JP2003506711A - 光学システムによる細胞の解析 - Google Patents

光学システムによる細胞の解析

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JP2003506711A JP2001515947A JP2001515947A JP2003506711A JP 2003506711 A JP2003506711 A JP 2003506711A JP 2001515947 A JP2001515947 A JP 2001515947A JP 2001515947 A JP2001515947 A JP 2001515947A JP 2003506711 A JP2003506711 A JP 2003506711A
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リチック ゴーシュ、
ロビン エル． デビアシオ、
プレム ジャナルダーン、
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  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経突起成長に特異的に影響するものについての非常に多数の化合物をスクリーニングする目的で、細胞における蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性を迅速に測定する細胞の光学系分析のためのシステム、方法、スクリーニング、試薬およびキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は薬物発見のための蛍光−ベースの細胞および分子生化学アッセイの分
野にある。
【０００２】 （背景技術） 相互参照 本出願は米国仮特許出願番号６０／１４７，４４３（１９９９年８月５日）、
６０／１７６，５８９（２０００年１月１８日）、６０／２０５，６９６（２０
００年５月１９日）、６０／１５１，７９７（１９９９年８月３１日）、６０／
１６８，４０８（１９９９年１２月１日）に対する優先権を主張し、１９９７年
２月２７に出願された米国出願Ｓ／Ｎ ０８／８１０９８３で、現在米国特許番
号５，９８９，８３５の一部継続出願である１９９８年２月２７日に出願された
出願番号０９／０３１，２７１の一部継続出願である１９９９年９月１７日に出
願された０９／３９８，９６５の一部継続出願であり、共有し、共に係属中の米
国特許出願番号０９／３８０，２５９（１９９８年２月２７日）、０９／３５２
，１７１（１９９９年７月１２日）、０９／５９８，３４７（２０００年６月２
１日）、０９／２９３，２０９（１９９９年４月１６日）、０９／２９３，２１
０（１９９９年４月１６日）、０９／３９８，９６５（１９９９年９月１７日）
、０９／４３０，６５６（１９９９年１０月２９日）、０９／５１３，７８３（
２０００年２月２５日）、そして０９／５６９，５０８（２０００年５月１２日
）に関連しており、全ての参照物は、ここに参照することでその全てを組込んで
いる。
【０００３】 当該分野で現在行われている薬物発見は、特異的病気標的の同定、特異的標的
に基づくアッセイの開発、このアッセイの有効化、スクリーニングを得るための
アッセイの最適化および自動化、「ヒット」を同定するためのアッセイを用いる
化合物ライブラリの高スループットスクリーニング、ヒット有効化およびヒット
化合物の最適化を含む長い複数工程のプロセスである。このプロセスの結果は、
前臨床および、有効化されれば、結局は臨床試験に至る先導的化合物である。こ
のプロセスにおいては、スクリーニング相はアッセイ開発相から区別され、生き
た生物学的系において化合物の効率をテストすることを含む。
【０００４】 歴史的には、薬物発見は遅くてコストがかかるプロセスであり、何年にもわた
り、創製された薬物あたり数億ドルを消費する。ゲノミックスおよび高スループ
ットスクリーニングの領域における開発の結果、評定の同定およびスクリーニン
グした化合物の容量の領域において能力および効率が増大した。自動ＤＮＡ配列
決定、ＰＣＲ適用、位置クローニング、ハイブリッド形成アッセイおよび生物情
報学におけるかなりの進歩は、潜在的薬物標的をコードする遺伝子（および遺伝
子断片）の数を大いに増加させた。しかしながら、薬物スクリーニングについて
の基本的なスキームは依然として同一である。
【０００５】 現行の方法およびプロトコルを用いる治療的介入のためのポイントとしてのゲ
ノム標的の有効化は、インビボ機能的モデル、組換えタンパク質の機能的分析、
および候補遺伝子の安定な細胞系発現等の、使用される遅い手動方法のため、薬
物発見プロセスにおいてネックとなった。自動配列決定を介して取得された一次
ＤＮＡ配列データは遺伝子機能の同定を可能としないが、公知の配列データベー
スと比較すると、共通の「モチーフ」および特異的遺伝子相同性についての情報
を提供することができる。減算ハイブリッド形成およびＲＡＤＥ（分別発現の迅
速増幅）等のゲノム方法を用いて、病気状態モデルで上方または下方調節される
遺伝子を同定することができる。しかしながら、同定および有効化は依然として
同一経路を進む。いくつかのプロテオミック方法は逆遺伝学と組み合わせてタン
パク質同定（全体的発現アレイ、２Ｄ電気泳動、コンビナトリアルライブラリ）
を用いて注目する候補遺伝子を同定する。無傷ｃＤＮＡとして単離されたそのよ
うな推定「病気関連配列」またはＤＡＳはこれらの方法に対して大きな利点があ
るが、それらは、コードされたタンパク質のタイプ、活性および分布に関するい
ずれの情報も提供する事なく多くのものによって同定される。薬物スクリーニン
グ標的としてのＤＡＳのサブセットの選択は「ランダム」であり、このように、
病気とのメカニズム的結合を提供するための機能的データなくして、極端に非効
率的である。従って、生物学的機能を達成するＤＡＳを迅速にスクリーニングし
、それにより、薬物発見における標的有効化および候補最適化を改良する新しい
技術を提供する必要がある。
【０００６】 初期の薬物発見の生産性を改良するには３つの主な道がある。まず、増大した
情報取り扱い能力を提供するツールに対する要望がある。生物情報学はＤＮＡ配
列決定システムの迅速な発展およびゲノミックスデータベースの進化で花咲いた
。ゲノミックスは潜在的新しい標的の同定で非常に重要な役割を果たし始めてい
る。プロテオミックスは、薬物相互作用を予測するためにタンパク質標的の構造
および機能を関連づけるのに不可欠なものとなった。しかしながら、生物学的複
雑性の次のレベルは細胞である。従って、細胞からの多次元情報を取得し、管理
しサーチする要望がある。第２に、より高いスループットツールに対する要望が
ある。ＤＮＡ配列決定および高スループット一次スクリーニングにおいてすでに
示されているように、自動化は生産性を改良する鍵である。本発明は、より高い
スループットのツールに対する要望を満足する細胞から複数パラメータ情報を抽
出する自動システムを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およ
びテスト化合物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大し
たスループットを可能とすることを提供する。
【０００７】 放射能は初期の薬物発見アッセイでは支配的な読み出し情報であった。しかし
ながら、より多い情報、より高いスループットおよび小型化に対する要望は、蛍
光検出の使用に向けてのシフトを引き起こした。蛍光−ベースの試薬は、スルー
プットおよび情報含有量が高いより強力な複数パラメータアッセイを生じさせる
ことができ、より低い容量の試薬およびテスト化合物を必要とする。また、蛍光
は放射能−ベースの方法よりも安全かつ安価である。
【０００８】 色素および蛍光試薬で処理した細胞のスクリーニングは当該分野でよく知られ
ている。レポータ分子としての修飾された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍
光タンパク質を生じる細胞の遺伝子工学に関連するかなり膨大な文献がある。野
生型ＧＦＰのいくつかの特性はモリス(Morise)ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１３（１９７４）２６５６−２６６２頁）およびワード(Ward)ら（Ｐｈｏｔｏｃ
ｈｅｍ，Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１（１９８０），６１１−６１５頁）によって
開示されている。オワンクラゲ(Aequorea Victoria)のＧＦＰは３９５ｎｍにお
ける励起最大および５１０ｎｍにおける発光最大を有し、蛍光活性に外因的因子
を要しない。文献に開示されたＧＦＰの使用は普及しており、細胞下小器官の可
視化（リゾット(Rizzuto)ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５），６
３５−６４２頁）、分泌経路に沿ったタンパク質輸送の可視化（ケーサー(Kaeth
er)およびゲルデス(Gerdes)，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５）
，２６７−２７１頁）、植物細胞（フー(Hu)およびチェン(Cheng)，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９（１９９５），３３１−３３４頁）およびショウジョウ
バエ胚（デービス(Davis)ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １７０（１９９５），
７２６−７２９頁）における発現のためのツールとして、および注目する別のタ
ンパク質に融合したレポータ分子として（米国特許第５，４９１，０８４号）、
遺伝子発現およびタンパク質位置決定（チャルフィー(Chalfie)ら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６３（１９９４），１２５０１−１２５０４頁）の研究を含む。同様に
、ＷＯ９６／２３８９８は、タンパク質キナーゼ活性化部位を有するＧＦＰ構築
体を利用することによる細胞内プロセスに影響する生物学的活性物質を検出する
方法に関する。この特許、および本出願で引用した全ての他の特許は参照してそ
の全体に組み込まれる。
【０００９】 多数の文献が生物学的系におけるＧＦＰタンパク質に関係する。例えば、ＷＯ
９６／０９５９８はＧＦＰ様タンパク質の発現を利用する注目する細胞を単離す
るためのシステムを説明する。ＷＯ９６／２７６７５は植物におけるＧＦＰの発
現を説明する。ＷＯ９５／２１１９１は、突然変異誘発を検出するための軽質転
換生物で発現された修飾ＧＦＰタンパク質を説明する。米国特許第５，４０１，
６２９号および第５，４３６，１２８号は、細胞表面受容体を発現し、細胞表面
受容体の活性に応答する転写調節要素を含むレポータ遺伝子構築体を含有する組
換え細胞を用いる細胞外シグナルの細胞内変換を検出し、評価するためのアッセ
イおよび組成物を説明する。
【００１０】 数千の化合物についてスクリーニングを行うには、多くの化合物および多くの
成分試薬の平行した取り扱いおよび処理を必要とする。標準的な高スループット
スクリーニング（「ＨＴＳ」）は、９６または３８４ウェルを備えた標準的なマ
イクロタイタープレート中のウェルのアレイに負荷されたいくつかのインジケー
タ化合物と共に化合物および生物学的試薬の混合物を用いる。各ウェルから測定
されたシグナル（蛍光または発光）、光学密度、または放射能はウェル中の全て
の物質からのシグナルを統合し、ウェル中の全ての分子の総じての集団平均を与
える。
【００１１】 サイエンス・アプリケーション・インターナショナル株式会社(Science Appli
cations International Corporation(SAIC))（１３０ ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕ
ｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ ９８１０９）はイメージングプレートリーダーを説
明する。このシステムはＣＣＤカメラを用いて、９６ウェルプレートの全領域を
イメージする。このイメージは解析され、ウェル中のすべての物質につきウェル
当たりの全蛍光が計算される。
【００１２】 モレキュラー・デバイス社(Molecular Devices, Inc.)（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ
，ＣＡ）は、標準的な９６ウェルプレート中のウェルの底部のほぼ２００ミクロ
ン内で選択的に蛍光を励起するのに低角レーザー走査照射およびマスクを用いて
、細胞単層をイメージする場合のバックグラウンドを低下させるシステム（ＦＬ
ＩＰＲ）を説明する。このシステムはＣＣＤカメラを用いてプレート底部の全領
域をイメージする。このシステムはウェルの底部の細胞単層に由来するシグナル
を測定するが、測定されたシグナルはウェルの領域にわたって平均化され、従っ
て、細胞の集団の平均的応答の測定であると依然として考えられる。イメージを
解析して、細胞−ベースのアッセイにつきウェル当たりの全蛍光を計算する。Ｆ
ＬＩＰＲシステム等の流体送達デバイスを細胞ベースのスクリーニングシステム
に取り込んで、応答を開始させ、次いで、これは、マクロ−イメージングシステ
ムを用いて全ウェル集団平均応答として観察される。
【００１３】 高スループットスクリーニングとは対照的に、細胞構成要素およびプロセスの
時間的−空間的動力学についてのより詳細な情報に対する必要性に対処するため
に、種々の高含有量スクリーニング（「ＨＣＳ」）が開発されている。高含有量
スクリーニングは、細胞に取り込まれた特異的蛍光−ベースの試薬に由来する多
色蛍光情報の抽出を自動化する（ジュリアノ(Giuliano)およびテーラー(Taylor)
（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：４、ジュリアノら（
１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２
４：４０５）。空間的、ならびに時間的動力学を測定することができる光学シス
テムを用いて細胞を分析する（ファーカス(Farkas)ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｈｙｓｏｌ．５５：７８５、ジュリアノら（１９９０）Ｉｎ Ｏｐｔｉｃ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ハーマン(B.Herman)お
よびジャコブソン(K.Jacobson)（編），５４３−５５７、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ハーン(Hahn)ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：７３
６、ワグナー(Waggoner)ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ。２７：４９４）
。この概念は、標識された構成要素の活性についての空間的および時間的情報を
有する「ウェル」として各細胞を処理することである。
【００１４】 今や、細胞に適用された蛍光−ベースの試薬を介して接近可能なタイプの生化
学的および分子的情報はイオン濃度、膜ポテンシャル、特異的移動、酵素活性、
遺伝子発現、ならびに代謝産物、タンパク質、脂質、炭水化物および核酸配列の
存在、量およびパターンを含む（デビアシオ(DeBiasio)ら（１９９６）Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：１２５９、ジュリアノら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５：ヘイム(Heim)
およびツシーン（Tsien），（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８）。
【００１５】 高含有量スクリーニングは、蛍光標識された抗体、生物学的リガンド、および
／または核酸ハイブリッド形成プローブを用いて固定細胞につき、あるいは多色
蛍光インジケータおよび「バイオセンサー」を用いて生細胞につき行うことがで
きる。固定もしくは生細胞スクリーニングの選択は、必要な特異的細胞−ベース
のアッセイに依存する。
【００１６】 固定細胞アッセイは最も単純である。なぜなら、マイクロタイタープレート様
式における最初に生きる細胞のアレイは、テストすべき種々の化合物および用量
で処理することができ、次いで、細胞は固定し、特異的試薬で標識し、測定する
ことができるからである。固定後に、細胞の環境の制御は必要でない。空間的情
報が取得されるが、１つの時点におけるのみである。細胞に適用することができ
る数千の抗体、リガンドおよび核酸ハイブリッド形成の利用可能性は、これを、
多くのタイプの細胞−ベースのスクリーニングに対する魅力的アプローチとする
。固定および標識工程は自動化することができ、アッセイの効果的処理を可能と
する。
【００１７】 生細胞アッセイはより技巧的かつ強力である。なぜなら、所望の試薬を含有す
る生細胞のアレイは時間、ならびに空間にわたってスクリーニングすることがで
きるからである。細胞の環境的制御（温度、湿度および二酸化炭素）が測定の間
に必要である。なぜなら、細胞の生理学的健康が、時間にわたっての複数蛍光測
定で維持されなければならないからである。細胞内での生化学的および分子的活
性の変化を報告することができる蛍光生理学的インジケータおよび「バイオセン
サー」の増大するリストがある（ジュリアノら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５、ハーンら（１９９
３）Ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ネーソン（W.T.Na
son）（編），３４９−３５９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ）。
【００１８】 蛍光−ベースの試薬の利用可能性および使用は、固定および生細胞高含有量ス
クリーニング双方の発達を進めるのを助けてきた。多色高含有量情報を自動的に
抽出するための装置化の進歩は、最近、ＨＣＳを自動ツールに開発するのを可能
とした。テーラーらによる論文（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ８０
（１９９２），３２２−３３５）は、これらの方法およびそれらの適用の多くを
説明する。例えば、プロフィット(Proffitt)ら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２４：２
０４−２１３（１９９６））は、種々の組織培養プレート様式、特に、９６−ウ
ェルマイクロタイタープレートウェルにおいて原位置で相対的細胞数を定量する
ための半自動蛍光デジタルイメージングシステムを説明する。このシステムは電
動段階を設けたエピ蛍光倒立顕微鏡、ビデオカメラ、イメージ増感剤、およびＰ
Ｃ−ビジョンデジタイザーを設けたマイクロコンピュータからなる。Ｔｕｒｂｏ
Ｐａｓｃａｌソフトウェアは段階を制御し、プレートを走査し、ウェル当たり
の複数のイメージを撮る。このソフトウェアはウェル当たりの全蛍光を計算し、
日キャリブレーションを提供し、種々の組織培養プレート様式につき容易に配置
を形成する。デジタルイメージの閾値設定および生細胞によって取られる場合の
み蛍光を発する試薬を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなくバックグラウ
ンド蛍光を減少させる。
【００１９】 走査共焦点顕微鏡イメージング（（ゴー(Go)）ら（１９９７）Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７：２１０−２１５、ゴールドマン(G
oldman)ら（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ２２１：３１１−３１９）および多光子顕微鏡イメージング（デンク(Denk)
ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７３、グラトン(Gratton)ら（１９９
４）Ｐｒｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１５４−１５５）もまた、顕微鏡試料の高分解能イメー
ジを取得するための良く確立された方法である。これらの光学系の主な利点は、
非常に浅い焦点深度であり、これは限定された軸方向の程度の特徴がバックグラ
ウンドに対して分解されることを可能とする。例えば、細胞表面の特徴から接着
性細胞の内部細胞質特徴を分解するのが可能である。走査多光子イメージングは
必要な高光子束を達成するのに非常に短い持続のパルスレーザー系が必要である
ので、蛍光の寿命もまたこれらの系で測定することができ（ラコウィッツ(Lakow
icz)ら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：３１６−３３０、ゲリ
ツセン(Gerrittsen)ら（１９９７），Ｊ．ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ７
：１１−１５）、異なる検出モードに対してさらなる能力を提供する。半導体レ
ーザーによるポンプドレーザー等の小さくて信頼ができかつ比較的安価なレーザ
ー系が、今日、多光子共焦点顕微鏡がかなり日常的に適用されるのを可能とする
ために入手できる。
【００２０】 集団における細胞の生物学的不均一性（ブライト(Bright)ら（１９８９），Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：４１０、ジュリアノ，（１９９６）Ｃｅ
ｌｌ Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌ．３５：２３７））ならびに細胞内に存在
する化学および分子情報の高い空間的および時間的頻度の組合せは、現存の全マ
イクロタイタープレートリーダーを用いて脂肪の集団から高含有量情報を抽出す
るのを不可能とする。個々に分析される細胞を用いる多色蛍光ベースのスクリー
ニングでは、高含有量スクリーニングプラットフォームでデザインされたものは
現存しない。同様に、特にマイクロタイタープレートで増殖した細胞からＨＣＳ
分析によって同定される細胞応答を誘導する能力につき化合物を組織的にスクリ
ーニングする目的で、自動流体送達を細胞のアレインに組み合わせる方法現在利
用できない。さらに、１つのアッセイで「ヒット」を同定するための高スループ
ットウェル間測定、続いてのヒットと同定されたウェルのみの同一プレートにつ
いての第２の高含有量細胞間測定を組み合わせる方法は当該分野では存在しない
。
【００２１】 本発明は、多くの細胞スクリーニング様式を蛍光ベースの分子試薬およびコン
ピュータベースの特徴抽出、データ解析、および自動化と組み合わせることによ
って標的の有効化および候補の最適化を有意に改良し、その結果データ収集の質
およびスピードの増加、サイクル時間の短縮化、および最終的には有用な薬物候
補のより早い評価をもたらす高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）および高
含有量スクリーニング（ＨＣＳ）を組み合わせるシステム、方法およびスクリー
ニングを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およびテスト化合
物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大したスループッ
トを可能とすることを提供する。
【００２２】 （発明の開示） 本発明の一つの特徴は、位置のアレイに蛍光レポータ分子を含有する細胞を提
供し、位置のアレイにおける細胞を１以上の試薬で処理し、各位置における多数
の細胞を蛍光光学でイメージングし、光学情報をデジタルデータに転換し、デジ
タルデータを利用して細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性お
よび細胞の分布を測定し、次いで、生物学的機能についてテストすべき化合物の
陽性効果、陰性効果、または無効果の項目につきその情報を解釈することを含む
細胞の分析方法に関する。
【００２３】 この実施形態において、この特徴に係る方法は、特定の生物学的機能に特異的
に影響するものにつき非常に多数の化合物をスクリーニングする目的で細胞中の
蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性を迅速に測定する。位置のアレイ
は、マイクロタイタープレート、または位置のアレイに細胞を有するマイクロプ
レートであるマイクロチップであって良い。好ましい実施形態において、この方
法は受領したデータを取得し、処理し、表示し、保存するためのコンピュータ化
手段を含む。好ましい実施形態において、この特徴に係る特徴に係る方法は、さ
らに、細胞のアレイへの自動流体送達を含む。別の好ましい実施形態において、
同一プレートでの高スループット測定から得られた情報を用いて、プレート上の
細胞位置のサブセットのみについて選択的に高含有量スクリーニングを行う。
【００２４】 本発明の他の特徴は、 ・顕微鏡対物レンズを有する高倍率蛍光光学系、 ・細胞のアレイを含有するプレートを保持し、適当な整列のためにプレートを
移動させ、細胞アレイ上に焦点を合わせるための手段を有するのに適したＸＹ段
階、 ・デジタルカメラ、 ・細胞アレイに励起光を向けるための光学手段および細胞から放出された蛍光
をデジタルカメラに向けるための手段、および ・デジタルカメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー
、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データ
の保存および検索のためのデジタル記録媒体、結果の制御、取得、処理および表
示のための手段を含み、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それ
を処理するためのコンピュータ手段とを具備する細胞スクリーニングシステムを
提供することである。
【００２５】 好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、データ
を表示するためのコンピュータと操作可能に関連するコンピュータ画面を含む。
別の好ましい実施形態において、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取
り、それを処理するためのコンピュータ手段はこのデータをバイオインフォマテ
ィクスデータベースに保存する。さらなる好ましい実施形態において、この細胞
スクリーニングシステムは、さらに、多くのまたは全てのウェルからのシグナル
を平行して測定するリーダーを含む。別の好ましい実施形態において、細胞スク
リーニングシステムは、さらに、システムの倍率を変化させて、高スループット
および高含有量スクリーニングの間のモードの変化を可能とする機械、光学手段
を含む。別の好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは、
さらに、細胞を生かしておくために必要なレベルにプレートの周囲の温度、ＣＯ ２ 濃度および湿度を維持するためのチャンバーおよび制御システムを含む。さら
なる好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは共焦点走査
照明および検出システムを利用する。
【００２６】 本発明のさらに他の特徴は、特異的細胞の構成要素およびプロセスの分布およ
び活性を規定するための手法を実行させるための指令の組を含有するプログラム
を含む機械読み取り可能記録媒体を提供することである。好ましい実施形態にお
いて、この細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するのに適した段階およ
び段階を移動させるための手段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、デ
ジタルカメラからデジタルデータを受け取り、それを処理するための光源、およ
びデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するためのコン
ピュータ手段を含む。機械読み取り可能記録媒体の好ましい実施形態は、細胞ス
クリーニングシステムが、図９、１１、１２、１３、１４または１５に記載され
た手法を実行させるための指令の組を含むプログラムを含む。別の好ましい実施
形態は、細胞スクリーニングシステムが、特異的細胞の構成要素およびプロセス
の分布および活性を検出するための手法を実行させるための指令の組からなるプ
ログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定される
ものではないが、タンパク質の核移動、細胞肥大、アポトーシス、およびタンパ
ク質のプロテアーゼ−誘導移動を含む。
【００２７】 別の好ましい実施形態において、転写因子活性、プロテインキナーゼ活性、細
胞形態、微小管構造、アポトーシス、受容体内部化、タンパク質のプロテアーゼ
−誘導移動および神経突起成長に影響する化合物を解析し、同定するためのスク
リーニングを含めた種々の細胞スクリーニング方法を提供することである。
【００２８】 全ての引用された特許、特許出願および他の文献は、参照してその全体に組み
込まれる。
【００２９】 本明細書中で用いるように、以下の用語は特定の意味を有する： 細胞ドメインのマーカ。特異的小器官または分子を含めた特異的細胞構成要素
に対して高親和性を有するルミネセンスプローブ。これらのプローブは、「標識
試薬」「環境インジケータ」または「バイオセンサー」として使用される小さな
ルミネセンス分子または蛍光タグ付きマクロ分子いずれかであり得る。
【００３０】 標識試薬。標識試薬は、限定されるものではないが、蛍光タンパク質アナログ
およびバイオセンサーを含めたルミネセンス標識マクロ分子、緑色蛍光タンパク
質およびその突然変異体とで形成されたものを含めたルミネセンスマクロ分子キ
メラ、生理学的応答に関与する細胞抗原と反応するルミネセンス標識一次または
二次抗体、ルミネセンス染料、色素および他の小分子を含む。
【００３１】 細胞移動のマーカ。いくつかの細胞プロセスまたは生理学的応答の間に１つの
細胞ドメインから別のドメインに移動するルミネセンスタグ付きマクロ分子また
は小器官。移動マーカは細胞ドメインのマーカに対する単にレポート位置であり
得るか、あるいはそれらは同様にいくつかの生化学または分子活性を報告する「
バイオセンサー」でもあり得る。
【００３２】 バイオセンサー。生物学的機能ドメインおよび内部またはその表面いずれかで
起こる環境の変化を報告するルミネセンスプローブまたは複数プローブからなる
マクロ分子。これらの変化を検知しそれを報告するほうにデザインされたルミネ
センス標識マクロ分子のクラスは「蛍光−タンパク質バイオセンサー」と呼ばれ
てきた。バイオセンサーのタンパク質成分は高度に進化した分子認識部位を提供
する。活性部位に隣接するタンパク質成分に付着した蛍光分子は、環境の変化を
蛍光シグナルに変化させ、これは本発明の細胞スクリーニングシステム等の適当
な時間および空間分解能を持つシステムを用いて検出される。生細胞内の天然タ
ンパク質活性の変調は可逆的であるので、かつ蛍光−タンパク質バイオセンサー
はタンパク質活性の可逆的変化を検知するようにデザインできるので、これらの
バイオセンサーは実質的に再使用可能である。
【００３３】 病気関連配列。（「ＤＡＳ」）。この用語は、薬物候補化合物についてのよう
に、一次ＤＮＡ配列データ等の標準的な技術、減算ハイブリッド形成およびＲＡ
ＤＥ等のゲノム方法、および逆遺伝子学と組み合わせたプロテオミック方法によ
って同定された核酸配列をいう。この用語は、配列が病気状態に関連するに過ぎ
ないということを意味しない。
【００３４】 高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）を用いて、シグナル変換経路等の複雑な分
子事象、ならびに限定されるものではないがアポトーシス、細胞***、細胞接着
、移動、エキソサイトーシスおよび細胞間通信を含めた細胞機能に対する薬物の
効果を測定することができる。多色蛍光は複数の標的および細胞プロセスが単一
のスクリーニングでアッセイできることを可能とする。細胞応答の交差−相関は
標的の有効化およびリード最適化に要する価値のある情報を生じるであろう。
【００３５】 本発明の１つの態様において、顕微鏡対物レンズ、細胞を保持する位置のアレ
イを備えたプレートを保持し、顕微鏡対物レンズとこの位置を整列させるために
プレートを移動させるための手段を有するＸＹ段階、および焦点合わせを行う方
向にプレートを移動させるための手段を有する高倍率蛍光光学系、デジタルカメ
ラ、位置のアレイにおける細胞に励起光を向けるための光学手段および細胞から
放出された蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、およびデジ
タルカメラからのデジタルデータを受け取りそれを処理するためのコンピュータ
手段、ここに、このコンピュータ手段はこのカメラからのイメージを受け取るた
めのデジタルフレームグラバー、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセ
イ結果のディスプレイ、データの保存および検索のためのデジタル記録媒体、お
よび結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含む、を含む細胞スクリ
ーニングシステムを提供することである。
【００３６】 図１は細胞走査システムの好ましい実施形態の概略図である。このカメラに対
して１−１００倍の倍率を持つ標準的な対物レンズ、および電源２を備えた白色
光源（例えば、１００Ｗの水銀灯ランプまたは７５Ｗキセノンランプ）を用いる
ツァイス・アキシオバート（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ）倒立蛍光顕微鏡等
の倒立蛍光顕微鏡１を用いる。顕微鏡対物レンズ上方にＸＹ方向にプレート４を
移動させるためのＸＹ段階３がある。Ｚ−軸焦点駆動５は焦点合わせのために対
物レンズをＺ方向に移動させる。操作レバー６はＸＹＺ方向の段階の手動移動を
提供する。高分解能デジタルカメラ７はプレート上の各ウェルまたは位置からイ
メージを取得する。カメラ電源８、自動コントローラ９および中央処理ユニット
１０がある。このＰＣ１１はディスプレイ１２を提供し、関連するソフトウェア
を有する。プリンタ１３はハードコピーレコードの印刷を提供する。
【００３７】 図２は本発明の顕微鏡アセンブリ１の１つの実施形態の概略図であり、詳細に
、ＸＹ段階３、Ｚ−軸焦点合わせ駆動５、操作レバー６、光源２、および自動コ
ントローラ９を示す。コンピュータ１５および顕微鏡１６へのケーブルが各々設
けられる。加えて、図２はＸＹ段階３上にＸＹ方向に移動する９６ウェルのマイ
クロタイタープレート１７を示す。抗原２からの光はＰＣ制御のシャッター１８
を通って励起フィルタ２０を備えた電動フィルタホイール１９へと通過する。こ
の光は、ダイクロイックミラー２６および発光フィルタ２７を有するフィルタキ
ューブ２５に通過する。励起光はこのダイクロイックミラーで反射されてマイク
ロタイタープレート１７中のウェルに向かい、蛍光２８はダイクロイックミラー
２６および発光フィルタ２７を通ってデジタルカメラ７へと通過する。
【００３８】 図３は好ましいカメラアセンブリの概略図を示す。露出制御のための自動シャ
ッターおよび電源３１を含有するデジタルカメラ７は顕微鏡アセンブリからの蛍
光２８を受け取る。デジタルケーブル３０はデジタルシグナルをコンピュータに
まで輸送する。
【００３９】 上述した標準的な光学配置は、カメラセンサー上の検体の拡大されたイメージ
を直接的に生じさせて、この検体の高分解能イメージを取得するための顕微鏡光
学を使用する。この光学系は通常「広視野」顕微鏡といわれる。当業者であれば
、検体の高分解能イメージは、限定されるものではないが、検体にわたって操作
した照明の焦点を合わせた点または線の標準的な走査共焦点検出（ゴーら，１９
９７，上記）、および多光子走査共焦点顕微鏡（デンクら，１９９０，上記）（
これらの双方はＣＣＤ検出器にて、または光電子増倍管のアナログ出力の同調デ
ジタル化によってイメージを形成できる）を含めた種々の他の光学系によって生
じさせることができるのを認識できるであろう。
【００４０】 スクリーニング適用において、しばしば、特定の細胞系または一次細胞培養を
用いて、それらの細胞の特定の特徴を利用するのが必要である。細胞培養の分野
の当業者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、それらは他の細胞に囲ま
れるようになると増殖を停止することを意味し、他方、他の細胞はそれらの条件
下で継続して増殖し、細胞は文字通り積みあがり、多くの層を形成することを認
識するであろう。そのような細胞系の例はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
５７３）系である。多層調製物における単一の細胞層のイメージを取得できる光
学系が、層を形成する蛍光にある細胞系での使用に必要である。広視野顕微鏡の
大視野深度は、多くの層の細胞を通じての投影であるイメージを生じ、層−形成
細胞で極端に困難な細胞下空間分布の解析を行う。別の方法として、共焦点顕微
鏡で達成することができる非常に狭い視野深度（約１ミクロン）は高分解能にて
単一の細胞層の区別を可能とし、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、
蛍光寿命イメージング等の検出モードが必要な場合には共焦点イメージングが好
ましい。
【００４１】 顕微鏡のための標準的共焦点イメージングアタッチメントの出力はデジタルイ
メージであり、これは上述した他の細胞スクリーニングシステムの実施形態によ
って生じるイメージと同一の様式に変換でき、従って、イメージと正確に同一の
方法で処理できる。この実施形態における全制御、取得および解析は実質的に同
一である。共焦点顕微鏡システムの光学配置は、照明器および検出器を除いて上
述したものに実質的に同一である。共焦点顕微鏡に必要な照明および検出系は、
本発明のもののような標準的な顕微鏡光学系に取り付けられるアクセサリとして
デザインされてきた（ツァイス(Zeiss)，ドイツ国）。従って、これらの別の光
学系は上述した体系に容易に取り込むことができる。
【００４２】 図４は、参照してその全体に組み込まれる同時係属米国出願Ｓ／Ｎ ０８／８
６５，３４１に記載された、細胞アレイがマイクロプレート４１上のマイクロウ
ェル４０にある本発明の別の実施形態を示す。典型的には、このマイクロプレー
トは、８６ｍｍ×１２９ｍｍである標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレ
ートと比較して２０ｍｍ×３０ｍｍである。マイクロプレート上の細胞のより高
い密度のアレイは、高スループットで画素当たり数ミクロンの低分解能にてイメ
ージされることを可能とし、このマイクロプレート上の特定の位置が画素当たり
０．５ミクロン未満の高分解能にてイメージされることを可能とする。これらの
２つの分解能濃度は、この系の全スループットを改良することを助ける。
【００４３】 マイクロプレートチャンバー４２は化合物の細胞への添加のためのミクロ流動
送達システムとして働く。マイクロプレートチャンバー４２中のマイクロプレー
ト４１はＸＹマイクロプレートリーダー４３に入れられる。デジタルデータは上
述したように処理される。このマイクロプレートシステムの小さなサイズはスル
ープットを増加させ、試薬容量を最小化し、速くて正確な細胞ベースの分析のた
めの細胞の分布および設置の制御を可能とする。処理されたデータはＰＣ画面１
１上に表示でき、バイオインフォマティクスデータベース４４の一部をなす。こ
のデータベースは本発明の方法を通じて得られたデータの保存および検索を可能
とするのみならず、細胞に関する外部データの取得および保存を可能とする。図
５は、ソフトウェアの操作を説明するＰＣディスプレイである。
【００４４】 代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）は同一プラットホ
ーム上または（ローカルエリアネットワークを介して）電子的に結合した２つの
別々のプラットフォーム上のＨＣＳと直接連結される。デュアルモード光学系と
言われる本発明のこの実施形態は、それをＨＴＳと連結させることによってＨＣ
Ｓのスループットを増加させる利点を有し、それにより、連結したＨＴＳにおけ
る応答を示すウェルの小さなサブセットについてのみより遅い高分解能データ取
得および分析を要する。
【００４５】 高スループット「全プレート」リーダーシステムは当該分野でよく知られてお
り、多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるＨＴＳシステムの成分と
して通常は使用される（ベグス(Beggs)（１９９７），Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌ
ｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ２：７１−７８、マーカフレー(Macaffrey)ら（１
９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １：１８７−１９０）。
【００４６】 デュアルモード細胞ベースのスクリーニングの１つの実施形態において、高ス
ループット取得が１つのプラットフォームで起こり、高含有量取得が第２のプラ
ットフォームで起こる２つのプラットフォーム構築体を提供することである。（
図６）。処理は各プラットフォームで独立して起こり、結果はネットワークイン
ターフェ-スを通過し、あるいは単一のコントローラを用いて両プラットフォー
ムからのデータを処理する。
【００４７】 図６に示すように、例示された２つのプラットフォームデュアルモード光学系
は２光の光学装備、高スループット６０および高含有量プラットフォーム６５よ
りなり、これはマイクロプレート上のマイクロタイタープレートまたはマイクロ
ウェルアレイ中で培養した細胞から放出された蛍光シグナルを読み取り、電子的
結合６４を介して相互に通信する。高スループットプラットフォーム６０は全プ
レート中の全てのウェルを平行してまたは迅速系列様式いずれかで分析する。ス
クリーニングの分野の当業者であれば、デュアルモード細胞ベースのスクリーニ
ングシステムに取り込むことができる多くのそのような商業的に入手可能な高ス
ループットリーダーシステムがあることを認識するであろう（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ
（パッカード・インスツルメント社(Packard Instruments)，Ｍｅｒｉｄｅｎ，
ＣＴ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｌｕｍｉｓｋａｎ（モレキュラー・デバイス社
，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ（ラブシステムズ(Labsy
stems)，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。上述した高含有量プラットフォーム６５は
ウェル間を走査し、ウェル内の個々の細胞から収集された高分解能イメージデー
タを取得し、それを分析する。
【００４８】 システムのコンピュータ６２に存在するＨＴＳソフトウェアは高スループット
装備を制御し、結果はモニター６１に表示される。そのコンピュータのシステム
６７に存在するＨＣＳソフトウェアは高含有量装備ソフトウェア６５、および任
意のデバイス（例えば、プレートローダー、環境チャンバー、流体ディスペンサ
ー）を制御し、プレートからのデジタルイメージデータを分析し、結果をモニタ
ー６６に表示し、取り込まれたデータベースで測定されたデータを管理する。ま
た、２つのシステムは単一のコンピュータを共有し、この場合、全てのデータは
、データを移動するためのローカルエリアネットワークの必要性なくして、その
コンピュータで収集され、処理され、表示される。マイクロタイタープレートは
、当該分野で知られているように、手動により、またはロボットプレート移動デ
バイスによって、高スループットシステムから高含有量システム６３に移動され
る（ベグス（１９９７），上記、マーカフレー（１９９６），上記）。
【００４９】 好ましい実施形態において、デュアルモード光学系は単一のプレートシステム
を利用する（図７）。それは、２つの別々の光学モジュール、ＨＣＳモジュール
２０３およびＨＴＳモジュール２０９よりなり、これは、一度に１つのみを用い
てマイクロタイタープレート２０１からのデータを収集することができるように
、独立してまたは集合的に移動させることができる。マイクロタイタープレート
２０１は電動Ｘ，Ｙ段階に設置され、そこで、それはＨＴＳまたはＨＣＳモード
いずれかでのイメージングのために位置させることができる。後記するＨＴＳデ
ータを収集し、それを分析した後、ＨＴＳ光学モジュール２０９を光路から外し
て移動させ、ＨＣＳ光学モジュール２０３が所定の位置に移動される。
【００５０】 ＨＴＳ２０９についての光学モジュールは投影レンズ２１４、励起波長フィル
タ２１３およびダイクロイックミラー２１０よりなり、これを用いて、通常の顕
微鏡ランプシステム（図示せず）からの特異的波長のバンドでプレート上の全底
部を照明する。蛍光発光は、センサー２１５を備えたカメラ２１６上にイメージ
を形成するレンズ２１２によってダイクロイックミラー２１０および発光波長フ
ィルタ２１１を通じて収集される。
【００５１】 ＨＣＳ２０３についての光学モジュールは投影レンズ２０８、励起波長フィル
タ２０７、ダイクロイックミラー２０４よりなり、これを用いて顕微鏡対物レン
ズ２０２の裏開口を照明し、それにより、標準的顕微鏡照明システム（図示せず
）からその対物レンズの視野を照明する。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ２０２に
よって収集され、ダイクロイックミラー２０４および発光波長フィルタ２０５を
通って通過し、センサー２１５を備えた同一カメラ２１６上にイメージを形成す
るチューブレンズ２０６によって焦点を結ぶ。
【００５２】 本発明の別の実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、細
胞スクリーニングの方法の生細胞実施形態での使用のための流体送達デバイスを
含む（以下参照）。図８は本発明のシステムで用いる流体送達デバイスを例示す
る。それは単一のモータ駆動によって駆動される１２のシリンジポンプ７０１の
バンクからなる。各シリンジ７０２は各ウェルへ送達されるべき容量、典型的に
は、１および１００μＬの間に従ったサイズとされる。各シリンジは柔軟なチュ
ーブ７０３を介して、標準的なピペット先端７０５を許容するコネクタの同様の
バンクに付着される。ピペット先端のバンクは駆動システムに付着され、従って
、それは、マイクロタイタープレート７０６に対して下降および上昇させて各ウ
ェルへ流体を送達することができる。このプレートはＸ，Ｙ段階に設置され、デ
ータ収集目的で光学系７０７に対する移動を行う。この設定はピペット先端の１
つの組、または単一のピペット先端のみでさえプレート上の全てのウェルに試薬
を送達するのを可能とする。シリンジポンプのバンクを用いて同時に１２のウェ
ルに、または先端のいくつかを除くことによってより少数のウェルに流体を送達
することができる。
【００５３】 別の態様において、本発明は、複数細胞を含有する位置のアレイを提供し、こ
こに、この細胞は１以上の蛍光レポータ分子を含有し、細胞を含有する位置の各
々における複数細胞を走査して、細胞中の蛍光レポータ分子からの蛍光シグナル
が得られ、蛍光シグナルをデジタルデータに変換し、次いで、このデジタルデー
タを用いて、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性を測定すること
を含む細胞の分析方法を提供する。
【００５４】 細胞アレイ 特定の生物学的機能に関する活性についての非常に多数の化合物のスクリーニ
ングは、細胞および試薬の平行した取り扱いのために細胞のアレイを調製するこ
とを必要とする。９ｍｍピッチの６ｍｍ直径のウェルを備えた、８６ｍｍ×１２
９ｍｍである標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレートは、現行の自動ロ
ーディングおよびロボット取り扱いシステムでの適合性にて使用される。このマ
イクロプレートは典型的には２０ｍｍ×３０ｍｍであり、約５００ミクロンのピ
ッチで寸法が１００−２００ミクロンである細胞位置を備えている。マイクロプ
レートを作成する方法は、参照してその全体に組み込まれる米国特許出願番号０
８／８６５，３４１に記載されている。マイクロプレートは、それに細胞が付着
しない材料でパターン化された、それに細胞が接着する材料の共平面層、または
同様にパターン化された材料のエッチングされた三次元表面からなることができ
る。以下の議論の目的では、用語「ウェル」および「マイクロウェル」とは、そ
れに細胞が接着し、その中で細胞がイメージされるいずれかの構築物のアレイに
おける位置をいう。マイクロプレートはウェルの間の空間に流体送達チャネルを
含むことができる。マイクロプレートの同様の様式は、調製の間の試薬、保存お
よび取り扱いの量ならびに走査操作に必要な全移動を最小化することによって、
システムの全効率を増加させる。加えて、マイクロプレートの全領域はより効果
的にイメージすることができ、本明細書中で後に説明するようにマイクロプレー
トリーダーのための第２のモードの操作を可能とする。
【００５５】 蛍光レポータ分子 新しい薬物発見のパラダイムの主要な要素は、細胞内イオン、代謝産物、マク
ロ分子および小器官の時間的および空間的分布、含有量および活性を測定するの
に使用される継続的に増大する一群の蛍光および蛍光試薬である。これらの試薬
のクラスは、生細胞および固定細胞における分子の分布および量、時間および空
間におけるシグナル変換事象を報告するための環境インジケータ、および生細胞
の標的分子活性を測定するための蛍光タンパク質バイオセンサーを測定する標識
試薬を含む。単一の細胞中でいくつかの試薬を組み合わせるマルチパラメータア
プローチは薬物発見のための強力な新しいツールである。
【００５６】 本発明の方法は、特異的細胞成分に対する蛍光またはルミネセンス分子の高親
和性に基づく。特異的成分に対する親和性は、イオン相互作用、共有結合（これ
は、タンパク質ベースの発色団、フルオロフォア、およびルミフォアを含む）、
ならびに疎水性相互作用、電気的ポテンシャル、およびある場合には、細胞成分
内での単純な取得等の物理的力によって支配される。ルミネセンスプローブは、
限定されるものではないが緑色蛍光タンパク質キメラを含めた、小分子、標識さ
れたマクロ分子、または遺伝子工学作成タンパク質であり得る。
【００５７】 当業者であれば、限定されるものではないが、タンパク質、リン脂質およびＤ
ＮＡハイブリダイジングプローブ等の蛍光標識生体分子を含めた、広く種々の蛍
光レポータ分子を本発明で用いることができるのを認識するであろう。同様に、
特異的に結合または会合の特定の化学的特性で合成された蛍光試薬が蛍光レポー
タ分子として使用されてきた（バラク(Barak)ら（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７２：２７４９７−２７５００、サウスウィック(Southwick)（１
９９０），Ｃｏｔｏｍｅｔｒｙ １１：４１８−４３０、ツシーン（１９８９）
ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９ テー
ラーおよびワン(Wang)（編），１２７−１５６頁）。蛍光標識抗体は、細胞また
は組織としての複合体としての分子の混合物中の単一分子標的に付着させるため
のそれらの高度な特異性のため特に有用なレポータ分子である。
【００５８】 ルミネセンスプローブは生細胞内で合成することができるか、あるいは拡散、
促進または能動輸送、シグナル配列−媒介輸送、およびエンドサイトーシスまた
はピノサイトーシス摂取を含めたいくつかの非機械的モーデを介して細胞に輸送
することができる。当該分野でよく知られた機械的バルクローディング方法を用
いて、ルミネセンスプローブを生細胞に負荷することもできる（バーバー(Barbe
r)ら（１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０７：１７
−２０、ブライトら（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２４：２２６−２３３
、ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，テーラーおよびワン（編），１５３−１７３）。これら
の方法はエレクトロポレーションおよびスクレイプ−ローディング、ビード−ロ
ーディング、インパクト−ローディング、シリンジ−ローディング、低張および
高張ローディング等の他の機械的方法を含む。加えて、細胞を遺伝子工学的に作
成して、上述した注目するタンパク質に連結された、ＧＦＰ等のレポータ分子を
発現するようにすることができる(チャルフィー(Chalfie)およびプラッシャー(P
rasher)，米国特許第５，４９１，０８４号、キュビット(Cubitt)ら（１９９５
），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４
４８−４５５)。
【００５９】 一旦細胞内に入れば、ルミネセンスプローブは、標的ドメインとの特異的かつ
高親和性相互作用の結果として、あるいはシグナル配列−媒介輸送等の分子標的
化の他の様式にてそれらの標的において蓄積する。蛍光標識レポータ分子は、レ
ポータの位置、量および化学的環境を測定するのに有用である。例えば、レポー
タが親油性膜中にあるか、またはより水性の環境にあるかは決定することができ
る（ジュリアノら（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ
ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４：４０５−４
３４、ジュリアノおよびテーラー（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１−１６）。レポータのｐＨ環境は測定することが
できる（ブライトら（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０４：１
０１９−１０３３、ジュリアノら（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
６７：３６２−３７１、トーマス(Thomas)ら（１９７９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １８：２２１０−２２１８）。キレート化基を有するレポータがＣａ＋ ＋ 等のイオンに結合しているか否かは測定することができる（ブライト（１９８
９），Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０
，テーラーおよびワン（編），１５７−１９２、シモウラ(Shimoura)ら（１９８
８），Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）２５１：４０５−４
１０、ツシーン（１９８９）Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，テーラーおよびワン（編），１２７−１５６）。
【００６０】 さらに、生物内のある細胞タイプは、特異的に標識することができる成分を含
有することができ、これは他の細胞タイプでは起こり得ない。例えば、上皮細胞
は、しばしば、極性化膜成分を含有する。すなわち、組織細胞は、それらの原形
質膜に沿ってマクロ分子を非対称に分布させる。結合もしくは支持組織は、しば
しば、その細胞型に特異的な分子（例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン
等）がそれに取得される顆粒を含有する。ほとんどの筋肉組織細胞は筋形質小胞
体、その機能が細胞質内のカルシウムイオンの濃度によって調節されるべき特殊
化された小器官を含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝
達物質がそこに取得されている、分泌顆粒および小胞体を含有する。従って、蛍
光分子は、特異的細胞内の特異的成分のみならず、混合された細胞型の集団内の
特異的細胞も標識するようにデザインできる。
【００６１】 当業者であれば、蛍光を測定する広く種々の方法を認識するであろう。例えば
、いくつかの蛍光レポータは励起または発光スペクトルの変化を呈し、いくつか
は１つの蛍光レポータが蛍光を失い、他方、第２のものが蛍光の利得を得る共鳴
エネルギー移動を呈し、いくつかは蛍光の喪失（消光）または出現を呈し、他方
、いくつかは合理的移動を報告する（ジュリアノら（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
２４：４０５−４３４、ジュリアノら（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１−１６）。
【００６２】 走査細胞アッセイ 図９を参照し、実行されるべきアッセイに基づいて選択されるべきオペレータ
−指向性パラメータ、試料内の蛍光シグナルの分布についての細胞スクリーニン
グシステムによるデータ取得、および対話形式のデータレビューおよび解析を含
む細胞を分析するための好ましい実施形態が提供される。自動走査の開始におい
て、オペレータは、試料を説明する情報１００を入力し、フィルタ設定および蛍
光チャネルを測定して、使用される生物学的標識および求められる情報を適合さ
せ、カメラ設定を調整して、試料の明るさを適合させる。ある範囲の試料を取り
扱う柔軟性のためには、ソウトウェアは、核および細胞質を同定するのに使用さ
れる種々のパラメータ設定の選択および異なる蛍光試薬の選択、形態または明る
さに基づく注目する細胞の同定、およびウェル当たりの分析すべき細胞の数の同
定を可能とする。これらのパラメータは、各自動実行につき容易な検索のために
、システムに保存される。このシステムの対話形式細胞同定モードは、分析すべ
き細胞のサイズ、形状および同一性の範囲等の形態学的パラメータの限界の選択
を単純化する。使用者は、プレートのいずれのウェルをシステムが走査するか、
およびいくつの視野およびいくつの細胞を各ウェルで分析すべきかを特定する。
工程１０１において使用者によって選択された設定に基づいて、システムは、プ
レート１０２の「焦点を見出す」ためのオートフォーカス手法を用いて走査され
るべきプレートの領域を自動的に予め焦点合わせし、あるいは使用者は、走査さ
れるべき三角形領域を規定する３つの「タグ」点を選択することによって走査領
域を予め焦点合わせする１０３。次いで、それらのタグ点から最小二乗適合「焦
点面デモル」を計算して、自動走査の間に各ウェルの焦点を評価する。各ウェル
の焦点は、走査の間に焦点面モデルから内挿することによって評価される。
【００６３】 自動走査の間に、ソウトウェアは、分析された細胞の数、分析されるべき現在
のウェル、それらが取得しつつある各独立した波長のイメージ、およびそれが決
定されつつある各ウェルのイメージを含めた、走査状態を動的に表示する。プレ
ート４（図１）はサーペンタインスタイルで走査される。なぜなら、ソウトウェ
アは、９６−ウェルプレートの各ウェル内のウェル間および視野間から電動顕微
鏡ＸＹ段階３を自動的に移動させるからである。プログラミングの分野の当業者
であれば、２４、４８および３８４ウェルプレート等の他のマイクロプレート様
式の走査のためにソウトウェアをいかにして適合させるかを認識するであろう。
全プレートの走査パターンならびに各ウェル内の視野のパターンがプログラムさ
れる。システムは、Ｚ軸焦点駆動５を介してオートフォーカス手法１０４（図９
）で試料の焦点を調整し、電動フィルタホイール１９を介してフィルタ選択を制
御し、４つの異なる色（「チャネル」または「波長」）からなるイメージを取得
し解析する。
【００６４】 オートフォーカス手法は、典型的には、各ウェル内の、各ウェル中で第１の視
野、次いで各４−５の視野毎に１回、使用者が選択した頻度で呼ばれる。オート
フォーカス手法は、予め計算された面焦点モデルから内挿することによって出発
Ｚ−軸を計算する。この設定点を超えるまたはそれ未満のプログラム可能な距離
で出発し、この手法は、多数の異なる位置を介して機械的Ｚ−軸を指導させ、各
地点でイメージを取得し、各イメージのコントラストを評価する計算された焦点
スコアの最大を見出す。最大焦点スコアを持つイメージのＺ位置は、特定の視野
のための最良焦点を決定する。当業者であれば、ハームス(Harms)ら，ｉｎ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ ５（１９８４），２３６−２４３，Ｇｒｏｎｅｎら，ｉｎ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６（１９８５），８１−９１，およびファイヤストン(Fir
estone)ら，ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １２（１９９１），１９５−２０６に
記載された自動焦点合わせ方法の変形としてこれを認識するであろう。
【００６５】 イメージ取得では、カメラの露出時間は、各色素につき別々に調整されて、各
チャネルからの最高品質のイメージを保証する。ソフトウェア手法は、使用者の
オプションにより、いずれかのさらなる測定をなす前に波長間で線状（Ｘおよび
Ｙ）シフトを説明することによって、波長間の登録シフトを修正するために呼ぶ
ことができる。電子シャッター１８は、試料フォト−ブリーチングが最小に保持
されるように制御される。バックグラウンド遮光および不均一な照明は、当該分
野で知られている方法を用いるこのソフトウェアによって修正することができる
（ブライトら（１９８７），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０４：１０１９−１０
３３）。
【００６６】 １つのチャネルにおいて、適合した閾値設定手法を用いて分割される（「同定
される」）一次マーカ１０５（図９）（典型的には、ＤＡＰＩまたはＰＩ蛍光色
素で逆染色された細胞核）からイメージが取得される。この適合閾値設定手法１
０６を用いてバックグラウンドから細胞を分離するため、イメージの閾値を動的
に選択する。蛍光色素での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試料中の細
胞を横切って、並びにマイクロタイタープレートの各ウェル内の細胞の視野のイ
メージ内で未知の程度変化し得る。この変化は、試料の調製および／または細胞
の動的性質の結果として起こり得る。全体的閾値は、バックグラウンドから細胞
を分離し、視野間変化を説明するために、完全なイメージについて計算される。
これらの全体的結合技術は当該分野で記載されているものの変形である。（キト
ラー(Kittler)ら，ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｇｒａｐｈｉｃｓ
ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ３０（１９８５），１２５−１
４７，リドラー(Ridler)ら，ｉｎ ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍ
ａｎ，ａｎｄ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（１９７８），６３０−６３２）。
【００６７】 別の適合閾値設定方法は、全体的イメージ閾値設定とは対照的に、局所領域閾
値決定を利用する。局所領域のイメージ分析は、良好な総じての細分化に導く。
なぜなら、細胞核（ならびに他の標識成分）の染色はイメージを横切って変化し
得る。この全体的／局所的手法を用い、減少した分解能イメージ（２から４の因
子だけサイズが減少）を、（適合閾値設定を用いて）まず全体的に分割して、イ
メージ中の注目する領域を見出す。次いで、これらの領域を、十分な分解能にお
いて同一領域をより十分に分析するためのガイドとして働かせる。次いで、（再
度、適合閾値設定を用いて）注目する各領域につき、より局所化された閾値を計
算する。
【００６８】 細分化手法の出力は、物体が白色であって、バックグラウンドが黒色であるバ
イナリーイメージである。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメー
ジを用いて、視野が物体１０７を含有するかを決定する。このマスクを小斑点標
識方法で標識し、それにより、各物体（または小斑点）は、それに帰属されるた
だ１つの数を有する。この小斑点の面積および形状等の形態学的特徴を用いて、
人口物と考えられるものから細胞であるように見える小斑点を区別する。既知の
細胞の形態学的特徴においてタイプ分けすることによって、あるいは対話形式ト
レーニング用途を用いることによって、使用者は形態学的選択基準をあらかじめ
設定する。注目する物体が視野で見出されれば、すべての他の活性はチャネル１
０８についてイメージを取得し、そうでなければ、段階を現在のウェル中の次の
視野１０９に進める。注目する各物体をさらなる分析１１０のためにイメージ中
に位置させる。その形態学的特徴（サイズおよび形状）を測定することによって
、このソウトウェアは、物体が有効な細胞核１１１についての基準を満たすかを
決定する。各有効な細胞については、ＸＹＺ段階の位置を記録し、細胞の小さな
イメージを保存し、特徴を測定する１１２。
【００６９】 多数の分析方法を同時に適用して複数の波長において特徴を測定することによ
って、本発明の細胞スクリーニング方法を用いて、細胞試料について多くの異な
るアッセイを行うことができる。１つのそのようなアッセイの例は以下の測定を
提供する： １．色１−４についての細胞核内の全蛍光強度 ２．色１についての細胞核の面積（一次マーカ） ３．色１についての細胞核の形状は： ａ）周辺の四角の面積 ｂ）ボックスの面積比 ｃ）高さ幅比 によって記載 ４．色１−４についての細胞核内の平均蛍光強度（すなわち、番号１を番号２
で割る） ５．色２−４について細胞の細胞質の蛍光を表す（細胞質マスク）核の外側の
リングの全蛍光強度（図１０参照） ６．細胞質マスクの面積 ７．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度（すなわち、番号６割る
番号６） ８．色２−４についての細胞核内の平均蛍光強度に対する細胞質マスクの平均
蛍光強度の比率（すなわち、番号７割る番号４） ９．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度および細胞核内の平均蛍
光強度の差（すなわち、番号７から番号４を引く） １０．色２−４について、細胞核内の蛍光ドメイン（スポット、ドットまたは
粒とも呼ばれる）の数。
【００７０】 特徴１から４は、本発明の異なる細胞スクリーニングアッセイの一般的特徴で
ある。これらの工程は種々のイメージ解析適用で通常用いられ、当該分野でよく
知られている（ルス（Russ）（１９９２）Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、ゴンザレス(Gonzales)ら（
１９８７），Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ａｄｄｉｓ
ｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．３９１−４４８）。特徴５
−９は、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子および細胞質から核への蛍光
分子の移行（すなわち、移動）の測定を供するために特異的に開発された。これ
らの特徴（工程５−９）は、各移動の阻害用のマイクロプレートにおいて細胞を
分析するために使用される。例えば、転写因子の核移動の阻害は、無傷細胞をス
クリーニングするための新規なアプローチを提供する（他のタイプのスクリーニ
ングの詳細な例は後に提供する）。具体的な方法は、各細胞の核領域における（
特徴４）対局所細胞質領域における（特徴７）プローブの量を測定する。これら
の２つの細胞下区画間の差異の定量は、多数の細胞質−核移動（特徴９）を提供
する。
【００７１】 特徴１０は、色２−４における核領域内のＤＮＡまたはＲＮＡプローブのカウ
ントで用いられるスクリーニングを説明する。例えば、プローブは、染色体−特
異的ＤＮＡ配列を同定するために商業的に入手可能である（ライフ・テクノロジ
ー社(Life Technologies),Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ、ジェノシス社(Gen
osys)，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ、バイオテクノロジー社（Biotechnologies,
Inc.），Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ、バイオ １０１社（Bio 101, Inc.），Ｖｉ
ｓｔａ，ＣＡ）。細胞は性質が三次元的であり、顕微鏡下で高倍率で調べると、
１つのプローブは焦点内に有り得るが、別のプローブは完全に焦点外となり得る
。本発明の細胞スクリーニング方法は、複数の焦点面からイメージを取得するこ
とによって、核中の三次元プローブの検出を提供する。このソウトウェアは小工
程にてＺ−軸モータ駆動５（図１）を移動させ、ここに、広い範囲の異なる核の
直径を説明するには、工程距離は使用者が選択する。焦点工程の各々において、
イメージが取得される。各イメージ中の各画素からの最大灰色レベル強度が見出
され、得られた最大投影イメージに保存される。次いで、最大投影イメージを用
いて、プローブをカウントする。この方法は、別のものの上方または下方に直接
積まれないプローブをカウントするのによく働く。Ｚ−方向に相互の頂部に積ま
れたプローブにつきカウントするには、使用者は、取得した焦点面の各々におい
てプローブを分析するというオプションを選択することができる。このモードに
おいて、走査システムは、上述した最大面投影方法を行い、このイメージ中の注
目するプローブ領域を検出し、次いで、さらに、すべての焦点面イメージにおい
てこれらの領域を分析する。
【００７２】 細胞の特徴１１２を測定した後（図９）、システムは、現在の視野１１３にい
ずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体があれば、
それは次の物体１１０を位置付け、それが有効な細胞核１１１についての基準を
満たすか否かを決定しその特徴を測定する。一旦現在の視野中の全ての物体が処
理されれば、システムは、現在のプレートの分析が完了したか否かを決定する１
１４、完了してなければ、それは現在のウェル１１５中により多くの細胞を見出
す必要性を判断する。その必要性が存在すれば、システムは現在のウェル１０９
内の次の視野にＸＹＡ段階を進め、あるいは段階をプレートの次のウェル１１６
に進める。
【００７３】 プレートの走査が完了すれば、イメージおよびデータは、システムのイメージ
レビュー、データレビュー、および要約レビュー設備でレビューすることができ
る。走査からの全てのイメージ、データおよび設定は、後のレビューのために、
またはネットワーク情報管理システムとインターフェ-スするためにシステムの
データベースで検索される。また、データを他の第３者の統計的パッケージに輸
出して、結果を表にし、他の報告を作成することもできる。使用者は、対話形式
イメージレビュー手法１１７を備えたシステムによって分析された各細胞のイメ
ージ単独をレビューすることができる。使用者は、対話形式グラフ、測定された
特徴のデータスプレッドシート、および対話形式細胞間データレビュー手法１１
８での注目する細胞の全ての蛍光チャネルのイメージの組合せを用い、細胞間ベ
ースでデータをレビューすることができる。ヒストグラムおよびばらつきプロッ
ト等の対話形式グラフを介してデータを解析することができるグラフプロッティ
ング能力が提供される。使用者は、対話形式ウェル間データレビュー手法１１９
でプレートの各ウェル内の全ての細胞について蓄積され、要約される要約データ
をレビューすることができる。グラフおよびイメージのハードコピーは、広い範
囲の標準的なプリンタで印刷することができる。
【００７４】 完全な走査の最終相として、測定された特徴の１以上の統計についてレポート
が作成できる。対話形式レポート作成手法１２０を用い、プレートの走査された
領域につきウェル間ベースで要約されたデータのグラフレポートを作成すること
ができる。このレポートは、試料についての表およびグラフ様式および同定情報
においてウェルによる統計の要約を含む。レポートウインドゥは、オペレータが
、後の検索のために走査についてコメントを入力することを可能とする。複数の
レポートが多くの統計について作成でき、１つのボタンに触れて印刷することが
できる。印字する前に、配置およびデータにつきレポートをあらかじめレビュー
することができる。
【００７５】 この方法の上述した実施形態は、高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）モードと
いう単一の高分解能モードで走査される。このＨＣＳモードは、ウェル内、ウェ
ル中の個々の細胞内の物質の分布を規定するための（１μｍのオーダーの）ウェ
ル内の十分な空間的分解を提供する。そのモードで接近可能な高度な情報含有量
は、必要なシグナル処理のスピードおよび複雑性を犠牲にして出現する。
【００７６】 代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）を同一プラットフ
ォーム、または（例えば、ローカルエリアネットワークを介して）電子的に結合
された２つの別々のプラットフォームいずれかでＨＣＳに直接連結される。デュ
アルモード光学システムと言われる本発明のこの実施形態は、それをＨＣＳと連
結されることによって、ＨＣＳのスループットを増加させる利点を有し、それに
より、連結されたＨＴＳにおける応答を示すウェルの小さなサブセットについて
のみより遅い高分解能データ取得および分析を必要とする。
【００７７】 高スループット「全プレート」リーダーシステムは当該分野でよく知られてお
り、多数の化合物をスクリーニングするのに用いられるＨＴＳシステムの成分と
して通常は使用される（ベグスら（１９９７），上記、マーカフレー(McCaffrey
)ら（１９９６），上記）。本発明のＨＴＳは、十分な分解能にてプレート中の
多くのまたは全てのウェルを同時に読んで、ウェル間ベースで測定を行うことに
よって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイで行われる。す
なわち、各ウェル中の多くのまたは全ての細胞または多量の物質の全シグナル出
力を平均することによって計算がなされる。ＨＴＳにおいていくつかの規定され
た応答を呈するウェル（「ヒット」）が、このシステムによって伝えられる。次
いで、同一のマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイについて、
ヒットとして同定された各ウェルは上述したようにＨＣＳを介して測定される。
このように、デュアルモードプロセスは以下のものを含む： １．マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイの多数のウェルの
迅速な測定、 ２．ウェル間ベースで蛍光標識レポータ分子の全活性を測定して「ヒット」（
規定された応答を呈するウェル）を同定するためのデータの解釈、 ３．各「ヒット」ウェルにおける多数の細胞のイメージング、および ４．個々の細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性（すなわち
、細胞内測定）および細胞の分布を測定して、特異的生物学的機能につきテスト
するためのデジタルイメージデータの解釈。
【００７８】 デュアルモード処理の好ましい実施形態において（図１１）、ラン３０１の開
始において、オペレータは、プレートおよびその内容を説明する情報３０２を入
力し、フィルタ設定および蛍光チャネルを特定して、使用される生物学的標識を
適合させ、求められる情報およびカメラ設定を測定して、試料の明るさを適合さ
せる。これらのパラメータは、各自動ランについての容易な検索のためにシステ
ムのデータベースに保存される。マイクロタイタープレートまたはマイクロウェ
ルアレイは、ロボットーローディングデバイスを制御することによって、手動ま
たは自動にて細胞スクリーニングシステム３０３にロードされる。任意の環境チ
ャンバー３０４はこのシステムによって制御されて、マイクロタイタープレート
またはマイクロウェルアレイ中の生細胞を囲う空気中の温度、湿度およびＣＯ２ レベルを維持する。任意の流体送達デバイス３０５（図８参照）は、走査の間に
流体をウェルに分注するためのシステムによって制御される。
【００７９】 高スループット処理３０６は、プレート中のウェルの各々からのシグナルを取
得し分析することによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルア
レイでまず行われる。高スループットモード３０７で行われる処理は図１２に示
され、以下に述べる。この高スループットモードにおいていくつかの選択された
強度応答を呈するウェル（「ヒット」）はこのシステムによって同定される。こ
のシステムは、ヒットについてテストする条件付操作３０８を行う。ヒットが見
出されれば、それらの特異的ヒットウェルは、さらに、高含有量（ミクロレベル
）モード３０９で分析される。高含有量モード３１２で行われる処理は図１３に
示される。次いで、システムは、プレート上の測定の結果と共に情報化学データ
ベース３１１を更新する３１０。分析すべきより多くのプレートがあれば３１３
、システムは次のプレート３０３をロードし、そうでなければ、プレートの分析
は終了する３１４。
【００８０】 以下の議論は、図１２に示された高スループットモードを説明する。システム
の好ましい実施形態、単一プラットフォームデュアルモードのスクリーニングシ
ステムを説明する。当業者であれば、操作的にはデュアルプラットフォームシス
テムは、光学を移動させるよりはむしろ２つの光学系の間でプレートを移動させ
ることを単に含む。一旦システムが設定され、プレートがロードされれば、シス
テムはＨＴＳ取得および分析４０１を開始する。ＨＴＳ光学モジュールは、デュ
アルモードシステムで電動任意位置決定デバイス４０２を制御することによって
選択される。１つの蛍光チャネルにおいて、プレート上の一次マーカからのデー
タが取得され４０３、マスキング手法４０４を用いてウェルをプレートのバック
グラウンドから単離する。また、使用されるべき他の蛍光チャネルでイメージが
取得される４０５。各ウェル４０６に対応する各イメージ中の領域が測定される
４０７。特定のウェルについての測定から計算された特徴をあらかじめ規定され
た閾値または強度応答４０８と比較し、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」４
０９として伝え、または伝えない。ヒットとして伝えられたウェルの位置は、引
き続いての高含有量モード処理のために記録される。処理すべきウェルが残って
いれば４１０、全てウェルが処理され４１１、且つシステムが高スループットモ
ードから出るまでプログラムはループバックする４０６。
【００８１】 ＨＴＳ分析に続き、システムは図１３で規定された高含有量モード処理５０１
を開始させる。このシステムは、電動位置決定システムを制御することによって
ＨＣＳ光学モジュール５０２を選択する。高スループットモードでよく同定され
た各「ヒット」では、ウェルのＸＹ段階位置をメモリーまたはディスクから検索
し、次いで、段階を選択された段階位置５０３まで移動させる。各ヒットウェル
における最初の視野、次いで、各ウェル内の５から８視野ごとに１回、オートフ
ォーカス手法５０４が求められる。１つのチャネルにおいて、一次マーカ５０５
（典型的には、ＤＡＰＩ、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）またはＰＩ蛍光色素で逆
染色した細胞核）でイメージが取得される。次いで、適合閾値決定手法５０６を
用いてイメージが分割される（核および非核の領域に分離される）。細分化手法
の出力はバイナリーマスクであり、ここに、物体は白色であって、バックグラウ
ンドは黒色である。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用
いて、視野が物体５０７を含有するかを決定する。マスクを小斑点標識方法で標
識し、それにより、各物体（または小斑点）はそれに帰属されるただ１つの数を
有する。物体が視野で見出されれば、全ての他の活性チャネル５０８でイメージ
が取得され、そうでなければ、段階は現在のウェル中の次の視野５１４に進めら
れる。さらなる分析５０９のために、各物体はイメージ中に位置させる。物体の
面積および形状等の形態学的特徴を用いて、細胞核５１０であるように見える物
体を選択し、人工物であると考えられるものを捨てる（それをさらに処理しない
）各有効細胞核では、ＸＹＺ段階の位置を記録し、細胞の小さなイメージを保存
し、アッセイ特異的特徴を測定する５１１。次いで、いくつかの分析方法を適用
していくつかの波長の各々で特徴を測定することによって、システムは細胞につ
いて多数のテストを行う。細胞の等張を測定した後、システムは、現在の視野５
１２中にいずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体
があれば、それは次の物体５０９を位置決定し、それが有効細胞核５１０につい
ての基準を満たしているか否かを決定し、その特徴を測定する。現在の視野中で
全ての物体を処理した後、システムは、それが現在のウェル５１３中により多く
の細胞または視野を見出す必要があるか否かを決定する。現在の視野中でより多
くの細胞または視野を見出す必要があれば、それはＸＹＺ段階を現在のウェル５
１５内の次の視野に進める。そうでなければ、システムは、それが測定すべきい
ずれかの残りのヒットウェルを有するか否かをチェックする５１５。そうであれ
ば、それは次のヒットウェル５０３に進み、取得および分析の別のサイクルを通
じて進め、そうでなければ、ＨＣＳモードは終了する５１６。
【００８２】 本発明の代替実施形態において、動的生細胞スクリーニングの方法が提供され
る。本発明のすでに記載した実施形態を用いて、時間において特定した時点で細
胞成分の空間的分布を特徴づける（化学的固定の時間）。それ自体、イメージ取
得の順次の性質およびプレート上の全てのウェルを読むのに必要な量のため、こ
れらの実施形態は動的ベースのスクリーニングを実行するための限定された利用
性を有する。例えば、プレートは全てのウェルを読み終えるのに３０から６０分
要するので、生細胞のプレートを単に調製し、次いで、１回以上全てのウェルを
読み終えることによって、非常にゆっくりとした動的プロセスが測定できるのに
すぎない。より速い動的プロセスは、次のウェルに進む前に各ウェルの複数の読
みを行うことによって測定できるが、最初および最後のウェルの間に経過する時
間はあまりにも長く、速い動的プロセスは最後のウェルに到達する前に完了する
ようである。
【００８３】 本発明の動的生細胞の延長は、その空間的特徴の代わりに、またはそれに加え
てその速度論によって生物学的プロセスを特徴づけるデザインおよびスクリーニ
ングの使用を可能とする。多くの場合、生細胞における応答は、試薬を特異的ウ
ェルに添加し、適当なタイミングでそのウェルについて複数の測定をなすことに
よって測定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞実施形態は、ウ
ェルを読む進行において特定の時点に試薬を各ウェルに送達するためのシステム
の個々のウェルへの流体送達用の装置を含む。この実施形態は、それにより、動
的測定が、プレートの各ウェルについて数秒から数分の時間的分解でなすことを
可能とする。動的生細胞システムの全効率を改良するために、取得制御プログラ
ムを修飾して、プレートのサブ領域からの反復的データ収集を可能とし、システ
ムが個々のウェルに必要な時点の間に他のウェルを読むことを可能とする。
【００８４】 図８は、本発明の生細胞実施形態で用いる流体送達デバイスの一例を記載し、
それは上述した。この設定は、ピペット先端７０５の１つの組、または単一のピ
ペット先端でさえ、プレート上の全てのウェルに試薬を送達するのを可能とする
。シリンジポンプ７０１のバンクを用いて、流体を１２のウェルに同時に、また
は先端７０５のいくつかを取り除くことによってより少数のウェルに流体を送達
することができる。従って、システムの時間的分解は、以下のように、先端およ
び走査パターンの数を変更することによって、データ収集効率を犠牲にすること
なく調整することができる。典型的には、単一ウェルからのデータ収集および分
析は約５秒を要する。ウェル間の移動およびウェル中の焦点合わせは約５秒要し
、従って、ウェルについての全サイクル時間は約１０秒である。従って、単一の
ピペット先端を用いて流体を単一のウェルに送達し、データをそのウェルから反
復して収集するならば、測定は約５秒の時間的分解にて行うことができる。６つ
のピペット先端を用いて流体を６つのウェルに同時に送達し、システムが全ての
６つのウェルを反復して走査するならば、各走査は６０秒を要し、それにより、
時間的分解を確立する。８分ごとにデータ収集を要するにすぎないより遅いプロ
セスでは、流体送達相の間にプレートを移動させ、次いで、プレートのその半分
を反復して走査することによって、流体をプレートの半分まで送達することがで
きる。従って、プレート上で走査すべきサブ領域のサイズを調整することによっ
て、取得の間に待ち時間を挿入する必要なくして時間的分解を調整することがで
きる。システムは継続してデータを走査し取得することができるので、従って、
プレートからの動的データ組を収集するための全時間は、単に、プレートの単一
走査を行うための時間に必要な時点の数を乗じたものである。典型的には、化合
物の添加前の１時点および添加に続いての２または３時点はスクリーニング目的
で十分なはずである。
【００８５】 図１４は、動的分析で用いられる取得系列を示す。処理８０１の開始はシステ
ムの配置であり、その多くは標準的なＨＣＳ配置と同一である。加えて、オペレ
ータは、サブ領域のサイズ、必要な時点の数、および必要な時間の増分等の、実
行すべき動的分析に特異的な情報８０２を入力しなければならない。サブ領域は
、動的データを蓄積するために反復して走査それるウェルの群である。サブ領域
のサイズは、単一時間増分の間に全サブ領域を１回走査し、このように、待ち時
間を最小化するように調整される。最適サブ領域サイズは設定パラメータから計
算され、必要であればオペレータが調整する。次いで、システムはプレートを第
１のサブ領域８０３に、およびそのサブ領域８０４中の最初のウェルに移動させ
て、予備刺激（時間＝０）時点を取得する。各ウェルで行われる取得系列は、動
的モードで実行される特異的ＨＣＳで必要はものと正確に同一である。図１５は
その処理についてのフローチャートを詳細に示す。開始９０１および復帰９０２
の間の工程の全ては、図１３中の工程５０４−５１４として記載されたものと同
一である。
【００８６】 サブ領域中の各ウェルを処理した後、システムは、サブ領域中の全てのウェル
が処理されたか否か８０６（図１４）をチェックし、全領域が処理されるまで全
てのウェルを通じてサイクルする。次いで、システムはプレートを流体添加のた
めの位置に移動させ、全サブ領域８０７への流体の流動システム送達を制御する
。これは、プレート上のいくつかの列にわたるサブ領域についての複数添加を必
要とし、システムはＸ，Ｙ段階上のプレートを添加の間に移動させる。一旦流体
が添加されれば、システムは第１のウェルをサブ領域８０８まで移動させて、時
点の取得を開始する。データは各ウェル８０９から取得され、上述したように、
システムはサブ領域８１０中の全てのウェルを通じてサイクルする。各々がサブ
領域を通った後、システムは、全ての時点が収集されたか否かをチェックし８１
１、そうでなければ、必要であれば８１２休み８１３、必要な時間増分と同調し
たままとする。そうでなければ、システムはプレート８１４上のさらなるサブ領
域をチェックし、次のサブ領域８０３まで移動するか、あるいは終了する８１５
。このように動的分析モードは、引き続いてのサブ領域中でのデータ取得に先立
ってのサブ領域内でのデータ取得と共に、調べるべき動的応答に基づいて、スク
リーニングすべきマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルのサブ領域の
オペレータによる同定を含む。
【００８７】 特異的スクリーニング 本発明の他の特徴は、細胞スクリーニング方法および特異的細胞構成要素およ
びプロセスの分布および活性を規定するための手法を細胞スクリーニングシステ
ムが実行させる指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能記録媒体
を提供することである。好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステ
ムは、細胞を保持するのに適した段階および段階を移動させるための手段、デジ
タルカメラ、デジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するための光源
、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するためのコンピュ
ータ手段を含む。本発明のこの態様は、細胞スクリーニングシステムが、ルミネ
センスプローブ、任意のイメージングシステム、および本発明のパターン認識ソ
フトウェアを用いて、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を規
定するように指令するプログラムを含む。機械読み取り可能記録媒体の好ましい
実施形態は、細胞スクリーニングシステムに図９、１１、１２、１３、１４また
は１５に記載された手法を実行させるための指令の組からなるプログラムを含む
。別の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムら、特異的細胞構成要
素およびプロセスの分布および活性を検出するための手法を実行させるための指
令の組からなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセ
スは、限定されるものではないが、タンパク質の核移動、細胞形態、アポトーシ
ス、受容体内部化、およびタンパク質のプロアーゼ−誘導移動を含む。
【００８８】 好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムを用いて、種々の細
胞プロセスを修飾する化合物を同定する。細胞をテスト化合物と接触させ、特定
の細胞プロセスに対するテスト化合物の効果を分析することができる。別の方法
として、細胞をテスト化合物および特定の細胞プロセスを修飾する既知の剤と接
触させて、テスト化合物が既知の剤の効果を阻害または増強するかを測定するこ
とができる。このように、この特徴に係る方法を用いて、特定の細胞応答を増加
または減少させるテスト化合物を同定し、ならびに特定の細胞応答を増加または
減少させる他の剤の能力に影響するテスト化合物を同定することができる。
【００８９】 別の実施例において、高スループットモードで低分解能でこの方法を用いて細
胞を含有する位置が分析させ、細胞を含有する位置のサブセットのみが高含有量
モードで分析させて、分析すべき細胞の細胞下区画においてルミネセンス標識受
容体分子からのルミネセンスシグナルが得られる。
【００９０】 以下の実施の形態は説明目的のためだけを意図し、添付の特許請求の範囲で規
定される本発明の範囲を限定されるものと解釈されるべきではない。
【００９１】 以下の実施の形態で言及される種々の化学化合物、試薬、色素、および抗体は
、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical)（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、モレキュ
ラー・プローブ社(Molecular Probes)（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、アルドリック・
ケミカル社(Aldrich Chemical Company)（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、アクレ
ート・ケミカル社(Accurate Chemical Company)（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、
ジャクソン・イムノラボ社(Jackson Immunolabs)およびクローンテック社(Clont
ech)（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）等の入手源から商業的に入手可能である。
【００９２】 実施形態１ 細胞質から核への移動スクリーニング ａ．転写因子 いくつかの遺伝子の転写の調節は、細胞質における転写因子の活性化を含み、
その結果、その因子は核に移動され、そこでそれは特定の遺伝子または複数遺伝
子の転写を開始することができる。転写因子分布のこの変化は、特定の遺伝子ま
たは遺伝子の群の転写を阻害または誘導する化合物を検出する細胞ベースのスク
リーニングシステムのためのスクリーニングの基礎である。スクリーニングの一
般的説明をし、続いて具体的な例を説明する。
【００９３】 転写因子の分布は、核をヘキスト３３４２３等のＤＮＡ特異的フルオロフォア
で、および転写因子を特異的蛍光抗体で標識することによって測定される。ヘキ
スト標識核に自動焦点合わせした後、細胞ベースのスクリーニングシステムで核
のイメージを取得し、それを用いて、上述したように、いくつかの任意閾値設定
方法のうちの１つによってマスクを作成する。このマスクによって規定される領
域の形態学的記述子を使用者規定のパラメータと比較し、有効核マスクを同定し
、転写因子分布を抽出するための以下の方法で用いる。各有効核マスクを腐食さ
せて、わずかにより小さな領域を規定する。次いで、元の核マスクを２つの方法
で膨張させて、核の周りのリング形状領域を規定し、これは、細胞質領域を表す
。これらの２つの領域の各々における平均抗体蛍光を測定し、これらの平均の間
の差異をＮｕｃＣｙｔ差異として規定する。核移動を測定するための２つの例を
以下で記載し、図１０Ａ−図１０Ｊに示す。図１０Ａは、青色フルオロフォアで
標識したその核２００および緑色フルオロフォアで標識した細胞質２０１におけ
る転写因子を備えた未刺激細胞を示す。図１０Ｂは細胞ベースのスクリーニング
システムによって誘導された核マスク２０２を示す。図１０Ｃは緑色波長でイメ
ージした未刺激細胞の細胞質２０３を示す。図１０Ｄは、核マスク２０２を一旦
腐食させて（還元して）、最小細胞質分布を持つ核サンプリング領域２０４を規
定することを示す。核境界２０２を数回膨張（拡大）して、２−３画素の広さで
あるリングを形成し、これを用いて、同一細胞につき細胞質サンプリング領域２
０５を規定する。図１０Ｅは、さらに側面図を示し、これは、核サンプリング領
域２０４および細胞質サンプリング領域２０５を示す。これらの２つのサンプリ
ング領域を用い、細胞間ベースで細胞ベーススクリーニングシステムによって、
核移動についてのデータを自動的に分析することができる。図１０Ｆ−Ｊは刺激
した細胞における核移動を測定するための戦略を示す。図１０Ｆは、青色フルオ
ロフォアで標識した核２０６および緑色フルオロフォアで標識した細胞質２０７
における転写因子を備えた刺激細胞を示す。図１０Ｇにおける核マスク２０８は
、細胞ベースのスクリーニングシステムによって駆動される。図１１は、緑色波
長でイメージした刺激細胞の細胞質２０９を示す。図１０Ｉは刺激細胞の核サン
プリング領域２１１および細胞質サンプリング領域２１２を示す。図１０Ｉは、
さらに、側面図を示し、これは核サンプリング領域２１１および細胞質２１１を
示す。
【００９４】 この方法の具体的適用を用いて、スクリーニングとしてこの方法を有効化した
。ヒト細胞系を９６ウェルマイクロタイタープレートで平板培養した。ウェルの
いくつかの列をＩＬ−１（ＭＦ−ＫＢ転写因子の既知の誘導因子）で力価測定し
た。次いで、細胞を固定し、転写因子に対するフルオレセイン標識抗体、および
ヘキスト３３４２３での標準的な方法によって染色した。細胞ベースのスクリー
ニングシステムを用いて、このプレートからのイメージを取得し分析し、Ｎｕｃ
Ｃｙｔ差異は、図１６に示すように、ウェルに添加されたアゴニストの量と強く
相関することが見出された。第２の実験において、ＩＬ−１、ＩＬ−１ＲＡに対
する受容体に対するアンタゴニストをＩＬ−１αの存在下で力価測定し、ＩＬ−
１αによって誘導された移動を徐々に阻害した。ＮｕｃＣｙｔ差異は、図１７に
示すように、移動のこの阻害を強く相関することが見出された。
【００９５】 さらなる実験は、ＮｕｃＣｙｔ差異、ならびにＮｕｃＣｙｔ比率が、広い範囲
の細胞密度および試薬濃度にわたって合致する結果を与え、従って、これを日常
的に用いて特異的核移動活性のための化合物ライブラリをスクリーニングするこ
とができるのを示した。さらに、同一方法は、他の転写因子、またはＧＦＰ−転
写因子キメラ、あるいは生細胞または固定細胞に導入された蛍光標識転写因子に
対する抗体で用いて、転写因子活性の調節に対する効果につきスクリーニングす
ることができる。
【００９６】 図１８は、実施の形態１に従って得られたデータのＰＣ画面上での代表的なデ
ィスプレイである。グラフ１ １８０は、核サンプリング領域および細胞質サン
プリング領域における平均抗体蛍光の間の差異、ＮｕｃＣｙｔ差異対ウェル番号
をプロットする。グラフ２ １８１は、核サンプリング領域における抗体の平均
蛍光、ＮＰ１平均、対ウェル番号をプロットする。グラフ３ １８２は、細胞質
サンプリング領域における平均抗体蛍光、ＬＩＰ１平均、対ウェル番号をプロッ
トする。ソフトウェアは各細胞からのデータの表示を行わせる。例えば、図１８
はスクリーンディスプレイ１８３、核イメージ１８４、および細胞番号２６につ
いての蛍光抗体イメージ１８５を示す。
【００９７】 図１８のグラフ１ １８０において言及したＮｕｃＣｙｔ差異は、平均細胞質
プローブ（蛍光レポータ分子）強度および平均核プローブ（蛍光レポータ分子）
強度の間の差異である。図１８のグラフ２ １８１で言及したＮＰ１平均は、核
サンプリング領域内の細胞質プローブ（蛍光レポータ分子）平均である。図１８
のグラフ３ １８２で言及したＬ１Ｐ１平均は、細胞質サンプリング領域内の平
均プローブ（蛍光レポータ分子）強度である。
【００９８】 当業者であれば、本発明のこの特徴は、活性化に際して細胞質から核に移動す
る他の転写因子を用いて実施できることを理解するであろう。別の特別の例にお
いて、細胞内のその空間的位置を規定することによって、ｃ−ｆｏｓ転写因子の
活性化を評価した。活性化されたｃ−ｆｏｓは核内のみに見出され、他方、不活
化ｃ−ｆｏｓは細胞質内に存在する。
【００９９】 ３Ｔ３細胞を、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ９６−ウェルプレート中、ウェ
ル当たり５０００−１００００細胞で平板培養した。細胞を付着させ、一晩増殖
した。細胞を１００μｌの無血清培地で２回濯ぎ、無血清ＭＥＭ培養基中で２４
−３０時間インキュベートし、次いで、１−５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にて無
血清培地に直接希釈した血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（シグマ・ケミ
カル社 Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で平均２０分間刺激した。
【０１００】 刺激に続き、１Ｘハンクスの緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）中の３．７％ホル
ムアルデヒドで２０分間細胞を固定した。固定の後、細胞をＨＢＳＳで洗浄して
、残存する固定剤を除去し、ＨＢＳＳ中の０．５％トリトンＸ−１００溶液で９
０秒間浸透させ、ＨＢＳＳで２回洗浄して残存する洗剤を除去した。次いで、Ｈ
ＢＳＳ中のＢＳＡの０．５％溶液で細胞を１５分間ブロックし、さらに、希釈さ
れた一次抗体溶液の希釈に先立ってＨＢＳＳで洗浄した。
【０１０１】 ｃ−ｆｏｓウサギポリクローナル抗体（カルバイオケム，ＰＣ０５）をＨＢＳ
Ｓ中に１：５０希釈し、５０μｌの希釈を各ウェルに適用した。室温にて、一次
抗体の存在下で細胞を１時間インキュベートし、次いで、ＡＬＥＸＡＴＭ４８８
（モレキュラー・プローブ社）にコンジュゲートしたヤギ抗−ウサギ二次抗体を
含む光密容器中、室温にて１時間インキュベートし、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／
ｍｌストックから１：５００希釈した。次いで、ヘキストＤＮＡ色素（モレキュ
ラー・プローブ社）を製造業者のストック溶液の１：１００希釈にて添加した（
１０ｍｇ／ｍｌ）。次いで、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、本発明の細胞スクリーニ
ングシステムでの分析に先立ってプレートを密封した。これらの実験からのデー
タは本発明の方法を用いて、細胞内のその空間的位置を規定することによってｃ
−ｆｏｓの転写活性化を測定することができるのを示した。
【０１０２】 以下の方法をｃ−ｆｏｓ活性化の検出に適用するが、それを、活性化に際して
細胞質から核に移動するいずれの転写因子の分析にも適用できることを当業者は
認識するであろう。そのような転写因子の例は、限定されるものではないが、ｆ
ｏｓおよびｊｕｎホモログ、ＮＦ−ＫＢ（Ｂ細胞からの核因子κ）、ＮＦＡＴ（
活性化されたＴ−リンパ球の核因子）、およびＳＴＡＴ（転写のシグナルトラン
スデューサおよびアクチベータ）因子を含む（例えば、ストレロー(Strehlow, I
.)およびシンドラー(Schindler, C.) ，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７３：２８０４９−２８０５６、コー(Chow)ら，１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２
７８：１６３８−１６４１、ディング(Ding)ら，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７３：２８８９７−２８９０５、ボルドウィン(Baldwin)，１９９６．
Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：６４９−８３、クオ（Kuo, C. T.）
，およびライデン(J. M. Leiden) ，１９９９．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１７：１４９−８７、ラオ(Rao)ら，１９９７．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５：７０７−４７、マスダ(Masuda)ら，１９９８．Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌ．１０：５９９−６１１、ホーイ(Hoey, T.)，およびユー．シンドラ
ー(U. Schindler) ，１９９８．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．８
：５８２−７、リュー(Liu)ら，１９９８．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１０：２７１−８参照）。
【０１０３】 このように、本発明のこの態様において、インジケータ細胞をテスト化合物で
処理し、ルミネセンス標識転写因子の分布を、前述した開示のもののような細胞
スクリーニングシステムを用いて空間および時間にて測定する。ルミネセンス標
識転写因子は、テスト化合物と細胞とを接触させる前に、それと共に、またはそ
の後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができる。
【０１０４】 例えば、転写因子は、トランスフェクトされたインジケータ細胞によってルミ
ネセンス標識タンパク質キメラとして発現することができる。別の方法として、
ルミネセンス標識転写因子を、上述したように発現させ、単離し、インジケータ
細胞にバルク−ロードすることができるか、あるいは転写因子を単離後にルミネ
センス標識することができる。さらなる代替として、転写因子は、インジケータ
細胞によって発現され、これを引き続いて転写因子を検出する抗体等の蛍光標識
と接触させる。
【０１０５】 さらなる態様において、注目する転写因子を特異的に認識する抗体、上述した
方法を実施するために抗体を用いる指令を含む、転写因子活性化を分析するため
のキットを提供することである。好ましい実施形態において、転写因子−特異的
抗体、転写因子抗体を検出する二次抗体をルミネセンス標識する。さらなる好ま
しい実施形態において、このキットは、注目する転写因子を発現する細胞を含有
し、および／またはこのキットは、限定されるものではないが、共にｆｏｓ活性
化を修飾する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血清、および共にＮＦ−Ｋ
Ｂ活性化を修飾するインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）を含めた注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を
含有する。
【０１０６】 別の実施形態において、このキットは、活性化に際して細胞質から核に移動す
る注目する転写因子をコードする核酸を含む組換え発現ベクターおよび注目する
細胞において転写因子活性化を修飾する化合物を同定するのに発現ベクターを用
いる指令を含む。別の方法として、このキットは精製されたルミネセンス標識転
写因子を含有する。好ましい実施形態において、転写因子は、限定されるもので
はないが、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはその突然変異体もしく
は断片を含めた、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現される。種々の
好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベクターでトランスフ
ェクトされた細胞、注目する転写因子に特異的に結合する抗体または断片、およ
び／または（上述した）注目する転写因子の活性化を修飾することが知られてい
る化合物を含む。
【０１０７】 ｂ．プロテインキナーゼ また、細胞質から核へのスクリーニング方法を用いて、細胞質に不活性状態で
存在し、活性化に際して核に輸送されるか、あるいはリン酸化に際して細胞質か
ら核に移動する基質をリン酸化するいずれのプロテインキナーゼの活性化も分析
することができる。適当なプロテインキナーゼの例は、限定されるものではない
が、細胞外シグナル−調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎアミノ末
端キナーゼ（ＪＮＫ）、Ｆｏｓ調節プロテインキナーゼ（ＦＲＫ）、ｐ３８マイ
トジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、プロテインキナーゼＡ
（ＰＫＡ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ
Ｋ）を含む。（例えば、ハル(Hall)ら，１９９９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２
７４：３７６−８３、ハン(Han)ら，１９９５．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ．１２６５：２２４−２２７、Ｊａａｒｏら，１９９７．Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：３７４２−３７４７、テー
ラーら，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０８−３１８、ザオ(Z
hao, Q.)，およびリー(F. S. Lee)，１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７
４：８３５５−８、パオリロエト(Paolilloet)ら，１９９９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ．２７４：６５４６−５２、コソ(Coso)ら，１９９５．Ｃｅｌｌ ８１：
１１３７−１１４６、ティブルス(Tibblies, L. A.)およびウッドゲット(J. R.
Woodgett)，１９９９．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５５：１２３０
−５４、シャエファ(Schaeffer, H. J.)およびウエーバー(M. J. Weber) ，１９
９９．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：２４３５−４４参照）。
【０１０８】 別の方法として、プロテインキナーゼ活性は、注目するプロテインキナーゼに
よってリン酸化された後、細胞質から核へのルミネセンス標識プロテインキナー
ゼ基質の移動をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態におい
て、この基質は非リン酸化されており、リン酸化に先立っては細胞質のものであ
り、プロテインキナーゼによるリン酸化に際して核へ移動する。この実施形態で
は、プロテインキナーゼそれ自体が細胞質から核へ移動するという用件はない。
そのような基質（および対応するプロテインキナーゼ）の例は、限定されるもの
ではないが、ｃ−ｊｕｎ（ＪＮＫ基質）、ｆｏｓ（ＦＲＫ基質）、およびｐ３８
（ｐ３８ＭＡＰＫ基質）を含む。
【０１０９】 このように、これらの実施形態においては、インジケータ細胞をテスト化合物
で処理し、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質
の分布は、前述で開示したもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空
間および時間において測定される。ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたは
プロテインキナーゼ基質は、細胞とテスト化合物とを接触させる前、それと共に
またはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができ
る。例えば、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、トランスフ
ェクトされたインジケータ細胞によってルミネセンス標識タンパク質キメラとし
て発現され得る。別の方法として、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたは
プロテインキナーゼ基質は、上述したように、発現され、単離され、インジケー
タ細胞にバルク−ロードできるか、あるいはプロテインキナーゼまたはプロテイ
ンキナーゼ基質は単離後にルミネセンス標識することができる。さらなる代替と
して、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質はインジケータ細胞に
よって発現され、これは引き続いてプロテインキナーゼまたはプロテインキナー
ゼ基質を検出する標識抗体等のルミネセンス標識と接触させる。
【０１１０】 さらなる実施形態において、プロテインキナーゼ活性は、プロテインキナーゼ
基質のリン酸化状態（すなわち：リン酸化されているまたはリン酸化されていな
い）をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態において、活性
化に際して、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質が細胞質から核
へ移動する要件はない。好ましい実施形態において、リン酸化状態は、注目する
プロテインキナーゼ基質のリン酸化形態にのみ結合する抗体と細胞とを接触させ
ることによってモニターされる（例えば、米国特許第５，５９９，６８１号に開
示）。
【０１１１】 別の好ましい実施形態において、リン酸化のバイオセンサーが用いられる。例
えば、ルミネセンス標識タンパク質またはその断片は、（ａ）注目するプロテイ
ンキナーゼによって認識されるリン酸化部位、および（ｂ）リン酸化によってマ
スク解除される核局所化シグナルを含有するように作成されたタンパク質に融合
させることができる。このように、そのようなバイオセンサーはリン酸化に際し
て核に移動し、その移動はプロテインキナーゼ活性化の尺度として用いることが
できる。
【０１１２】 別の態様において、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ基質、または注
目するプロテインキナーゼ基質のリン酸化形態に特異的に結合する一次抗体およ
び注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物を同定する
一次抗体を用いる指令を含むプロテインキナーゼ活性化を分析するためのキット
を提供することである。好ましい実施形態において、一次抗体、またはこの一次
抗体を検出する二次抗体はルミネセンス標識される。他の好ましい実施形態にお
いて、このキットは、さらに、注目するプロテインキナーゼを発現する細胞、お
よび／または限定されるものではないが、ジブチリルｃＡＭＰ（修飾されたＰＫ
Ａ）、フォルスコリン（ＰＫＡ）、およびアニソマイシン（ｐ３８ＭＡＰＫ）を
含めた、注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化
合物を含む。
【０１１３】 別の方法として、このキットは、活性化に際して、細胞質から核に移動する注
目するプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質をコードする発現ベク
ター、および注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物
を同定するために発現ベクターを用いる指令を含む。別の方法として、このキッ
トは、精製されたルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナー
ゼ基質を含有する。好ましい実施形態において、注目するプロテインキナーゼま
たはプロテインキナーゼ基質は、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現
される。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベク
ターでトランスフェクトされた細胞、注目するプロテインキナーゼまたはプロテ
インキナーゼ基質に特異的に結合する抗体またはその断片、および／または（上
述した）注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化
合物を含む。
【０１１４】 別の態様において、本発明は、細胞スクリーニングシステムに転写因子または
プロテインキナーゼ活性化の分析につき開示した方法を実行させるための指令の
組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能記録媒体を含み、ここに、細胞
スクリーニングシステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適した段階
を備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンス
をデジタルカメラに向けるための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデ
ータを受領し処理するためのコンピュータ手段を含む。
【０１１５】 実施形態２ 細胞形態を修飾する化合物についての自動スクリーニング 細胞サイズの変化は、肥大、細胞付着および展延、分化、成長および***、壊
死およびプログラムされた細胞死滅、細胞移動度、形態形成、チューブ形成、お
よびコロニー形成等の多数の細胞条件に関連する。
【０１１６】 例えば、細胞肥大は遺伝子発現の改変のカスケードと関連づけられており、カ
バーグラス上で増殖する接着性細胞で明瞭に見ることができる細胞サイズの変化
によって細胞培養で特徴づけることができる。
【０１１７】 また、細胞サイズを測定して、接着性細胞の付着および展延を決定することも
できる。細胞展延は、基質リガンドへの細胞表面受容体の選択的結合およびシグ
ナリング経路の細胞骨格への引き続いての活性化の結果である。基質分子に対す
る細胞の付着および展延は、癌細胞の転移、炎症反応の間の白血球活性化、創傷
治癒の間のケラチノサイトの移動、および血管形成の間の内皮細胞の移動のため
の重要な工程である。これらの表面受容体、シグナリング経路、または細胞骨格
に影響する化合物は細胞展延に影響し、細胞サイズを測定することによってスク
リーニングすることができる。
【０１１８】 全細胞面積は、ＤＮＡ標識と組み合わせて、細胞骨格マーカ、サイトゾル容量
マーカ、細胞表面マーカを用いて全細胞体または細胞質を標識することによって
モニターすることができる。そのような標識（多くはモレキュラー・プローブ社
（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯｒｅＧｏｎ）およびシグマ・ケミカル社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手可能）の例は以下のものを含む。
【０１１９】
【表１】 これらの種々の剤での細胞染色のためのプロトコルは当業者によく知られてい
る。細胞を生きたまま、または固定後に染色し、細胞面積を測定することができ
る。例えば、ＤｉＩＣ１６で染色した生細胞は均一に標識された原形質膜を有し
、細胞の突出した断面積は色素の蛍光強度によってバックグラウンドから均一に
区別される。ＣＭＦＤＡ等のサイトゾル染料で染色した生細胞は、細胞の厚みに
比例する蛍光強度を生じる。細胞標識は細胞の薄い領域では薄暗いが、全細胞面
積はバックグラウンドから区別することができる。固定細胞は、重合されたアク
チンを標識するＡＬＥＸＡＴＭ４８８ファロイジン等の細胞骨格マーカで染色す
ることができる。ファロイジンは細胞質を均一に染色しないが、依然として、全
細胞面積をバックグラウンドから区別する。
【０１２０】 細胞肥大 以下の戦略を用い、細胞肥大を分析するスクリーニングを実行する。初代ラッ
ト筋細胞を９６ウェルプレート中で培養し、種々の化合物で処理し、次いで、固
定し、ヘキスト等のＤＮＡ標識と組み合わせて、細胞表面マーカまたはローダミ
ン−ファロイジン等の細胞骨格のための蛍光マーカに対する抗体等の、細胞膜ま
たは細胞質、または細胞骨格のための蛍光マーカで標識する。
【０１２１】 ヘキスト標識核に焦点を合わせた後、２つのイメージを取得し、１つはヘキス
ト標識核のイメージであり、１つの蛍光細胞質イメージである。この核は、閾値
設定してマスクを形成させ、次いで、マスクの形態学的記述子を使用者規定記述
子値の組と比較することによって同定される。次いで、各非核イメージ（または
「細胞質イメージ」）を別々に処理する。元の細胞質イメージは閾値設定でき、
細胞質マスクイメージを生じる。細胞を含有する局所領域が核のまわりに定義さ
れる。次いで、それらの領域における細胞の制限は、蛍光抗体イメージ中の同一
領域に対する局所的動的閾値操作によって規定することができる。腐食および膨
張の系列を用いて、わずかに触れる細胞を分離し、形態学的記述子の第２の組を
用いて単細胞を同定する。個々の細胞の面積を表にして、正常および肥大細胞か
らのサイズデータとの比較のために細胞サイズの分布を規定する。
【０１２２】 （平均細胞質面積／細胞として測定された）全９６−ウェルプレートからの応
答は上述した方法によって分析され、結果は、このアッセイがウェル間、プレー
ト間、および日間ベースで同一のものを実行することを示した（最大シグナルに
つき１５％ｃｏｖ）。このデータは毎日について非常に良好な相関を示し、プレ
ート中のウェル位置による変動はないことを示した。
【０１２３】 以下のものは全て視野につき計算できる。凝集体全核面積は核マスクにおける
非ゼロ画素の数である。平均全核面積は凝集体全核面積を核の全数で割ったもの
である。各細胞質イメージでは、いくつかの値を計算することができる。これら
は全細胞質面積であり、これは細胞質マスクにおける非ゼロ画素のカウントであ
る。凝集体細胞質強度は細胞質マスクにおける全ての画素の強度の合計である。
核当たりの細胞質面積は全細胞質面積を全核カウントで割ったものである。核当
たりの細胞質強度は、凝集体細胞質強度を全核カウントで割ったものである。平
均細胞質強度は、凝集体細胞質強度を細胞質面積で割ったものである。細胞質核
比率は、全細胞質面積を全核面積で割ったものである。
【０１２４】 加えて、主要な筋肉タンパク質等の他の細胞タンパク質に対する１以上の蛍光
抗体を含めることができる。これらのさらなる標識タンパク質のイメージを取得
し、後のレビューのために、このイメージに関して保存して、肥大細胞中のこれ
らのタンパク質の分布および形態の異常を同定することができる。マルチパラメ
ータスクリーニングのこの例は、細胞肥大およびアクチンもしくはミオシン分布
の変化の同時分析を可能とする。
【０１２５】 当業者であれば、この例は筋細胞を分析するが、この特徴に係る方法は全ての
細胞型における肥大または一般的な形態学的変化を分析するのに適用できること
を認識するであろう。
【０１２６】 前立腺癌についての細胞形態アッセイ 細胞展延は、基質付着リガンドに対する細胞表面受容体の応答の尺度である。
展延はリガンドの濃度に、または受容体−リガンド機能を低下させる化合物の濃
度に比例する。選択的な細胞−基質付着の１つの例は、細胞外マトリックスタン
パク質コラーゲンに対する前立腺癌細胞接着である。前立腺癌細胞はコラーゲン
に対する選択的接着を介して骨に転移する。
【０１２７】 前立腺癌細胞の転移に干渉する化合物を以下のようにスクリーニングした。Ｐ
Ｃ３ヒト前立腺癌細胞を適当な刺激体を含む培地中で培養し、それをコラーゲン
被覆９６プレートに継代する。リガンドの濃度は変化させることができ、あるい
は細胞展延の阻害剤をウェルに添加することができる。展延に影響し得る化合物
の例は、インテグリン−またはプロテオグリカン−ブロッキング抗体、ホスファ
チジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤を含めたシグナリング阻害剤、およびサ
イトカラシンＤ等の細胞骨格阻害剤等の受容体アンタゴニストである。２時間後
、細胞を固定し、細胞肥大についてのプロトコルのように、ＡＬＥＸＡＴＭ４８
８ファロイジン（モレキュラー・プローブ社）およびヘキスト３３３４２で染色
する。細胞質染色によって測定されたこれらの条件下での細胞のサイズは、バッ
クグラウンドレベルを超えて区別できる。視野当たりの細胞の数は、ヘキストＤ
ＮＡ色素で染色した核の数を測定することによって決定される。細胞当たりの面
積は、細胞質面積（ファロイジンイメージ）を細胞数（ヘキストイメージ）で割
ることによって見出される。細胞のサイズはリガンド−受容体の機能に比例する
。この面積はリガンド濃度によって、および細胞の得られた結果によって決定さ
れるので、薬物の効力ならびに薬物能力はこの細胞ベースのアッセイによって決
定することができる。他の測定は細胞肥大について上述したようになすことがで
きる。
【０１２８】 細胞形態を分析するための方法は、組み合わせた高スループット−高含有量ス
クリーニングで用いることができる。１つの例において、高スループットモード
は蛍光ファロイジン強度の増加につき全ウェルを操作する。閾値は、核（ヘキス
ト）および細胞（ファロイジン）が高含有量モードで測定されるものを超えるよ
うに設定される。別の例において、環境バイオセンサー（その例は、限定される
ものではないが、カルシウムおよびｐＨ変化に感受性のバイオセンサーを含む）
を細胞に添加し、この細胞を化合物と接触させる。細胞を高スループットモード
で走査し、バイオセンサーのルミネセンスについての所定の閾値を超えるウェル
を高含有量モードで走査する。
【０１２９】 さらなる態様において、（上述したもののように）細胞の細胞質、膜または細
胞骨格を特異的に標識するのに用いることができるルミネセンス化合物、および
この方法に従って細胞形態の変化を誘導または阻害するテスト刺激物を同定する
ために蛍光化合物を用いる指令を含む細胞形態を分析するためのキットを提供す
ることである。好ましい実施形態において、このキットは、さらに、細胞核につ
いての蛍光マーカを含む。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、
限定されるものではないが、インテグリン−もしくはプロテオグリカン−ブロッ
キング抗体、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤を含めたシグナリ
ング阻害剤、およびサイトカラシンＤ等の細胞骨格阻害剤を含めた細胞形態を修
飾することが知られている少なくとも１つの化合物を含む。
【０１３０】 別の態様において、本発明は、細胞スクリーニングシステムに細胞形態を分析
するための開示方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機
械読み取り可能記録媒体を含み、ここに、この細胞スクリーニングシステムは、
細胞を含有するプレートを保持するのに適合した段階を備えた光学系、デジタル
カメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラに向ける
ための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するため
のコンピュータ手段を含む。
【０１３１】 実施形態３ デュアルモードの高スループットおよび高含有量スクリーニング 以下の実施例は、原形質膜から基部側核位置へのＧＰＣＲの移動によって検出
されるＧ−プロテイン結合受容体（ＧＰＣＲ）の活性化のためのスクリーニング
である。本実施例は、どのようにして、細胞ベースのスクリーニングのためのデ
ュアルモードシステムにおいて高スループットスクリーニングを高含有量スクリ
ーニングと結合させることができるかを示す。
【０１３２】 Ｄ−プロテイン結合受容体は７つの膜貫通ドメイン細胞表面受容体の大きなク
ラスである。これらの受容体についてのリガンドは細胞中で二次シグナルのカス
ケードを刺激し、これは、限定されるものではないが、Ｃａ＋＋トランジエント
、環状ＡＭＰ生産、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびリン酸化を含むこと
ができる。数秒から数分に起こる、これらのシグナルの各々は迅速であるが、一
般的でもある。例えば、多くの異なるＧＰＣＲは活性化されると二次Ｃａ＋＋シ
グナルを生じる。また、ＧＰＣＲの刺激の結果、ＧＰＣＲが、細胞表面膜から内
部の基部側核区画に輸送される。この内部化は、上述した二次シグナルよりも特
定の受容体の活性化のかなりより受容体−特異的なインジケータである。
【０１３３】 図１９はＧＰＣＲの活性化についてのデュアルモードスクリーニングを示す。
ＧＰＣＲと青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）との安定なキメラを運ぶ細胞には、Ｆ
ｌｕｏ−３のアセトキシメチルエステル形態（エステルの加水分解によって生細
胞に取得される細胞浸透性カルシウムインジケータ（緑色蛍光））がロードされ
るであろう。次いで、それらをマイクロタイタープレート６０１のウェルに沈積
されるであろう。次いで、このウェルを流体送達システムを用いてテスト化合物
のアレイで処理し、全マイクロタイタープレートのＦｌｕｏ−３イメージの短い
系列が取得され、カルシウム応答を提示するウェルを分析する（すなわち、高ス
ループットモード）。このイメージは、図１９においてマイクロタイタープレー
ト６０１の例のように見える。この例におけるウェルＣ４およびＥ９等の少数の
ウェルは、受容体の刺激に際して放出されるＣａ＋＋のためより明るく蛍光を発
するであろう。次いで、応答６０２を誘導した化合物を含有するウェルの位置を
ＨＣＳプログラムに移し、核周辺領域へのＧＰＣＲ移動の焦点となる青色蛍光の
詳細な細胞間分析のために光学をスイッチする。図１９の底部は、高分解能細胞
データの分析の２つの可能な結果を示す。このカメラはウェル領域６０３のサブ
領域６０４をイメージし、蛍光細胞６０５のイメージを生じる。ウェルＣ４にお
いて、細胞中の蛍光の均一な分布は、受容体が内部化されていないことを示し、
これは観察されたＣａ＋＋応答が細胞中のいくつかの他のシグナリングシステム
の刺激の結果であったことを意味する。他方、ウェルＥ９ ６０６中の細胞は、
核周辺領域の受容体の濃度を明瞭に示し、これは受容体の十分な活性化を明瞭に
示す。少数のヒットウェルのみが高分解能で分析される必要があるため、デュア
ルモードシステムの全スループットはかなり高く、高スループットシステム単独
と匹敵する。
【０１３４】 実施形態４ 動的高含有量スクリーニング 以下は受容体の内部化の動力学を測定するためのスクリーニングの例である。
上述したように、ＧＰＣＲの刺激の結果、約１５分の時間経過で受容体が内部化
される。内部化されたまたはそうでないとして終点を単に検出するのは、ＧＰＣ
Ｒアゴニストまたはアンタゴニストとしての化合物の効力を否定するのに十分で
はないであろう。しかしながら、５分間隔での３時点は、測定の時間経過の間の
効力についての情報を提供するのみならず、このデータのより長時間への外挿を
可能とする。このアッセイを行うには、サブ領域を２つの列として規定し、サン
プリング間隔を５分とし、時点３の全数とする。次いで、２つの列を走査し、次
いで、剤を二列に添加し、時間＝０参照を確立することによってシステムを開始
させる。試薬の添加の後に、システムは二列のサブ領域を再び走査し、最初の時
点のデータを取得する。このプロセスはサブ領域の開始までの戻り走査を含めて
約２５０秒必要とするので、このシステムは第２の時点の取得を開始するのに５
０秒待つであろう。２以上のサイクルが３地点を生じ、システムは第２の二列サ
ブ領域に移動するであろう。最後の２つの二列サブ領域を走査してプレート上の
全てのウェルを終了し、その結果、全プレートにわたって各ウェルについて４時
点が得られる。ウェルについての時点は時間＝０に対してわずかに相殺されるが
、時点の間隔は必要な５分に非常に近く、現実の取得時間および結果は固定され
た細胞スクリーニングよりもかなり正確に記録される。
【０１３５】 実施形態５ ヒトグルココルチコイド受容体移動の高含有量スクリーニング ＨＣＳの１つのクラスは、細胞内構成要素の薬物−誘導動的再分布を含む。ヒ
トグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ（細胞の複雑な環境応答機構における単一
「センサー」）は、細胞に拡散したステロイド分子に結合する。リガンド−受容
体複合体は核に移動し、そこで転写活性化が起こる（フトン(Htun)ら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４８４５，１９９６）。
【０１３６】 一般に、それらの活性は鍵となる細胞内シグナリング経路の先端にあるので、
ホルモン受容体は優れた薬物標的である。従って、ｈＧＲ移動の高含有量スクリ
ーニングはインビトロリガンド−受容体結合アッセイよりも優れた区別された利
点を有する。本発明の細胞スクリーニングシステムにおける蛍光の２以上までの
チャネルの利用性は、スクリーニングが、他の受容体、他の区別される標的また
は他の細胞プロセス等の、２つのさらなるパラメータを平行して含有するのを可
能とする。
【０１３７】 プラスミド構築体。緑色蛍光タンパク質−ヒトグルココルチコイド受容体（Ｇ
ＦＰ−ｈＧＲ）キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラ
スミドは、ＧＦＰ突然変異体を用いて調製した（パーム(Palm)ら，Ｎａｔ．Ｓｔ
ｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：３６１（１９９７））。この構築体を用いてヒト頸癌
細胞系（ＨｅＬａ）をトランスフェクトした。
【０１３８】 細胞の調製およびトランスフェクション。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−
２）はトリプシン処理し、トランスフェクションに１２から２４時間先立って、
５％木炭／デキストラン−処理胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）およ
び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含有するＤＭＥＭを
用いて平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフ
ェクションは、リン酸カルシウム共沈殿によって（グラハム(Graham)およびバン
・デ・エブ(Van der Eb)，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３、サンブ
ルーク(Sambrook)ら（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）によって、またはリポフェクタミン（ライフ・テ
クノロジー社，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で行った。リン酸カルシウム
トランスフェクションでは、トランスフェクションに先立って、５％木炭／デキ
ストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培地を置き換えた。細胞を３７℃お
よび５％ＣＯ２にてリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共に４から５時間インキュ
ベートし、ＤＭＥＭで３から４回洗浄して沈殿を除去し、続いて、Ｃ−ＤＭＥＭ
を添加した。
【０１３９】 製造業者の指示に従って、抗生物質を含まない無血清ＤＭＥＭ中でリポフェク
タミントランスフェクションを行った（ライフ・テクノロジー社，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ＤＮＡ−リポソーム複合体での２から３時間のインキュ
ベーションに続き、培地を取り出し、Ｃ−ＤＭＥＭで置き換えた。９６−ウェル
マイクロタイタープレート中の全てのトランスフェクトされた細胞を、薬物処理
に先立って、３３℃および５％ＣＯ２にて２４時間から４８時間インキュベート
した。実験は、ＨｅＬａ細胞中にて一過的に発現された受容体で行った。
【０１４０】 ＧＦＰ−ｈＧＲ移動のデキサメタゾン誘導。受容体−リガンド移動動的データ
を得るために、トランスフェクトされた細胞の核を、まず、３３℃および５％Ｃ
Ｏ２にて、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（モレキュラー
・プローブ社）で２０分間標識した。細胞をハンクスの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）
中で１回洗浄し、１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳと共にＨＢＳＳ中の１０
０ｎＭデキサメタゾンを添加した。固定時点デキサメタゾン滴定データを得るた
めに、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞をまずＤＭＥＭで洗浄し、次いで、
１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の０から１０００ｎ
Ｍデキサメタゾンの存在下で、３３℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベート
した。細胞を生きたまま分析するか、あるいはそれをＨＢＳＳで濯ぎ、ＨＢＳＳ
中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト３３３４２で染色し
、分析前に洗浄した。細胞内ＧＦＰ−ｈＧＲルミネセンスシグナルはこの固定手
法によっては減少しなかった。
【０１４１】 イメージの取得および分析。動的データは、デキサメタゾンの添加後、１分間
間隔で３０分間、生細胞の視野から蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ｈＧＲおよびヘキ
スト３３３４２−標識核）を取得することによって収集した。同様に、イメージ
対は、デキサメタゾンの添加１時間後に、固定された時点のスクリーニングプレ
ートの各ウェルから得た。両方の場合において、各地点で得られたイメージ対を
用いて、各細胞中の核および細胞質領域を規定した。ＧＦＰ−ｈＧＲの移動は、
核におけるＧＦＰ−ｈＧＲの積分した蛍光強度を細胞質中のキメラの積分した蛍
光強度で割ることによってあるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として計算した
。固定時点スクリーニングにおいて、テストしたデキサメタゾンの核濃度におい
て少なくとも２００細胞から得られたデータから計算した。従って、細胞質から
核へのＧＦＰ−ｈＧＲの薬物−誘導移動は移動比の増加と相関した。
【０１４２】 結果。図２０は、ヒトグルココルチコイドの薬物に誘導された細胞質２５３か
ら核２５２への移動を概略的に表示する。この概略図の上方対は、デキサメタゾ
ンでの刺激の前２５０（Ａ）およびこの刺激の後２５１（Ｂ）の細胞内のＧＦＰ
−ｈＧＲの局所化を示す。これらの実験条件下で、薬物は細胞質ＧＦＰ−ｈＧＲ
の大部分を誘導して、核に移動させる。この再分布は、処理された２５５および
未処理の２５４細胞における細胞質および核蛍光の積分強度比率を決定すること
によって定量される。蛍光ミクログラフの下方対は、処理の前２５４および後２
５５における、単一細胞中のＧＦＰ−ｈＧＲの同定再分布を示す。数１００から
数１０００の細胞を含有するウェルでＨＣＳを行い、移動は、ＧＦＰ蛍光を呈す
る視野中で各細胞につき定量した。安定にトランスフェクトされた細胞系の使用
は最も首尾一貫して標識された細胞を生じるが、一過性トランスフェクションに
よって誘導された異なるレベルのＧＦＰ−ｈＧＲ発現は、本発明の細胞スクリー
ニングシステムによる分析に干渉しなかった。
【０１４３】 スクリーニングを実行するためには、この細胞スクリーニングシステムはプレ
ートの各ウェルを走査し、各々において細胞の集団をイメージし、個々に細胞を
分析する。ここに、２つのチャネルの蛍光を用いて、各細胞内でＧＦＰ−ｈＧＲ
の細胞質および核分布を規定する。図２１には、ＧＦＰ−ｈＧＲスクリーニング
の終わり近くにおける細胞スクリーニングシステムのグラフによるユーザインタ
ーフェ-スが描かれる。ユーザインターフェ-スは、システムの平行データ収集お
よび分析能力を示す。「核」２６１および「ＧＦＰ−ｈＧＲ」２６２と記された
ウインドウは、単一視野で得られ分析した蛍光イメージの対を示す。「色オーバ
ーレイ」２６０と記されたウインドウは、このイメージを偽着色し、それらを一
緒にすることによって形成され、従って、使用者は細胞変化を直ちに同定するこ
とができる。「保存された物体領域」ウインドウ２６５内では、各分析された細
胞およびその隣の細胞を検出するイメージが、それが検索されるにつれて提示さ
れる。さらに、ＨＣＳデータが収集されるにつれて、それは分析され、ＧＦＰ−
ｈＧＲ移動のこの場合には、直後の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーン２
６７の下方ウインドウに描かれた９６ウェルプレートは、いずれのウェルが使用
者−規定のスクリーニング基準の組に合致するかを示す。例えば、白色ウェル２
６９は、薬物−誘導移動が５０％の所定の閾値を超えたことを示す。他方、黒色
ウェル２７０は、テストすべき薬物が１０％未満の移動を誘導したことを示す。
灰色ウェル２６８は、移動値が１０％および５０％の間にある「ヒット」を示す
。分析すべき９６ウェルプレート２６６上の列「Ｅ」は、ＧＦＰ−ｈＧＲ移動を
活性化することが知られている薬物であるデキサメタゾンでの滴定を示す。本実
施例のスクリーニングは２つの蛍光チャネルを用いたに過ぎなかった。２つのさ
らなるチャネル（チャネル３ ２６３および４ ２６４）は他の特異的標識、細
胞プロセス、または細胞毒性の平行した分析のために複数のパラメータスクリー
ニングを作成するのに利用できる。
【０１４４】 新しいスクリーニングの有効化プロセスの間に強力なツールであるイメージデ
ータベースおよび情報データベースの間にリンクがある。スクリーニングの完了
において、使用者はイメージおよび計算されたデータに全てアクセスできる（図
２２）。細胞スクリーニングシステムの包括的なデータ分析パッケージは、使用
者が、複数のレベルにおいてＨＣＳデータを調べるのを可能とする。個々の細胞
についてのスプレッドシート２７９中のイメージ２７６および詳細なデータは別
々に見ることができるか、あるいは要約データをプロットすることができる。例
えば、９６ウェルプレート中の各細胞についての単一パラメータの計算された結
果はグラフ１ ２７５と記されたパネルに示される。このグラフ中で単一の点を
選択することによって、使用者は、存在するデータベースから要求された特定の
細胞についての全データ組を表示することができる。ここでは、単一細胞（細胞
番号１１８、灰色線２７７）からのイメージ対２７６および詳細な蛍光および形
態データが示される。大きなグラフ挿入２７８は、ＧＦＰ−ｈＧＲの移動につい
てのデキサメタゾンの濃度の結果を示す。各点は少なくとも２００細胞からのデ
ータの平均である。このアッセイにおいてデキサメタゾンについての計算された
ＥＣ５０は２ｎＭである。
【０１４５】 細胞スクリーニングシステムでのＨＣＳの強力な態様は、生細胞における多色
蛍光および形態パラメータを用いる動的測定の能力である。時間および空間測定
は、視野中の細胞の集団内の単一細胞で行うことができる。図２３は、単一視野
内のいくつかの細胞におけるＧＦＰ−ｈＧＲのデキサメタゾン−誘導移動につい
ての動的データを示す。ＧＦＰ−ｈＧＲでトランスフェクトされたヒトＨｅＬａ
細胞を１００ｎＭデキサメタゾンで処理し、ＧＦＰ−ｈＧＲの移動は単一細胞の
集団で経時的に測定した。グラフは、トランスフェクトされた細胞２８５、２８
６、２８７および２８８および非トランスフェクト細胞２８９の応答を示す。ま
た、これらのデータは、異なる発現レベルでの細胞を分析する能力を示す。
【０１４６】 実施形態６ 薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニング アポトーシスは、膨大な分子事象および経路を含む複雑な細胞プログラムであ
る。このプロセスに対する薬物作用のメカニズムを理解するには、時間および空
間分解にて可能な限り多くのこれらの細胞内事象を測定するのが必須である。従
って、細胞試料調製をほとんど要求しないアポトーシススクリーニングは、いく
つかのアポトーシス−関連パラメータの自動読み出しを提供し、理想的であろう
。細胞スクリーニングシステムのためにデザインされた細胞ベースアッセイは、
パクリタキセル−誘導アポトーシスの形態学的、小器官およびマクロ分子ホール
マークのいくつかを同時に定量するのに用いられてきた。
【０１４７】 細胞調製。この実験で選択された細胞はマウス結合組織繊維芽細胞（Ｌ−９２
９、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１）および高度に侵入的な神経膠細胞腫細胞系（ＳＮＢ
−１９、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１９）（ウェルチ(Welch)ら，Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１：６１０，１９９５）であった。アポト
ーシス誘導薬物での処理の前日、３５００細胞を９６−ウェルプレートの各ウェ
ルに入れ、湿潤５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、
培養基を各ウェルから取り出し、ＤＭＳ中で作成された２０ｍＭストックからの
種々の濃度のパクリタキセル（０−５０μＭ）を含有する新鮮な培地で置き換え
た。これらの実験で用いたＤＭＳＯの最大濃度は０．２５％であった。次いで、
細胞を上述したように２６時間インキュベートした。パクリタキセル処理時間の
最後において、各ウェルに、７５０ｍＭ Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（
モレキュラー・プローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および３μｇ／ｍｌのヘキス
ト３３３４２ ＤＮＡ−結合色素（モレキュラー・プローブ社）を含有する新鮮
な培地を与え、上述したように２０分間インキュベートした。次いで、プレート
上の各ウェルをＨＢＳＳで洗浄し、室温にて、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアル
デヒドで１５分間固定した。ホルムアルデヒドをＨＢＳＳで洗浄し、細胞を０．
５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００で９０秒間浸透させ、ＨＢＳＳで洗浄し、２
Ｕ ｍｌ−１ Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬファラシジン（モレキュラー・プローブ社）
と共に３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した。次いで、プレート上の
ウェルに２００μｌのＨＢＳＳを満たし、密封し、必要であればプレートを４℃
で保存した。このようにして保存したプレートからの蛍光シグナルは調製後に少
なくとも２週間安定であった。核移動アッセイにおけるように、蛍光試薬を、生
細胞高含有量スクリーニングにこのアッセイを変換するようにデザインすること
ができる。
【０１４８】 アレイ走査（ＡｒｒａｙＳｃａｎ）システムでのイメージの取得および分析。
細胞内Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ，ヘキスト３３３４２およびＢｏｄｉ
ｐｙ ＦＬファラシジンの蛍光強度は、上述したように細胞スクリーニングシス
テムで測定した。また、各ウェルから得られたイメージの各対からの形態データ
を得て、イメージ視野中の各物体（例えば、細胞および核）を検出し、そのサイ
ズ、形状および積分強度を計算した。
【０１４９】 計算および出力。合計５０−２５０細胞をイメージ視野当たり測定した。細胞
の各視野については以下の計算を行った：（１）平均核面積（μｍ２）は、視野
中の全核面積を検出された核の数で割ることによって計算した。（２）平均核周
囲（μｍ）は、視野中の全ての核の周囲の合計をその視野で検出された核の数で
割ることによって計算した。高度に複雑なアポトーシス核は最大の核周囲値を有
した。（３）平均核明るさは、核の全視野の積分強度をその視野における核の数
で割ることによって計算した。核明るさの増加は増大したＤＮＡ含有量に相関し
た。（４）平均細胞明るさは、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ色素で染色した細胞の
全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ミトコン
ドリア内に蓄積されるＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ色素の量はミトコンドリアポテ
ンシャルに比例するので、平均細胞明るさの増加はミトコンドリアポテンシャル
の増加と合致する。（５）平均細胞明るさは、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬファラシジン
色素で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによっ
て計算した。ファロトキシンは高い親和性を持ってアクチンの重合形態に結合す
るので、細胞内に蓄積するＢｏｄｉｐｙ ＦＬファラシジン色素の量はアクチン
重合状態に比例する。平均細胞明るさの増加はアクチン重合の増加と合致する。
【０１５０】 結果。図２４（頂部パネル）は、Ｌ−９２９細胞の核形態でパクリタキセル誘
導された変化を示す。増大させる量のパクリタキセルは核を拡大させ、断片化さ
せた２９３（アポトーシスのホールマーク）。細胞スクリーニングシステムによ
って得られたこれらのおよび他のイメージの定量分析は同一図面に提示する。測
定された各パラメータは、Ｌ−９２９細胞２９６がＳＮＢ−１９細胞２９７より
も低濃度のパクリタキセルに対して感受性が低かったことを示した。しかし、よ
り高い濃度では、Ｌ−９２９細胞は測定された各パラメータにつき応答を示した
。このアッセイのマルチパラメータアプローチは、薬物作用のメカニズムを解剖
するのに有用である。例えば、核２９８の面積、明るさおよび断片化、ならびに
アクチン重合値２９４は、ＳＮＢ−１０細胞を１０ｎＭのパクリタキセルで処理
した場合に最大値に到達した（図２４、頂部および底部グラフ）。しかしながら
、ミトコンドリアポテンシャル２９５は、パクリタキセルの同一濃度で最小であ
った（図２４、中央グラフ）。測定された全てのパラメータは、増大するパクリ
タキセル濃度（＞１０ｎＭ）で対照レベルに到達したという事実は、ＳＮＢ−１
０細胞が、薬物の十分に高いレベルで補償的である低親和性薬物代謝またはクリ
アランス経路を有することを示唆する。ＳＮＢ−１９細胞２９７の薬物感受性と
対照させると、Ｌ−９２９はパクリタキセル２９６に対して異なる応答を示した
。これらの繊維芽細胞は、５μＭのパクリタキセル（ＳＮＢ−１９細胞よりも５
００倍高い用量）にて多くのパラメータで最大応答を示した。さらに、Ｌ−９２
９細胞は、テストしたパクリタキセル濃度のいずれにおいてもミトコンドリアポ
テンシャル２９５の鋭い減少は示さなかった。この結果は、正常および癌細胞系
の間の唯一のアポトーシス経路の存在と合致する。従って、これらの結果は、比
較的単純な蛍光標識プロトコルを本発明の細胞スクリーニングシステムと連結さ
せて、プログラムされた細胞の死滅と関与する鍵となる事象の高含有量スクリー
ニングを得ることができることを示す。
【０１５１】 実施形態７ プロテアーゼにより誘導される、疾病関連配列を含むシグナル伝
達酵素の、細胞質から核までの転位置 プラスミド作成物。緑蛍光タンパク質−カスパーゼ（コ−エン(Cohen)（１９
９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．３２６：１〜１６；リアング(Liang)ら
（１９９７）Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７４：２９１〜３０２）キメ
ラのコード配列を含む真核生物発現プラスミドを、ＧＦＰ変異体を使用して調製
する。この作成物を使用して、真核細胞をトランスフェクトする。
【０１５２】 細胞の調製およびトランスフェクション。細胞をトリプシン処理し、トランス
フェクションの２４時間前に蒔き、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートす
る。トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈降法またはリポフェクショ
ンを含むがこれに限定されない方法により実施する。細胞を、４から５時間、３
７℃および５％ＣＯ２で、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈降物と共にインキュベー
トし、３から４回、ＤＭＥＭで洗浄して沈降物を除去し、次いで、Ｃ−ＤＭＥＭ
を加える。リポフェクタミンによるトランスフェクションを、製造業者の指示に
従って、抗生物質を含まない血清非含有ＤＭＥＭ中で実施する。ＤＮＡ−リポソ
ーム複合体と共に２から３時間インキュベートした後、培地を除去し、Ｃ−ＤＭ
ＥＭと交換する。
【０１５３】 アポトーシスによる、カスパーゼ−ＧＦＰ転位置の誘導。カスパーゼ−ＧＦＰ
の転位置動力学的データを得るために、トランスフェクトした細胞の核を、最初
に、Ｃ−ＤＭＥＭ中、５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（モレキュラー・プロ
ーブ社）で、３７℃および５％ＣＯ２で２０分間標識する。細胞を、１回、ハン
クの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、次いで、アポトーシスを誘導する化合
物を加える。これらの化合物は、パクリタキセル、スタウロスポリン、セラミド
、および腫瘍壊死因子を含むがこれに限定されない。定時点の滴定データを得る
ために、トランスフェクト細胞を、最初に、ＤＭＥＭで洗浄し、次いで、３７℃
および５％ＣＯ２で１時間、０から１０００ｎＭの化合物の存在下でＤＭＥＭ中
インキュベートする。細胞を、生存したままで解析するか、または、細胞をＨＢ
ＳＳで濯ぎ、１５分間ＨＢＳＳ中３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト
３３３４２で染色し、洗浄し、その後解析する。
【０１５４】 画像獲得および解析。動力学的データを、化合物の添加後３０分間、１分間間
隔で、生細胞のフィールドの蛍光画像対（カスパーゼ−ＧＦＰおよびヘキスト３
３３４２標識核）を獲得することにより集める。同様に、画像対を、化合物の添
加１時間後に、定時点のスクリーニングプレートの各ウェルから得る。両方の場
合において、各時点で得た画像対を使用して、各細胞の核および細胞質領域を規
定する。カスパーゼ−ＧＦＰの転位置は、核中のカスパーゼ−ＧＦＰの積分蛍光
強度を、細胞質中のキメラの積分蛍光強度で割ることにより、すなわち、ＧＦＰ
蛍光における核−細胞質の差異として計算する。定時点スクリーンにおいて、こ
の転位置比は、試験した化合物の各濃度で、少なくとも２００個の細胞から得ら
れたデータから計算する。薬物により誘導される、細胞質から核への、カスパー
ゼ−ＧＦＰの転位置は、それ故、転位置比の増加に相関する。アポトーシスによ
り活性化される酵素の推定的活性化剤または阻害剤を含むライブラリを含むがこ
れに限定されない分子相互作用ライブラリを使用して、指標細胞系をスクリーニ
ングし、ＤＡＳに特異的なリガンドおよび化合物の活性により活性化される経路
を同定する。
【０１５５】 実施形態例８ ＤＡＳの新規ステロイド受容体の同定 ２つの材料および／または情報源が、この実施形態の活用に必要であり、これ
により、特徴づけられていない遺伝子の機能の評価が可能となる。第１に、哺乳
動物細胞へのトランスフェクションに適したｃＤＮＡ配列を含む、疾病関連配列
バンク（群）を使用できる。各ＲＡＤＥまたは差次的発現実験により、数１００
個までの配列が作成されるので、豊富にＤＡＳを供給することが可能である。第
２に、一次配列データベース探索からの情報を使用して、ＤＮＡを、シグナル配
列、７回膜貫通モチーフ、保存プロテアーゼ活性部位ドメイン、または他の同定
可能なモチーフを含むカテゴリーを含むがこれに限定されない、広いカテゴリー
に入れることができる。これらの源から獲得した情報に基づいて、トランスフェ
クトする方法の種類および指標細胞系を選択する。大量のモチーフがすでに十分
に特徴づけられており、既存のゲノムデータベースの多くの遺伝子に含まれる線
形配列にコードされている。
【０１５６】 １つの実施形態において、以下の段階を実施する： １）ＤＡＳ同定実験（データベース探索を含む）からの情報を、関連する生物
学的プロセスの選択の基礎として使用する（例えば、細胞周期調節、アポトーシ
ス、転移プロテアーゼ等に関して、腫瘍系のＤＡＳを参照）。
【０１５７】 ２）同定可能なモチーフによるＤＮＡ配列またはＤＡＳの選別（すなわち、シ
グナル配列、７回膜貫通ドメイン、保存プロテアーゼ活性部位ドメイン等）。こ
の初期の分類により、蛍光タグ戦略、宿主細胞系、指標細胞系、および上記した
ようなスクリーニングする生物活性分子のバンクが決定される。
【０１５８】 ３）十分に確立された分子生物学的方法を使用して、ＤＡＳを、この目的に設
計された発現ベクターにくくる。一般的な発現ベクターは、一過性発現のために
標識配列を細胞に送達するための、プロモーター、エンハンサー、および終結因
子を含む。かかるベクターはまた、宿主による発現時の検出を容易にするために
、抗体タグ配列、直接会合配列、ＧＦＰのような発色団融合配列等も含み得る。
【０１５９】 ４）リン酸カルシウム共沈降法、リポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介
、ポリカチオン媒介、ウイルス媒介、または電気穿孔法を含む、標準的なトラン
スフェクションプロトコルを使用して、ＤＡＳ含有ベクターを用いて、細胞を一
過性にトランスフェクトし、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルア
レイに蒔く。別に、トランスフェクションは、マイクロタイタープレート自体に
直接実施できる。
【０１６０】 ５）上記したような細胞スクリーニング法を実施する。
【０１６１】 この実施形態において、転写活性化能（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、アミノ
末端調節ドメイン、ヒンジ領域、またはカルボキシ末端リガンド結合ドメイン）
を示唆するモチーフ（群）を有することが示されたＤＡＳを使用して、新規ステ
ロイド受容体を同定する。
【０１６２】 この実験の蛍光タグの規定は、染色による核の同定、および、ＧＦＰをコード
する遺伝子の近位に融合する、ＤＡＳの発現ベクターへの挿入を介したＧＦＰキ
メラの創製によるＤＡＳのタグ化を含む。別に、発現ＤＡＳのある部分に高い親
和性を有する単鎖抗体断片を、当分野で利用可能な技術を使用して作成でき（ケ
ンブリッジ・アンチボディ・テクノロジー社(Cambridge Antibody Technologies
)）、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）に連結させて、細胞中の推定転写アクチベー
ター／受容体をタグできる。この代替法は、ＤＮＡトランスフェクションを必要
としない外部タグを提供し、それ故、分布データを、ＤＡＳの作成に使用した最
初の一次培養物から集めたい場合には、有用である。
【０１６３】 プラスミド作成。緑蛍光タンパク質−ＤＡＳキメラのコード配列を含む、真核
生物発現プラスミドを、ＧＦＰ変異体を使用して調製する。作成物を使用して、
ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする。プラスミドは、宿主細胞にトランスフェ
クトされると、ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐと称される、ＤＡＳタンパク質産物に融合し
たＧＦＰを産生する。
【０１６４】 細胞の調製およびトランスフェクション。ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、
５％木炭／デキストラン処理胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ハイクロン社(Hyclone)
）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含む、ＤＭＥ
Ｍを使用して、トランスフェクションの１２から２４時間前に蒔き、３７℃およ
び５％ＣＯ２でインキュベートする。トランスフェクションは、リン酸カルシウ
ム共沈降法により、またはリポフェクタミン（ライフ・テクノロジー社）を用い
て実施する。リン酸カルシウムによるトランスフェクションでは、培地を、トラ
ンスフェクション前に、５％木炭／デキストラン処理ＦＢＳを含むＤＭＥＭと交
換する。細胞を、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈降物と共に、４から５時間、３７
℃および５％ＣＯ２でインキュベートし、３から４回、ＤＭＥＭで洗浄して沈降
物を除去し、次いで、Ｃ−ＤＭＥＭを加える。リポフェクタミンによるトランス
フェクションを、製造業者の指示に従って、抗生物質を含まない血清非含有ＤＭ
ＥＭ中で実施する。ＤＮＡ−リポソーム複合体と共に２から３時間インキュベー
トした後、培地を除去し、Ｃ−ＤＭＥＭと交換する。９６ウェルマイクロタイタ
ープレート中の全てのトランスフェクト細胞を３３℃および５％ＣＯ２で２４か
ら４８時間、薬物処理前にインキュベートする。実験を、ＨｅＬａ細胞で一過性
に発現される受容体を用いて実施する。
【０１６５】 細胞内の発現ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの局在。細胞分布データを得るために、トラ
ンスフェクト細胞の核を、最初に、Ｃ−ＤＭＥＭ中、５μｇ／ｍｌのヘキスト３
３３４２（モレキュラー・プローブ社）で、２０分間３３℃および５％ＣＯ２で
標識する。細胞を、１回、ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄する。細胞
を、生存したままで解析するか、または、細胞をＨＢＳＳで濯ぎ、１５分間ＨＢ
ＳＳ中３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト３３３４２で染色し、洗浄
し、その後解析する。
【０１６６】 好ましい実施形態において、画像獲得および解析は、本発明の細胞スクリーニ
ングシステムを使用して実施する。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光シグナルを、
フィールドの細胞からの蛍光画像対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト３３３
４２標識核）の獲得により集める。各時点で得られた画像対を使用して、各細胞
中の核および細胞質領域を規定する。細胞質中で分散したシグナルを示すデータ
は、ＤＮＡ転写アクチベーターである、既知のステロイド受容体と一致している
。
【０１６７】 ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ転位置の誘導のスクリーニング。指標細胞系として、ＧＦ
Ｐ−ＤＡＳｐｐの適切な発現の確認された、上記の作成物を使用して、種々のリ
ガンドのスクリーンを、エストロゲン、プロゲステロン、レチノイド、成長因子
、アンドロゲン、および多くの他のステロイドおよびステロイドをベースとした
分子を含むがこれに限定されない、一連のステロイドタイプのリガンドを使用し
て実施する。画像獲得および解析は、本発明の細胞スクリーニングシステムを使
用して実施する。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光シグナルは、蛍光画像対（ＧＦ
Ｐ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト３３３４２標識核）をフィールドの細胞から獲得
することにより集める。各時点で得られた画像対を使用して、各細胞の核および
細胞質領域を規定する。ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの転位置は、核中のＧＦＰ−ＤＡＳ
ｐｐの積分蛍光強度を、細胞質中のキメラの積分蛍光強度で割ることにより、す
なわち、ＧＦＰ蛍光の核−細胞質の差異として計算する。細胞質から核への転位
置は、リガンド結合によるＤＡＳｐｐの活性化を示し、従って、潜在的な受容体
クラスおよび作用が同定される。このデータを、ステロイド受容体の既知の阻害
剤および修飾剤を使用して同じ方法で得られた他のデータと合わせると、標的と
してのＤＡＳｐｐが確認されるか、または、より多くのデータが、種々の源から
生じるであろう。
【０１６８】 実施形態９ 細胞内微小管安定性 本発明の別の態様において、微小管構造を修飾する化合物を同定するための自
動化された方法を提供する。この実施形態において、指標細胞を試験化合物で処
理し、発光微小管標識分子の分布を、上記に開示したようなものなどの、細胞ス
クリーニングシステムを使用して空間的および時間的に測定する。発光微小管標
識分子は、細胞を試験化合物と接触する前、それと共に、またはその後に、細胞
により発現させ得るか、または細胞に添加し得る。
【０１６９】 本発明のこの態様の１つの実施形態において、生細胞は、発光タンパク質に融
合した微小管を標識するタンパク質を含む、微小管の動力学の発光標識タンパク
質バイオセンサーを発現する。本発明のこの態様の適切な微小管標識タンパク質
は、αおよびβチューブリンアイソフォーム、およびＭＡＰ４を含むがこれに限
定されない。発光タンパク質の好ましい実施形態は、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）およびＧＦＰ変異体を含むがこれに限定されない。好ましい実施形態において
、方法は、細胞を、微小管標識発光タンパク質でトランスフェクトすることを含
み、ここでの微小管標識タンパク質は、α−チューブリン、β−チューブリン、
または微小管会合タンパク質４（ＭＡＰ４）であり得るが、これに限定されない
。ここに概略を示した試みにより、当業者は、生細胞測定を行ない、インビボで
のチューブリン活性および微小管安定性に対するリード化合物の効果を決定でき
る。
【０１７０】 最も好ましい実施形態において、ＭＡＰ４は、修飾形のオワンクラゲ緑蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）に融合している。ＥＧＦＰコード配列（クロンテック社から
入手）とマウスＭＡＰ４のコード配列間の融合からなる、ＤＮＡ作成物を作成し
た（Ｏｌｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０（３）：６３９
〜６５０）。ＭＡＰ４は、間期の微小管並びに有糸***細胞と相互作用すること
が知られている、遍在的な微小管会合タンパク質である（オルムステッド(Olmst
ed)およびムラフシ(Murofushi)（１９９３）、ＭＡＰ４、「細胞骨格および運動
タンパク質へのガイドブック」、オックスフォード大学出版、（クライス(T. Kr
eis)およびベール(R. Vale)編）。次いで、その局在は、細胞をベースとしたＨ
ＣＳアッセイにおける、全細胞周期段階での、生（または固定）細胞における微
小管の局在、構成、および完全性の指標として役立ち得る。ＭＡＰ２およびタウ
（神経細胞で特異的に発現される微小管会合タンパク質）は、ＧＦＰキメラの形
成に使用されてきたが（ケーチ(Kaech)ら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ．１７：１
１８９〜１１９９；ハルら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．９４：４７３３〜４７３８）、その限定された細胞タイプの分布および過剰発
現時にこれらのタンパク質が微小管を束ねる傾向があることにより、これらのタ
ンパク質は、種々の組織および器官を起源とする生細胞における解析用の分子試
薬としてはあまり望ましくない。ＧＦＰ−ＭＡＰ４の中程度の過剰発現は、微小
管の機能または完全性を破壊しない（オルソン(Olson)ら、１９９５）。類似の
作成物は、β−チューブリンまたはα−チューブリンを使用して、当分野の標準
的な技術を介して作成できる。これらのキメラは、細胞周期の全段階における生
細胞の微小管活性を観察および解析する手段を提供する。
【０１７１】 別の実施形態において、微小管動力学の発光標識タンパク質バイオセンサーを
発現し、単離し、解析すべき細胞に、マイクロインジェクション、掻爬添加、お
よび衝撃により媒介する添加などのバルク添加技術を介して添加する。この実施
形態において、細胞内での過剰発現の問題はなく、従って、αおよびβチューブ
リンアイソフォーム、ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および／またはタウを全て使用できる
。
【０１７２】 さらなる実施形態において、タンパク質バイオセンサーは細胞により発現され
、細胞を、その後、タンパク質バイオセンサー、タンパク質抗原の内因性レベル
、または両方を検出する、標識抗体などの発光標識と接触させる。この実施形態
において、αおよびβチューブリンアイソフォーム、ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および
／またはタウを検出する発光標識を使用できる。
【０１７３】 種々のＧＦＰ変異体が入手可能であり、市販で入手できるＧＦＰ変異体（クロ
ンテック、カリフォルニア）を含むがこれに限定されない、全てのＧＦＰ変異体
が、本発明に有効である。
【０１７４】 ＭＡＰ４作成物を、数個の哺乳動物細胞系（ＢＨＫ−２１、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ
３、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＬＬＣＰＫ）に導入し、チューブリンの構成およ
び局在を、ＭＡＰ４局在の指標であるＧＦＰ蛍光を用いて、生細胞において可視
化した。その作成物は一過性に発現できるか、または、安定な細胞系を、標準的
な方法により調製できる。ＥＧＦＰ−ＭＡＰ４キメラを発現している安定なＨｅ
Ｌａ細胞系を得、これにより、キメラの発現は無毒性であり、有糸***に干渉し
ないことが示される。
【０１７５】 安定な細胞系を確立および維持するための可能性ある選択マーカは、ネオマイ
シン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、プロマイシ
ン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、およびブラスタシジン耐性遺伝子を
含むがこれに限定されない。
【０１７６】 微小管会合、脱会合、および再編成のモニタリングにおけるこの方法の有用性
は、一過性および安定なトランスフェクト細胞を、パクリタキセル、ノコダゾー
ル、ビンクリスチン、またはビンブラスチンなどの微小管薬物で処理することに
より実証された。
【０１７７】 本発明の方法は、特にマルチパラメトリック癌標的スクリーンにおける１つの
パラメータとして、抗微小管薬物のための高含量並びにハイスループット−高含
量の組合せの細胞をベースとしたスクリーンを提供する。本明細書に使用したＥ
ＧＦＰ−ＭＡＰ４作成物はまた、複数のシグナル伝達経路または生理的事象を測
定する、高含量スクリーンの成分の１つとして使用できる。好ましい実施形態に
おいて、ハイスループットおよび高含量の組合せを使用し、ここで、細胞を含む
各位置の複数の細胞を、ハイスループットモードで解析し、細胞を含む位置の部
分集合のみを、高含量モードで解析する。ハイスループットスクリーンは、発光
強度の増加した位置、レポータ遺伝子の発現を示す位置、カルシウム変化を受け
た位置およびｐＨ変化を受けた位置を同定することを含むがこれに限定されない
、さらに解析すべき細胞を含む位置を同定するのに有用である、任意のスクリー
ンであり得る。
【０１７８】 薬物スクリーニング適用に加えて、本発明は、臨床診断、化学的および生物学
的戦闘兵器の検出、および、基本的な研究市場に適用し得る。なぜなら、細胞分
裂および運動性などの基本的な細胞プロセスは、微小管動力学に高度に依存して
いるからである。
【０１７９】 画像獲得および解析 画像データは、固定または生指標細胞から得ることができる。得られた各画像
から形態計測データを抽出するために、以下の解析法を使用する： １．各核および細胞質画像を閾値処理し、核または細胞境界外の各ピクセルに
ついて値＝０を有するマスクを作成する ２．最初の画像上にマスクを重層し、フィールド（すなわち核または細胞）中
の各物体を検出し、そのサイズ、形状、および積分強度を計算する ３．上で得られた全細胞マスクを、対応する発光微小管画像に重層し、以下の
分類因子のセットの１つ以上を適用して、微小管形態および微小管形態に対する
薬物の作用を決定する。
【０１８０】 微小管の形態は、微小管の形状、サイズ、凝集状態、および重合状態の態様を
定量するための、１セットの分類因子を使用して定義する。これらの分類因子は
、共起マトリックス、テクスチャー測定、スペクトル法、構造的方法、ウェーブ
レット変換、統計学的方法、またはその組合せを含む、アプローチに基づき得る
。かかる分類因子の例は、以下の通りである： １．コレガ(Kolega)ら（（１９９３）．ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ １：１３６〜
１５０、これは、個々の細胞の縁端強度を決定するための非自動化方法を開示し
ている）に考察されたような、縁端検出法を使用して微小管の長さおよび幅を定
量して、各細胞内の全縁端強度を計算するための、分類因子。細胞サイズを標準
化するために、全縁端強度を、細胞面積で割ると、「微小管形態」値を得ること
ができる。大きな微小管形態値は、強い縁端強度値に関連し、それ故、別個の微
小管構造を含む細胞では最大である。同様に、小さな微小管形態値は、弱い縁端
強度に関連し、脱重合微小管を有する細胞では最小である。微小管形態値の生理
的範囲は、細胞を、微小管を安定化する薬物であるパクリタキセル（１０μＭ）
または微小管を脱重合する薬物であるノコダゾール（１０μｇ／ｍｌ）で処理す
ることにより設定する。
【０１８１】 ２．上記で考察した受容体内部移行法の方法論を使用して、微小管の、点状の
斑点または焦点への凝集を定量する分類因子 ３．画像テクスチャーの測定値を使用した、微小管脱重合を定量するための分
類因子 ４．微小管の見かけの相互連結または分岐（または両方）を定量するための分
類因子 ５．試験化合物で処理した細胞の画像の時間シリーズに関する、上記の分類因
子を使用した、微小管再構成の動力学の測定。
【０１８２】 さらなる態様において、微小管標識タンパク質をコードする核酸を含む発現ベ
クター、並びに、上記の方法を実施するために発現ベクターを使用するための命
令を含む、微小管安定性を解析するためのキットが提供される。好ましい実施形
態において、発現ベクターはさらに、発光タンパク質をコードする核酸を含み、
ここでの微小管結合タンパク質およびその発光タンパク質は、融合タンパク質と
して発現される。別に、キットは、微小管標識タンパク質に特異的に結合する、
抗体を含み得る。さらなる実施形態において、キットは、微小管標識タンパク質
を発現する細胞を含む。好ましい実施形態において、細胞を、発現ベクターでト
ランスフェクトする。別の好ましい実施形態において、キットはさらに、クラシ
ン、ノコダゾール、ビンクリスチン、またはビンブラスチンを含むがこれに限定
されない、微小管構造を破壊することが知られる化合物を含む。別の好ましい実
施形態において、キットはさらに、タクソール（パクリタキセル）、およびジス
コデルモリドを含むがこれに限定されない、微小管構造を安定化することが知ら
れる化合物を含む。
【０１８３】 別の態様において、本発明は、細胞スクリーニングシステムに、微小管安定性
を解析するために、開示した方法を実行させるための、１セットの命令を含んだ
プログラムを含む、機械で解読可能な記録媒体を含み、ここでの細胞スクリーニ
ングシステムは、細胞を含むプレートを保持するのに適合した載物台を有する光
学システム、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光または発光をデジタルカ
メラに向ける手段、および、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処
理するコンピュータ手段を含む。
【０１８４】 実施形態１０ 神経突起成長 薬物発見についての主な興味は、ニューロンからの神経突起成長に影響を及ぼ
す化合物の同定である。神経成長を促進する薬物は、脊髄損傷、糖尿病および卒
中などの疾病から生じる神経障害、パーキンソン病、および、アルツハイマー病
を含む他の形態の痴呆を含むがこれに限定されない、神経障害および神経損傷を
もたらす、多種多様の疾病および外傷の処置に有用である。
【０１８５】 従って、別の態様において、本発明は、神経突起成長を解析するための、自動
化された方法、キットおよびコンピュータで解読可能な媒体を提供する。この実
施形態の方法は、 −細胞を含む位置のアレイを提供し、ここでの細胞は、細胞数を報告する少な
くとも１つの第１の発光標識したレポータ分子、および、神経突起成長を報告す
る少なくとも１つの第２の発光標識したレポータ分子を有し、 −複数の細胞を含む各位置における複数の細胞を画像化または走査して、第１
および第２の発光標識したレポータ分子から発光シグナルを得、 −発光シグナルを、デジタルデータに変換し、そして −デジタルデータを使用して、自動的に測定を行ない、ここでの測定を使用し
て、細胞上または細胞内の、第１および第２の発光標識レポータ分子の分布、環
境または活性の変化を自動的に計算し、ここでの計算した変化は、神経突起成長
の測定値を提供することを含む。
【０１８６】 本明細書に使用したような「ニューロン」または「神経細胞」なる語は、ニュ
ーロンを含む脳細胞の一次培養液、一次神経細胞を含む単離細胞培養液、神経前
駆細胞、ニューロンのモデルとして使用する組織培養細胞（例えばＰＣ１２細胞
、これは、ラットクロム親和細胞腫からクローニングした新生物神経細胞系であ
る）、またはその混合物を含むがこれに限定されない、任意の種類のニューロン
を含む、任意の細胞個体群を含む。
【０１８７】 本明細書に使用したような「神経突起」なる語は、軸索、樹状突起、神経突起
、中間セグメント、末端セグメント、糸状仮足および成長錘状体を含むがこれに
限定されない、神経細胞体から成長する、任意のプロセスおよび／または構造を
意味する。
【０１８８】 本明細書に使用したような「神経突起成長」なる語は、正の神経突起成長、神
経突起成長阻害、神経突起成長分解、および、神経突起形態における他の変化を
含む。
【０１８９】 本明細書に使用したような「細胞は、１つ以上の発光レポータ分子を有する」
なる語は、発光レポータ分子は、細胞により、発光レポータ分子として発現させ
得るか、発光レポータ分子として細胞に加え得るか、または、細胞を、レポータ
分子に結合する、色素または抗体などのレポータ分子に結合する発光標識分子と
接触させることにより、発光標識し得ることを意味する。発光レポータ分子は、
試験物質で処理する前、同時、または後に、発現または添加できる。
【０１９０】 別の実施形態において、この方法はさらに、ニューロンを、試験化合物と接触
させることを含み、ここでの計算した変化により、試験化合物が、ニューロンの
神経突起成長を修飾したかどうかが示される。混合細胞培養液を使用し、アスト
ロサイト、オリゴデンドロサイト、またはミクログリアなどの、混合培養液中の
他の細胞の核を同定したい場合、これらの細胞型に特異的であり、異なるフルオ
ロフォアで標識した、蛍光プローブを使用し、１つのフィールドあたり十分な画
像（すなわち２より多い）を獲得して、アストロサイト、オリゴデンドロサイト
、またはミクログリアを同定する。本発明のこの実施形態を使用して、神経細胞
からの神経突起成長に（正または負に）影響を及ぼす化合物を発見でき、並びに
、ニューロンに毒性であり、神経突起長、数、および分岐を含むがこれに限定さ
れない、その神経突起の形態に影響を及ぼす、条件を同定できる。かかる神経毒
性研究では、方法は、神経突起を分解する化合物を同定するか、または、既知の
神経毒の活性を阻害する試験化合物を同定することを含む。
【０１９１】 好ましい実施形態において、第１の発光標識レポータ分子は、ＤＮＡ結合化合
物を含む。さらなる好ましい実施形態において、第２の発光標識レポータ分子は
、細胞質、膜および細胞タンパク質からなる群から選択した細胞成分を選択的に
検出する化合物を含む。さらなる実施形態において、第２の発光標識レポータ分
子は、ニューロン特異的である。別の実施形態において、細胞は、ニューロン特
異的であるか、または、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、およびアストロ
サイトを含むがこれに限定されない、目的の他の細胞型に特異的である、少なく
とも１つの第３の発光標識レポータ分子を含む。
【０１９２】 別の実施形態において、方法はさらに、細胞を、神経突起成長を修飾すること
が知られる対照化合物と接触させ、計算した変化を利用して、対照化合物がニュ
ーロンにおける神経突起成長を修飾するのを試験刺激が阻害するかどうかを決定
する。別法として、試験刺激を加えず、対照化合物を除去した後に、測定および
変化の計算を行ない、神経突起成長に対するかかる除去の効果を決定する。
【０１９３】 さらなる実施形態において、位置のアレイの亜領域を、数回、間隔をおいてサ
ンプリングして、細胞上または細胞内の発光レポータ分子の分布、環境または活
性における動力学的な変化の測定を提供する。
【０１９４】 さらに、適用を通じて記載したものを含むがこれに限定されない、他の高含量
またはハイスループットアッセイを、本発明のアッセイと組合せて使用して、化
合物で処理した場合の同じニューロンの生理的状態を測定できる。本発明の方法
のマルトパラメトリックアッセイに使用するに好ましいアッセイは、細胞生存ア
ッセイ、アポトーシスアッセイ、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）お
よび他の受容体内部移行アッセイである。
【０１９５】 本発明のこの態様は、異なる化合物で処理した細胞個体群のアレイを自動的に
走査し、神経細胞の神経突起成長を、集合的におよび個々に自動的に定量する方
法を提供する。ニューロンは、この実施形態に使用する異なる細胞型または異な
る神経細胞型の混合物から単離する必要はなく、従って、この方法は、一次脳培
養液にも適用できる。
【０１９６】 本発明はさらに、細胞スクリーニングシステムに、本発明のこの態様の方法を
実行させる、１セットの命令を含んだプログラムを備えるコンピュータ解読可能
な記録媒体を提供し、ここでの細胞スクリーニングシステムは、細胞を含むプレ
ートを保持するのに適合した載物台を有する光学システム、載物台または光学シ
ステムを移動する手段、デジタルカメラ、細胞から放出された光をデジタルカメ
ラに向ける手段、および、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理
するコンピュータ手段を含む。好ましい実施形態において、細胞スクリーニング
システムは、上記に開示するものである。
【０１９７】 本発明はさらに、少なくとも１つのニューロン特異的発光レポータ分子；少な
くとも１つの核特異的発光レポータ分子；並びに、ニューロン特異的発光レポー
タ分子および核特異的発光レポータ分子を使用して、神経突起成長を解析するか
、または、神経突起成長を修飾する化合物を同定するための命令を含む、神経突
起成長を解析するための、または、神経突起を修飾する化合物を同定するための
、キットを提供する。
【０１９８】 ニューロンの同定 １つの実施形態において、試料中の全細胞を、発光レポータ分子マーカで標識
して、その位置を同定する。一旦細胞の位置が同定されると、細胞を計測できる
。典型的には、核酸色素ヘキスト３３３４２を、発光レポータ分子として使用し
て、全細胞の核を同定する。しかし、他の核標識も使用できる。核酸蛍光染色は
２種類ある：生細胞の形質膜を通過できるもの、および、膜に不透過性であるも
の。膜透過性核酸染色の例は、ＤＡＰＩ、ジヒドロエチジウム、ヨウ化ヘキシジ
ウム、ヘキスト３３２５８、およびＳＹＴＯ（登録商標）色素シリーズ（モレキ
ュラー・プローブ社）を含む。膜不透過性色素で核を標識するために、形質膜を
透過化処理しなければならない。膜不透過性核酸色素の例は、シアニン核酸標識
、例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯＴＭ、ＰＯ
ＰＯＴＭ、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）、ＹＯ−ＰＲＯ（登録商標）、ＢＯ−ＰＲ
ＯＴＭ、およびＰＯ−ＰＲＯＴＭ（モレキュラー・プローブ社）、エチジウム類
似体、例えばエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、臭化エチジウム、エチジ
ウムジアジド、およびエチジウムホモダイマー１および２、ヨウ化プロピジウム
、および緑核酸染色ＳＹＴＯＸ（登録商標）（モレキュラー・プローブ）を含む
。さらに、ニューロンを低密度で蒔いた場合、細胞質などの細胞の他の成分を標
識して、培養液中の全ての細胞を同定できる。好ましい実施形態において、核標
識を使用する。いくつかの細胞質染色の例を以下に示す。
【０１９９】 試料が、脳細胞の混合物からなる場合（ニューロン以外の細胞型も含む）、ニ
ューロンに属する発光標識された核を同定する。ニューロンは、核マーカおよび
任意の他のマーカまたは使用する他の発光レポータ分子とは異なる波長の発光を
有する、ニューロンに特異的な発光レポータ分子により、他の細胞と区別する。
ニューロン特異的マーカと一致する核を、ニューロンに属する混合細胞個体群中
の核として同定する。多くの異なるニューロン特異的標識マーカを使用できる。
ニューロン特異的標識戦略の数例は、神経フィラメントに対する間接的免疫蛍光
、βＩＩＩ−チューブリンに対する間接的な免疫蛍光、および、毛様体神経栄養
因子（ＣＮＴＦ）などの神経栄養因子に対する間接的な免疫蛍光を含むがこれに
限定されず、全てが、ニューロン特異的抗原およびタンパク質である。
【０２００】 細胞を発光で標識し、よって、培養液がニューロンまたはニューロン様細胞の
みから構成されているか、または混合細胞培養液中のニューロンであるか、全て
のそのプロセスを可視化できる。発光で標識して、プロセスを可視化できる、標
的がニューロンにいくつかある。
【０２０１】 （１）細胞質染色：細胞質を、任意の標準的な細胞質染色で染色できる。かか
る染色の例は、ＣＭＦＤＡ（クロロメチルフルオレセインジアセテート）、また
はＣＭＴＭＲ（クロロメチルテトラメチルローダミン）（モレキュラー・プロー
ブ）である。別法として、細胞を工学して、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの
自己蛍光タンパク質を発現させ得る。細胞質中に発現されたＧＦＰにより、ニュ
ーロンのプロセスを可視化できる。
【０２０２】 （２）膜染色：膜染色は、ｄｉＩ（ジオクタデシリンカルボシアニン）（モレ
キュラー・プローブ）などの標準的な脂質色素であり得るか、または、細胞膜上
にある蛍光標識タンパク質であり得る。タンパク質を蛍光標識するために、細胞
表面タンパク質に対する免疫蛍光（標準的な免疫蛍光染色技術を使用）または膜
タンパク質に結合する蛍光リガンドを使用できる。この戦略は、ニューロン形状
およびプロセスの同定に加えて、混合脳混合物からニューロンを特異的かつ選択
的に同定するのに使用できるという点で、二重の目的に役立ち得る。膜上にある
ニューロン特異的マーカの例は、種々の神経栄養因子である。例えば、ニューロ
ンの表面上の毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦに対する間接的な免疫蛍光は、ニュー
ロンの構築を描写できる。
【０２０３】 （３）細胞タンパク質の染色：特定の細胞質染色液は、細胞タンパク質を標識
し、そのいくつかはニューロンに特異的である。このカテゴリーは、ニューロン
の描写を助ける細胞骨格タンパク質を含む。この例は、神経フィラメントに対す
る、またはβＩＩＩ−チューブリンに対する間接的な免疫蛍光を含むがこれに限
定されず、この両方共、ニューロン特異的細胞骨格タンパク質である。
【０２０４】 （４）全てのこれらの染色戦略の組合せを使用して、ニューロンプロセスおよ
び成長している神経突起をより良く同定できる。
【０２０５】 神経突起成長を刺激する化合物の同定 細胞を、慣用的な光学顕微鏡カバーガラスなどの、ガラス、プラスチック、ま
たはシリコンウエハースを含むがこれに限定されない、任意の光学的に透明な材
料から製造され得る、基質上に蒔く。特定の状況において、プラスチック基質は
、細胞の良好な付着に十分である。しかし、いくつかの細胞型については、基質
は、良好な付着および成長のために、特定の細胞外マトリックスでコーティング
する必要がある。例えば、ＰＣ１２細胞は、コラーゲン基質上で増殖する必要が
ある。次いで、試験する化合物（群）を細胞に加える。適切な時間の経過後、神
経細胞を発光標識し（それらが以前に標識されていない場合）、次いで、画像を
獲得し、自動的に解析して、下記のように神経突起成長を定量する。神経成長因
子（ＮＧＦ）で処理したＰＣ１２細胞を用いて実施したいくつかの実験では、細
胞を発光標識し、画像化し、ＮＧＦ処理の２から７日後に解析した。
【０２０６】 神経突起成長を阻害する化合物の同定 神経細胞を最初に、上記のような基質上に蒔く。細胞を、試験すべき化合物、
および、神経突起成長を刺激することが知られる対照化合物（例えば神経成長因
子（ＮＧＦ））で処理し、ここで、対照化合物での処理は、試験化合物処理の前
、後、または同時に実施する。適切な時間の経過後、画像を獲得し、自動的に解
析して、上記のように神経突起成長を定量する。
【０２０７】 ニューロンおよび神経突起に対して毒性である条件の同定 神経細胞を、最初に、上記のような基質上に蒔き、神経突起成長が可能となる
ように処理する。例えば、細胞を、上記のように、ＮＧＦと接触できる。神経突
起成長が生じた後、細胞を、ニューロンおよび神経突起に対する毒性について試
験する条件で処理する。かかる条件の例は、毒性の可能性のある濃度範囲の化合
物の添加、細胞の増殖に重要な物理的パラメータ、またはいくつかの場合では、
ＮＧＦなどの神経突起成長を刺激する因子の中止であり得る。適切な時間の経過
後、画像を獲得し、下記したように自動的に解析し、神経突起成長を定量する。
【０２０８】 画像獲得および解析 神経細胞が低密度であるか、または高度の神経突起成長を有さない場合、個々
の細胞を容易に同定できる。しかし、神経突起が成長し始め、細胞が数多くのプ
ロセスを生じ始めると、これらのプロセスは交差し得、神経細胞は、大きな細胞
のクラスターの一部となる。従って、全細胞クラスターが、１つの連結された発
光実体となる。神経細胞体から成長する、異なるプロセスおよび構造は、軸索、
樹状突起、神経突起、中間セグメント、末端セグメント、糸状仮足および成長錘
状体を含む。画像獲得および解析のために、全てのプロセスおよび構造は、２つ
の群に分類される：（１）細胞体（神経細胞体としても知られる）および（２）
神経突起。細胞体は、核を含み、粗く緻密で丸い形態を有する、ニューロンの中
心部分である。細胞体から出現する全ての成長およびプロセスが、神経突起と分
類される。神経突起は分岐し得るか、他の神経突起と交差し得るか、または、そ
れから成長しているより小さなプロセスを有し得、その全てを、画像解析の目的
のその親神経突起の一部と考える。従って、神経突起は、細胞体中にある１つの
起源を有するが、それが分岐する場合には複数の終点を有し得る。本発明の方法
の適用から得られた結果により、使用者は、その分類ガイドラインに従って神経
突起を規定および分類できる。例えば、１つの刊行物において、軸索は、細胞体
からの最も長い連続的な神経突起と定義され、０．７μｍないし５．１μｍ長の
間の神経突起セグメントは、糸状仮足と定義され、５．１μｍより長いものは、
細胞体から出現している場合には神経突起、または、末端が神経突起に付着して
いる場合、末端セグメント突起と呼ばれる（ラマーカス(Ramakers)ら、１９９８
、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０８：２０
５〜２１６）。
【０２０９】 本発明の神経突起成長法は、以下の種類の解析を実施する： ａ．細胞の核を同定する。試料が細胞の混合培養液である場合、それはニュー
ロンに属する核を同定する。核を使用して、ニューロンの数を同定および維持し
、ニューロンのクラスター中の細胞体の数も決定する。
【０２１０】 ｂ．ウェル中および個々の細胞クラスターにおける神経突起成長度を同定する
（細胞が低密度であるか、神経突起成長が制限されている場合、細胞クラスター
は単に１細胞からなる）。これは、細胞体およびそれから伸びている神経突起を
含む、神経細胞（または細胞クラスター）の形態を測定することにより達成され
る。
【０２１１】 ｃ．神経突起の特定の特性および形態特徴、例えばその長さ、数、および分岐
点を測定する； ｄ．多くのニューロン中のどれ、およびどれ位の数が、神経突起成長について
正であると考えることができるかを測定する；および／または ｅ．その解析を、同じ細胞または細胞クラスターに関する他のＨＣＳ解析と合
わせる。適用できる他のＨＣＳアッセイの例は、細胞生存度、アポトーシス、ま
たはＧＰＣＲおよび他の受容体内部移行のアッセイを含むがこれに限定されない
。
【０２１２】 例えば、方法の１つの実施形態において、細胞、ニューロンおよび神経突起の
以下の特徴を測定および報告する：
【表２】 さらに、上記の特徴を合わせて（例えば、１つの特徴を他の特徴で正規化する
、または２つ以上の特徴を相関させる）、新しい特徴として報告できる。
【０２１３】 神経突起成長を定量し、これらの特徴を測定する好ましい方法を下記する。本
明細書に使用したような、以下の用語は、特定の意味を有する： 「画像」は、強度を有するピクセルの表示を示す。
【０２１４】 「ピクセル」は、関連する強度値と共に、アレイ内の（ｘ，ｙ）座標位置を意
味する。
【０２１５】 「バイナリ画像」は、各ピクセルが０または１の強度を有する画像を意味する
。これは、通常、ピクセルが完全な強度範囲を有する画像から得られる。バイナ
リ化は、閾値より高い強度を有するピクセルを、バイナリ画像で１の強度を有す
ると割当てる。閾値未満または閾値に等しい強度を有するピクセルは、バイナリ
画像で強度０を有する。バイナリ画像「に含まれる」ピクセルは、単に、１の値
を有するピクセルと考える。バイナリ化画像はまた、他の画像に適用するマスク
として使用して、バイナリマスクされた構造と同じ場所に配置するピクセルの強
度を測定することができる。
【０２１６】 「閾値処理」は、強度が、閾値と呼ばれる値よりも高い、画像のピクセルを選
択するプロセスを意味する。閾値処理の結果を、閾値より高いピクセルが１の値
を有し、他は０の値を有する、バイナリ画像内に保存する。
【０２１７】 「自動閾値処理」は、画像に存在する輝度の分布を考慮することにより、画像
に適切な閾値を自動的に選択および適用するプロセスを意味する。閾値を選択す
る多種多様な方法が知られており；このアッセイに使用する方法は「ｉｓｏｄａ
ｔａ法」として知られるが、他の自動閾値処理スキームも使用できる。
【０２１８】 連結要素：どのピクセル（その位置は、画像境界に沿っていない）も、８つの
隣接するピクセルを有する（４つのピクセルと側を共有し、他の４つと隅を共有
する）。ピクセルは、その８つの隣接する各ピクセルに８連結していると言われ
る。「８連結要素」は、強度閾値より高い強度を有するどのピクセルが、同じ物
体に連結および属しているかを決定する方法である。８連結要素スキームにおい
て、目的のピクセルの周囲の８つのピクセルのいずれかが、強度閾値より高い強
度を有する場合、中心ピクセルと同じ物体の一部として同定される。バイナリ画
像で１の強度を有するピクセルを考える。これらのピクセルは、別々の群に分け
得、ここでの別々の群は、特定の特性を満たす：１）どの群も、任意の他の群の
いずれかのピクセルに８連結しているピクセルは含まない。２）群の中の任意の
２つのピクセルが、その群のピクセルのみを通過する、それらを連結する経路を
含む。これらの特性を満たす群は、画像の連結要素と称される。
【０２１９】 「フォームファクタ」は、神経突起成長の定量的測定値として使用できる。そ
れは、画像物体の円周の二乗を、物体面積の４π倍で割ったものからなる（すな
わち、ＦＦ＝円周２／（４π面積））。
【０２２０】 神経突起成長が起こらず、神経細胞の形状が円に類似している場合、フォーム
ファクタは１に近いだろう。神経突起成長が起こり、細胞または細胞クラスター
がより分岐するようになると、このＦＦ測定値は増加する。全画像フィールドに
おける平均ＦＦをコンピュータ計算して、全ウェルにおよぶ神経突起成長度を得
ることができる。さらに、個々のニューロンまたは神経細胞クラスターにおける
神経突起成長度も、その個々のＦＦにより決定できる。
【０２２１】 バックグラウンド補正：不均一な蛍光分布由来の感度を回避するために、バッ
クグラウンド補正フィルタを画像に適用できる。この段階により、画像の、低い
空間的変動頻度が除去される。これを実施する１つの戦略は、各ピクセルの近傍
に由来するバックグラウンド強度を差し引くことである。ピクセルの近傍のバッ
クグラウンド強度を推定するために、ピクセルを中心とする平方領域内の強度を
平均化する。我々は、この推定を形成するために非常に明るいピクセルを使用し
たくないので（非常に明るいピクセルは、明らかにフォアグラウンドピクセルで
あり、バックグラウンドの推定に含むべきはない）、我々は、平均を形成するた
めに、強度閾値より低いピクセルのみを含める。バックグラウンドの強度推定を
得たので、我々は、ピクセル強度からこの強度を差し引く。結果は、この操作を
全画像に通じて実施する場合、バックグラウンド補正画像である。
【０２２２】 分岐同定：分岐は、主な細胞体から成長している神経突起が、神経突起から成
長している１つより多い（通常２つ）神経突起セグメントに分割する場合の点で
ある。分岐点またはトリプル点は、１つの分岐が、２つまたは多数の分岐に分割
している場所の接合部である。
【０２２３】 画像獲得 ａ．好ましい実施形態（図２５Ａ―Ｂ） 方法への入力： ２つの画像を、方法への入力画像として提供する。：核チャネル画像および神
経突起チャネル画像。核チャネル画像では、細胞の核を、ヘキスト３３３４２ま
たはいくつかの他の蛍光または発光核染色で標識する。神経突起チャネル画像で
は、神経細胞体およびその付着した神経突起を蛍光または発光標識する。
【０２２４】 初期化相： 初期化相は、核およびニューロン画像の両方に対する、任意選択のバックグラ
ウンド補正を用いて始める。バックグラウンド補正段階を適用して、不均一な照
明の効果を低減し、検出を向上する。
【０２２５】 バイナリ画像を、閾値の適用により、核チャネル画像および神経突起チャネル
画像の両方について作成し；自動閾値処理が、ユーザーによる入力を必要としな
いので、好ましい方法である。
【０２２６】 核チャネル： バイナリ画像を、自動閾値の適用により、核チャネル画像から作成する。１つ
のニューロン核または核凝集塊あたり、１つの連結要素が核小体画像に存在する
。各々の核の位置座標は、最初に、バックグラウンド補正した核画像にマスクと
してバイナリ核小体画像を適用し、次いで、ピーク検出慣行を使用して、ピーク
最大強度を有するピクセルを選択することにより決定する。このピクセルは、各
々の核の位置座標としてタグ化する。
【０２２７】 神経突起チャネル： バイナリ蓄積画像を、自動閾値処理の適用により、神経突起チャネル画像から
作成する。この蓄積画像中のピクセルは、一般に、核小体画像のピクセルの上位
集合である。
【０２２８】 細胞体の同定 ニューロンは、細胞体から伸びている神経突起を有する細胞体からなる。各細
胞体が１つの核を含み、細胞体は、核よりも広い面積を覆う。神経突起成長の定
量を開始する前に、神経突起の源である、細胞体を同定する必要がある。従って
、核小体画像（これはニューロンの核に対応する）の連結要素が拡張して、関連
する神経細胞体が膨らむまで、各々の核のピークのピクセルの、一連の膨張を実
施する。実施した膨張は、条件付膨張であり；膨張を適用する毎に、１つのピク
セルの層を、その層中のピクセルがニューロン蓄積画像に存在する条件で、核小
体に加える。これは、膨張に因る面積の増加は、依然として、細胞体の境界を越
えて伸びていないことを意味する。各膨張中に、ｎｆｒｏｎｔおよびｎａｄｄｅ
ｄの数を、核小体画像中の各連結要素について測定する。Ｎｆｒｏｎｔは、単に
追加のピクセルによる膨張である、単純な（条件のない）膨張により連結要素に
加えられる、ピクセルの数である。Ｎｆｒｏｎｔは、最新の膨張に因る物体の、
ピクセル数で測定した、新しい円周と考えることができる。Ｎａｄｄｅｄは、条
件付膨張により実際に加えられる、ピクセルの数である。１ピクセルの膨張後に
、蓄積画像で正である新しい円周のピクセルのみを計測するので条件付である。
従って、ｎａｄｄｅｄは、バイナリ蓄積画像で１の強度を有する、新しい円周の
ピクセルの数である。ｎａｄｄｅｄ／ｎｆｒｏｎｔの比が、膨張の経過で、幾人
かのユーザーにより定義された閾値数よりも低いとコンピュータ計算された場合
（我々は、経験的に、０．０５から０．３の範囲が我々の試験画像で作動するこ
とを発見する）、これ以上の連結要素の膨張を実施しない。これは、細胞体の限
界に達し、膨張がもはや必要ではないことを意味する。バイナリ蓄積画像で正で
ある、その後の膨張における追加のピクセルは、細胞体から成長している実際の
神経突起に属する。細胞体の限界は、細胞体面積として報告できる。全ての連結
要素がこの段階を達成すると（すなわち、全ての個々の核が、この段階まで処理
されると）、次の方法の段階を開始する。
【０２２９】 この時点で、核小体画像は、各神経細胞体について、１つの連結要素（すなわ
ち１つの実体）を含む。
【０２３０】 繰返し相：次の段階は、各細胞体から伸びている神経突起を同定することであ
る。このために、１つの条件付膨張を、核小体画像に実施して、各神経突起スタ
ブを同定する。膨張画像なる語は、膨張により加えられた、正のバイナリピクセ
ルのみを含む画像を記載する。膨張画像中の各連結要素は、節と称される。各節
を使用して、１節神経突起データ構造を初期化する。神経突起データ構造は、複
数の分岐を含む可能性があり、他の神経突起と接続している可能性があり、神経
細胞体から外に伸びているので、物理的神経突起を示すと捉えられる。
【０２３１】 次に、条件付膨張は、核小体画像のピクセルに連続的な、蓄積画像からのさら
なるピクセルがなくなるまで、核小体画像上に連続的に実施する。各々のかかる
膨張により生じた膨張画像において、節のセットをコンピュータ計算する。各節
は、神経突起物体の連続、神経突起物体の分岐、または２つの神経突起物体の接
続を示す。節の１つ以上のピクセルが、神経突起物体のピクセルに隣接している
場合に、節と既存の神経突起物体の間に会合が形成される。節が、１つ以上の神
経突起物体と会合している場合、それは接続点を示す。複数の節が神経突起物体
と会合している場合、それは分岐点を示す。節が唯１つの神経突起物体と会合し
、その神経突起物体が前記の節のみと会合している場合、節は、神経突起物体の
伸長である。伸長、分岐または接続を記録する。接続の場合、関与する神経突起
物体は融合する。
【０２３２】 全神経突起が、その連結された節のセットを繋ぎ、次いで神経突起長を測定す
ることにより同定される。閾値長の基準を適用して、異なる神経突起を分類し得
る。かかる基準の１つの適用は、短すぎる神経突起を拒否することであろう。各
神経突起の起源は、それが起始するニューロンに会合している。これを実施する
１つの方法は、神経突起の起源の節を、最も近い細胞体または核ピークに繋ぐこ
とである。特定の細胞型（例えばＰＣ１２細胞）では、ニューロンはクラスター
を形成し、クラスター内の細胞の部分集合のみが神経突起を伸長する。神経突起
とその起始ニューロンとのこの会合により、神経突起および細胞のクラスター内
のその起始細胞が同定される。
【０２３３】 出力特徴： 種々の異なる量を、この方法により測定できる。第１に、細胞数およびニュー
ロン数を測定および報告できる。各神経突起について、全長（全てのその分岐の
長さの合計として測定）および分岐数を測定できる。各々の核について、それか
ら出現する神経突起の数を測定できる。各クラスターについて、フォームファク
タ（円周２÷（４π×面積））を測定し、神経突起成長度として報告する。さら
に、各々の核からの神経突起長を合計し、閾値長よりも長い場合、核を、神経突
起成長について正と同定する。これらの測定は、種々の方法で合わせて、表２に
報告した出力特徴を出すことがでる。
【０２３４】 好ましい実施形態の実証 １．ＰＣ６−３細胞における神経突起成長の測定 ＰＣ６−３細胞（ＰＣ１２細胞のサブクローン）を、コラーゲンでコーティン
グしておいた、９６ウェルマイクロプレートで増殖した。ウェルは、神経突起成
長を刺激するための種々の濃度のＮＧＦ（神経成長因子）（０〜１０００ｎｇ／
ｍｌ）を含んだ。対照個体群は、ＮＧＦを含まなかった。２日後、細胞を固定し
、間接的な免疫蛍光を、ウサギ抗βＩＩＩ−チューブリン一次抗体およびＡＬＥ
ＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（モレキュ
ラー・プローブ）を使用して、βＩＩＩ−チューブリンに対して実施した。次い
で、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で２０分間固定し、固定溶液はまた、そ
の核を標識するための１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２を含んだ。細胞を、
本発明の細胞スクリーニングシステムで画像化し、次いで、上記したプロトタイ
プ法で解析した。以下に示した結果は、ＮＧＦ濃度の関数である、フォームファ
クタおよび平均神経突起長についてである。
【０２３５】
【表３】 ２．ＰＣ１２細胞の神経突起に対するドーパミン毒性の測定 ＰＣ１２細胞を、１μｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下で、コラーゲンＩＶでコーテ
ィングしたウェルを有する、９６ウェルマイクロプレート上で７日間増殖した。
種々の濃度のドーパミンを３時間で加え、その後、細胞を３．７％ホルムアルデ
ヒド中で２０分間で固定し；固定溶液はまた、１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３
４２も含んだ。細胞を、βＩＩＩ−チューブリンに対するウサギ一次抗体、およ
び、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲＴＭ ４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を
使用して、間接的な免疫蛍光により染色した。細胞を、本発明の細胞スクリーニ
ングシステムで画像化し、次いで、上記したプロトタイプ法で解析した。以下に
示した結果は、ドーパミン濃度の関数である、神経突起成長係数（表２参照）に
ついてである。各データ点は、８ウェルの平均結果であり、誤差棒は標準偏差で
ある。このデータからの神経突起に対するドーパミン毒性についてのＩＣ５０（
５０％阻止濃度）は０．４６ｍＭである。
【０２３６】
【表４】 ｂ．別の画像獲得実施形態（図２６および２７Ａ―Ｂ参照） 別の実施形態において、この方法は、特定の状態、この場合、細胞型の混合し
た個体群を含む培養液中のニューロンである、フィールド中の細胞の比率を測定
する。陽性状態は、細胞が明るく蛍光であることを意味し、陰性状態は、細胞が
蛍光をほとんどまたは全く有さないことを意味する。ニューロン特異的レポータ
分子を使用する場合、陽性状態は、どの神経細胞についても起こり、陰性状態は
全ての他の細胞について起こる。ニューロンを同定するために、２つの画像を、
上記に考察したように、１フィールドあたりで捉える。陽性状態の細胞数を、全
細胞の総数と比較して、フィールド中の陽性状態の細胞の比率を得る。
【０２３７】 さらに、異なるタイプのニューロンの混合物を、神経突起成長についてアッセ
イできる。解析する各ニューロン亜個体群を、別個のレポータ分子により同定す
る。かかる方法は、例えば、特定の神経伝達物質受容体に対する免疫蛍光により
、混合個体群において、コリン作動性ニューロンからＧＡＢＡ作動性ニューロン
を区別するために使用できる。
【０２３８】 この別の実施形態は、以下のように要約する： 検出閾値のコンピュータ計算 ２つの対照ウェルを使用する：全細胞が陽性状態にある試料、および、全細胞
が陰性状態にある試料。陽性状態の細胞を明るく標識し、陰性状態の細胞はそう
しない。細胞セグメンテーションを向上するために、全ての画像を、ユーザーの
決定した面積におよぶ局所平均強度を差し引くことにより、バックグラウンド補
正できる。陰性対照では、細胞を含まないバックグラウンドおよび細胞の強度分
布の変動を最小限にするように設定する。陽性対照では、細胞を含まないバック
グラウンドおよび細胞の強度分布の変動を最小限にするように設定する。陽性状
態検出閾値は、対照画像からコンピュータ計算した閾値の秤量合計として設定す
る。
【０２３９】 核の検出および計測（ヘキストで標識） 核画像を、局所平均の差し引きにより、バックグラウンド補正する。閾値を画
像に適用する。画像は、細胞を含まないバックグラウンドの薄いピクセルおよび
細胞に関連したより明るいピクセルに因る、二項強度分布を有する。閾値は、こ
れらの２つの分布の変動を最小限にするように設定する。８連結要素を標識およ
び計測する。これにより、各々の核により覆われる面積が同定され、各々の個々
の核のマスクが設定される。
【０２４０】 陽性状態の検出および計数 核マスク画像の８連結要素を標識する。陽性状態の細胞を発光で標識した画像
を、局所平均の差し引きにより、バックグラウンド補正する。次いで、陽性状態
の細胞を、固定または自動閾値（陽性状態検出閾値より高いピクセルの選択）に
より選択する。
【０２４１】 次いで、陽性細胞を、「形態学的」または「Ｂｌｏｂ解析」方法により同定す
る： ａ．形態学的方法（図２８）：形態学的膨張（例えば５つのピクセルの）を選
択した面積に適用する。選択した面積は、論理的に核マスクで「ＡＮＤ」し、次
いで、得られた面積の８連結要素を標識および計測する。
【０２４２】 ｂ．Ｂｌｏｂ解析法（図２９）：選択した面積は、論理的に、核マスクの各々
の別々の８連結要素で「ＡＮＤ」する。得られた画像の面積を、閾値（拒絶閾値
）と比較し、より大きい場合、細胞を、陽性状態と計測する。
【０２４３】 陽性状態の細胞（例えばニューロン）を神経突起成長アッセイに連関させる 各々のウェルについて、検出された核の数および陽性状態（すなわちニューロ
ンである）の核の数を、記録および報告する。１ピクセルあたりの全積分強度お
よび平均強度も報告できる。次に、神経突起成長法を、陽性状態の神経細胞に適
用して、その神経突起成長を定量および特徴づける。陽性状態の核を使用して、
陽性状態の細胞を係数化し、追跡する。
【０２４４】 神経突起成長度の測定 神経突起成長度を測定するために、神経細胞または細胞クラスターの円周およ
び面積の両方を測定する。神経突起成長度を定量するために、我々は、上記で考
察したような、フォームファクタ（ＦＦ）を使用する。関与する一連の段階の要
約は以下の通りである： １．バックグラウンド補正：好ましい実施形態と同じ ２．画像バイナリ化：その後、画像をバイナリ化して、全ての選択した細胞を
用いてマスク画像を作成する。
【０２４５】 ３．成長度：バイナリ化画像の連結要素を標識し、その各々が、個々の細胞ま
たは細胞クラスターを示す。各要素の円周、面積およびフォームファクタをコン
ピュータ計算する。
【０２４６】 ４．分岐同定：全ての分岐をコンピュータ計算するために、最初に細胞分岐を
、モルフォロジーオープニング（例えば画像プロセシングによる画像の侵食）を
最初のマスク画像に適用することにより除去する。次いで、骨格抽出したマスク
画像（上でコンピュータ計算）から、領域の主な細胞体を差し引く。これにより
、細胞分岐の骨格のみ残る。
【０２４７】 ５．トリプル点同定：トリプル点は、１つの分岐が、２つまたは多数の分岐に
分割しているか、または異なる神経突起分岐が交差している接合部である。この
画像を解析して、トリプル点を発見および計測する。次いで、これらの点を、画
像から取り出し、各分岐およびその亜分岐を分離する。連結要素標識を使用して
、分岐および亜分岐の数を計測し、各物体（分岐）のピクセル数を計測すること
により、各々の別々の分岐の長さもコンピュータ計算する。
【０２４８】 トリプル点特徴づけ：画像獲得を、トリプル点をさらに特徴づける特徴を含め
るように膨張できる。上記したように、トリプル点は、異なる細胞の神経突起が
交差する場所であり得る。連結がこれらの異なる神経突起間でなされる場合、こ
れらの連結に特徴的な特定のタンパク質が発現され得る。例は、シナプトブレビ
ンなどのシナプス小胞タンパク質であり得る。アッセイに使用したその他のもの
と区別できるスペクトルを有するフルオロフォアを使用した、これらのタンパク
質に対する免疫蛍光により、連結がなされたかどうかを決定できる。ニューロン
発光標識と比較して、トリプル点が実際に、タンパク質に対して免疫蛍光と同じ
場所に配置しているかどうかを決定することにより、トリプル点が特徴づけられ
、神経突起間の連結がなされているかどうかが測定および定量される。
【０２４９】 別の画像獲得実施形態を使用した実証データ １．ＰＣ１２細胞における神経突起成長の測定 ＰＣ１２細胞を、ウェルをコラーゲンでコーティングしておいた、９６ウェル
マイクロプレートで増殖した。ウェルのいくつかは、神経突起成長を刺激するた
めのＮＧＦ（神経成長因子）（０．５〜１μｇ／ｍｌ）を含んだ。対照個体群は
、ＮＧＦを含まなかった。２日後、細胞を製造業者の指示に従ってＣＭＦＤＡで
標識した。次いで、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で１０分間で固定し、固
定溶液はまた、その核を標識するための１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２を
含んだ。細胞を、本発明の細胞スクリーニングシステムで画像化し、次いで、上
記したプロトタイプ法で解析した。最初に、細胞フォームファクタを計算した。
【０２５０】
【表５】 神経突起成長法を、ＮＧＦで処理しておいた細胞のクラスターに適用した結果
は、細胞クラスターに以下の解析を戻した：
【表６】 実施形態１１ 追加のスクリーン 形質膜と細胞質の間の転位置 プロフィラクチン複合体の解離およびプロフィリンの形質膜への結合 １つの実施形態において、プロフィリン膜結合の蛍光タンパク質バイオセンサ
ーを、精製プロフィリン（フェデロブ(Federov)ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ
．Ｂｉｏｌ．２４１：４８０〜４８２；ランブレッツ(Lanbretchts)ら（１９９
５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２８１〜２８６）を、２〜３００ｎ
秒の範囲の蛍光寿命を有するプローブで標識することにより調製する。標識プロ
フィリンを、バルク添加方法を使用して、指標生細胞に導入し、指標細胞を、試
験化合物で処理する。蛍光異方性画像化顕微鏡（ゴー(Gough)およびテーラー（
１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１０９５〜１１０７）を使用して
、０．１秒から１０時間までの範囲の処理後のある期間、細胞質と膜の間の、プ
ロフィリンの蛍光誘導体の、試験化合物依存的な移動を測定する。
【０２５１】 Ｒｈｏ−ＲｈｏＧＤＩ複合体の膜への転位置 別の実施形態において、指標細胞を試験化合物で処理し、次いで、固定、洗浄
および透過化処理した。指標細胞形質膜、細胞質、および核を全て、別個の色の
マーカで標識し、次いで、Ｒｈｏタンパク質（セルフ(Self)ら（１９９５）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２５６：３〜１０；タナカ(Tanaka)
ら（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２５６：４１
〜４９）を、第４の色で標識した抗体で抗原局在化する。４つの各標識を、細胞
スクリーニングシステムを使用して別々に画像化し、この画像を使用して、試験
化合物により奏効される転位置の阻害または活性化の量を計算する。この計算を
行なうために、形質膜および細胞質に印しを付すのに使用したプローブの画像を
使用して、免疫学的プローブの画像をマスクし、細胞内Ｒｈｏタンパク質の位置
に印しを付す。各マスク下での単位面積あたりの積分輝度を使用して、形質膜積
分輝度／面積を、細胞質積分輝度／面積で割ることにより、転位置指数を形成す
る。対照および実験ウェルの転位置指数値を比較することにより、転位置の比率
を、各々の可能性あるリード化合物について計算する。
【０２５２】 Ｇ−タンパク質受容体活性化時における、β−アレスチンの形質膜への転位置 細胞質から膜への転位置の高含量スクリーンの別の実施形態において、細胞処
理に応答した、細胞質から形質膜へのβ−アレスチンタンパク質の転位置を測定
する。転位置を測定するために、発光ドメインマーカを含む指標生細胞を試験化
合物で処理し、β−アレスチンマーカの移動を、本発明の細胞スクリーニングシ
ステムを使用して、時間的および空間的に測定する。好ましい実施形態において
、指標細胞は、一過性または安定な細胞トランスフェクションの使用により指標
細胞により発現される、緑蛍光タンパク質β−アレスチン（ＧＦＰ−β−アレス
チン）タンパク質基キメラ（バラク(Barak)ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２：２７４９７〜２７５００；ダーカ(Daaka)ら（１９９８）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６８５〜６８８）、および、細胞質および膜ドメイ
ンに印しを付すのに使用する他のレポータからなる発光マーカを含む。指標細胞
が休止状態にある場合、ドメインマーカ分子は、主に、形質膜または細胞質に分
配する。高含量スクリーンにおいて、これらのマーカを使用して、別個の蛍光チ
ャネルにおける、細胞質および形質膜を描写する。指標細胞を試験化合物で処理
する場合、ＧＦＰ−β−アレスチンの動力学的再分布を、０．１秒から１０時間
の範囲の時間尺度におよび、一連の画像として記録する。好ましい実施形態にお
いて、時間尺度は１時間である。各画像を、形質膜と細胞質の間のＧＦＰ−β−
アレスチンタンパク質キメラの移動を定量する方法により解析する。この計算を
行なうために、形質膜および細胞質に印しを付すのに使用するプローブの画像を
使用して、ＧＦＰ−β−アレスチンプローブの画像をマスクし、細胞内ＧＦＰ−
β−アレスチンタンパク質の位置に記しを付す。各マスク下での単位面積あたり
の積分輝度を使用して、形質膜積分輝度／面積を、細胞質積分輝度／面積で割る
ことにより、転位置指数を形成する。対照および実験ウェルの転位置指数値を比
較することにより、転位置の比率を、各々の可能性あるリード化合物について計
算する。高含量スクリーンの出力は、目的の試験化合物で処理しておいた、大量
の個々の細胞内の転位置の大きさを記載した量的データに関する。
【０２５３】 小胞体とゴルジ体の間の転位置 小胞体からゴルジ体への転位置の高含量スクリーンの１つの実施形態において
、細胞処理に応答した、小胞体口内炎ウイルスのｔｓ０４５変異株由来のＶＳＶ
Ｇタンパク質（エレンバーグ(Ellenberg)（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．１３８：１１９３〜１２０６；プレスリー(Presley)ら（１９９７）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３８９：８１〜８５）の、小胞体からゴルジ体ドメインまでの転位置を測
定する。転位置を測定するために、発光レポータを含む指標細胞を試験化合物で
処理し、レポータの移動を、本発明の細胞スクリーニングシステムを使用して空
間的および時間的に測定する。指標細胞は、一過性または安定な細胞トランスフ
ェクションの使用により指標細胞により発現される、ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク
質キメラからなる発光レポータ、および、小胞体およびゴルジ体ドメインの局在
を測定するのに使用する他のドメインマーカを含む。指標細胞が４０℃でその休
止状態にある場合、ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラ分子は主に小胞体に分配
する。この高含量スクリーンにおいて、別個の色のドメインマーカを、別個の蛍
光チャネルにおける、小胞体およびゴルジ体ドメインの描写に使用した。指標細
胞を試験化合物で処理し、温度を同時に３２℃まで下げる場合、ＧＦＰ−ＶＳＶ
Ｇタンパク質キメラの動力学的再分布は、０．１秒から１０時間までの範囲の時
間尺度におよび、一連の画像として記録する。各画像を、小胞体とゴルジ体ドメ
インの間のＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラの移動を定量する方法により測定
する。この計算を行なうために、小胞体およびゴルジ体ドメインに印しを付すの
に使用したプローブの画像を使用して、ＧＦＰ−ＶＳＶＧプローブの画像をマス
クし、細胞内ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質の位置に印しを付す。各マスク下での
単位面積あたりの積分輝度を使用して、小胞体積分輝度／面積を、ゴルジ体積分
輝度／面積で割ることにより、転位置指数を形成する。対照および実験ウェルの
転位置指数値を比較することにより、転位置の比率を、各々の可能性あるリード
化合物について計算する。高含量スクリーンの出力は、１分間から１０時間まで
の範囲の期間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度の、目的の試験化
合物で処理しておいた、大量の個々の細胞内の転位置の大きさを記載した量的デ
ータに関する。
【０２５４】 巨大分子の機能的局在化に関与する高含量スクリーン このクラスの高含量スクリーン内で、外的刺激に応答した巨大分子の機能的局
在化を、生細胞内で測定する。
【０２５５】 糖分解酵素活性調節。細胞酵素活性高含量スクリーンの好ましい実施形態にお
いて、処理細胞の、重要な糖分解調節酵素の活性を測定する。酵素活性を測定す
るために、発光標識試薬を含む指標細胞を、試験化合物で処理し、レポータの活
性を、本発明の細胞スクリーニングシステムを使用して空間的および時間的に測
定する。
【０２５６】 １つの実施形態において、細胞内酵素活性のレポータは、フルクトース−６−
リン酸、２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ（ＰＦＫ−
２）、リン酸化状態により細胞内の炭水化物の同化または異化が示される調節酵
素である（デプレッツ(Deprez)ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２
：１７２６９〜１７２７５；ケーラー(Kealer)ら（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ ３９５：２２５〜２２７；リー(Lee)ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３５：６０１０〜６０１９）。指標細胞は、ＰＦＫ−２リン酸化の
蛍光タンパク質バイオセンサーからなる、発光レポータを含む。蛍光タンパク質
バイオセンサーは、酵素の既知のリン酸化部位の近辺に、環境的に感度の高い蛍
光色素を導入することにより作成する（デプレッツら（１９９７）上記；ジュリ
アノら（１９９５）上記）。色素は、ケトシアニンのクラス（ケスラー(Kessler
)およびウルフバイス(Wolfbeis)（１９９１）Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ ４７Ａ：１８７〜１９２）、または、その励起および発光スペクトル
が溶液の極性に感受性である、タンパク質反応性部分および蛍光色素を含む任意
のクラスであり得る。蛍光タンパク質バイオセンサーを、バルク添加方法を使用
して、指標細胞に導入する。
【０２５７】 指標生細胞を、０．１秒から１０時間までの範囲の時間、１０−１２Ｍから１
０−３Ｍの範囲の最終濃度の試験化合物で処理する。好ましい実施形態において
、画像データ比は、各時点における蛍光画像のスペクトル対を収集することによ
り、処理した指標生細胞から得る。各時点から形態計測データを抽出するために
、各時点の２つのスペクトル画像を、ピクセルに対してピクセルで割ることによ
り、各画像対間の比を出す。次いで、各ピクセル値を使用して、ＰＦＫ−２のリ
ン酸化の割合を計算する。リン酸化の割合の低い値では、ＰＦＫ−２は、炭水化
物異化を刺激する。リン酸化の割合の高い値では、ＰＦＫ−２は、炭水化物同化
を刺激する。
【０２５８】 プロテインキナーゼＡの活性およびサブユニットの局在。高含量スクリーンの
別の実施形態において、試験化合物による処理に応答した、指標細胞内のプロテ
インキナーゼＡ（ＰＫＡ）のドメイン局在化および活性の両方を測定する。
【０２５９】 指標細胞は、ＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーを含む、発光レポ
ータを含む。蛍光タンパク質バイオセンサーは、環境的に感度の高い蛍光色素を
、ＰＫＡの調節サブユニットと相互作用することが知られる部位に近い、ＰＫＡ
の触媒サブユニットに導入することにより作成する（ハローツニアン(Harootuni
an)ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ４：９３３〜
１００２；ジョンソン(Johnson)ら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５：１４９〜１５
８；ジュリアノら（１９９５）上記）。色素は、ケトシアニンのクラス（ケスラ
ーおよびウルフバイス（１９９１）Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ
４７Ａ：１８７〜１９２）、または、その励起および発光スペクトルが溶液の極
性に感受性である、タンパク質反応性部分および蛍光色素を含む任意のクラスで
あり得る。ＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーを、バルク添加方法を
使用して、指標細胞に導入する。
【０２６０】 １つの実施形態において、標識生細胞を、０．１秒から１０時間までの範囲の
時間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度の試験化合物で処理する。
好ましい実施形態において、画像データ比は、処理した指標生細胞から得る。各
時点からバイオセンサーデータを抽出するために、各画像対間の比を出し、次い
で、各ピクセル値を使用して、ＰＫＡのリン酸化の割合を計算する（例えば、ｃ
ＡＭＰ結合後の触媒および調節サブユニットの分離）。活性の割合の高い値では
、ＰＦＫ−２は、生細胞内の生化学的カスケードを刺激する。
【０２６１】 ＰＫＡの触媒サブユニットの転位置を測定するために、発光レポータを含む指
標細胞を、試験化合物で処理し、レポータの移動を、細胞スクリーニングシステ
ムを使用して空間的および時間的に測定する。指標細胞は、細胞質および核ドメ
インの局在化の測定に使用するドメインマーカからなる、発光レポータを含む。
指標細胞を試験化合物で処理する場合、ＰＫＡ蛍光タンパク質バイオセンサーの
動力学的再分布を、細胞内で、０．１秒から１０時間の範囲の時間尺度におよび
、一連の画像として記録する。各画像を、細胞質と核ドメインの間のＰＫＡの移
動を定量する方法により解析する。この計算を行なうために、細胞質および核ド
メインに印しを付すのに使用するプローブの画像を使用して、ＰＫＡ蛍光タンパ
ク質バイオセンサーの画像をマスクする。各マスク下での単位面積あたりの積分
輝度を使用して、細胞質積分輝度／面積を、核積分輝度／面積で割ることにより
、転位置指数を形成する。対照および実験ウェルの転位置指数値を比較すること
により、転位置の比率を、各々の可能性あるリード化合物について計算する。高
含量スクリーンの出力は、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの濃度範囲の試験化合物
で処理しておいた、大量の個々の細胞内の転位置の大きさを記載した量的データ
に関する。
【０２６２】 遺伝子発現の誘導または阻害に関与する高含量スクリーン ＲＮＡをベースとした蛍光バイオセンサー 細胞骨格タンパク質の転写およびメッセージ局在化。細胞−基質粘着、細胞−
細胞粘着、シグナル伝達、細胞周期事象、中間およびシグナル伝達分子の代謝、
細胞歩行運動、細胞−細胞伝達、および細胞死を含む、一般的なクラスの細胞生
理的応答の調節は、遺伝子発現の変化を含み得る。高含量スクリーンはまた、こ
のクラスの生理的応答を測定するように設計できる。
【０２６３】 １つの実施形態において、細胞内遺伝子発現のレポータは、標的ｍＲＮＡとハ
イブリッド形成でき、その蛍光シグナルを変化できる、オリゴヌクレオチドであ
る。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、蛍光シグナルが細胞間
および細胞内相互作用に依存する、発光をベースとした試薬である、ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ（ティヤギ(Tyagi)およびクレマー(Kramer)（１９９６
）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３〜３０８）。蛍光バイオセンサ
ーは、試薬の各末端（５’および３’）に１つあるように、蛍光色素の蛍光エネ
ルギー伝達対を導入することにより作成する。色素は、励起および発光スペクト
ルが、休止状態の色素間の蛍光エネルギー伝達を提供するに十分な程、重複して
いる、フルオレセインおよびローダミン（モレキュラー・プローブ社）を含むが
これに限定されない、タンパク質反応性部分および蛍光色素を含む、任意のクラ
スであり得る。好ましい実施形態において、β−アクチン（キスラウスキース(K
islauskis)ら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：４４１〜４５１；
マッカン(McCann)ら（１１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９
４：５６７９〜５６８４；ストー(Sutoh)（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２１：３６５４〜３６６１）をコードするメッセージの一部を、分子内ハイ
ブリッド形成により末端が共に繋がっている、ヘアピン形のオリゴヌクレオチド
のループ領域に挿入する。バイオセンサーの各末端で、蛍光ドナー（フルオレセ
イン）および蛍光アクセプター（ローダミン）が共有結合している。繋がった状
態で、蛍光エネルギー伝達は最大であり、それ故、ハイブリッド形成していない
分子を示す。β−アクチンをコードするｍＲＮＡとハイブリッド形成した場合、
繋ぎは壊れ、エネルギー伝達は失なわれる。完全な蛍光バイオセンサーを、バル
ク添加技術を使用して、指標細胞に導入する。
【０２６４】 １つの実施形態において、指標生細胞を、０．１秒から１０時間までの範囲の
時間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度の試験化合物で処理する。
好ましい実施形態において、画像データ比は、指標生細胞から得る。各時点から
形態計測データを抽出するために、各画像対間の比を出し、次いで、各ピクセル
値を使用して、標識ヌクレオチドのハイブリッド形成の割合を計算する。ハイブ
リッド形成の割合の低い値では、β−アクチンの発現はほとんど示されない。リ
ン酸化の割合の高い値では、β−アクチンの最大発現が示される。さらに、指標
細胞の細胞質内のハイブリッド形成分子の分布も、指標細胞の生理的応答の測定
値である。
【０２６５】 リガンドの細胞表面結合 生細胞におけるその細胞表面受容体への標識インスリンの結合。形質膜ドメイ
ンを特定の色の標識試薬で標識しておいた細胞を、適切な条件下で、適切な時間
、異なる色の発光プローブで標識した、インスリン分子を含む溶液と共にインキ
ュベートする（リーら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２７０１
〜２７０８；マルチネス-ザグイラン(Martinez-Zaguilan)ら（１９９６）Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｃ１４３８〜Ｃ１４４６）。インキュベート後、
非結合インスリン分子を洗浄して除去し、細胞を固定し、インスリンの形質膜上
での分布および濃度を測定する。これを行なうために、細胞膜画像を、インスリ
ン画像のマスクとして使用する。マスクしたインスリン画像からの積分強度を、
既知量の標識インスリンを含む１セットの画像と比較する。細胞に結合したイン
スリンの量を、標準から決定し、細胞と共にインキュベートしたインスリンの総
濃度と共に使用して、解離定数またはその細胞表面受容体へのインスリンを計算
する。
【０２６６】 細胞区分の標識 全細胞標識 全細胞標識は、細胞の形状の動力学および細胞の移動を、細胞の蛍光画像を解
析することにより、時間をかけて測定できるように、細胞成分を標識することに
より行なわれる。
【０２６７】 １つの実施形態において、小さな反応性蛍光分子を、生細胞に導入する。これ
らの膜透過性分子は、拡散し、また、形質膜中のタンパク質成分と反応する。色
素分子は、細胞内分子と反応して、各分子から放出される蛍光シグナルを増加さ
せ、また、生細胞内の蛍光色素も包括する。これらの分子は、アミノクマリン、
ヒドロキシクマリン、エオシンジアセテート、フルオレセインジアセテートの反
応性クロロメチル誘導体、いくつかのＢｏｄｉｐｙ色素誘導体、およびテトラメ
チルローダミンを含む。これらの色素の巨大分子に対する反応性は、遊離一級ア
ミノ基および遊離スルフヒドリル基を含む。
【０２６８】 別の実施形態において、細胞を、細胞表面上の分子と特異的に反応する、蛍光
標識抗体またはレクチン（シグマ・ケミカル社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と相
互作用させることにより、細胞表面を標識する。緑蛍光タンパク質またはその変
異体の成分を含む、目的の細胞により発現される、細胞表面タンパク質キメラを
使用して、全細胞表面を蛍光標識できる。一旦、全細胞を標識すると、全細胞ま
たは細胞アレイの画像は、細胞形状、移動性、サイズ、および成長および***の
測定を含む、高含量スクリーンのパラメータとなり得る。
【０２６９】 形質膜標識 １つの実施形態において、全形質膜の標識は、全細胞の標識について上記した
のと同じ方法のいくつかを使用する。全細胞表面を標識する発光分子は、形質膜
を描写するように作用する。
【０２７０】 第２の実施形態において、形質膜のサブドメイン、細胞外表面、脂質二重層、
および細胞内表面は、別々に標識して、高含量スクリーンの要素として使用でき
る。第１の実施形態において、細胞外表面を、フルオレセイン、ローダミン、シ
アニンおよびボディフィス(Bodiphys)などの、蛍光色素のスクシンイミジルエス
テルまたはヨードアセトアミド誘導体などの、反応性蛍光分子での簡潔な処理を
使用して標識する。
【０２７１】 第３の実施形態において、細胞外表面を、細胞表面分子に高い親和性を有する
、蛍光標識した巨大分子を使用して標識する。これらは、タチナタマメ（Ｃｏｎ
Ａ）、レッドキドニービーン（赤血球凝集素ＰＨＡ−Ｅ）、または小麦から得ら
れた、レクチンのフルオレセイン、ローダミン、およびシアニン誘導体などの、
蛍光標識レクチンを含む。
【０２７２】 第４の実施形態において、細胞表面成分に対して高い親和性を有する蛍光標識
抗体を使用して、形質膜の細胞外領域を標識する。細胞表面受容体の細胞外領域
およびイオンチャネルは、抗体で標識できるタンパク質の例である。
【０２７３】 第５の実施形態において、形質膜の脂質二重層を、蛍光分子で標識する。これ
らの分子は、形質膜脂質二重層の中心の疎水性領域と強く相互作用する、長鎖疎
水性分子に付着した、蛍光色素を含む。これらの色素の例は、ＰＫＨシリーズの
色素（米国特許第４，７８３，４０１号、第４，７６２，７０１号および第４，
８５９，５８４号；シグマ・ケミカル社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販され
ている）、蛍光リン脂質、例えばニトロベンゾキサジアゾールグリセロホスホエ
タノールアミン、およびフルオレセイン誘導体化ジヘキサデカノイルグリセロホ
スホエタノールアミン、蛍光脂肪酸、例えば５−ブチル−４，４−ジフルオロ−
４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナン酸および１−ピレ
ンデカノン酸（モレキュラー・プローブ社）、コレステリル４，４−ジフルオロ
−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ド
デカノエートおよびコレステリル１−ヘキサノエートを含む蛍光ステロール、お
よび、アネキシンＶの蛍光誘導体（カルタグ・アンチボディ社(Caltag Antibody
Co,)Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）などの脂質二重層に特異的に相互作用する
蛍光標識タンパク質を含む。
【０２７４】 別の実施形態において、形質膜の細胞内成分を、蛍光分子で標識する。これら
の分子の例は、３量体Ｇ−タンパク質受容体の細胞内成分、アデニル酸シクラー
ゼ、およびイオン輸送タンパク質である。これらの分子は、蛍光標識した特異的
抗体への強固な結合の結果として、または、膜会合タンパク質および緑蛍光タン
パク質およびその変異体からなる、蛍光タンパク質キメラの取り込みにより標識
できる。
【０２７５】 エンドソーム蛍光標識 １つの実施形態において、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより
細胞に輸送されるリガンドを使用して、エンドソーム細胞小器官の動力学を追跡
する。標識リガンドの例は、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ標識低密度リポタンパク質複合
体、テトラメチルローダミントランスフェリン類似体、および蛍光標識した表皮
増殖因子（モレキュラー・プローブ社）を含む。
【０２７６】 第２の実施形態において、エンドソームリガンドを特異的に標識する、蛍光標
識した一次または二次抗体（シグマ・ケミカル社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；モ
レキュラー・プローブ社，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；カルタグ・アンチボディ社）を
使用して、細胞中のエンドソーム区分に印しを付す。
【０２７７】 第３の実施形態において、エンドソームを、緑蛍光タンパク質またはその変異
体を、内部移行によりエンドソームが標識される受容体と融合することにより形
成した、タンパク質キメラを発現している細胞において、蛍光標識する。ＥＧＦ
、トランスフェリン、および低密度リポタンパク質受容体のキメラは、これらの
分子の例である。
【０２７８】 リソソーム標識 １つの実施形態において、膜透過リソソーム特異的発光試薬を使用して、生お
よび固定細胞のリソソーム区分を標識する。これらの試薬は、発光分子ニュート
ラルレッド、Ｎ−（３−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）プロピル）−
Ｎ−（３−アミノプロピル）メチルアミン、および、リソソーム内のｐＨを報告
するＬｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒプローブ、並びに、リソソーム（モレキュラー・
プローブ社）の動力学的分布を含む。
【０２７９】 第２の実施形態において、リソソーム抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社
；モレキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特定の
リソソームドメインに局在化する、リソソーム成分を標識する。これらの成分の
例は、コレステロールエステル加水分解、膜タンパク質プロテアーゼ、およびヌ
クレアーゼ、並びに、ＡＴＰにより駆動するリソソームプロトンポンプに関与す
る、分解酵素である。
【０２８０】 第３の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的な
発光タンパク質に遺伝子的に融合した、リソソームタンパク質からなるタンパク
質キメラを使用して、リソソームドメインを標識する。これらの成分の例は、コ
レステロールエステル加水分解、膜タンパク質プロテアーゼ、おおびヌクレアー
ゼ、並びに、ＡＴＰにより駆動するリソソームプロトンポンプに関与する、分解
酵素である。
【０２８１】 細胞質蛍光標識 １つの実施形態において、反応性基を有する細胞透過蛍光色素（モレキュラー
・プローブ社）を生細胞と反応させる。モノブロモビマン、５−クロロメチルフ
ルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイ
ミジルエステル、およびクロロメチルテトラメチルローダミンを含む、反応性色
素は、細胞の細胞質の長期標識に使用する、細胞透過性蛍光色素の例である。
【０２８２】 第２の実施形態において、ルシファーイエローおよびカスケードブルーをベー
スとした蛍光色素（モレキュラー・プローブ社）などの、極性のトレーサー分子
を、バルク添加法を使用して細胞に導入し、細胞質標識に使用する。
【０２８３】 第３の実施形態において、細胞質成分に対する抗体（シグマ・ケミカル社：モ
レキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、細胞質を蛍
光標識する。細胞質抗原の例は、中間体代謝に関与する多くの酵素である。エノ
ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、およびアセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは
、均一に分布している細胞質抗原の例である。
【０２８４】 第４の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの、内因的
に発光するタンパク質に遺伝子的に融合した、細胞質タンパク質からなるタンパ
ク質キメラを使用して、細胞質を標識する。均一に分布したタンパク質の蛍光キ
メラを使用して、全細胞質ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、中
間体代謝に関与する多くのタンパク質であり、エノラーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、およびヘキソキナーゼを含む。
【０２８５】 第５の実施形態において、細胞質抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社：モ
レキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特定の細胞
質サブドメインに局在する、細胞質成分を標識する。これらの成分の例は、細胞
骨格タンパク質であるアクチン、チューブリン、およびサイトケラチンである。
細胞内でのこれらのタンパク質の個体群は、別個の構造に構築され、これはこの
場合、繊維状である。それ故、抗体をベースとした試薬でこれらのタンパク質を
蛍光標識すると、細胞質の特定のサブドメインが標識される。
【０２８６】 第６の実施形態において、細胞質タンパク質と強力に相互作用する、抗体をベ
ースとしていない蛍光標識分子を使用して、特定の細胞質成分を標識する。一例
は、酵素ＤＮＡｓｅＩの蛍光類似体（モレキュラー・プローブ社）である。この
酵素の蛍光類似体は、細胞質のアクチンに強固かつ特異的に結合し、よって、細
胞質のサブドメインを標識する。別の例では、マッシュルームの毒素であるファ
ロイジンまたは薬物パクリタキセルの蛍光類似体（モレキュラー・プローブ社）
を使用して、アクチン−および微小管−細胞骨格の成分をそれぞれ標識する。
【０２８７】 第７の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的に
蛍光なタンパク質に遺伝子的に融合した細胞質タンパク質からなるタンパク質キ
メラを使用して、細胞質の特定のドメインを標識する。高度に局在したタンパク
質の蛍光キメラを使用して、細胞質のサブドメインを標識する。これらのタンパ
ク質の例は、細胞骨格の調節に関与する、多くのタンパク質である。それらは、
構造タンパク質であるアクチン、チューブリン、およびサイトケラチン、並びに
、調節タンパク質の微小管会合タンパク質４およびα−アクチニンを含む。
【０２８８】 核標識 １つの実施形態において、膜透過性核酸特異的発光試薬（モレキュラー・プロ
ーブ社）を使用して、生および固定細胞の核を標識する。これらの試薬は、シア
ニンをベースとした色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標
）、およびＢＯＢＯＴＭ）、フェナチジンおよびアクリジン（例えば、臭化エチ
ジウム、ヨウ化プロピジウム、およびアクリジンオレンジ）、インドールおよび
イミダゾール（例えば、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、および４’
，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）および他の類似試薬（例えば、７
−アミノアクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジンおよびプソラレン）を
含む。
【０２８９】 第２の実施形態において、核抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社：モレキ
ュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特定の核ドメイ
ンに局在する、核成分を標識する。これらの成分の例は、ＤＮＡ構造および機能
の維持に関与する巨大分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、および、アクチンなどの細胞質タンパク質
の核変形が、核抗原の例である。
【０２９０】 第３の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的に
発光性のタンパク質に遺伝子的に融合した、核タンパク質からなる、タンパク質
キメラを使用して、核ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、ＤＮＡ
構造および機能の維持に関与する多くのタンパク質である。ヒストン、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、および、アクチンなどの細胞質タン
パク質の核変形が、核タンパク質の例である。
【０２９１】 ミトコンドリア標識 １つの実施形態において、膜透過性ミトコンドリア特異的発光試薬（モレキュ
ラー・プローブ社）を使用して、生および固定細胞のミトコンドリアを標識する
。これらの試薬は、ローダミン１２３、テトラメチルロサミン、ＪＣ−１、およ
びＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ反応性色素を含む。
【０２９２】 第２の実施形態において、ミトコンドリア抗原に対する抗体（シグマ・ケミカ
ル社：モレキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特
定のミトコンドリアドメインに局在する、ミトコンドリア成分を標識する。これ
らの成分の例は、ミトコンドリアのＤＮＡ構造および機能の維持に関与する巨大
分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラ
ーゼ、およびミトコンドリアｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどの細胞質巨大分子のミ
トコンドリア変形が、ミトコンドリア抗原の例である。ミトコンドリア抗原の他
の例は、ミトコンドリアに見られる酸化的リン酸化系の成分である（例えば、チ
トクロムｃ、チトクロムｃオキシダーゼ、およびコハク酸デヒドロゲナーゼ）。
【０２９３】 第３の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的に
発光性のタンパク質に遺伝子的に融合した、ミトコンドリアタンパク質からなる
、タンパク質キメラを使用して、ミトコンドリアドメインを標識する。これらの
成分の例は、ミトコンドリアＤＮＡ構造および機能の維持に関与する巨大分子で
ある。例は、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および、ミ
トコンドリアに見られる酸化的リン酸化系の成分である（例えば、チトクロムｃ
、チトクロムｃオキシダーゼ、およびコハク酸デヒドロゲナーゼ）。
【０２９４】 小胞体標識 １つの実施形態において、膜透過性小胞体特異的発光試薬（モレキュラー・プ
ローブ社）を使用して、生および固定細胞の小胞体を標識する。これらの試薬は
、短鎖カルボシアニン色素（例えばＤｉＯＣ６およびＤｉＯＣ３）、長鎖カルボ
シアニン色素（例えばＤｉＩＣ１６およびＤｉＩＣ１８）および発光標識したレ
クチン、例えばコンカナバリンＡを含む。
【０２９５】 第２の実施形態において、小胞体抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社：モ
レキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特定の小胞
体ドメインに局在する、小胞体成分を標識する。これらの成分の例は、脂肪酸伸
長系、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ ＣｏＡ−レダクターゼ
に関与する巨大分子である。
【０２９６】 第３の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的に
発光性のタンパク質に遺伝子的に融合した、小胞体タンパク質からなる、タンパ
ク質キメラを使用して、小胞体ドメインを標識する。これらの成分の例は、脂肪
酸伸長系、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ ＣｏＡ−レダクタ
ーゼに関与する巨大分子である。
【０２９７】 ゴルジ体標識 １つの実施形態において、膜透過性ゴルジ体発光試薬（モレキュラー・プロー
ブ社）を使用して、生および固定細胞のゴルジ体を標識する。これらの試薬は、
発光標識した巨大分子、例えば、小麦凝集素およびブレフェルディンＡ、並びに
、発光標識したセラミドを含む。
【０２９８】 第２の実施形態において、ゴルジ体抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社：
モレキュラー・プローブ社；カルタグ・アンチボディ社）を使用して、特定のゴ
ルジ体ドメインに局在する、ゴルジ体成分を標識する。これらの成分の例は、Ｎ
−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体特異的ホスホジエ
ステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸受容体タンパク質である。
【０２９９】 第３の実施形態において、緑蛍光タンパク質またはその変異体などの内因的に
発光性のタンパク質に遺伝子的に融合した、ゴルジ体タンパク質からなる、タン
パク質キメラを使用して、ゴルジ体ドメインを標識する。これらの成分の例は、
Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体特異的ホスホジ
エステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸受容体タンパク質である。
【０３００】 提示した実施例の多くは、１つの細胞プロセスの測定を含むが、これは、ここ
でも、単に説明するためのものである。複数のパラメータ高含量スクリーンは、
数個の単一パラメータスクリーンをマルチパラメータ高含量スクリーンに合わせ
ることにより、または、細胞パラメータを任意の既存の高含量スクリーンに加え
ることにより、作成できる。さらに、各実施例は、生または固定細胞に基づいて
記載したが、各高含量スクリーンは、生または固定細胞の両方で使用するように
設計できる。
【０３０１】 当業者は、本明細書に提供した開示に基づいて開発できる、多種多様の別個の
スクリーンを認識するだろう。細胞内の特定の成分の転位置または再構成に関与
する、細胞における、既知の生化学的および分子的プロセスのリストは多く漸増
している。
【０３０２】 細胞内での細胞表面から標的部位へのシグナル伝達経路は、形質膜会合タンパ
ク質の細胞質への転位置を含む。例えば、タンパク質チロシンキナーゼのｓｒｃ
ファミリーの一員であるｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（ウォカー(Walker)ら（１９９３）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９５５２〜１９５５８）は、血小板由来成
長因子（ＰＤＧＦ）で繊維芽細胞を刺激すると、形質膜から細胞質に転位置する
ことが知られている。さらに、スクリーニングの標的は、それ自体、リガンド結
合および転位置後修飾を含む、分子変化を報告する、蛍光をベースとした試薬に
変換できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、細胞ベースの走査システムの構成要素の図を示す。
【図２】 図２は、顕微鏡サブアセンブリの概略図を示す。
【図３】 図３は、カメラサブアセンブリを示す。
【図４】 図４は、細胞走査システムのプロセスを示す。
【図５】 図５は、使用者を導く主な機能を示すユーザインターフェ-スを示す。
【図６】 図６は、１つのプラットフォームがマイクロタイタープレートの全てのウェル
を読むために望遠鏡レンズを用い、第２のプラットフォームがウェル中の個々の
細胞を読むために高倍率レンズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのための
デュアルモードシステムの２つのプラットフォーム構築体のブロック図である。
【図７】 図７は、マイクロタイタープレートの全てのウェルを読むために移動可能な「
望遠鏡」レンズおよびウェル中の個々の細胞を読むための移動可能な高倍率レン
ズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムの単
一プラットフォーム構築体についての光学系の詳細である。
【図８】 図８は、細胞ベースのスクリーニングシステムについての動的データを取得す
るための流体送達システムの説明である。
【図９】 図９は、細胞ベースの走査システムについての処理工程のフローチャートであ
る。
【図１０】 図１０Ａから図１０Ｊは、核移動アッセイの戦略を示す。
【図１１】 図１１は、マイクロタイタープレートの高スループットおよび高含有量スクリ
ーニングを組み合わせる細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシ
ステムにおける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１２】 図１２は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高スループットモ
ードにおける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１３】 図１３は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高含有量モードに
おける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１４】 図１４は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高含有量モードに
おいて動的データを取得するのに必要な処理工程を規定するフローチャートであ
る。
【図１５】 図１５は、動的データの取得の間にウェル内で行われた処理工程を規定するフ
ローチャートである。
【図１６】 図１６は、移動の既知の阻害剤からのデータの例である。
【図１７】 図１７は、移動の既知の刺激体からのデータの例である。
【図１８】 図１８は、グラフ表示についてのデータ提示を示す。
【図１９】 図１９は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高スループットモ
ードからのデータ、高含有量モードまで通過したデータの例、高含有量モードで
取得されたデータ、そのデータの解析の結果の説明である。
【図２０】 図２０は、薬物−誘導の細胞質から核への移動の測定を示す。
【図２１】 図２１は、図２０に示された測定のグラフ使用者インターフェ-スを示す。
【図２２】 図２２は、図２０に示された測定の、データ提示での、グラフ使用者インター
フェ-スを示す。
【図２３】 図２３は、図２０に示された測定から得られた動的データを表すグラフである
。
【図２４】 図２４は、薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニングの詳細を示す。
【図２５】 図２５Ａは、画像獲得初期化相のフローチャートで、図２５Ｂは、画像獲得繰
返し相のフローチャートである。
【図２６】 図２６は、陽性状態の検出閾値コンピュータ計算のフローチャートである。
【図２７】 図２７Ａは、神経突起成長択一定量化方法のニューロン核同定のフローチャー
トで、図２７Ｂは、神経突起成長定量化のフローチャートである。
【図２８】 図２８は、細胞状態検出方法（形態学的方法）のフローチャートである。
【図２９】 図２９は、細胞状態検出方法（Ｂｌｏｂ解析方法）のフローチャートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ 33/15 Ｚ 33/15 33/483 Ｃ 33/483 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｓ 33/53 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (31)優先権主張番号 ６０／１７６，５８９ (32)優先日 平成12年１月18日(2000．1．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２０５，６９６ (32)優先日 平成12年５月19日(2000．5．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デビアシオ、 ロビン エル． アメリカ合衆国 ペンシルヴェニア州 15238 ピッツバーグ ローカスト レー ン 53 (72)発明者 ジャナルダーン、 プレム アメリカ合衆国 ペンシルヴェニア州 15238 ピッツバーグ ウィリアム ピッ ト ウェイ 635 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 FA01 FA02 GA02 GA07 GB18 GB19 GB21 HA01 HA09 JA03 KA03 LA03 2G045 BA14 BB24 CB01 FA16 FB03 FB12 GC22 4B024 AA11 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA11 4B029 AA07 BB11 FA03 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR32 QR33 QR60 QR66 QR77 QR80 QR81 QS05 QS25 QS36 QX02

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 神経突起成長を解析する自動化された方法であって、 細胞の位置を報告する少なくとも１つの第１の発光標識したレポータ分子と、
    前記神経突起成長を報告する少なくとも１つの第２の発光標識したレポータ分子
    を有し、ニューロンを含む細胞を含む位置のアレイを提供し、 複数の細胞を含む各位置において、前記複数の細胞を画像化または走査して、
    前記第１および前記第２の発光標識したレポータ分子から発光シグナルを得、 前記発光シグナルを、デジタルデータに変換し、 前記細胞上または前記細胞内の、前記第１および前記第２の発光標識レポータ
    分子の分布、環境、または活性の変化を自動的に計算し、前記計算した変化が前
    記ニューロンからの前記神経突起成長の測定値を提供する自動測定に、前記デジ
    タルデータを使用する ことを含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記計算した変化により、試験化合物が前記ニューロンの前
    記神経突起成長を修飾したかどうかを示すように、前記ニューロンを前記試験化
    合物と接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ニューロンを、前記試験化合物の前、後、または同時に
    、神経毒と接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 前記第１の発光標識したレポータ分子が、ＤＮＡ結合化合物
    を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第２の発光標識したレポータ分子が、細胞質、膜、ニュ
    ーロン特異的細胞成分、および細胞タンパク質からなる群から選択した細胞成分
    を選択的に検出する化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記細胞を、前記神経突起成長を刺激することが知られてい
    る対照化合物と接触させ、前記対照化合物が前記ニューロンの前記神経突起成長
    を誘導するのを試験刺激が阻止するかどうかを決定するのに、前記計算した変化
    を使用することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ニューロンに対して毒性があり、神経突起形態に影響を
    及ぼす条件を同定するために、前記計算した変化を使用することを特徴とする請
    求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第２の発光標識したレポータ分子が、ニューロン特異的
    であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記細胞を含む位置のアレイが、前記第１および前記第２の
    発光標識レポータ分子とはスペクトル的に区別できる、ニューロン特異的発光レ
    ポータ分子を有するニューロン以外の細胞を含むことを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ニューロン特異的発光レポータ分子が、神経フィラメ
    ントタンパク質、βＩＩＩ−チューブリン、毛様体神経栄養因子、および前記神
    経フィラメントタンパク質、前記βＩＩＩ−チューブリン、前記毛様体神経栄養
    因子に特異的な抗体からなる群から選択した分子を含むことを特徴とする請求項
    ８または９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記画像化または前記走査が、 ａ．核画像および神経突起画像を獲得し、 ｂ．細胞体を同定し、 ｃ．前記各細胞体から伸びた神経突起を同定する 段階を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１つに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記細胞体の同定が、 ａ．前記核画像から核小体画像を作成し、 ｂ．前記核小体画像の条件付き膨張を実施して、前記細胞体を同定する 段階を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞体から伸びた前記神経突起の同定が、 ａ．前記神経突起画像から蓄積画像を作成し、 ｂ．前記細胞体に存在しない前記蓄積画像中の前記細胞体から伸びた前記神経
    突起に属する正のピクセルを同定する 段階を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ａ．前記核小体画像の１回の条件付膨張を実施して、膨張
    画像を獲得し、 ｂ．前記膨張画像から１セットの節を決定し、 ｃ．連結された節を繋ぎ、 ｄ．全神経突起長を追跡するまで段階（ａ）から（ｃ）を繰返す ことをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記測定が ａ．細胞数、 ｂ．ニューロンの数、 ｃ．全細胞からの全神経突起長、 ｄ．全細胞からの神経突起分岐の総数、 ｅ．１細胞あたりの神経突起の数、 ｆ．１つの正のニューロンあたりの神経突起の数、 ｇ．各細胞の神経突起長、 ｈ．１つの正のニューロンあたりの神経突起長、 ｉ．１つの神経突起あたりの神経突起長、 ｊ．神経突起成長について正である細胞の数、 ｋ．神経突起成長について正である細胞の比率、 ｌ．細胞体面積、 ｍ．１つのニューロンあたりの分岐の数、 ｎ．１つの神経突起あたりの分岐の数、 ｏ．ニューロンまたはニューロン細胞クラスターの神経突起成長度 の１つ以上を含むことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１つに記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記計算した変化が、 ａ．前記細胞数の変化、 ｂ．前記ニューロン数の変化、 ｃ．全細胞からの前記全神経突起長の変化、 ｄ．全細胞からの神経突起分岐の前記総数の変化、 ｅ．１つの細胞あたりの前記神経突起数の変化、 ｆ．１つの正のニューロンあたりの前記神経突起数の変化、 ｇ．各細胞の前記神経突起長の変化、 ｈ．１つの正のニューロンあたりの前記神経突起長の変化、 ｉ．１つの神経突起あたりの前記神経突起長の変化、 ｊ．神経突起成長について正である細胞の前記数の変化、 ｋ．神経突起成長について正である細胞の前記比率の変化、 ｌ．前記細胞体面積の変化、 ｍ．１つのニューロンあたりの前記分岐数の変化、 ｎ．１つの神経突起あたりの前記分岐数の変化、 ｏ．ニューロンまたはニューロン細胞クラスターからの前記神経突起成長度の
    変化 の１つ以上を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記細胞を含む位置のアレイの亜領域を、間隔をおいて数
    回サンプリングして、前記細胞上または前記細胞内の前記発光レポータ分子の前
    記分布、環境または活性における動力学的な変化の測定を提供することを特徴と
    する請求項１乃至１６のいずれか１つに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞を含むプレートを保持するのに適合した載物台を有す
    る光学システムと、前記載物台または前記光学システムを移動する手段と、デジ
    タルカメラと、前記細胞から放出された光を前記デジタルカメラに向ける手段と
    、前記デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するコンピュータ手
    段とを含む細胞スクリーニングシステムに、請求項１乃至１７のいずれか１つに
    記載の方法を実行させるための１セットの命令を含むプログラムを備えることを
    特徴とするコンピュータ解読可能な記録媒体。
  19. 【請求項１９】 （ａ）少なくとも１つのニューロン特異的発光レポータ分
    子と、 （ｂ）核特異的発光レポータ分子と、 （ｃ）前記ニューロン特異的発光レポータ分子および前記核特異的発光レポー
    タ分子を使用して、神経突起成長を解析するための命令 とを含むことを特徴とする神経突起成長を解析するためのキット。
  20. 【請求項２０】 前記ニューロン特異的発光レポータ分子は、神経フィラメ
    ントタンパク質、βＩＩＩ−チューブリン、毛様体神経栄養因子、および、前記
    神経フィラメントタンパク質、前記βＩＩＩ−チューブリン、前記毛様体神経栄
    養因子に特異的な抗体からなる群から選択した分子を含むことを特徴とする請求
    項１９に記載のキット。
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