JP2004000154A - 核酸の配列特異的検出 - Google Patents
核酸の配列特異的検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004000154A JP2004000154A JP2003048630A JP2003048630A JP2004000154A JP 2004000154 A JP2004000154 A JP 2004000154A JP 2003048630 A JP2003048630 A JP 2003048630A JP 2003048630 A JP2003048630 A JP 2003048630A JP 2004000154 A JP2004000154 A JP 2004000154A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- solid support
- site
- information
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】核酸の配列特異的検出のための択一的方法、この方法のための好適な材料および、固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法を提供する。
【解決手段】(1) 固体担体表面上の異なる部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を保持してなる固体担体。(2) 該担体を使用する以下の方法、−少なくとも1つの核酸類似体が、検出対象の核酸の1つの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、少なくとも1つの他の核酸類似体が、その塩基配列と相補的でない塩基配列を有し、検出対象の核酸が核酸類似体に結合する条件下で行なう、前もって決定した部位で起こった結合の決定、−変異核酸および/または非変異核酸の結合が、異なる部位で決定されることを特徴とする、非変異核酸の大過剰の存在下での核酸変異体の選択的検出、−結合した変異核酸および非変異核酸を比較することによる、変異核酸および正常核酸の相対量の決定、ならびに−核酸の定量。
【選択図】 なし
【解決手段】(1) 固体担体表面上の異なる部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を保持してなる固体担体。(2) 該担体を使用する以下の方法、−少なくとも1つの核酸類似体が、検出対象の核酸の1つの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、少なくとも1つの他の核酸類似体が、その塩基配列と相補的でない塩基配列を有し、検出対象の核酸が核酸類似体に結合する条件下で行なう、前もって決定した部位で起こった結合の決定、−変異核酸および/または非変異核酸の結合が、異なる部位で決定されることを特徴とする、非変異核酸の大過剰の存在下での核酸変異体の選択的検出、−結合した変異核酸および非変異核酸を比較することによる、変異核酸および正常核酸の相対量の決定、ならびに−核酸の定量。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、固体担体表面上の前もって決定した部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を保持する固体担体である。また、本発明は、この性質の担体を用いる核酸の検出方法も提供する。
【0002】
【従来の技術】
この10年間に、試料分析は、迅速な発展を受けている。通常の化学試薬との反応により、被検体がまず最初に検出され、後に酵素を用いて検出されたが、特に、医学的診断において、被検体の免疫学的特性を利用する試験が最近標準となってきた。これは、特に、感染性疾患の分野で事実である。しかしながら、免疫学的手法は、基本的には、抗原または抗体等の免疫学的活性化合物が役割を果たす被検体のみしか検出できない。これらの手法は、ウイルスまたは細菌により生じる多くの感染に対して可能な適応を約束する結果となった。しかしながら、蛋白質のパターンに変化として発現しないか不充分な含有量しか発現しない遺伝病または前傾向は、免疫学的手法を用いて検出することは、困難または不可能である。したがって、最近、多くの場合で、核酸が検出対象となった。ある種の核酸の存在により、感染病原体の存在または生物の遺伝的状態を推論することができる。少数で存在する核酸の増幅方法が利用できるようになった近年、特に、特異的核酸配列の存在に基づく検出手法が容易になった。大量の配列情報および完全に異なる機能を有する2つのヌクレオチド配列が、たびたびたった1個の塩基単位が異なるのみであるという事実により、ヌクレオチド配列の特異的検出は、核酸配列の検出に基づく試薬および分析方法に対する相当な挑戦的姿勢をいまだとっている。また、ヌクレオチド配列は公知でないことが多いが、むしろ、核酸検出方法それ自体で初めて検出されるものである。
【0003】
臨床的に関連した点変異を検出することができるHLA遺伝子のヌクレオチド配列の検出方法が記載されている(例えば、特許文献1参照)。この方法において、膜に結合して識別対象の2つの核酸のうちの1つと正確に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが、試料と接触させる。ある一定の条件が維持されている間、正確に相補的な核酸のみが、固相に結合したオリゴヌクレオチドと結合して、検出可能である。
【0004】
ポリdTによりナイロン膜の別々の前もって決定された部位に結合した多数のオリゴヌクレオチドを使用して、核酸の増幅された領域の公知の対立遺伝子変異体のすべてを同時に検出するための方法が記載されている(例えば、非特許文献1参照)。
【0005】
ハイブリダイゼーション条件下、前もって決定した公知の配列を有するオリゴヌクレオチドを未知の核酸試料と接触させることにより、核酸配列を理論的に決定できる方法が記載されている(例えば、特許文献2参照)。このことは、核酸配列のすべての可能な置換が、固相の既知の部位で固定されていることを必要とする。決定対象の配列を含む核酸がハイブリダイズする部位を決定することにより、核酸にどの配列が存在するかを理論的に決定することがきる。
【0006】
「オリゴヌクレオチド アレイ(arrays)」を用いる遺伝的ポリモルフィズムの分析分野での先行技術が記載されている(例えば、非特許文献2および非特許文献3参照)。
【0007】
【特許文献1】
欧州特許第EP−B−0 237 362号明細書
【特許文献2】
米国特許第5,202,231 号明細書
【非特許文献1】
「Proc. Natl. Acad. Sci.USA 」,1989年,第86巻,p.6230−6234
【非特許文献2】
「Nucleic Acids Research」,1994年,第22巻,p.5456−5465
【非特許文献3】
「Clin. Chem. 」,1995年,第41巻,第5 号,p.700−6
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
先行技術に伴う主要な問題は、シーケンスまたは検出対象の核酸を含む選択した配列特異的オリゴヌクレオチドの融解温度が異なるという事実である。この状況を改善するために、オリゴヌクレオチドの長さおよびその塩基組成を選択し、該オリゴヌクレオチド内のミスマッチの位置およびハイブリダイゼーション複合体の塩濃度を最適化するという複雑な方法を行わなければならない。しかしながら、多くの場合、互いに密接に関連した配列を同時に区別することは、実際上不可能である。ハイブリダイゼーションの温度は、別の厳密なパラメーターである。1〜2℃程度の少ない変化で、強度を変えたり間違いのない結果を生じることができる。点変異の存在に基づく間違った分析結果が、診断に対して重大な係わり合いを有する。
【0009】
したがって、本発明の目的は、核酸の配列特異的検出のための択一的方法を提供することおよびこの方法のための好適な材料を提供することにある。
【0010】
この目的は、固体担体の表面上の前もって決定された部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を有する固体担体を提供することにより達成された。本発明の別の目的は、この固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法である。
【0011】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
(1) 核酸がハイブリダイズする表面に結合された少なくとも2つの異なるペプチド核酸プローブを有する固体担体を再生するための方法であって、
a)ペプチド核酸/核酸複合体の変性のための条件下で担体を処理する工程;および
b)固体担体を洗浄して、変性核酸ポリマーを除去する工程、
を含む、方法、
(2)温度を上昇させた蒸留水を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、前記(1)記載の方法、
(3)温度を上昇させた水酸化ナトリウム含有溶液を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、前記(1)記載の方法、
(4)固体担体が基本的に平坦である、前記(1)記載の方法、
(5)ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、前記(1)記載の方法、
(6)別々のかつ別個の領域で固体担体に共有結合された、異なる塩基配列の少なくとも2つの一本鎖ペプチド核酸プローブを含む、固体担体、
(7)別々のかつ別個の領域が、プローブが結合されない領域によってそれぞれに分けられる、前記(6)記載の固体担体、
(8)プローブが全て塩基長において同一である、前記(6)記載の固体担体、
(9)プローブが全て10〜50塩基長を有する、前記(6)記載の固体担体、
(10)固体担体が基本的に平坦である、前記(6)記載の固体担体、ならびに
(11)ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、前記(6)記載の固体担体、
に関する。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明において「固体担体」とは、表面上で特異的領域が区別できるほど広い表面を有するものをいう。この表面は、平らであることが好ましく、5mm2 よりも大きく、10mm2 〜約100cm2 であることが好ましい。担体の材料は、液体状または気体状でなく、試料液体または核酸を表面に固定するために用いられる反応調製物に全く溶解しないか、不完全に溶解することが好ましい。かかる材料の例は、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等)、金等である。材料はそれ自体、必ずしも完全に固体である必要はないが、むしろ、支持材料の付加により固体をなすことが可能である。
【0013】
固体担体の外見の形は、この固体担体上の核酸の存在を検出するために用いられる方法に、基本的に依存する。例えば、チップ等の基本的に平坦な型を選ぶことが適当であることがわかった。
【0014】
したがって、特に好適な固体担体は、例えば、1〜5mmの厚さで、1〜5cm2 の表面積を有するポリスチレンチップである。大きさが4×2.5cm2 であるポリアミド膜が、本発明とともに用いるために特によく適することがわかった。異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を、この担体の表面の異なる部位に結合させる。これらの部位または領域は、互いに重なり合わないことが好ましい。それらは、核酸類似体が結合していない表面領域により互いに離れていることが好ましい。核酸類似体が結合する部位を、以下、「結合領域」という。結合領域は、異なる形を有することができる。これらの形は、基本的には、固体担体の製造方法または結合領域で核酸類似体を決定するために用いる方法により決定される。結合領域の最小の大きさは、基本的には、事象−領域の核酸類似体への核酸の結合−を検出する器具により決定される。大きさが約1μmである領域への結合を検出できる器具が、既に利用可能である。結合領域の大きさの上限値は、費用効率および操作の斟酌により決定される。
【0015】
結合領域の大きさも、基本的には、核酸類似体の表面への適用のために用いられる方法により決定される。かかる方法は、後述する。
【0016】
固体担体上の結合領域数は、固体担体の予定された使用に依存する。最も単純な場合、ちょうど2個の結合領域が、ある種の点変異を検出するために必要である。この場合、結合領域は、点変異が検出される位置で塩基を有する核酸類似体を含む。この塩基は、正常の配列の位置の塩基と相補的である。一方、他の結合領域は、対応する位置に、変異した配列の塩基と相補的な塩基を有する核酸類似体を含む。別の場合、表面に結合した2個の全く異なる核酸類似体を有する固体担体を用いて、互いにわずかに関連するのみの2個の核酸または核酸配列を同時に検出できる。
【0017】
「核酸類似体」とは、塩基対形成により核酸を検出できる非天然性分子をいう。したがって、それらは、検出対象の核酸の塩基配列と完全に相補的な特異的塩基配列を含む。したがって、塩基配列は、2個の天然ヌクレオ塩基からなることが好ましい。しかしながら、塩基対形成の特異性が失われない限り、ヌクレオ塩基に対する修飾も可能である。
【0018】
それらの核酸類似体は、核酸と結合したときに、塩基対形成の原理によって、核酸の塩基配列と水素結合を形成する塩基配列を有する核酸と相補的であるとみなす。この配列は、少なくとも8塩基長が好ましく、8〜25塩基長がより好ましい。
【0019】
さらに、核酸類似体は、少なくともバックボーンという用語において、それらが構造上核酸とは異なるという事実により定義される。核酸または核酸類似体における「バックボーン」とは、それぞれ塩基を含む基本的には同一のユニットからなる構造をいう。天然の核酸において、バックボーンは、糖リン酸バックボーンである。核酸類似体においては、このバックボーンは、例えば、糖またはリン酸基部分が非環式成分等の他の化学単位で完全にまたは部分的に置換されたもの等、構造的に修飾される。基本的には、同一のユニットも、バックボーンで互いに置換することができる。
【0020】
本発明で用いるために好適な核酸類似体の選択を容易にするために、核酸類似体のいくつかの特性を以下に記載する。核酸類似体が同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりも配列相補的核酸に対して高い親和性を有することは、核酸類似体にとって有利である。また、同じ長さの対応するオリゴヌクレオチドよりも少ない電荷を保持するか、または反対の電荷で電荷を埋め合わせることができる核酸類似体が好ましい。基本的には、非荷電核酸類似体が特に好ましい。特に好ましい核酸類似体は、その相補的核酸との親和性がハイブリダイゼーション複合体の塩含有量に基本的に依存しないものである。
【0021】
特に好適な核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットおよび国際公開第92/20703号パンフレット(ペプチド核酸、PNA、例えば、Nature 365, 566−568(1993) およびNucl. Acids Res. 21, 5332−5(1993))に記載の核酸類似体である。これらの特許出願は、核酸類似体の構造の説明に参照される。好ましい核酸類似体は、バックボーンの窒素原子と結合した各塩基でバックボーンにそって結合した多くの塩基を含むポリアミドバックボーンを有する化合物である。しかしながら、核酸類似体は、欧州特許出願公開第0 672 677号明細書に記載のような化合物も含有してもよい。追加の核酸類似体は、Recueil 91, 1069−1080(1971) 、Methods in Molecular Biology 29, 355−389(1993)、Tetrahedron 31, 73−75(1975) 、J. Org. Chem. 52, 4202−4206(1987) 、Nucl. Acids Res. 17, 6129−6141(1989)、Unusual Properties of New Polymers(Springer Verlag 1983)、1−16、Specialty Polymers(Springer Verlag 1981)、1−51、国際公開第92/20823号パンフレット、国際公開第94/06815号パンフレット、国際公開第86/05518号パンフレットおよび国際公開第86/05519号パンフレットに記載されている。追加の核酸類似体は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7864−7868(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6097−6101(1995)およびJ. Am. Chem. Soc. 117, 6140−6141(1995)に記載されている。記載された核酸類似体は、8〜30塩基長であるが、10〜25塩基長が特に有利である。核酸類似体と称されたものは、直接または間接、固体担体の表面に結合する。結合の型は、どの反応基が固体担体上に結合するために利用できるか、および相補的核酸に結合する核酸類似体の能力を限定することなく、どの反応基が核酸類似体との結合のために利用できるかに基本的に依存する。結合の型も、意向が核酸類似体を同時に異なる部位へ結合させるかどうか、またはそれらの上に構築させるかどうかに依存する。また、より強力な結合力を有する材料の層で固体担体の表面を被覆すること、または化学反応により表面を活性化することがふさわしい。固体担体の表面上の反応基は、通常、−OH、NH2 およびSH群から選ばれる。核酸類似体の反応基は、−OH、−NH2 、−SH、−COOH、−SO3 Hおよび−PO3 H2 群から選ばれることが好ましい。
【0022】
特に好ましい態様において、特に、15原子を越え、200原子未満の長さのリンカーにより表面および核酸類似体の反応基が互いに共有結合している。「リンカー」とは、基本的に、固体担体の表面で立体的に利用可能な、核酸類似体を除去する機能を有する分子の一部をいう。溶解を容易にする水素原子(例えば、アルキレンユニット中の)および多くのヘテロ原子(例えば、−O−または−NH−または−NR−)を有するリンカーが、通常選ばれる。リンカーは、1以上のエチレンオキシユニットおよび/またはペプチド基を含むことが好ましい。特に好ましい態様において、リンカーは、独国特許出願公開第3924705号明細書に記載の1以上のユニットを含む。以下、Ado(8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)と称する実施例に記載のユニットが、特に好ましい。PNAと固体担体間により長いリンカーを用いることにより、PNA表面に対する核酸の結合依存性を、やや低減させることができる。
【0023】
部位に結合した核酸類似体は、異なるが公知の配列を有する2以上の類似体の混合物であってもよい。このことにより、多数決定のために必要な部位の数を低減することができる。
【0024】
担体の表面は、荷電されていないことが好ましく、親水性であることが好ましい。本発明は、核酸を検出する際に、基本的に荷電されていない表面の使用が有利であることを示した。
【0025】
本発明により提供される異なる部位で核酸類似体を負荷した固体担体は、種々の方法で製造することができる。1つの態様において、異なる核酸類似体をそれぞれ含む適当な量の溶液を、例えば、ピペットを介して固体担体の表面の異なる部位に適用する。液体試料は、固体担体の表面で互いに混合してはならない。このことは、例えば、適用部位を互いに離して位置させることにより、または種々の部位間の液体の広がりを停止させる疎水性バリアーを用いることによりなされる。核酸類似体または固体担体の表面のいずれかが、反応のために活性化されることが好ましい。この活性化は、例えば、前記基の1つが反応種の創作により活性化されていることで達成される。カルボキシル基の場合、これは、さらに活性化させることなくヒドロキシル基で迅速にエステル結合にする活性化エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル等)である。好適に活性化されたポリアミド膜は、例えば、共有結合の形成で核酸類似体のアミノ基と反応可能なトリアジン基を保持する。活性化は、国際公開第95/15983号パンフレットのスクエア酸誘導体またはグルタルアルデヒド(英国特許第2197720号明細書)の二官能試薬でも行なうことができる。
【0026】
また、類似体の結合は、ヌクレオチド類似体の配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有する担体表面を被覆することによっても認識することができる。結合領域への異なる核酸類似体の結合は、同時にまたは連続して行なうことができる。
【0027】
結合を行なうための充分な時間が経過した後、用いたいかなる結合試薬とともに、結合しないかまたは不十分に結合したいかなる核酸類似体も洗浄して除去することが有利である。このことは、未結合核酸類似体が他の領域に結合した核酸類似体と結合できない条件下で行うことが好ましい。
【0028】
基本的には、モノマーユニットにより表面の異なる部位に核酸類似体を構築することも可能である。国際公開第92/10092号パンフレットまたは国際公開第90/15070号パンフレットに記載の技術を、この目的のために用いることができる。適当なモノマーは、例えば、国際公開第92/20702号パンフレットに記載されている。
【0029】
本発明の別の主題は、本発明により提供される固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法である。
【0030】
検出可能な核酸は、天然または人工の核酸である。したがって、「核酸」とは、核酸類似体をもいう。しかしながら、検出対象の核酸は、例えば、ウイルス、細菌、多細胞生物、プラスミドまたはある種の疾患に対する前傾向もしくは傾向または自発的遺伝子の変異等の遺伝的条件等の核酸を含む生物に特有な、特にRNAまたはDNAである。この場合、RNAおよびDNAは、基本的にはゲノム起源またはそれから派生する起源のものである。本発明の状況においては、核酸の重要なクラスは、核酸増幅の成果である。これらの成果を、以下、「増幅物」または「アンプリコン」とも称する。核酸は、未精製型で、精製型でまたはプロセッシング型で存在することができる。精製は、アフィニティ分離工程等の調製工程で細胞成分から核酸を分離することにより、行なうこともできる。核酸は、酵素的に伸長、具体的には増幅または転写することもできる。
【0031】
核酸の配列特異的検出のために本発明により提供される担体は、検出対象の核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、ある部位に結合した核酸類似体を保持する。核酸の存在を特異的に示すことができるように、この塩基配列を意図的に選択する。通常の場合、このことは、混合物ができる限り少なく同一の全配列を有する追加の核酸を含み、好ましくは、全く該核酸を含まないことを意味する。しかしながら、本発明により提供される担体は、核酸群を特異的に検出するために用いることもできることを言及しなければならない。例えば、細菌のファミリー等のある種の分類学上の群のいかなるメンバーをもその核酸により検出することは、本発明の方法の課題となり得る。この場合、核酸類似体の塩基配列を、保存領域中にあるがこの分類学上の群のメンバーのみに存在するように、意図的に選択することができる。
【0032】
同一の塩基配列と相補的でない塩基配列を有する追加の核酸類似体を、表面の異なる部位に結合させることが好ましい。それは、その塩基配列がより短いかもしくはより長くてもよく、または1以上の塩基により第1の核酸類似体とは異なる核酸類似体であってもよい。塩基配列の相違は、解決する課題による。該相違は、例えば、点変異またはより小さい欠失および挿入を含んでもよい。嚢胞性線維症等の多くの遺伝病において、核酸類似体の配列は、個々の位置(点変異)および多くの位置(例えば、Δ508等での欠失)の観点から異なる。
【0033】
検出対象の変異は、該類似体の塩基配列の中間に近接して位置することが好ましい。
【0034】
該類似体の配列を、長さが同一(重複)であるけれどもハイブリダイゼーションの位置が互いに1塩基異なるように、意図的に選択することもできる。ハイブリダイゼーションの領域が検出対象の核酸上で互いに隣接するように、該配列を意図的に選択することもできる。
【0035】
これらの核酸の配列と相補的な配列を有する核酸類似体を選択することにより、同一または異なった核酸において、多くの変異を検出することもできる。
【0036】
2つの対立遺伝子のうちのどちらが複合体に存在するかを決定することが目的である、特に容易な場合において、2つの核酸類似体が固体担体の表面の異なる部位に結合し、その塩基配列は、対立遺伝子も異なる位置が正確に異なる。したがって、1つの対立遺伝子のある配列と相補的な核酸類似体を選択するが、他の核酸類似体は、他方の対立遺伝子の配列と相補的である。核酸類似体の長さとハイブリダイゼーションの部位は、同一である。
【0037】
例えば、嚢胞性線維症等に対するすべての対立遺伝子を、通常検出する。野生型は、2つの健常な対立遺伝子を含む。ヘテロ接合体は、1つの変異および1つの野生型配列を含有し、ホモ接合体変異は、2つの変異核酸を含む。この場合、変異が存在するかを決定することだけではなく、それがヘテロ接合体であるかホモ接合体であるかを決定する意向である。本発明によれば、両対立遺伝子を同時に定量的に検出することが可能であり、したがって、前記3つの場合を識別することが可能である。
【0038】
多くの場合、特に腫瘍学および感染パラメーターの決定において、変異した細胞/粒子は、通常、非変異/正常細胞のバックグランドに存在している。これらの場合、選択的検出を確実に行なうことができないか、または当該技術分野の状況により提供される方法を全く使用できない。例えば、便の試料由来のDNAからのras変異の分析は、約100個の正常配列の存在下で、変異配列を確実に検出することが要求される(Science 256, 102−105 (1992)) 。感染病の分野において、1人の感染患者において異なるHIV集団を決定することが所望される。しかしながら、これらのHIV集団の多くの変異体の量は、すべてのHIV配列に対して2%未満である。したがって、本発明により提供される方法は、1つの核酸が決定対象の核酸よりもずっと大量に存在しても、互いに非常に類似した核酸混合物を調べることを特に完全に可能ならしめる。
【0039】
結合した核酸類似体の長さは、同一であることが好ましい。適当な長さは、10〜100塩基、好ましくは10〜50塩基であることがわかった。10〜25塩基長である核酸類似体を用いて、特に良好な結果が得られる。
【0040】
本発明により提供される方法を行なうために、核酸を含む試料を、核酸類似体と結合した担体表面上の部位と接触させる。このことは、例えば、固体担体を試料液内にもってくることにより、または試料液を1以上に分けて固体担体上に注ぐことにより行なうことができる。担体と接触させる前に、試料液中の核酸を変性(一本鎖)させることができる。しかし、本発明の主要な有利性は、例えば、PNAを用いることにより予備的な変性工程を排除できるという事実である。PNAは、決定対象の二本鎖核酸から鎖を押し出す。唯一の重要な要求は、決定対象の核酸の1つの配列に相補的な核酸類似体により、検出対象の核酸が該表面の適当な部位に特異的に結合する条件下で、固体担体と接触させることである。もちろん、これらの条件は、核酸類似体の別々の型に対して異なってよいが、試験を行なうことにより一定の核酸類似体に対して容易に決定される。通常の場合、これらの条件は、オリゴヌクレオチドで負荷した担体に対して公知の条件に基づく。しかし、核酸類似体を国際公開第92/20702号パンフレットに記載のように使用したならば、対応するオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション条件とはかなり異なる条件を選択することができる。しかし、対応するオリゴヌクレオチドを用いる場合よりもずっと少量の塩を用いることが適当であることがわかった。例えば、100mM未満の塩の存在、より好ましくは50mM未満の塩の存在および最も好ましくは10mM未満の塩の存在が推薦される。これらの条件下では、同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて類似の配列を有する核酸を十分識別することはできないであろう。
【0041】
表面上の適当な部位に核酸を十分結合させることを達成するために必要な限り、試料を該表面と接触させておく。この期間は、通常、数分間である。
【0042】
次の工程で、核酸が表面に結合したかどうか、もしそうならばどの部位に結合したかを決定する。このことを、この部位に結合した核酸類似体に相補的な塩基配列を含む核酸の存在の指標とみなす。様々な方法を用いて結合を決定することができる。
【0043】
表面の特異的部位での変化を直接決定できる装置が、すでに利用できる。これらの型の装置を用いる方法にとって、核酸を含む試料を適用した後表面からそれを除去することは、必ずしも必要でない。しかしながら、通常、表面から該液体を除去し、洗浄溶液を用いて表面に依然として付着しているいかなる残存試薬をも除去することが好ましい。この工程は、結合決定に干渉することができる試料成分も洗い出すという有利性を提供する。
【0044】
好ましい態様において、試料を表面に接触させる前に行なう工程で決定対象の核酸に挿入した標識により、核酸類似体と検出対象の核酸との結合を決定する。標識は、例えば、蛍光基等の検出可能な基であってもよい。この決定は、任意に、顕微鏡を用いて、またはこの目的のために提供される測定セルで行なうことができる。結合が起こった部位は、ある種の配列を有する核酸の存在の指標であるけれども、前もって決定した部位での標識の量を、決定対象の核酸の量の指標として用いることができる。
【0045】
特に好ましい態様において、決定対象の核酸は、欧州特許EP−B−0 202 362号明細書に記載のポリメラーゼ鎖反応または欧州特許出願公開第0 329 822号明細書に記載のNASBA等の核酸増幅方法の産物である。核酸類似体と結合する核酸配列が、増幅方法により増幅されることが重要である。増幅方法が原配列を良好に保持すればするほど、すなわち、増幅中に配列に組み込まれるエラーが少なければ少ないほど、その増幅方法が適する。ポリメラーゼ鎖反応が特に適することがわかった。増幅プライマーを、特に、検出対象の核酸配列がハイブリダイゼーション部位間の領域に位置するように選択する。
【0046】
増幅中に、検出反応に必要な標識を増幅物に挿入することが有利であることもわかった。例えば、このことは、標識プライマーまたは標識モノヌクレオシド三リン酸を用いることにより行なうことができる。
【0047】
起こった結合は、例えば、インターカーレート剤を用いることにより、標識を挿入することなく直接検出することができる。これらの剤は、配列特異的様式で結合した核酸類似体と核酸との複合体を含む塩基を含有する二本鎖化合物上で、選択的に沈殿する特徴を有する。複合体の存在は、蛍光試薬等のインターカーレート剤の特殊な性質を用いて検出することができる。臭化エチジウムが特に好適な剤である。
【0048】
標識を挿入することなくハイブリッドを検出する別の方法は、例えば、欧州特許出願公開第0 618 441号明細書に記載のように、表面プラスモン共鳴に基づく。
【0049】
結合を決定する別の可能な方法によれば、表面を、検出のために標識された抗体溶液と接触させる。この抗体は、核酸類似体および決定対象の核酸からなる複合体に対するものである。この性質の抗体は、例えば、国際公開第95/17430号パンフレットに記載されている。
【0050】
ハイブリッドの検出は、用いる標識の型による。例えば、スキャナー、CCDカメラまたは顕微鏡を用いて検出できる。
【0051】
本発明は、多くの有利性を提供する。特に、二次構造内に位置する核酸領域の配列の相違を検出可能にする。従来の方法に比べて決定対象の結合核酸のより大きな絶対量を用いることができるので、本発明を用いて、検出の感度を増幅させることも可能である。特に、オリゴヌクレオチドを用いる方法と比べて、シグナル対ノイズ比を増加させることも可能である。最初の試みにおいて、1:1000未満のシグナル対ノイズ比が得られた。
【0052】
本発明は、少なくとも2つの分野で使用することができる。第1の場合、固体担体を用いて公知の変異およびポリモルフィズムを検出する。この場合、検出対象の変異およびポリモルフィズムの数は、表面上に要する様々な核酸類似体の数または部位の指標である。核酸類似体の配列は、変異およびポリモルフィズム付近の核酸の配列と特異的に対等である。該配列は、類似の配列を有する核酸類似体による異なる塩基が、該配列の中間またはその近くに位置するような方法で選択されることが好ましい。
【0053】
本発明により提供される担体は、下記分野で用いることができる:
感染性疾患、異なる被検体/パラメーターの同時決定および例えば多剤耐性研究等のための細菌またはウイルスにおける遺伝子の状態の研究において。
腫瘍学(癌抑制遺伝子および癌遺伝子における変異検出ならびに変異細胞および正常細胞間の相関の決定)。
遺伝性疾患の研究(嚢胞性線維症、鎌状赤血球性貧血等)。
組織および骨髄のタイピング(MHC複合体)(Clin. Chem. 41/4, 553−5(1995) を参照)。
【0054】
第2の可能な適用において、いわゆる「ハイブリダイゼーションによるシーケンス」法を用いて、短い核酸断片の配列を決定することができる。この方法において、選択した配列の長さの順列が存在するの同数の異なる核酸類似体を固定する。十分なレベルの感度を達成するために、Nが各核酸類似体の塩基数と等しい4N 個の部位が必要である。Nが5〜12であることが好ましい。非常に短いDNA断片をシーケンスするためには、相当するより少ない部位を必要とする。「ハイブリダイゼーションによるシーケンス」法を用いて未知の核酸をシーケンスする方法は、国際公開第92/10588号パンフレットに記載されている。
本発明の有利な点は、ハイブリダイゼーションの特異性が、試料の条件にほとんど依存しないという事実である。このことは、表面の異なる領域への核酸の同時結合を容易にする。
【0055】
驚くべきことに、PNA等の核酸類似体が表面の配列を識別する優れた能力を有することが示された。この識別は、類似の溶解した化合物の融解温度から予想されるよりも良好であった。
【0056】
驚くべきことに、本発明により提供される担体は、多くの連続した核酸の決定に用いるためにも好適である。決定を行なう後に、液体と接触している担体を熱処理に供する。核酸類似体と核酸との結合が溶解する温度を選択する。次いで、別の決定を行なうために、担体を利用できる。本発明により提供される方法を用いて、少なくとも100倍の範囲の濃度で、試料中に互いに近接して位置する非常に類似の核酸の相対量を最初に決定することが可能である。例えば、シーケンス法を用いて変異体を定量的に決定することが可能であった。しかし、この方法を用いて利用できる識別の最大値は、1:10であった。
【0057】
本発明により提供される方法を用いて、変性工程なしに固体担体の固定された核酸類似体に二本鎖DNAを結合することも可能である。このことは、固定されたDNAを用いては不可能であることが比較研究により示された。ハイブリッドの中心には存在しないミスマッチも、高い選択度で識別することができることも示された。
【0058】
【実施例】
下記実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【0059】
一般:
用いた核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のよに製造した。他に指示しなければ、化合物および試薬は、Boehringer Mannheim GmbHの製品であった。
【0060】
実施例1:
ナイロン膜の共有結合誘導化
0.5M 炭酸ナトリウム pH9.0中、所望の濃度でPNAを含む200nlの溶液を、ピペットを用いてImmunodyne ABC膜(Pall)に適用する。スポットが乾燥した後、未だに存在するかもしれない表面の機能的反応基を不活化させるために、0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて膜を洗浄する。膜を水で2回洗浄し、次いで乾燥させる。
【0061】
実施例2:
ルミネセンスを用いるハイブリダイゼーション事象の検出
100μM、10μM、1μM、および0.1μM PNA溶液を用いて、実施例1に記載のように膜を誘導化する。次いで、50mlのハイブリダイゼーション容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))を用いて、45℃のハイブリダイゼーションオーブンで、膜をプレハイブリダイズする。30分後、DIG標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で含む10μlの溶液を添加し、もう60分間複合体をハイブリダイズさせる。次いで、1回当たり25mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.05%SDS)を用いて、45℃、10分間で2回、膜を洗浄する。ジゴキシゲニン検出のためのプロトコール(DIG Detection Kit, Boehringer Mannheim GmbH, BRD) に従って、検出反応を行なう。抗−DIG−APコンジュゲートを、1:10000の希釈で用いる。アルカリホスファターゼの基質として、CDP−StarTMを1:10000の希釈で用いる。
【0062】
実施例3:
蛍光を用いるハイブリダイゼーション事象の検出
100μM、10μMおよび1μM PNA溶液を用いて、実施例1に記載のように膜を誘導化する。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃のオーブンで膜をプレハイブリダイズする。30分後、蛍光標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で含む10μlの溶液を添加し、もう60分間調製物をハイブリダイズさせる。次いで、1回当たり25mlの洗浄緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃、10分間で2回、膜を洗浄する。膜を乾燥させ、次いで、蛍光強度を測定する。
【0063】
実施例4:
方法の選択性
実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA分子(図1a、配列番号1、2、3を参照)で、3つの膜片を誘導化する。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液で30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標識オリゴヌクレオチド(図1b、配列番号4、5、6)のうちの1つを添加する。60分間ハイブリダイズした後、各回25mlの洗浄緩衝液で10分間2回、膜を洗浄する。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出する。
【0064】
含まれるPNA分子とオリゴヌクレオチドとのすべての可能な二本鎖ハイブリッドを、図1dに示す。図2は、ほとんどすべての場合において、検出されるオリゴヌクレオチドのみが、固定した核酸類似体(PNA1、PNA2、PNA3)と正確に相補的なものであるということを示す。シグナル対ノイズ比(S/N)も、図から推定できる。それらを定量的に評価し、表1に結果を示す。
【0065】
【表1】
【0066】
実施例5:
定量
実施例1に記載のように、100μMの濃度で、異なる塩基配列を有する3つの(Ado)6 −PNA分子(図1a、配列番号1、2、3)を用いて、膜片を誘導化する。次いで、20mlのハイブリダイゼーション容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(実施例2を参照)を用いて、45℃でそれらをプレハイブリダイズする。30分後、緩衝液を交換する。実施例1〜7を通して、添加する緩衝液は、DIG標識成分−オリゴヌクレオチド1、2および3、配列番号4、5、6の被検体の濃度により異なる。該片を、45℃で60分間ハイブリダイズし、次いで、10mlの洗浄緩衝液で10分間2回洗浄する。実施例2に記載の手法を用いて、検出を行なう。ルミネセンスシグナルを、ルミネセンスイメージャーを用いて記録し、次いで、評価する(図4)。
【0067】
見出されたシグナル強度を用いて、被検体複合体組成物に関して定性的または半定量的発見を達成することができる。シグナル強度を更正した後、絶対的に定量的な発見を達成することができる。
【0068】
実施例6:
PCRアンプリコンの検出
A.好適な被検体(増幅物)を得ること
その配列がPNAプローブ、PNA1に相補的な二本鎖DNA断片をpUC19プラスミドに連結する。該プラスミドを大腸菌に形質転換し、クローニングし、次いでシーケンスする。次のハイブリダイゼーション実験には、プラスミド配列の一部分を増幅し、増幅反応中にDIG標識する。50μlの全体積中で増幅を行なう。増幅複合体は、1μl プラスミド(1ng/μl)、1μl プライマーF1(10μM)、1μl DIGプライマーR1(10μM)、5μl10×PCR緩衝液(100mM Tris/HCl、15mM MgCl2 、500mM KCl、pH8.3)、2μl dNTP溶液(蒸留水中、10mM dATP、10mM dCTP、10mM dGTP、10mM dTTP、pH7.0)、0.5μl Taqポリメラーゼ(5ユニット/μl)および38.5μl水からなる。
【0069】
プライマーF1:5’−GTA AAA CGA CGG CCA GT−3’(配列番号12)
プライマーR1:5’−DIG−AAC AGC TAT GAC CAT GA−3’(配列番号13)
【0070】
各反応混合物を、96℃で3分間温める。次の工程で、3段階のPCRサイクル(96℃、45秒、48℃、30秒、72℃、1分)を30回行なう。最終サイクルで、72℃、5分間、伸長工程を増やす。
【0071】
B.ハイブリダイゼーション反応
実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA配列(図1a、配列番号:1、2、3を参照)で、膜を誘導化する。20mlのハイブリダイゼーション容器中、5mlのハイブリダイゼーション緩衝液を用いて45℃で該膜を前処理する。30分後緩衝液を交換し、被検体溶液を添加する。被検体溶液を作るために、1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で、増幅複合体を直接(dsアンプリコン)、および5分間の熱変性後(ssアンプリコン)希釈する。45℃で1時間、2時間30分および4時間ハイブリダイゼーション後、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて、10分間2回、膜を洗浄する。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図3)。
【0072】
図3に、9個の区画を示す。各列間の相違は、インキュベーションの時間(4時間、2.5時間および1時間)である。各カラム間の相違は、検出対象の核酸の型である。3つの重複する列のスポットをカラムIの3つの区画それぞれに適用する。列間の相違は、PNAの配列であるが、各区画のカラム間の相違は、濃度である。オリゴヌクレオチドを検出する核酸として用いた場合に対して、特異性および定量能力をカラムIに示す。
【0073】
図は、インキュベーション時間の影響を示す。たった1時間のハイブリダイゼーション後、ODN1aと増幅物に対する優れた配列識別性が得られることが明らかである。図3におけるカラムIIとIII との相違は、前もって一本鎖にした増幅物を、検出対象の核酸として1 つの場合で用いることである。カラムIII において、前もって一本鎖にしなかった増幅物を、検出対象の核酸として用いる。二本鎖核酸を固体担体に適用する前に変性させることは必ずしも必要でないことが、シグナルにより明らかに示される。このことにより、作業工程数が減少(加熱工程、一本鎖の分離、洗浄工程)し、したがって、コンタミネーションの危険が減少する。したがって、低塩条件と組み合わせたPNAプローブは、DNAプローブよりも明らかな有利性を提供する。
【0074】
実施例7:
PNA/DNAハイブリダイゼーションの比較
実施例1に記載のように、50μMの溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置で異なる(図1aおよび1b参照)、それぞれ3つの(Ado)6 −PNA配列(配列番号:1、2、3)およびそれぞれ3つのDNA分子(配列番号:8、10、11)で、膜片を誘導化する。実施例1とは異なり、スポット体積は、200nlの代わりに400nlである。20mlのハイブリダイゼーション容器中、5mlの低塩緩衝液(実施例2を参照)または高塩緩衝液(6×SSC;0.9M NaCl、90mM クエン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)のいずれかを用いて、37℃または45℃いずれかで30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標識オリゴヌクレオチド(図1c、配列番号:4、5、6)の1つを添加する。60分間のハイブリダイゼーション工程後、37℃または45℃で、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて10分間2回、該片を洗浄する。低塩実験には、実施例2由来の洗浄緩衝液を用いる。高塩実験には、0.02%SDSを有する1×SSC緩衝液、pH7.0を用いる。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーションの結果を検出する。定量的に評価を行ない、表2に示す。
【0075】
DNAおよびPNA両プローブは、一重および二重ミスマッチ配列の相補的一本鎖標的配列を完全に識別することが可能である。PNAプローブは、ある種の型のミスマッチに対して、特にミスマッチが配列の中間に存在しないが、むしろ末端にシフトしている場合に、DNAプローブよりも明らかな有利性を示す。このことは、同一の配列を有するPNAプローブよりもDNAプローブによりずっと強力に寛容される分散したG/Tミスマッチ(プローブ1/ODN3)の例において、特に明解になる。
【0076】
【表2】
【0077】
実施例8:
膜およびPNAプローブ間のリンカーの長さの影響
実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用いて、リンカーの長さ(Ado3 、Ado6 またはAdo9 )により異なるPNA分子(図1a、配列番号7、1、9を参照)で、膜片を誘導化する。実施例1とは異なり、スポット体積は、200nlの代わりに1μlである。10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(5、10または25mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を含むハイブリダイゼーション容器中、35℃で30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、10pMolの32P標識オリゴヌクレオチド(図1c;ODN1b、配列番号4を参照)を添加し、50℃で60分間、調製物をハイブリダイズする。50mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を用いて、50℃で10分間2回、該片を洗浄する。オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図5)。図は、より長いリンカーがハイブリダイゼーションを大きく改良することを示す。
【0078】
実施例9:
PNA膜の再利用
実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用いて、(Ado)6 −PNA分子(図1a;PNA1b、配列番号1を参照)で、膜を誘導化する。5つの同一の濃度の連続で、PNAを適用する。実施例8に記載のように、スポット体積は1μlである。10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を含むハイブリダイゼーション容器中、35℃で30分間、該膜をプレハイブリダイズする。次の工程で、10pMolの32P標識オリゴヌクレオチド(図1c;ODN1b、配列番号4)を添加し、50℃で60分間、調製物をハイブリダイズする。50mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を用いて、50℃で10分間2回、該膜を洗浄する。オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6a)。オートラジオグラフィーを行なった後、該膜を5つの同一片に切断する。これらの膜片を、実験休止中、それぞれ別々に取り扱う。膜1は、インキュベートせずに対照膜として供する。膜2は、50mlの0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて室温で60分間インキュベートする。膜3は、50mlの1M水酸化ナトリウム溶液を用いて同様に60分間インキュベートする。膜4は、50mlの蒸留水を用いて70℃で60分間インキュベートする。膜5は、50mlの0.1N水酸化ナトリウム溶液を用いて70℃で60分間インキュベートする。次いで、蒸留水を用いて10分間2回、すべての膜を洗浄する。この操作が終了後、もう1度オートラジオグラフィーを行なう(図6b)。次いで、これらの膜片を、記載したように、2回目のハイブリダイゼーション反応に用いて、オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6c)。
【0079】
図6bに示すように、異なる処理方法により非常に異なる結果を得る。70℃で再蒸留水での処理(膜4)は、膜をほとんど完全に再生させる。予期せぬ発見は、核酸の変性に通常用いられる条件を使用した場合、再生の成功がより不成功になるという事実であった。室温で1M水酸化ナトリウム溶液との膜3のインキュベーションそれ自体が、事実上再生効果を生じない。1Mから0.1Mへ水酸化ナトリウム溶液の濃度を下げることは、室温(膜2)および70℃(膜5)での再生度を高める。しかし、これらの条件は、再蒸留水を用いた場合(膜4)のように、どれも再生度を少しでも良好にするという結果を生じない。これらの条件が膜結合PNA/DNA二本鎖の効率的な変性に対する重要なパラメーターであることが、実施例により示される。
【0080】
再生方法に関わらず、すべての膜は、シグナル対ノイズ比をかなり悪化させることなく、ハイブリダイゼーションに再利用できる(図6c)。再生または再ハイブリダイズするPNA膜の能力の顕著な効果を失うことなく、6回までの再ハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【0081】
【発明の効果】
本発明によって、核酸の配列特異的検出のための択一的方法を提供することおよびこの方法のための好適な材料を提供することができる。また固体担体の表面上の前もって決定された部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を有する固体担体を提供することができる。さらに、本発明によって、この固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法が提供できる。
【0082】
【配列表】
(1) 配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:2の情報
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、 N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:3の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:4の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンまたは32−Pで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:5の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:6の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:7の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の酒類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−トリ(8−アミノ −3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニン である」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:8の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:9の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の酒類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ノナ(8−アミノ −3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニン である」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:10の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:11の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:12の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:17塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:13の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:17塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/note=「5’− 末端のA は、アミノ修飾剤(BoehringerMannheim GmbH) を介してジゴキシゲニンに結合する」
【図面の簡単な説明】
【図1】図1aは、PNA分子の配列を示す。それらを、本発明の方法を説明する例として用いる。PNAを、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のように調製した。
図1bは、図1a由来のPNA配列と相同な、DNA/ODNハイブリダイゼーション実験に用いたDNA分子の配列を示す。
図1cは、5’−DIG End Labelling Kit(BoehringerMannheim)を用いて5’−リン酸末端をジゴキシゲニンで標識し、ポリヌクレオチドキナーゼおよび32P−γ−ATP5’を用いてリン酸化した、用いた相補的オリゴヌクレオチド(ODN)の配列を示す。
図1dは、ハイブイッドを形成するオリゴヌクレオチド(ODN)とPNAとの可能な組み合わせを示す。同一の組み合わせを、DNAプローブ(DNA、図1bを参照)とオリゴヌクレオチド(ODN、図1cを参照)との間のハイブリダイゼーションに適用する。
【図2】図2は、本発明の方法の選択性を示す実施例4由来のハイブリダイゼーションの結果を示す。条件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであった。
【図3】図3は、実施例6由来のハイブリダイゼーションの結果を示す。それらは、固定したPNAプローブによりPCRアンプリコンを検出することを証明する。条件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであった。図3の符号は、以下を意味する:
I 対照実験、ODN1a(1pMol、1nM)、列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)
II ss増幅物(118bp、1倍のDIG標識)
94℃で5分間の熱変性
(1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した50μl PCR調製物)
列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)
III ds増幅物(118bp、1倍のDIG標識)
(1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で直接希釈した50μl PCR調製物)
列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)。
【図4】図4は、PNAアレイにより分析混合物の定性的定量的分析の結果を示す。条件は:200nlのスポット体積(100μM PNA、列当たり1つのPNA、開裂当たり1つの分析混合物)であった。
【図5】図5は、ハイブリダイゼーションにおけるリンカーの長さの効果を示す。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度、列1では(Ado)3 −PNA、列2では(Ado)6 −PNA、列3では(Ado)9 −PNA)であった。図5の符号は、以下を意味する:
A.5mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション
B.10mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション
C.25mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション。
【図6】図6Aは、1回目のハイブリダーゼーション後のシグナル強度を示す。図6Aは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
図6Bは、再生手法後のシグナル強度を示す。図6Bは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
膜1:再生なし(対照)
膜2:0.1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜3:1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜4:蒸留水、70℃ 1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜5:0.1M水酸化ナトリウム溶液、70℃ 1時間、2×10分 再蒸留水RTを用いる再生
図6Cは、再ハイブリダイゼーション後のシグナル強度を示す。図6Cは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、固体担体表面上の前もって決定した部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を保持する固体担体である。また、本発明は、この性質の担体を用いる核酸の検出方法も提供する。
【0002】
【従来の技術】
この10年間に、試料分析は、迅速な発展を受けている。通常の化学試薬との反応により、被検体がまず最初に検出され、後に酵素を用いて検出されたが、特に、医学的診断において、被検体の免疫学的特性を利用する試験が最近標準となってきた。これは、特に、感染性疾患の分野で事実である。しかしながら、免疫学的手法は、基本的には、抗原または抗体等の免疫学的活性化合物が役割を果たす被検体のみしか検出できない。これらの手法は、ウイルスまたは細菌により生じる多くの感染に対して可能な適応を約束する結果となった。しかしながら、蛋白質のパターンに変化として発現しないか不充分な含有量しか発現しない遺伝病または前傾向は、免疫学的手法を用いて検出することは、困難または不可能である。したがって、最近、多くの場合で、核酸が検出対象となった。ある種の核酸の存在により、感染病原体の存在または生物の遺伝的状態を推論することができる。少数で存在する核酸の増幅方法が利用できるようになった近年、特に、特異的核酸配列の存在に基づく検出手法が容易になった。大量の配列情報および完全に異なる機能を有する2つのヌクレオチド配列が、たびたびたった1個の塩基単位が異なるのみであるという事実により、ヌクレオチド配列の特異的検出は、核酸配列の検出に基づく試薬および分析方法に対する相当な挑戦的姿勢をいまだとっている。また、ヌクレオチド配列は公知でないことが多いが、むしろ、核酸検出方法それ自体で初めて検出されるものである。
【0003】
臨床的に関連した点変異を検出することができるHLA遺伝子のヌクレオチド配列の検出方法が記載されている(例えば、特許文献1参照)。この方法において、膜に結合して識別対象の2つの核酸のうちの1つと正確に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが、試料と接触させる。ある一定の条件が維持されている間、正確に相補的な核酸のみが、固相に結合したオリゴヌクレオチドと結合して、検出可能である。
【0004】
ポリdTによりナイロン膜の別々の前もって決定された部位に結合した多数のオリゴヌクレオチドを使用して、核酸の増幅された領域の公知の対立遺伝子変異体のすべてを同時に検出するための方法が記載されている(例えば、非特許文献1参照)。
【0005】
ハイブリダイゼーション条件下、前もって決定した公知の配列を有するオリゴヌクレオチドを未知の核酸試料と接触させることにより、核酸配列を理論的に決定できる方法が記載されている(例えば、特許文献2参照)。このことは、核酸配列のすべての可能な置換が、固相の既知の部位で固定されていることを必要とする。決定対象の配列を含む核酸がハイブリダイズする部位を決定することにより、核酸にどの配列が存在するかを理論的に決定することがきる。
【0006】
「オリゴヌクレオチド アレイ(arrays)」を用いる遺伝的ポリモルフィズムの分析分野での先行技術が記載されている(例えば、非特許文献2および非特許文献3参照)。
【0007】
【特許文献1】
欧州特許第EP−B−0 237 362号明細書
【特許文献2】
米国特許第5,202,231 号明細書
【非特許文献1】
「Proc. Natl. Acad. Sci.USA 」,1989年,第86巻,p.6230−6234
【非特許文献2】
「Nucleic Acids Research」,1994年,第22巻,p.5456−5465
【非特許文献3】
「Clin. Chem. 」,1995年,第41巻,第5 号,p.700−6
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
先行技術に伴う主要な問題は、シーケンスまたは検出対象の核酸を含む選択した配列特異的オリゴヌクレオチドの融解温度が異なるという事実である。この状況を改善するために、オリゴヌクレオチドの長さおよびその塩基組成を選択し、該オリゴヌクレオチド内のミスマッチの位置およびハイブリダイゼーション複合体の塩濃度を最適化するという複雑な方法を行わなければならない。しかしながら、多くの場合、互いに密接に関連した配列を同時に区別することは、実際上不可能である。ハイブリダイゼーションの温度は、別の厳密なパラメーターである。1〜2℃程度の少ない変化で、強度を変えたり間違いのない結果を生じることができる。点変異の存在に基づく間違った分析結果が、診断に対して重大な係わり合いを有する。
【0009】
したがって、本発明の目的は、核酸の配列特異的検出のための択一的方法を提供することおよびこの方法のための好適な材料を提供することにある。
【0010】
この目的は、固体担体の表面上の前もって決定された部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を有する固体担体を提供することにより達成された。本発明の別の目的は、この固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法である。
【0011】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
(1) 核酸がハイブリダイズする表面に結合された少なくとも2つの異なるペプチド核酸プローブを有する固体担体を再生するための方法であって、
a)ペプチド核酸/核酸複合体の変性のための条件下で担体を処理する工程;および
b)固体担体を洗浄して、変性核酸ポリマーを除去する工程、
を含む、方法、
(2)温度を上昇させた蒸留水を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、前記(1)記載の方法、
(3)温度を上昇させた水酸化ナトリウム含有溶液を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、前記(1)記載の方法、
(4)固体担体が基本的に平坦である、前記(1)記載の方法、
(5)ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、前記(1)記載の方法、
(6)別々のかつ別個の領域で固体担体に共有結合された、異なる塩基配列の少なくとも2つの一本鎖ペプチド核酸プローブを含む、固体担体、
(7)別々のかつ別個の領域が、プローブが結合されない領域によってそれぞれに分けられる、前記(6)記載の固体担体、
(8)プローブが全て塩基長において同一である、前記(6)記載の固体担体、
(9)プローブが全て10〜50塩基長を有する、前記(6)記載の固体担体、
(10)固体担体が基本的に平坦である、前記(6)記載の固体担体、ならびに
(11)ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、前記(6)記載の固体担体、
に関する。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明において「固体担体」とは、表面上で特異的領域が区別できるほど広い表面を有するものをいう。この表面は、平らであることが好ましく、5mm2 よりも大きく、10mm2 〜約100cm2 であることが好ましい。担体の材料は、液体状または気体状でなく、試料液体または核酸を表面に固定するために用いられる反応調製物に全く溶解しないか、不完全に溶解することが好ましい。かかる材料の例は、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等)、金等である。材料はそれ自体、必ずしも完全に固体である必要はないが、むしろ、支持材料の付加により固体をなすことが可能である。
【0013】
固体担体の外見の形は、この固体担体上の核酸の存在を検出するために用いられる方法に、基本的に依存する。例えば、チップ等の基本的に平坦な型を選ぶことが適当であることがわかった。
【0014】
したがって、特に好適な固体担体は、例えば、1〜5mmの厚さで、1〜5cm2 の表面積を有するポリスチレンチップである。大きさが4×2.5cm2 であるポリアミド膜が、本発明とともに用いるために特によく適することがわかった。異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を、この担体の表面の異なる部位に結合させる。これらの部位または領域は、互いに重なり合わないことが好ましい。それらは、核酸類似体が結合していない表面領域により互いに離れていることが好ましい。核酸類似体が結合する部位を、以下、「結合領域」という。結合領域は、異なる形を有することができる。これらの形は、基本的には、固体担体の製造方法または結合領域で核酸類似体を決定するために用いる方法により決定される。結合領域の最小の大きさは、基本的には、事象−領域の核酸類似体への核酸の結合−を検出する器具により決定される。大きさが約1μmである領域への結合を検出できる器具が、既に利用可能である。結合領域の大きさの上限値は、費用効率および操作の斟酌により決定される。
【0015】
結合領域の大きさも、基本的には、核酸類似体の表面への適用のために用いられる方法により決定される。かかる方法は、後述する。
【0016】
固体担体上の結合領域数は、固体担体の予定された使用に依存する。最も単純な場合、ちょうど2個の結合領域が、ある種の点変異を検出するために必要である。この場合、結合領域は、点変異が検出される位置で塩基を有する核酸類似体を含む。この塩基は、正常の配列の位置の塩基と相補的である。一方、他の結合領域は、対応する位置に、変異した配列の塩基と相補的な塩基を有する核酸類似体を含む。別の場合、表面に結合した2個の全く異なる核酸類似体を有する固体担体を用いて、互いにわずかに関連するのみの2個の核酸または核酸配列を同時に検出できる。
【0017】
「核酸類似体」とは、塩基対形成により核酸を検出できる非天然性分子をいう。したがって、それらは、検出対象の核酸の塩基配列と完全に相補的な特異的塩基配列を含む。したがって、塩基配列は、2個の天然ヌクレオ塩基からなることが好ましい。しかしながら、塩基対形成の特異性が失われない限り、ヌクレオ塩基に対する修飾も可能である。
【0018】
それらの核酸類似体は、核酸と結合したときに、塩基対形成の原理によって、核酸の塩基配列と水素結合を形成する塩基配列を有する核酸と相補的であるとみなす。この配列は、少なくとも8塩基長が好ましく、8〜25塩基長がより好ましい。
【0019】
さらに、核酸類似体は、少なくともバックボーンという用語において、それらが構造上核酸とは異なるという事実により定義される。核酸または核酸類似体における「バックボーン」とは、それぞれ塩基を含む基本的には同一のユニットからなる構造をいう。天然の核酸において、バックボーンは、糖リン酸バックボーンである。核酸類似体においては、このバックボーンは、例えば、糖またはリン酸基部分が非環式成分等の他の化学単位で完全にまたは部分的に置換されたもの等、構造的に修飾される。基本的には、同一のユニットも、バックボーンで互いに置換することができる。
【0020】
本発明で用いるために好適な核酸類似体の選択を容易にするために、核酸類似体のいくつかの特性を以下に記載する。核酸類似体が同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりも配列相補的核酸に対して高い親和性を有することは、核酸類似体にとって有利である。また、同じ長さの対応するオリゴヌクレオチドよりも少ない電荷を保持するか、または反対の電荷で電荷を埋め合わせることができる核酸類似体が好ましい。基本的には、非荷電核酸類似体が特に好ましい。特に好ましい核酸類似体は、その相補的核酸との親和性がハイブリダイゼーション複合体の塩含有量に基本的に依存しないものである。
【0021】
特に好適な核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットおよび国際公開第92/20703号パンフレット(ペプチド核酸、PNA、例えば、Nature 365, 566−568(1993) およびNucl. Acids Res. 21, 5332−5(1993))に記載の核酸類似体である。これらの特許出願は、核酸類似体の構造の説明に参照される。好ましい核酸類似体は、バックボーンの窒素原子と結合した各塩基でバックボーンにそって結合した多くの塩基を含むポリアミドバックボーンを有する化合物である。しかしながら、核酸類似体は、欧州特許出願公開第0 672 677号明細書に記載のような化合物も含有してもよい。追加の核酸類似体は、Recueil 91, 1069−1080(1971) 、Methods in Molecular Biology 29, 355−389(1993)、Tetrahedron 31, 73−75(1975) 、J. Org. Chem. 52, 4202−4206(1987) 、Nucl. Acids Res. 17, 6129−6141(1989)、Unusual Properties of New Polymers(Springer Verlag 1983)、1−16、Specialty Polymers(Springer Verlag 1981)、1−51、国際公開第92/20823号パンフレット、国際公開第94/06815号パンフレット、国際公開第86/05518号パンフレットおよび国際公開第86/05519号パンフレットに記載されている。追加の核酸類似体は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7864−7868(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6097−6101(1995)およびJ. Am. Chem. Soc. 117, 6140−6141(1995)に記載されている。記載された核酸類似体は、8〜30塩基長であるが、10〜25塩基長が特に有利である。核酸類似体と称されたものは、直接または間接、固体担体の表面に結合する。結合の型は、どの反応基が固体担体上に結合するために利用できるか、および相補的核酸に結合する核酸類似体の能力を限定することなく、どの反応基が核酸類似体との結合のために利用できるかに基本的に依存する。結合の型も、意向が核酸類似体を同時に異なる部位へ結合させるかどうか、またはそれらの上に構築させるかどうかに依存する。また、より強力な結合力を有する材料の層で固体担体の表面を被覆すること、または化学反応により表面を活性化することがふさわしい。固体担体の表面上の反応基は、通常、−OH、NH2 およびSH群から選ばれる。核酸類似体の反応基は、−OH、−NH2 、−SH、−COOH、−SO3 Hおよび−PO3 H2 群から選ばれることが好ましい。
【0022】
特に好ましい態様において、特に、15原子を越え、200原子未満の長さのリンカーにより表面および核酸類似体の反応基が互いに共有結合している。「リンカー」とは、基本的に、固体担体の表面で立体的に利用可能な、核酸類似体を除去する機能を有する分子の一部をいう。溶解を容易にする水素原子(例えば、アルキレンユニット中の)および多くのヘテロ原子(例えば、−O−または−NH−または−NR−)を有するリンカーが、通常選ばれる。リンカーは、1以上のエチレンオキシユニットおよび/またはペプチド基を含むことが好ましい。特に好ましい態様において、リンカーは、独国特許出願公開第3924705号明細書に記載の1以上のユニットを含む。以下、Ado(8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)と称する実施例に記載のユニットが、特に好ましい。PNAと固体担体間により長いリンカーを用いることにより、PNA表面に対する核酸の結合依存性を、やや低減させることができる。
【0023】
部位に結合した核酸類似体は、異なるが公知の配列を有する2以上の類似体の混合物であってもよい。このことにより、多数決定のために必要な部位の数を低減することができる。
【0024】
担体の表面は、荷電されていないことが好ましく、親水性であることが好ましい。本発明は、核酸を検出する際に、基本的に荷電されていない表面の使用が有利であることを示した。
【0025】
本発明により提供される異なる部位で核酸類似体を負荷した固体担体は、種々の方法で製造することができる。1つの態様において、異なる核酸類似体をそれぞれ含む適当な量の溶液を、例えば、ピペットを介して固体担体の表面の異なる部位に適用する。液体試料は、固体担体の表面で互いに混合してはならない。このことは、例えば、適用部位を互いに離して位置させることにより、または種々の部位間の液体の広がりを停止させる疎水性バリアーを用いることによりなされる。核酸類似体または固体担体の表面のいずれかが、反応のために活性化されることが好ましい。この活性化は、例えば、前記基の1つが反応種の創作により活性化されていることで達成される。カルボキシル基の場合、これは、さらに活性化させることなくヒドロキシル基で迅速にエステル結合にする活性化エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル等)である。好適に活性化されたポリアミド膜は、例えば、共有結合の形成で核酸類似体のアミノ基と反応可能なトリアジン基を保持する。活性化は、国際公開第95/15983号パンフレットのスクエア酸誘導体またはグルタルアルデヒド(英国特許第2197720号明細書)の二官能試薬でも行なうことができる。
【0026】
また、類似体の結合は、ヌクレオチド類似体の配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有する担体表面を被覆することによっても認識することができる。結合領域への異なる核酸類似体の結合は、同時にまたは連続して行なうことができる。
【0027】
結合を行なうための充分な時間が経過した後、用いたいかなる結合試薬とともに、結合しないかまたは不十分に結合したいかなる核酸類似体も洗浄して除去することが有利である。このことは、未結合核酸類似体が他の領域に結合した核酸類似体と結合できない条件下で行うことが好ましい。
【0028】
基本的には、モノマーユニットにより表面の異なる部位に核酸類似体を構築することも可能である。国際公開第92/10092号パンフレットまたは国際公開第90/15070号パンフレットに記載の技術を、この目的のために用いることができる。適当なモノマーは、例えば、国際公開第92/20702号パンフレットに記載されている。
【0029】
本発明の別の主題は、本発明により提供される固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法である。
【0030】
検出可能な核酸は、天然または人工の核酸である。したがって、「核酸」とは、核酸類似体をもいう。しかしながら、検出対象の核酸は、例えば、ウイルス、細菌、多細胞生物、プラスミドまたはある種の疾患に対する前傾向もしくは傾向または自発的遺伝子の変異等の遺伝的条件等の核酸を含む生物に特有な、特にRNAまたはDNAである。この場合、RNAおよびDNAは、基本的にはゲノム起源またはそれから派生する起源のものである。本発明の状況においては、核酸の重要なクラスは、核酸増幅の成果である。これらの成果を、以下、「増幅物」または「アンプリコン」とも称する。核酸は、未精製型で、精製型でまたはプロセッシング型で存在することができる。精製は、アフィニティ分離工程等の調製工程で細胞成分から核酸を分離することにより、行なうこともできる。核酸は、酵素的に伸長、具体的には増幅または転写することもできる。
【0031】
核酸の配列特異的検出のために本発明により提供される担体は、検出対象の核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、ある部位に結合した核酸類似体を保持する。核酸の存在を特異的に示すことができるように、この塩基配列を意図的に選択する。通常の場合、このことは、混合物ができる限り少なく同一の全配列を有する追加の核酸を含み、好ましくは、全く該核酸を含まないことを意味する。しかしながら、本発明により提供される担体は、核酸群を特異的に検出するために用いることもできることを言及しなければならない。例えば、細菌のファミリー等のある種の分類学上の群のいかなるメンバーをもその核酸により検出することは、本発明の方法の課題となり得る。この場合、核酸類似体の塩基配列を、保存領域中にあるがこの分類学上の群のメンバーのみに存在するように、意図的に選択することができる。
【0032】
同一の塩基配列と相補的でない塩基配列を有する追加の核酸類似体を、表面の異なる部位に結合させることが好ましい。それは、その塩基配列がより短いかもしくはより長くてもよく、または1以上の塩基により第1の核酸類似体とは異なる核酸類似体であってもよい。塩基配列の相違は、解決する課題による。該相違は、例えば、点変異またはより小さい欠失および挿入を含んでもよい。嚢胞性線維症等の多くの遺伝病において、核酸類似体の配列は、個々の位置(点変異)および多くの位置(例えば、Δ508等での欠失)の観点から異なる。
【0033】
検出対象の変異は、該類似体の塩基配列の中間に近接して位置することが好ましい。
【0034】
該類似体の配列を、長さが同一(重複)であるけれどもハイブリダイゼーションの位置が互いに1塩基異なるように、意図的に選択することもできる。ハイブリダイゼーションの領域が検出対象の核酸上で互いに隣接するように、該配列を意図的に選択することもできる。
【0035】
これらの核酸の配列と相補的な配列を有する核酸類似体を選択することにより、同一または異なった核酸において、多くの変異を検出することもできる。
【0036】
2つの対立遺伝子のうちのどちらが複合体に存在するかを決定することが目的である、特に容易な場合において、2つの核酸類似体が固体担体の表面の異なる部位に結合し、その塩基配列は、対立遺伝子も異なる位置が正確に異なる。したがって、1つの対立遺伝子のある配列と相補的な核酸類似体を選択するが、他の核酸類似体は、他方の対立遺伝子の配列と相補的である。核酸類似体の長さとハイブリダイゼーションの部位は、同一である。
【0037】
例えば、嚢胞性線維症等に対するすべての対立遺伝子を、通常検出する。野生型は、2つの健常な対立遺伝子を含む。ヘテロ接合体は、1つの変異および1つの野生型配列を含有し、ホモ接合体変異は、2つの変異核酸を含む。この場合、変異が存在するかを決定することだけではなく、それがヘテロ接合体であるかホモ接合体であるかを決定する意向である。本発明によれば、両対立遺伝子を同時に定量的に検出することが可能であり、したがって、前記3つの場合を識別することが可能である。
【0038】
多くの場合、特に腫瘍学および感染パラメーターの決定において、変異した細胞/粒子は、通常、非変異/正常細胞のバックグランドに存在している。これらの場合、選択的検出を確実に行なうことができないか、または当該技術分野の状況により提供される方法を全く使用できない。例えば、便の試料由来のDNAからのras変異の分析は、約100個の正常配列の存在下で、変異配列を確実に検出することが要求される(Science 256, 102−105 (1992)) 。感染病の分野において、1人の感染患者において異なるHIV集団を決定することが所望される。しかしながら、これらのHIV集団の多くの変異体の量は、すべてのHIV配列に対して2%未満である。したがって、本発明により提供される方法は、1つの核酸が決定対象の核酸よりもずっと大量に存在しても、互いに非常に類似した核酸混合物を調べることを特に完全に可能ならしめる。
【0039】
結合した核酸類似体の長さは、同一であることが好ましい。適当な長さは、10〜100塩基、好ましくは10〜50塩基であることがわかった。10〜25塩基長である核酸類似体を用いて、特に良好な結果が得られる。
【0040】
本発明により提供される方法を行なうために、核酸を含む試料を、核酸類似体と結合した担体表面上の部位と接触させる。このことは、例えば、固体担体を試料液内にもってくることにより、または試料液を1以上に分けて固体担体上に注ぐことにより行なうことができる。担体と接触させる前に、試料液中の核酸を変性(一本鎖)させることができる。しかし、本発明の主要な有利性は、例えば、PNAを用いることにより予備的な変性工程を排除できるという事実である。PNAは、決定対象の二本鎖核酸から鎖を押し出す。唯一の重要な要求は、決定対象の核酸の1つの配列に相補的な核酸類似体により、検出対象の核酸が該表面の適当な部位に特異的に結合する条件下で、固体担体と接触させることである。もちろん、これらの条件は、核酸類似体の別々の型に対して異なってよいが、試験を行なうことにより一定の核酸類似体に対して容易に決定される。通常の場合、これらの条件は、オリゴヌクレオチドで負荷した担体に対して公知の条件に基づく。しかし、核酸類似体を国際公開第92/20702号パンフレットに記載のように使用したならば、対応するオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション条件とはかなり異なる条件を選択することができる。しかし、対応するオリゴヌクレオチドを用いる場合よりもずっと少量の塩を用いることが適当であることがわかった。例えば、100mM未満の塩の存在、より好ましくは50mM未満の塩の存在および最も好ましくは10mM未満の塩の存在が推薦される。これらの条件下では、同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて類似の配列を有する核酸を十分識別することはできないであろう。
【0041】
表面上の適当な部位に核酸を十分結合させることを達成するために必要な限り、試料を該表面と接触させておく。この期間は、通常、数分間である。
【0042】
次の工程で、核酸が表面に結合したかどうか、もしそうならばどの部位に結合したかを決定する。このことを、この部位に結合した核酸類似体に相補的な塩基配列を含む核酸の存在の指標とみなす。様々な方法を用いて結合を決定することができる。
【0043】
表面の特異的部位での変化を直接決定できる装置が、すでに利用できる。これらの型の装置を用いる方法にとって、核酸を含む試料を適用した後表面からそれを除去することは、必ずしも必要でない。しかしながら、通常、表面から該液体を除去し、洗浄溶液を用いて表面に依然として付着しているいかなる残存試薬をも除去することが好ましい。この工程は、結合決定に干渉することができる試料成分も洗い出すという有利性を提供する。
【0044】
好ましい態様において、試料を表面に接触させる前に行なう工程で決定対象の核酸に挿入した標識により、核酸類似体と検出対象の核酸との結合を決定する。標識は、例えば、蛍光基等の検出可能な基であってもよい。この決定は、任意に、顕微鏡を用いて、またはこの目的のために提供される測定セルで行なうことができる。結合が起こった部位は、ある種の配列を有する核酸の存在の指標であるけれども、前もって決定した部位での標識の量を、決定対象の核酸の量の指標として用いることができる。
【0045】
特に好ましい態様において、決定対象の核酸は、欧州特許EP−B−0 202 362号明細書に記載のポリメラーゼ鎖反応または欧州特許出願公開第0 329 822号明細書に記載のNASBA等の核酸増幅方法の産物である。核酸類似体と結合する核酸配列が、増幅方法により増幅されることが重要である。増幅方法が原配列を良好に保持すればするほど、すなわち、増幅中に配列に組み込まれるエラーが少なければ少ないほど、その増幅方法が適する。ポリメラーゼ鎖反応が特に適することがわかった。増幅プライマーを、特に、検出対象の核酸配列がハイブリダイゼーション部位間の領域に位置するように選択する。
【0046】
増幅中に、検出反応に必要な標識を増幅物に挿入することが有利であることもわかった。例えば、このことは、標識プライマーまたは標識モノヌクレオシド三リン酸を用いることにより行なうことができる。
【0047】
起こった結合は、例えば、インターカーレート剤を用いることにより、標識を挿入することなく直接検出することができる。これらの剤は、配列特異的様式で結合した核酸類似体と核酸との複合体を含む塩基を含有する二本鎖化合物上で、選択的に沈殿する特徴を有する。複合体の存在は、蛍光試薬等のインターカーレート剤の特殊な性質を用いて検出することができる。臭化エチジウムが特に好適な剤である。
【0048】
標識を挿入することなくハイブリッドを検出する別の方法は、例えば、欧州特許出願公開第0 618 441号明細書に記載のように、表面プラスモン共鳴に基づく。
【0049】
結合を決定する別の可能な方法によれば、表面を、検出のために標識された抗体溶液と接触させる。この抗体は、核酸類似体および決定対象の核酸からなる複合体に対するものである。この性質の抗体は、例えば、国際公開第95/17430号パンフレットに記載されている。
【0050】
ハイブリッドの検出は、用いる標識の型による。例えば、スキャナー、CCDカメラまたは顕微鏡を用いて検出できる。
【0051】
本発明は、多くの有利性を提供する。特に、二次構造内に位置する核酸領域の配列の相違を検出可能にする。従来の方法に比べて決定対象の結合核酸のより大きな絶対量を用いることができるので、本発明を用いて、検出の感度を増幅させることも可能である。特に、オリゴヌクレオチドを用いる方法と比べて、シグナル対ノイズ比を増加させることも可能である。最初の試みにおいて、1:1000未満のシグナル対ノイズ比が得られた。
【0052】
本発明は、少なくとも2つの分野で使用することができる。第1の場合、固体担体を用いて公知の変異およびポリモルフィズムを検出する。この場合、検出対象の変異およびポリモルフィズムの数は、表面上に要する様々な核酸類似体の数または部位の指標である。核酸類似体の配列は、変異およびポリモルフィズム付近の核酸の配列と特異的に対等である。該配列は、類似の配列を有する核酸類似体による異なる塩基が、該配列の中間またはその近くに位置するような方法で選択されることが好ましい。
【0053】
本発明により提供される担体は、下記分野で用いることができる:
感染性疾患、異なる被検体/パラメーターの同時決定および例えば多剤耐性研究等のための細菌またはウイルスにおける遺伝子の状態の研究において。
腫瘍学(癌抑制遺伝子および癌遺伝子における変異検出ならびに変異細胞および正常細胞間の相関の決定)。
遺伝性疾患の研究(嚢胞性線維症、鎌状赤血球性貧血等)。
組織および骨髄のタイピング(MHC複合体)(Clin. Chem. 41/4, 553−5(1995) を参照)。
【0054】
第2の可能な適用において、いわゆる「ハイブリダイゼーションによるシーケンス」法を用いて、短い核酸断片の配列を決定することができる。この方法において、選択した配列の長さの順列が存在するの同数の異なる核酸類似体を固定する。十分なレベルの感度を達成するために、Nが各核酸類似体の塩基数と等しい4N 個の部位が必要である。Nが5〜12であることが好ましい。非常に短いDNA断片をシーケンスするためには、相当するより少ない部位を必要とする。「ハイブリダイゼーションによるシーケンス」法を用いて未知の核酸をシーケンスする方法は、国際公開第92/10588号パンフレットに記載されている。
本発明の有利な点は、ハイブリダイゼーションの特異性が、試料の条件にほとんど依存しないという事実である。このことは、表面の異なる領域への核酸の同時結合を容易にする。
【0055】
驚くべきことに、PNA等の核酸類似体が表面の配列を識別する優れた能力を有することが示された。この識別は、類似の溶解した化合物の融解温度から予想されるよりも良好であった。
【0056】
驚くべきことに、本発明により提供される担体は、多くの連続した核酸の決定に用いるためにも好適である。決定を行なう後に、液体と接触している担体を熱処理に供する。核酸類似体と核酸との結合が溶解する温度を選択する。次いで、別の決定を行なうために、担体を利用できる。本発明により提供される方法を用いて、少なくとも100倍の範囲の濃度で、試料中に互いに近接して位置する非常に類似の核酸の相対量を最初に決定することが可能である。例えば、シーケンス法を用いて変異体を定量的に決定することが可能であった。しかし、この方法を用いて利用できる識別の最大値は、1:10であった。
【0057】
本発明により提供される方法を用いて、変性工程なしに固体担体の固定された核酸類似体に二本鎖DNAを結合することも可能である。このことは、固定されたDNAを用いては不可能であることが比較研究により示された。ハイブリッドの中心には存在しないミスマッチも、高い選択度で識別することができることも示された。
【0058】
【実施例】
下記実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【0059】
一般:
用いた核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のよに製造した。他に指示しなければ、化合物および試薬は、Boehringer Mannheim GmbHの製品であった。
【0060】
実施例1:
ナイロン膜の共有結合誘導化
0.5M 炭酸ナトリウム pH9.0中、所望の濃度でPNAを含む200nlの溶液を、ピペットを用いてImmunodyne ABC膜(Pall)に適用する。スポットが乾燥した後、未だに存在するかもしれない表面の機能的反応基を不活化させるために、0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて膜を洗浄する。膜を水で2回洗浄し、次いで乾燥させる。
【0061】
実施例2:
ルミネセンスを用いるハイブリダイゼーション事象の検出
100μM、10μM、1μM、および0.1μM PNA溶液を用いて、実施例1に記載のように膜を誘導化する。次いで、50mlのハイブリダイゼーション容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))を用いて、45℃のハイブリダイゼーションオーブンで、膜をプレハイブリダイズする。30分後、DIG標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で含む10μlの溶液を添加し、もう60分間複合体をハイブリダイズさせる。次いで、1回当たり25mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.05%SDS)を用いて、45℃、10分間で2回、膜を洗浄する。ジゴキシゲニン検出のためのプロトコール(DIG Detection Kit, Boehringer Mannheim GmbH, BRD) に従って、検出反応を行なう。抗−DIG−APコンジュゲートを、1:10000の希釈で用いる。アルカリホスファターゼの基質として、CDP−StarTMを1:10000の希釈で用いる。
【0062】
実施例3:
蛍光を用いるハイブリダイゼーション事象の検出
100μM、10μMおよび1μM PNA溶液を用いて、実施例1に記載のように膜を誘導化する。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃のオーブンで膜をプレハイブリダイズする。30分後、蛍光標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で含む10μlの溶液を添加し、もう60分間調製物をハイブリダイズさせる。次いで、1回当たり25mlの洗浄緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃、10分間で2回、膜を洗浄する。膜を乾燥させ、次いで、蛍光強度を測定する。
【0063】
実施例4:
方法の選択性
実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA分子(図1a、配列番号1、2、3を参照)で、3つの膜片を誘導化する。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液で30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標識オリゴヌクレオチド(図1b、配列番号4、5、6)のうちの1つを添加する。60分間ハイブリダイズした後、各回25mlの洗浄緩衝液で10分間2回、膜を洗浄する。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出する。
【0064】
含まれるPNA分子とオリゴヌクレオチドとのすべての可能な二本鎖ハイブリッドを、図1dに示す。図2は、ほとんどすべての場合において、検出されるオリゴヌクレオチドのみが、固定した核酸類似体(PNA1、PNA2、PNA3)と正確に相補的なものであるということを示す。シグナル対ノイズ比(S/N)も、図から推定できる。それらを定量的に評価し、表1に結果を示す。
【0065】
【表1】
【0066】
実施例5:
定量
実施例1に記載のように、100μMの濃度で、異なる塩基配列を有する3つの(Ado)6 −PNA分子(図1a、配列番号1、2、3)を用いて、膜片を誘導化する。次いで、20mlのハイブリダイゼーション容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(実施例2を参照)を用いて、45℃でそれらをプレハイブリダイズする。30分後、緩衝液を交換する。実施例1〜7を通して、添加する緩衝液は、DIG標識成分−オリゴヌクレオチド1、2および3、配列番号4、5、6の被検体の濃度により異なる。該片を、45℃で60分間ハイブリダイズし、次いで、10mlの洗浄緩衝液で10分間2回洗浄する。実施例2に記載の手法を用いて、検出を行なう。ルミネセンスシグナルを、ルミネセンスイメージャーを用いて記録し、次いで、評価する(図4)。
【0067】
見出されたシグナル強度を用いて、被検体複合体組成物に関して定性的または半定量的発見を達成することができる。シグナル強度を更正した後、絶対的に定量的な発見を達成することができる。
【0068】
実施例6:
PCRアンプリコンの検出
A.好適な被検体(増幅物)を得ること
その配列がPNAプローブ、PNA1に相補的な二本鎖DNA断片をpUC19プラスミドに連結する。該プラスミドを大腸菌に形質転換し、クローニングし、次いでシーケンスする。次のハイブリダイゼーション実験には、プラスミド配列の一部分を増幅し、増幅反応中にDIG標識する。50μlの全体積中で増幅を行なう。増幅複合体は、1μl プラスミド(1ng/μl)、1μl プライマーF1(10μM)、1μl DIGプライマーR1(10μM)、5μl10×PCR緩衝液(100mM Tris/HCl、15mM MgCl2 、500mM KCl、pH8.3)、2μl dNTP溶液(蒸留水中、10mM dATP、10mM dCTP、10mM dGTP、10mM dTTP、pH7.0)、0.5μl Taqポリメラーゼ(5ユニット/μl)および38.5μl水からなる。
【0069】
プライマーF1:5’−GTA AAA CGA CGG CCA GT−3’(配列番号12)
プライマーR1:5’−DIG−AAC AGC TAT GAC CAT GA−3’(配列番号13)
【0070】
各反応混合物を、96℃で3分間温める。次の工程で、3段階のPCRサイクル(96℃、45秒、48℃、30秒、72℃、1分)を30回行なう。最終サイクルで、72℃、5分間、伸長工程を増やす。
【0071】
B.ハイブリダイゼーション反応
実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA配列(図1a、配列番号:1、2、3を参照)で、膜を誘導化する。20mlのハイブリダイゼーション容器中、5mlのハイブリダイゼーション緩衝液を用いて45℃で該膜を前処理する。30分後緩衝液を交換し、被検体溶液を添加する。被検体溶液を作るために、1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で、増幅複合体を直接(dsアンプリコン)、および5分間の熱変性後(ssアンプリコン)希釈する。45℃で1時間、2時間30分および4時間ハイブリダイゼーション後、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて、10分間2回、膜を洗浄する。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図3)。
【0072】
図3に、9個の区画を示す。各列間の相違は、インキュベーションの時間(4時間、2.5時間および1時間)である。各カラム間の相違は、検出対象の核酸の型である。3つの重複する列のスポットをカラムIの3つの区画それぞれに適用する。列間の相違は、PNAの配列であるが、各区画のカラム間の相違は、濃度である。オリゴヌクレオチドを検出する核酸として用いた場合に対して、特異性および定量能力をカラムIに示す。
【0073】
図は、インキュベーション時間の影響を示す。たった1時間のハイブリダイゼーション後、ODN1aと増幅物に対する優れた配列識別性が得られることが明らかである。図3におけるカラムIIとIII との相違は、前もって一本鎖にした増幅物を、検出対象の核酸として1 つの場合で用いることである。カラムIII において、前もって一本鎖にしなかった増幅物を、検出対象の核酸として用いる。二本鎖核酸を固体担体に適用する前に変性させることは必ずしも必要でないことが、シグナルにより明らかに示される。このことにより、作業工程数が減少(加熱工程、一本鎖の分離、洗浄工程)し、したがって、コンタミネーションの危険が減少する。したがって、低塩条件と組み合わせたPNAプローブは、DNAプローブよりも明らかな有利性を提供する。
【0074】
実施例7:
PNA/DNAハイブリダイゼーションの比較
実施例1に記載のように、50μMの溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置で異なる(図1aおよび1b参照)、それぞれ3つの(Ado)6 −PNA配列(配列番号:1、2、3)およびそれぞれ3つのDNA分子(配列番号:8、10、11)で、膜片を誘導化する。実施例1とは異なり、スポット体積は、200nlの代わりに400nlである。20mlのハイブリダイゼーション容器中、5mlの低塩緩衝液(実施例2を参照)または高塩緩衝液(6×SSC;0.9M NaCl、90mM クエン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)のいずれかを用いて、37℃または45℃いずれかで30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標識オリゴヌクレオチド(図1c、配列番号:4、5、6)の1つを添加する。60分間のハイブリダイゼーション工程後、37℃または45℃で、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて10分間2回、該片を洗浄する。低塩実験には、実施例2由来の洗浄緩衝液を用いる。高塩実験には、0.02%SDSを有する1×SSC緩衝液、pH7.0を用いる。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーションの結果を検出する。定量的に評価を行ない、表2に示す。
【0075】
DNAおよびPNA両プローブは、一重および二重ミスマッチ配列の相補的一本鎖標的配列を完全に識別することが可能である。PNAプローブは、ある種の型のミスマッチに対して、特にミスマッチが配列の中間に存在しないが、むしろ末端にシフトしている場合に、DNAプローブよりも明らかな有利性を示す。このことは、同一の配列を有するPNAプローブよりもDNAプローブによりずっと強力に寛容される分散したG/Tミスマッチ(プローブ1/ODN3)の例において、特に明解になる。
【0076】
【表2】
【0077】
実施例8:
膜およびPNAプローブ間のリンカーの長さの影響
実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用いて、リンカーの長さ(Ado3 、Ado6 またはAdo9 )により異なるPNA分子(図1a、配列番号7、1、9を参照)で、膜片を誘導化する。実施例1とは異なり、スポット体積は、200nlの代わりに1μlである。10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(5、10または25mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を含むハイブリダイゼーション容器中、35℃で30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、10pMolの32P標識オリゴヌクレオチド(図1c;ODN1b、配列番号4を参照)を添加し、50℃で60分間、調製物をハイブリダイズする。50mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を用いて、50℃で10分間2回、該片を洗浄する。オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図5)。図は、より長いリンカーがハイブリダイゼーションを大きく改良することを示す。
【0078】
実施例9:
PNA膜の再利用
実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用いて、(Ado)6 −PNA分子(図1a;PNA1b、配列番号1を参照)で、膜を誘導化する。5つの同一の濃度の連続で、PNAを適用する。実施例8に記載のように、スポット体積は1μlである。10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を含むハイブリダイゼーション容器中、35℃で30分間、該膜をプレハイブリダイズする。次の工程で、10pMolの32P標識オリゴヌクレオチド(図1c;ODN1b、配列番号4)を添加し、50℃で60分間、調製物をハイブリダイズする。50mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を用いて、50℃で10分間2回、該膜を洗浄する。オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6a)。オートラジオグラフィーを行なった後、該膜を5つの同一片に切断する。これらの膜片を、実験休止中、それぞれ別々に取り扱う。膜1は、インキュベートせずに対照膜として供する。膜2は、50mlの0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて室温で60分間インキュベートする。膜3は、50mlの1M水酸化ナトリウム溶液を用いて同様に60分間インキュベートする。膜4は、50mlの蒸留水を用いて70℃で60分間インキュベートする。膜5は、50mlの0.1N水酸化ナトリウム溶液を用いて70℃で60分間インキュベートする。次いで、蒸留水を用いて10分間2回、すべての膜を洗浄する。この操作が終了後、もう1度オートラジオグラフィーを行なう(図6b)。次いで、これらの膜片を、記載したように、2回目のハイブリダイゼーション反応に用いて、オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6c)。
【0079】
図6bに示すように、異なる処理方法により非常に異なる結果を得る。70℃で再蒸留水での処理(膜4)は、膜をほとんど完全に再生させる。予期せぬ発見は、核酸の変性に通常用いられる条件を使用した場合、再生の成功がより不成功になるという事実であった。室温で1M水酸化ナトリウム溶液との膜3のインキュベーションそれ自体が、事実上再生効果を生じない。1Mから0.1Mへ水酸化ナトリウム溶液の濃度を下げることは、室温(膜2)および70℃(膜5)での再生度を高める。しかし、これらの条件は、再蒸留水を用いた場合(膜4)のように、どれも再生度を少しでも良好にするという結果を生じない。これらの条件が膜結合PNA/DNA二本鎖の効率的な変性に対する重要なパラメーターであることが、実施例により示される。
【0080】
再生方法に関わらず、すべての膜は、シグナル対ノイズ比をかなり悪化させることなく、ハイブリダイゼーションに再利用できる(図6c)。再生または再ハイブリダイズするPNA膜の能力の顕著な効果を失うことなく、6回までの再ハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【0081】
【発明の効果】
本発明によって、核酸の配列特異的検出のための択一的方法を提供することおよびこの方法のための好適な材料を提供することができる。また固体担体の表面上の前もって決定された部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を有する固体担体を提供することができる。さらに、本発明によって、この固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方法が提供できる。
【0082】
【配列表】
(1) 配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:2の情報
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、 N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:3の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ヘキサ(8− アミノ−3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:4の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンまたは32−Pで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:5の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:6の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/note=「アミノリンカー(Boehringer Mannheim GmbH , BRD)を介するジゴキシゲニンで5’− リン酸基を標識」
(1) 配列番号:7の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:15塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の酒類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−トリ(8−アミノ −3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニン である」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:8の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:9の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:16アミノ酸
(B) 配列の型:アミノ酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の酒類:ぺプチド
(iii)ハイポセティカル: NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノ(N’−ノナ(8−アミノ −3,6− ジオキサ− オクタノ−1− イル)−エチル)−ベータ− アラニン である」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:2
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:3
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:4
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:5
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:6
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−グアニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:7
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:8
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:9
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:10
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:11..12
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:13
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−シトシル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:14
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−チミニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:Modified−site
(B) 存在位置:15
(D) 他の情報:/product= 「その他」
/note=「Xaa は、
N−((1−アデニニル) アセチル)−N−(2− アミノエチル)−ベータ− アラニンである」
(1) 配列番号:10の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:11の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:30塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:12の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:17塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(1) 配列番号:13の情報:
(i)配列の特徴:
(A) 配列の長さ:17塩基対
(B) 配列の型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A) 種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)配列の特徴:
(A) 特徴を表わす記号:misc_feature
(B) 存在位置:1
(D) 他の情報:/note=「5’− 末端のA は、アミノ修飾剤(BoehringerMannheim GmbH) を介してジゴキシゲニンに結合する」
【図面の簡単な説明】
【図1】図1aは、PNA分子の配列を示す。それらを、本発明の方法を説明する例として用いる。PNAを、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のように調製した。
図1bは、図1a由来のPNA配列と相同な、DNA/ODNハイブリダイゼーション実験に用いたDNA分子の配列を示す。
図1cは、5’−DIG End Labelling Kit(BoehringerMannheim)を用いて5’−リン酸末端をジゴキシゲニンで標識し、ポリヌクレオチドキナーゼおよび32P−γ−ATP5’を用いてリン酸化した、用いた相補的オリゴヌクレオチド(ODN)の配列を示す。
図1dは、ハイブイッドを形成するオリゴヌクレオチド(ODN)とPNAとの可能な組み合わせを示す。同一の組み合わせを、DNAプローブ(DNA、図1bを参照)とオリゴヌクレオチド(ODN、図1cを参照)との間のハイブリダイゼーションに適用する。
【図2】図2は、本発明の方法の選択性を示す実施例4由来のハイブリダイゼーションの結果を示す。条件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであった。
【図3】図3は、実施例6由来のハイブリダイゼーションの結果を示す。それらは、固定したPNAプローブによりPCRアンプリコンを検出することを証明する。条件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであった。図3の符号は、以下を意味する:
I 対照実験、ODN1a(1pMol、1nM)、列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)
II ss増幅物(118bp、1倍のDIG標識)
94℃で5分間の熱変性
(1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した50μl PCR調製物)
列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)
III ds増幅物(118bp、1倍のDIG標識)
(1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で直接希釈した50μl PCR調製物)
列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)。
【図4】図4は、PNAアレイにより分析混合物の定性的定量的分析の結果を示す。条件は:200nlのスポット体積(100μM PNA、列当たり1つのPNA、開裂当たり1つの分析混合物)であった。
【図5】図5は、ハイブリダイゼーションにおけるリンカーの長さの効果を示す。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度、列1では(Ado)3 −PNA、列2では(Ado)6 −PNA、列3では(Ado)9 −PNA)であった。図5の符号は、以下を意味する:
A.5mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション
B.10mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション
C.25mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション。
【図6】図6Aは、1回目のハイブリダーゼーション後のシグナル強度を示す。図6Aは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
図6Bは、再生手法後のシグナル強度を示す。図6Bは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
膜1:再生なし(対照)
膜2:0.1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜3:1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜4:蒸留水、70℃ 1時間、2×10分 再蒸留水 RTを用いる再生
膜5:0.1M水酸化ナトリウム溶液、70℃ 1時間、2×10分 再蒸留水RTを用いる再生
図6Cは、再ハイブリダイゼーション後のシグナル強度を示す。図6Cは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。
Claims (11)
- 核酸がハイブリダイズする表面に結合された少なくとも2つの異なるペプチド核酸プローブを有する固体担体を再生するための方法であって、
a)ペプチド核酸/核酸複合体の変性のための条件下で担体を処理する工程;および
b)固体担体を洗浄して、変性核酸ポリマーを除去する工程、
を含む、方法。 - 温度を上昇させた蒸留水を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、請求項1記載の方法。
- 温度を上昇させた水酸化ナトリウム含有溶液を使用して、ペプチド核酸/核酸複合体の変性を引き起こす、請求項1記載の方法。
- 固体担体が基本的に平坦である、請求項1記載の方法。
- ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、請求項1記載の方法。
- 別々のかつ別個の領域で固体担体に共有結合された、異なる塩基配列の少なくとも2つの一本鎖ペプチド核酸プローブを含む、固体担体。
- 別々のかつ別個の領域が、プローブが結合されない領域によってそれぞれに分けられる、請求項6記載の固体担体。
- プローブが全て塩基長において同一である、請求項6記載の固体担体。
- プローブが全て10〜50塩基長を有する、請求項6記載の固体担体。
- 固体担体が基本的に平坦である、請求項6記載の固体担体。
- ペプチド核酸プローブが2−アミノエチルグリシンサブユニットのバックボーンを有する、請求項6記載の固体担体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP95103122 | 1995-03-04 | ||
EP95118843 | 1995-11-30 | ||
DE19548590A DE19548590A1 (de) | 1995-12-23 | 1995-12-23 | Sequenzspezifischer Nachweis von Nukleinsäuren |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP08526599A Division JP2000513921A (ja) | 1995-03-04 | 1996-03-04 | 核酸の配列特異的検出 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004000154A true JP2004000154A (ja) | 2004-01-08 |
Family
ID=27215779
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP08526599A Ceased JP2000513921A (ja) | 1995-03-04 | 1996-03-04 | 核酸の配列特異的検出 |
JP2003048630A Pending JP2004000154A (ja) | 1995-03-04 | 2003-02-26 | 核酸の配列特異的検出 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP08526599A Ceased JP2000513921A (ja) | 1995-03-04 | 1996-03-04 | 核酸の配列特異的検出 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0813610A1 (ja) |
JP (2) | JP2000513921A (ja) |
AU (1) | AU5002996A (ja) |
CA (1) | CA2214430A1 (ja) |
WO (1) | WO1996027680A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007292596A (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Kohan Co Ltd | プローブポリヌクレオチド固定化担体の再生方法 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6156501A (en) * | 1993-10-26 | 2000-12-05 | Affymetrix, Inc. | Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use |
US7375198B2 (en) | 1993-10-26 | 2008-05-20 | Affymetrix, Inc. | Modified nucleic acid probes |
US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
AU4174397A (en) | 1996-08-30 | 1998-03-19 | Life Technologies, Inc. | Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna |
US6306588B1 (en) | 1997-02-07 | 2001-10-23 | Invitrogen Corporation | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof |
HUP0003296A3 (en) | 1997-07-22 | 2001-09-28 | Qiagen Genomics Inc Bothell | Apparatus and methods for arraying solution onto a solid support |
CN1268979A (zh) * | 1997-07-22 | 2000-10-04 | 拉普吉恩公司 | 阵列单元的多功能性及其用途 |
EP1214594B1 (en) | 1999-05-14 | 2006-08-02 | Iris BioTechnologies, Inc. | Reversible immobilization of ligands onto metal surfaces, their preparation and use in biochemical applications |
EP1234182A2 (en) * | 1999-06-30 | 2002-08-28 | Iris Bio Technologies | Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs |
EP1111069A1 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-27 | BioChip Technologies GmbH | Modified nucleic acids and their use |
US6316608B1 (en) * | 2000-03-20 | 2001-11-13 | Incyte Genomics, Inc. | Combined polynucleotide sequence as discrete assay endpoints |
DE10152925A1 (de) * | 2001-10-26 | 2003-05-08 | Febit Ag | Asymmetrische Sonden |
JP2005520554A (ja) * | 2002-03-21 | 2005-07-14 | ボストン プローブス,インコーポレイテッド | BacillusAnthracisの検出に関するPNAオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキット |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8810400D0 (en) * | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
GB8811608D0 (en) * | 1988-05-17 | 1988-06-22 | Animal Health Inst | Detecting disease susceptibility |
AU632494B2 (en) * | 1988-05-20 | 1993-01-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immobilized sequence-specific probes |
US5641625A (en) * | 1992-05-22 | 1997-06-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids |
GB9211979D0 (en) * | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Buchard Ole | Uses of nucleic acid analogues |
-
1996
- 1996-03-04 AU AU50029/96A patent/AU5002996A/en not_active Abandoned
- 1996-03-04 JP JP08526599A patent/JP2000513921A/ja not_active Ceased
- 1996-03-04 CA CA002214430A patent/CA2214430A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-04 WO PCT/EP1996/000893 patent/WO1996027680A1/de not_active Application Discontinuation
- 1996-03-04 EP EP96906732A patent/EP0813610A1/de not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-02-26 JP JP2003048630A patent/JP2004000154A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007292596A (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Toyo Kohan Co Ltd | プローブポリヌクレオチド固定化担体の再生方法 |
JP4524392B2 (ja) * | 2006-04-25 | 2010-08-18 | 国立大学法人 千葉大学 | プローブポリヌクレオチド固定化担体の再生方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2214430A1 (en) | 1996-09-12 |
AU5002996A (en) | 1996-09-23 |
JP2000513921A (ja) | 2000-10-24 |
WO1996027680A1 (de) | 1996-09-12 |
EP0813610A1 (de) | 1997-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0915991B1 (en) | Nucleic acid amplification method based on ramification-extension (ram) and in vitro transcription | |
US6593086B2 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
EP2118310B1 (en) | Systems and methods for detecting nucleic acids | |
JP4499987B2 (ja) | 非−標準塩基を使用する固体支持体アッセイ系及び方法 | |
EP0717782A1 (en) | Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes | |
KR20010012175A (ko) | 폴리뉴클레오티드의 2단계 혼성화 및 포획법 | |
CA2374406A1 (en) | Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations | |
US7125972B2 (en) | Solid carriers with peptide nucleic acid probes and methods for regeneration | |
JP2005511030A (ja) | 核酸の増幅方法 | |
AU2002220132A1 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
WO2003050306A1 (en) | Hybridization portion control oligonucleotide and its uses | |
JP2009519001A5 (ja) | ||
JP2004000154A (ja) | 核酸の配列特異的検出 | |
CA2469383A1 (en) | Hybridization portion control oligonucleotide and its uses | |
WO2017096394A1 (en) | High-efficiency hybrid capture compositions, and methods | |
JP4934679B2 (ja) | 9種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種を特異的に検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよびその方法 | |
US6790623B2 (en) | DNA detection by means of a strand reassociation complex | |
WO2003089894A2 (en) | Isothermal amplification in nucleic acid analysis | |
JP2002017399A (ja) | 塩基多型を検出する方法 | |
JP2007174986A (ja) | 核酸の塩基配列解析方法 | |
JP2004523221A (ja) | 部分相補的プローブを用いた遺伝子型分類 | |
JP2003125800A (ja) | 核酸の検出方法 | |
JPH11103894A (ja) | Dnaの特異的検出方法 | |
WO2002024960A1 (en) | Detection of dna variation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051213 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060525 |