JP5219185B2 - Multiple cystic kidney model small fish and their use - Google Patents
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Description
本発明は、多発性嚢胞腎疾患のモデル魚類及びその利用に関し、詳しくは多発性嚢胞腎疾患のモデル成魚類及び当該モデル魚類の多発性嚢胞腎疾患の発症及び進展等の予防、治療又は症状の改善への利用に関する。 The present invention relates to a model fish of multiple cystic kidney disease and use thereof, and more specifically, an adult model of multiple cystic kidney disease and prevention, treatment or symptoms of the onset and progression of multiple cystic kidney disease of the model fish. Regarding utilization for improvement.
ヒトにおける多発性嚢胞腎疾患（Polycystic Kidney Disease,PKD）には、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患（Autosomal Ressive Polycystic Kidney Disease, ARPKD）と常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ARPKD）とがあるが、なかでもADPKDは、ありふれた遺伝子疾患の一つであり、わが国においては１０万人〜２０万人程度の罹患が推測されている。ADPKDは全身性疾患であり、腎臓における嚢胞のほか、肝臓、膵臓、脾臓等にも嚢胞が生じることがあるほか、頭蓋骨内出血などの既往を高い頻度で有し、その半数以上において高血圧症を合併する。ADPKDにおける最も顕著な特徴である腎臓嚢胞の形成は、腎臓の肥大化および腎臓の濃縮能力の低下を引き起こす。ADPKD患者におけるこれらの症状は年齢とともに進行するが、有効な治療方法がないために、最終的に腎不全となり腎臓透析及び腎臓移植を要するようになる場合もある。 Polycystic Kidney Disease (PKD) in humans includes autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) and autosomal dominant polycystic kidney disease (ARPKD). ARPKD), among which ADPKD is one of the common genetic diseases, and it is estimated that about 100,000 to 200,000 people are affected in Japan. ADPKD is a systemic disease. In addition to cysts in the kidney, cysts may occur in the liver, pancreas, spleen, etc., and there is a high frequency of intracranial hemorrhage, and more than half of them have hypertension. To do. Renal cyst formation, the most prominent feature in ADPKD, causes enlarged kidneys and reduced ability to concentrate the kidneys. These symptoms in ADPKD patients progress with age, but due to the lack of effective treatment, they may eventually become renal failure and require renal dialysis and kidney transplantation.
ヒトADPKDの遺伝学的発症機序として、遺伝子機能の喪失（loss-of-function）、中でもtwo-hit説が提唱されている。父母より変異型と野生型のPKD遺伝子を引き継いで出生後、成長の過程で何らかの原因により野生型PKD 遺伝子に体細胞変異が生じるために、PKD遺伝子の機能が喪失し嚢胞を形成し発症すると考えられている（非特許文献１）。 As the genetic pathogenesis of human ADPKD, loss-of-function, especially the two-hit theory, has been proposed. After inheriting the mutant and wild-type PKD genes from the parents, the somatic mutation occurs in the wild-type PKD gene for some reason during the growth process, so the function of the PKD gene is lost and a cyst is formed and developed. (Non-Patent Document 1).
ヒトADPKDの原因遺伝子としては、PKD1遺伝子とPKD2遺伝子が特定されている。ヒトの１６番染色体上の16p13.3に位置されるPKD1遺伝子及びヒト４番染色体の4q21-23に位置されるPKD2遺伝子とされており、これらはそれぞれタンパク質ポリシスチン１（PC1）とポリシスチン２（PC2）をコードしている（非特許文献１）。また、マウスの多発性嚢胞腎モデルからも原因遺伝子がクローニングされている（非特許文献２）。 PKD1 gene and PKD2 gene have been identified as causative genes of human ADPKD. PKD1 gene located at 16p13.3 on human chromosome 16 and PKD2 gene located at 4q21-23 on human chromosome 4, which are protein polycystin 1 (PC1) and polycystin 2 (PC2), respectively. ) (Non-Patent Document 1). In addition, a causal gene has been cloned from a mouse polycystic kidney model (Non-patent Document 2).
PKD1はヒト16番染色体16p13.3に位置し、mRNAの大きさは約14kbpで、46個のエクソンよりなる巨大な遺伝子である。その遺伝子産物であるポリシスチン１（polycystin-1）は4320個のアミノ酸からなり、そのN末端は細胞外に、C末端は細胞内に存在し、11個の膜貫通ドメインをもつ膜貫通蛋白である。細胞外からのシグナルを細胞内に伝えるセンサーの役割を果たすと考えられている。Pkd1ノックアウトマウスはヘテロ接合体では表現型に乏しく、ホモ接合体で多発性嚢胞腎及び胎性致死をきたす（非特許文献３）。 PKD1 is located on human chromosome 16p13.3, the size of mRNA is about 14 kbp, and it is a huge gene consisting of 46 exons. Its gene product, polycystin-1, is composed of 4320 amino acids, its N-terminus is extracellular and C-terminus is intracellular, and it is a transmembrane protein with 11 transmembrane domains. . It is thought to serve as a sensor that transmits signals from outside the cell into the cell. Pkd1 knockout mice have poor phenotype in heterozygotes, and cause polycystic kidney disease and embryonic lethality in homozygotes (Non-patent Document 3).
PKD2はヒト4番染色体4q21-23に位置し、5.4kbpのmRNAをもち、15個のエクソンよりなる遺伝子である。遺伝子産物であるポリシスチン２（polycystin-2）は968個のアミノ酸から成り、N末端、C末端ともに細胞内に存在し、その間に6個の膜貫通ドメインをもつ膜貫通蛋白であり、その機能はCa2+イオンチャンネルと考えられている（非特許文献１）。Pkd2ノックアウトマウスはPkd1ノックアウトマウスと同様、ヘテロ接合体では特異的な表現型に乏しく、ホモ接合体で多発性嚢胞腎を形成し、胎性致死となる（非特許文献４）。Pkd1ノックアウトマウスとの相違点として、Pkd2ノックアウトマウスのホモ接合体では内臓逆位が起こる（非特許文献５）。 PKD2 is located on human chromosome 4 4q21-23, has a 5.4 kbp mRNA, and consists of 15 exons. The gene product polycystin-2 (polycystin-2) is a transmembrane protein consisting of 968 amino acids, present in the cell at both the N-terminal and C-terminal, and having six transmembrane domains between them. It is considered a Ca 2+ ion channel (Non-patent Document 1). Pkd2 knockout mice, like Pkd1 knockout mice, lack a specific phenotype in heterozygotes, and form polycystic kidneys in homozygotes, resulting in fetal lethality (Non-patent Document 4). As a difference from Pkd1 knockout mice, visceral inversion occurs in homozygotes of Pkd2 knockout mice (Non-patent Document 5).
ポリシスチン１及びポリシスチン２は、ともに尿細管上皮細胞の管腔側に存在する線毛(primary cilium)に局在し、細胞内のそれぞれのC末端で相互作用がある。ポリシスチン１が尿細管内の尿の流速を傾きとして捉え、共役するポリシスチン２に伝え、Ca2+チャンネルとしてポリシスチン２が機能する。細胞外から細胞内へのCa2+流入は、細胞内の小胞体にあるポリシスチン２からの大量のCa2+放出を引き起こす。この細胞内のCa2+濃度の変化が、引き続いて分化、増殖、アポトーシスなどに関与するさまざまな遺伝子の発現を制御し、尿細管上皮の分化、増殖をコントロールすると推測されている。ポリシスチン１及びポリシスチン２のいずれの変異でも、センサーとしての線毛機能は破綻し、適切な尿細管径の維持ができず嚢胞を生じさせる（非特許文献６、７）。 Both polycystin 1 and polycystin 2 are localized in the primary cilium existing on the luminal side of tubular epithelial cells, and interact with each other at the C-terminal in the cell. Polycystin 1 captures the flow rate of urine in the tubule as an inclination and transmits it to the conjugated polycystin 2, and the polycystin 2 functions as a Ca 2+ channel. Ca 2+ influx from outside the cell causes a large amount of Ca 2+ release from polycystin 2 in the endoplasmic reticulum. It is speculated that this change in intracellular Ca 2+ concentration subsequently controls the expression of various genes involved in differentiation, proliferation, apoptosis, etc., and controls the differentiation and proliferation of tubular epithelium. With either mutation of polycystin 1 or polycystin 2, the ciliary function as a sensor is broken, and an appropriate tubule diameter cannot be maintained, resulting in a cyst (Non-patent Documents 6 and 7).
生じた嚢胞は、いくつかの増殖機転により増大していくが、その一つとして、cAMPが関与することが報告されている。cAMPは正常尿細管細胞の増殖を抑制するが、ADPKD患者から得られた尿細管細胞では、逆にcAMPが増殖を促進する。ポリシスチン１の発現低下によりcAMPの作用が細胞増殖抑制から細胞増殖促進へと変化したと考えられている（非特許文献８）。バゾプレッシン、プロスタグランディンE2、セクレチン、VIP（vasoactive intestinal polypeptide）などのホルモンはcAMPを増加させ、嚢胞を増大させる可能性がある。自然発症嚢胞腎ラット（ヒト常染色体劣性多発性嚢胞腎遺伝子異常を持つ）ならびにPkd2遺伝子操作マウスにcAMPを抑制するバゾプレッシンV2レセプター阻害薬であるOPC31260を投与したところ、腎cAMP含有量が減少し、嚢胞形成も著明に減少したとの報告がある（非特許文献９、１０）。これらのことより、嚢胞形成におけるcAMPの関与が有力視され、その抑制を目的としたバゾプレッシンV2レセプター阻害薬の臨床治験が世界で始まりつつある。 The resulting cysts increase with several growth mechanisms, one of which has been reported to involve cAMP. cAMP suppresses the proliferation of normal tubular cells, but cAMP promotes the proliferation of tubular cells obtained from ADPKD patients. It is considered that the action of cAMP has changed from cell growth suppression to cell growth promotion due to the decreased expression of polycystin 1 (Non-patent Document 8). Hormones such as vasopressin, prostaglandin E2, secretin, VIP (vasoactive intestinal polypeptide) increase cAMP and may increase cysts. When OPC31260, a vasopressin V2 receptor inhibitor that suppresses cAMP, was administered to spontaneous cystic kidney rats (with human autosomal recessive polycystic kidney gene abnormality) and Pkd2 genetically engineered mice, renal cAMP content decreased, There are reports that cyst formation has also been significantly reduced (Non-Patent Documents 9 and 10). From these facts, cAMP is likely to be involved in cyst formation, and clinical trials of vasopressin V2 receptor inhibitors for its suppression are beginning in the world.
一方、現在多発性嚢胞腎モデル動物として複数のノックアウトマウスが作成されているが（非特許文献１１）、遺伝子組換えマウスの維持・繁殖には多大な手間と費用が必要である。既に説明したように、通常のノックアウトマウスでは胎性致死となるため薬剤投与研究には適さない。また、胎性致死を回避させたPkd1コンディショナルノックアウトマウスも報告されている（非特許文献１２）。さらに、Nishioらが作製したPkd1ノックアウトキメラマウスではヒトADPKDに類似した多発性嚢胞腎が認められ、病態解析モデルとして有用なことが報告されている（非特許文献１３）。 On the other hand, although a plurality of knockout mice have been created as a model animal for polycystic kidney disease (Non-patent Document 11), much effort and cost are required for maintenance and breeding of transgenic mice. As already explained, normal knockout mice are embryonic lethal and are not suitable for drug administration studies. In addition, Pkd1 conditional knockout mice that have avoided fetal lethality have been reported (Non-patent Document 12). Furthermore, in the Pkd1 knockout chimeric mouse produced by Nishio et al., Multiple cystic kidneys similar to human ADPKD were observed, and it has been reported that it is useful as a pathological analysis model (Non-patent Document 13).
また、近年、小型魚類を用いて薬物スクリーニングを行う試みが成果をあげつつある。メダカ（Oryzias latipes）は、日本産のモデル動物である。染色体は48本あり、ゲノムサイズが800Mbpと小さく、ヒトゲノムの4分の１の大きさである。飼育が比較的容易で、世代交代時間が2〜3ヵ月であり、毎日産卵するといった遺伝学研究に適した利点をもつ。さらに、ゼブラフィッシュにおいては、腎嚢胞形成突然変異体も多数発見され（非特許文献１４、１５）、メダカにおいては、多発性嚢胞腎を発症する突然変異メダカが報告されている（非特許文献１６）。さらに、メダカについて、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウンも報告されている（非特許文献１７、１８）。
上記特許文献９、１０に開示されるｃAMPの抑制に関する報告における自然発症嚢胞腎ラット及びPkd2遺伝子操作マウスでは、いずれも嚢胞はバゾプレッシンV2レセプターが高発現している遠位尿細管・集合管を主体に形成されている。したがって、近位尿細管由来の嚢胞が70%と考えられているヒトADPKDでの有効性については不明であり、有効薬剤のさらなる検討が必要であり、このためには、ヒトADPKDについての適切なモデル動物が必要である。 In spontaneously occurring cystic kidney rats and Pkd2 gene-engineered mice reported in the reports on cAMP suppression disclosed in Patent Documents 9 and 10, the cysts are mainly distal tubules / collecting tubes in which vasopressin V2 receptor is highly expressed. Is formed. Therefore, the effectiveness of human ADPKD, which is thought to be 70% of cysts derived from proximal tubules, is unclear, and further investigation of effective drugs is required. Model animals are needed.
しかしながら、現状において、ヒトADPKDの発症、進展を抑制する薬剤スクリーニング等に適したモデル動物が提供されているとはいえなかった。また、簡易で迅速なスクリーニングに適したモデル動物が提供されているともいえなかった。 However, at present, it cannot be said that a model animal suitable for drug screening that suppresses the onset and progression of human ADPKD has been provided. Moreover, it cannot be said that a model animal suitable for simple and rapid screening is provided.
すなわち、薬剤の検討には、多発性嚢胞腎疾患モデル動物が必要であるが、非特許文献３、４に開示されるように、PKD1遺伝子又はPKD2遺伝子のヘテロ接合ノックアウトマウスでは嚢胞腎特異的な発現が不十分であり、ホモ接合ノックアウトマウスでは、致死性であった。また、非特許特許文献１２に開示される胎生致死を回避させたPkd1コンディショナルノックアウトマウスは、腎嚢胞の数は少なく、非特許特許文献１４に開示されるPkd1ノックアウトキメラマウスではそのキメラ率により表現型にばらつきがあった。このように、いずれのモデルマウスにおいても薬剤投与研究には適するものではなかった。 That is, for examination of drugs, a model animal for multiple cystic kidney disease is required, but as disclosed in Non-Patent Documents 3 and 4, heterozygous knockout mice of PKD1 gene or PKD2 gene are specific to cystic kidneys. Insufficient expression was lethal in homozygous knockout mice. The Pkd1 conditional knockout mouse disclosed in Non-Patent Document 12 avoiding embryonic lethality has a small number of renal cysts, and the Pkd1 knockout chimeric mouse disclosed in Non-Patent Document 14 is expressed by its chimera rate. There was variation in the mold. Thus, none of the model mice was suitable for drug administration studies.
また、ゼブラフィッシュやメダカにおいて嚢胞腎形成突然変異体が発見されているが、これらの原因遺伝子は、PKD1、PKD2遺伝子と相同遺伝子ではなく、ポリシスチン１及び２をコードするmRNAの発現には異常が認められないことがわかっている。さらに、メダカ等の小型魚類には、上述のような利点があるが、現時点においてノックアウトが不可能である。さらにまた、遺伝子ノックダウン法は系統化することが困難であり、非特許文献１７に開示されるノックダウンメダカは、嚢胞を形成するものの成魚に至らない致死性であった。 In addition, cyst nephrogenic mutants have been discovered in zebrafish and medaka fish, but these causative genes are not homologous to PKD1 and PKD2 genes, but the expression of mRNA encoding polycystin 1 and 2 is abnormal. I know it ’s not allowed. Furthermore, although small fishes such as medaka have the advantages described above, knockout is not possible at this time. Furthermore, it is difficult to systematize the gene knockdown method, and the knockdown medaka disclosed in Non-Patent Document 17 is lethal so as to form a cyst but not to an adult fish.
そこで、本発明では、ヒトADPKDに有効な薬剤検討等に適切なモデル魚類及びその用途を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、多発性嚢胞腎の病態（典型的には嚢胞腎の増大）を形成し、胎生致死でなく、ヒトADPKDの原因遺伝子に変異を有する遺伝子組換え魚類及びその用途を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、こうした魚類において、系統化可能な魚類及びその用途を提供することを他の一つの目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a model fish suitable for studying a drug effective for human ADPKD and the use thereof. The present invention also provides a genetically modified fish that forms a pathological condition of polycystic kidneys (typically an increase in cystic kidneys), has no mutation in embryonic lethality, and has a mutation in the gene responsible for human ADPKD, and uses thereof This is another purpose. Furthermore, another object of the present invention is to provide a fish that can be systematized in such fish and its use.
本発明者らは、薬剤投与研究がより簡便に低コストで実施可能な動物モデルとしてメダカに着目した。そこで、本発明者らは、メダカPKD1及びPKD2をクローニングし、さらに、これらの遺伝子につき、可能性あるドミナントネガティブ変異体について検討した。マウスの先例によれば、メダカPKD1遺伝子及び／又はPKD2遺伝子の変異は、メダカにおいても致死的であると考えられたが、意外にも、これらの遺伝子のドミナントネガティブ遺伝子導入メダカは、その表現型において、胎生致死でなく、成魚後多発性嚢胞腎を発症するとともにその魚令に伴い嚢胞は増加して、ヒトADPKDの同様の疾患の発症、進展経緯を示した。本発明らはこれらの知見に基づき以下の発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。 The present inventors have focused on medaka as an animal model that enables drug administration studies to be carried out more easily and at low cost. Therefore, the present inventors cloned medaka PKD1 and PKD2, and further examined possible dominant negative mutants for these genes. According to mouse precedents, mutations in the medaka PKD1 gene and / or PKD2 gene were considered to be lethal in medaka, but surprisingly, the dominant negative transgenic medaka of these genes has its phenotype However, the cysts were not lethal but developed post-adult polycystic kidney disease, and the number of cysts increased with the age of the fish, indicating the onset and progress of human ADPKD. The present inventors have completed the following invention based on these findings. That is, according to the present invention, the following means are provided.
本発明によれば、ドミナントネガティブ効果を発現可能にPKD2遺伝子の変異遺伝子が導入されて得られる遺伝子組換え魚類である、多発性嚢胞腎モデル小型魚類が提供される。好ましくは、このモデル小型魚類はメダカである。 According to the present invention, a polycystic kidney model small fish, which is a genetically modified fish obtained by introducing a mutant gene of the PKD2 gene so as to express a dominant negative effect, is provided. Preferably, the model small fish is a medaka.
前記変異遺伝子は、前記モデル魚類と同種魚類由来の前記PKD2遺伝子の変異遺伝子とすることができる。また、前記変異遺伝子は、前記PKD2遺伝子がコードするタンパク質の少なくとも一部の欠損を生じさせる欠失変異を有していてもよい。さらに、前記変異遺伝子は、前記PKD2遺伝子がコードするタンパク質のＣ末端側の欠損を生じさせる欠失変異を有していてもよい。 The mutant gene can be a mutant gene of the PKD2 gene derived from the same species of fish as the model fish. The mutant gene may have a deletion mutation that causes a deletion of at least a part of the protein encoded by the PKD2 gene. Furthermore, the mutant gene may have a deletion mutation that causes a C-terminal deletion of the protein encoded by the PKD2 gene.
本発明によれば、ヒト多発性嚢胞腎の発症又は進展に関連する外部因子のスクリーニング方法であって、上記いずれかの多発性嚢胞腎モデル小型魚類にスクリーニング対象である外部因子を付与する工程と、前記外部因子を付与した前記モデル魚類におけるヒト多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用又は抑制作用を評価する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a screening method for an external factor related to the onset or progress of human polycystic kidneys, the method comprising providing an external factor to be screened to any of the above polycystic kidney model small fishes; And a step of evaluating a promoting action or an inhibitory action on the onset and / or progression of human polycystic kidney in the model fish to which the external factor has been imparted.
本スクリーニング方法においては、前記外部因子は、化合物又は化合物以外の環境因子とすることができる。また、前記外部因子は化合物であり、前記評価工程は、前記ヒト多発性嚢胞腎疾患の発症又は進展を抑制する作用を評価する工程とすることもできる。 In the present screening method, the external factor can be a compound or an environmental factor other than the compound. Further, the external factor is a compound, and the evaluation step can be a step of evaluating an action of suppressing the onset or progress of the human polycystic kidney disease.
本発明の多発性嚢胞腎モデル魚類は、PKD2遺伝子のドミナントネガティブ変異遺伝子が導入されて得られる魚類である。本発明の魚類によれば、ヒトADPKDの原因遺伝子の変異に起因して、嚢胞を多発し胎生致死でない遺伝子組換え小型魚類を得ることができる。すなわち、ヒトADPKDの発症及び進展態様を有するモデル魚類を得ることができる。また、本発明の小型魚類によれば、遺伝子組換え魚類であるため、系統化することが魚類を提供することができる。さらに、本発明の小型魚類によれば、小型魚類の特性から、低コストで簡易にかつ迅速にヒトADPKDに関連する外部因子をスクリーニングすることができる。 The polycystic kidney model fish of the present invention is a fish obtained by introducing a dominant negative mutant gene of the PKD2 gene. According to the fish of the present invention, it is possible to obtain a transgenic small-sized fish that causes a large number of cysts and is not embryonic lethal due to mutations in the gene responsible for human ADPKD. That is, it is possible to obtain a model fish having the onset and progress of human ADPKD. Moreover, according to the small fish of this invention, since it is a genetically modified fish, systematization can provide a fish. Furthermore, according to the small fish of the present invention, external factors related to human ADPKD can be screened easily and rapidly at low cost from the characteristics of the small fish.
また、本発明のヒト多発性嚢胞腎の発症又は進展に関連する外部因子のスクリーニング方法は、本発明の魚類にスクリーニング対象である外部因子を付与し、外部因子を付与したモデル魚類における多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用又は抑制作用を評価する、方法である。このスクリーニング方法によれば、ヒトADPKDの発症等に関連する外部因子を適切、簡易かつ迅速にスクリーニングすることができる。また、ヒトADPKDの病因についての解明にも利用することができる。 In addition, the screening method for external factors related to the onset or development of human polycystic kidneys of the present invention provides the external factors to be screened to the fish of the present invention, and multiple cysts in model fish to which the external factors have been added. It is a method for evaluating a promoting action or an inhibitory action on the onset and / or development of the kidney. According to this screening method, an external factor related to the onset of human ADPKD and the like can be screened appropriately, simply and rapidly. It can also be used to elucidate the pathogenesis of human ADPKD.
以下、本発明の多発性嚢胞腎モデル小型魚類及びその利用についての実施の形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the polycystic kidney model small fish of the present invention and use thereof will be described in detail.
（多発性嚢胞腎モデル小型魚類）
本発明の多発性嚢胞腎モデル小型魚類（以下、単に本小型魚類ともいう。）は、遺伝子組換えにより、ドミナントネガティブ効果を発現可能にPKD2遺伝子の変異遺伝子を導入して得られる遺伝子組換え小型魚類である。
(Multiple cyst kidney model small fish)
The polycystic kidney model small fish of the present invention (hereinafter also simply referred to as the present small fish) is a genetically modified small size obtained by introducing a mutant gene of the PKD2 gene so that a dominant negative effect can be expressed by genetic recombination. It is a fish.
（小型魚類）
本小型魚類を得るための小型魚類は、研究又は実験用途の小型魚類が好ましく、より好ましくは、硬骨魚類の小型魚類であって、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウ、トラフグ及びニジマスなどが挙げられる。なかでも、体外から内部器官を視認できる透明小型魚類が好ましい。こうした透明小型魚類としては、例えば、特開2001−328480号公報に開示される透明メダカなどを含むメダカ属又はその近縁に属する小型魚類を好ましく用いることができる。また、ゼブラフィッシュも好ましく用いることができる。
(Small fish)
The small fish for obtaining the present small fish is preferably a small fish for research or experimental use, more preferably a small fish of teleost, such as zebrafish, medaka, goldfish, loach, tiger trout, etc. . Among these, transparent small fish that can visually recognize internal organs from outside the body is preferable. As such a transparent small fish, for example, a small fish belonging to the genus genus including the transparent medaka disclosed in JP-A-2001-328480 or the like or a related fish can be preferably used. Also, zebrafish can be preferably used.
（導入遺伝子）
導入する遺伝子であるドミナントネガティブ変異遺伝子は、遺伝子組換えしようとする小型魚類と同種又は異種の小型魚類由来のPKD2遺伝子を変異させたものであってもよいし、異種動物のPKD2遺伝子を変異させたものであってもよい。小型魚類のPKD2遺伝子においては、ヒトなどの哺乳動物の遺伝子と高い相同性を有していることも多いため、必ずしも小型魚類のPKD2遺伝子を変異させたものでなくもよい。
(Transgene)
The dominant negative mutant gene to be introduced may be a mutant of the PKD2 gene derived from a small fish of the same or different species as the small fish to be genetically modified, or may be a mutant of the PKD2 gene of a heterologous animal. It may be. The small fish PKD2 gene is often highly homologous to the gene of a mammal such as a human, and therefore the PKD2 gene of the small fish may not necessarily be mutated.
PKD2遺伝子としては、既に、ヒト(アクセッション番号：NM_000297)、マウス（アクセッション番号：NM_008861）、ゼブラフィッシュ（アクセッション番号：NM_001002310）において知られている。現在知られていない小型魚類を含む動物のPKD2遺伝子は、こうした既知の小型魚類のPKD2遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列及び／又は既知のヒトやマウスなどの異種動物のPKD2遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて、遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列に関し利用可能に公開されているデータベース（National Center for Biotechnology Information, USA及びMedaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan）等を利用して相同検索を行うことで取得することができる。例えば、メダカPKD2遺伝子は、本発明者らがはじめて同定したものであるが、マウスPKD2遺伝子に基づいてフグデータベース(DOE Joint Genome Institute, USA)上で、フグPKD2遺伝子を予測し、これをもとにメダカデータベースで相同検索を行ってメダカPKD2遺伝子を取得している（配列番号３）。なお、メダカPKD2遺伝子は、ヒトやマウスのPKD2とも比較的高い相同性を示した。 The PKD2 gene is already known in humans (accession number: NM_000297), mice (accession number: NM_008861), and zebrafish (accession number: NM_001002310). The PKD2 gene of animals including small fish that is not currently known is the nucleotide sequence or amino acid sequence of the known small fish PKD2 gene and / or the known nucleotide sequence or amino acid sequence of the PKD2 gene of a different animal such as a human or mouse. Based on the above, homologous search using publicly available databases (National Center for Biotechnology Information, USA and Medaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan) regarding gene base sequences and amino acid sequences Can be obtained at. For example, the medaka PKD2 gene was first identified by the present inventors, and the puffer PKD2 gene was predicted on the puffer database (DOE Joint Genome Institute, USA) based on the mouse PKD2 gene. The homologous search was conducted in the medaka database to obtain the medaka PKD2 gene (SEQ ID NO: 3). The medaka PKD2 gene showed relatively high homology with human and mouse PKD2.
なお、他の一つの原因遺伝子であるPKD1遺伝子としては、既に、ヒト(アクセッション番号：NM_001009944)、マウス（アクセッション番号：NM_013630、において知られている。現在知られていない小型魚類を含む動物のPKD1遺伝子は、こうした既知の小型魚類のPKD1遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列及び／又は既知のヒトやマウスなどの異種動物のPKD1遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて、遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列に関し利用可能に公開されているデータベース（National Center for Biotechnology Information, USA及びMedaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan）等を利用して相同検索を行うことで取得することができる。例えば、メダカPKD1遺伝子は、本発明者らがはじめて同定したものであるが、フグPKD1遺伝子の塩基配列に基づいてアミノ酸レベルで相同性のあるメダカ配列をメダカデータベース（Medaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan）上でのBLAST検索により取得している（配列番号１）。なお、メダカPKD1遺伝子は、フグのPKD1遺伝子と高い相同性を示したが、ヒトやマウスなどの哺乳類のPKD1遺伝子との相同性は低い。 The PKD1 gene, which is another causative gene, is already known in humans (accession number: NM_001009944) and mice (accession number: NM_013630. Animals including small fish that are not currently known. The PKD1 gene is based on the nucleotide sequence or amino acid sequence of the known small fish PKD1 gene and / or the known nucleotide sequence or amino acid sequence of the PKD1 gene of a different animal such as human or mouse. It can be obtained by performing a homologous search using publicly available databases (National Center for Biotechnology Information, USA and Medaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan), etc. For example, medaka The PKD1 gene was first identified by the present inventors, but the amino acid level was determined based on the base sequence of the puffer PKD1 gene. Belle homologous medaka sequences have been obtained by BLAST search on the medaka database (Medaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan) (SEQ ID NO: 1) The medaka PKD1 gene is the pufferfish PKD1 gene. However, the homology with the PKD1 gene of mammals such as humans and mice is low.
導入遺伝子は、PKD2遺伝子を変異させることにより、変異遺伝子を導入する遺伝子組換えによりドミナントネガティブ効果を発現させるものであることが好ましい。PKD2遺伝子における変異がドミナントネガティブ効果を発現可能なものであれば、当該変異遺伝子の導入量や発現時期や発現量の調節によって、ドミナントネガティブ効果の発現について調節することが可能となる。 The transgene is preferably one that causes a dominant negative effect to be expressed by gene recombination that introduces the mutated gene by mutating the PKD2 gene. If the mutation in the PKD2 gene can express a dominant negative effect, the expression of the dominant negative effect can be controlled by adjusting the introduction amount, expression time, and expression level of the mutant gene.
遺伝子に対する変異は、塩基の置換、欠失、挿入及び付加から選択される１種又は２種以上の組み合わせとすることができ、また、こうした変異に係る塩基数も特に限定されない。変異は、また、PKD2遺伝子の産物のアミノ酸配列においては、１個又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び付加を生じる変異のほか、ノンセンス変異、ナンセンス変異及びフレームシフト変異の形態を採ることができる。 The mutation for the gene can be one or a combination of two or more selected from base substitution, deletion, insertion and addition, and the number of bases related to such mutation is not particularly limited. In addition to mutations that cause substitution, deletion, insertion, and addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the product of the PKD2 gene, mutations include forms of nonsense mutations, nonsense mutations, and frameshift mutations. Can be taken.
PKD2遺伝子のドミナントネガティブ変異としては、例えば、その遺伝子産物であるPC2のC末端側を欠損するような欠失変異が挙げられる。C末端側の欠損は、有効にドミナントネガティブ効果を発現可能な程度に欠失していればよいが、例えば、ヒトPKD2遺伝子及びメダカPKD2遺伝子は、ともに１５個のエクソンに分かれているが、エクソン１２〜１５の全部又は一部を欠失させる変異とすることができる。好ましくは、エクソン１２〜１５の全てを欠失する変異とする。なお、他の小型魚類や動物のPKD2遺伝子のドミナントネガティブ変異としては、メダカ又はヒトのPKD2遺伝子のエクソン１２〜１５に相当する領域の全部又は一部を欠失させる変異とすることが好ましい。 Examples of dominant negative mutations in the PKD2 gene include deletion mutations that lack the C-terminal side of the gene product PC2. The deletion on the C-terminal side only needs to be deleted to such an extent that a dominant negative effect can be effectively expressed. For example, the human PKD2 gene and the medaka PKD2 gene are both divided into 15 exons. It can be a mutation that deletes all or part of 12-15. Preferably, it is set as the mutation which deletes all the exons 12-15. The dominant negative mutation of the PKD2 gene of other small fish or animals is preferably a mutation that deletes all or part of the region corresponding to exons 12 to 15 of the medaka or human PKD2 gene.
このような変異遺伝子、例えば、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。 Such a mutant gene, for example, a DNA comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added, can be any known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, mutagenesis, etc. It can produce by the method of.
なお、PKD2遺伝子を変異させてドミナントネガティブ効果を発現可能とするPKD2遺伝子の変異形態はこれに限定するものではなく、各種のPKD2変異遺伝子を作製し、これを導入遺伝子として遺伝子組換えした小型魚類について、多発性嚢胞腎における嚢胞腎の形成態様等を指標とし正常なPKD2遺伝子産物の機能が阻害されているかどうかを評価することで、有効なPKD2遺伝子の変異形態を取得することができる。なお、こうした評価にあたっては、例えば、得られた遺伝子組換え小型魚類の組織切片における嚢胞の観察する手法を採用できる。 In addition, the mutant form of the PKD2 gene that allows the dominant negative effect to be expressed by mutating the PKD2 gene is not limited to this, and small fish that have been prepared by various PKD2 mutant genes and genetically modified as transgenes. By evaluating whether or not the function of the normal PKD2 gene product is inhibited by using as an index the form of cyst kidney formation in polycystic kidneys, an effective mutant form of the PKD2 gene can be obtained. In this evaluation, for example, a technique for observing a cyst in a tissue section of the obtained transgenic small fish can be employed.
（変異遺伝子導入用DNA構築物）
PKD2変異遺伝子による遺伝子組換え小型魚類を作製するには、変異遺伝子産物を小型魚類細胞内で発現可能なDNA構築物として導入する必要がある。このようなDNA構築物における遺伝子発現のための要素の組み合わせやその配列は、特に限定しないが、PKD2変異遺伝子を適当なプロモーターの制御下に連結するほか、ポリアデニル化配列等必要な調節領域を付加することができる。その他必要に応じて、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やエンハンサー配列、転写終結を指令するターミネーター配列を用いることもできる
(DNA construct for mutated gene introduction)
In order to produce transgenic small fish using the PKD2 mutant gene, it is necessary to introduce the mutant gene product as a DNA construct that can be expressed in small fish cells. The combination of elements for gene expression in such a DNA construct and the sequence thereof are not particularly limited, but a necessary regulatory region such as a polyadenylation sequence is added in addition to linking a PKD2 mutant gene under the control of an appropriate promoter. be able to. In addition, an intron sequence, an enhancer sequence having a function of enhancing gene expression, or a terminator sequence that directs transcription termination can be used as necessary.
プロモーターとしては、特に限定しないで、小型魚類内において機能可能なものであればよい。構成的プロモーターであってもよいし、誘導的プロモーターであってもよい。構成的プロモーターを用いるか誘導的プロモーターを用いるかは、変異遺伝子によって得られるドミナントネガティブ効果の程度によって決定することもできる。例えば、正常PKD2遺伝子の機能抑制程度が強い場合には、誘導的プロモーターを用いてその発現強度を調節することで、有効なヒトADPKDモデルとして成立する場合がある。また、変異遺伝子の正常PKD2遺伝子の機能抑制程度が穏やかな場合には、構成的プロモーターを用いて発現させることで有効なヒトADPKDモデルとして成立する場合がある。 The promoter is not particularly limited as long as it can function in small fish. It may be a constitutive promoter or an inducible promoter. Whether to use a constitutive promoter or an inducible promoter can also be determined by the degree of dominant negative effect obtained by the mutated gene. For example, when the degree of functional suppression of the normal PKD2 gene is strong, an effective human ADPKD model may be established by controlling the expression intensity using an inducible promoter. In addition, when the degree of function suppression of the normal PKD2 gene of the mutant gene is moderate, it may be established as an effective human ADPKD model by expressing it using a constitutive promoter.
誘導的プロモーターとしては、商業的に入手可能な各種のシステムを用いることができる。例えば、ドキシサイクリンによる誘導可能なTet-On and Tet-Off gene expression systems（タカラバイオ）が挙げられる。さらに、PKD2変異遺伝子にあっては、発現状態を容易に確認可能にPKD2の変異タンパク質と各種のレポータータンパク質との融合タンパク質として発現させるようにしてもよい。レポータータンパク質遺伝子としては、GFPをはじめとする蛍光タンパク質の遺伝子、lacZ遺伝子、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。 As the inducible promoter, various commercially available systems can be used. An example is Tet-On and Tet-Off gene expression systems (Takara Bio) that can be induced by doxycycline. Furthermore, in the case of a PKD2 mutant gene, it may be expressed as a fusion protein of a mutant protein of PKD2 and various reporter proteins so that the expression state can be easily confirmed. Examples of reporter protein genes include fluorescent protein genes such as GFP, lacZ gene, soluble alkaline phosphatase gene, and luciferase gene.
また、組織特異性の高いプロモーターであってもよいし、組織特異性の低いプロモーターであってもよい。組織特異性を考慮すると、少なくとも腎臓においてPKD2変異遺伝子を発現可能なプロモーターであることが必要である。ヒトADPKDは、本来全身的な疾患であり多種類の器官に及ぶ疾患であることを考慮すると、筋肉以外の組織で発現されるプロモーターを利用することが好ましい。こうしたプロモーターとしては、例えば、EF-1α-Aプロモーター、β−アクチンプロモーター等が挙げられる。 Moreover, a promoter with high tissue specificity may be sufficient, and a promoter with low tissue specificity may be sufficient. Considering tissue specificity, it is necessary to be a promoter capable of expressing a PKD2 mutant gene in at least the kidney. Considering that human ADPKD is inherently a systemic disease and a disease affecting many types of organs, it is preferable to use a promoter expressed in tissues other than muscle. Examples of such a promoter include EF-1α-A promoter and β-actin promoter.
DNA構築物の形態も特に限定されない。後述するように受精卵等に対する遺伝子導入形態等に応じて適宜選択することができる。DNA構築物は、裸の状態であってもよいし、適当なプラスミドに保持させたベクターの形態としてもよい。 The form of the DNA construct is not particularly limited. As will be described later, it can be appropriately selected according to the gene transfer mode for fertilized eggs and the like. The DNA construct may be naked or may be in the form of a vector held on a suitable plasmid.
遺伝子組換え小型魚類は、遺伝子導入のDNA構築物を小型魚類の受精卵等に導入するなど、公知の遺伝子組換え小型魚類の作製方法に基づいて作製できる。すなわち、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウイルスベクター感染法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法によって行うことができる。 The transgenic small fish can be produced based on a known method for producing a transgenic small fish, such as introducing a DNA construct for gene introduction into a fertilized egg of a small fish. That is, it can be performed by a microinjection method, viral vector infection method, particle gun method, or electroporation method to an oocyte or a fertilized egg.
なお、本小型魚類には、このような変異遺伝子が導入された魚成体、その子孫の他、魚受精卵細胞、魚胚細胞なども含まれる。 The small fish includes adult fish into which such a mutated gene has been introduced, its progeny, fish fertilized egg cells, fish embryo cells, and the like.
（ヒト多発性嚢胞腎の発症又は進展に関連する外部因子のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、本小型魚類にスクリーニング対象である外部因子を付与する工程と、前記外部因子を付与した本小型魚類における多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用又は抑制作用を評価する工程と、
を備えることができる。
(Screening method for external factors related to the onset or progression of human polycystic kidney disease)
The screening method of the present invention comprises a step of applying an external factor to be screened to the small fish, and an action of promoting or suppressing the onset and / or progression of multiple cystic kidneys in the small fish to which the external factor is applied. A process of evaluating;
Can be provided.
（外部因子付与工程）
スクリーニング対象である外部因子としては、特に限定しない。ヒトADPKDの発症や進展に関連する可能性があればよい。例えば、外部因子としては,ヒトADPKDの発症や進展を抑制、すなわち、予防又は治療する薬剤となりうる化合物や環境因子であってもよいし、ヒトADPKDの発症や進展を促進するような化合物や各種ストレスなどの環境因子であってもよい。付与する外部因子は、１種利のみならず、複数種類であってもよい。例えば、化合物と環境ストレスとの双方であってもよいし、相乗効果がある可能性のある２種類以上の化合物であってもよい。互いに相殺作用のある可能性のある２種類以上の化合物であってもよい。本スクリーニング方法は、モデル動物を大量に準備できるため、2種類以上の外部因子を組み合わせたスクリーニングも大きなコストをかけずに実施することができる。
(External factor application process)
The external factor to be screened is not particularly limited. It may be related to the onset and progression of human ADPKD. For example, the external factor may be a compound or an environmental factor that can be used as a drug for suppressing or preventing human ADPKD, that is, a preventive or therapeutic agent, It may be an environmental factor such as stress. The external factor to be imparted may be not only one kind but also plural kinds. For example, it may be both a compound and environmental stress, or two or more kinds of compounds that may have a synergistic effect. Two or more types of compounds that may have a canceling action may be used. Since this screening method can prepare a large amount of model animals, screening combining two or more external factors can be performed without incurring a large cost.
外部因子を本小型魚類に付与するには、本小型魚類が仔魚又は成魚の場合には、仔魚又は成魚の飼料中に化合物などの外部因子を含めてもよいし、これらを飼育する液体に対して化合物を供給してもよいし、温度等の各種環境因子を付与してもよい。また、飼育用液体に供給する酸素を含有するガスに外部因子を含めることもできる。本小型魚類が発生途中の場合には、培地が培養中のガスに化合物や環境因子を付与することができる。 In order to impart an external factor to the small fish, if the small fish is a larvae or an adult fish, an external factor such as a compound may be included in the feed of the larvae or the adult fish. The compound may be supplied or various environmental factors such as temperature may be imparted. Moreover, an external factor can also be included in the gas containing oxygen supplied to the breeding liquid. When this small fish is in the process of development, the medium can add compounds and environmental factors to the gas being cultured.
（評価工程）
本小型魚類における多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用や抑制作用を評価する手法は特に限定されない。こうした評価のための指標としては、例えば、発生途中又は飼育中の本小型魚類の状態、組織切片における嚢胞の状態などが挙げられる。そのほか、嚢胞の増加や減少に伴うものであればどのようなものであってもよい。例えば、スクリーニング時における飼育用液体中の組成から検出される新たな指標であってもよいし、スクリーニング時における本小型魚類から検出される新たな指標であってもよい。すなわち、外部因子工程と評価工程とに加えて、飼育用液体や飼育中の本小型魚類おいて増減する因子の有無を評価する工程を実施することで、ヒトAPKDの発症及び／又は進展の抑制又は促進をモニターすることができる新たな指標を見出すこともできる。
(Evaluation process)
There is no particular limitation on the method for evaluating the promoting and inhibiting effects on the onset and / or progression of multiple cystic kidneys in this small fish. Examples of such an index for evaluation include the state of the present small fish during development or rearing, the state of a cyst in a tissue section, and the like. In addition, it may be anything as long as it accompanies an increase or decrease in cysts. For example, it may be a new index detected from the composition in the breeding liquid at the time of screening, or a new index detected from the small fish at the time of screening. In other words, in addition to the external factor process and the evaluation process, it is possible to suppress the onset and / or progression of human APKD by performing the process of evaluating the presence or absence of factors that increase or decrease in the rearing liquid and the small fish being bred. Or new indicators can be found that can monitor the promotion.
評価工程においては、多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用や抑制作用を評価するには、外部因子が付与されない場合などコントロールとなりうる飼育等の条件下で本小型魚類を飼育等するか、あるいは、こうしたコントロールとしてのデータを予め取得しておき、コントロールにおける多発性嚢胞腎の発症及び進展の傾向と対比することができる。 In the evaluation process, in order to evaluate the promoting and / or inhibiting effects on the onset and / or progression of multiple cystic kidneys, this small fish is reared under conditions such as rearing that can be used as a control when no external factor is applied. Alternatively, data as such a control can be acquired in advance and compared with the tendency of the onset and progression of multiple cystic kidneys in the control.
評価工程において、外部因子について本小型魚類における多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する促進作用が肯定される場合には、当該外部因子は、ヒトADPKDの発症及び／又は進展に悪影響を及ぼす外部因子である。したがって、ヒトADPKDの予防・治療の観点からは、こうした外部因子の不活性化、分解又は除去等が可能な別の外部因子等を新たにスクリーニングする。例えば、本スクリーニング方法において、悪影響を及ぼす外部因子を予め本小型魚類の飼育用液体等の飼育環境や飼料等に付与しておいた上、この外部因子の影響を緩和、中和等する可能性のある外部因子を付与し、その作用を評価すればよい。 In the evaluation process, if the external factor is positive for the effect on the onset and / or progression of multiple cystic kidneys in this small fish, the external factor is an external factor that adversely affects the onset and / or progression of human ADPKD. Is a factor. Therefore, from the viewpoint of prevention / treatment of human ADPKD, another external factor capable of inactivating, degrading or removing such an external factor is newly screened. For example, in this screening method, there is a possibility that an external factor that has an adverse effect is previously given to the breeding environment such as liquid for breeding the small fish or feed, and the influence of this external factor is mitigated or neutralized. What is necessary is just to give a certain external factor and to evaluate the effect | action.
また、評価工程において、外部因子について本小型魚類における多発性嚢胞腎の発症及び／又は進展に対する抑制作用が肯定される場合には、当該外部因子は、ヒトADPKDの発症及び／又は進展の予防又は治療に好ましい影響を及ぼす外部因子である。このような外部因子は、ヒトADPKDの予防・治療用の薬剤として利用可能であり、また、ヒトADPKDの予防・治療に好ましい環境因子として利用可能である。 In addition, in the evaluation process, when the inhibitory action on the onset and / or progression of multiple cystic kidneys in the small fish is affirmed with respect to the external factor, the external factor is used to prevent the onset and / or progression of human ADPKD or It is an external factor that favors treatment. Such an external factor can be used as a drug for the prevention / treatment of human ADPKD, and can also be used as an environmental factor preferable for the prevention / treatment of human ADPKD.
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、本実施例は本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, this example does not limit the present invention.
（メダカPkd1とPkd2のクローニング）
フグPkd１の塩基配列（Hum Mol Genet 1997; 6: 1483-1489.）とアミノ酸レベルで相同性のあるメダカゲノム配列を特定するためにデータベース（National Center for Biotechnology Information, USA及びMedaka genome project by NIG DNA Sequencing Center, Japan）上でBlast searchを行った。メダカPkd2については、まずマウスPkd2をもとにフグデーターベース(DOE Joint Genome Institute, USA)上でフグPkd2を予測し、これをもとに相同検索を行った。
(Cloning of medaka Pkd1 and Pkd2)
Databases (National Center for Biotechnology Information, USA and Medaka genome project by NIG DNA) to identify medaka genome sequences that are homologous at the amino acid level with the base sequence of pufferfish Pkd1 (Hum Mol Genet 1997; 6: 1483-1489.) Blast search was performed on Sequencing Center, Japan. As for medaka Pkd2, first, puffer Pkd2 was predicted on the puffer database (DOE Joint Genome Institute, USA) based on mouse Pkd2, and homologous search was performed based on this.
得られたメダカPkd1,Pkd2において、エクソンと推測される場所にプライマーを設定しRT-PCRを行った。RT-PCRの鋳型には、Marathon法（Marathon cDNA Amplification Kit;タカラバイオ, 大津、 滋賀, 日本）により、野生型メダカOR(orange red)から作成された卵および腎臓cDNAライブラリーを使用した。遺伝子の両末端は、キット付属のプロトコールにより5'RACE及び3'RACE法を用いた。得られたPCR産物をベクターにサブクローニングし、シーケンス解析を行った。結果を図１並びに表１及び表２に示す。 In the obtained medaka Pkd1 and Pkd2, RT-PCR was performed by setting a primer at a place presumed to be an exon. As an RT-PCR template, an egg and kidney cDNA library prepared from wild type medaka OR (orange red) by the Marathon method (Marathon cDNA Amplification Kit; Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan) was used. For both ends of the gene, 5′RACE and 3′RACE methods were used according to the protocol attached to the kit. The obtained PCR product was subcloned into a vector and subjected to sequence analysis. The results are shown in FIG. 1 and Tables 1 and 2.
(1)メダカPkd1
図１Ａ及び表１に示すように、遺伝子の大きさはおよそ80kbpであり、mRNAの翻訳領域は13791bpで56個のエクソンに分かれていた(図１A〜図１N)。なお、図１B〜図１Qの塩基配列中の下線部位は、それぞれエクソンの最後の塩基であり、当該塩基の配列右欄に記載の数字は、最後の塩基が含まれるエクソンの番号を示している。アミノ酸レベルの相同性はヒトPKD1では49.6%、マウスPkd1では48.4％、フグPkd1では68.7％であった。他の種で認められた長いイントロン1がメダカPkd1でも認められた。フグのエクソン2とエクソン31がメダカではそれぞれ2つに分かれ、結果としてメダカPkd1は56個のエクソンからなっていた。なお、表１には、ヒト、フグ、メダカPkd1の比較を示し、ヒトPKD1のデータベース（NCBI）上のドメインと、それぞれの種のエクソンとの対応を示している。
As shown in FIG. 1A and Table 1, the gene size was approximately 80 kbp, and the mRNA translation region was 13791 bp and was divided into 56 exons (FIGS. 1A to 1N). The underlined sites in the base sequences of FIGS. 1B to 1Q are each the last base of the exon, and the numbers described in the right column of the base sequence indicate the numbers of the exons including the last base. . The homology at the amino acid level was 49.6% for human PKD1, 48.4% for mouse Pkd1, and 68.7% for puffer fish Pkd1. A long intron 1 found in other species was also found in medaka Pkd1. Puffer exon 2 and exon 31 were each divided into two in Medaka, and as a result, Medaka Pkd1 consisted of 56 exons. Table 1 shows a comparison of human, puffer fish, and medaka Pkd1, and shows the correspondence between the domains on the human PKD1 database (NCBI) and the exons of each species.
(2)メダカPkd2
図１Ａ及び表２に示すように、遺伝子の大きさはおよそ9.2kbpであり、mRNAの翻訳領域は2706bpで15個のエクソンに分かれていた(図1A、図１O〜図１Q)。アミノ酸レベルの相同性はヒトPKD2では64.6％、マウスPkd2では65.2％であった。ヒトPKD2と同じように15個のエクソンに分かれていた。なお、表２には、ヒト、メダカPkd2の比較を示しており、ヒトPKD2のデータベース（NCBI）上のドメインと、それぞれの種のエクソンとの対応を示す。
As shown in FIG. 1A and Table 2, the gene size was approximately 9.2 kbp, and the translation region of mRNA was 2706 bp and was divided into 15 exons (FIG. 1A, FIG. 1O to FIG. 1Q). Amino acid homology was 64.6% for human PKD2 and 65.2% for mouse Pkd2. Like human PKD2, it was divided into 15 exons. Table 2 shows a comparison between human and medaka Pkd2, and shows the correspondence between the domains on the human PKD2 database (NCBI) and the exons of each species.
メダカPkd1はフグPkd1と高い相同性を示したが、ヒトやマウスなどの哺乳類との相同性は低かった。それに対して、メダカPkd2は、ヒトやマウスのPKD2とも比較的高い相同性を示した。PKD2相同遺伝子が線虫C. elegansにも存在すること[22]からも、進化の過程で種を越えてよく保存されており生物にとって極めて重要な機能を果たしていると考えられた。 Medaka Pkd1 showed high homology with pufferfish Pkd1, but low homology with mammals such as humans and mice. In contrast, medaka Pkd2 showed relatively high homology with human and mouse PKD2. The presence of the PKD2 homologous gene in C. elegans [22] suggests that it is well conserved across species during evolution and plays an extremely important function for organisms.
本実施例では、図２に示す各種コンストラクトを作製、マイクロインジェクション法による遺伝子導入により一過性発現実験を行った。 In this example, various constructs shown in FIG. 2 were prepared, and a transient expression experiment was performed by gene introduction by a microinjection method.
（欠失変異体コンストラクト作製）
図２に示す各種コンストラクトを作製した。メダカPkd1では、シグナルペプチド以外のN末端を欠失させるためエクソン6からエクソン27までを欠失させ、強化緑色蛍光蛋白質EGFP（タカラバイオ）に置き換えたプラスミドコンストラクトEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔNを作成した。
(Deletion mutant construct production)
Various constructs shown in FIG. 2 were prepared. In medaka Pkd1, the plasmid construct EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN was deleted from exon 6 to exon 27 to replace the N-terminal other than the signal peptide and replaced with enhanced green fluorescent protein EGFP (Takara Bio). Created.
メダカPkd2ではエクソン12からエクソン15までのC末端を欠失させた変異体の3’側にEGFPをタグとして付加したプラスミドコンストラクトEF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFPを作成した。なお、プロモーターとして、筋肉以外の全身で発現するEF-1α-Aプロモーター（Develop Growth Differ 2000; 42: 469-478.）を使用した。 In the medaka Pkd2, a plasmid construct EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP was prepared by adding EGFP as a tag to the 3 ′ side of the mutant from which the C-terminal from exon 12 to exon 15 was deleted. As a promoter, an EF-1α-A promoter (Develop Growth Differ 2000; 42: 469-478.) Expressed in the whole body other than muscle was used.
また、Tet-On/Off誘導系を用いた系統をつくるため、市販のTet-On and Tet-Off gene expression systems（タカラバイオ）を用いて、Tet-On用の転写因子rtTAをEF-1α-Aプロモーターにより発現させるコンストラクトEF-1α-A-rtTAとTet-Off用の転写因子tTAを発現するコンストラクトEF-1α-A-tTAを作成した。これに対応するtet response elementを持ち、ドキシサイクリンにより発現が調節される応答遺伝子をもつコンストラクトTRE2-EGFP-Pkd1ΔN及びTRE2-Pkd2ΔC-EGFPも作成した。 In addition, in order to create a strain using the Tet-On / Off induction system, a commercially available Tet-On and Tet-Off gene expression systems (Takara Bio) was used to convert the transcription factor rtTA for Tet-On to EF-1α- A construct EF-1α-A-tTA that expresses a construct EF-1α-A-rtTA expressed by the A promoter and a transcription factor tTA for Tet-Off was prepared. Constructs TRE2-EGFP-Pkd1ΔN and TRE2-Pkd2ΔC-EGFP having a tet response element corresponding to this and having a response gene whose expression is regulated by doxycycline were also prepared.
（Micro-injection法による遺伝子導入）
野生型メダカOR(orange red)の1〜4細胞期の受精卵細胞質にマイクロマニピュレータ及びマイクロメーターシリンジを用いて、顕微鏡下にmicro-injection法[21]で遺伝子導入を行った。DNA濃度は25ng/μlに調整した。
(Gene transfer by micro-injection method)
Using a micromanipulator and a micrometer syringe in the fertilized egg cytoplasm of the 1 to 4 cell stage of wild type medaka OR (orange red), the gene was introduced under the microscope by the micro-injection method [21]. The DNA concentration was adjusted to 25 ng / μl.
（結果）
(1)EGFP-Pkd1ΔNの一過性発現実験
275個の受精卵に、プラスミドコンストラクトEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔNをmicro-injection法により遺伝子導入した。結果を表３及び図３に示す。24時間後、104個の卵がEGFPによる蛍光を発した。1個の卵に心臓逆位を認めた。35個が孵化し、12匹に躯幹の屈曲を認めた。組織切片による評価で25匹中1匹に前腎の嚢胞を認めた（図３A,B）。
(result)
(1) Transient expression experiment of EGFP-Pkd1ΔN
Plasmid construct EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN was introduced into 275 fertilized eggs by the micro-injection method. The results are shown in Table 3 and FIG. After 24 hours, 104 eggs fluoresced with EGFP. Heart inversion was observed in one egg. Thirty-five hatched and 12 animals had trunk flexion. As a result of evaluation by tissue section, cysts of the pronephros were observed in 1 out of 25 animals (FIGS. 3A and 3B).
なお、表３には、一過性発現実験結果を示す。すなわち、micro-injection法により遺伝子導入し、受精卵及び稚魚で認められた表現型の一覧を示す。ただし、蛍光；micro-injectionの24時間後、EGFPによる緑色蛍光を呈した卵数、心臓逆位；6日目の受精卵の観察により心臓逆位があると認めた個体数、屈曲；孵化したものの躯幹屈曲を呈した稚魚数、直；異常なく孵化した稚魚数、切片；主に屈曲した稚魚を固定し組織切片を作成した数、腎嚢胞；組織切片の検鏡により前腎嚢胞が確認された個体数、である。
(2)Pkd2ΔC-EGFPの一過性発現実験
452個の卵にプラスミドコンストラクトEF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFPをmicro-injection法により遺伝子導入した。結果を表３及び図４に示す。24時間後、135個の卵がEGFPによる蛍光を発した。孵化直前の受精後6日目の卵を実体顕微鏡で観察したところ、8個の卵に心臓逆位を認めた（図４C、D）。74個が孵化し、29匹に躯幹の屈曲を認めた（図４A）。組織切片による評価で24匹中3匹に前腎の嚢胞を認めた(図４B)。
(2) Transient expression experiment of Pkd2ΔC-EGFP
Plasmid construct EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP was introduced into 452 eggs by micro-injection method. The results are shown in Table 3 and FIG. After 24 hours, 135 eggs fluoresced with EGFP. When the eggs on the 6th day after fertilization immediately before hatching were observed with a stereomicroscope, heart inversion was observed in 8 eggs (FIGS. 4C and D). 74 hatched and 29 animals showed trunk flexion (FIG. 4A). Evaluation by histological section revealed prorenal cysts in 3 of 24 animals (FIG. 4B).
メダカでは受精卵の1〜4細胞期の細胞質にプラスミドコンストラクトをmicro-injectionすることにより、in vivoで導入遺伝子を発現させることができる。遺伝子導入された卵はおよそ7日で孵化し、稚魚は脊椎動物の基本的器官をすべて備えているため、導入遺伝子の機能の簡便な評価が可能であった。本実験では、ペプチド鎖伸長因子のプロモーターであるEF-1α-AプロモーターによりC末端の欠失した変異メダカPkd2を初期胚の段階で過剰発現させた。この結果、前腎に嚢胞が形成され、欠失変異蛋白質がドミナントネガティブ変異体として働き、ノックアウト動物と同等の表現型を得たものと考えられた。また腎嚢胞以外に、心臓逆位、屈曲も一過性の欠失変異体遺伝子発現の表現型として認められた。野生型メダカでは約0.5%に心臓逆位を認めるが、一過性発現実験では、Pkd2欠失変異体をmicro-injectionされ蛍光を認めた卵のうち6%の個体に心臓逆位を認めた。ヒトADPKDでは心臓逆位を認めないが、Pkd2ノックアウトマウスのホモ接合体では33%に心臓逆位を認める。これは初期胚においてpolycystin-2が左右軸決定に関与しており、その機能が阻害されたときに心臓逆位が発生すると考えられている。従って、一過性発現ではあるものの変異Pkd2を導入したメダカの初期胚に心臓逆位が認められたことはPkd2欠失変異体がドミナントネガティブ機序を介して野生型のPkd2を阻害した可能性を強く示唆するものであった。 In medaka, transgenes can be expressed in vivo by micro-injecting plasmid constructs into the cytoplasm of the 1st to 4th cell stages of fertilized eggs. The transgenic egg hatched in about 7 days, and the fry had all the basic organs of the vertebrate, so it was possible to easily evaluate the function of the transgene. In this experiment, the mutant medaka Pkd2 with the C-terminal deleted by the EF-1α-A promoter, which is a peptide chain elongation factor promoter, was overexpressed at the early embryonic stage. As a result, it was considered that a cyst was formed in the pronephros, and the deletion mutant protein worked as a dominant negative mutant, resulting in a phenotype equivalent to that of the knockout animal. In addition to renal cysts, cardiac inversion and flexion were also recognized as transient deletion mutant gene expression phenotypes. About 0.5% of wild-type medakas have cardiac inversions, but in transient expression experiments, 6% of eggs that were micro-injected with Pkd2 deletion mutants and showed fluorescence showed heart inversions. . Human ADPKD does not show heart inversion, but Pkd2 knockout mouse homozygotes show heart inversion in 33%. This is because polycystin-2 is involved in the determination of the left and right axis in early embryos, and it is thought that cardiac inversion occurs when its function is inhibited. Therefore, the inversion of the heart was observed in the early embryos of the medaka that was transiently expressed but introduced the mutant Pkd2. The possibility that the Pkd2 deletion mutant inhibited wild-type Pkd2 through a dominant negative mechanism. Was strongly suggested.
躯幹の屈曲については、野生型では孵化した稚魚の0.5%に認められるが、Pkd1欠失変異体導入では蛍光を認めた卵のうち13%、Pkd2欠失変異体導入では33%に躯幹屈曲が認められた。micro-injection自体の影響でも屈曲が生じる可能性も考えられたが、本実験においては屈曲のある稚魚にのみ腎嚢胞を認めた。Morpholino anti-sense oligonucleotideによりInvsやPkd2の遺伝子発現をノックダウンさせたゼブラフィッシュや腎嚢胞を持つ多くのゼブラフィッシュの変異体においても腎嚢胞とともに屈曲も表現型として出現することが報告されており、腎嚢胞と屈曲の関連性が示唆された。 Stem flexion is observed in 0.5% of hatched fry in the wild type, but in 13% of eggs that showed fluorescence when the Pkd1 deletion mutant was introduced, and 33% when the Pkd2 deletion mutant was introduced. Admitted. Although it was considered that bending could occur due to the effect of the micro-injection itself, renal cysts were observed only in bent fry in this experiment. In zebrafish and many zebrafish mutants with kidney cysts that have knocked down Invs or Pkd2 gene expression by Morpholino anti-sense oligonucleotide, it has been reported that flexion appears as a phenotype along with kidney cysts. The relationship between renal cyst and flexion was suggested.
もう1つ特記すべきことは、micro-injection後に半数以上が孵化せず死滅したことである。Pkd1ならびにPkd2ノックアウトマウスのホモ接合体ではそのほとんどが胎性致死となるが、胎生期に既に腎実質をほとんど認めないような多発性嚢胞腎を有している。欠失変異体導入メダカに関しても、胚生期に変異体が過剰発現した場合に腎嚢胞はできるものの胚性致死となり孵化できなかった可能性が考えられた。胚性致死を免れ、孵化したメダカではむしろ欠失変異体遺伝子発現が十分でなく、嚢胞形成も少なかったとも考えられた。 Another thing to note is that more than half of them died without hatching after micro-injection. Most of the homozygotes of Pkd1 and Pkd2 knockout mice are fetally lethal, but have multiple cystic kidneys in which almost no renal parenchyma is observed in the embryonic period. It was also possible that the deletion mutant-introduced medaka could not be hatched due to embryonic lethality when the mutant was overexpressed during embryogenesis, but a kidney cyst was formed. The medaka that had escaped embryonic lethality and was hatched would rather have insufficient mutant mutant gene expression and less cyst formation.
このようにPkd1およびPkd2の欠失変異体の遺伝子導入では、腎嚢胞ができるほど十分量を導入されると屈曲及び致死を起こす可能性があり、何らかの発現調節可能な系統化されたトランスジェニックメダカの作成が必要であると考えられた。このため、EF-1α-Aプロモーターにより構成的に導入遺伝子を発現する系統以外にも、Tet-On/Off誘導系を用いて、ドキシサイクリンを投与することにより遺伝子発現を調節する系統も作成し、さらなる検討を行った。 In this way, gene transfer of Pkd1 and Pkd2 deletion mutants may cause bending and lethality when a sufficient amount of kidney cysts is introduced, and systematic transgenic medaka that can regulate some expression. Was considered necessary. For this reason, in addition to the strain that expresses the transgene constitutively by the EF-1α-A promoter, a strain that regulates gene expression by administering doxycycline using the Tet-On / Off induction system is also created, Further study was conducted.
（トランスジェニックメダカ系統の確立）
本実施例では、一過性発現実験から得られた成魚から、PCR法にて導入遺伝子が導入された個体を特定し、この個体を野生型との交配、さらに遺伝子導入が確認された個体と野生型との交配によってF1世代を取得し、さらにF2世代を取得した。
(Establishment of transgenic medaka lines)
In this example, from an adult fish obtained from a transient expression experiment, an individual into which a transgene was introduced by a PCR method was identified, and this individual was crossed with a wild type, and an individual in which gene introduction was further confirmed. F1 generation was acquired by crossing with the wild type, and F2 generation was further acquired.
（系統化及びジェノタイピング）
micro-injection後の卵から孵化した稚魚を2〜3ヵ月飼育し、成魚となった後、尾びれより以下の方法でDNAを抽出し、以下の表４に示すPCR法にて導入遺伝子が導入された個体を特定した。なお、表４には、ゲノタイピングに用いられるPCRプライマー（配列番号５〜配列番号１４）を示す。mep1-B1FとGFP3の組は、EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN系統も検出する。P2HindFとGFP3の組は、EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP系統も検出する。
After larvae hatched from eggs after micro-injection were raised for 2-3 months and became adults, DNA was extracted from the tail fin by the following method, and the transgene was introduced by the PCR method shown in Table 4 below. Identified individuals. Table 4 shows PCR primers (SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 14) used for genotyping. The combination of mep1-B1F and GFP3 also detects the EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN line. The P2HindF and GFP3 pair also detects the EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP strain.
lysis buffer(10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 0.3% Tween20, 1mM EDTA) 50μl中に、メダカ成魚の尾びれを入れた。95℃、10分加熱後、ProteinaseK(20mg/ml)を2.5μlを加え、55℃で一晩加熱した。翌日、95℃、10分加熱し、蒸留水で5倍希釈した。このうちの1μｌをPCRに使用した。 The tail fin of an adult medaka fish was placed in 50 μl of lysis buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.3% Tween20, 1 mM EDTA). After heating at 95 ° C. for 10 minutes, 2.5 μl of Proteinase K (20 mg / ml) was added and heated at 55 ° C. overnight. The next day, the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes and diluted 5-fold with distilled water. 1 μl of this was used for PCR.
魚類はモザイク状に遺伝子が組み込まれるため、この個体と野生型を交配し、その受精卵のDNAを用いてPCR法で生殖細胞に導入遺伝子が導入された個体をさらに特定した。この個体と野生型との交配で得られたF1世代が、全細胞に導入遺伝子が組み込まれた個体となった。魚類では、F1世代においても、導入遺伝子の挿入部位とコピー数がそれぞれの個体で異なることがあることが知られており、さらにF1世代より1匹を選択し、野生型と交配した。これにより得られたF2世代以降がメンデルの法則に従う遺伝様式をもち系統の確立となった。結果を表５に示す。 Since the fish has a mosaic gene integration, this individual was bred with the wild type, and the individual into which the transgene was introduced into the germ cells was further identified by PCR using the DNA of the fertilized egg. The F1 generation obtained by crossing this individual with the wild type became an individual in which the transgene was integrated into all cells. In fish, it is known that the insertion site and copy number of the transgene may be different for each individual even in the F1 generation, and one animal was selected from the F1 generation and mated with the wild type. As a result, the F2 generation and subsequent generations have inherited patterns according to Mendel's law, resulting in the establishment of strains. The results are shown in Table 5.
なお、表５には、micro-injection法により遺伝子導入し、導入遺伝子が生殖細胞に組み込まれたトランスジェニックメダカの数の一覧を示す。ただし、体細胞遺伝子陽性；尾びれを用いたゲノタイピングにより導入遺伝子が陽性であった個体数、生殖細胞遺伝子陽性；さらにそれらの個体を野生型と交配し,得られた受精卵のゲノタイピングが陽性であった個体数である。
（結果）
表５に示すように、欠失変異体の遺伝子導入では、屈曲及び致死の可能性があり、発現調節可能な系統を作るためTet-On/Off誘導系を用いた。Tet-On/Off系統については、転写因子を持つ系統と誘導される遺伝子を持つ系統をそれぞれ確立したのち、これらを交配させることにより得た。Tet-On誘導系で使用される転写因子rtTAを持つメダカとして、EF-1α-A-rtTA系統が1系統、Tet-Off誘導系のための転写因子tTAを持つ系統としてEF-1α-A-tTA系統が3系統確立された。
(result)
As shown in Table 5, the Tet-On / Off induction system was used to create a strain that can be bent and lethal in gene transfer of a deletion mutant and can regulate expression. Tet-On / Off strains were obtained by establishing a strain with a transcription factor and a strain with an induced gene, respectively, and then mating them. One EF-1α-A-rtTA strain as a medaka with the transcription factor rtTA used in the Tet-On induction system, and EF-1α-A- as a strain with the transcription factor tTA for the Tet-Off induction system Three tTA lines were established.
(1)Pkd1ΔNを持つ系統
Tet-On/Off誘導系の応答遺伝子をもつメダカとして、TRE2-EGFP-Pkd1ΔN系統が3系統、作成された。サザンブロットの結果からコピー数の最も多いno.7系統を選択し、EF-1α-A-tTA no.6系統と交配し、Tet-Off EGFP-Pkd1ΔN系統とした。さらに誘導系を介さず、導入遺伝子を発現する系統として、EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN系統が2系統、得られた。
(1) System with Pkd1ΔN
Three TRE2-EGFP-Pkd1ΔN strains were created as medakas with Tet-On / Off induction system response genes. The no.7 strain with the highest copy number was selected from the Southern blot results and crossed with the EF-1α-A-tTA no.6 strain to obtain a Tet-Off EGFP-Pkd1ΔN strain. Furthermore, two lines of EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN were obtained as lines expressing the transgene without involving the induction system.
(2)Pkd2ΔCを持つ系統
Tet-On/Off誘導系の応答遺伝子をもつメダカとして、TRE2-Pkd2ΔC-EGFP系統が2系統、作成された。サザンブロットの結果からコピー数の最も多いno.17系統を選択し、EF-1α-A-rtTA 系統と交配し、Tet-On Pkd2ΔC-EGFP系統とした。構成的に導入遺伝子を発現する系統として、EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP系統が5系統、得られた。
(2) System with Pkd2ΔC
Two strains of TRE2-Pkd2ΔC-EGFP were created as medakas with Tet-On / Off induction system response genes. The no.17 strain with the highest copy number was selected from the Southern blot results and crossed with the EF-1α-A-rtTA strain to obtain the Tet-On Pkd2ΔC-EGFP strain. Five strains of EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP were obtained as constitutively expressing transgenes.
（サザンブロッティングによる導入遺伝子の確認とコピー数の概算）
本実施例では、系統化された個体よりゲノムを抽出しDIG-サザンブロッティング法により、導入遺伝子の全長が組み込まれたことを確認するとともに、そのコピー数を概算した。ポジティブコントロールとして、それぞれの系統を作るために使用されたプラスミドコンストラクトを濃度を調整して使用した。
(Transgene confirmation by Southern blotting and copy number estimation)
In this example, genomes were extracted from the systematized individuals, and it was confirmed by the DIG-Southern blotting method that the full length of the transgene was integrated, and the copy number was estimated. As a positive control, the plasmid construct used to make each strain was used with the concentration adjusted.
（ゲノム抽出）
lysis buffer(50mM Tris-HCl,20mM EDTA, 100mM NaCl) 5ml中に、メダカ成魚全個体をいれ、ホモジナイズした。その後、10%SDS 250μl、ProteinaseK(20mg/ml) 125μlを加え、55℃で一晩加熱した。翌日、3000rpm、室温、5分遠心し上清のみを別のチューブに移し、5M NaClを1.25ml加え、氷上に15分置いた。3000rpm、室温、5分遠心し、上清を別のチューブに移し、蒸留水を2ml加え、再度、3000rpm、室温、15分遠心した。上清のみ別のチューブに移し、0.8倍容量のイソプロパノールを加え、DNAのひも状の沈殿を作った。沈殿をエッペンチューブに移し、70%エタノールでリンスしTE 200μlに溶解したあと、RNase(10mg/ml)2μlを加え37℃、1時間加熱した。フェノール・クロロホルム処理を2回行った後、エタノール沈殿を行い、TE 200μlに溶解した。
(Genome extraction)
All medaka adult fish were placed in 5 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl) and homogenized. Thereafter, 250 μl of 10% SDS and 125 μl of Proteinase K (20 mg / ml) were added and heated at 55 ° C. overnight. The next day, the mixture was centrifuged at 3000 rpm and room temperature for 5 minutes, and only the supernatant was transferred to another tube. 1.25 ml of 5M NaCl was added and placed on ice for 15 minutes. The mixture was centrifuged at 3000 rpm and room temperature for 5 minutes, the supernatant was transferred to another tube, 2 ml of distilled water was added, and the mixture was centrifuged again at 3000 rpm and room temperature for 15 minutes. Only the supernatant was transferred to another tube, and 0.8 times the volume of isopropanol was added to form a DNA string-like precipitate. The precipitate was transferred to an Eppendorf tube, rinsed with 70% ethanol, dissolved in 200 μl of TE, added with 2 μl of RNase (10 mg / ml), and heated at 37 ° C. for 1 hour. After phenol / chloroform treatment twice, ethanol precipitation was performed and dissolved in 200 μl of TE.
（サザンブロッティング(DIG法)）
上記方法にてメダカ全個体よりゲノムを抽出し、それぞれ8μgを使用した。EGFP-Pkd1ΔNを持つ系統はゲノムをEcoRI/BglIIで切断し、Pkd2ΔC-EGFPを持つ系統はBamHIで切断した。メダカPkd1に対するDIG-dUTP（Roche, Basel, Basel-Stadt, Switzerland）で標識されたプローブは、エクソン56を目標にコンストラクトEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔNをテンプレートにプライマー5'-GCTCATCCTCCACCAGTGAC-3'（配列番号１５）と5'-CCCTCCCTCTCTGAAAGGTT-3'（配列番号１６）を使用し PCR法を用い作成した。メダカPkd2に対するプローブはエクソン1を目標にコンストラクトEF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFPをテンプレートにプライマー5'-CTGATGTTTTGCGCTTTGTC-3'（配列番号１７）と5'-GGGATGCTCGTGTCTGTCTT-3'（配列番号１８）を用いPCR法で作成した。
(Southern blotting (DIG method))
The genome was extracted from all medaka individuals by the above method, and 8 μg was used for each. In the line with EGFP-Pkd1ΔN, the genome was cut with EcoRI / BglII, and the line with Pkd2ΔC-EGFP was cut with BamHI. The probe labeled with DIG-dUTP (Roche, Basel, Basel-Stadt, Switzerland) against medaka Pkd1 is a primer 5'-GCTCATCCTCCACCAGTGAC-3 'using the construct EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN as a template targeting exon 56 (SEQ ID NO: 15) and 5′-CCCTCCCTCTCTGAAAGGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 16) were used to prepare the PCR method. The probe for medaka Pkd2 is the primer 5'-CTGATGTTTTGCGCTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 17) and 5'-GGGATGCTCGTGTCTGTCTT-3' (SEQ ID NO: 18) using the construct EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP as a template for exon 1. The PCR method was used.
標準的なプロトコールに従い、アルカリトランスファー法でポジティブチャージナイロンメンブレン(Hybond N+;GE healthcare Bio-Science Corp, Piscataway, New Jersey, USA)に転写した。化学発光基質に、CDP-star（Roche）を用い、現像はCCDカメラ(Cool saver;アトー、東京、日本)で行った。結果を、図５に示す。 Transfer to a positively charged nylon membrane (Hybond N +; GE healthcare Bio-Science Corp, Piscataway, New Jersey, USA) by an alkaline transfer method according to a standard protocol. CDP-star (Roche) was used as a chemiluminescent substrate, and development was performed with a CCD camera (Cool saver; Atou, Tokyo, Japan). The results are shown in FIG.
（結果）
(1)Pkd1ΔNを持つ系統
TRE2-EGFP-Pkd1ΔN系統及びEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN系統のサザンブロッティングを行った。計算上、プラスミド100pgが1コピーに相当した。それぞれの系統の中でもっともコピー数が多いものは、EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1系統のおよそ10コピー(図5A)、TRE2-EGFP-Pkd1ΔN no.7系統のおよそ10コピー（図5B）であると概算された。
(result)
(1) System with Pkd1ΔN
Southern blotting of TRE2-EGFP-Pkd1ΔN line and EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN line was performed. In calculation, 100 pg of plasmid corresponded to 1 copy. The highest number of copies in each strain is approximately 10 copies of the EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1 strain (FIG. 5A), and approximately 10 copies of the TRE2-EGFP-Pkd1ΔN no.7 strain ( Figure 5B).
(2)Pkd2ΔCを持つ系統
TRE2-Pkd2ΔC−EGFP系統及びEF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP系統のサザンブロッティングを行った。TRE2-Pkd2ΔC-EGFP no.17系統とno.24系統はともに10コピー未満であると概算された(図5C)。EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP系統の中では no.7及びno.12系統が10コピー以上あり、多くのコピー数があると考えられた(図5D)。
(2) System with Pkd2ΔC
Southern blotting of TRE2-Pkd2ΔC-EGFP strain and EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP strain was performed. Both TRE2-Pkd2ΔC-EGFP no.17 and no.24 lines were estimated to be less than 10 copies (FIG. 5C). Among the EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP lines, the no.7 and no.12 lines had 10 copies or more, and it was considered that there were many copy numbers (FIG. 5D).
（RT-PCRによる発現の確認）
本実施例では、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子が発現しているか、導入遺伝子固有のプライマーを用いてRT-PCRで確認した。
(Confirmation of expression by RT-PCR)
In this example, it was confirmed by RT-PCR that the transgene integrated in the genome was expressed using primers specific to the transgene.
メダカ肝および腎を摘出し、RNAlater(QIAGEN, Hilden, North Rhine-Westphalia, Germany)中に保存した。RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いてキット添付のプロトコールに従いシリカメンブレン上でのRNase-free DNase I(QIAGEN)処理を追加して、total RNAを抽出した。さらにDNase I （Invitrogen, Carlsbad, California, USA）処理を行い、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿後、RNA濃度を1μg/μlに調整した。このtotal RNA 1μlをテンプレートにランダムヘキサマーを用いてSuperScriptIII Reverse Transcriptase（Invitrogen）で逆転写を行いcDNAを得た。RNase（SIGMA, Saint Louis, Missouri, USA）処理を行ったあと、このcDNAをテンプレートに、Pkd1ΔNの発現については、mep-1B1Fプライマー及びGFP3プライマー(表４)を用い、Pkd2ΔCはP2HindFプライマー及びGFP3プライマー(表４)を用いてPCR反応を行った。ネガティブコントロールとして、逆転写前のRNAを用いて同じ条件でPCR反応を行った。PCR条件は、Ex Taq(タカラバイオ)を用い、熱変性94℃、30秒、アニール温度60℃、30秒、伸長反応72℃、1分を35サイクル行った。結果を図６に示す。 Medaka liver and kidney were excised and stored in RNAlater (QIAGEN, Hilden, North Rhine-Westphalia, Germany). Total RNA was extracted using RNeasy mini kit (QIAGEN) by adding RNase-free DNase I (QIAGEN) treatment on a silica membrane according to the protocol attached to the kit. Further, DNase I (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) treatment was performed, and after phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation, the RNA concentration was adjusted to 1 μg / μl. Using 1 μl of this total RNA as a template, cDNA was obtained by reverse transcription with SuperScriptIII Reverse Transcriptase (Invitrogen) using a random hexamer. After RNase (SIGMA, Saint Louis, Missouri, USA) treatment, using this cDNA as a template, for expression of Pkd1ΔN, mep-1B1F primer and GFP3 primer (Table 4) were used, and Pkd2ΔC was P2HindF primer and GFP3 primer PCR reaction was performed using (Table 4). As a negative control, PCR reaction was performed under the same conditions using RNA before reverse transcription. As PCR conditions, Ex Taq (Takara Bio) was used, and heat denaturation 94 ° C., 30 seconds, annealing temperature 60 ° C., 30 seconds, extension reaction 72 ° C., 1 minute, 35 cycles. The results are shown in FIG.
（結果）
(1)Pkd1ΔNを持つ系統
EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1系統の肝および腎のRT-PCRにおいて、逆転写酵素を添加した場合にのみ目的とする730bpのバンドを認めた(図6A)。
(2)Pkd2ΔCを持つ系統
EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP no.12系統の肝および腎のRT-PCRにおいて、逆転写酵素を添加した場合にのみ目的とする657bpのバンドを認めた(図6B)。
(result)
(1) System with Pkd1ΔN
In the EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1 liver and kidney RT-PCR, a target 730 bp band was observed only when reverse transcriptase was added (FIG. 6A).
(2) System with Pkd2ΔC
In the EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP no.12 liver and kidney RT-PCR, a target 657 bp band was observed only when reverse transcriptase was added (FIG. 6B).
（ウエスタンブロッティングによる転写因子rtTA及びtTAの確認）
メダカ肝をRIPAバッファー中でホモジェナイズし、10%SDS PAGEゲルを用いて電気泳動した。ウェット型のブロッティング装置でPVDF膜(Immobilon-P;Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)にブロッティングした。1次抗体に抗VP16抗体（SIGMA）5000倍希釈、2次抗体にHRP-Goat Anti-Rabbit IgG抗体(H+L)(Zymed, San Francisco, California, USA)20000倍希釈を用いた。化学発光基質にImmobilon Western(Millipore)を用い、CCDカメラ(Cool saver;アトー)で現像した。結果を図７に示す。
(Confirmation of transcription factors rtTA and tTA by Western blotting)
Medaka liver was homogenized in RIPA buffer and electrophoresed using a 10% SDS PAGE gel. Blotting was performed on PVDF membrane (Immobilon-P; Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) with a wet type blotting apparatus. Anti-VP16 antibody (SIGMA) was diluted 5000 times as the primary antibody, and HRP-Goat Anti-Rabbit IgG antibody (H + L) (Zymed, San Francisco, California, USA) was diluted 20000 times as the secondary antibody. Immobilon Western (Millipore) was used as a chemiluminescent substrate and developed with a CCD camera (Cool saver; Ato). The results are shown in FIG.
転写因子rtTA及びtTAにあるVP16 transcription active domain に対する抗体（抗VP16抗体）を用いたウエスタンブロッティングにより、EF-1α-A-rtTA系統及びEF-1α-A-tTA no.6系統が37kDaの目的蛋白質を発現していることを確認した(図7A,図7B)。 The target protein of 37 kDa in the EF-1α-A-rtTA and EF-1α-A-tTA no.6 strains by Western blotting using an antibody against the VP16 transcription active domain in the transcription factors rtTA and tTA (anti-VP16 antibody) Was confirmed to be expressed (FIGS. 7A and 7B).
（系統化したトランスジェニックメダカの組織切片）
本実施例では、稚魚及び成魚をブアン固定後、パラフィンに包埋した。ミクロトームを用いて連続切片を作成し、HE染色を行った。
(Tissue section of a transgenic medaka)
In this example, the juvenile fish and adult fish were fixed in bud and then embedded in paraffin. Serial sections were prepared using a microtome, and HE staining was performed.
トランスジェニックメダカを飼育し、定期的に組織切片を作成し、腎嚢胞を検索した。結果を図８及び図９に示す。 Transgenic medaka was bred, tissue sections were periodically prepared, and renal cysts were searched. The results are shown in FIGS.
（結果）
(1)Pkd1ΔNを持つ系統
コピー数が多いと考えられたEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1系統のヘテロ接合体の成魚の組織検索では5ヵ月の時点では、腎嚢胞を認めなかった。Tet-Off EGFP-Pkd1ΔN系統は、ドキシサイクリンがなければ最大活性で導入遺伝子が発現するはずだが、6ヵ月後の成魚の組織切片では腎嚢胞は認めなかった。
(result)
(1) Tissue search of adult EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN no.1 heterozygous fish, which was thought to have a large number of copies with Pkd1ΔN, showed no renal cysts at 5 months . The Tet-Off EGFP-Pkd1ΔN line should express the transgene with maximum activity without doxycycline, but no kidney cysts were found in tissue sections of adult fish 6 months later.
以上のことから、メダカPkd1ΔN変異については以下のようにまとめることができる。すなわち、メダカPkd1のN末端欠失変異体を受精卵にmicro-injection法で遺伝子導入したところ、稚魚に腎嚢胞、躯幹屈曲を認めた。メダカPkd1のN末端欠失変異体を遺伝子導入し系統化したが、腎嚢胞は認めなかった。 From the above, the medaka Pkd1ΔN mutation can be summarized as follows. That is, when an N-terminal deletion mutant of medaka Pkd1 was introduced into a fertilized egg by the micro-injection method, kidney cysts and trunk trunk flexion were observed in the fry. N-terminal deletion mutant of medaka Pkd1 was introduced and systematized, but no renal cyst was observed.
(2)Pkd2ΔCを持つ系統
EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP no.12系統を7ヵ月飼育した後、ヘテロ接合体の組織切片を作成し検鏡した。両腎に数個の中等度の腎嚢胞を認めた(図8A,8B,8C,8D)。また、Tet-On Pkd2ΔC-EGFP系統をドキシサイクリン10μg/mlに4ヵ月曝露した後、転写因子rtTAと応答遺伝子TRE2-Pkd2ΔC-EGFPがともにヘテロ接合体である個体の組織切片を検鏡したところ、片腎に数個の腎嚢胞を認めた(図9A,9B,9C)。
(2) System with Pkd2ΔC
After breeding EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP no.12 line for 7 months, a tissue section of heterozygote was prepared and microscopically examined. Several moderate renal cysts were found in both kidneys (FIGS. 8A, 8B, 8C, 8D). In addition, after exposing the Tet-On Pkd2ΔC-EGFP strain to doxycycline at 10 μg / ml for 4 months, a microscopic examination of a tissue section of an individual in which both the transcription factor rtTA and the response gene TRE2-Pkd2ΔC-EGFP are heterozygotes was performed. Several renal cysts were found in the kidney (FIGS. 9A, 9B, 9C).
以上のことから、メダカPkd2ΔC変異については以下のようにまとめることができる。すなわちメダカPkd2のC末端欠失変異体を受精卵にmicro-injection法で遺伝子導入したところ、稚魚に腎嚢胞、心臓逆位、躯幹屈曲を認めた。また、メダカPkd2のC末端欠失変異体を用いて腎嚢胞を形成するトランスジェニックメダカを系統化できた。 Based on the above, the medaka Pkd2ΔC mutation can be summarized as follows. In other words, when a C-terminal deletion mutant of medaka Pkd2 was introduced into fertilized eggs using the micro-injection method, kidney cysts, heart inversion, and trunk flexion were observed in the fry. In addition, a transgenic medaka that forms a renal cyst could be systematized using a medaka Pkd2 C-terminal deletion mutant.
（まとめ）
メダカでは導入遺伝子がモザイク状に組み込まれるため、生殖細胞に入る確率が10%と低い。しかし採卵が容易であることから多数の受精卵にmicro-injectionすることができ、手技に習熟すれば総じてマウスよりも容易にトランスジェニックメダカを作成することが可能である。系統化されたトランスジェニックメダカは全細胞で導入遺伝子が発現する。しかし一過性実験に比べてゲノムに組み込まれた遺伝子の発現量は減少している。micro-injectionされた導入遺伝子の数%のみがゲノムに組み込まれ、さらにその発現はゲノム上の挿入位置により影響を受ける。本実験でも、一過性発現実験ではタグとして用いたEGFPの蛍光を実体顕微鏡下に認めることができたが、系統化されたトランスジェニックメダカでは蛍光を肉眼的に確認することは不可能であり、発現量の差によるものと考えられた。
(Summary)
In medaka, the transgene is integrated in a mosaic pattern, so the probability of entering a germ cell is as low as 10%. However, since egg collection is easy, it is possible to micro-injection into a large number of fertilized eggs, and it is possible to produce transgenic medakas more easily than mice as a whole if they are proficient in the technique. Transgenic medakas that are systematized express the transgene in all cells. However, the expression level of the gene integrated into the genome is reduced compared to the transient experiment. Only a few percent of the micro-injected transgene is integrated into the genome, and its expression is also affected by the insertion position on the genome. In this experiment as well, in the transient expression experiment, the fluorescence of EGFP used as a tag could be observed under a stereomicroscope, but it was impossible to visually confirm the fluorescence with a systematic transgenic medaka. This was thought to be due to the difference in the expression level.
系統化されたトランスジェニックメダカの組織学的検討を行った。 Pkd1 N末端欠失変異体を導入したEF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN系統では腎嚢胞を形成するメダカを認めなかった。腎嚢胞ができるほど欠失変異体が発現したメダカは致死となり、系統化できたものは発現量が少ない可能性が考えられた。このため、転写因子tTAを持つ系統と、応答遺伝子TRE2-EGFP-Pkd1ΔNを持つ系統をそれぞれつくり、この2系統を交配させてTet-Off誘導系によりPkd1のN末端欠失変異体を発現させたが、EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN系統と同様に腎嚢胞や屈曲などの表現型は認められなかった。Pkd1については、ゼブラフィッシュでヒトPKD1のC末端mRNAを卵にmicro-injectionし過剰発現させることによって腎嚢胞を形成することが示されており[25][26]、本実験の一過性発現実験で認めた表現型は、ドミナントネガティブ効果による野生型Pkd1の阻害によるものではなく、C末端の過剰発現による可能性も考えられた。いずれにしても、系統化されたPkd1変異メダカにおいては欠失変異体の発現量が十分でなく、嚢胞形成を認めなかったことが推察された。 A histological study of systematic transgenic medaka was performed. In the EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN line introduced with the Pkd1 N-terminal deletion mutant, no medaka that forms a renal cyst was observed. The medaka in which the deletion mutant was expressed to the extent that a kidney cyst was formed was lethal. Therefore, a line with the transcription factor tTA and a line with the response gene TRE2-EGFP-Pkd1ΔN were created, and these two lines were crossed to express the N-terminal deletion mutant of Pkd1 by the Tet-Off induction system. However, similar to the EF-1α-A-EGFP-Pkd1ΔN strain, phenotypes such as renal cysts and flexion were not observed. Pkd1 has been shown to form renal cysts by micro-injection and overexpression of human PKD1 C-terminal mRNA in eggs in zebrafish [25] [26]. The phenotype observed in the experiment was not due to the inhibition of wild-type Pkd1 due to the dominant negative effect, but could be due to overexpression of the C-terminus. In any case, it was speculated that the expression level of the deletion mutant was not sufficient in the systematic Pkd1 mutant medaka and cyst formation was not observed.
一方、Tet-On誘導系を用いたTet-On Pkd2ΔC-EGFP系統は10μg/mlの濃度のドキシサイクリンに曝露し続けて、4ヵ月後に腎嚢胞を形成する個体が出現した。構成的に導入遺伝子を発現したEF-1α-A−Pkd2ΔC-EGFP系統も、当初の仮説に反して遺伝子の発現により致死となることもなく系統化できた。最もコピー数の多いと考えられたno.12系統は7ヵ月後に腎嚢胞を形成したが、腎嚢胞の数は少なかった。他のコピー数の少ない系統は7ヵ月たっても腎嚢胞はできず、欠失変異体がドミナントネガティブ変異体として機能するには十分な発現量が必要であると考えられた。多量に変異体を発現させた一過性実験では稚魚の段階で腎嚢胞を認めているのに対して、系統化したメダカでは嚢胞形成に数ヵ月を要していることから、変異体の発現量が少ないほど、嚢胞形成に要する時間は長くなるものと推察された。また両系統ともに一過性実験で認められた躯幹屈曲や心臓逆位は認めなかった。このことはむしろ腎嚢胞のみを形成するモデルとしては好都合である。躯幹屈曲や心臓逆位が認められない程度に欠失変異体の発現量を増加させることにより、早期に嚢胞が発生し、また嚢胞発生頻度も多くなることが期待され、ヒトADPKDの表現型により近づくことが期待される。 On the other hand, the Tet-On Pkd2ΔC-EGFP line using the Tet-On induction system continued to be exposed to doxycycline at a concentration of 10 μg / ml, and individuals that formed renal cysts appeared 4 months later. The EF-1α-A-Pkd2ΔC-EGFP strain that constitutively expressed the transgene could also be systematized without being lethal due to gene expression, contrary to the original hypothesis. The no.12 line, which was considered to have the highest copy number, formed a renal cyst after 7 months, but the number of renal cysts was small. The other low-copy-number lines did not form renal cysts even after 7 months, and sufficient expression was considered necessary for the deletion mutant to function as a dominant negative mutant. In transient experiments in which a large amount of mutants were expressed, renal cysts were observed at the stage of fry, whereas in medakas that were systematized, it took several months to form cysts. It was assumed that the smaller the amount, the longer the time required for cyst formation. Neither trunk flexion nor cardiac inversion was observed in both strains. This is rather convenient as a model for forming only a renal cyst. Increasing the expression level of deletion mutants to the extent that trunk flexion or cardiac inversion is not observed is expected to cause early cysts and an increased frequency of cysts, depending on the phenotype of human ADPKD. Expected to approach.
以上のことから、Pkd1 N末端欠失変異体導入トランスジェニックメダカでは表現型が得られなかったが、Pkd2 C末端欠失変異体導入トランスジェニックメダカでは,十分な発現量があればドミナントネガティブ変異体として機能し腎嚢胞を形成できることがわかった。また、Pkd2欠失変異体導入トランスジェニックメダカが、嚢胞形成における薬剤曝露試験において有効な新たなモデル動物となることがわかった。 From the above, Pkd1 N-terminal deletion mutant-introduced transgenic medaka did not obtain a phenotype, but Pkd2 C-terminal deletion mutant-introduced transgenic medaka had a dominant negative mutant with sufficient expression. It was found that it can function as a renal cyst. It was also found that transgenic medaka transgenic for Pkd2 deletion mutant is a new model animal that is effective in drug exposure tests for cyst formation.
配列番号５〜１８：プライマー Sequence number 5-18: Primer
Claims (8)
前記小型魚類は、ゼブラフィッシュ、メダカ、金魚、ドジョウ、トラフグ及びニジマスからなる群から選択され、
ドミナントネガティブ効果を発現可能に前記小型魚類と同種魚類由来のPKD2遺伝子がコードするタンパク質のＣ末端側の欠損を生じさせる欠失変異を有する外来性の変異遺伝子を保持する、モデル小型魚類。 A polycystic kidney model small fish,
The small fish is selected from the group consisting of zebrafish, medaka, goldfish, loach, tiger puffer and rainbow trout,
A model small fish, which retains an exogenous mutant gene having a deletion mutation that causes a deletion on the C-terminal side of a protein encoded by a PKD2 gene derived from a fish of the same species as the small fish so that a dominant negative effect can be expressed.
請求項１〜３のいずれかに記載の多発性嚢胞腎モデル小型魚類にスクリーニング対象である外部因子を付与する工程と、
前記外部因子を付与した前記メダカにおける腎嚢胞の形成及び／又は進展に対する促進作用又は抑制作用を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。 A screening method for external factors associated with the formation or development of cystic kidneys , comprising:
A step of providing an external factor to be screened to the polycystic kidney model small fish according to any one of claims 1 to 3 ,
Evaluating the promoting or inhibiting action on the formation and / or progression of renal cysts in the medaka to which the external factor has been applied;
A screening method comprising:
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