JP7030977B2 - 検査デバイス及び検査方法 - Google Patents
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Description
〔検査デバイス〕
図1に示す本実施形態の検査デバイス11は、検出部1と、この検出部1の上方に配置されたセル2とを有する。
〔セル〕
セル2はケース2aと、このケース2aの中に収容されたシート部材2bを有する。シート部材2bは細胞が培養される足場として機能する。検出部1とシート部材2bはケース2aの一部を介して対向する。
(ケース)
ケース2aはシート部材2bを収容する。ケース2aは収容されたシート部材2bの上および/または内部で細胞3を培養し、培養された細胞3を検出するための容器である。このため、シート部材2b、細胞3、および細胞3を培養するための培養液4、細胞を検出する時に添加する試薬5等と相互に影響を与えない材質が好ましい。また、細胞を検出するために必要な波長の光を透過する材質であることが好ましい。具体的にはガラス、石英ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ABS樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン、4フッ化系フッ素樹脂、PTFE樹脂、PFA、アクリル樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、ウレタン樹脂、ポリエーテルサルフォン、パーマノックス等を例示することができる。図示は省略するが、ケース2aは外気や光などケース2aの外部の環境の影響を遮断できるように蓋が装着できる構成となっていてもよい。
(シート部材)
シート部材2bには細胞3を培養可能な材料が選択される。具体的には、ナノインプリントで表面に凹凸が形成された樹脂、繊維がシート状に形成された樹脂、等を用いることができる。特に平均10μm以下の径を有する繊維をシート状に形成したシート部材2bが好ましい。この場合、シート部材2bを形成する繊維は互いにランダムに配向していることが好ましい。理由は定かではないが、ランダムに配向することで細胞が接着しやすい凹凸のある表面構造を提供するとともに、細胞が特定の方向に規定されることなく成長することができるため、多くの細胞に対応できるためと推定される。シート部材2bは既知の方法で製造することができるが、特にエレクトロスピニング法により形成することが好ましい。エレクトロスピニング法で作製したシート部材2bは綿状の多孔質体である。エレクトロスピニング法によるシートの製造方法は次の通りである。
〔エレクトロスピニング法によるシートの製造方法〕
図2にエレクトロスピニング法を用いてシート部材2bを製造する時の電界紡糸装置21の模式図を示す。図2に示すように、電界紡糸装置21は、複数のノズル22、原料液供給部23、電源24、収集部25、および制御部26を有する。
(ノズル)
各ノズル22は、針状を呈している。ノズル22の内部には、原料液を排出するための孔が設けられている。ノズル22は、導電性材料から形成されている。ノズル22の材料は、導電性と原料液に対する耐性を有するものとすることが好ましい。ノズル22は、例えば、ステンレスなどから形成することができる。
(原料供給部)
原料液供給部23は、収納部231、供給部232、原料液制御部233、および配管234を有する。
(収納部)
収納部231は、原料液を収納する。収納部231は、原料液に対する耐性を有する材料から形成されている。収納部231は、例えば、ステンレスなどから形成することができる。
(供給部)
供給部232は、収納部231に収納されている原料液をノズル22に供給する。供給部232は、例えば、原料液に対する耐性を有するポンプなどとすることができる。
(原料液制御部)
原料液制御部233は、ノズル22に供給される原料液の流量、圧力などを制御して、新しい原料液がノズル22の内部に供給された際に、ノズル22の内部にある原料液がノズルの排出口から押し出されないようにする。なお、原料液制御部233に対する制御量は、排出口の寸法や原料液の粘度などにより適宜変更することができる。原料液制御部233に対する制御量は、実験やシミュレーションを行うことで求めることができる。また、原料液制御部233は、原料液の供給の開始と、供給の停止を切り替えるものとすることもできる。原料液制御部233は後述する制御部26の一部として含めることができる。
(配管)
配管234は、収納部231と供給部232との間、供給部232とノズル22との間に設けられている。配管234は、原料液の流路となる。配管234は、原料液に対する耐性を有する材料から形成されている。
(第1電源)
第1電源24は、ノズル22および収集部25の間に相対的な電位差を形成するため、電圧を印加する。ノズル22に印加する電圧(駆動電圧)の極性は、プラスとすることもできるし、マイナスとすることもできる。ただし、ノズル22にマイナスの電圧を印加するとノズル22の先端から電子が放出されるので異常放電が発生しやすくなる。そのため、ノズル22に印加する電圧の極性はプラスとすることが好ましい。
(収集部)
収集部25は、収集体251、堆積調整部252、および第2電源27を有する。
(収集体)
収集体251は、複数のノズル22に対向して、原料液が排出される側に設けられている。本実施形態において収集体251は前述のケース2aを用いることができる。ケース2aに直接繊維6を堆積することで、細胞に影響を与える可能性がある異物の混入を減らすことができる。本実施形態において収集体251はステージ28の上に載置される。
(堆積調整部)
堆積調整部252は、収集体251を介してノズル22と対向している。堆積調整部252は、導電性材料から形成されている。堆積調整部252は、例えば、ステンレスなどの金属から形成することができる。堆積調整部252の収集体251側の端部は尖っている。堆積調整部252の収集体251側の端部が尖っていれば、電界集中が生じ易くなる。そのため、ノズル22と堆積調整部252の間に電界を形成するのが容易となる。
(第2電源)
第2電源27は、堆積調整部252に電圧を印加する。第2電源27は、ノズル22に印加される電圧と逆極性の電圧を堆積調整部252に印加する。第2電源27は、例えば、直流高圧電源とすることができる。第2電源27は、例えば、10kV以上100kV以下の直流電圧を出力するものとすることができる。
(制御部)
制御部26は、供給部232、原料液制御部233、第1電源24、電源27の動作を制御する。制御部26は、例えば、CPU(Central Processing Unit)やメモリなどを備えたコンピュータとすることができる。
〔電界紡糸装置の作用〕
次に、電界紡糸装置21の作用について説明する。原料液は、表面張力によりノズル22の排出口の近傍に留まっている。
(シート部材)
ノズル22に印加する電圧、ノズル22への原料液の供給速度、原料液に含まれる高分子の種類と濃度、溶媒の種類、ノズル22と収集体251との距離の少なくともいずれかを制御することで、シート部材2bを構成する繊維6の平均直径は、0.05μm以上、10μm以下とすることができる。シート部材2bに含まれる繊維6の平均直径は、例えば、シート部材2bの表面の電子顕微鏡写真を撮影し、電子顕微鏡写真により確認されたランダムに100本の繊維6の直径寸法を平均することで求めることができる。
〔検出部〕
上記のように作製したセル2の中のシート部材2bに細胞3を載置し(図3のS3)、これを培養液に浸して所定の温度や時間などの条件下で細胞3を培養することにより作製される(図3のS4)。こうして細胞が培養されたセルを直接そのまま検出部1の上に載置することで、セル2のケース2aの底面を通して直接細胞の状態を検出することが可能である。
〔細胞検出方法〕
上記のように細胞3を培養したセル2を検出部1の上に載置して検査対象となる細胞3を観察することもできるが、よりよく観察するために、培養した細胞3と特定の反応を示す試薬5を滴下して観察しても良い(図3のS5)。こうすることにより目的に応じた観察をより正確に行うことが可能となる。例えば、培養後の細胞3に生細胞と死細胞を判定する試薬を滴下する、特定遺伝子の発現を可視化するためのルシフェラーゼ等の発光酵素遺伝子をレポーターとして含むレポーターベクターDNAを導入し発光基質を滴下することで特定の性質をもつ細胞の判別性能を向上させることができる(図2のS6)。
[試薬の一例]
ある一例では、試薬5は、細胞の活性に応じて信号を産生する物質を含む。細胞の活性に応じて信号を産生する物質は、キャリアによって外套され得る内包物質であり得る。ある一例では、細胞の活性に応じて信号を産生する物質によって、細胞において測定対象を含む成分が生成される。細胞の活性に応じて信号を産生する物質(内包物質)は、生体分子を認識する分子、タンパク質、抗体、酵素、核酸、ベクターDNA、プラスミド、タンパク質染色剤及びDNA染色剤の少なくとも一つを含み得る。また、キャリアは、生体由来性分子、生体適合性分子、生体分解性分子、脂質分子及びポリマーの少なくとも1つを含み得るとともに、キャリアの具体例として、リポソームが挙げられる。また、試薬5には、細胞において生成された測定対象を含む成分と反応することにより発光を生じさせる基質(発光基質)が含まれ得る。
[検出の具体例]
以下、前述の検査デバイスを用いた検出の具体例について説明する。図4は、検出の一例を示す。図4の一例では、セル2のケース2a内に反応場2cが形成され、反応場2cにおいてケース2aの底面上にシート部材(シート)2bが配置される。そして、シート部材2b上に、細胞3が載置され、反応場2cにおいて細胞3は培養液4に浸される。そして、反応場2cに試薬5を滴下するにより、細胞3の活性に応じて信号を産生する物質によって、細胞3において測定対象となる成分が生成され、生成された成分と試薬5に含まれる成分との反応等によって、反応場2cにおいて発光反応が生じる。そして、検出部1は、反応場2cで発光した光を受光する(矢印A1)。すなわち、反応場2cにおいて発光した光は、シート部材2bを透過し、検出部1に導光される。ある一例では、検出部1は、プレートリーダー等の分光光度計を備え、所定の時間の間に受光した光子量を検出する。これより、検出部1は、反応場2cでの発光強度(発光量)を検出する。
[反応場での発光を検出する具体例]
図6A乃至図6Dは、反応場2cでの発光反応の一例を示す。図6A乃至図6Dの一例では、反応場2cに滴下される試薬5は、前述した細胞の活性に応じて信号を産生する物質(内包物質)51を含み、物質51はキャリア52によって外套される。図6Aに示すように、反応場2cに物質51及びキャリア52が投入されると、図6Bに示すように、細胞3に物質51及びキャリア52が取込まれる。キャリア52は、細胞3に取込まれた後、分解する。なお、図6Aは、物質51及びキャリア52が細胞3に取込まれる前の状態を示す。また、図6Bに示す状態では、細胞3は、反応場2cにおいてシート部材2b上に配置され、かつ、培養液4に浸された状態で、培養される。
図7A及び図7Bは、図6A乃至図6Dの一例のように反応場2cで発光が起こる場合のシート部材2bの作用を説明する。図7Aに示すように、レポーター分子53が生成された反応場2cに基質55が投入されると、投入された基質55の一部は、レポーター分子53と反応する(矢印B2)。そして、レポーター分子53と基質55との反応によって、発光が起こる。一方、投入された基質55の別の一部は、シート部材2bに吸着する(矢印B3)。前述のように繊維から形成されるシート部材2bの内部には、基質55は、侵入可能であるが、細胞3及びレポーター分子53は、侵入不可能である。このため、シート部材2bに吸着した基質55は、レポーター分子53と反応しない。すなわち、シート部材2bによって、シート部材2bに吸着した基質55とレポーター分子53との反応が、抑制される。
[反応場を透過した光を検出する具体例]
図9A乃至図9Cは、反応場2cを透過した光を検出する一例を示す。図9A乃至図9Cの一例では、反応場2cに滴下される試薬5は、前述した細胞の活性に応じて信号を産生する物質(内包物質)51A,51Bを複数種含み、複数種の物質51A,51Bは、キャリア52によって外套される。図9Aに示すように、反応場2cに物質51A,51B及びキャリア52が投入されると、図9Bに示すように、細胞3に物質51A,51B及びキャリア52が取込まれる。キャリア52は、図6A乃至図6Dの一例と同様に、細胞3に取込まれた後、分解する。なお、図9Aは、物質51A,51B及びキャリア52が細胞3に取込まれる前の状態を示す。
(実施形態の変形例)
上記実施形態においては、セル2と検出部が別々の形態を示したが、これに限られるものではない。具体的には、ケース2aの底面に検出部1が最初から一体化されていて、これにシート部材2bを形成する形態も考えられる。これらは検出対象の態様や検出に必要な解像度等に応じて適宜使い分ければよい。
また、前述の実施形態等では、シート部材2b等のシートに基質55が吸着するが、これに限るものではない。ある変形例では、細胞の活性に応じて信号を産生する物質(内包物質)51、キャリア52及びレポーター分子53のいずれかが、基質55の代わりに、又は、基質55に加えて、シートに吸着してもよい。この場合、シートに吸着した物質51、キャリア52及びレポーター分子53等のいずれかは、徐放される。
〔実施例〕
(実施例1)
シート部材をナノインプリンティングの樹脂、ポリウレタン、コラーゲンとしたシート部材2bを作製し、細胞の生着率を観察した。ポリウレタンおよびコラーゲンは前述のエレクトロスピニング法を用いて、ガラス基板をステージとして作製した。その特徴を表1に、細胞生着率の結果を図11に示す。シート部材の幅は全て18mmとした。
特定遺伝子を発現する細胞の判別を目的として、上記実施例1で用いたシート部材No2を配置したセルにMCF7を播種し、サイトメガロウイルスプロモーターにNanoLuc遺伝子を連結したレポーターベクターDNA(Promega)を細胞に導入して24時間培養した後、同セルを検査デバイスにて観察した。その結果を図12A及び図12Bに示す。図12Aのように明視野像ではすべての細胞が同様に観察できるが、遺伝子発現を可視化したことにより、特定遺伝子が発現している細胞が発光する画像が得られ(図12B)特定の性質をもつ細胞の区別がつきやすくなることが判明した。
(実施例3)
材料をコラーゲンとしたシート部材2bを作製し、細胞の生着と発光細胞の判別性能を評価した。シート部材2bは前述のエレクトロスピニング法を用いて作製した。幅6μm以上20μm以下の太い繊維の存在比率を求めた。シート部材No.5~23を配置したセルにMCF7を播種し、サイトメガロウイルスプロモーターにNanoLuc遺伝子を連結したレポーターベクターDNA(Promega)を細胞に導入して24時間培養した後、同セルを検査デバイスにて観察した。細胞の生着は、培養前後で細胞数を比較し、×(0~9%)、△(10~79%)、〇(80~119%)、◎(120%~)の4段階で評価した。発光細胞の判別は、明視野で観察される細胞数に対して暗視野で観察される発光細胞の比率で、×(不可:0~1%)、△(可:2~29%)、〇(30~59%)、◎(60%~)の4段階で評価した。結着部位の有無は、アクリル系粘着剤の紙粘着テープでシート部材を剥離した後のステージの表面を電子顕微鏡で観察し、ステージの表面にシート部材の一部が残留していた場合に「有」と判定した。シート部材No.5~23の特徴と評価結果を表2に示す。
(実施例4)
前述のシート部材2b及びシート片2b1等のシートが、基質(発光基質)を吸着することについて、検証した。検証では、検出部として、プレートリーダー(ルミノメーター)を用い、プレートリーダー上に形成されるケース内に反応場を形成した。そして、細胞としてはMCF7を用い、リポソームで外套された発光検出用のプラスミドを細胞に投与した。そして、プラスミドを細胞に投与してから1時間後に、細胞をケース内の反応場に載置した。ここで、反応場では、ケースの底面上にシート部材は敷かれず、細胞は、ケースの底面上に直接的に、すなわち、プレートリーダー上に直接的に載置した。また、反応場では、載置された細胞を培養液に浸し、細胞を培養した。前述のようにして、検証では、プラスミドを細胞に投与してから1時間後に、細胞を反応場に播種した。そして、細胞を播種後、24時間反応場において細胞を培養した。
(実施例5)
前述のシート部材2b及びシート片2b1等のシートが、吸着した基質(発光基質)を徐放することについて、検証した。検証では、実施例4の検証と同様に、プレートリーダー上に反応場を形成した。そして、実施例4での検証と同様に、細胞としてMCF7を用い、リポソームで外套された発光検出用のプラスミドを細胞に投与した。そして、実施例4での検証と同様に、プラスミドを細胞に投与してから1時間後に、細胞を反応場に播種し、播種した細胞を反応場において24時間播種した。そして、反応場で24時間細胞を培養した後、実施例4の検証で前述した条件X1,X2のそれぞれで、基質(発光基質)が溶解した溶液を反応場に滴下し(添加し)、反応場において発光を生じさせた。基質としては、実施例4の検証と同様に、一過性発光基質を用いた。そして、プレートリーダーにおいて、発光した光を受光し、発光した光の光学特性を検出した。
以下に、本願の出願当初の特許請求の範囲に記載された事項を付記する。
[1]検出部と、
前記検出部の上方に配置され光透過性の材料で構成されるケース、および前記ケースの中に配置されるシート部材、を有するセルと、
を有する検査デバイス。
[2]前記検出部は
光を集光するレンズ群と、前記レンズ群により集光される前記光を受光する受光部と、を含む画素が所定の間隔で複数個配列された固体撮像素子である
[1]に記載の検査デバイス。
[3]前記シート部材は生体親和性高分子の繊維を含み、前記シート部材は幅90mm以下、高さ150μm以下である[1]または[2]に記載の検査デバイス。
[4]前記シート部材は生体親和性高分子の繊維を含み、前記繊維の平均直径は、0.05μm以上、10μm以下である[1]乃至[3]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[5]前記シート部材は生体親和性高分子の繊維を含み、前記検出部の表面と繊維の一部が結着している[1]乃至[4]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[6]前記シート部材は生体親和性高分子の繊維を含み、前記生体親和性高分子の繊維同士の一部が溶着し合い、幅6μm以上の前記生体親和性高分子の繊維を1%以上、70%未満含む[1]乃至[5]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[7]前記生体親和性高分子はコラーゲン、プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ゼラチンのいずれかを含む[3]乃至[6]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[8]前記シート部材は、算術平均高さ0.1μm≦Sa≦5μm、最大高さ1μm≦Sz≦90μmとなる表面粗さをもつ[1]乃至[7]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[9]検出部と、前記検出部の上方に配置され光透過性の材料で構成されるケース、および前記ケースの中に配置されるシート部材、を有するセルと、を有する検査デバイスの製造方法であって、
前記シート部材はエレクトロスピニング法により前記セル内に直接形成される工程を有する検査デバイスの製造方法。
[10]検出部と、前記検出部の上方に配置され光透過性の材料で構成されるケース、および前記ケースの中に配置されるシート部材、を有するセルと、を有する検査デバイスを用いる細胞検出方法であって、
前記ケースの中で被検細胞群を培養する工程と、
前記被検細胞群の特性を光学的特性として可視化しうる試薬を前記被検細胞群と接触させる工程と、
前記光学的特性を前記検出部にて取得する工程と、
前記光学的特性に基づいて前記被検細胞群に含まれる被検対象細胞を判別する工程と、を有する細胞検出方法。
[11]蛍光または可視光が前記被検細胞群を透過する際の受光量の変化量、または波長の変化量を前記光学的特性とする[10]に記載の細胞検出方法。
[12]外部からの光が照射しない状態で、前記被検細胞群から発生する受光量の変化量を前記光学的特性とする[11]に記載の細胞検出方法。
[13]前記試薬は生体分子を認識する分子、タンパク質、抗体、酵素、核酸、ベクターDNA、タンパク質染色剤、DNA染色剤の少なくとも一つを含む[10]乃至[12]のいずれか1項に記載の細胞検出方法。
[14]前記試薬が生体由来分子、生体適合性分子、生分解性分子のいずれかで外套されている[10]乃至[13]のいずれか1項に記載の細胞検出方法。
[15]前記外套が、脂質分子またはポリマーを含む[14]に記載の細胞検出方法。
[16]光透過性の材料で構成される前記ケース、前記ケースの中に配置される前記シート部材と、を有する、[1]乃至[8]のいずれか1項に記載の検査デバイスに用いられる検査デバイス用セル。
[17]光透過性の材料で構成される前記ケースと、前記ケースの中に配置される前記シート部材と、を有する、[1]乃至[8]のいずれか1項に記載の検査デバイス用セルの製造方法であって、前記シート部材はエレクトロスピニング法により前記セル内に直接形成される工程を有する検査デバイス用セルの製造方法。
[18]測定対象との反応により発光を生じさせる試薬と、
前記試薬を吸着し、吸着した前記試薬を徐放することが可能なシートと、
前記測定対象と前記試薬との前記反応による前記発光の光学特性を検出する検出部と、
を具備する検査デバイス。
[19]前記シートは、前記検出部上に敷かれるシート部材を備える、[18]に記載の検査デバイス。
[20]前記シートは、前記試薬が溶解された溶液に分散される複数のシート片を備える、[18]に記載の検査デバイス。
[21]前記検出部は、前記反応による前記発光の発光強度の所定の積算時間における積算値を検出する、[18]乃至[20]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[22]前記検出部は、前記所定の積算時間を3秒以上60分以下のいずれかの時間として、前記発光強度の前記積算値を検出する、[21]に記載の検査デバイス。
[23]前記試薬は、前記検出部の近傍に形成される反応場において、前記測定対象と反応し、前記発光を生じさせる、[18]乃至[22]のいずれか1項の検査デバイス。
[24]前記シートは、生体親和性高分子の繊維を含み、
前記繊維の平均直径は、0.05μm以上10μm以下である、
[18]乃至[23]のいずれか1項に記載の検査デバイス。
[25]試薬を吸着可能及び徐放可能なシートが配置された反応場において、前記試薬と測定対象との反応により、前記反応場において発光を生じさせることと、
前記反応場の近傍に配置される検出部において前記反応場で発光した光を受光し、前記反応場で発光した前記光の光学特性を検出することと、
を具備する検査方法。
Claims (6)
- 測定対象との反応により発光を生じさせる試薬と、
前記試薬を吸着し、吸着した前記試薬を徐放することが可能なシートと、
前記測定対象と前記試薬との前記反応による前記発光の光学特性を検出する検出部と、
を具備し、
前記シートは、前記試薬が溶解された溶液に分散される複数のシート片を備える、
検査デバイス。 - 前記検出部は、前記反応による前記発光の発光強度の所定の積算時間における積算値を検出する、請求項1に記載の検査デバイス。
- 前記検出部は、前記所定の積算時間を3秒以上60分以下のいずれかの時間として、前記発光強度の前記積算値を検出する、請求項2に記載の検査デバイス。
- 前記試薬は、前記検出部の近傍に形成される反応場において、前記測定対象と反応し、前記発光を生じさせる、請求項1乃至3のいずれか1項の検査デバイス。
- 前記シートは、生体親和性高分子の繊維を含み、
前記繊維の平均直径は、0.05μm以上10μm以下である、
請求項1乃至4のいずれか1項に記載の検査デバイス。 - 試薬を吸着可能及び徐放可能なシートである複数のシート片を、前記試薬が溶解された溶液に分散させることと、
反応場において、前記試薬と測定対象との反応により、前記反応場において発光を生じさせることと、
前記反応場の近傍に配置される検出部において前記反応場で発光した光を受光し、前記反応場で発光した前記光の光学特性を検出することと、
を具備する検査方法。
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