64 uM, při využití zónového inhibičního testu. Tyto údaje ukazují, že množství DOX v séru je 22,4x nižší než množství, při kterém může být 50- MMP aktivity inhibováno. Je tedy nepravděpodobné, že dochází k významné inhibici DOXem.Tetracycline and its analogs are known inhibitors of MMP activity. We compared serum DOX levels by adding 1 mg / ml to drinking water and in vitro IC ₅₀ . In the MCA fluorescence assay, IC 50 = 59.1 µM, while serum levels showed 2.64 µM using the zone inhibition assay. These data indicate that the amount of DOX in serum is 22.4 times lower than the amount at which 50-MMP activity can be inhibited. Therefore, significant inhibition of DOX is unlikely.

Obrázek 3B je fotografií obarvení celého vzorku (whole mount staining) na β-galaktosidázovou aktivitu 16 embryonální den u transgenních myší exprimujících transgen zobrazený na obr. 3A. Modré zabarvení (šipky) je zřejmé u kloubů v celém těle transgenních zvířat, zatímco u netransgenních potomku ve vrhu není. pozorovatelné jakékoliv zbarvení. Konkrétně klouby zahrnující kotníky, kolena, kyčle, články prstu, zápěstí, lokty, ramenní klouby a obratel vykazovaly expresi transgenu. Kromě chrupavky kloubu, se také zabarvila modře chrupavka, která nebyla doposud osifikována na kost v daném vývojovém stádiu, tj . některé obličejové, lebeční a žeberní kosti. Obrázek 3C ukazuje zvětšení lokte a tlapky. Tato data potvrzují expresní schopnosti promotoru kolagenu typu II a jsou užitečná pro určení těch pletiv (kloubů), které budou exprímovat MMP13* transgen.Figure 3B is a photograph of whole mount staining for β-galactosidase activity 16 embryonic day in the transgenic mice expressing the transgene shown in Figure 3A. The blue color (arrows) is evident in the joints throughout the body of the transgenic animals, while it is not in the non-transgenic offspring. observable any coloring. Specifically, the joints including the ankles, knees, hips, finger, wrist, elbows, shoulder joints and vertebrae showed transgene expression. In addition to the articular cartilage, the cartilage that has not yet been ossified to the bone at a given stage of development, ie. some facial, skull and rib bones. Figure 3C shows an enlargement of the elbow and paw. These data confirm the expression capabilities of the type II collagen promoter and are useful for determining those tissues (joints) that will express the MMP13 * transgene.

Konstrukty uvedené na obrázcích 2A a 2B se oba společně injikovaly do oplodněných myších embryí. Ze 112 nově narozených myší jich 7 neslo oba transgeny, ale jenom čtyři odvozené linie byly schopné rozmnožování. Transgeny se identifikovaly pomocí PCR a ověřily Southern blot analýzou s využitím sondy specifické pro transgen (data nejsou uvedena). Počet kopií každého ze čtyř transgenu se dále stanovil pomocí Taqman kvantitativní PCR. (data ·« ··** • fc fc fc fc fc • fcfcfc fcfc • · • · fc * · • · • fc fcfc fcfc fcfc « · • fc • · · • · • fc nejsou uvedena). V krátkosti, počet kopií transgenů se pohyboval od 1 do 32 pro tet aktivátor a od 1 do 20 pro MMP13*. Konkrétně linie 6 obsahovala asi 8 kopií tet aktivátoru a asi 3 kopie transgenů MMP13*.The constructs shown in Figures 2A and 2B were both co-injected into fertilized mouse embryos. Of the 112 newly born mice, 7 carried both transgenes, but only four derived lines were capable of reproduction. Transgenes were identified by PCR and verified by Southern blot analysis using a transgene-specific probe (data not shown). The copy number of each of the four transgenes was further determined by Taqman quantitative PCR. (data fc fc fc fc fc fc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc not listed). Briefly, the copy number of transgenes ranged from 1 to 32 for tet activator and from 1 to 20 for MMP13 *. Specifically, lane 6 contained about 8 copies of tet activator and about 3 copies of MMP13 transgenes.

Exprese transgenů TA a MMP13* se nejdříve hodnotila v kolením kloubu zadních končetin u myší starých 4 měsíce (linie 6). Pro kontrolu účinnosti každé reakce se prováděla amplifikace c-fos endogenní cDNA. Obrázek 4 ukazuje amplifikací fragmentu dlouhého 890 bp získaného pomocí TA-specifických primerů. RT-PCR ukázala, že TA transgen je exprimován v transgenních myších jak s DOX, tak bez DOX, ale. nebyl exprimován v netransgenních kontrolách (dráhy 4-5) . Konstitutivní exprese TA se dá očekávat, protože je řízená konstitutivně aktivním promotorem. Navíc je exprese TA omezená na klouby a nebyla pomocí RT-PCR prokázaná v jiných pletivech, včetně mozku, srdce, jater, ledvin, sleziny nebo kosterního svalstva (údaje nejsou uvedené).The expression of TA and MMP13 * transgenes was first evaluated in the knees of the hind limb joint in 4 month old mice (line 6). To check the efficiency of each reaction, c-fos endogenous cDNA was amplified. Figure 4 shows the amplification of a 890 bp long fragment obtained using TA-specific primers. RT-PCR showed that the TA transgene is expressed in transgenic mice both with and without DOX but. was not expressed in non-transgenic controls (lanes 4-5). Constitutive expression of TA is expected to be driven by a constitutively active promoter. In addition, the expression of TA is limited to the joints and has not been demonstrated by RT-PCR in other tissues, including brain, heart, liver, kidney, spleen or skeletal muscle (data not shown).

Obrázek 4B ukazuje amplifikací 645 bp dlouhého fragmentu získaného s primery specifickými pro MMP13*. Povšimněte si, že primery pro MMP13* jsou specifické pro lidský MMP13 a nereagují se svým endogenním myším homologem, kolagenázou-1. RT-PCR ukázala, že k expresi MMP13* nedocházelo v netransgenních kontrolách (dráhy 4-5). Dráhy 6-7 ukazují, že dochází k expresi transgenů MMP13* u myší, kterým byl podáván DOX. Odstraněním DOXu z pitné vody došlo ke značnému zvýšení exprese (dráhy 8-9), podle našich odhadu asi 5-10x. Po elektroforéze byly pak PCR fragmenty přenesené na nylonovou membránu a hybridizovány s TA nebo MMP13* specifickými sondami pro ověření identity PCR produktů (data nejsou uvedená).Figure 4B shows the amplification of the 645 bp long fragment obtained with primers specific for MMP13 *. Note that the primers for MMP13 * are specific for human MMP13 and do not react with their endogenous mouse homologue, collagenase-1. RT-PCR showed that MMP13 * expression did not occur in non-transgenic controls (lanes 4-5). Lanes 6-7 show that MMP13 * transgenes are expressed in DOX-treated mice. Removal of DOX from drinking water resulted in a significant increase in expression (lanes 8-9), according to our estimates, about 5-10x. After electrophoresis, the PCR fragments were then transferred to a nylon membrane and hybridized with TA or MMP13 * specific probes to verify the identity of the PCR products (data not shown).

Fibroblasty z několika transgenních linií. (např. linie 8 a 42) byly schopné exprimovat MMP13*, což se dokázalo přítomností PCR produktu o předpokládané délce. Nebyl detekován žádný MMP13* RT-PCR pruh u buněk transformovaných samotným nosičem. Tyto výsledky ukazují, že u těchto myší je transgen MMP13* integrován do transkripčně aktivní oblasti chromatinu.Fibroblasts from several transgenic lines. (eg, lines 8 and 42) were able to express MMP13 * as evidenced by the presence of a PCR product of predicted length. No MMP13 * RT-PCR band was detected in cells transformed with the carrier alone. These results indicate that in these mice the MMP13 * transgene is integrated into the transcriptionally active region of chromatin.

Již za tři dny po zastavení podávání doxycyklinu bylo možné detekovat imunologicky štěpné produkty MMP-13. Po 30 dnech bez doxycyklinu bylo možné pozorovat podstatný nárůst obarvení u »· ···· • : / • * • · ··»· · «« ·· • · * · *·• · * !As early as three days after stopping doxycycline, immunologically cleavable MMP-13 products could be detected. After 30 days without doxycycline, a significant increase in staining was observed with: / * * * · · · ««!!!!

» · · „ ·» *<»· ·" · »* <

·· « · «·· «·

• * • * ·· ··• * •··

Φ ·*· růstových plotének a u kloubových chrupavek (obr 5), ale výsledky se u různých myších linií lišily (viz tabulka 1 níže).Growth plates and articular cartilage (Figure 5), but the results differed between mouse lines (see Table 1 below).

Tabulka 1Table 1

Imunohist Imunohist ^chemie ^ chemistry Fi zvířata Fi animals dní bez DOX days without DOX HMMP13 HMMP13 Ab Ab protilátky pro štěpné fragmenty kolagenu typu II antibodies for cleavage fragments type II collagen ztráta zabarvení Sď í rariinem 0 loss of color Network 0 linie 8 line 8 wt wt - - - - neznatelná invisible linie 8 line 8 0 d 10 d - - - - neznatelná invisible 3 d 2 d + + + + neznatelná invisible 7 d 7 d + + + + e + e + rn í r n á rn í r n á 14 d 14 d + +· + + + · + + + + + + + nevelká small wt wt - - - - neznatelná invisible lilii e 6 lilii e 6 30 d 30 d nezniká nezniká linie 8 line 8 30 d 30 d + L i + L i + 'ř + + 'ř + n-/»Lká n - / »Lk líní e -12 lazy e -12 30 d 30 d •i •and - - neznatelná invisible

Příklad 5: Fenotyp MMP13* transgenní myši.Example 5: Phenotype of MMP13 * transgenic mice.

Materiály a metodyMaterials and methods

Pro studium účinku aktivity MMP13* na chrupavky u dospělých transgenních zvířat se myším přestal podávat doxycyklin postupně vzrůstající dobu, po které se usmrtily. Parafínové, formaldehydem fixovanách řezy dekalcifikovaných chrupavek se nařezaly a obarvily (i) hematoxylinem a eosinem (H&E) a (ii) Safraninem O a následně fast green (American Histo Labs, Gaíthersburg MD). Barvící techniky pro kloubní chrupavky jsou popsané (Peter et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990).To study the effect of MMP13 * activity on cartilage in adult transgenic animals, mice were stopped receiving doxycycline over an increasing period of time after which they were sacrificed. Paraffin-formaldehyde-fixed sections of decalcified cartilage were cut and stained with (i) hematoxylin and eosin (H&E) and (ii) Safranin O followed by fast green (American Histo Labs, Gaithhersburg MD). Staining techniques for articular cartilage are described (Peter et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990).

VýsledkyResults

Kontrolní transgenní zvířata bez exprese MMP13* si udržela významné množství obarvení Safraninem O v kloubní chrupavce a růstové ploténce jejich čéšky (obr. 6A) . Naproti tomu transgenní zvířata linie 8 vykazují podstatnou ztrátu barvení Safraninem O ve svých kloubech po té, co se přestal podávat doxycyklin. Po sedmi • · · · « * • « ·· ·· • · · · · dnech bylo možné pozorovat mírnou redukci obarvení Safraninem 0 v chrupavce čéšky (obr. 6B), které se zvětšovalo a 14 den se pozorovala poněkud větší ztráta obarvení u kloubní chrupavky a růstové ploténky (obr. 6C). Značná ztráta zabarvení Safraninem O se také pozorovala u ostatních kloubů, včetně chrupavky zánártí a stehenní kostí, dále u zápěstí, a kotníku na prstu, což ukazuje na sníženou proteoglykanovou koncentraci v těchto oblastech v porovnání s kontrolou.Control transgenic animals without MMP13 * expression retained a significant amount of Safranin O staining in the articular cartilage and patella growth plate (Fig. 6A). In contrast, transgenic line 8 animals exhibited a significant loss of Safranin O staining in their joints after the doxycycline was stopped. After seven days, a slight reduction in Safranin 0 staining in the patella cartilage (Fig. 6B) was observed, which increased and a somewhat greater staining loss was observed in 14 days. articular cartilage and growth discs (Fig. 6C). Significant loss of staining with Safranin O was also observed in other joints, including cartilage of inflammation and femur, wrist, and ankle, indicating a decreased proteoglycan concentration in these areas compared to control.

Pro zaznamenání všech změn kloubních chrupavek vyvolaných expresí transgenu se myši linie 6 udržovaly s nebo bez DOX po dobu 114 dní; z jejích kloubů se připravily řezy a obarvily H&E. Při porovnání s věkově shodnými kontrolami, se u transgenních zvířat bez DOX vyvinul patologický nález připomínající osteoartritidu. Na obr. ΊΑ je vidět, že u kontrolního zvířete nevznikly léze nebo jiná osteoartritická patologie, zatímco transgenní zvířata vykazují tvorbu lézí na svých kloubních chrupavkách (obr. 7B). H&E sekce konkrétně vykazují značnou ztrátu chrupavek, ohniskové narušení, narušení které se rozšiřuje do kostí a zanícené synovíum. Uvnitř synovia je důkaz fibroidní nekrózy, metaplasie a synoviální buněčné hyperplasie. Kromě těchto symptomů osteoartritidy jsou pozorovány některé změny charakteristické spíše pro revmatickou artritidu. Tyto změny zahrnují angiogenezi - pozorovatelnou infiltraci buněk krevních krvinek, monocytú a makrofágu. Obrázky 7C a 7D ukazují synovíum ve vyšším rozlišení.To record all changes in articular cartilage induced by transgene expression, Line 6 mice were maintained with or without DOX for 114 days; slices were prepared from her joints and stained with H&E. In comparison to age-matched controls, transgenic animals without DOX developed a pathological finding resembling osteoarthritis. Figure ΊΑ shows that no control lesions or other osteoarthritic pathology occurred in the control animal, while transgenic animals showed lesion formation on their articular cartilage (Figure 7B). Specifically, the H&E sections show significant cartilage loss, focal disturbance, disturbance that extends to the bones, and inflamed synovium. Inside the synovium is evidence of fibroid necrosis, metaplasia, and synovial cell hyperplasia. In addition to these symptoms of osteoarthritis, some changes characteristic of rheumatoid arthritis are observed. These changes include angiogenesis - observable blood cell, monocyte and macrophage cell infiltration. Figures 7C and 7D show synovium at a higher resolution.

DiskuzeDiscussion

Podařilo se úspěšně vytvořit transgenní myši exprimující konstitutivně aktivní lidský MMP13 protein v kloubních chrupavkách dospělých zvířat. Ukázali jsme, že ojedinělá kombinace technologií, tj. tetracyklinem regulovatelný genový expresní systém a pro chondryocyty specifická exprese konstitutivně aktivního MMP proteinu, nám umožnila vyvinout transgenní model, u kterého dochází k tvorbě lézí a dalším osteoartritickým patologickým změnám.We succeeded in creating transgenic mice expressing constitutively active human MMP13 protein in articular cartilage of adult animals. We showed that a unique combination of technologies, ie the tetracycline-regulated gene expression system and chondryocyte-specific expression of a constitutively active MMP protein, allowed us to develop a transgenic model that produces lesions and other osteoarthritic pathological changes.

Použitím regulovatelného/indukovatelného systému jsme se vyhnuli škodlivým účinkům na embrya, i když jsme dosáhli významné exprese hMMP13* v dospělých myších. Lac Z barvení předvedené na obr. 3 * ·Using a controllable / inducible system, we avoided deleterious effects on embryos, although we achieved significant expression of hMMP13 * in adult mice. Lac Z staining shown in Fig. 3 * ·

• · ’ i · ·· .· .· . ϊ · · ♦ · • ζ · · * • i ·» ·· • · · · * ukazuje, že k expresi kolagenu II dochází během vývoje zhruba ve fázi E16 a kolagen typu II se účastní tvorby kostry. Kolagen typu II spolu s kolagenem typu I jsou známé jako substráty pro proteolytické štěpení pomocí MMP13. Předpokládali jsme proto, že neregulovaná exprese MMP13 během embryogeneze by byla letální.• · i i · ··. ·. ·. It shows that collagen II expression occurs during development around E16, and type II collagen is involved in skeletal formation. Type II collagen together with type I collagen are known as substrates for proteolytic cleavage by MMP13. We therefore assumed that unregulated expression of MMP13 during embryogenesis would be lethal.

Ustanovili jsme čtyři transgenní linie obsahující oba transgeny. U dvou linií, které exprimovaly hMMP13*, byla hladina exprese u jedné velmi nízká, ale druhá exprimovala významné množství hMMP13*. Linie, která exprimovala pouze menší množství transgenu vykazovala histologické důkazy ztráty proteoglykanu. Po šesti měsících bez DOX nebyly ale pozorovány žádné léze. Linie 6, která exprimuje podstatně větší množství hMMP13*, vykazuje po čtyřech měsících bez DOX osteoartritidovou patologii včetně tvorby lézí, degenerace chrupavky a zánětu synovia. Navíc může být exprese hMMP13* u linie 6 řízená tj. spuštěná nebo zastavená badatelem. Tyto výsledky dále potvrzují, že fenotyp je závislý na expresi hMMP13* a není výsledkem integrace na určité místo v chromatinu.We have established four transgenic lines containing both transgenes. In the two lines that expressed hMMP13 *, the expression level in one was very low, but the other expressed a significant amount of hMMP13 *. A line that expressed only minor amounts of transgene showed histological evidence of proteoglycan loss. However, no lesions were observed after six months without DOX. Lane 6, which expresses significantly greater amounts of hMMP13 *, shows osteoarthritis pathology including lesion formation, cartilage degeneration and synovium inflammation after four months without DOX. In addition, expression of hMMP13 * in line 6 can be driven, i.e., initiated or stopped by the investigator. These results further confirm that the phenotype is dependent on expression of hMMP13 * and is not the result of integration at a particular site in chromatin.

Stejně jako u linie 6 se také u pacientů s osteoartritidou objevuje mezi jinými kloubní destrukce/poškození, léze, fibroídní nekróza, metaplasie, synoviální buněčná hyperplasie a záněty synovia (při nepřítomností T-buněk). Ne všechny patologické stavy pozorované u transgenních myší připomínají ale osteoartrítidu. Například angiogeneze a infiltrace monocytú a makrogágu jsou patologické stavy pozorované během zánětlivého procesu spojeného s revmatoidní artritidou. Za povšimnutí stojí nepřítomnost neutrofilú v synoviální tekutině. Putování neutrofilú k místu zánětu je charakteristický znak pro patologii revmatické artritidy.As with Line 6, osteoarthritis patients also experience joint destruction / injury, lesions, fibroid necrosis, metaplasia, synovial cell hyperplasia, and synovium inflammation (in the absence of T-cells). Not all pathological conditions observed in transgenic mice resemble osteoarthritis. For example, angiogenesis and infiltration of monocytes and macrogages are pathological conditions observed during the inflammatory process associated with rheumatoid arthritis. Note the absence of neutrophils in the synovial fluid. The pathway of neutrophils to the site of inflammation is a hallmark of the pathology of rheumatoid arthritis.

Údaje předložené v této práci poskytují přímé důkazy, že MMP13 je rozhodujícím hráčem při vzniku osteoartritidy. Transgenní zvířata popsaná v této práci navíc poskytují zvířecí model pro testování účinnosti terapeutik. Sloučeniny, které mění aktivitu MMP13 nebo inhibují postup osteoartritidy, se můžou monitorovat na tvorbě lézí a jiných patologických osteoartritických (OA) změnách v různý čas během postupu choroby. Schopnost vyvolat a zastavit expresí hMMP13* a tak řídit tvorbu/načasování vzniku lézí bude výhodou při určení účinností sloučeniny.The data presented in this work provide direct evidence that MMP13 is a critical player in osteoarthritis. Moreover, the transgenic animals described in this work provide an animal model for testing the efficacy of therapeutics. Compounds that alter MMP13 activity or inhibit the progression of osteoarthritis can be monitored for the formation of lesions and other pathological osteoarthritic (OA) changes at different times during disease progression. The ability to induce and stop expression of hMMP13 * and thus control the formation / timing of lesion formation will be an advantage in determining the potency of a compound.

··· • 0 • · ···· • 0 • · ·

* • 000 ** • 000 *

Tento osteoartriticlě podobný (OA-like) transgenní model se také může použít pro získání odpovědí na rozšiřující se seznam biologických otázek. Kolagen typu II štěpí kromě MMP13 také intersticiální kolagenáza (MMP1) a neutrofilní kolagenáza (MMP8). U transgenních myší konstitutivně exprimujících aktivní MMP1 nebo MMP8 je tedy možné očekávat podobný fenotyp jejich kloubních chrupavek.This osteoarthritically-like (OA-like) transgenic model can also be used to answer the expanding list of biological questions. In addition to MMP13, type II collagen also cleaves interstitial collagenase (MMP1) and neutrophil collagenase (MMP8). Thus, transgenic mice constitutively expressing active MMP1 or MMP8 can be expected to have a similar phenotype of their articular cartilage.

Příklad 6: Rozšíření vývoje symptomů kloubních onemocnění u MMP-13 transgeních myšíExample 6: Extension of the Development of Symptoms of Joint Diseases in MMP-13 Transgenic Mice

Následující ošetření se dělají s cílem zvýraznit symptomy kloubní degenerace vykazované transgennímy zvířaty vynálezu.The following treatments are made to highlight the symptoms of joint degeneration exhibited by the transgenic animals of the invention.

U skupiny transgenních myší byla indukována exprese transgenů ve věku 4-12 měsíců. Dva až šest týdnů po indukci je myším aplikován intraperitoneálně zánětlivé činidlo, jako například lipopolysacharidy (10-100 ug), zamosan (1-10 mg), superantigen stafylokokového enterotoxinu B (1-100 ug) nebo TGF- β (1-10 ug) nebo některé jiné. Zvířatům může být případně injikováno do kloubu zánětlivé nebo funkci chondryocytú ovlivňující činidlo, jako například lipopolysacharid (1-100 ng), zymosan (50-250 ug), papain (10-100 ug) , TGF- β (0,01-1 ug), kostní morfogenní protein - 2 (bone Morphogenic Protein - 2) (2-1000 ng) IL-1 (1-100 ng). TGF-a (10-200 ng), IGF (0,01-1 ug) nebo FGF (0,01-1 ug) nebo některé další. Transgení myši stejného stáří a pohlaví chované tak, aby nedocházelo k expresi transgenů byly ošetřeny stejným způsobem a sloužili jako kontrola.In the group of transgenic mice, transgene expression was induced at the age of 4-12 months. Two to six weeks after induction, mice are given an intraperitoneal inflammatory agent, such as lipopolysaccharides (10-100 µg), zamosan (1-10 mg), staphylococcal enterotoxin B superantigen (1-100 µg), or TGF-β (1-10 µg) ) or some other. Alternatively, the animals may be injected into the joint with an inflammatory or function-influencing agent, such as lipopolysaccharide (1-100 ng), zymosan (50-250 µg), papain (10-100 µg), TGF-β (0.01-1 µg) ), bone morphogenic protein - 2 (2-1000 ng) IL-1 (1-100 ng). TGF-α (10-200 ng), IGF (0.01-1 µg) or FGF (0.01-1 µg) or some others. Transgenic mice of the same age and sex bred to avoid transgene expression were treated in the same way and served as a control.

Vývoj symptomů degenerativních kloubních onemocnění je monitorován celkovým pozorováním kloubních otoků a funkcí a histologickým hodnocením kloubů ve vybrané časové řadě po vystavení účinkům zánětlivého činidla.The development of symptoms of degenerative joint diseases is monitored by overall observation of joint swelling and functions and histological evaluation of joints at selected time series after exposure to the inflammatory agent.

Činidla budou indukovat akutní zánětlívou odpověď a/nebo krátkodobou ztrátu proteoglykanu na dobu kratší než jeden týden. Akutní zánětlivá odpověď a/nebo dočasné změny chrupavky budou dále regulovat expresi genu v chondryocytech, zvyšovat expresi transgenů a zvyšovat hladinu produkovaných MMP-13.The agents will induce an acute inflammatory response and / or short-term loss of proteoglycan for less than one week. Acute inflammatory response and / or temporary cartilage changes will further regulate gene expression in chondryocytes, increase expression of transgenes, and increase the level of MMP-13 produced.

Všechny patenty aplikace, články, publikace a testovací metody zmíněné výše jsou tímto zahrnuté odkazem jako ceiek.All application patents, articles, publications and test methods mentioned above are hereby incorporated by reference as ceiek.

< φ · ♦ φ ·<φ · ♦ φ ·

Ve světle výše zmíněných popisů se bude mnoho variant předkládaného vynálezu samo nabízet odborníkům. Takové zřejmé variace jsou v plném souladu s přiloženými nároky.In light of the above descriptions, many variations of the present invention will be offered to those skilled in the art. Such obvious variations are fully consistent with the appended claims.

» · · · · •9 »909990 909

9 *9 *

· • •9« *9 •

SEQUENCE LISTINGSEQUENCE LISTING

<110> Neuhold, Lisa Killar, Loran <120> TRANSGENIC ANIMAL MODEL FOR DEGENERATIVE DISEASES OF CARTILAGE <130> AHP-97285PCT <140> TBA <141><110> Neuhold, Lisa Killar, Loran <120> TRANSGENIC ANIMAL MODEL FOR DEGENERATIVE DISEASES OF CARTILAGE <130> AHP-97285PCT <140> TBA <141>

<150> 60/060,312 <151> 1997-12-19 <150> 08/994,609 <151> 1997-12-19 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1<150> 60 / 060,312 <151> 1997-12-19 <150> 08 / 994.609 <151> 1997-12-19 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 7 <212 > PRT <212> Homo sapiens <400> 1

Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp 1 5 <21O> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2For Arg Cys Gly Xaa For Asp 1 5 <21O> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 1521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caagatgcat ccaggggccc tggccgcccc ccccttcccg agccggaccc accgccgggc cccgcccccc cccagcggcg gcgacgaaga tgacccgcct gaggaagacc cccagcccgc agagcgccac ccgagaccac accaccaccc cacaaacccc gcgggaaccc cgaaggagaa cgcagcaagc cccacgaccg agaggccccg agaaacgcag cccccccccg gctcagaggt gactggcaaa cttgacgata acaccccaga cgccacgaaa aagccaagat gcggggccgc cgacgcgggc gaacacaacg cccccccccg aacccccaaa cggcccaaaa cgaatccaac ccacagaacc gcgaaccaca cccccgacac gacccacccc gaagccgaaa aggcacccaa aaaagccccc aaagcccggc ccgacgcaac ccccccgaac cccaccagac cccacgacgg caccgccgac accacgaccc cccccggaac caaggagcac ggcgaccccc acccacccga cgggcccccc ggcccgccgg cccacgcccc cccccccggg ccaaaccacg gaggagacgc ccaccccgac gacgacgaaa cccggacaag cagccccaaa ggccacaacc cgccccccgt cgccgcgcac gagcccggcc accccccagg ccccgaccac cccaaggacc ccggagcacc cacgcccccc acccacaccc acaccggcaa aagccacccc acgccccccg acgacgacgcHis Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 1521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caagatgcat ccaggggccc tggccgcccc accaccaccc cacaaacccc gcgggaaccc cgaaggagaa cgcagcaagc cccacgaccg agaggccccg agaaacgcag cccccccccg gctcagaggt gactggcaaa cttgacgata acaccccaga cgccacgaaa aagccaagat gcggggccgc cgacgcgggc gaacacaacg cccccccccg aacccccaaa cggcccaaaa cgaatccaac ccacagaacc gcgaaccaca cccccgacac gacccacccc gaagccgaaa aggcacccaa aaaagccccc aaagcccggc ccgacgcaac ccccccgaac cccaccagac cccacgacgg caccgccgac accacgaccc cccccggaac caaggagcac ggcgaccccc acccacccga cgggcccccc ggcccgccgg cccacgcccc cccccccggg ccaaaccacg gaggagacgc ccaccccgac gacgacgaaa cccggacaag cagccccaaa ggccacaacc cgccccccgt cgccgcgcac gagcccggcc accccccagg ccccgaccac cccaaggacc ccggagcacc cacgcccccc acccacaccc acaccggcaa aagccacccc acgccccccg acgacgacgc

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

780 líbacaagggatc cagtctctct atggtccagg agatgaagac cccaacccta aacacccaaa aacgccagac aaatgtgacc cttccttatc ccttgatgcc attaccagtc tccgaggaga aacaatgatc tttaaagaca gattcttctg gcgcctgcat cctcagcagg ttgatgcgga gctgttttta acgaaatcat tttggccaga acttcccaac cgtattgatg ctgcatatga gcacccttct catgacctca tcttcatctt cagaggtaga aaattttggg ctcttaatgg ttatgacatt ctggaaggtt atcccaaaaa aatatctgaa ctgggtcttc caaaagaagt taagaagata agtgcagctg ttcactttga ggatacaggc aagactctcc tgttctcagg aaaccaggtc tggagatatg atgatactaa ccatattatg gataaagact atccgagact aatagaagaa gacttcccag gaattggtga taaagtagat gctgtctatg agaaaaatgg ttatatctat tttttcaacg gacccataca gtttgaatac agcatctgga gtaaccgtat tgttcgcgtc atgccagcaa attccatttt gtggtgttaa gtgtcttttt aaaaattgtt atttaaatcc tgaagagcat ttggggtaat acttccagaa gtgcggggta ggggaagaag agctatcagg agaaagcttg g <210> 4 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens780 líbacaagggatc cagtctctct atggtccagg agatgaagac cccaacccta aacacccaaa aacgccagac aaatgtgacc cttccttatc ccttgatgcc attaccagtc tccgaggaga aacaatgatc tttaaagaca gattcttctg gcgcctgcat cctcagcagg ttgatgcgga gctgttttta acgaaatcat tttggccaga acttcccaac cgtattgatg ctgcatatga gcacccttct catgacctca tcttcatctt cagaggtaga aaattttggg ctcttaatgg ttatgacatt ctggaaggtt atcccaaaaa aatatctgaa ctgggtcttc caaaagaagt taagaagata agtgcagctg ttcactttga ggatacaggc aagactctcc tgttctcagg aaaccaggtc tggagatatg atgatactaa ccatattatg gataaagact atccgagact aatagaagaa gacttcccag gaattggtga taaagtagat gctgtctatg agaaaaatgg ttatatctat tttttcaacg gacccataca gtttgaatac agcatctgga gtaaccgtat tgttcgcgtc atgccagcaa attccatttt gtggtgttaa gtgtcttttt aaaaattgtt atttaaatcc tgaagagcat ttggggtaat acttccagaa gtgcggggta ggggaagaag agctatcagg agaaagcttg g <210> 4 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens

840840

900900

960960

10201020

10801080

11401140

12001200

12601260

13201320

13801380

14401440

15001500

1521 <400> 41521 <400> 4

Met Met His His Pro For Gly Gly Val Wall Leu . Leu. Ala Ala Ala Ala Phe Phe Leu Leu Phe Phe Leu Leu Ser ¹ Ser ¹ Trp ¹ Trp ¹ Thr : Thr: His His 1 1 5 5 10 10 15 15 Dec Cys Cys Arg Arg Ala Ala Leu Leu Pro For Leu Leu Pro For Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Asp Leu Leu Ser Ser 20 20 May 25 25 30 30 Glu Glu Glu Glu Asp Asp Leu Leu Gin Gin Phe Phe Ala Ala Glu Glu Arg Arg Tyr Tyr Leu Leu Arg Arg Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr His His 35 35 40 40 45 45 Pro For Thr Thr Asn Asn Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ile Ile Leu Leu Lys Lys Glu Glu Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Met Met 50 50 55 55 60 60 Thr Thr Glu Glu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Glu Glu Met Met Gin Gin Ser Ser Phe Phe Phe Phe Gly Gly Leu Leu Glu Glu Val Wall Thr Thr 65 65 70 70 75 75 80 80 Gly Gly Lys Lys Leu Leu Asp Asp Asp Asp Asn Asn Thr Thr Leu Leu Asp Asp Val Wall Met Met Lys Lys Lys Lys Pro For Arg Arg Cys Cys 85 85 90 90 95 95 Gly Gly Val Wall Val Wall Asp Asp Val Wall Gly Gly Glu Glu Tyr Tyr Asn Asn Val Wall Phe Phe Pro For Arg Arg Thr Thr Leu Leu Lys Lys 100 100 ALIGN! 105 105 110 110 Trp Trp Ser Ser Lys Lys Met Met Asn Asn Leu Leu Thr Thr Tyr Tyr Arg Arg Ile Ile Val Wall Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro For Asp Asp 115 115 120 120 125 125 Met Met Thr Thr His His Ser Ser Glu Glu Val Wall Glu Glu Lys Lys Ala Ala Phe Phe Lys Lys Lys Lys Ala Ala Phe Phe Lys Lys Val Wall 130 130 135 135 140 140 Trp Trp Ser Ser Asp Asp Val Wall Thr Thr Pro For Leu Leu Asn Asn Phe Phe Thr Thr Arg Arg Leu Leu His His Asp Asp Gly Gly Ile Ile 145 145 150 150 155 155 160 160 Ala Ala Asp Asp Ile Ile Met Met Ile Ile Ser Ser Phe Phe Gly Gly Ile Ile Lys Lys Glu Glu His His Gly Gly Asp Asp Phe Phe Tyr Tyr 165 165 170 170 175 175 Pro For Phe Phe Asp Asp Gly Gly Pro For Ser Ser Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala His His Ala Ala Phe Phe Pro For Pro For Gly Gly 180 180 185 185 190 190 Pro For Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ala Ala His His Phe Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Thr Thr Trp Trp Thr Thr 195 195 200 200 205 205 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Lys Gly Gly Tyr Tyr Asn Asn Leu Leu Phe Phe Leu Leu Val Wall Ala Ala Ala Ala His His Glu Glu Phe Phe 210 210 215 215 220 220 Gly Gly His His Ser Ser Leu Leu Gly Gly Leu Leu Asp Asp His His Ser Ser Lys Lys Asp Asp Pro For Gly Gly Ala Ala Leu Leu Met Met 225 225 230 230 235 235 240 240 Phe Phe Pro For Ile Ile Tyr Tyr Thr Thr Tyr Tyr Thr Thr Gly Gly Lys Lys Ser Ser His His Phe Phe Met Met Leu Leu Pro For Asp Asp 245 245 250 250 255 255 Asp Asp Asp Asp Val Wall Gin Gin Gly Gly Ile Ile Gin Gin Ser Ser Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Pro For Gly Gly Asp Asp Glu Glu Asp Asp 260 260 265 265 270 270 Pro For Asn Asn Pro For Lys Lys His His Pro For Lys Lys Thr Thr Pro For Asp Asp Lys Lys Cys Cys Asp Asp Pro For Ser Ser Leu Leu 275 275 280 280 285 285 Ser Ser Leu Leu Asp Asp Ala Ala Ile Ile Thr Thr Ser Ser Leu Leu Arg Arg Gly Gly Glu Glu Thr Thr Met Met Ile Ile Phe Phe Lys Lys 290 290 295 295 300 300 Asp Asp Arg Arg Phe Phe Phe Phe Trp Trp Arg Arg Leu Leu His His Pro For Gin Gin Gin Gin Val Wall Asp Asp Ala Ala . Glu . Glu . Leu . Leu 305 305 310 310 315 315 320 320 Phe Phe Leu Leu Thr Thr Lys Lys Ser Ser Phe Phe Trp Trp Pro For Glu Glu . Leu . Leu . Pro . For i Asr i Asr i Arg i Arg ’ Ile 'Ile : ASp : ASp i Ala i Ala

325 325 330 330 • • • • ·« · • • • ··· · «· • • • ··· • 0« * • ♦ · • • • 0 « * • ♦ · • • ·* » » * · ♦ · » » »· · * »» * · ♦ · »» »· ·· » · ·« • · ♦ · ·· 335 ·· »· · • ♦ · ·· 335 í 0 • • · • 4 and 0 • • · • 4 Ala Tyr Glu His Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu For Ser His Asp Leu Ile Ile Phe Phe Ile Ile Phe Phe Arg Arg Gly Gly Arg Arg 340 340 345 345 350 350 Lys Phe Trp Ala Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Ile Leu Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Tyr Pro For Lys Lys 355 355 360 360 365 365 Lys Ile Ser Glu Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Leu Gly Leu For Lys Glu Glu Val Wall Lys Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ser Ala Ala 370 370 375 375 380 380 Ala Val His Phe Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Glu Asp Thr Gly Lys Thr Thr Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser Ser Gly Gly Asn Asn 385 385 390 390 395 395 400 400 Gin Val Trp Arg Gin Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn Tyr Asp Asp Thr Asn His His Ile Ile Met Met Asp Asp Lys Lys Asp Asp Tyr Tyr 405 405 410 410 415 415 Pro Arg Leu Ile For Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Asp Phe Pro Gly Gly Ile Ile Gly Asp Gly Asp Lys Lys Val Wall Asp Asp 420 420 425 425 430 430 Ala Val Tyr Glu Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Tyr Phe Phe Phe Phe Asn Asn Gly Gly Pro For Ile Ile 435 435 440 440 445 445 Gin Phe Glu Tyr Gin Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Ser Ile Trp Ser Asn Arg Arg Ile Ile Val Wall Arg Arg Val Wall Met Met Pro For 450 450 455 455 460 460 Ala Asn Ser Ile Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys Leu Trp Cys

465 470 <210> 5 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>465 470 <210> 5 <211> 470 <212> Artificial Sequence <220>

<223> Tet promotér cloned into cytomegaloviral promotér, tet 07 promotér <400> 5 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc <210> 6 <211> 3479 <212> DNA <213> Unknown <220><223> Tet promoter cloned into cytomegaloviral promoter, tet 07 promoter <400> 5 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc <210> 6 <211> 34791 <211>

<223> Sprague Dawley rat type II collagen promotér.<223> Sprague Dawley rat type II collagen promoter.

<400> 6 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattaca tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaaggtttg tatgtggtct gagatcggcc tgactatatt tttttgtcct aaatttgcaa gcacacaccc acaaagctgc ggtcttgacc ggtattcttt atagagcgca atggagtgag ctgagtgtct aaacgatttc cctaattcat ctgatagcag aggcgctctc ctaattggcg aagagctgcc tcatgtccgc aactttttgg cagagtgaat tccacagctt tgtgtgtgtg tgtggggggg ggtgtaaggg gtgtctaaaa ctttcggtct cctactattc tgtatctcga ccggttggtt ttacaccccg gctcatctca<400> 6 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattaca tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaaggtttg tatgtggtct gagatcggcc tgactatatt tttttgtcct aaatttgcaa gcacacaccc acaaagctgc ggtcttgacc ggtattcttt atagagcgca atggagtgag ctgagtgtct aaacgatttc cctaattcat ctgatagcag aggcgctctc ctaattggcg aagagctgcc tcatgtccgc aactttttgg cagagtgaat tccacagctt tgtgtgtgtg tgtggggggg ggtgtaaggg gtgtctaaaa ctttcggtct cctactattc tgtatctcga ccggttggtt ttacaccccg gctcatctca

120120

180180

240240

300300

360360

420420

470470

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

780780

♦ ···♦ ···

ccaacgcaaa accaggaacg gaaactcccc aagcgccgca agggaccggc gtcccccgcg agaggcaagg ccccccccgc aagcaacaca atgccgcacg cctttccgcg ttacactgtt ctgtctgatg cacccggccg aagccagcca caaaatgtcc gacccaaaac ataggccggg cagcacacct gctccaaagt cgggggttcc ttcgagacaa aagttcccta acccccttgt ggggtaaggt ggggaagacg tggcggcgga ccggagccgc cgctgctccc aagagccgaa ctcggttgtc gtccccctct cgcctaccta cgcgagcctc ctggaaaact ccccccgccc cgcctttcca ttctaacccc agagggggca cgatcaggcc cttggcaggc cagccccgcg cgaccgggag ccgggtctcc cccggacccg cacccccact tcagaaacct ggctgcgaag ggttcgggag agcgatggct gagagctgtg cccagtgggt gcccgcctgc gttccccgaa gcggtaacga ccacaattag ggctcctttc gagggctgtg gatctcatat agctagcttg cccgggctaa cagctttcta aagatgcaag gcatagaaat ctgaggtggt atgggggtag aggagttact gaggaccatc tatggaagga cggggttggg tgtgtgtgtg caactaggaa ctccagactc tccaggctaa ttagacaagt tgcagctcct gtgtaggaat gatttttttc caggcgggag gtcccccaga cctaaactcc gccttgagtc agcagaactc gtgtggcagt actgggcaca gtgggccctg gggggccggg catataaccg tgcctcctcc ctccgcgctc cccctatgga agagcccacg accccgaccc gggagacccc tccagatggg aaccgggctc ccccccgacc cgccacctcc agaggcagcc ggggaaccgg ggtggcgccg tcgggcagcc tccggagccc ggcgcacccc cgcaagctag gatccgacag gcagaggcag aacggcaccc caagcctcac gcggcacgcc ccccccccaa gcctaaacca ccacccccaa gaccccggga gggagcaagg cgcgcgtgtg actctggcgc tccggccagg gggcacccac gtctccaatc ttagtccctt acaccagacc atagccagtt ttcaccgaca tttaggattc ccatccccac taaagctcca cgaggaaagg cccaagtggg tcgggggcgg gcccggcctg gggcggcccg gagcccctgc tcctgctcct tgccgccccgccaacgcaaa accaggaacg gaaactcccc aagcgccgca agggaccggc gtcccccgcg agaggcaagg ccccccccgc aagcaacaca atgccgcacg cctttccgcg ttacactgtt ctgtctgatg cacccggccg aagccagcca caaaatgtcc gacccaaaac ataggccggg cagcacacct gctccaaagt cgggggttcc ttcgagacaa aagttcccta acccccttgt ggggtaaggt ggggaagacg tggcggcgga ccggagccgc cgctgctccc aagagccgaa ctcggttgtc gtccccctct cgcctaccta cgcgagcctc ctggaaaact ccccccgccc cgcctttcca ttctaacccc agagggggca cgatcaggcc cttggcaggc cagccccgcg cgaccgggag ccgggtctcc cccggacccg cacccccact tcagaaacct ggctgcgaag ggttcgggag agcgatggct gagagctgtg cccagtgggt gcccgcctgc gttccccgaa gcggtaacga ccacaattag ggctcctttc gagggctgtg gatctcatat agctagcttg cccgggctaa cagctttcta aagatgcaag gcatagaaat ctgaggtggt atgggggtag aggagttact gaggaccatc tatggaagga cggggttggg tgtgtgtgtg caactaggaa ctccagactc tccaggctaa ttagacaagt tgcagctcct gtgtaggaat gatttttttc caggcgggag gtcccccaga cctaaactcc gccttgagtc agcagaactc gtgtggcagt actgggcaca gtgggccctg gggggccggg catataaccg tgcctcctcc ctccgcgctc cccctatgga agagcccacg accccgaccc gggagacccc tccagatggg aaccgggctc ccccccgacc cgccacctcc agaggcagcc ggggaaccgg ggtggcgccg tcgggcagcc tccggagccc ggcgcacccc cgcaagctag gatccgacag gcagaggcag aacggcaccc caagcctcac gcggcacgcc ccccccccaa gcctaaacca ccacccccaa gaccccggga gggagcaagg cgcgcgtgtg actctggcgc tccggccagg gggcacccac gtctccaatc ttagtccctt acaccagacc atagccagtt ttcaccgaca tttaggattc ccatccccac taaagctcca cgaggaaagg cccaagtggg tcgggggcgg gcccggcctg gggcggcccg gagcccctgc tcctgctcct tgccgccccg

1L cccaaggacc cccctcccct acatccgcat agtcctcctt ctgaaaccct tgtatgcgct ccccgacccc cgggctccgg ttctaatcgg atcgggcggc gcttcctccg atttaatcct catccacaaa cagtacaatc ctcgcgatcc ccatggtcca aaggatctag tacataaaga acttgaagtt gggtaattct ggacttccag ggccctaatt agaaaaggtg acagagcaag aaggcaagtg tgtgtgtgtg tttccccccc gcctcagagt tcccccggag cggctgcgtg ccctggcctg ctctcttagc ggatggggga ggtaccccgc tgggcagctt cttcctttct tgcttatgcc ggccggaggc ggcgaccgga gaagctgggc ggcaggctcc cggcttgggc tgggagaaga agagcctcct ccgagctccg • · · • » t » · · · • · · ··· * ♦♦ cgacgcgggg ccacccttcc cccccagccc tgcgaggctt gcccgtattc cgagaaaagc cctcccccac ccccgcgcgc ccagccacaa caggatgcta accgcaccta actccttacc gagtcagcca cgctctgatg gtaaaaatgt aagaagactt agccaaaggc acactctctc ctttgtttcc ccccaccccc cggcaacaca tccaaggttc tattcgggga ggccgagccc aggctggagg tgtgtgtgtc cctcacaaaa ggtcaacagt attcctgaac cggattttgc ccccttacac cacacacacc tgggttaggg aaaggagctg ccatcagctt cccgttactt tctgcaaaca cccccctctc ggccgtctcg tcaccaaagg gggggcgggg tggtttgcca cgcagagcgc gcatgagggc cccgcaagct gaaggcggac acgagtttgg cagcctccaa gtttgcgttg atttaaactg cccattcatg aatatatccc agcggcgacg agaatcactt tctgtgtagc ggcgatctgg ctacgaatgt gcagctctca ccgcatagtt gtgagagtca cggcactgca aaagactcga cttttccagc atcctgagaa caacattccc gaaatcccac cctttgctta cccatcctca ccggcagttt cccagggata tcggggatgg ctgagcccag ccctggccag ctgggccagg tgcggtgtcc ctccacacag tccagtcccc aggctgggct gaaggcaggt atactttggc cgtcctccct accccctccc gcctgtggtt gtgccccgcc ggcgactggc tcccaggtta gcccttggag cgccgggctg gcggtagaga ggggaattc1L cccaaggacc cccctcccct acatccgcat agtcctcctt ctgaaaccct tgtatgcgct ccccgacccc cgggctccgg ttctaatcgg atcgggcggc gcttcctccg atttaatcct catccacaaa cagtacaatc ctcgcgatcc ccatggtcca aaggatctag tacataaaga acttgaagtt gggtaattct ggacttccag ggccctaatt agaaaaggtg acagagcaag aaggcaagtg tgtgtgtgtg tttccccccc gcctcagagt tcccccggag cggctgcgtg ccctggcctg ctctcttagc ggatggggga ggtaccccgc tgggcagctt cttcctttct tgcttatgcc ggccggaggc ggcgaccgga gaagctgggc ggcaggctcc cggcttgggc tgggagaaga agagcctcct ccgagctccg • · • »t» · · · • · · ··· * ♦♦ cgacgcgggg ccacccttcc cccccagccc tgcgaggctt gcccgtattc cgagaaaagc cctcccccac ccccgcgcgc ccagccacaa caggatgcta accgcaccta actccttacc gagtcagcca cgctctgatg gtaaaaatgt aagaagactt agccaaaggc acactctctc ctttgtttcc ccccaccccc cggcaacaca tccaaggttc tattcgggga ggccgagccc aggctggagg tgtgtgtgtc cctcacaaaa ggtcaacagt attcctgaac cggattttgc ccccttacac cacacacacc tgggttaggg aaaggagctg ccatcagctt cccgttactt tctgcaaaca cccccctctc ggccgtctcg tcaccaaagg ggggg cgggg tggtttgcca cgcagagcgc gcatgagggc cccgcaagct gaaggcggac acgagtttgg cagcctccaa gtttgcgttg atttaaactg cccattcatg aatatatccc agcggcgacg agaatcactt tctgtgtagc ggcgatctgg ctacgaatgt gcagctctca ccgcatagtt gtgagagtca cggcactgca aaagactcga cttttccagc atcctgagaa caacattccc gaaatcccac cctttgctta cccatcctca ccggcagttt cccagggata tcggggatgg ctgagcccag ccctggccag ctgggccagg tgcggtgtcc ctccacacag tccagtcccc aggctgggct gaaggcaggt atactttggc cgtcctccct accccctccc gcctgtggtt gtgccccgcc ggcgactggc tcccaggtta gcccttggag cgccgggctg gcggtagaga ggggaattc

840840

900900

960960

10201020

10901090

11401140

12001200

12601260

13201320

13801380

14401440

15001500

15601560

16201620

16801680

17401740

18001800

18601860

19201920

19801980

20402040

21002100

21602160

22202220

22802280

23402340

24002400

24602460

25202520

25802580

26402640

27002700

27602760

28202820

28802880

29402940

30003000

30603060

31203120

31803180

32403240

33003300

33603360

34203420

3479 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Horr.o sapiens <400> Pro Arg Cys3479 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Horr. Sapiens <400> Pro Arg Cys

Gly Val Pro Asp Val 5 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>Gly Val Pro Asp Val 5 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

·« ♦···· «♦ ···

<223> MMP13* Mutagenic Oligonucleotide <400> 8 aagccaagac gcggggttgt cgatgtgggt gaatacaat <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220><223> MMP13 * Mutagenic Oligonucleotide <400> 8 aagccaagac gcggggttgt cgatgtgggt gaatacaat <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> MMP13* Mutagenic Oligonucleotide <400> 9 gaaaaagcca agatgcgggg gtcctgatgt gggtgaatac 40 <210> 10 <211> 98 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220><223> MMP13 * Mutagenic Oligonucleotide <400> 9 gaaaaagcca agatgcgggg gtcctgatgt gggtgaatac 40 <210> 10 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> BS(SK-) vector <400> 10 ggtaccacta gtaagcttag atctcatatg gtcgaccccg gggaattcct gcagggatcc tctagaagta ccccatgggt atacatcgat gcggccgc <210> 11 <211> 2792 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220><223> BS (EN-) vector <400> 10 ggtaccacta gtaagcttag atctcatatg gtcgaccccg gggaattcct gcagggatcc tctagaagta ccccatgggt atacatcgat gcggccgc <210> 11 <211> 2792 <212> DNA <213> Artificí

<223> tet-07/MMP13* transgene <400> 11 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 60 tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 120 gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc 180 actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag 240 agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag 300 ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt 360 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 420 ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc gagctcggta 480 cccggggatc ctctagacaa gatgcatcca ggggtcctgg ctgccttcct cttcttgagc 540 tggactcatt gtcgggccct gccccttccc agtggtggtg atgaagatga tttgtctgag 600 gaagacctcc agtttgcaga gcgctacctg agatcatact accatcctac aaatctcgcg 660 ggaatcctga aggagaatgc agcaagctcc atgactgaga ggctccgaga aatgcagtcc 720 ttcttcggct tagaggtgac tggcaaactt gacgataaca ccttagatgt catgaaaaag 780 ccaagatgcg gggttgtcga tgtgggtgaa tacaatgttt tccctcgaac tcttaaatgg 840 tccaaaatga atttaaccta cagaattgtg aattacaccc ctgatatgac tcattctgaa 900 gtcgaaaagg cattcaaaaa agccttcaaa gtttggtccg atgtaactcc tctgaatttt 960 accagacctc acgatggcat tgctgacatc atgatctctt ttggaattaa ggagcatggc 1020 gacctctacc catttgatgg gccctctggc ctgctggctc atgcttttcc tcctgggcca 1080 aatcatggag gagatgccca ttttgatgat gacgaaacct ggacaagtag ttccaaaggc 1140 cacaactcgt ttcttgttgc cgcgcatgag ttcggccact ccttaggtct tgaccactcc 1200 aaggaccctg gagcactcat gtttcctatc tacacctaca ccggcaaaag ccactttatg 1260 cttcctgatg acgatgtaca agggatccag tctctctatg gtccaggaga tgaagacccc 1320 aaccccaaac acccaaaaac gccagacaaa tgtgaccctt ccttatccct tgatgccatt 1380 accagtcccc gaggagaaac aatgatcttt aaagacagat tcttctggcg cctgcatccc 1440 u<223> tet-07 / MMP-13 * transgene <400> 11 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 60 tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 120 gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc 180 actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag 240 agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag 300 ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt 360 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 420 ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc gagctcggta 480 cccggggatc ctctagacaa gatgcatcca ggggtcctgg ctgccttcct cttcttgagc 540 tggactcatt gtcgggccct gccccttccc agtggtggtg atgaagatga tttgtctgag 600 gaagacctcc agtttgcaga gcgctacctg agatcatact accatcctac aaatctcgcg 660 ggaatcctga aggagaatgc agcaagctcc atgactgaga ggctccgaga aatgcagtcc 720 ttcttcggct tagaggtgac tggcaaactt gacgataaca ccttagatgt catgaaaaag 780 ccaagatgcg gggttgtcga tgtgggtgaa tacaatgttt tccctcga c tcttaaatgg 840 tccaaaatga atttaaccta cagaattgtg aattacaccc ctgatatgac tcattctgaa 900 gtcgaaaagg cattcaaaaa agccttcaaa gtttggtccg atgtaactcc tctgaatttt 960 accagacctc acgatggcat tgctgacatc atgatctctt ttggaattaa ggagcatggc 1020 gacctctacc catttgatgg gccctctggc ctgctggctc atgcttttcc tcctgggcca 1080 aatcatggag gagatgccca ttttgatgat gacgaaacct ggacaagtag ttccaaaggc 1140 cacaactcgt ttcttgttgc cgcgcatgag ttcggccact ccttaggtct tgaccactcc 1200 aaggaccctg gagcactcat gtttcctatc tacacctaca ccggcaaaag ccactttatg 1260 cttcctgatg acgatgtaca agggatccag tctctctatg gtccaggaga tgaagacccc 1320 aaccccaaac acccaaaaac gccagacaaa tgtgaccctt ccttatccct tgatgccatt 1380 accagtcccc gaggatcat aatcat

ftft · • ft ·· ft ftft · ftftft* • ftft · • ♦ · · ft* ·· ftftftft • · • ftftft · κftft · ftft · ftft ftftft ftftft ftft ftftft ftftftft ftftftft

ft ft •ft ft •

ft cagcaggccg atgcggagct gtttttaacg aaatcactcc ggccagaact ccccaaccgt actgacgctg catatgagca cccttctcat gacctcatct tcatcttcag aggtagaaaa ttttgggctc ttaatggtta tgacattctg gaaggttatc ccaaaaaaac atctgaactg ggtcttccaa aagaagttaa gaagataagt gcagctgttc actttgagga tacaggcaag actctcccgt tctcaggaaa ccaggtctgg agatatgatg atactaacca tattatggat aaagactatc cgagactaat agaagaagac ttcccaggaa ttggtgataa agtagatgct gtctatgaga aaaatggtta tatctatttt ttcaacggac ccatacagtt tgaatacagc atctggagta accgtattgt tcgcgtcatg ccagcaaatt ccattttgtg gtgttaagtg tctttttaaa aattgttatt taaatcccga agagcatttg gggtaatact tccagaagtg cggggtaggg gaagaagagc tatcaggaga aagccccagt tccagagggc cctattctat agtgtcacct aaacgccaga ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac cgacgaacgg gagcagcggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc cgactcccaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccctcagaa tcgctaagtt ttttgagtca tgccgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atatttgacg tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacctg tttattgcag ctcataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcaccaacgt atcttatcat gtctggatca tcccgccacg ggtatacatc gacgcggccg cc <210> 12 <211> 5276 <212> DNA <213> Artificial Sequenee <220>ft cagcaggccg atgcggagct gtttttaacg aaatcactcc ggccagaact ccccaaccgt actgacgctg catatgagca cccttctcat gacctcatct tcatcttcag aggtagaaaa ttttgggctc ttaatggtta tgacattctg gaaggttatc ccaaaaaaac atctgaactg ggtcttccaa aagaagttaa gaagataagt gcagctgttc actttgagga tacaggcaag actctcccgt tctcaggaaa ccaggtctgg agatatgatg atactaacca tattatggat aaagactatc cgagactaat agaagaagac ttcccaggaa ttggtgataa agtagatgct gtctatgaga aaaatggtta tatctatttt ttcaacggac ccatacagtt tgaatacagc atctggagta accgtattgt tcgcgtcatg ccagcaaatt ccattttgtg gtgttaagtg tctttttaaa aattgttatt taaatcccga agagcatttg gggtaatact tccagaagtg cggggtaggg gaagaagagc tatcaggaga aagccccagt tccagagggc cctattctat agtgtcacct aaacgccaga ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac cgacgaacgg gagcagcggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc cgactcccaa cattctactc ctccaaaaaa gaagaga AAG gtagaagacc ccaaggactt tccctcagaa tcgctaagtt ttttgagtca tgccgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atatttgacg tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacctg tttattgcag ctcataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcaccaacgt atcttatcat gtctggatca tcccgccacg ggtatacatc gacgcggccg cc <210> 12 <211> 5276 <212> DNA <213> Artificial Sequenee <220>

<223> tetracycline/VP16 repressor-activator fusion linked to a type II collagen promotér and enhancer, CPE-tTA transgene <400> 12 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggcgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggageagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaagtgttt gtatgtggtc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggtcttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tetgatagea gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcccactatt ctgtatctcg accggttggt tttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaac gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgccgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgcgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaact ggttcctcgt ggagagctgt gaaccgggcc ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccattcat gagaggcaag gcccagcggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caatacatcc cccctccctg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggtagc tttttaattg gccagccaca aagaatcacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttctcgt gccacaatta gggcggcgct ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgc tggctccttt cctgggcagc cacttaatcc tactttttac tctacgaacg cccgcctgac ggagggctgt gcccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctccc<223> tetracycline / VP16 repressor-activator fusion Linked to and type II collagen promoter and enhancer, CPE-tTA transgene <400> 12 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggcgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggageagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaagtgttt gtatgtggtc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggtcttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tetgatagea gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcccactatt ctgtatctcg accggttggt tttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaac gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgccgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgcgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaact ggttcctcgt ggagagctgt gaaccgggcc ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccattcat gagaggcaag gcccagcggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caatacatcc cccctccctg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggtagc tttttaattg gccagccaca aagaatcacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttctcgt gccacaatta gggcggcgct ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgc tggctccttt cctgggcagc cacttaatcc tactttttac tctacgaacg cccgcctgac ggagggctgt gcccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctccc

15001500

15601560

16201620

16601660

17401740

18001800

1Θ601Θ60

19201920

19801980

20402040

21002100

21602160

22202220

22802280

23402340

24002400

24602460

25202520

25802580

26402640

27002700

27602760

27922792

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

780780

840840

900900

960960

10201020

10801080

11401140

12001200

12601260

13201320

13801380

14401440

15001500

1560 1560

·· a » « « «· • · · »·· a »« «« ·

• · *• · *

«* *· «··· a · · aacgtacccc accacgcccg gatcatcccg ccacgggtat acatcgatgc ggccgc <210> 13 <211> 7664 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220>«* * ·« ··· a · · aacgtacccc accacgcccg gatcatcccg ccacgggtat acatcgatgc ggccgc <210> 13 <211> 7664 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> beta-galactosidase (lacZ) gene linked to beta-globin splice sequence and polyadenylation signál, and linked to type II collagen promotér sequence <400> 13 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagacgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggcc ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacac cgaagtgttt gcacgtggcc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggccttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tctgatagca gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcctactatt ctgtatctcg accggttggt tttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaat gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgctgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgtgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaacc ggccccccgc ggagagctgt gaatcgggct ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccacccac gagaggcaag gcccagtggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caacacaccc cccctccccg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggcagc cccctaaccg gccagccaca aagaaccacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttttcgt gccacaatta gggcggcgcc ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgt tggctccttt cttgggcagt catttaatcc tactttttac tctacgaatg tctgtctgat ggagggctgt gtccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctctc acacccggct ggatctcata tggtgcactc ccagcacaac ctgctctgat gccgcacagc caagccagcc aagctagctt gcgcaagcta gcttgcgatc cgtaaaaatg tgcgagagcc acaaaatgtc ttccgggcca agatccgaca gccatggtcc aaagaagact tcggcactgc agactcaaaa ccagctttct agcagaggca gaaggatcta gagccaaagg caaagacttg aataggctgg gaagatgcaa gaacggcacc ttacataaag aacactctct ccttttccag ccagcacact tgcatagaaa ttaagtttta cacttgaagt tctttgtttc catcctgaga agccccaaag tctgaggtgg cgcggcacgc tgggtaatcc tccccacccc ccaacattcc ccgggggttc cacgggggca gcttctccca aggacttcca gcggcaacac agaaatccca cttcgagaca aaggagttac cgcccaaacc aggccctaat ttccaaggtt ccctttgctc aaagttccct agaggaccat ctcacttcta aagaaaaggt gtattcgggg acccatcctc aacccccccg ttatggaagg agacttcggg aacagagcaa gggctgagcc cccggcagcc cggggcaagg ccggggccgg ggggagcaag gaaggcaagt gaggctggag gcccagggac aggggaagac gtgtgtgcgt gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gtgtgtgtgt ctcggggatg gcggcggcgg acaactagga aactctggcg ctttctcctc ccctcacaaa actgagtcca gctggagccg cctccagact ctctggccag ggcctcagag tggtcaacag tccctggcca gcgttgcccc ccccaggcca agggcaccca ctcccctgga gattcctgaa cctgggccag gaagagccga accagacaag cgcccccaac ccggctgcgt gcggattttg ttgcggtgtc ccccggccgc ctgcagttcc tttagccccc cccccggccc gccccttaca cccccacaca ggcccccccc tgtgtaggaa tacaccagac cctctcctag ccacacacac ctccagtccc<223> beta-galactosidase (lacZ) gene linked the beta-globin splice sequence and polyadenylation signal, and linked to type II collagen promoter sequence <400> 13 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagacgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggcc ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacac cgaagtgttt gcacgtggcc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggccttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tctgatagca gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcctactatt ctgtatctcg accggttggt t ttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaat gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgctgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgtgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaacc ggccccccgc ggagagctgt gaatcgggct ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccacccac gagaggcaag gcccagtggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caacacaccc cccctccccg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggcagc cccctaaccg gccagccaca aagaaccacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttttcgt gccacaatta gggcggcgcc ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgt tggctccttt cttgggcagt catttaatcc tactttttac tctacgaatg tctgtctgat ggagggctgt gtccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctctc acacccggct ggatctcata tggtgcactc ccagcacaac ctgctctgat gccgcacagc caagccagcc aagctagctt gcgcaagcta gcttgcgatc cgtaaaaatg tgcgagagcc acaaaatgtc ttccgggcca agatccgaca gccatggtcc aaagaagact tcggcactgc agactcaaaa ccagctttct agcagaggca gaaggatcta gagccaaagg caaagacttg aataggctgg gaagatgcaa gaacggcacc ttacataaag aacactctct ccttttccag ccagcacact tgcatagaaa ttaagtttta cacttgaagt tctttgtttc catcctgaga agccccaaag tctgaggtgg cgcggcacgc tgggtaatcc tccccacccc ccaacattcc ccgggggttc cacgggggca gcttctccca aggacttcca gcggcaacac agaaatccca cttcgagaca aaggagttac cgcccaaacc aggccctaat ttccaaggtt ccctttgctc aaagttccct agaggaccat ctcacttcta aagaaaaggt gtattcgggg acccatcctc aacccccccg ttatggaagg agacttcggg aacagagcaa gggctgagcc cccggcagcc cggggcaagg ccggggccgg ggggagcaag gaaggcaagt gaggctggag gcccagggac aggggaagac gtgtgtgcgt gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gtgtgtgtgt ctcggggatg gcggcggcgg acaactagga aactctggcg ctttctcctc ccctcacaaa actgagtcca gctggagccg cctccagact ctctggccag ggcctcagag tggtcaacag tccctggcca gcgttgcccc ccccaggcca agggcaccca ctcccctgga gattcctgaa cctgggccag gaagagccga accagacaag cgcccccaac ccggctgcgt gcggattttg ttgcggtgtc ccccggccgc ctgcagttcc tttagccccc cccccggccc gccccttaca cccccacaca ggcccccccc tgtgtaggaa tacaccagac cctctcctag ccacacacac ctccagtccc

99

52765276

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

780780

840840

900900

960960

10201020

10801080

11401140

12001200

12601260

13201320

13801380

14401440

15001500

15601560

16201620

16801680

17401740

18001800

18601860

19201920

19801980

20402040

21002100

21602160

22202220

22802280

23402340

24002400

24602460

25202520

25802580

26402640

2700 acacccggcc <2700 acacccggcc

caagccagcc i acaaaatgcc t agactcaaaa <.caagccagcc i acaaaatgcc t agactcaaaa <.

aataggctgg <aataggctgg <

ccagcacact i agctccaaag 1 ctgggggttc <ccagcacact i agctccaaag 1 ctgggggttc <

ctccgagaca i aaagttcccc i aacctccttg 1 tggggtaagg i aggggaagat <ctccgagaca i aaagttcccc i aacctccttg 1 tggggtaagg i aggggaagat <

gtggtggcgg i gccggagccg gcgttgctct gaagagccga ccccggttgt ggtccccctc ccgtctacct ttgcgagcct tccggaaaac ctcccccgcc tcgcctttcc cttctaaccc tagagggggc ccgatcaggc ccttggcagg acagccccgc gcgaccggga gccgggtctc acccggaccc atatgtctag tcggaatcga cattgtattg cagataggca gtaataacgc atttaggtac tatgccaaca ttaccttagg cacctactac aaggtgcaga aacttaaatg ctaccatcga cggctccgcg cgaccgatgt acgccgacgc cgggatttac ttgagcagat gatcctctag aacctcacct aggtaaatat tattttagat aggaaaacct ctcaacattc cagaattgct ctatttacac tgatgtatag cttgctttaa gttgttgtta aatttcacaa ggatcccata aagctagctt ttccgggcta ccagctttct gaagatgcaa tgcatagaaa tctgaggtgg catgggggta aaggagttac agaggaccat ttatggaagg ttggggttgg gtgtgtgtgt acaaccagga cctccagact ctccaggcta attagacaag ctgcagttcc tgtgtaggaa agattttttt ccaggtggga tgtcccccag ccctaaactc agccttgagt cagcagaacc agtgtggcag cactgggcac tgtgggctct ggggggctgg gcatataacc ctgcctcctc gctccgtgct attagataaa aggcttaaca gcatgtaaaa ccatactcac taaaagtttt acggcctaca aggtttttca ttgcgtattg tgatagtatg gccagccttc tgaaagtggg gggcctgctc cctgtccttt cagcctgggg gctagacgat : cccccacgac gtttaccgat í agggccctat ctgtggtgtg . aaaattctca : tccaacctat : gttttgctca : tactcctcca . aagtctcctg : cacaaaggaa j tgccttgacc i aaaacccccc i acttgtttat i ataaagcatc cggtgcaccc gcgcaagcca agatccgaca agcagaggca gaatggcatt tcaagtttta tgtggtatgc gcttctccca tgcttaaacc ctcacttcta .gtggtggcgg and gccggagccg gcgttgctct gaagagccga ccccggttgt ggtccccctc ccgtctacct ttgcgagcct tccggaaaac ctcccccgcc tcgcctttcc cttctaaccc tagagggggc ccgatcaggc ccttggcagg acagccccgc gcgaccggga gccgggtctc acccggaccc atatgtctag tcggaatcga cattgtattg cagataggca gtaataacgc atttaggtac tatgccaaca ttaccttagg cacctactac aaggtgcaga aacttaaatg ctaccatcga cggctccgcg cgaccgatgt acgccgacgc cgggatttac ttgagcagat gatcctctag aacctcacct aggtaaatat tattttagat aggaaaacct ctcaacattc cagaattgct ctatttacac tgatgtatag cttgctttaa gttgttgtta aatttcacaa ggatcccata aagctagctt ttccgggcta ccagctttct gaagatgcaa tgcatagaaa tctgaggtgg catgggggta aaggagttac agaggaccat ttatggaagg ttggggttgg gtgtgtgtgt acaaccagga cctccagact ctccaggcta attagacaag ctgcagttcc tgtgtaggaa agattttttt ccaggtggga tgtcccccag ccctaaactc agccttgagt cagcagaacc agtgtggcag cactgggcac tgtgggctct ggggggctgg gcatataacc ctgcctcctc gctccgtgct attagataaa aggcttaaca gcatgtaaaa ccatactcac taaaagtttt acggcctaca aggtttttca ttgcgtattg tgatagtatg gccagccttc tgaaagtg gg gggcctgctc cctgtccttt cagcctgggg gctagacgat: cccccacgac gtttaccgat i agggccctat ctgtggtgtg. aaaattctca: tccaacctat: gttttgctca: tactcctcca aagtctcctg: cacaaaggaa j tgccttgacc i aaaacccccc i acttgtttat i ataaagcatc cggtgcaccc gcgcaagcca agatccgaca agcagaggca gaatggcatt tcaagtttta tgtggtatgc ctcttcta cg

agacttcgggagacttcggg

Sgggagcaag gtgtgtgtgt aaccctggcg ctctggccag agggcaccca tgtctccaat tttagtccct tacaccagac catagctagt gttcaccgac atttaggatt cccaccccca ctaaagctcc ccgaggaaag ccccaagtgg atcgggggcg ggtccggccc ggggcggccc ggagcctccg cccctgctcc ctgccgcctc agtaaagtga acccgcaaac aataagcggg tcttgccctt agatgtgctt gaaaaacagc ctagagaatg gaagatcaag ccgccattat tcattcggcc tccgcgtaca gatctcccgg ccccccgcgg gacgagctcc ttcgacctgg tccgcccccc gccctcggaa tctatagtgt acataattgg agtgtataac ggaaccgatg gaagaaacgc aaaaagaaga agccatgctg aaagccgcac agagatcata acacctcccc cgcagcttac ccccccaccgSgggagcaag gtgtgtgtgt aaccctggcg ctctggccag agggcaccca tgtctccaat tttagtccct tacaccagac catagctagt gttcaccgac atttaggatt cccaccccca ctaaagctcc ccgaggaaag ccccaagtgg atcgggggcg ggtccggccc ggggcggccc ggagcctccg cccctgctcc ctgccgcctc agtaaagtga acccgcaaac aataagcggg tcttgccctt agatgtgctt gaaaaacagc ctagagaatg gaagatcaag ccgccattat tcattcggcc tccgcgtaca gatctcccgg ccccccgcgg gacgagctcc ttcgacctgg tccgcccccc gccctcggaa tctatagtgt acataattgg agtgtataac ggaaccgatg gaagaaacgc aaaaagaaga agccatgctg aaagccgcac agagatcata acacctcccc cgcagcttac ccccccaccg

4 4 »· #«·· • 9 · • 4 · »· #« ·· • 9 · • 4 · 4 «4 ·· 4 4 4 4 4 4 44 4 4 3 «4 ·· 4 4 4 4 4 4 45 4 4 4 • 4 4 4 • 4 4 « 4 4 9 «3 4 9 4 4 4 4 4 » 1 2 3 4 » • 4 • 4 Φ · w — w — » - <<·« · fl* · · Φ · w - w - << · «· fl * ... ... tcagtacaac tcagtacaac ccgctccgat ccgctccgat gccgcatagt gccgcatagt 1620 1620 gcccgcgatc gcccgcgatc cgcaaaaacg cgcaaaaacg cgcgagagtc cgcgagagtc 1680 1680 gccacggtcc gccacggtcc aaagaagacc aaagaagacc ccggcaccgc ccggcaccgc 1740 1740 gaaggatcta gaaggatcta gagccaaagg gagccaaagg caaagacttg caaagacttg 1800 1800 ttacataaag ttacataaag aacactctct aacactctct cctcttccag cctcttccag 1860 1860 cacttgaagc cacttgaagc tcttcgtctc tcttcgtctc catcctgaga catcctgaga 1920 1920 tgggtaattc tgggtaattc tccccacccc tccccacccc ccaacattcc ccaacattcc 1980 1980 aggacttcca aggacttcca gcggcaacac gcggcaacac agaaatccca agaaatccca 2040 2040 aggccccaat aggccccaat tcccaaggtt tcccaaggtt ccctttgctt ccctttgctt 2100 2100 aagaaaaggt aagaaaaggt gtattcgggg gtattcgggg acccaccccc acccaccccc 2160 — 2160 - aacagagcaa aacagagcaa gggccgagcc gggccgagcc tccggcagtt tccggcagtt 2220 2220 gaaggcaagt gaaggcaagt gaggctggag gaggctggag gcccagggat gcccagggat 2280 2280 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ctcggggatg ctcggggatg 2340 2340 ctttctcctc ctttctcctc ccctcacaaa ccctcacaaa actgagtcca actgagtcca 2400 2400 ggcctcagag ggcctcagag tggtcaacag tggtcaacag tccctggcca tccctggcca 2460 2460 ctcccctgga ctcccctgga gattcctgaa gattcctgaa cctgggccag cctgggccag 2520 2520 ccggctgcgt ccggctgcgt gcggattttg gcggattttg ttgcggtgtc ttgcggtgtc 2580 2580 tccctggcct tccctggcct gccccttaca gccccttaca cctccacaca cctccacaca 2640 2640 cctctcttag cctctcttag ccacacacac ccacacacac ctccagtccc ctccagtccc 2700 2700 tggatggggg tggatggggg atgggctagg atgggctagg gaggctgggt gaggctgggt 2760 2760 aggtaccccg aggtaccccg caaaggagct caaaggagct ggaaggcagg ggaaggcagg 2820 2820 ctgggcagct ctgggcagct tccatcagcc tccatcagcc tatactttgg tatactttgg 2880 2880 ccttcccttc ccttcccttc tcccgtcact tcccgtcact tcgtcctccc tcgtcctccc 2940 2940 atgcctatgc atgcctatgc ccccgcaaac ccccgcaaac aaccccctcc aaccccctcc 3000 3000 gggccggagg gggccggagg ccccccttct ccccccttct cgcctgcggt cgcctgcggt 3060 3060 gggcgaccgg gggcgaccgg aggccgtccc aggccgtccc ggtgccccgc ggtgccccgc 3120 3120 ggaagccggg ggaagccggg ctcaccaaag ctcaccaaag gggcgactgg gggcgactgg 3180 3180 gggcaggctc gggcaggctc cgggggcggg cgggggcggg gtcccaggtt gtcccaggtt 3240 3240 gcggtttggg gcggtttggg ctggtttgcc ctggtttgcc agcctttgga agcctttgga 3300 3300 ctgggagaag ctgggagaag acgcagagcg acgcagagcg ccgctgggct ccgctgggct 3360 3360 tagagccccc tagagccccc tgcatgaggg tgcatgaggg cgcggtagag cgcggtagag 3420 3420 gccgagcttc gccgagcttc gcccgcaagc gcccgcaagc tggggaattc tggggaattc 3480 3480 ttaacagcgc ttaacagcgc attagagctg attagagctg cttaacgagg cttaacgagg 3540 3540 tcgcccagaa tcgcccagaa gctaggtgta gctaggtgta gagcagccta gagcagccta 3600 3600 ctttgctcga ctttgctcga cgccttagcc cgccttagcc attgagatgt attgagatgt 3660 3660 tagaagggga tagaagggga aagctggcaa aagctggcaa gatcttttac gatcttttac 3720 3720 tactaagtca tactaagtca tcgcgatgga tcgcgatgga gcaaaagtac gcaaaagtac 3780 3780 acgaaactct acgaaactct cgaaaaccaa cgaaaaccaa ttagcctttt ttagcctttt 3840 3840 cattatatgc cattatatgc actcagcgct actcagcgct gtggggcatt gtggggcatt 3900 3900 agcatcaagt agcatcaagt cgctaaagaa cgctaaagaa gaaagggaaa gaaagggaaa 3960 3960 tacgacaagc tacgacaagc tatcgaatta tatcgaatta tttgatcacc tttgatcacc 4020 4020 ttgaattgat ttgaattgat catatgcgga catatgcgga ccagaaaaac ccagaaaaac 4080 4080 gccgcgcgcg gccgcgcgcg cacgaaaaac cacgaaaaac aaccacgggt aaccacgggt 4140 4140 acgacgacgc acgacgacgc ccccgaagag ccccgaagag gcggggctgg gcggggctgg 4200 4200 gacacacgcg gacacacgcg cagactgtcg cagactgtcg acggcccccc acggcccccc 4260 4260 acttagacgg acttagacgg cgaggacgtg cgaggacgtg gcgatggcgc gcgatggcgc 4320 4320 acacgtcggg acacgtcggg ggacggggat ggacggggat tccccgggtc tccccgggtc 4380 4380 acggcgctct acggcgctct ggatatggcc ggatatggcc gaccccgagt gaccccgagt 4440 4440 tcgacgagta tcgacgagta cggcgggcag cggcgggcag ggggcgcgag ggggcgcgag 4500 4500 cacctaaatg cacctaaatg ctagaggatc ctagaggatc cctgtgaagg cctgtgaagg 4560 4560 acaaactacc acaaactacc cacagagatt cacagagatt taaagctcta taaagctcta 4620 4620 gtgttaaact gtgttaaact actgattcta actgattcta accgcctgtg accgcctgtg 4680 4680 aacgggagca aacgggagca gcggcggaac gcggcggaac gcccccaacg gcccccaacg 4740 4740 catccagcga catccagcga cgatgaggct cgatgaggct accgccgact accgccgact 4800 4800 gaaaggtaga gaaaggtaga agaccccaag agaccccaag gaccttccct gaccttccct 4860 4860 tgtttagcaa tgtttagcaa tagaactctc tagaactctc gcctgcctcg gcctgcctcg 4920 4920 cgccacacaa cgccacacaa gaaaattatg gaaaattatg gaaaaatacc gaaaaatacc 4980 4980 accagccata accagccata ccacatttgt ccacatttgt agaggtttca agaggtttca 5040 5040 ctgaacctga ctgaacctga aacataaaat aacataaaat gaacgcaacc gaacgcaacc 5100 5100 aacggctaca aacggctaca aacaaagcaa aacaaagcaa cagcaccaca cagcaccaca 5160 5160 cattccagct cattccagct gtggtccgcc gtggtccgcc caaacccacc caaacccacc 5220 5220

4^ ·· ···· • · • 44 ^ ·· ···· · · • 4

4· 11 • 1 1 114 · 11 • 1 1 11

11

1 1 111 1 11

111 ι 1 11111911 1111 and 1 11111911 1

1 1111111 1111 1 11 ·« ·* ·*· κ1 1111111 1111 1 11 κ

ccgtcúaccc agatttttcc catagccagt tggatzggggg acgggtitagg gaggccgggt 2760 ccgcgagccc ccaggcggga gcccaccgac aggcaccccg caaaggagcc ggaaggcagg 2820 cccggaaaac cgccccccag actcaggacc ccgggcagcc cccaccagcc cacaccttgg 2880 cccccccgcc ccctaaaccc cccaccccca cccccccccc ccccgccacc ccgccccccc 2940 ccgccccccc agccccgagc ccaaagcccc acgcccacgc ccccgcaaac aacccccccc 3000 cccccaaccc cagcagaacc ccgaggaaag gggccggagg cccccccccc cgcccgcggc 3060 cagagggggc agcgcggcag tcccaagcgg gggcgaccgg aggccgcccc ggcgccccgc 3120 ccgatcaggc caccgggcac aCcgggggcg ggaagccggg cccaccaaag gggcgaccgg 3180 ccccggcagg tgcgggcccc ggtccggccc gggcaggccc cgggggcggg gccccaggtc 3240 acagccccgc ggggggccgg ggggcggccc gcggcccggg ccggcttgcc agccctcgga 3300 gcgaccggga gcatataacc ggagcccccg ccgggagaag acgcagagcg ccgctgggcc 3360 gccgggcctc ccgcctcccc ctcccgcccc tagagcctcc tgcacgaggg cgcggcagag 3420 acccggaccc gccccgcgcc ctgccgcccc gccgagcttc gcccgcaagc cggggaattc 3480 ggacccccgg gaccgaaaga gcccgctaaa gcaaaaaaga agccaccatg tcgctcactt 3540 tgaccaacaa gaacgcgacc cccgccgccg gcccgggagg cattggcctg gacaccagca 3600 aggagccgcc caagcgcgac cccgccgccc cacaacgccg tgaccgggaa aaccctggcg 3660 ctacccaacc taatcgccct gcagcacatc cccctttcgc cagccggctt catagcgaag 3720 aggcccgcac cgaccgcccc ccccaacagc cgcgcagccc gaatggcgaa' tggcgccttg 3780· cctggcctcc ggcaccagaa gcggcgccgg aaagccggcc ggagcgcgat ccccccgagg 3840 ccgataccgc cgtcgccccc ccaaactggc agacgcacgg tcacgatgcg cccatctaca 3900 ccaacgcaac ccatcccacc acggccaacc cgccgtttgc tcccacggag aacccgacgg 3960 gctgccaccc gcccacatct aatgctgatg aaagccggcc acaggaaggc cagacgcgaa 4020 ccacccccga cggcgccaac ccggcgcccc acccgcggcg caacgcgcgc cgggccggcc 4080 acggccagga cagccgcccg ccgcccgaac ccgacccgag cgcaccccca cgcgccggag 4140 aaaaccgccc cgcggcgacg gcgccgcgcc ggagcgacgg cagccacccg gaagaccagg 4200 acacgcggcg gacgagcggc accccccgcg acgccccgcc gccgcacaaa ccgaccacac 4260 aaaccagcga cccccacgcc gccacCcgcc ccaacgacga ccccagccgc gccgaaccgg 4320 aggccgaagc ccagacgcgc ggcgagccgc gcgaccaccc acgggcaaca gcccccccac 4380 ggcagggcga aacgcaggcc gccagcggca ccgcgccccc cggcggcgaa accaccgacg 4440 agcgcggcgg ccacgccgac cgcgccacac cacgcccgaa cgccgaaaac ccgaaaccgc 4500 ggagcgccga aaccccgaac ccccaccgcg cggcggccga accgcacacc gccgacggca 4560 cgccgaccga agcagaagcc cgcgacgccg gcccccgcga ggcgcggaCc gaaaacggcc 4620 cgctgccgcc gaacggcaag ccgccgccga cccgaggcgc caaccgccac gagcaccacc 4680 ccccgcatgg ccaggccacg gacgagcaga cgacggcgca ggacaccccg ccgacgaagc 4740 agaacaaccc caacgccgcg cgcCgcccgc accacccgaa ccacccgccg cggcacacgc 4800 cgcgcgaccg ccacggcccg cacgcggcgg acgaagccaa caccgaaacc cacggcaCgg 4860 cgccaacgaa cccgccgacc gacgacccgc gccggccacc agcgacgagc gaacgcgCaa 4920 cgcgaacggc gcagcgcgac cgcaaccacc cgagcgcgac cacccggccg ccggggaacg 4980 aaccaggcca cggcgccaac cacgacgcgc cgcaccgccg gaccaaaccc gccgaccccc 5040 cccgcccggc acagcacgaa ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgac accacccgcc 5100 cgacgcacgc gcgcgcggac gaagaccagc cccccccggc cgcgccgaaa cggcccacca 5160 aaaaacggcc cccgccaccc ggagagacgc gcccgccgac cccccgcgaa cacgcccacg 5220 cgacgggcaa cagccccggc ggccccgcca aacaccggca ggcgccccgc cagcaccccc 5280 gttcacaggg cggccccgcc tgggaccggg cggaccagcc gccgaccaaa cacgacgaaa 5340 acggcaaccc gcggccggcc cacggcggcg accccggcga cacgccgaac caccgccagc 5400 cccgcacgaa cggcccggcc cccgccgacc acacgccgca cccagcgccg acggaagcaa 5460 aacaccagca gcagcccccc cagccccgcc cacccgggca aaccaccgaa gcgaccagcg 5520 aacacccgcc ccgccacagc gacaacgagc ccccgcaccg gacggcggcg ccggacggca 5580 agccgccggc aagcggcgaa gcgcccccgg acgccgcccc acaaggcaaa cagccgaccg 5640 aaccgcccga accaccgcag ccggagagcg ccgggcaacc ccggcccaca gcacgcgcag 5700 cgcaaccgaa cgcgaccgga cggccagaag ccgggcacac cagcgcccgg cagcagcggc 5760 gcccggcgga aaaccccagc gcgacgcccc ccgccacgcc ccacgccacc ccgcacccga 5820 ccaccagcga aacggacccc cgcaccgagc cgggcaacaa gcgccggcaa cccaaccgcc 5880 agccaggccc ccccccacag ccgcggaccg gcgacaaaaa acaaccgccg acgccgcCgc 5940 gcgaccagcc cacccgcgca ccgccggaca acgacaccga cgcaagcgaa gcgacccgca 6000 ccgaccccaa cgcccgggcc gaacgccgga aggcggcggg ccaccaccag gccgaagcag 6060 cgccgccgca gcgcacggca gacacacccg ccgacgcggc gccgaccaca accgcccacg 6120 cgcggcagca ccaggggaaa accccactca ccagccggaa aacccaccgg accgacggca 6180 gcggccaaac ggcgaccacc gccgacgccg aagcggcgag cgacacaccg cacccggcgc 6240 ggaccggccc gaaccgccag ccggcgcagg cagcagagcg ggcaaaccgg cccggaccag 6300 ggccgcaaga aaaccacccc gaccgcccca ccgccgcccg ccccgaccgc cgggacccgc 6360ccgtcúaccc agatttttcc catagccagt tggatzggggg acgggtitagg gaggccgggt 2760 ccgcgagccc ccaggcggga gcccaccgac aggcaccccg caaaggagcc ggaaggcagg 2820 cccggaaaac cgccccccag actcaggacc ccgggcagcc cccaccagcc cacaccttgg 2880 cccccccgcc ccctaaaccc cccaccccca cccccccccc ccccgccacc ccgccccccc 2940 ccgccccccc agccccgagc ccaaagcccc acgcccacgc ccccgcaaac aacccccccc 3000 cccccaaccc cagcagaacc ccgaggaaag gggccggagg cccccccccc cgcccgcggc 3060 cagagggggc agcgcggcag tcccaagcgg gggcgaccgg aggccgcccc ggcgccccgc 3120 ccgatcaggc caccgggcac aCcgggggcg ggaagccggg cccaccaaag gggcgaccgg 3180 ccccggcagg tgcgggcccc ggtccggccc gggcaggccc cgggggcggg gccccaggtc 3240 acagccccgc ggggggccgg ggggcggccc gcggcccggg ccggcttgcc agccctcgga 3300 gcgaccggga gcatataacc ggagcccccg ccgggagaag acgcagagcg ccgctgggcc 3360 gccgggcctc ccgcctcccc ctcccgcccc tagagcctcc tgcacgaggg cgcggcagag 3420 acccggaccc gccccgcgcc ctgccgcccc gccgagcttc gcccgcaagc cggggaattc 3480 ggacccccgg gaccgaaaga gcccgctaaa gcaaaaaaga agccaccatg tcgctcactt 3540 TGA ccaacaa gaacgcgacc cccgccgccg gcccgggagg cattggcctg gacaccagca 3600 aggagccgcc caagcgcgac cccgccgccc cacaacgccg tgaccgggaa aaccctggcg 3660 ctacccaacc taatcgccct gcagcacatc cccctttcgc cagccggctt catagcgaag 3720 aggcccgcac cgaccgcccc ccccaacagc cgcgcagccc gaatggcgaa 'tggcgccttg 3780 · cctggcctcc ggcaccagaa gcggcgccgg aaagccggcc ggagcgcgat ccccccgagg 3840 ccgataccgc cgtcgccccc ccaaactggc agacgcacgg tcacgatgcg cccatctaca 3900 ccaacgcaac ccatcccacc acggccaacc cgccgtttgc tcccacggag aacccgacgg 3960 gctgccaccc gcccacatct aatgctgatg aaagccggcc acaggaaggc cagacgcgaa 4020 ccacccccga cggcgccaac ccggcgcccc acccgcggcg caacgcgcgc cgggccggcc 4080 acggccagga cagccgcccg ccgcccgaac ccgacccgag cgcaccccca cgcgccggag 4140 aaaaccgccc cgcggcgacg gcgccgcgcc ggagcgacgg cagccacccg gaagaccagg 4200 acacgcggcg gacgagcggc accccccgcg acgccccgcc gccgcacaaa ccgaccacac 4260 aaaccagcga cccccacgcc gccacCcgcc ccaacgacga ccccagccgc gccgaaccgg 4320 aggccgaagc ccagacgcgc ggcgagccgc gcgaccaccc acgggcaaca gcccccccac 4380 ggcagg gcga aacgcaggcc gccagcggca ccgcgccccc cggcggcgaa accaccgacg 4440 agcgcggcgg ccacgccgac cgcgccacac cacgcccgaa cgccgaaaac ccgaaaccgc 4500 ggagcgccga aaccccgaac ccccaccgcg cggcggccga accgcacacc gccgacggca 4560 cgccgaccga agcagaagcc cgcgacgccg gcccccgcga ggcgcggaCc gaaaacggcc 4620 cgctgccgcc gaacggcaag ccgccgccga cccgaggcgc caaccgccac gagcaccacc 4680 ccccgcatgg ccaggccacg gacgagcaga cgacggcgca ggacaccccg ccgacgaagc 4740 agaacaaccc caacgccgcg cgcCgcccgc accacccgaa ccacccgccg cggcacacgc 4800 cgcgcgaccg ccacggcccg cacgcggcgg acgaagccaa caccgaaacc cacggcaCgg 4860 cgccaacgaa cccgccgacc gacgacccgc gccggccacc agcgacgagc gaacgcgCaa 4920 cgcgaacggc gcagcgcgac cgcaaccacc cgagcgcgac cacccggccg ccggggaacg 4980 aaccaggcca cggcgccaac cacgacgcgc cgcaccgccg gaccaaaccc gccgaccccc 5040 cccgcccggc acagcacgaa ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgac accacccgcc 5100 cgacgcacgc gcgcgcggac gaagaccagc cccccccggc cgcgccgaaa cggcccacca 5160 aaaaacggcc cccgccaccc ggagagacgc gcccgccgac cccccgcgaa cacgcccacg 5220 cgacgggcaa C agccccggc ggccccgcca aacaccggca ggcgccccgc cagcaccccc 5280 gttcacaggg cggccccgcc tgggaccggg cggaccagcc gccgaccaaa cacgacgaaa 5340 acggcaaccc gcggccggcc cacggcggcg accccggcga cacgccgaac caccgccagc 5400 cccgcacgaa cggcccggcc cccgccgacc acacgccgca cccagcgccg acggaagcaa 5460 aacaccagca gcagcccccc cagccccgcc cacccgggca aaccaccgaa gcgaccagcg 5520 aacacccgcc ccgccacagc gacaacgagc ccccgcaccg gacggcggcg ccggacggca 5580 agccgccggc aagcggcgaa gcgcccccgg acgccgcccc acaaggcaaa cagccgaccg 5640 aaccgcccga accaccgcag ccggagagcg ccgggcaacc ccggcccaca gcacgcgcag 5700 cgcaaccgaa cgcgaccgga cggccagaag ccgggcacac cagcgcccgg cagcagcggc 5760 gcccggcgga aaaccccagc gcgacgcccc ccgccacgcc ccacgccacc ccgcacccga 5820 ccaccagcga aacggacccc cgcaccgagc cgggcaacaa gcgccggcaa cccaaccgcc 5880 agccaggccc ccccccacag ccgcggaccg gcgacaaaaa acaaccgccg acgccgcCgc 5940 gcgaccagcc cacccgcgca ccgccggaca acgacaccga cgcaagcgaa gcgacccgca 6000 ccgaccccaa cgcccgggcc gaacgccgga aggcggcggg ccaccaccag gccgaagcag 6060 cgccgccgca gcgcacg GCA gacacacccg ccgacgcggc gccgaccaca accgcccacg 6120 cgcggcagca ccaggggaaa accccactca ccagccggaa aacccaccgg accgacggca 6180 gcggccaaac ggcgaccacc gccgacgccg aagcggcgag cgacacaccg cacccggcgc 6240 ggaccggccc gaaccgccag ccggcgcagg cagcagagcg ggcaaaccgg cccggaccag 6300 ggccgcaaga aaaccacccc gaccgcccca ccgccgcccg ccccgaccgc cgggacccgc 6360

XT?XT?

• ·• ·

cattgtcaga catgtatacc ccgtacgtct ccccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagc ggcgcggcga cttccagtcc aacatcagcc gccacagcca acagcaaccg atggaaacca gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag gcacatggcc gaacatcgac ggtctccata tggggattgg tggcgacgac tcctggagcc cgtcagtatc ggcggaatta cagctgagcg ccggtcgcta ccatcaccag ttggtctggt gtcaaaaata ataataaccg gcaggccatg tctgaaagca ttcgcgtaag gaaatccatt acgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt ctcttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgcttttc ccgatttggc cacacgacat caaccatatg agcaaaagcg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttgtcgct attattccaa ccgccgctgg tctgctttct gacaaactcg gcctcgactc cagactgaga acttcagggt gagtttgggg acccttgatt gttctttctt tttcgctatt gaaaaattca tgttatatgg agggggcaaa gttttcaggg tgttgtttag aatgggaaga tgtcccttgt atcaccatgg accctcatga taatttcgtt tccttcactt tctactctgt cgacaaccat tgtctcctct tattttcttt tcattttctg taactttttt cgttaaactt tagcttgcat ttgtaacgaa tttttaaatt caetttcgtt tatttgtcag attgtaagta ctttctctaa tcactttttt tccaaggcaa tcagggtaat tatattgtac ttcagcacag tcttagagaa caattgttat aattaaatga taaggtagaa catttctgca tataaattct ggctggcgtg gaaatattct tattggtaga aacaactaca tcccggcaat catcctgcct ttctctttat ggttacaatg atatacactg tttgagatga ggataaaata ctctgagccc aaaccgggcc cctctgccaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcactcc tcaggtgcag gccgcctatc agaaggtggt ggctggtgcg gccaacgccc tggctcacaa ataccaccga gatccattgtcaga catgtatacc ccgtacgtct ccccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagc ggcgcggcga cttccagtcc aacatcagcc gccacagcca acagcaaccg atggaaacca gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag gcacatggcc gaacatcgac ggtctccata tggggattgg tggcgacgac tcctggagcc cgtcagtatc ggcggaatta cagctgagcg ccggtcgcta ccatcaccag ttggtctggt gtcaaaaata ataataaccg gcaggccatg tctgaaagca ttcgcgtaag gaaatccatt acgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt ctcttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgcttttc ccgatttggc cacacgacat caaccatatg agcaaaagcg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttgtcgct attattccaa ccgccgctgg tctgctttct gacaaactcg gcctcgactc cagactgaga acttcagggt gagtttgggg acccttgatt gttctttctt tttcgctatt gaaaaattca tgttatatgg agggggcaaa gttttcaggg tgttgtttag aatgggaaga tgtcccttgt atcaccatgg accctcatga taatttcgtt tccttcactt tctactctgt cgacaaccat tgtctcctct tattttcttt tcattttctg taactttttt cgttaaactt tagcttgcat ttgtaacgaa tttttaaatt caetttcgtt tatttgtcag attgtaagta ctttctctaa tcactttttt tccaaggcaa tcagggtaat tatattgtac ttcagcacag tcttagagaa caattgttat aattaaatga taaggtagaa catttctgca tataaattct ggctggcgtg gaaatattct tattggtaga aacaactaca tcccggcaat catcctgcct ttctctttat ggttacaatg atatacactg tttgagatga ggataaaata ctctgagccc aaaccgggcc cctctgccaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcactcc tcaggtgcag gccgcctatc agaaggtggt ggctggtgcg gccaacgccc tggctcacaa ataccaccga GATC

64206420

64806480

65406540

66006600

66606660

67206720

67806780

68406840

69006900

69606960

70207020

70807080

71407140

72007200

72607260

73207320

73807380

74407440

75007500

75607560

76207620

7664 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220>7664 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence

<223 > primer corresponding to tTA seguence <400> 14 cgagggcctg ctcgatctcc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220><223> primer corresponding to tTA segence <400> 14 cgagggcctg ctcgatctcc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220>

<223> primer corresponding to 3' untranslated region of tTA seguence <400> 15 ggcattccac cactgctccc<223> primer corresponding to 3 'untranslated region of tTA segence <400> 15 ggcattccac cactgctccc

<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <400> 16 16

gagcaccctc ctcatgacct c <21O> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli gagcaccctc ctcatgacct c <21o> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli

• · <400> 17 gttggtgtag atgggcgcat cg• <400> 17 gttggtgtag atgggcgcat cg

<210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> <400> 18 18

gcggggtctc aggttacagc c <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>gcggggtctc aggttacagc c <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> PCR primer corresponding to tet activator <400> 19 cgcccagaag ctaggtgtag ag<223> PCR primer corresponding to tet activator <400> 19 cgcccagaag ctaggtgtag ag

<210> <210> 20 20 May <211> <211> 20 20 May <212> <212> DNA DNA <213> <213> Artificial Artificial Sequence Sequence <220> <223> <220> <223> PCR primer PCR primer for tet for tet <400> <400> 20 20 May

activator cggccatatc cagagcgccgactivator cggccatatc cagagcgccg

<210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <400> 21 21

gccctctggc ctgctggctc atggccctctggc ctgctggctc atg

<210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <400> 22 22nd

caggagagtc ttgcctgtat cctccaggagagtc ttgcctgtat cctc

<210> <210> 23 23 <211> <211> 25 25 <212> <212> DNA DNA <213> <213> Mus muscalis Mus muscalis <400> <400> 23 23

aggagggagc tgacagatac actccaggagggagc tgacagatac actcc

Claims (27)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Transgenní nehumání savec nebo jeho potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují ve stabilně integrované formě rekombinantní gen kódující polypeptid, zahrnující enzymaticky aktivní, matrix degradující enzym, kde je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v chondryocytech zmíněného savce a zmíněná exprese vyvolá patologické symptomy, charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavkyA transgenic non-human mammal or its progeny with somatic and germ cells comprising in a stable integrated form a recombinant gene encoding a polypeptide, comprising an enzymatically active, matrix degrading enzyme, wherein said recombinant gene is selectively expressed in chondryocytes of said mammal and said expression causes pathological symptoms characteristic of degenerative cartilage disease 2. Transgenní zvíře nebo jeho potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují stabilně integrovaný první rekombinantní gen kódující polypeptid vybraný ze skupiny skládající se Z MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13,2. A transgenic animal or its progeny with somatic and germ cells comprising a stably integrated first recombinant gene encoding a polypeptide selected from the group consisting of MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP- 9, MMP-10, MMP-13 MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17 a jejich enzymaticky aktivních variant.MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17 and enzymatically active variants thereof. 3. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde zmíněný první rekombinantní gen je selektivně exprimován v synoviálních chondriocytěch daného zvířete.The transgenic animal as defined in claim 2, wherein said first recombinant gene is selectively expressed in synovial chondriocytes of said animal. 4. Transgenní zvíře definované v nároku rekombinantní gen kóduje MMP-13.The transgenic animal defined in claim recombinant gene encodes MMP-13. 2, kde zmíněný první2, wherein said first 5. Transgenní zvíře je lidský.5. The transgenic animal is human. definované v nárokuas defined in the claim 4, kde zmíněný MMP-134, wherein said MMP-13 6. Transgenní zvíře definované v nároku 4, kde zmíněný první rekombinantní gen kóduje variantu polypeptidu MMP-13 obsahující enzymaticky aktivní proMMP-13.The transgenic animal as defined in claim 4, wherein said first recombinant gene encodes a variant of the MMP-13 polypeptide comprising the enzymatically active proMMP-13. 7. Transgenní zvíře definované v nároku 6, kde rekombinantní gen obsahuje sekvenci kódující MMP-13, daný popsanou v SEQThe transgenic animal as defined in claim 6, wherein the recombinant gene comprises a sequence encoding MMP-13 given in SEQ. ID NO:1.ID NO: 1. *1 ·· · · · · · · ·· ·· ·· · · « · · · .* 1 ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·. • « ·»·· · · • · · · · · ·· ····· ·· · · · ·• · »·« «« «« «« «« «« 8. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde je zmíněné vybrané ze skupiny skládající se z myši, krysy, králíka, ovce, krávy, kozy a prasete.The transgenic animal as defined in claim 2, wherein said transgenic animal is selected from the group consisting of mouse, rat, rabbit, sheep, cow, goat and pig. 9. Transgenní zvíře definované v nároku 8, kde je zmíněné zvíře myš.The transgenic animal as defined in claim 8, wherein said animal is a mouse. zvířeanimal 10. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde je exprese zmíněného rekombinantního genu pod řízením prvního regulovatelného promotoru.The transgenic animal as defined in claim 2, wherein the expression of said recombinant gene is under the control of a first regulatable promoter. 11. Transgenní zvíře definované v nároku 10, kde zmíněný první regulovatelný promotor obsahuje tet07.The transgenic animal as defined in claim 10, wherein said first regulatable promoter comprises tet07. 12. Transgenní zvíře definované v nároku 11, kde má zmíněný promotor sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2.The transgenic animal as defined in claim 11, wherein said promoter has the sequence shown in SEQ ID NO: 2. 13. Transgenní zvíře definované v nároku 10, obsahující dále druhý rekombinantní gen kódující polypeptid, který reguluje zmíněný první promotor.The transgenic animal as defined in claim 10, further comprising a second recombinant gene encoding a polypeptide that regulates said first promoter. 14. Transgenní zvíře definované v nároku 12, kde je exprese zmíněného druhého rekombinantního genu pod řízením druhého regulovatelného promotoru.The transgenic animal as defined in claim 12, wherein the expression of said second recombinant gene is under the control of a second controllable promoter. 15. Transgenní zvíře definované v nároku 13, kde zmíněný druhý regulovatelný promotor obsahuje sekvence odvozené od promotoru kolagenu typu II, který způsobuje selektivní expresi zmíněného druhého rekombinantního genu v kloubních pletivech.The transgenic animal as defined in claim 13, wherein said second controllable promoter comprises sequences derived from a type II collagen promoter that causes the selective expression of said second recombinant gene in the joint tissue. 16. Transgenní myš nebo její potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují ve stabilně integrované formě:16. Transgenic mouse or its progeny with somatic and germ cells, containing in a stably integrated form: (i) první rekombinantní gen obsahující sekvenci kódující odlišný MMP-13 polypeptid obsahující MMP-13*, kde je zmíněná sekvence operačně připojená k tetO7 promotoru; a • · · ♦· · (ii) druhý rekombinantní gen kódující tTA protein operativně připojený k sekvenci odvozené od promotoru kolagenu typu II.(i) a first recombinant gene comprising a sequence encoding a different MMP-13 polypeptide comprising MMP-13 *, wherein said sequence is operably linked to the tetO7 promoter; and (ii) a second recombinant gene encoding a tTA protein operably linked to a sequence derived from the type II collagen promoter. 17. Transgenní myš definovaná v nároku 16, kde exprese zmíněných rekombinantních genů v kloubním pletivu vyvolá patologické symptomy charakteristické pro degenerativní kloubní degenerativní onemocnění.The transgenic mouse as defined in claim 16, wherein expression of said recombinant genes in the joint tissue causes pathological symptoms characteristic of degenerative joint degenerative diseases. 18. Izolovaná nukleová kyselina kódující enzymaticky aktivní proMMP-13, kde má zmíněná nukleová kyselina sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze sekvence popsané v SEQ ID NO:1, její sekvenčně konzervativní mutanty a funkčně konzervativní mutanty.An isolated nucleic acid encoding an enzymatically active proMPM-13, wherein said nucleic acid has a sequence selected from the group consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 1, its sequence-conserved mutants and functionally-conserved mutants. 19. Rekombinantní klonovací vektor obsahující nukleovou kyselinu definovanou v nároku 18.A recombinant cloning vector comprising the nucleic acid defined in claim 18. 20. Hostitelskou buňku obsahující vektora definovaného v nároku 19.A host cell comprising the vector as defined in claim 19. 21. Metodu pro produkci polypeptidu zahrnující kultivaci buňky definované v nároku 20 za podmínek vhodných pro expresi zmíněného enzymaticky aktivního proMMP-13A method for producing a polypeptide comprising culturing a cell as defined in claim 20 under conditions suitable for expression of said enzymatically active proMMP-13. 22. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u savců, zahrnující udržování savce definovaného v nároku 1 za podmínek, kdy je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v kloubním pletivu zmíněného savce.A method for inducing phenotypic changes associated with degenerative cartilage disease in a mammal, comprising maintaining the mammal as defined in claim 1 under conditions wherein said recombinant gene is selectively expressed in the joint tissue of said mammal. 23. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u savců, zahrnující udržování savce definovaného v nároku 2 za podmínek, kdy je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v kloubním pletivu zmíněného savce.A method for inducing phenotypic changes associated with degenerative cartilage disease in a mammal, comprising maintaining the mammal as defined in claim 2 under conditions wherein said recombinant gene is selectively expressed in the joint tissue of said mammal. 24. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u myši, zahrnující udržování A method for inducing phenotypic changes associated with degenerative cartilage disease in mice, including maintenance 00 9999 > ·0 • 0 0 • 00 myši definované v nároku 16 po předem stanovenou dobu bez tetracyklinu nebo jeho biologicky aktivních analoga.The mice defined in claim 16 for a predetermined period without tetracycline or biologically active analogs thereof. 25. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:25. A method for determining the ability of a substance to counteract degenerative cartilage disease, said method comprising: (i) podávání známé dávky látky transgennímu zvířeti definovanému v nároku 1 za podmínek, kdy se projevují fenotypové indikátory spojené s degenerativním onemocněním chrupavky;(i) administering a known dose of the agent to the transgenic animal as defined in claim 1 under conditions where phenotypic indicators associated with degenerative cartilage disease manifest; (ii) sledování vývoje fentotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky po předem určenou dobu po podávání látky; a (iii) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, kterému se podávala látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, kterému se látka nepodávala, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu fenotypových indikátorů nebo jakýkoliv rozdíl v čase nutném pro vývoj fenotypových indikátorů naznačuje možnost, že daná látka působí proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.(ii) monitoring the development of phentotypic indicators of cartilage degenerative disease for a predetermined time after drug administration; and (iii) comparing the range of phenotypic indicators in the treated animal relative to the control non-administered transgenic animal, wherein any difference in the nature or extent of the phenotypic indicators or any difference in time necessary for the development of the phenotypic indicators indicates the possibility that the substance acts against degenerative cartilage disease. 26. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:26. A method for determining the ability of a substance to counteract degenerative cartilage disease, said method comprising: (i) udržování transgenního zvířete definovaného v nároku 16 po předem určenou dobu bez tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, kdy zmíněné udržování způsobí objevení se jednoho nebo více fenotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky ve zmíněném zvířeti;(i) maintaining the transgenic animal as defined in claim 16 for a predetermined period of time without tetracycline or a tetracycline analogue, wherein said maintaining causes one or more phenotypic indicators of cartilage degenerative disease to appear in said animal; (ii) podávání známé dávky zmíněné látky zvířeti;(ii) administering to the animal a known dose of said agent; (iii) sledování vývoje zmíněných fenotypových indikátorů po předem určenou dobu po podání látky; a (iii) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, kterému byla podávána daná látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, které nebylo vystaveno účinkům látky, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu fenotypových indikátorů naznačuje schopnost látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.(iii) monitoring the development of said phenotypic indicators for a predetermined period of time after administration of the substance; and (iii) comparing the range of phenotypic indicators in the animal treated with the substance compared to the control transgenic animal not exposed to the substance, where any difference in the nature or range of phenotypic indicators indicates the ability of the substance to counteract degenerative cartilage disease. 4^ ·« *···5 ^ · «* ··· 27. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:A method for determining the ability of a substance to counteract degenerative cartilage disease, the method comprising: (i) poskytnutí transgenního zvířete definovaného v nároku 16, které se udržovalo za přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, aby se potlačila exprese zmíněného prvního rekombinantniho genu;(i) providing a transgenic animal as defined in claim 16, which is maintained in the presence of a tetracycline or tetracycline analogue to suppress the expression of said first recombinant gene; (ii) v podstatě současné (a) podání známé dávky zmíněné látky zmíněnému zvířeti a (b) zastavení podávání zmíněného tetracyklinu;(ii) substantially co-administering (a) administering a known dose of said agent to said animal and (b) stopping said tetracycline; (iii) sledování vývoje fenotypových indikátorů degenerativního , onemocnění chrupavky po předem určenou dobu po podání látky; a (iv) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, i kterému byla podána daná látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, které nebylo vystaveno účinkům látky, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu indikátorů, nebo jakýkoliv rozdíl v čase nutném pro vývoj indikátorů, naznačuje schopnost látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.(iii) monitoring the development of phenotypic indicators of degenerative cartilage disease for a predetermined time after administration of the agent; and (iv) a comparison of the range of phenotypic indicators in the animal treated with the substance compared to the control transgenic animal not exposed to the substance, where any difference in the nature or range of the indicators, or any difference in time necessary for the development of the indicators ability of the substance to counteract degenerative cartilage disease.