-
Gebiet der Erfindung
-
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Fluoreszenz-Mikroskopie, insbesondere an Zellmembranen.
-
Zellmembranen sind die Kontaktstelle von Zellen nach außen, hier erfolgt der Stoffaustausch mit der Umgebung (Ausschüttung und Aufnahme von Substanzen), aber auch z. B. Vireninfektionen. Hierbei sind innere Vorgänge der Membran häufig beteiligt. Dieses Feld ist daher aus biologisch und auch medizinischer Sicht hochrelevant.
-
Stand der Technik
-
Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie
-
Für Fluoreszenzlebensdauer-Messungen werden meist konfokale Methoden mit gepulster Anregung ggf. kombiniert mit Rasterscanning der Probe oder des Laserstrahles verwendet. Die zeitaufgelöste Detektion erfolgt zumeist basierend auf der sog. TCSPC-Technik (Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC, zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen) [siehe z. B. D. O'Connor, D, Phillips, Time Correlated Single Photon Counting, Academic Press 1984]. Dabei wird die Probe durch eine gepulste Anregungslichtquelle, i. d. R. einen gepulsten Laser angeregt. Typische Pulslängen sind dabei kleiner als 1 ns, häufig kleiner als 200 ps, teils auch im Femtosekunden-Bereich, also kleiner als 1 ps. Die dabei verwendeten Detektoren sind beispielsweise Photomultiplier oder Avalanche-Photodioden, wobei letztere insbesondere in hochempfindlichen Anwendungen, beispielsweise der Detektion einzelner Moleküle wictig sind. Sie können einzelne Photonen detektieren und haben dabei eine zeitliche Auflösung von besser als 1 ns (typisch sind zeitliche Auflösungen im Bereich von 30 bis 3–400 ps (SPADs bis 0.5 ns) [siehe W. Becker, Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques, Springer Series in Chemical Physics, 2005].
-
Die Fluoreszenzlebensdauer erweitert die erhältlichen Informationen rein Intensitäts-basierter Messungen und damit die möglichen Analysen und Aussagen beträchtlich. Zwei Anwendungen sind dabei besonders wichtig:
-
FLIM-FRET
-
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Substanzen, z. B. Proteinen oder Nucleinsäuren, lassen sich mittels Försterenergietransfers (FRET: Foerster Resonance Energy Transfer; FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, bildgebende Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie) untersuchen. Dabei nimmt die Fluoreszenzlebensdauer eines Donor-Farbstoffs ab, wenn er mit einem zweiten, mit einem Akzeptor-Farbstoff markierten Biomolekül, z. B. einem Protein, durch räumliche Nähe in Interaktion tritt. Auf diese Weise lassen sich z. B. Änderungen der inneren Struktur einer Membran untersuchen [siehe z. B. J. Lakowicz, „Principles of Fluorescence Spectroscopy”, 3rd. Ed., Springer; Kap. 13]
-
Umgebungs-sensitives FLIM
-
Die Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffes hängt z. B. in vielen Fällen auch von der Polarität seiner Umgebung ab, die im Inneren einer Membran deutlich anders als an der Grenzfläche zum wässrigen Medium ist. Durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer lassen sich daher Schlussfolgerungen auf die Lage des untersuchten Biomoleküls innerhalb der Membranstruktur ziehen. Ein Biomolekül kann dabei entweder selbst fluoreszieren (z. B. ein fluoreszierendes Protein) oder mit einem Farbstoff markiert sein (etwa ein Protein, eine Nucleinsäure oder ein Lipid). Zu diesem Zweck wird mit Hilfe von FLIM häufig ein ortsaufgelöstes Bild der Lebensdauer-Verteilung innerhalb der Probe aufgenommen [s. z. B. A. Esposito, F. S. Wouters, „Fluoresence Lifetime imaging microscopy”, Curr. Prot. Cell Biol., Unit 4.14 (2004)].
-
In der Weitfeldmikroskopie beleuchtet man wegen der geringen Tiefenschärfe, gegeben durch ein axial relativ ausgedehntes Untersuchungsvolumens (mehrere μm), immer auch ungewünschte Bereiche innerhalb der Zelle, die als störender Hintergrund das eigentlich interessante Signal überlagern. Dies gilt selbst für konfokale Mikroskopie, bei der der axiale Durchmesser des Beobachtungsvolumens immer noch mindestens 600 nm beträgt. Dies kann zu einer Überlagerung von z. B. Membranfluoreszenz mit Fluoreszenz aus dem Zellinneren führen.
-
Daher wird üblicherweise Totalreflexions-Fluoreszenz (total internal reflection fluorescence, TIRF) zur selektiven Untersuchung von Zellmembranen verwendet [s. z. B. K. N. Fish, Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.18 (2009)]. Bei der TIRF-Mikroskopie wird ein Laserstrahl derart in den Probenträger (Deckglas) eingekoppelt, dass an der Grenzfläche zwischen Probenträger und Probe Totalreflexion auftritt und die Probe nur durch ein ca. 100 nm tiefes evaneszentes Feld beleuchtet wird.
-
Da es sich bei dieser Methode um eine Weitfeldbeleuchtung handelt, wird die emittierte Fluoreszenz üblicherweise mit einer CCD-Kamera detektiert. Mit einer CCD-Kamera ist allerdings eine effiziente und exakte, ortsaufgelöste Charakterisierung des Fluoreszenzzerfalls nur schwer möglich.
-
Die Druckschrift
DE 10 2007 030 403 A1 beschreibt die grundsätzliche Herangehensweise der sog. ROXS-Technologie, welche weiter unten detailliert erläutert wird.
-
Die Druckschrift Tinnefeld et al. [Tinnefeld, P.; Bauschmann, V.; Weston, K. D.; Biebricher, A.; Herten, D. -P.; Piestert, O.; Heinlein, T.; Heilemann, M.; Sauer, M.: How single molecule photophysical studies complement ensemble methods for a better understanding of chromophores and chromophore interaactions. In: Recent Research Development in Physical Chemistry, Vol. 7, 2004, S. 95–125] beschreibt ein Verfahren zur räumlich und zeitlich hochaufgelösten Detektion der Fluoreszenz eines Fluorophors einer Probe.
-
Die Druckschrift
EP 1 291 627 B1 beschreibt eine Vorrichtung zur räumlich und zeitlich aufgelösten Detektion von Fluorophoren.
-
Aufgabe
-
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit anzugeben, mit Hilfe derer die Fluoreszenz einer Probe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung detektiert werden kann.
-
Lösung
-
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
-
Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.
-
Zur Lösung der Aufgabe wird ein Verfahren zur räumlich und zeitlich hochaufgelösten Detektion der Fluoreszenz eines Fluorophors einer Probe mit folgenden Schritten vorgeschlagen:
- a) die Probe wird an der Oberfläche eines Probenträgers angeordnet;
- b) der Probe wird ein Redox-Puffer umfassend wenigstens ein Reduktionsmittel, und/oder wenigstens ein Oxidationsmittel und/oder wenigstens ein Reduktions-Oxidations-Mittel zugesetzt, um ein Photobleichen des Fluorophors zu verhindern;
- c) gepulstes Anregungslicht mit einer Pulslänge kleiner als 1 ns, bevorzugt zwischen 10 und 200 ps, wird derart in den Probenträger eingekoppelt, dass es wahlweise die Probe analog zur Standard Epifluoreszenzbeleuchtung durchleuchtet (on axis Einkopplung) oder am Ort der Probe den Probenträger nur evaneszent verlässt (sog. off axis Einkopplung, die zur Totalreflexion führt, total internal reflection, TIR);
- d) die Wellenlänge des Anregungslichts wird derart gewählt, dass das Anregungslicht geeignet ist, die Fluoreszenz des Fluorophors der Probe anzuregen;
- e) von der Probe ausgehendes Fluoreszenzlicht wird mit einem optischen Aufbau durch eine Lochblende auf einen Detektor geleitet, wobei der optischen Aufbau mittels der Lochblende ein Detektionsvolumen definiert;
- f) der Detektor wird derart gewählt, dass er einzelne Photonen des Fluoreszenzlichts mit einer zeitlichen Auflösung von besser als 1 ns, bevorzugt mit einer Auflösung von 10 bis 100 ps, detektieren kann;
- g) das Fluoreszenzlicht wird aufgeteilt und zusätzlich mit einem ortsauflösenden Detektor (22) aufgenommen;
- h) mittels des ortsauflösenden Detektors (22) wird eine interessante Messregion innerhalb der Probe identifiziert;
- i) das räumlich begrenzte Detektionsvolumen (45) der zeitaufgelösten Detektion wird auf die interessante Messregion in der Probe positioniert; und
- j) die interessante Messregion wird mit dem räumlich begrenzten Detektionsvolumen (45) der zeitaufgelösten Detektion abgerastert.
-
Eine Probe kann z. B. eine Zelle o. ä. sein. Mit dem Wort Probe wird das zu untersuchende Objekt bezeichnet.
-
Detektiert wird die Fluoreszenz eines Fluorophors der Probe. Dabei handelt es sich z. B. um ein oder mehrere Farbstoff-Moleküle oder Quantum-Dots oder ähnlich zur Fluoreszenz anregbare Substanzen, mit denen die Probe markiert wurde. Es kann aber auch die Probe selbst einen fluoreszierenden Teil (als Fluorophor bezeichnet) aufweisen. Oder die Probe ist ein Fluorophor.
-
Die Anordnung oder Fixierung der Probe an der Oberfläche des Probenträgers erfolgt z. B. durch Immobilisierung, z. B. durch eine chemische Verbindung mit der Oberfläche des Probenträgers. Möglich ist aber auch die Nutzung nicht-chemischer Haftung für die Immobilisierung, z. B. durch biochemische Bindung, van-der-Waals-Kräfte und Ähnliches.
-
Durch die punktförmige Detektion in Verbindung mit einem geeigneten Detektor erreicht man die gewünschte hohe zeitliche Auflösung bei der Bestimmung der Fluoreszenz-Lebensdauer. Gleichzeitig ermöglicht insbesondere die TIR-Beleuchtung eine hohe örtliche Auflösung von ca. 100 nm entlang der optischen Achse (axial) durch die evaneszente Anregung. Dies erlaubt zeitaufgelöste Messungen in Volumen, die kleiner sind als in der bisherigen konfokalen Mikroskopie, insbesondere mit einer stärkeren axialen Einschränkung für selektive Messungen in Zellmembranen.
-
Das vorgeschlagene Verfahren bietet somit eine Möglichkeit, mit Hilfe derer Proben im Weitfeld evaneszent angeregt werden können, wobei die Detektion derart erfolgt, dass mit hoher zeitlicher Auflösung die Fluoreszenz-Lebensdauer von ausgewählten Probenbereichen punktuell gemessen werden kann, ohne dass die Probe photobleicht.
-
Da die verwendete Methode des Time-Correlated Single Photon-Countings (TCSPC) durch Verwendung von Avalanche-Photodioden extrem empfindlich wird, sind diese Messungen auch mit Einzelmolekülempfindlichkeit möglich.
-
Weitfeld-Messung
-
Um ein ortsaufgelöstes Bild eines Probenbereiches mit Lebensdauer-Informationen zu erhalten, wird die Probe üblicherweise mit einem konfokalen Aufbau gescannt. Dabei wird jeweils nur ein kleiner Punkt innerhalb der Probe für jeweils kurze zeit beleuchtet, wodurch störende lichtinduzierte Prozesse minimiert werden.
-
Ohne Hilfsmittel zur Erhöhung der Photostabilität, wie die beschriebene ROXS-Technologie, ist eine permanente TIRF-Anregung im Weitfeld nicht mit einer gescannten, punktförmigen Fluoreszenz-Lebensdauer-Messung effizient kombinierbar.
-
Um das bildgebende Messverfahren zu beschleunigen und damit auch das Photobleichen darüber hinaus weiter zu reduzieren, kann zusätzlich das Fluoreszenzlicht mit einem ortsauflösenden Detektor aufgenommen werden. Die punktförmige Detektion kann dann auf einen Ort positioniert werden, der mittels des ortsauflösenden Detektors zuvor identifiziert wurde.
-
Genauer formuliert, wird das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht aufgeteilt und zusätzlich mit einem ortsaufgelösten Detektor aufgenommen. Mittels des ortsaufgelösten Detektors wird eine interessante Messregion innerhalb der Probe identifiziert. Auf die interessante Messregion wird das räumlich begrenzte Detektionsvolumen der zeitaufgelösten Detektion positioniert.
-
Typischerweise ist der ortsaufgelöste Detektor eine Kamera, z. B. eine hochempfindliche CCD-Kamera, die eine entsprechende Weitfeld-Messung durchführen kann. Die Kamera kann auf dem Probenträger einzelne Moleküle identifizieren und lokalisieren. Deren Fluoreszenz-Lebensdauer kann anschließend dann nacheinander in einer jeweils punktuellen Messung bestimmt werden, um daraus die angesprochenen Schlüsse zu ziehen.
-
Dadurch wird eine signifikante Reduzierung der Messzeit zur Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauern in der Probe dergestalt erreicht, dass gezielt nur noch ausgesuchte Regionen innerhalb der Probe, sogenannte Region-of-interest (ROI), zeitaufgelöst gemessen werden müssen. Dazu werden aus den in wenigen Millisekunden registrierten Kamerabildern die Koordinaten von interessierenden Probenbereichen mittels geeigneter effizienter Algorithmen bestimmt, auf welchen dann gezielt zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden. Da typisch gewählte Bildgrößen biologischer Präparate oft nur in einem Bereich bis 10% der Fläche mit hohem Informationsgehalt belegt sind, ist eine Messzeitverkürzung um einen Faktor 2–20 möglich.
-
Zeitauflösende Bildgebung durch Raster-Scanning
-
Konfokale optische Aufbauten sind hinlänglich bekannt und z. B. in der Schrift von Tony Wilson beschrieben [Tony Wilson, „Confocal Microscopy: Basic Principles and Architectures”, in: A. Diaspro, „Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications and Advances”, Wiley-Liss, 2002]. Dort sind auch Systeme beschrieben, bei denen die Abrasterung durch Verschieben der Probe oder des Objektivs erfolgt.
-
Das durch die Lochblende gegebene Detektionsvolumen kann mit den genannten Methoden auch im vorliegenden Fall dreidimensional in der Probe verschoben werden. Insbesondere ist es möglich, die Probe zweidimensional mit dem Detektionsvolumen abzurastern wobei letzteres z. B. mit dem Spiegelscanner verschoben wird.
-
Das vorgeschlagene Verfahren ersetzt dabei die gescannte, fokussierte Beleuchtung des konfokalen Mikroskops durch eine ortsfeste, weitflächige Beleuchtung. Erfolgt dabei die Einkopplung des Lichts parallel versetzt relativ zur optischen Achse des Objektiv erhält man eine evanescente Anregung mit einer geringen Eindringtiefe in die Probe. Somit werden nur die Probenbereiche unmittelbar an der Objektträgergrenzfläche erreicht. Die Einkopplung kann aber auch direkt auf der optischen Achse erfolgen, wodurch ein deutlich tieferer Bereich der Probe durchstrahlt wird. Das Prinzip eines punktförmigen, gescannten Detektionsvolumens bleibt dabei analog zu einem konfokalen Mikroskop erhalten.
-
Beschreibung der ROXS-Technologie
-
Für das sequentielle Abrastern eines Bildes wird relativ viel Zeit benötigt. Im Besonderen gilt dies für die hier durchzuführenden Lebensdauermessungen, bei der für jeden Bildpunkt eine hinreichende Anzahl an Photonen für eine aussagekräftige Lebensdaueranalyse eingesammelt werden muss. Bei weitflächiger Beleuchtung bzw. Anregung und gescannter Detektion wird das Verhältnis zwischen der „Beleuchtungszeit” eines Punktes in der Probe und der „Zeit in welcher von dort ein Signal detektiert wird” um Größenordnungen höher als bei Methoden, bei denen auch das Anregungslicht synchron gescannt wird (z. B. bei der oben erwähnten konfokalen Laserscanningmikroskopie).
-
Dies kann zu großen Problemen bezüglich des Photobleichens der Fluorophore im untersuchten Probenbereich führen. In der Regel wird die Probe schneller ausgebleicht als sie mit dem Scanner vermessen werden kann.
-
Daher kann bisher eine TIRF-Anregung nicht mit einer Fluoreszenz-Lebensdauer-Messung effizient kombiniert werden.
-
Um das Ausbleichen zu verhindern, bzw. zumindest signifikant zu reduzieren, werden in dem hier vorgeschlagenen Verfahren daher dem wässrigen Probenmilieu reduzierende und/oder oxidierende Substanzen zugesetzt. Dieses Vorgehen basiert auf der ROXS(Reducing Oxidizing System)-Technologie zur Verbesserung der Photostabilität eines Farbstoffes die der
WO 2009/003948 A2 sowie z. B. in der Veröffentlichung von J. Vogelsang [J. Vogelsang et al., Ang. Chem. Int. Ed. 47 (29), 5465–5469 (2008)] beschrieben ist und deren diesbezüglicher Inhalt hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht wird.
-
Ziel der ROXS-Technologie ist u. a. die maximale Verkürzung der Aufenthaltsdauer eines Farbstoffs im Triplett-Zustand, da dieser häufig den primären Ausgangspunkt für eine Photooxidation oder eine direkte irreversible chemische Reaktion und damit Photobleichen darstellt. Durch das Reduktionsmittel wird dabei im Photozyklus eines Farbstoffmoleküls ein zusätzlicher geladener Zustand erzeugt, der den Triplettzustand schnell entvölkern soll. Wichtige Zustandsübergänge sind:
- a) der Licht-induzierte Übergang aus dem Grundzustand SO in den angeregten Zustand S1,
- b) die direkte Rückkehr aus dem S1 in den SO Zustand, bei dem ein Fluoreszenzphoton abgestrahlt wird,
- c) Der spontane Übergang aus dem S1 in den Triplettzustand T1,
- d) Der durch das Oxidations- oder Reduktionsmittel initiierte Übergang aus T1 in einen geladenen Zustand (z. B. ein Radikalkation oder Radikalanion), und
- e) final die durch ein Oxidations- oder Reduktionsmittel ausgelöste Rückkehr aus dem geladenen Zustand in den ungeladenen Grundzustand S0.
-
Wichtig sind hier ein schneller Übergang in den stabilen, geladenen Zustand und anschließend eine schnelle Rückkehr in den Grundzustand S0 damit das Farbstoffmolekül wieder erneut zur Fluoreszenz angeregt werden kann. Auf diese Weise kann die Photostabilität dramatisch gesteigert werden, so dass eine permanente Beleuchtung der Probe auch an Positionen, an denen nicht dauerhaft detektiert wird, toleriert werden kann.
-
Das Wirkprinzip der ROXS-Chemie bei der Verbesserung der Photostabilität beruht darauf, dass mit der ROXS-Chemie die Probe möglichst schnell vom angeregten in den Grundzustand überführt wird. Nach Absorption eines Photons aus dem Grundzustand wird das Molekül in den S1-Zustand transferiert. Der schnellste Weg zur Entvölkerung des S1-Zustandes ist die spontane Emission, die mit Aussendung eines Photons einhergeht. Mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit kann das Farbstoffmolekül aber auch in andere Dunkelzustände, etwa den Triplettzustand, transferiert werden. Der Triplettzustand hat in Wasser normalerweise eine wesentlich längere Lebensdauer als der S1-Zustand (z. B. 100 ns–10 μs vs. 0.2–10 ns), daher ist die Wahrscheinlichkeit eines irreversiblen chemischen Prozesses aus dem Triplettzustand normalerweise viel größer, was z. B. auch durch Absorption eines weiteren Photons aus dem Triplettzustand heraus gefördert werden kann.
-
Die im ROXS-Puffer enthaltenen Agenzien entvölkern nun diesen potentiell reaktiven Dunkelzustand durch Oxidation oder Reduktion, so dass ein geladenes Teilchen entsteht.
-
Die Eignung des Oxidations- oder Reduktionsmittels hängt von seinem Redoxpotential ab. Für ein geeignetes Oxidationsmittel liegt dieses vorzugsweise im Bereich von ≥ –1 V bis ≤ –0,2 V, bevorzugt im Bereich von ≥ –600 mV bis ≤ 100 mV, bevorzugt im Bereich von ≥ –250 mV bis ≤ –200 mV.
-
Der durch den Oxidations- oder Reduktionsprozess entstandene geladene Zustand ist ebenfalls ein Dunkelzustand und kann nun durch den gegenteiligen Prozess wieder entvölkert werden, wobei das Farbstoffmolekül wieder in den Grundzustand zurückkehrt. Ist etwa der geladene Zustand durch ein Oxidationsmittel verursacht, kann die Rückführung in den Grundzustand durch ein Reduktionsmittel verursacht werden und umgekehrt.
-
Wichtig ist hierbei das Redoxpotential des Reduktionsmittels. Das Redoxpotential eines geeigneten Reduktionsmittels liegt bei pH 7 gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode (NHE) in Acetonitril vorzugsweise im Bereich von ≥ 0,1 V bis ≤ 2 V, bevorzugt im Bereich von ≥ 500 mV bis ≤ 800 mV, bevorzugt im Bereich von ≥ 540 mV bis ≤ 750 mV.
-
Die wichtigste Aufgabe der Pufferlösung, in der Oxidations- und Reduktionsmittel gelöst werden, ist die Einstellung eines geeigneten pH-Wertes, da die Redoxpotentiale von Oxidations- und Reduktionsmittel sowie auch der verschiedenen Zustände des Farbstoffes abhängig vom pH-Wert sind.
-
Da in fixierten Zellen die Zellwände durch die Fixierung permeabilisiert werden, kann der Puffer auch in das Zellinnere eindringen und dort eine Photostabilisierung im Sinne der ROXS-Chemie ermöglichen.
-
Dieses Prinzip ist prinzipiell auch auf lebende Zellen übertragbar, da dort mit gelöstem Luftsauerstoff ein Oxidationsmittel sowie mit der eine Thiolgruppe enthaltenden Aminosäure Cystein ein geeignetes Reduktionsmittel vorhanden ist, hier ist die Wahl des Fluoreszenzfarbstoffes entscheidend.
-
Als Reduktionsmittel wird dabei typischerweise ein Thiol (etwa 100 mM Mercaptoethylamin) und als Oxidationsmittel z. B. Luftsauerstoff verwendet. Das Verfahren ist aber mit vielen anderen verschiedenen Oxidations- und/oder Reduktionsmitteln und/oder Reduktions-Oxidations-Mittel realisierbar.
-
Als Oxidationsmittel können z. B. – und nicht abschließend – dienen: Bipyridiniumsalze, deren Derivate, bevorzugt Viologene, insbesondere Methylviologen, und/oder Nitroaromaten; substituierte Nitroaromaten, insbesondere Carbonsäure-substituierte Nitroaromaten, bevorzugt Nitrobenzole, oder Sulfonsäure-substituierte Nitroaromaten, Benzochinone, substituierte Benzochinone, insbesondere Chlorsubstituierte und/oder Cyan-substituierte Benzochinone, insbesondere Dichlorobenzochinon, Tetrachlorobenzochinon, Tetracyanobenzochinon, und/oder Mischungen davon, sowie Phenole, Indophenole, Hydrochinone, Catechole, Chromane, Dihydrobenzofurane, Dihydroxinaphthalene und/oder Naphthole, sowie deren Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Nitro-, Chlor- und/oder oder Cyan-substituierte Derivate, wie etwa das Oxidations-/Reduktionsmittel Ubiquinon oder Cytochrome.
-
Geeignete Reduktionsmittel sind etwa aliphatische und aromatische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, mono- und di-Naphthylamine, insbesondere Phenylamin, Diphenylamin, p-Phenylendiamin, Hydroxylamine, Hydroxylamin-Derivate, Dihydrochinolin-Derivate, Piperidin-Derivate und/oder Pyrrolidin-Derivate, sowie Thiophenole, Thionaphthole, Phenolsulfide, Harnsäure (Urat), Harnstoff (Urea), Bilirubin, Ascorbinsäure und/oder Flavine, ferner cyclo-Octatetraen (5,6-Bis-Acetoxymethyl-Cycloocta, COT) und 1,4-diaza-bicyclo-(2,2,2)-octan (DABCO). Bevorzugte Reduktionsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, Ascorbinsäure, β-Mercaptoethanol, β-Mercaptoethylamin, β-Naphthylamin, Dithiothreitol, NaBH3CN, n-Propyl-Gallate und/oder Mischungen davon. Ein besonders bevorzugtes Reduktionsmittel ist 6-Hydro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox®).
-
Geeignete Reduktions-Oxidationsmittel sind etwa Ubiquinon oder Cytochrome. Generell handelt es sich hierbei um Substanzen, die sowohl als Oxidations- als auch als Reduktionsmittel fungieren können.
-
Eine umfassend Beschreibung möglicher Substanzen ist der
WO 2009/003948 A2 einschließlich zu entnehmen, deren diesbezüglicher Inhalt hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht wird.
-
Als Oxidationsmittel des Redox-Puffers kann auch Sauerstoff gewählt, da dies am einfachsten zu realisieren ist. Um den Sauerstoffgehalt des Redox-Puffers herabsetzen zu können, kann z. B. mit Stickstoff gespült werden. Da sich die Probe regelmäßig in wässriger Lösung befindet, kann diese mit Stickstoff durchströmt werden, um den Stauerstoffgehalt zu reduzieren.
-
Der Sauerstoffgehalt kann alternativ eingestellt werden durch Zugabe eines enzymatischen Systems umfassend Glucoseoxidase. Dieses enzymatische System besteht aus einem Enzym samt Substrat. Ein geeignetes Enzym ist Glucoseoxidase. Ein geeignetes zugehöriges Substrat ist Glukose. Die Glucose wird durch die Glucoseoxidase oxidiert, wodurch Sauerstoff verbraucht wird.
-
Das vorgeschlagene Verfahren erlaubt es auch, spezifische markierte Positionen innerhalb definierter Regionen der Probe abhängig von einer Zustandsänderung der Fluorophore zu identifizieren. Z. B. kann im Weitfeldbild eine dynamische Entwicklung der Probe ausgewertet werden. Daraus abgeleitet kann selektiv derjenige Probenbereich mit der punktförmigen Detektion angesteuert bzw. fokussiert werden, der die gesuchte Dynamik aufweist. Wenn etwa eine Zelle kontrahiert an Stelle x – y, kann genau an dieser Stelle mittels TCSPC z. B. die Ca2+ Konzentration bestimmt werden, denn diese beeinflusst die Fluoreszenz-Lebensdauer eines geeigneten Sondenmoleküls.
-
hochauflösende Mikroskopie
-
Ein wichtiger Trend in der Lichtmikroskopie ist die immer genauere räumliche Auflösung zellulärer Strukturen. Klassische Lichtmikroskopie erreicht eine Auflösung, die durch die Wellenlänge des Lichtes sowie den optischen Aufbau begrenzt ist. Gegeben durch die Abbésche Formel liegt die erreichbare Auflösung im günstigsten Falle bei ca. der Hälfte der verwendeten Wellenlänge, im sichtbaren Bereich also zwischen 200 und 300 nm.
-
In den letzten Jahren wurden diverse neue Verfahren entwickelt, die diese klassische Auflösungsgrenze umgehen. Allen Verfahren ist gemeinsam, dass sie auf dem An- und Ausschalten eines Fluorophors beruhen. Mit diesen Verfahren lassen sich Auflösungen von bis zu 20 nm erreichen. Die wichtigsten Methoden sind:
- – STED (stimulated emission depletion microscopy, stimulierte Emissions-Entvölkerungs-Mikroskopie), entwickelt von Stefan Hell (s. z. B. WO 1995/021393 A2 ; WO 2009/024529 ], eine konfokale Methode, bei der das Bild über ein Rasterverfahren gewonnen wird.
- – PALM (Photoactivated Localization Microscopy, photoaktivierte Lokalisations-Mikroskopie), entwickelt von Betzig und Hess [ WO 2005/127592 ], ein Verfahren, bei dem die Probe flächig zyklisch zunächst mit einer ersten Wellenlänge beleuchtet wird, die einen Teil der Moleküle von einem Aus- in einen An-Zustand transferriert, und anschließend mit einer zweiten Wellenlänge im An-Zustand bestrahlt wird, wobei die Moleküle nach einigen Zyklen entweder bleichen oder in den Aus-Zustand zurückkehren. Danach wird dieser Zyklus wiederholt. Gleichzeitig wird die Fluoreszenz mit einer ortsauflösenden Kamera aufgenommen. In einer von Stefan Hell entwickelten Variante (PALMIRA: „PALM with Independly Running Acquisition”, A. Egner, Biophys. J. 93, 3285–90 (2007)] erfolgt die Bestrahlung mit beiden Wellenlängen gleichzeitig.
- – STORM (stochastical image reconstruction microscopy, stochastische Bildrekonstruktions-Mikroskopie), entwickelt von Rust und Zhuang [ WO 2008/091296 ], ebenfalls ein Verfahren mit flächiger Beleuchtung mit einer ersten Wellenlänge zum Einschalten eines Farbstoffes über einen Aktivatorfarbstoff, sowie einer zweiten Wellenlänge zum Anregen des detektierten Fluoreszenzfarbstoffs im An-Zustand. Die Detektion erfolgt mit einer ortsauflösenden Kamera.
- – dSTORM (direct STORM, direkte STORM bzw. direkte stochastische Bildrekonstruktions-Mikroskopie), entwickelt von Sauer [Heilemann et al., Ang. Ch. Int. Ed. 48 (37) 6903–8 (2009)], ebenfalls ein Verfahren mit flächiger Beleuchtung, bei der im Gegensatz zu STORM kein Aktivatorfarbstoff benutzt wird. Das Schalten von Farbstoffen kann entweder optisch mit einer zweiten Wellenlänge (bei Carbocyanin-Farbstoffen), oder mit einer einzigen Wellenlänge ausschließlich über die Pufferbedingungen gesteuert werden (z. B. bei Oxazin oder Rhodamin-Farbstoffen). Hier wird ebenfalls mit einer ortsauflösenden Kamera detektiert.
- – Das gezielte Schalten von Dunkelzuständen wird außerdem auch in der GSD-Methode verwendet, allerdings zielt diese Methode auf das Schalten von Farbstoffen durch Verlängerung der Lebensdauer des Triplett-Zustandes ab, z. B. durch Messungen in Polyvinylalkohol, PVA („Ground State Depletion”) [siehe z. B. DE 10 2006 021 317 B3 ; J. Fölling et. al., Nature Methods, 5, 943–5, 2008].
- – Die Unterschiede zwischen PALM, STORM, dSTORM und GSDIM liegen im Wesentlichen darin, welche Prozesse zum Schalten des Farbstoffes genutzt werden, sowie in der Probenpräparation und der Verwendung des Anregungslichtes.
-
Eine bedeutende Motivation solcher hochaufgelöster Messungen sind Anwendungen, in denen verschiedene Strukturen mit spektral unterschiedlichen Farbstoffen markiert werden, so dass die räumliche Anordnung verschiedener Strukturen und ihr Verhältnis zueinander bestimmt werden können.
-
dSTORM
-
Die hier beschriebene Vorrichtung verwendet die dSTORM-Technologie, die in Heilemann et al., Ang. Ch. Int. Ed. 48 (37) 6903–8 (2009)] beschrieben ist. Die Offenbarung dieser Schrift wird hiermit durch Bezugnahme in diese Beschreibung integriert.
-
dSTORM ermöglicht das Schalten eines Farbstoffs mit nur einer einzigen Wellenlänge, was Markierungen mit mehreren Farbstoffen wesentlich erleichtert. Hierbei wird eine zelluläre Struktur mit einem Antikörper markiert, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen ist. Die Probe wird mit einer Pufferlösung überschichtet, die einen speziellen Pufferzusatz basierend auf der ROXS-Technologie enthält, so dass die Farbstoffmoleküle bei flächiger Bestrahlung im Mikroskop mit ihrer Anregungswellenlänge zwischen An- und Aus-Zuständen wechseln.
-
Die Zusammensetzung des ROXS-Puffers wird in diesem Falle anders als Eingangs im Zusammenhang mit dem Thema Photostabilität beschrieben gewählt, ohne dabei die Photostabilität der Fluorophore wesentlich zu verschlechtern. Hier wird die Konzentration des Oxidations- und Reduktionsmittels so eingestellt, dass sich die Moleküle längere Zeit im nicht leuchtenden Radikalanion-Zustand (Aus-Zustand) befinden und somit die meisten Moleküle bei einer Mikroskopaufnahme in einem einzelnen Bild nicht sichtbar sind.
-
Durch Aufnahme eines zeitlichen Bildstapels aus ca. 1.000–10.000 Einzelbildern mit Aufnahmedauern für ein Einzelbild von üblicherweise 50–100 ms erhält man eine Serie von Bildern, wobei in jedem Bild eine andere Untermenge der Moleküle stochastisch eingeschaltet ist.
-
Diese Menge muss in jedem Bild so gering sein, dass die Moleküle in jedem Bild soweit auseinander liegen, dass jedes einzelne Molekül als individueller, räumlich von den anderen Molekülsignalen getrennter, beugungsbegrenzter Spot zu sehen ist.
-
Nun wird in jedem Einzelbild des Bildstapels jeweils bei allen gefundenen Einzelmolekülsignalen das Zentrum – der Schwerpunkt – der Fluoreszenz bestimmt. Dies lässt sich mit sehr genauer Präzision durchführen, die theoretisch mögliche Genauigkeit liegt bei Berücksichtigung der Aufnahmezeit und emittierten Photonenzahl bei bis zu ca. 20 nm [siehe R. E. Thompson et al., Biophys. J. 82, 2775–2783, 2002].
-
Aus allen gefundenen Molekülpositionen des Bildstapels wird danach ein Bild mit einer Auflösung erzeugt, die nur durch die Genauigkeit der Positionsbestimmung der einzelnen Moleküle in den Bildern gegeben ist, nicht durch die beugungsbegrenzte optische Auflösung eines Standard-Mikroskops, die damit ca. 10-fach verbessert wird.
-
Die Methode beruht im Wesentlichen auf dem Schalten der Moleküle zwischen An- und Aus-Zuständen des Farbstoffes. Die ROXS-Technologie wurde ursprünglich zur Unterdrückung von Bleichprozessen mittels Photozerstörung entwickelt, indem die Aufenthaltsdauer des Farbstoffes im Triplettzustand, der stark anfällig für Reaktionen mit Luftsauerstoff ist, stark verkürzt wurde. Hierbei wurde zunächst kein Wert auf eine anschließende längere Verweildauer (und damit einen Aus-Zustand) im Radikalanion-Zustand gelegt.
-
Für die dSTORM-Mikroskopie sind allerdings längere Aus-Zustände ein Grundvorrausetzung, um nur eine kleine Teilmenge an im Moment leuchtenden Fluorophoren untersuchen zu können. Es werden dazu die die gleichen ROXS-Pufferzusätze verwendet, allerdings werden die Konzentrationen der Pufferzusätze speziell auf längere Aus-Zeiten angepasst.
-
Bei beiden Anwendungen ist die Tatsache, dass die Aufenthaltsdauer des Farbstoffes in verschiedenen An- und Aus-Zuständen durch den Zusatz von oxidierenden und/oder reduzierenden Substanzen eingestellt werden kann, essentiell für das Funktionieren der Methode.
-
Eine besonders hohe Ortsauflösung für die Lebensdaueruntersuchungen erhält man, wenn man für die Weitfeld-Bildgebung die hochaufgelöste Positionsbestimmung mittels der dSTORM Methode oder verwandter Technologien verwendet. Die interessierenden Fluorophore können über die Kameraaufnahme identifiziert und anschließend zeitaufgelöst, insbesondere mittels TCSPC, vermessen werden.
-
Erfolgt die Bildgebung über dSTORM wird man sinnvollerweise genau diejenigen Fluorophore zeitaufgelöst vermessen, die sich gerade in einem fluoreszierenden An-Zustand befinden.
-
Die Verwendung der anderen eingangs beschriebenen hochauflösenden Techniken für diese Anwendung ist ebenfalls möglich. Bei Einsatz anderer sub-beugungsbegrenzter Techniken als dSTORM bedarf es ggf. des Einsatzes weiteren An- oder Abregungslichts, welches – je nach verwendeter Methode – ebenfalls evaneszent zur Beleuchtung der Probe eingekoppelt wird.
-
Man erhält auf diese Weise ortsaufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Informationen, wobei die Ortsauflösung unterhalb der Beugungsbegrenzung liegt (siehe dazu auch 7 weiter unten mit zugehöriger Beschreibung).
-
Foerster-Resonanz-Energie-Transfer
-
Die oben beschriebenen Methoden ermöglichen aber noch nicht ausreichend gut die räumliche Auflösung direkter Interaktionen zwischen zwei markierten Molekülen, die im Bereich kleiner ca. 20 nm stattfinden.
-
Zur Messung von direkten Interaktionen wird in der Zellbiologie häufig die Übertragung der Anregungsenergie von einem Donorfarbstoff, der mit einem spektral geeigneten Laserstrahl angeregt wird, auf einen Akzeptorfarbstoff, der in einem anderen spektralen Bereich Fluoreszenzphotonen emittiert, verwendet. Dieses Verfahren nennt man Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Bei diesem Prozess, der eine maximale Reichweite von 10 nm hat, wird die Fluoreszenzlebensdauer des Donormoleküls verkürzt [siehe hierzu z. B. L. Stryer, Annu. Rev. Biochem. 47, 819–847 (1978)].
-
FRET-Messungen decken einen Abstandsbereich bis max. 10 nm ab. Der messbare Abstandsbereich liegt damit im Bereich molekularer Interaktionen und schließt an die bisher erreichte Auflösungsgrenze von ca. 20 nm der o. g. Verfahren STED, GSDIM, STORM, dSTORM und PALM an. Mit einer Kombination von präzisen FRET-Messungen auf der Basis zeitaufgelöster Methoden mit den räumlich hochauflösenden Methoden wird somit ein Messsystem möglich, welches von 1 nm bis 1000 nm orts- und zeitlich aufgelöst messen kann.
-
Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht u. a. auch selektive FRET-Messungen für Bindungsstudien innerhalb von Zellmembranen, wobei auch Bindungsstöchiometrien bestimmt werden können. Ferner sind Untersuchungen zur Positionierung einzelner Biomoleküle innerhalb von Zellmembranen und damit Untersuchungen der Membranstruktur möglich.
-
Ferner wird zur Lösung der Aufgabe eine Vorrichtung vorgeschlagen, die geeignet ist, das vorgeschlagene Verfahren durchzuführen.
-
Insbesondere hat die Vorrichtung:
- a) eine gepulste Anregungslichtquelle mit einer Pulslänge kleiner als 1 ns;
- b) Mittel zur Auflicht-Beleuchtung eines Probenträgers oder zum evaneszenten Einkoppeln des Lichts der Anregungslichtquelle in einen Probenträger; und
- c) einen optischen Aufbau, um von dem Fluorophor ausgehendes Fluoreszenzlicht durch eine Lochblende auf einen Detektor zu leiten,
- d) wobei der optischen Aufbau mittels der Lochblende ein Detektionsvolumen definiert, und
- e) wobei der Detektor derart ausgebildet ist, dass er einzelne Photonen des Fluoreszenzlichts mit einer zeitlichen Auflösung von besser als 1 ns detektieren kann. Ferner weist die Vorrichtung folgendes auf:
- f) einen ortsaufgelösten Detektor zur Aufnahme von Fluoreszenzlicht;
- g) Mittel zum Identifizieren einer interessanten Messregion innerhalb der Probe ausgehend von mindestens einer Aufnahme des ortsaufgelösten Detektors,
- g1) wobei hierfür ein Verfahren eingesetzt wird, welches eine Ortsauflösung unterhalb der Beugungsbegrenzung erreichen kann, insbesondere direkte stochastische Bildrekonstruktions-Mikroskopie;
- h) Mittel zum Positionieren des Detektionsvolumens auf die interessante Messregion; und
- i) Mittel zum Abrastern der interessanten Messregion mit dem räumlich begrenzten Detektionsvolumen (45) der zeitaufgelösten Detektion.
-
Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. So umfassen beispielsweise Bereichsangaben stets alle – nicht genannten – Zwischenwerte und alle denkbaren Teilintervalle.
-
Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch dargestellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:
-
1 eine schematische Darstellung des optischen Aufbaus;
-
2 eine schematische Darstellung der evanescenten Beleuchtung mittels Totalreflexion (TIR) sowie der Auflichtbeleuchtung;
-
3 eine schematische Darstellung der Überlagerung von TIR-Beleuchtung und räumlich begrenzter Detektion in der Probe auf einem Objektträger; und
-
4 den schematischen Ablauf einer Datenaufnahme für ein sub-beugungsbegrenztes hochaufgelöstes Fluoreszenzbild und die gleichzeitige, punktuelle Aufnahme von Fluoreszenzlebensdauerinformation.
-
Vorrichtung
-
1 zeigt eine schematische Darstellung des optischen Aufbaus.
-
Licht der Strahlquelle 10 wird über eine Linse 11, einen dichroitischen Strahlteiler 12 und ein Mikroskop bzw. dessen Objektiv 13 in den Probenträger 14 eingekoppelt. Der dichroitische Strahlteiler 12 reflektiert das Anregungslicht und transmittiert das Fluoreszenzlicht.
-
Die Einheit 37 erlaubt dabei das Anregungslicht sowohl auf der optischen Achse des Objektivs in dieses einzukoppeln oder parallel versetzt zu dessen Achse. Wird das Licht so dezentral bezogen auf die optische Achse in das Objektiv 13 eingekoppelt, dass es unter einem hinreichend großen Winkel bezogen auf die optische Achse in den Probenträger 14 eingekoppelt wird, so wird es zumindest an einer, und zwar der oberen, Oberfläche des Probenträgers 14 totalreflektiert.
-
Zu diesem Zweck sitzt die Probe vorzugsweise auf der vom Objektiv 13 abgewandten Seite des Probenträgers 14. Meist wird das Mikroskop als inverses Mikroskop betrieben, da hiermit die Probe zum Austausch des Puffers leichter zugänglich ist. Aber auch ein Aufbau mit einem aufrechten Mikroskopaufbau ist bei Verwendung geeigneter Probenkammern möglich.
-
Emittiertes Fluoreszenzlicht wird vom Objektiv 13 aufgefangen und über den Strahlteiler 12, einen Strahlteiler 16 und eine Linse oder ein weiteres Objektiv 20 auf eine CCD-Kamera 22 für die Weitfeld-Beobachtung der Probe geleitet.
-
Zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer wird das Fluoreszenzlicht in dem zweiten Strahlengang nach dem Strahlteiler 16 über verschiedene Linsen 24, eine kippbare Spiegeleinheit 26 und eine Fokussierlinse 30 auf eine Lochblende 32 geleitet, hinter der ein zeitaufgelöster Detektor 34, z. B. eine SPAD, (single photon counting avalanche photodiode) bzw. ein PMT (photo multiplier tube) hinter einer weiteren Linse 36 das Licht detektiert.
-
Die kippbare Spiegeleinheit 26 erlaubt die Positionierung des Detektionsvolumens in zwei zueinander senkrechten Richtungen. Zum Vermessen eines Probenbereiches kann entweder der Probenträger 14 abgescannt werden, wodurch ein Bild mit Fluoreszenzlebensdauern erzeugt werden kann. Oder – wie eingangs erläutert – es kann mit der CCD-Kamera 22 direkt ein komplettes, ortsaufgelöstes Bild aufgenommen werden. Danach können die fluoreszierenden Positionen der Sondenmoleküle lokalisiert werden, woraufhin das Detektionsvolumen mittels des kippbaren Spiegels 26 auf die ausgesuchten Bereiche gerichtet werden kann.
-
Die kippbare Spiegeleinheit 26 kann durch einen singulären, zweiachsigen Kippspiegel (z. B. mit Piezo-Antrieb und/oder miniaturisiert auf MOEMS Basis) oder zwei einachsige Kippspiegel (z. B. mit Galvo-Antrieben) mit zueinander orthogonalen Kippachsen realisiert sein. Für das schnelle Anfahren und regelmäßige Abrastern (und Überspringen uninteressanter Probenbereiche) ist ein Einzelschrittbetrieb (Steg & Settle Betriebsart) notwendig, der die Positionierung innerhalb von weniger als 1 ms erlaubt.
-
Im Folgenden wird auf 2 Bezug genommen. 2 zeigt eine schematische Darstellung der evanescenten Beleuchtung mittels Totalreflexion (TIR) sowie der Auflichtbeleuchtung.
-
Der Strahlengang 41 wird seitlich derart in das Mikroskop-Objektiv 13 eingekoppelt, dass er – nach Durchlaufen des Immersionsöls 40 – an der Oberseite des Probenträgers 14 totalreflektiert wird. Es kommt dadurch nur zu einem entlang der optischen Achse eng begrenzten Anregungsvolumen 43. Dieses hat entlang der optischen Achse einen exponentiell abfallenden Intensitätsverlauf mit einer Ausdehnung von ca. 100 nm. Dies erlaubt eine selektive Untersuchung dieses eingegrenzten Bereichs der Probe 50.
-
Der Lichtstrahl 42 deutet schematisch eine Auflichtbeleuchtung an.
-
Im Folgenden wird auf 3 Bezug genommen. 3 zeigt eine schematische Darstellung der Überlagerung von TIR-Beleuchtung 41 und räumlich begrenzter Detektion 45 in der Probe 50 auf einem Objektträger 14. Die evaneszente (TIR) Beleuchtung 41 führt zu einem entlang der optischen Achse räumlich begrenzten Anregungsvolumen 43 an der Oberfläche 46 des Probenträgers 14. Auf der anderen Seite führt die Detektion mit Hilfe einer Lochblende 32 zu einem senkecht zur optischen Achse begrenzten Detektionsvolumen 45. Der Überlapp dieser beiden Volumina ist kleiner als die Beugungsgrenze. Die räumliche Ausdehnung des überlappenden Bereich ist etwa 100 nm × 500 nm × 500 nm.
-
Messablauf
-
Der typische Ablauf bei einer Messung ist wie folgt:
Die Probe wird auf einem Probenträger 14 angeordnet. Typischerweise ist die Probe eine Zelle, in deren zu untersuchender Membran ein fluoreszenz-markiertes Biomolekül ein- oder angelagert ist.
-
Ein gepulster Laser 10 wird als Anregungslicht entweder an axis oder off axis (seitlich versetzt zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs 13) in dieses eingekoppelt.
-
Die Einkopplung des Anregungslichts in den Probenträger 14 kann also dergestalt erfolgen, dass Totalreflexion des Anregungslichts an der Grenzfläche zwischen Probenträger 14 und Probe erzielt wird. Dadurch wird die Probe selektiv in einem axial (bezogen auf die optische Achse des Mikroskops) nur ca. 100 nm tiefen Bereich angeregt (total internal reflection fluorescence, TIRF). Die Anregungsregion ist in diesem Fall signifikant dünner als bei üblicher Weitfeld- oder Konfokal-Mikroskopie.
-
Das limitierende Photobleichen der Probe wird außerdem durch Zugabe bestimmter Puffersubstanzen stark vermindert (siehe die obige Beschreibung der ROXS-Technologie).
-
Beispiele für Messbedingungen sind z. B. in Heilemann et al., Ang. Chem. Int. Ed. 48 (37), 6903–8 (2009) beschrieben, die wir hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung machen. Für viele Farbstoffe (z. B. ATTO520 oder Alexa Fluor 532), wird ein PBS-Puffer (phoshate buffered saline) mit einem pH-Wert von 7.4 mit Zusatz eines Thiols als Reduktionsmittel, wie etwa Mercaptoethylamin (MEA), verwendet, wobei die Konzentration des Thiols häufig 10–100 mM beträgt.
-
Das Fluoreszenzlicht wird über das Objektiv 13 wieder eingesammelt.
-
Das auf das Pinhole 32 fokussierte Licht wird mit einem schnellen Detektor 34 via Einzelphotonenzählen detektiert. Auf diese Art sind sowohl Messungen der Intensität als auch der Fluoreszenzlebensdauer in einem Punkt möglich.
-
Um ein zeitaufgelöstes Bild zu erhalten, wird nun das abgebildete Detektionsvolumen über vor dem Pinhole 32 angebrachte kippbare Detektionsspiegel 26 gescannt. Auf diese Art entsteht ein Rasterbild eines Probenbereiches.
-
Das vorgeschlagene Verfahren unterscheidet sich u. a. dahingehend von existierenden konfokalen Mikroskopier-Verfahren, dass hier nicht Anregungs- und Detektionsvolumen gleichzeitig gescannt werden. Vorliegend wird nur das Detektionsvolumen gescannt. Dadurch bleibt die Möglichkeit erhalten, mit derselben Beleuchtung gleichzeitig ein stationäres Weitfeldbild aufzunehmen.
-
Alternativ zu den kippbaren Spiegeln 26 kann auch die Probe mit dem Probenträger 14 verschoben werden.
-
Gleichzeitig mit dem Scannen des punktförmigen Detektionsvolumens wird mittels eines Strahlteilers 16 ein Teil des Fluoreszenzlichts auf einen Flächendetektor 22 geleitet. Die Strahlteilung im Strahlteiler 16 kann auf Grund verschiedenster Diskriminierungsmerkmale erfolgen (Intensitätsverhältnisse, Polarisationszustände, spektrale Aufsplittung, etc.).
-
Das mit der CCD-Kamera 22 aufgenommene Weitfeldbild von größeren Teilen der Oberfläche des Probenträgers wird analysiert, um interessante Bereiche zu identifizieren. Dies kann z. B. mittels einer einfachen Intensitäts-Schwelle oder aber komplexerer Algorithmen erfolgen.
-
Die so gewonnenen Informationen werden dahingehend genutzt, dass nachfolgend nur die interessanten Bereiche abgerastert bzw. abgescannt werden. Die übrigen Bereiche werden übersprungen, woraus sich eine erhebliche Zeitersparnis ergibt.
-
Der interaktive Feedback zwischen Aufnahme des Weitfeldbildes mit der CCD-Kamera 22 und der Steuerung des konfokalen Scanners bzw. des kippbaren Spiegels 26 kann auf verschiedene Weisen erfolgen:
- – Der einfachste Fall ist derjenige, bei dem ein Nutzer auf dem Weitfeldbild einen ihn interessierenden Bereich markiert. Dieser wird anschließend abgescannt.
- – Für die Detektion einzelner Moleküle bzw. Fluorophore bestimmt ein Algorithmus automatisch aus dem Weitfeldbild Einzelmolekülsignale. Anschließend fährt der Scanner diese sequentiell an, wobei die Aufnahmezeit der konfokalen Aufnahme unabhängig einstellbar ist.
- – Zur Bestimmung zellulärer Strukturen werden über eine Schwelle (Threshold) oder andere Auswahlkriterien die interessanten Bereiche ausgewählt. Der Scanner 26 fährt die entsprechenden Bereiche ab. Dabei kann auch ein Bild generiert werden.
- – Es ist auch ein Feedback-Loop-denkbar, in dem z. B. nach Anfahren eines konfokalen Punktes das Molekül selektiv gebleicht oder geschaltet wird.
- – Durch die gleichzeitige Weitfeldaufnahme ohne Umschaltung von optischen Elementen im Strahlengang können auf dem Flächendetektor 22 permanent intensitätsbasierte Bilder der gesamten Probe aufgenommen werden. Dies ermöglicht z. B. die Untersuchung von Dynamiken im ms-Bereich.
- – Es können weiterhin auf Basis des Kamerabildes spezielle Bereiche in der Probe (Englisch: Region of Interest (ROI)) durch geeignete Algorithmen sehr schnell ermittelt werden, in welchen selektiv die zeitaufgelöste Detektion stattfindet
-
Beschreibung der ROXS-Präparation
-
Das limitierende Photobleichen der Probe wird außerdem durch Zugabe bestimmter Puffersubstanzen stark vermindert [siehe
WO 2009/003948 A2 ]. Dadurch werden auch lange Weitfeldbeleuchtungszeiten ermöglicht, die für die vergleichsweise langsam abrasternde, sequentielle Detektion und für die wiederholte Aufnahme von CCD-Bildern für Superresolutions-Mikroskopie notwendig sind. Dies ist insbesondere für jene Pixel wichtig, die erst gegen Ende der Bildaufnahme abgefragt werden, aber bereits seit Aufnahmebeginn beleuchtet wurden.
-
Die ROXS-Technologie kann hierbei in zweierlei Weise genutzt werden: Soll nur das Photobleichen minimiert werden, werden die in der ROXS-Technologie verwendeten Pufferzusätze so ausgewählt, dass das Molekül möglichst schnell in den S0-Grundzustand zurückbefördert wird.
-
Dieses Verfahren ist in der Publikation von J. Vogelsang et al, Ang. Chem. Int. Ed. 47 (29), 5465–5469 (2009) sowie im Patent
WO 2009/003948 A2 beschrieben. Hierin wird gezeigt, dass z. B. für einzelne Moleküle des Farbstoffes ATTO647N die Zeit bis zum Photobleichen durch Zusatz von 1.8 mM des Oxidationsmittels Methylviologen und 0.5 mM des Reduktionsmittels Trolox im den Probenpuffer von ~20 s (in einem beispielhaften Aufbau) auf über 20 min erhöht werden kann, also um das 60-Fache. Das Prinzip beruht meist darauf, dass z. B. das Reduktionsmittel den Farbstoff, wenn er sich gerade im Triplettzustand befindet, zu einem Radikalanion reduziert, welches vom Oxidationsmittel wieder in den Grundzustand oxidiert wird. Allgemein kann mit der ROXS-Technologie ein Farbstoff durch das Oxidations- oder Reduktionsmittel in einen geladenen Zustand überführt werden. Damit wird die zeitliche Aufenthaltsdauer im bleichempfindlichen Triplettzustand verkürzt und der Farbstoff weniger anfällig für das Photobleichen.
-
Da der geladene Zustand selbst einen normalerweise langlebigen Dunkelzustand darstellt, kann auch durch Erniedrigung der Konzentration des Oxidationsmittels die Aufenthaltsdauer des Farbstoffes im Dunkelzustand gezielt erhöht werden, wie es beispielsweise bei der dSTORM-Methode der Fall ist.
-
Bei dieser zweiten Verwendung der ROXS-Methode, die etwa in der Publikation M. Heilemann et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (37) 6903–8 (2009) verwendet wird, werden die Konzentrationen des Oxidations- und/oder Reduktionsmittels im Probenpuffer so eingestellt, dass der Farbstoff sich statistisch längere Zeit in dem geladenen reversiblen Dunkelzustand aufhält. Weiterhin kann durch Einstellung des Verhältnisses zwischen Reduktionsmittel und Oxidationsmittel die Dauer des nicht fluoreszierenden ”Aus”-Zustands eines Fluoreszenzfarbstoffs im Bereich von Nanosekunden bis in den Millisekundenbereich eingestellt werden. So kann die Dauer des nicht fluoreszierenden ”Aus”-Zustands eines Fluoreszenzfarbstoffs im Bereich von ≥ 10 ns bis ≤ 200 ms, bevorzugt im Bereich von ≥ 100 ns bis ≤ 100 ms, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 ms bis ≤ 100 ms, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 5 ms bis ≤ 20 ms, eingestellt werden.
-
Außerdem kann die Dauer des fluoreszierenden ”An”-Zustands des Fluoreszenzfarbstoffs zum Einen durch die Laserleistung gesteuert werden, und kann beispielsweise ca. 5 ms bei ca. 100 W/cm2 betragen. Beispielsweise kann eine Erhöhung der Laserleistung eine entsprechende antiproportionale Verkürzung der Dauer des fluoreszierenden ”An”-Zustands des Fluoreszenzfarbstoffs bewirken. Dabei verändert sich vorzugsweise die Anzahl der emittierten Photonen während eines ”An”-Zustands annähernd nicht. Zum Anderen kann die Dauer des ”An”-Zustands darüber hinaus durch eine erhöhte Zugabe von Oxidationsmittel bzw. Reduktionsmittel beeinflusst werden, indem bei Konzentrationen ≥ 10 μmol/l bis ≤ 1 mol/l, bevorzugt ≥ 100 μmol/l bis ≤ 50 mmol/l, auch die Singulettzustände durch photoinduzierten Elektronentransfer entvölkert werden. Bei dieser Art der Steuerung des ”An”-Zustands kann sich entsprechend die Zahl der emittierten Photonen während eines ”An”-Zustands verringern.
-
Bevorzugte Puffer und Agenzien für diese Methode entsprechen den Agenzien der bereits beschriebenen Erhöhung der Photostabilität. Bevorzugte Lösemittel sind z. B. Pufferlösungen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und/oder BSS (balanced salt solution), aber auch andere Lösungsmittel als Wasser, wie etwa Alkohole, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerol, organische Lösemittel und/oder Mischungen davon.
-
Bevorzugte Oxidationsmittel sind, wie bereits oben beschrieben, Bipyridiniumsalze, deren Derivate, bevorzugt Viologene, insbesondere Methylviologen, und/oder Nitroaromaten, insbesondere Carbonsäure-substituierte Nitroaromaten oder Sulfonsäure-substituierte Nitroaromaten, bevorzugt Nitrobenzole, Benzochinone, substituierte Benzochinone, insbesondere Chlorsubstituierte und/oder Cyan-substituierte Benzochinone, insbesondere Dichlorobenzochinon, Tetrachlorobenzochinon und/oder Mischungen davon, sowie z. B. Phenole oder Chinone.
-
Bevorzugte Reduktionsmittel stammen aus der Gruppe der aliphatischen oder aromatischen Amine, Thiophenole, Thionaphthole, Phenolsulfide, Harnsäure (Urat), Harnstoff (Urea), Bilirubin, Ascorbinsäure und/oder Flavine, sowie 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, Ascorbinsäure, β-Mercaptoethanol, β-Mercaptoethylamin, β-Naphthylamin, Dithiothreitol, NaBH3CN, n-Propyl-Gallate und/oder Mischungen davon.
-
In weiteren Ausführungsformen kann die Konzentration eines Redox-Puffers umfassend wenigstens ein Reduktionsmittel und/oder wenigstens ein Oxidationsmittel oder ein Reduktions-Oxidations-Mittel beispielsweise in einer wässrigen Lösung vorzugsweise im Bereich von ≥ 0 mM bis ≤ 100 mM, bevorzugt im Bereich von ≥ 0,01 mM bis ≤ 50 mM, weiter bevorzugt im Bereich von ≥ 0,1 mM bis ≤ 10 mM, auch bevorzugt im Bereich von ≥ 0,2 mM bis ≤ 5 mM, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,5 mM bis ≤ 2 mM liegen.
-
Zur Einstellung des Fluoreszenzzustandes eines Fluoreszenzfarbstoffs kann das Verhältnis von Reduktionsmittel zu Oxidationsmittel deutlich zu einer Seite verschoben sein oder der Anteil von Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel Null sein. Beispielsweise kann das Verhältnis von Reduktionsmittel zu Oxidationsmittel im Bereich von ≥ 1000:1 bis ≤ 1:1000, bevorzugt im Bereich von ≥ 1000:1 bis ≤ 1:100 oder im Bereich von ≥ 100:1 bis ≤ 1:1000, weiter bevorzugt im Bereich von ≥ 100:1 bis ≤ 1:100, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 10:1 bis ≤ 1:10, liegen.
-
Einzelmolekül-Vermessung
-
Im Folgenden wird auf 4 Bezug genommen.
-
Bei Einsatz von dSTORM leuchten in der Regel nur wenige Fluorophore auf der Detektionsfläche und sind entsprechend weit voneinander entfernt.
-
Um diese zu finden, anschließend zu vermessen und final ein hochaufgelöstes Weitfeldbild zu generieren bzw. punktuelle Statistiken zu gewinnen, wird typischerweise mit der CCD-Kamera 22 die Aufnahme eines Bildstapels gestartet. Die Einzelbilder 65, 66, 67 werden in Echtzeit analysiert, um die Position eines eingeschalteten Fluorophores 54 zu identifizieren. Dieses sollte möglichst hell leuchten, keine Nachbarmoleküle haben und schnell mit dem Scanner erreichbar sein.
-
Nach dem Identifizieren eines solchen Fluorophores 54 im ersten Einzelbild 65 wird das punktuelle Detektionsvolumen innerhalb der An-Zeit des identifizierten Fluorophores auf dessen Position verfahren. Anschließend wird die Fluoreszenzabklingkurve 56 dieses Fluorophores aufgenommen. Zeitversetzt dazu wird mit dem CCD-Detektor 22 bereits ein weiteres Einzelbild 66 aufgenommen, in dem wiederum ein neuer Fluorophor identifiziert, angefahren und charakterisiert werden kann. So erhält man für (mindestens) jeweils einen Fluorophor pro Bild zusätzliche Lebensdauer-Information.
-
Das Ergebnis ist in 4 schematisch dargestellt. Der Rahmen 53 ist eine schematische Darstellung einer Probe, die mit einzelnen Fluorophoren markiert ist. Der Rahmen 61 zeigt das sub-beugungsbegrenzte Fluoreszenzbild, aufgebaut aus allen Mittelpunkten der in den Einzelbildern 65, 66, 67 erfassten beugungsbegrenzten Spots. In 62 sind die Fluorophore zusätzlich Lebensdauer codiert dargestellt. In diesem Beispiel zeigen die Fluorophore in verschiedenen Strukturen unterschiedliche Lebensdauern (1 ns und 3 ns). Für einen Teil der Fluorophore 63 liegt keine Lebensdauerinformation vor.
-
Auf diese Weise erhält man ein sub-beugungsbegrenztes, ortsaufgelöstes Bild mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Informationen.
-
Beschreibung der FRET-Messungen
-
Um zusätzlich zur hochaufgelösten Positionsbestimmung noch FRET zur Bestimmung molekularer Interaktionen nutzen zu können, wird eine zweite Struktur, z. B. ein Protein oder ein Lipid o. ä., das sich in bestimmte Membranstrukturen einlagert, direkt angeregt (fluoreszierendes Protein) oder mit einem zweiten Farbstoff (Akzeptor) markiert. Dieser absorbiert in einem langwellig verschobenen Bereich des optischen Spektrums, wobei für den Energietransfer die Emission des ersten, angeregten Farbstoffs (Donor) mit der Absorption des zweiten Farbstoffs (Akzeptor) spektral überlappen muss.
-
Der erste Farbstoff (Donor) wird durch Zugabe bestimmter Puffersubstanzen nicht nur am Bleichen gehindert, sondern auch dazu gebracht, bei den Aufnahmebedingungen zwischen einem An- und einem Aus-Zustand zu wechseln (siehe
WO 2009/003948 A2 ).
-
Beispiele für Messbedingungen sind z. B. in Heilemann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48 (37), 6903–8 (2009) beschrieben. Für viele Farbstoffe (z. B. ATTO520 oder Alexa Fluor 532) wird ein PBS-Puffer (phoshate buffered saline) mit einem pH-Wert von 7.4 mit Zusatz eines Thiols als Reduktionsmittel, wie etwa Mercaptoethylamin (MEA), verwendet, wobei die Konzentration des Thiols häufig 10–100 mM beträgt.
-
Das Fluoreszenzlicht wird über das Objektiv 13 wieder eingesammelt und mittels des Strahlteilers 16 für gleichzeitige Weitfeld- und zeitaufgelöste, punktförmige Detektion aufgespalten.
-
Mit der CCD-Kamera 22 wird ein Bildstapel aufgenommen. Beim Photoschalten der Moleküle im dSTORM-Verfahren darf innerhalb der optischen Auflösung immer nur ein einziges Molekül des Donors in seinem An-Zustand vorliegen. Dies wird durch die Einstellung des Puffers sowie durch die Intensität des Anregungslichts und/oder durch die Anwendungen einer zweiten Wellenlänge, mit der der erste Farbstoff evtl. photogeschaltet werden kann, gewährleistet. Beispiele hierzu finden sich in der Publikation von M. Heilemann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48 (37): 6903-8 (2009) für Farbstoffe, die mit nur einer Wellenlänge geschaltet werden, oder in der Publikation von M. Heilemann et al, Angew. Chem. Int. Ed. 47 (33): 6172–6 (2008) für Farbstoffe, bei denen zwei Wellenlängen zum Schalten notwendig sind. Für ersteren Fall ist beispielsweise für den Farbstoff ATT0655 die Verwendung eines PBS-Puffers mit pH 7.4 mit einem Zusatz von 100 mM Mercaptoethylamin (MEA) üblich, wobei die Beleuchtungsintensität z. B. 1.5 kW/cm2 bei 647 nm beträgt. Innerhalb eines einzelnen Bildes (Aufnahmedauer z. B. 50 ms) des Bildstapels liegen damit nur Signale einzelner Moleküle vor.
-
Mit Subpixelauflösung wird für jedes gefundene Molekül der Schwerpunkt des beugungsbegrenzten Fluoreszenzsignals und damit seine Position bestimmt (Lokalisationsmikroskopie) [s. z. B. R. E. Thompson et al., Biophys. J., 82, 2775–2783 (2002) oder S. Wolter et al., J. Microsc., 237, 12–22 (2010)].
-
Aus allen gefundenen Positionen eines Bildstapels wird ein hochaufgelöstes Bild aller gefundenen Positionen erzeugt. Wichtig ist, dass für jede gefundene Position immer noch die Information über das zeitliche Auftreten innerhalb der Aufnahme vorhanden ist.
-
Der zweite Teil des detektierten Fluoreszenzlichts wird auf das Pinhole 32 abgebildet und dahinter auf den schnellen und empfindlichen Detektor 34 fokussiert. Dieser Detektor registriert einzelne Photonen und ihre zeitliche Ankunft im Verhältnis zum anregenden Laserpuls via Einzelphotonenzählen. Auf diese Art sind Messungen der Fluoreszenzlebensdauer in einem Punkt möglich.
-
Da eine verkürzte Fluoreszenzlebensdauer in einem Fluoreszenzsignal auf einen Resonanzenergietransfer mit dem zweiten Farbstoff (Akzeptor) hindeutet, wird die Lokalisation dieser Interaktionen den Signalen auf dem berechneten Positionierungsbild eindeutig zugeordnet, d. h. die Interaktionsstellen zwischen Donor und Akzeptormolekül können anhand der Lebensdauer eindeutig zugeordnet werden. Damit können nicht nur Strukturen hochaufgelöst abgebildet werden, sondern auch Interaktionszentren.
-
Möglichkeiten des Einsatzes
-
erste Möglichkeit: räumlich hochaufgelöste Lebensdauer-Bildgebung
-
Die Probe wird kontinuierlich mit dem konfokalen, zeitlich hochauflösenden Detektionskanal gescannt und parallel mit der Kamera 22 aufgenommen.
-
Nach der Messung wird die vom schnellen Detektor 34 gemessene Fluoreszenzabklingzeit bzw. -lebensdauer zu verschiedenen Zeiten der Aufnahme mit der Information der Kamera 22 zu den unterschiedlichen Zeiten der Messung korreliert.
-
Damit lassen sich innerhalb des Bereiches des Kamerabildes, das dem Abbildungsbereich des schnellen Punktdetektors entspricht, die Fluoreszenzsignale des Kamerabildes bestimmten Fluoreszenzlebensdauern zuordnen. Daraus lassen sich z. B. mittels FRET Abstände ermitteln, welche eine Größenordnung genauer sind, als die mit einer Kamera ermittelbaren Abstände auf Basis der Hochauflösungsansätze wie STORM, PALM etc..
-
zweite Möglichkeit: Single Molecule Feedback
-
Da der punktförmige Detektionsbereich, gegeben durch das Pinhole 32, gescannt werden kann, kann während der Kamera-Aufnahme eine Rückkopplung dergestalt erfolgen, dass durch online Bildanalyse der Kameradaten Koordinaten von Molekülen identifiziert werden, die sich gerade im An-Zustand befinden.
-
Diese Koordinaten werden innerhalb weniger Millisekunden an die Kontrolleinheit des Scanners weitergereicht, so dass sich das punktförmige Detektionsvolumen innerhalb einer gewünschten Bildregion verschiebt.
-
Die Blinkzeiten der Moleküle (ein Molekül ist typischerweise ca. 100 ms an) werden hierbei mittels des speziell gewählten Puffers auf die Aufnahmerate der Kamera (ca. 20 Hz entspricht 2 frames pro 100 ms) abgestimmt, indem durch Ausnutzung der ROXS-Technologie die Konzentration des Oxidations- bzw. Reduktionsmittels so eingestellt wird, dass die An-Zeiten des Farbstoffes die gewünschte Länge von durchschnittlich 100 ms erreichen.
-
Dadurch wird das folgende Szenario ermöglicht (siehe dazu auch 4). Alle erwähnten Zeiten sind nur beispielhaft und können sowohl in Größenordnung als auch Verhältnis zueinander variieren.
- – Erstes Bild (Frame) der Kamera 22 (50 ms): es werden Daten mit der Kamera gesammelt.
- – Zweites Bild (50 ms):
- – In den ersten 10 ms erfolgt die Datenverarbeitung (Kamera auslesen, Position der gerade leuchtenden Moleküle innerhalb der Probe identifizieren).
- – In den nächsten 10 ms wird das konfokale Detektionsvolumen auf das zuvor identifizierte Molekül positioniert.
- – In den folgenden 40 ms werden im konfokalen Detektionsvolumen zeitaufgelöste Daten zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer aufgenommen.
- – Während der gesamten 50 ms wird im Weitfeld-Detektionsvolumen ein neues Kamerabild aufgenommen, um anschließend ein neues Molekül auszuwählen und den Scanner zu repositionieren.
-
Durch Einsatz dieses Algorithmus kann die Aufnahmedauer für Lebensdauerbilder unter den Pufferbedingungen für optische Hochauflösung deutlich reduziert werden, da das Verhältnis von An- zu Aus-Zeiten der Moleküle je nach gewünschter Hochauflösung ca. 1:100 betragen muss. Dies bedeutet, dass man im ungünstigsten Falle ohne diese Methode mehr als 100x der eigentlich benötigten Messzeit für die Ermittlung einer Fluoreszenzlebensdauer aufwenden müsste.
-
Auf diese Art kann alternativ pro Zeiteinheit die Lebensdauer einer wesentlich größeren Zahl von Molekülen bestimmt werden.
-
Bezugszeichenliste
-
- 10
- Laser
- 11
- Linse
- 12
- dichroitischer Strahlteiler
- 13
- Objektiv
- 14
- Probenträger
- 16
- Strahl-Kombination/Teilung z. B. 50/50
- 20
- Tubuslinse
- 22
- CCD-Kamera
- 24
- Teleskop (telezentrisches System)
- 26
- Scan-Spiegel
- 30
- Tubuslinse
- 32
- Lochblende
- 34
- zeitlich hochauflösender Einzelphotonen-Detektor
- 36
- Linse
- 37
- Beam Shifter (Modul für parallelen Strahlversatz)
- 40
- Immersionsöl
- 41
- Anregungslicht für evanescente Beleuchtung
- 42
- Anregungslicht für Auflichtbeleuchtung
- 43
- TIR-Anregungsvolumen
- 45
- Räumlich begrenztes Detektionsvolumen
- 46
- Oberseite des Probenträgers 14
- 50
- Probe
- 53
- mit Fluorophoren markierte Probe
- 54
- Spot eines leuchtenden Fluorophors
- 56
- Abklingkurve eines einzelnen, leuchtenden Fluorophors
- 61
- sub-beugungsbegrenztes Fluoreszenzbild
- 62
- Fluoreszenzbild mit zusätzlichen Lebensdauer-Informationen
- 63
- Fluorophor ohne Lebensdauer-Informationen
- 65
- CCD Einzelbild
- 66
- CCD Einzelbild
- 67
- CCD Einzelbild
-
zitierte Literatur
-
zitierte Patentliteratur
-
-
zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- W. Becker, Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques, Springer Series in Chemical Physics, 2005
- A. Egner: „PALM with Independly Running Acquisition”, Biophys. J. 93, 3285–90 (2007)
- A. Esposito, F. S. Wouters, „Fluoresence Lifetime imaging microscopy”, Curr. Prot. Cell Biol., Unit 4.14 (2004)
- K. N. Fish, Curr. Protoc. Cytom., Chapter 12, Unit 12.18 (2009)
- J. Fölling et al., Nature Methods, 5, 943–5 (2008)
- M. Heilemann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 47 (33) 6172–6 (2008)
- M. Heilemann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48 (37) 6903–8 (2009)
- J. Lakowicz, „Principles of Fluorescence Spectroscopy”, 3rd. Ed., Springer; Kap. 13 (2006)
- D. O'Connor, D, Phillips, Time Correlated Single Photon Counting, Academic Press (1984)
- L. Stryer, Annu. Rev. Biochem. 47, 819–847 (1978)
- R. E. Thompson et al., Biophys. J. 82, 2775–2783 (2002)
- J. Vogelsang et al., Ang. Chem. Int. Ed. 47 (29), 5465–5469 (2008)
- Tinnefeld, P.; Bauschmann, V.; Weston, K. D.; Biebricher, A.; Herten, D. -P.; Piestert, O.; Heinlein, T.; Heilemann, M.; Sauer, M.: How single molecule photophysical studies complement ensemble methods for a better understanding of chromophores and chromophore interaactions. In: Recent Research Development in Physical Chemistry, Vol. 7, 2004, S. 95–125.
- Tony Wilson, „Confocal Microscopy: Basic Principles and Architectures”, in: A. Diaspro, „Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications and Advances”, Wiley-Liss (2002)
- S. Wolter et al., J. Microsc., 237, 12–22 (2010)
