ES2352417T3 - Método para la detección de una alteración en un ácido nucléico. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de: a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica una agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere en líneas generales a métodos para detectar una alteración en un ácido nucleico diana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Muchas enfermedades están asociadas con la inestabilidad genómica. Por tanto, se han propuesto marcadores de inestabilidad como agentes de diagnóstico. Por ejemplo, las mutaciones se consideran marcadores valiosos para una diversidad de enfermedades, y han formado la base para los ensayos de exploración. Las mutaciones específicas pueden ser una base para ensayos de exploración molecular para las fases tempranas de ciertos tipos de cáncer. Véase, por ejemplo, Sidransky, et al., Science, 256:102-105 (1992). Por ejemplo, las mutaciones en los genes BRCA se han propuestos como marcadores para cáncer de mama, y las mutaciones en el gen regulador del ciclo celular p53 se han asociado con el desarrollo de numerosos tipos de cánceres.

La detección temprana de una alteración permite el diagnóstico temprano de una enfermedad, y por tanto también proporciona una opción para la intervención antes de la presentación de los síntomas de la enfermedad que a menudo suceden después de la metástasis cuando se puede obtener menos fácilmente una cura. Sin embargo, la detección de mutaciones genéticas u otras alteraciones es difícil, o imposible, en ciertos tipos de muestra. Por ejemplo, la dificultada de aislar ADN de muestras heterogéneas, complejas hace difícil la identificación de una mutación en fase temprana.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos eficaces para determinar la presencia o ausencia de ciertas mutaciones genéticas u otras alteraciones en un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

El documento US 6.051.378 se refiere a métodos para explorar ácidos nucleicos para mutaciones analizando ácidos nucleicos fragmentados no aleatoriamente usando técnicas de espectrometría de masas y a procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos métodos.

Shenk et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1975, vol. 72, nº 3, marzo de 1975, páginas 989-993 se refiere a un método bioquímico para mapear alteraciones mutacionales en ADN con nucleasa S1.

Seitz et al. Chem. Eur. J. US, vol. 7, nº 18, 17 de septiembre de 2001 (2001-0917), páginas 3911-3925 se refiere a estrategias para la unión de grupos informadores fluorescentes a ácidos péptido-nucleicos en solución y en fase sólida.

Brookes et al. (1989) Eur. J. Biochem., vol. 183, nº 2 se refiere a la evaluación del uso de la nucleasa S1 para detectar variaciones de pequeña longitud en ADN

genómico.

El documento WO99/19517 se refiere al análisis de ADN mellado por cromatografía de polinucleótidos iónicos apareados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos para detectar una alteración en un ácido nucleico diana en una muestra biológica. De acuerdo con la invención, se expone una pluralidad de sondas de ácido nucleico monocatenario o ácido péptido-nucleico complementarias a una región contigua del ácido nucleico diana, si dicha región está inalterada, a una muestra biológica que se sospecha que contiene la diana. El método comprende adicionalmente añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana así como la presencia de un producto de degradación resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana. Se diseñan sondas para que hibriden con la diana de un modo contiguo para formar un dúplex que comprende la diana y las sondas contiguas "adosadas" a lo largo de la diana. Un ejemplo de este dúplex se muestra en la Figura 1. Si existe una mutación u otra alteración en la diana, se interrumpirá el adosado contiguo, produciendo regiones monocatenarias de la diana en las que no existe dúplex. Esto se muestra en la Figura

2. La identificación de una o más regiones monocatenarias en la diana es indicativa de una mutación u otra alteración en la diana que evitó la hibridación de la sonda en esa región. Para propósitos de la presente invención, una "secuencia adosada" o "adosado" se refiere a la hibridación contigua de sondas con una región diana, estén separadas por secuencia monocatenaria o no.

Por consiguiente, en métodos de la invención, se expone una muestra que comprende un ácido nucleico diana monocatenario a una pluralidad de sondas de ácido nucleico. En una realización preferida, la pluralidad de sondas comprende sondas que son complementarias a diferentes posiciones de la diana de modo que la hibridación de los miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie continua de sondas a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana cuando la diana es una diana de tipo silvestre. Pueden emplearse sondas que incluyen ARN, ADN y/o ácido péptido-nucleico (PNA) para hibridar con el ácido nucleico diana. No es necesario ligar la serie de sondas para formar una cadena continua, aunque puede realizarse ligamiento a juicio del usuario.

Cuando la diana es una secuencia de tipo silvestre, no habrá una parte monocatenaria en la región en la que se adosan las sondas. Sin embargo, cuando existe una mutación u otra alteración en la región de la diana a la que están dirigidas las sondas, una o más de las sondas no lograrán hibridar, produciendo una o más partes monocatenarias de la región diana. La identificación de esta región monocatenaria es, de acuerdo con la invención, un ensayo positivo para una mutación

u otra alteración en la diana.

En una realización preferida, una región monocatenaria indicativa de una mutación en la diana se detecta exponiendo la diana, después de la hibridación de la sonda, a un agente que escinde selectivamente el ácido nucleico monocatenario. En una diana mutada, los métodos de la invención producen más de un dúplex "adosado" en la región diana. Se producen múltiples dúplex adosados bicatenarios por la escisión de la diana en la región monocatenaria en la que ninguna sonda logró hibridar. Se conocen numerosas enzimas de escisión que escinde selectivamente o degradan ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, nucleasa S1, MutY, MutS y del fríjol mungo). La identificación de un único dúplex contiguo que comprende la diana y las sondas adosadas contiguas tras la exposición al agente de escisión o degradación selectivo es indicativa de una región diana de tipo silvestre (no mutada). Como alternativa, los productos de escisión se miden para determinar, por ejemplo, si el peso molecular de los productos es diferente de que se esperaría de un único dúplex contiguo.

De acuerdo con la invención, pueden generarse ácidos nucleicos monocatenarios para formar la diana por métodos convencionales conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios y/o generar ácidos nucleicos monocatenarios en una reacción catalizada por enzima invitro donde se genera un exceso de una cadena. Los métodos preferidos incluyen capturar un ácido nucleico diana monocatenario en un soporte sólido o semisólido.

También en una realización preferida, el ensayo descrito anteriormente se combina para examinar múltiples dianas simultáneamente. Por tanto, se pueden buscar productos de escisión bicatenarios específicos para identificar la o las dianas mutadas específicas o simplemente se pueden identificar múltiples productos de escisión (resultantes, como se ha descrito anteriormente, de la interposición de regiones monocatenarias en la "diana adosada") como evidencia de una mutación en una de las dianas examinadas. Por ejemplo, se examinan múltiples dianas, conteniendo cada una un llamado "punto caliente" para mutación en cáncer, siendo la producción de una región diana monocatenaria después del adosado suficiente para producir una exploración positiva para cáncer o pre-cáncer.

Además, en otra realización preferida más, se diluye una muestra heterogénea añadiendo tampón, por ejemplo, tampón de muestra o ensayo, y la muestra diluida después se separa en fracciones. Las fracciones preferidas contienen un promedio de 1-5 moléculas de ácido nucleico de la muestra heterogénea original. Las fracciones separadas de muestra preferiblemente se amplifican por, por ejemplo, PCR, que concentra cada fracción de muestra separada de ácido nucleico diana. Como resultado, cada fracción separada se enriquece para un subconjunto de moléculas de ácido nucleico que estaban presentes en la muestra heterogénea original. Por consiguiente, cuando se añaden sondas complementarias a la secuencia de tipo silvestre a cada fracción separada de muestra, puede detectarse una mutación que está enriquecida en una de las fracciones separadas como una señal potenciada. Dichos métodos pueden emplearse, por ejemplo, para detectar eventos raros en la muestra.

Los métodos de la invención también son útiles para detectar regiones no hibridadas en los extremos de una diana. Cuando sucede una mutación en una región de la diana con la que un bloque de adosado terminal hibridaría si la diana es una diana de tipo silvestre, la degradación resultante del extremo monocatenario, como se ha descrito anteriormente, no producirá múltiples productos dúplex indicativos de una región monocatenaria interpuesta. En su lugar, la región monocatenaria terminal se escindirá o degradará, dejando una parte adosada de la diana intacta. En ese caso, la mutación terminal se identificar por el peso molecular esperado reducido de la diana adosada o por la actividad del agente degradante (por ejemplo, una exonucleasa).

Como alternativa, también puede detectarse una mutación u otra alteración en los extremos de una diana evaluando tanto la cadena con sentido como la cadena antisentido de la diana. De acuerdo con los métodos de la invención, tanto la cadena con sentido como la cadena antisentido de la diana se unen a un soporte sólido por el mismo extremo respectivo; por ejemplo, tanto la cadena con sentido como la cadena antisentido de la diana se unen a un soporte sólido por sus respectivos extremos 5'. Después de ello, las cadenas con sentido y antisentido unidas de la diana se examinan en solución. Una mutación terminal en, por ejemplo, el extremo 3' no unido de la cadena con sentido, permanecería sin detectar, sin embargo, la mutación presenta un dúplex escindido del sitio de mutación cerca del extremo 5' unido de la cadena antisentido. La mutación se detecta cuando se retira el soporte sólido y el dúplex escindido de la cadena antisentido permanece en solución. Si se ensaya solamente la cadena con sentido, entonces la mutación permanecería sin detectar, por tanto el ensayo de tanto la cadena con sentido como la cadena antisentido evita un falso negativo causado por una mutación terminal en una de las cadenas.

Los métodos de la invención pueden usarse para evitar detectar un polimorfismo conocido como un falso positivo para una alteración. Puede estar presente uno o más polimorfismos en una región del ácido nucleico diana. En ese caso, se diseñan múltiples sondas para que hibriden con cada una de las variantes polimórficas conocidas que se sabe que están presentes en la región diana. La sonda complementaria al polimorfismo variante que está presente en la diana hibridará con la región del polimorfismo. Proporcionar el intervalo de variantes complementarias a los polimorfismos asociados asegura que la región del polimorfismo está "adosada" y cualquier señal positiva detectada indica la presencia de una alteración diferente al polimorfismo asociado en el ácido nucleico diana.

Los métodos de la invención también son útiles para detectar la presencia, en una población, de uno o más polimorfismos en un ácido nucleico diana. Una pluralidad de sondas de ácido nucleico es complementaria a una primera variante de un ácido nucleico diana que comprende un polimorfismo de modo que la hibridación de miembros de la pluralidad con la diana que comprende el polimorfismo variante produce una serie contigua de sondas a lo largo de al menos una parte de la diana. Cuando está presente una o más variantes polimórficas diferentes en la región de la diana a la que están dirigidas las sondas, al menos una de las sondas no logrará hibridar en el sitio de la otra variante polimórfica. Después de la hibridación, una parte monocatenaria de la región diana se expone en el sitio de, por ejemplo, una segunda variante polimórfica. Después de la exposición a un agente que degrada selectivamente ácido nucleico monocatenario, la variante polimórfica presenta un dúplex escindido a partir de, por ejemplo, el sitio de la segunda variante polimórfica. Por consiguiente, la detección de un producto de escisión es un ensayo positivo para una alteración, en este caso la una o más variantes polimórficas diferentes, en la diana.

En otro aspecto, se diseñan sondas que hibridan con la diana de modo que haya huecos que separan una o más de las sondas hibridadas entre sí. De acuerdo con este aspecto de la invención, se expone una muestra que comprende ácido nucleico diana monocatenario a una pluralidad de sondas de ácido nucleico. La pluralidad comprende sondas que son complementarias a diferentes posiciones en el ácido nucleico diana de modo que la hibridación de miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie de sondas, a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana, algunas de las cuales pueden estar separadas por un hueco.

Preferiblemente, los huecos son suficientemente pequeños para evitar que el agente de degradación corte en el hueco. Por consiguiente, las separaciones de hueco preferidas son más cortas que las sondas, es decir, las sondas tienen una cantidad mayor de pares de bases que los huecos. En realizaciones preferidas, las separaciones de hueco varían entre aproximadamente 1 par de bases y aproximadamente 3 pares de bases de longitud. Como alternativa, los huecos pueden ser entre aproximadamente 3 pares de bases y 15 pares de bases de longitud. De acuerdo con la invención, puede realizarse un ensayo de detección usando una pluralidad de sondas, algunas de las cuales están separadas por huecos y algunas de las cuales no cuando hibridan con el ácido nucleico diana.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el agente de degradación que se selecciona, o como alternativa, las condiciones empleadas con el agente, no escinden el ácido nucleico diana en los huecos monocatenarios. En algunas realizaciones, se emplean condiciones de degradación más suaves que evitan la degradación de cualquier separación de hueco monocatenario. Por ejemplo, la cantidad de unidades de agente de degradación usadas se mantienen a una temperatura y durante un periodo de tiempo apropiado para mantener las separaciones de hueco monocatenario entre bloques de adosado. Las condiciones del agente de degradación degradan simultáneamente regiones monocatenarias más grandes donde una o más sondas no lograron hibridar debido a una alteración en la diana. Como las separaciones de hueco no se degradan, se evitan los falsos positivos creados por separaciones de hueco entre las sondas. Sin embargo, las condiciones posibilitan la degradación de la región diana donde la sonda no logró hibridar, evitando un falso negativo. Por tanto, de acuerdo con la invención, un ensayo positivo para una alteración en un ácido nucleico diana puede comprender huecos que separan sondas complementarias hibridadas con la diana. Cuando están presentes separaciones de hueco entre las sondas, el agente de degradación seleccionado, las unidades de agente usadas, la temperatura y el tiempo de exposición se seleccionan para proporcionar condiciones que mantengan separaciones de hueco monocatenario y que escindan simultáneamente una región de alteración monocatenaria donde una sonda no logró hibridar. También puede usarse la impedancia estérica para evitar el corte en los huecos.

Las sondas pueden diseñarse de modo que eviten que sondas hibridadas adyacentes creen un efecto de estabilización que provoque una hibridación de sonda en el sitio de una alteración en una región del ácido nucleico diana. Por consiguiente, las propias sondas están alteradas para que incluyan entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 sitios abásicos en el extremo 5' y/o 3' de uno o más de las sondas. Asimismo, las sondas pueden alterarse para poner entre aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ADN, ARN, o ácidos péptido-nucleicos que no aparean con el ácido nucleico diana en el extremo 5' y/o 3', y que no evitan que la sonda hibride con su diana complementaria.

En una realización preferida, se une un ácido nucleico diana a un soporte sólido en cualquiera de sus extremos 3' ó 5'. Se adosan sondas complementarias a lo largo de toda la longitud de la diana como se ha descrito anteriormente. Una mutación se indica cuando se detectan productos de hibridación bicatenarios en solución después de tratar la muestra con un agente de degradación, lo que indica que una o más de las sondas de adosado no lograron hibridar con la diana debido a la mutación. Puede explorarse simultáneamente más de un ácido nucleico diana de más de una fuente uniendo múltiples ácidos nucleicos diana a soportes sólidos. Además, el ácido nucleico bicatenario puede fundirse, por ejemplo, por calentamiento.

En caso de que se detecte una mutación en un ácido nucleico diana, la identidad de la mutación se determina por cualquier método conocido en la técnica, tal como secuenciación, espectroscopía de masas, y otras.

En una realización preferida, se expone una muestra biológica a sondas complementarias a un ADN diana en condiciones de hibridación rigurosas de modo que cada sonda hibridará solamente con el ácido nucleico diana de tipo silvestre. Dichas condiciones son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, 2 Joseph Sambrook, Peter MacCallum, & David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual cap. 10 (3ª ed. 2001).

En una realización, la temperatura de fusión de hibridación de cada sonda es aproximadamente la misma. En otra realización, las sondas son entre aproximadamente 8 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En una realización preferida, cada sonda tiene la misma longitud, es decir, está compuesta por la misma cantidad de nucleótidos.

Muestras biológicas preferidas son esputo, fluido pancreático, bilis, linfa, plasma, orina, fluido cefalorraquídeo, fluido seminal, saliva, aspirado del pezón de la mama, pus, tejido de biopsia, células fetales, fluido amniótico, y deposiciones.

En otra realización, al menos una de las sondas de adosado comprende un marcador detectable. Cada sonda puede comprender un marcador detectable diferente, lo que permite la detección diferencial de las sondas (es decir, por ejemplo, las diferentes sondas pueden comprender un nucleótido con un isótopo radiactivo diferente, una marca fluorescente, o una entidad modificadora del peso molecular). Un marcaje diferencial de las sondas permite la identificación de la sonda que no hibridó con su diana en el caso de una mutación. Puede marcarse cada sonda o un subconjunto de sondas y/o puede marcarse todo o una parte del ácido nucleico diana. En una realización preferida, todas las sondas están marcadas. En una realización más preferida, el ácido nucleico diana se une a un soporte sólido, y un marcador, situado en cualquiera de la diana, las sondas, o ambas, está distal, preferiblemente lo más distal, es decir, en el extremo no unido, a la posición de una alteración.

En otra realización, el ácido nucleico diana comprende un marcador detectable en la región en la que se sospecha una mutación. Cuando la mutación sospechada está presente en la diana, ninguna sonda hibridará con la diana y la región de la mutación que comprende el marcador detectable permanecerá monocatenaria. Tras la exposición a un agente que escinde ácido nucleico monocatenario, la región de mutación monocatenaria que comprende el marcador detectable se degrada de la diana. La ausencia del marcador en los productos de degradación es indicativa de la presencia de una mutación en la región del marcador detectable.

El medio de identificación de la alteración, incluyendo, por ejemplo, marcaje de sondas, preparación de sondas, por ejemplo, en un soporte sólido, las mutaciones asociadas a enfermedad, fuentes de muestra, agentes de degradación, y otras realizaciones y ejemplos ilustrativos pueden aplicarse a todos los métodos de detección de alteraciones descritos en este documento. Por ejemplo, pueden hibridarse sondas marcadas de forma fluorescente con la diana de una forma contigua, las sondas marcadas de forma fluorescente pueden estar separadas por huecos, o las sondas marcadas de forma fluorescente pueden ser complementarias a las variantes polimórficas presentes en la diana. En otra realización, una diana que está unida a un soporte sólido puede exponerse a sondas: que hibridan con la diana de una forma contigua, que hibridan con la diana con separaciones de hueco, o que hibridan con las variantes polimórficas presentes en la diana.

En realizaciones preferidas de la invención, se analizan simultáneamente diferentes muestras de pacientes, diferentes fracciones de una muestra de un paciente, o una combinación de las mismas, por ejemplo, en una serie bidimensional tal como en una placa de múltiples pocillos, usando métodos de la invención.

En una realización, los métodos de la invención comprenden detectar una mutación en un locus genético que está asociado con un enfermedad, tal como KRAS, p53, APC, DCC, o BAT26. En una realización preferida, esa mutación está asociada con cáncer, tal como cáncer de colon, cáncer pulmonar, cáncer esofágico, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer hepático, o linfoma.

A continuación se proporciona una descripción detallada de ciertas realizaciones de la invención. Son evidentes aspectos y ventajas adicionales de la invención tras la consideración de los siguientes dibujos, descripción y reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un diagrama de organigrama que ilustra una realización de un método de la invención para detectar la ausencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 2A muestra un diagrama de organigrama que ilustra una realización de un método de la invención para detectar la presencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 2B ilustra otra realización del método de la invención para detectar la ausencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 2C muestra un diagrama de organigrama que ilustra otra realización de un método de la invención para detectar la presencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 3 muestra los resultados de un gel donde se emplean selectivamente sondas de variantes polimórficas para bloquear las variantes polimórficas de la muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 4A ilustra una sonda que tiene un resto informador y un resto inactivador.

La Figura 4B ilustra el resto informador de una primera sonda de la Figura 4A hibridada con el resto inactivador de una segunda sonda.

La Figura 4C muestra un diagrama de organigrama que ilustra otra realización de un método de la invención para detectar la ausencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

La Figura 5 muestra un diagrama de organigrama que ilustra otra realización de un método de la invención para detectar la presencia de mutación en una muestra de ácido nucleico diana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para detectar una alteración genética en ácidos nucleicos diana indicativa de inestabilidad genómica. Por ejemplo, los métodos de la presente invención son útiles para detectar y/o identificar mutaciones u otras alteraciones asociadas con enfermedades, tales como cáncer y otras afecciones, trastornos o síndromes genéticos patológicos. Dichas mutaciones incluyen inserciones, deleciones, reordenamientos, transiciones, traslaciones, transversiones, polimorfismos y sustituciones de nucleótidos. La presente invención puede usarse para identificar mutaciones u otras alteraciones heredadas, tales como mutaciones esporádicas inducidas o espontáneas. Generalmente, sin embargo, las alteraciones incluyen cualquier cambio en el ácido nucleico diana, tal como una mutación, pérdida de heterocigosidad, u otro indicio de inestabilidad genómica.

Los métodos de la invención dependen del uso de una pluralidad de sondas, comprendiendo cada sonda ácidos nucleicos monocatenarios y siendo cada sonda complementaria a una parte diferente de una región contigua del ácido nucleico diana. De acuerdo con la invención, cada sonda hibrida con su región complementaria en el ácido nucleico diana. Cuando no hay mutación u otra alteración presente en la diana, la pluralidad de sondas forma un "adosado" contiguo a lo largo de toda la longitud de la región diana. En el caso de que una parte de la diana contenga una mutación u otra alteración, la diana permanece monocatenaria en esa región porque la sonda por lo demás complementaria no logrará hibridar en presencia de la mutación. La identificación de la región monocatenaria es indicativa de una mutación u otra alteración.

En una realización preferida, se detecta una región monocatenaria indicativa de una mutación u otra alteración exponiendo la diana adosada a un agente que degrada

o escinde preferentemente ácido nucleico monocatenario, y analizando el o los productos de degradación. Los agentes de degradación ejemplares incluyen agentes químicos y enzimas, tales como nucleasa S1, MutY, MutS, y de fríjol mungo. La presencia de un producto de ácido nucleico bicatenario intacto singular es indicativa de la ausencia de una mutación en cualquiera de las regiones del ácido nucleico diana (es decir, sin escisión de la diana debida a la ausencia de una parte monocatenaria). La presencia de dos o más productos bicatenarios es indicativa de la presencia de una mutación u otra alteración en una o más de las regiones del ácido nucleico diana (lo que evidencia la escisión de la diana en la región o regiones bicatenarias que contienen la mutación).

Las muestras biológicas que son útiles en la presente invención incluyen cualquier muestra de un paciente en la que está presente un ácido nucleico diana. Dichas muestras se preparan a partir de cualquier tejido, célula, o fluido corporal. Los ejemplos de fuentes celulares biológicas incluyen células sanguíneas, células de colon, células bucales, células cervicovaginales, células epiteliales de la orina, células fetales o células presentes en tejido obtenido por biopsia. Los tejidos o fluidos corporales ejemplares incluyen esputo, fluido pancreático, bilis, linfa, plasma, orina, fluido cefalorraquídeo, fluido seminal, saliva, aspirado del pezón de la mama, pus, fluido amniótico y deposiciones. Las muestras biológicas útiles también incluyen ácido nucleico aislado de un paciente. El ácido nucleico puede aislarse de cualquier tejido, célula, o fluido corporal usando cualquiera de numerosos métodos que son convencionales en la técnica. El método de aislamiento de ácido nucleico particular dependerá de la fuente de la muestra del paciente.

La muestra biológica que comprende un ácido nucleico diana puede analizarse por métodos de la presente invención sin preparación o purificación adicional. En una realización preferida, puede amplificarse una o más regiones específicas presentes en el ácido nucleico diana por, por ejemplo, PCR. La concentración del ácido nucleico diana por amplificación mejora la precisión reduciendo el ruido de fondo en la muestra.

En una realización, el ácido nucleico diana se une a una fase sólida o matriz de fase semisólida. La unión al soporte permite el procesamiento y exploración simultánea de una pluralidad de muestras de ácido nucleico de diferentes fuentes, y permite que los productos de degradación se comparen en la fase líquida. Las matrices ejemplares adecuadas para su uso en la presente invención incluyen nitrocelulosa o filtros de nylon, perlas de vidrio, perlas magnéticas recubiertas con agentes para la captura por afinidad, placas de microtitulación tratadas o sin tratar, geles poliméricos, agarosa y similares. Los especialistas en la técnica entenderán que el método por el cual se une el ácido nucleico diana a la matriz dependerá de la matriz particular usada. Por ejemplo, la unión a nitrocelulosa puede conseguirse por absorción simple del ácido nucleico al filtro seguido de desecado del filtro a 75º-80ºC al vacío durante 25 minutos a 2 horas. Como alternativa, pueden usarse membranas de nylon cargadas que no requieren ningún tratamiento adicional del ácido nucleico unido. Pueden usarse perlas y placas de microtitulación que se recubren con avidina para unir el ácido nucleico diana al que se ha adherido biotina (por, por ejemplo, el uso de cebadores de PCR conjugados con biotina). Además, pueden usarse anticuerpos para adherir el ácido nucleico diana a cualquiera de los soportes sólidos anteriores recubriendo las superficies con un anticuerpo e incorporando un hapteno específico de anticuerpo en el ácido nucleico diana. El exceso de agentes de unión se elimina del ácido nucleico diana unido lavando con tampones apropiados.

En la práctica de la presente invención, el ácido nucleico diana, preferiblemente unido a una fase sólida o matriz en fase semisólida, se incuba con una pluralidad de sondas de ácido nucleico. La longitud de las sondas individuales puede ser de 8-100 nucleótidos. En una realización preferida, las sondas individuales son de 8-30 nucleótidos de longitud. En una realización más preferida, las sondas son de aproximadamente 17 nucleótidos de longitud. Pueden emplearse sondas que comprenden ARN, ADN, y/o ácido péptido-nucleico (PNA) para hibridar con el ácido nucleico diana. Las sondas pueden sintetizarse químicamente por métodos que son convencionales en la técnica, por ejemplo, usando sintetizadores automatizados disponibles en el mercado. Puede marcarse una o más las sondas. Por ejemplo, pueden adherirse fluorocromos (tales como FITC o rodamina), enzimas (tales como fosfatasa alcalina), biotina, u otros compuestos de marcaje bien conocidos directamente o indirectamente. Como alternativa, las sondas pueden marcarse radiactivamente (por ejemplo, marcaje en el extremo con 32P usando polinucleótido quinasa) o conjugarse con otros marcadores o moléculas informadoras usadas habitualmente. Además, estos oligonucleótidos pueden marcarse con una entidad modificadora del peso molecular (MWME) que identifica de forma exclusiva cada una de las sondas.

Como se describe en Shuber et al., Human Molecular Genetics, 2:153-158, (1993), la reacción de hibridación puede realizarse en condiciones en las que las sondas que tienen diferentes secuencias de ácido nucleico hibriden con su ADN complementario con fuerza equivalente. Esto se consigue por: 1) el empleo de sondas de longitud equivalente; y 2) la inclusión en la mezcla de hibridación de concentraciones apropiadas de uno o más agentes que eliminan la disparidad en las temperaturas de fusión (Tm) entre sondas de longitud idéntica pero diferente contenido de guanosina+citosina (G+C). Por tanto, en estas condiciones, las temperaturas de fusión de hibridación (Tm) de cada miembro de la pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios son aproximadamente equivalentes. Los agentes que pueden usarse para este propósito incluyen compuestos de amonio cuaternario tales como cloruro de tetrametilamonio (TMAC).

El TMAC reduce la energía del enlace de hidrógeno entre pares G-C. Al mismo tiempo, el TMAC aumenta la estabilidad térmica de los enlaces de hidrógeno entre pares A-T. Esas influencias opuestas reducen la diferencia en la fuerza de enlace normal entre el par de bases G-C unido con tres enlaces de hidrógeno y el par A-T unido con dos enlaces de hidrógeno. El TMAC también aumenta la pendiente de la curva de fusión para cada sonda. En conjunto, esos efectos permiten aumentar la rigurosidad de hibridación hasta el punto en que puedan resolverse diferencias de una única base, y se minimice la hibridación no específica. Véase, por ejemplo, Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:1585, (1985)..

Puede emplearse cualquier agente que muestre esas propiedades en la práctica de la presente invención. Dichos agentes se identifican fácilmente determinando las curvas de fusión para diferentes sondas de ensayo en presencia y ausencia de concentraciones crecientes del agente. Esto puede conseguirse uniendo un ácido nucleico diana a una matriz sólida tal como un filtro de nylon, hibridando individualmente sondas radiomarcadas de longitudes idénticas pero diferente contenido de G+C al filtro, lavando el filtro a temperaturas crecientes, y midiendo la cantidad relativa de sonda radiomarcada unida al filtro a cada temperatura. Puede usarse cualquier agente que, cuando está presente en las etapas de hibridación y lavado descritas anteriormente, produce curvas de fusión aproximadamente superponibles y pronunciadas para los diferentes oligonucleótidos.

En la práctica de la presente invención, el ácido nucleico diana y las sondas se incuban durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas para maximizar la hibridación específica y minimizar la hibridación no específica. Las condiciones a considerar incluyen la concentración de cada sonda, la temperatura de hibridación, la concentración salina, y la presencia o ausencia de ácido nucleico no relacionado.

La concentración de cada sonda generalmente varía de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 0,2 pmol por ml de solución de hibridación. En una realización, cada una de las sondas comprende una cantidad igual de nucleótidos. Las secuencias de sonda se diseñan para hibridar con regiones adyacentes, consecutivas del ácido nucleico diana. La concentración óptima para cada sonda puede determinarse por hibridaciones de ensayo en las que se mide la proporción señal-ruido (es decir, la unión específica frente a la no específica) de cada sonda a concentraciones crecientes de sondas marcadas.

La temperatura para la hibridación puede optimizarse para la longitud de las sondas que se están usando. Esto puede determinarse empíricamente, usando el procedimiento de determinación de la curva de fusión descrito anteriormente. Los especialistas en la técnica entenderán que la determinación de las condiciones de hibridación de tiempo, temperatura, concentración de sonda, tipo de sal, y concentración salina óptimas debe hacer de forma coordinada.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, las sondas de adosado hibridan solamente con su región complementaria en el ácido nucleico diana. Por tanto, el ácido nucleico diana permanecerá monocatenario en cualquier locus en el que esté presente una mutación porque no hibridará ninguna sonda en ese locus. Una alteración ejemplar incluye un polimorfismo de un único nucleótido. Después de la hibridación, las sondas no unidas, si es necesario, se retiran por lavado en condiciones que conservan los productos de hibridación ácido nucleico diana:sonda perfectamente apareados. Las condiciones de lavado tales como la temperatura, el tiempo de lavado, los tipos de sales y las concentraciones salinas se determina empíricamente como se ha descrito anteriormente.

Los métodos de la invención también evitan que se detecten polimorfismos conocidos como un falso positivo para una alteración. Cuando uno o más polimorfismos están asociados con una región del ácido nucleico diana, se proporcionan múltiples sondas, diseñada cada una para hibridar con una de las variantes polimórficas. Una sonda complementaria a una variante polimórfica en la diana hibridará con la región del polimorfismo. Por tanto, de acuerdo con el método, se diseñan sondas para bloquear las variantes polimórficas de modo que cuando la diana esté por lo demás inalterada, las sondas hibriden de forma contigua a una región del ácido nucleico diana. Por tanto, proporcionar sondas complementarias a cada variante polimórfica asegura que la región polimórfica se "adose" y que cualquier región monocatenaria detectada de acuerdo con el método indique la presencia en el ácido nucleico diana de una alteración diferente una variante polimórfica asociada.

En otro aspecto, se diseñan sondas para hibridar con la diana de modo que hay huecos que separan una o más de las sondas hibridadas. De acuerdo con este aspecto de la invención, se expone una muestra que comprende ácido nucleico diana monocatenario a una pluralidad de sondas de ácido nucleico. La pluralidad comprende sondas que son complementarias a diferentes posiciones del ácido nucleico diana de modo que la hibridación de miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie de sondas, a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana, que están separadas por un hueco de ácido nucleico monocatenario. Los huecos se ajustan en tamaño de modo que las sondas sean más largas que las separaciones de hueco, es decir, las sondas tengan una cantidad mayor de pares de bases que los huecos. En algunas realizaciones, los huecos varían entre aproximadamente 1 par de bases y aproximadamente 3 pares de bases de longitud. Como alternativa, los huecos pueden variar entre aproximadamente 3 pares de bases y aproximadamente 15 pares de bases de longitud.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el agente que se selecciona, o como alternativa, las condiciones empleadas con el agente, no escinden el ácido nucleico diana en las separaciones de hueco monocatenario. En algunas realizaciones, se emplea un agente de degradación más suave en condiciones seleccionadas para evitar la degradación de separaciones de hueco monocatenario, tal como, por ejemplo, el agente nucleasa de fríjol mungo que se expone a una temperatura de aproximadamente 37ºC durante un periodo de aproximadamente 10 minutos. Cuando están presentes separaciones de hueco entre sondas, el agente de degradación seleccionado, las unidades de agente usadas, la temperatura y el tiempo de exposición se seleccionan para proporcionar condiciones que mantengan (es decir, no corten) separaciones de hueco monocatenario en el ácido nucleico. Sin embargo, las condiciones seleccionadas degradan la región monocatenaria del ácido nucleico donde una o más sondas no lograron hibridar debido a una alteración en la diana. Como las separaciones de hueco no se degradan, se evitan los falsos positivos creados por separaciones de hueco entre las sondas. Sin embargo, las condiciones posibilitan la degradación de la región de ácido nucleico monocatenario en la diana donde la sonda no logró hibridar, evitando un falso negativo. Por tanto, de acuerdo con la invención, un ensayo positivo para una alteración en un ácido nucleico diana puede comprender huecos monocatenarios en la diana que separan sondas complementarias hibridadas con la diana.

En una realización, el ácido nucleico diana está presente a una concentración mayor que cada una de las sondas individuales, al menos uno de las cuales está marcada con, por ejemplo, un marcador fluorescente que puede detectarse por excitación a la longitud de onda de absorción específica de una fuente de luz en un espectrofotómetro (informador fluorescente). Los productos de hibridación se retiran de la solución, y la solución se evalúa para la fluorescencia. Si no hay mutación presente en el ácido nucleico diana, ninguna sonda marcada permanecerá en la solución ya que todas las sondas marcadas se unirán al ácido nucleico diana. Por tanto, se indica ausencia de mutación en el ácido nucleico diana si la solución no tiene fluorescencia a un nivel apreciable. Como alternativa, si el ácido nucleico diana está unido a un soporte sólido, la fluorescencia del ácido nucleico hibridado en solución después de exposición a un agente de degradación es indicativa de la presencia de una mutación en el ácido nucleico diana.

En otra realización, la sonda está marcada radiactivamente o se emplean sondas quimioluminiscentes y la presencia de una mutación en el ácido nucleico diana se determina por exposición a una película de rayos X. Como alternativa, o adicionalmente, las sondas pueden portar una entidad modificadora del peso molecular (MWME) que es única para cada sonda. Dicha entidad permite una identificación directa de la sonda separada por determinación del peso molecular relativo por cualquiera de varios métodos.

Aunque generalmente se prefiere la inmovilización del ácido nucleico diana, en algunas realizaciones puede ser deseable hibridar las sondas de adosado con el ácido nucleico diana en solución. Después de exponer el producto de hibridación en solución a un agente de degradación que degrada preferentemente ácido nucleico monocatenario, el o los productos de degradación se analizan por métodos de la técnica que incluyen electroforesis en gel de SDS poliacrilamida, espectrometría de masas, cromatografía, captura por hibridación y otros. Véase, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed. (John Wiley & Sons, Inc., 1995); Wu Recombinant DNA Methodology II, (Academic Press, 1995).

Después de la detección de una mutación, la región, o locus genético en el ácido nucleico diana donde está presente la mutación, puede determinarse por identificación de sondas específicas que no lograron hibridar con el ácido nucleico diana. Por ejemplo, en una realización, el producto de hibridación se escinde en dos ácidos nucleicos bicatenarios diferentes después del tratamiento con un agente de degradación que degrada preferentemente ácido nucleico monocatenario. Los dos ácidos nucleicos se separan y se secuencian de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Después puede determinarse la localización relativa y la identidad de las sondas que hibridaron satisfactoriamente con el ácido nucleico diana. A través del proceso de eliminación puede identificarse la una o más sondas que no lograron hibridar, así como su posición relativa en el ácido nucleico diana. El locus genético que tiene una mutación tendrá un tipo silvestre correspondiente que es complementario a

la sonda que no logró hibridar.

La Figura 1 muestra un diagrama de organigrama que ilustra una realización de la presente invención. Como se muestra en la Figura 1, la ausencia de una mutación en un ácido nucleico diana se determina cuando el ácido nucleico diana no se escinde en dos o más fragmentos bicatenarios. En una visión de conjunto general, el método comprende las etapas de: exponer un ácido nucleico diana unido a una pluralidad de sondas; exponer el ácido nucleico diana y la mezcla de sondas a un agente que degrada preferentemente ácidos nucleicos monocatenarios; y determinar que hay ausencia de una mutación en el ácido nucleico diana su está presente un producto de ácido nucleico bicatenario intacto singular en la muestra después de la exposición al agente de degradación.

Más específicamente, el ácido nucleico diana (6) se une a una fase sólida o matriz de fase semisólida (10). El ácido nucleico diana se expone a una pluralidad de sondas (2) que están marcadas con, por ejemplo, una molécula fluorescente. El ácido nucleico diana (6) y la pluralidad de sondas (2) se incuban en condiciones óptimas de tiempo, temperatura, concentración de sonda, tipo de sal, y concentración salina. Se emplean condiciones de hibridación rigurosas que maximizan la hibridación específica mejorando la simetría de energía de enlace y proporcionando temperaturas de fusión similares para cada sonda. Esas condiciones de hibridación posibilitan que solamente las sondas complementarias hibriden con el ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana (6) y la mezcla de sondas (2) después se exponen a un agente de degradación que degrada preferentemente ácido nucleico monocatenario. El agente puede ser, por ejemplo, nucleasa S1.

El producto de hibridación que comprende el ácido nucleico diana y las sondas

(18) después se retira por su extremo unido de la solución. El uso de ácido nucleico diana unido posibilita explorar simultáneamente varias muestras retirando la parte unida de la solución (por ejemplo, retirando el sobrenadante de una mezcla de reacción que contiene la diana unida) y después analizando la fase en solución para el producto de degradación indicativo de una mutación.

La Figura 2A muestra un diagrama de organigrama que ilustra una realización de la presente invención. En una visión de conjunto general, el método comprende las etapas de: exponer un ácido nucleico diana unido que tiene una región, en la que está presente una mutación, a una pluralidad de sondas; exponer el ácido nucleico diana hibridado y la mezcla de sondas a un agente de degradación que degrada preferentemente ácidos nucleicos monocatenarios; y detectar la presencia de mutación en el ácido nucleico diana cuando se degrada una región monocatenaria.

Más específicamente, el ácido nucleico diana (8) que tiene una región con una mutación (22) se une a una fase sólida o matriz de fase semisólida (10). El ácido nucleico diana (8) se expone a una pluralidad de sondas (2) que están marcadas por, por ejemplo, fluorescencia. El ácido nucleico diana (8) y la pluralidad de sondas (2) se incuban en condiciones óptimas de tiempo, temperatura, concentración de oligonucleótido, tipo de sal, y concentración salina. Se emplean condiciones de hibridación rigurosas que maximizan la hibridación específica mejorando la simetría de energía de enlace y proporcionando una temperatura de fusión similar para cada sonda. Las condiciones de hibridación posibilitan que solamente las sondas complementarias hibriden con el ácido nucleico diana. Como ninguna sonda será complementaria a la región que tiene una mutación (22), no existirá hibridación en esa región, y la región permanecerá monocatenaria.

Después de la exposición a un agente de degradación que degrada preferentemente ácido nucleico monocatenario, el producto de hibridación se retira de la solución por su extremo unido. El uso de ácido nucleico diana unido posibilita explorar simultáneamente varias muestras retirando la parte unida de la solución y después analizando la fase en solución para segmentos de producto de degradación hibridado (es decir, bicatenario) (26) indicativo de la presencia de una mutación en el ácido nucleico diana. La presencia de uno o más segmentos de producto de degradación hibridado (26) en la solución es indicativa de que el ácido nucleico diana comprende una región que tiene mutación (22) que se degradó por el agente de degradación. La mutación se detecta exponiendo la solución a una fuente de luz en un espectrofotómetro a la longitud de onda de absorción específica, que revela las cantidades apreciables de producto de degradación fluorescente (26) indicativo de una mutación (22).

La Figura 2B ilustra una realización del método de la invención donde no está presente una mutación en una muestra de ácido nucleico diana. En esta realización, el ácido nucleico diana se une a una fase sólida o matriz de fase semisólida (10). El ácido nucleico diana se expone a una pluralidad de sondas (4) que están diseñadas para hibridar con la diana de modo que haya huecos que separan una o más de las sondas hibridadas. La sonda (4) diseñada para hibridar con el área del ácido nucleico diana más distal a la matriz (10) está marcada con un informador (12), por ejemplo, un radionucleótido o un fluoróforo.

El ácido nucleico diana y la pluralidad de sondas (4) se incuban en condiciones óptimas de tiempo, temperatura, concentración de sonda, tipo de sal, y concentración salina. La pluralidad de sondas (4) son complementarias a diferentes posiciones del ácido nucleico diana de modo que la hibridación de miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie de sondas (4), a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana, que están separadas por un hueco de ácido nucleico monocatenario. Preferiblemente se emplean condiciones de hibridación rigurosas que maximizan la hibridación específica mejorando la simetría de energía de enlace y proporcionando temperaturas de fusión similares para cada sonda. Esas condiciones de hibridación posibilitan que solamente las sondas complementarias hibriden con el ácido nucleico diana.

El producto de hibridación (18) de ácido nucleico diana y la sonda (4) después se expone a un agente, o como alternativa a condiciones empleadas con el agente, que no escinden el ácido nucleico diana en las separaciones de hueco monocatenario, pero que degradan una región de hueco monocatenario donde una o más sondas no lograron hibridar. El producto de hibridación (18) que comprende el ácido nucleico diana y las sondas, después se retira por su extremo unido de la solución. El uso de ácido nucleico diana unido posibilita explorar simultáneamente varias muestras retirando la parte unida de la solución y después analizando la fase en solución para el producto de degradación indicativo de una mutación. La ausencia del informador (12) que permanece en solución indica la ausencia de mutación en el ácido nucleico diana.

La Figura 2C muestra un diagrama de organigrama que ilustra una realización de la invención conde está presente una mutación en un ácido nucleico diana en la muestra. De acuerdo con esta realización, el ácido nucleico diana (8) que tiene una mutación (22) se une a una fase sólida o matriz de fase semisólida (10). El ácido nucleico diana (8) se expone a una pluralidad de sondas (4) diseñadas para hibridar con la diana (8) de modo que haya huecos que separan una o más de las sondas hibridadas y la sonda (4) diseñada para ser complementaria al área del ácido nucleico diana (8) más distal a la matriz (10) está marcada con un informador (12).

El ácido nucleico diana (8) y la pluralidad de sondas (4) se incuban en las condiciones de hibridación rigurosas descritas anteriormente. Las condiciones posibilitan la pluralidad de sondas (4) complementarias a diferentes posiciones del ácido nucleico diana de modo que la hibridación de miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie de sondas (4), a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana (8), que están separadas por un hueco de ácido nucleico monocatenario. Las condiciones de hibridación rigurosas posibilitan que solamente las sondas complementarias hibriden con el ácido nucleico diana.

La hibridación del ácido nucleico diana (8) y la sonda (4) después se expone a un agente, o como alternativa a las condiciones empleadas con el agente, que no escinden el ácido nucleico diana en las separaciones de hueco monocatenario, pero que degradan una región de hueco monocatenario donde una o más sondas no lograron hibridar. El producto de hibridación que comprende el ácido nucleico diana y las sondas después se retira por su extremo unido de la solución. La presencia de uno

o más segmentos de producto de degradación hibridado (28) incluyendo el informador marcado (12) que permanece en solución indica la presencia de mutación (22) en el ácido nucleico diana (8), porque la región monocatenaria de mutación (22) se degradó por el agente de degradación.

El siguiente ejemplo ilustra métodos de la invención útiles para detectar una mutación en la región de agrupación de mutaciones de APC en muestras preparadas a partir de deposiciones.

Ejemplo 1: Detección de mutación en la región de agrupación de mutaciones APC

Los métodos de la invención se usan para detectar la mutación puntual C → T en el codón 1450 en la región de agrupación de mutaciones APC, en http://perso.curie.fr/Thierry.Soussi/APC.html (última visita el 20 de febrero de 2001). Puede usarse cualquier muestra biológica que comprenda APC incluyendo, por ejemplo, una muestra de deposiciones. Para el análisis de muestras de deposiciones, los métodos preferidos de la invención comprenden obtener al menos una sección transversal o parte circunferencial de una deposición evacuada como se muestra en las patentes de Estados Unidos número 5.741.650, y 5.952.178, ambas cuales se incorporan por referencia en este documento. Aunque se deseable una sección transversal o parte circunferencial de deposición, los métodos proporcionados en este documento se realizan sobre muestras aleatorias obtenidas de deposiciones evacuadas, que incluyen frotis o raspados. Una vez obtenida, la muestra de deposición se homogeneiza. Un tampón preferible para la homogeneización es uno que contiene ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) al menos 16 mM, como se muestra en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente, del mismo propietario que la presente, número de serie 09/491.093, incorporada por referencia en este documento. Se ha descubierto que el uso de EDTA al menos 16 mM, y preferiblemente EDTA 100 mM o más mejora el rendimiento de ácido nucleico a partir de la deposición. Por tanto, un tampón preferido para la homogeneización de deposiciones comprende solución salina tamponada con fosfato, NaCl o KCl 20-100 mM, EDTA al menos 16 mM, y opcionalmente un detergente (tal como SDS) y una proteinasa (por ejemplo, proteinasa K).

Después de la homogeneización, el ácido nucleico preferiblemente se aísla de la muestra de deposición. El aislamiento o la extracción del ácido nucleico no es necesario en todos los métodos de la invención, ya que los métodos de la invención pueden realizarse adecuadamente en deposición homogeneizada sin aislamiento de ácidos nucleicos. En una realización preferida, sin embargo, la deposición homogeneizada se centrifuga para crear un sobrenadante que contiene ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, y otros desechos celulares. El sobrenadante se trata con un detergente y proteinasa para degradar las proteínas, y el ácido nucleico se extrae con fenol-cloroformo. Los ácidos nucleicos extraídos después se precipitan con alcohol. Pueden usarse otras técnicas para aislar el ácido nucleico de la muestra. Dichas técnicas incluyen la captura de híbridos, y la amplificación directamente de la deposición homogeneizada. Los ácidos nucleicos pueden purificarse y/o aislarse al grado necesario por el ensayo de exploración a emplear.

El ácido nucleico después se mezcla con perlas Dynal recubiertas con estreptavidina, que proporciona una matriz en fase sólida. La mezcla de ácido nucleico y perlas se agita con vórtice y se incuba, lo que une las perlas al ácido nucleico. El ácido nucleico puede amplificarse por PCR, lo que requiere mezclar el molde de ácido nucleico con tampones de unión y lavado. La mezcla de ácido nucleico se agita con vórtice. El sobrenadante se retira, y se añade tampón. Después se repiten estas etapas varias veces.

Se emplean sondas de ácido nucleico diseñadas para ser complementarias a regiones consecutivas de la región de agrupación de mutaciones APC conocida. Las sondas son de longitud uniforme y están marcadas de forma fluorescente. La sonda y el ácido nucleico diana que comprende una mutación puntual en el codón 1450 se incuban en condiciones que maximizan la selectividad de hibridación. Se eliminan las disparidades en la temperatura de fusión de las sondas, mejorando la selectividad, cuando se emplea una combinación adecuada de condiciones de hibridación de temperatura, tiempo, concentración de sonda, tipo de sal y concentración salina. El TMAC es el agente seleccionado para mejorar la selectividad de hibridación.

Las sondas están diseñadas para detectar mutaciones en el codón 1450 en la región de agrupación de mutaciones APC. Cuando se hibridan en estas condiciones de hibridación selectivas, la presencia de una única mutación en la región de agrupación de mutaciones evitará que la sonda complementaria hibride, de modo que una parte de la región permanece monocatenaria.

Las sondas complementarias consecutivas están diseñadas para hibridar con la región de agrupación de mutaciones APC de tipo silvestre donde el extremo 5' de esta región es (5'-CTCCACCACCTCCTCAAACAGCTCAAACC AAGCGAGAAGTACCTAAAAATA-3', SEC ID Nº 1).

En el experimento, cada sonda comprende 17 nucleótidos, y el extremo 5' de la sonda complementaria diseñada para la región del codón 1450 es (5'CGCTTGGTTTGAGCTGT-3', SEC ID Nº 2). La sonda complementaria cadena arriba de la región de la mutación puntual del codón 1450 es (5'-TTGAGGAGGTGGTGGAG3', SEC ID Nº 3). La sonda complementaria cadena debajo de la región de la mutación puntual del codón 1450 es (5'-TATTTTTAGGTACTTCT-3', SEC ID Nº 4). Las sondas y la muestra de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual en el codón 1450 en la región de agrupación de mutaciones se incuban en condiciones que maximizan la selectividad de hibridación. La sonda complementaria a la región de tipo silvestre, SEC ID Nº 2, no hibridará con la secuencia que comprende la mutación puntual en el codón 1450 (C → T en la mutación puntual del codón 1450), (5'ACAGCTCAAACCAAGTG-3' SEC ID Nº 5). La mutación puntual en el codón 1450 evita la hibridación y la parte de la región APC que contiene la mutación permanecerá monocatenaria.

Después de la hibridación, las sondas no hibridadas se retiran lavando la mezcla de ácido nucleico en condiciones de tiempo, temperatura, tipo de sal y concentración salina que conservan los híbridos ácido nucleico:sonda. La exposición a la enzima S1 escinde el ácido nucleico diana en la región monocatenaria que comprende la mutación puntual en el codón 1450, donde la sonda complementaria no logró hibridar.

Los productos de degradación se separan por electroforesis en gel y se analizan usando un espectrofotómetro. La presencia de mutación se detecta por la presencia de uno o más productos de degradación, comprendiendo cada uno ácidos nucleicos bicatenarios que emiten fluorescencia tras la excitación a la longitud de onda apropiada del espectrofotómetro.

Ejemplo 2: Sondas que bloquean las variantes polimórficas en el codón 1493

Generalmente, un polimorfismo de un único nucleótido está asociado con cada región que tiene 1.000 pares de bases nucleotídicas. De acuerdo con los métodos de la invención, las variantes polimórficas asociadas se factorizan en el diseño de la sonda de modo que los polimorfismos asociados se "bloqueen" y puedan detectarse otras alteraciones.

Es posible evitar detectar una variante polimórfica como un falso positivo en un ácido nucleico diana. Esto proporciona una oportunidad para la detección de alteraciones de novo en dichas dianas. La Figura 3 ilustra métodos de la invención empleados para bloquear el polimorfismo G → A en el codón 1493 de la región de agrupación de mutaciones APC, para posibilitar la detección de novo.

Puede usarse cualquier muestra biológica que comprenda un polimorfismo asociado, por ejemplo, una muestra de tejido, deposiciones o sangre. Para este análisis, se ensayaron por separado muestras de sangre de seis individuos. La serie de muestras incluía una base de variante polimórfica en el codón 1493. Para propósitos de control en este experimento, se realizó secuenciación del genotipo en las seis muestras individuales antes de realizar el análisis ilustrado en la Figura 3. La secuencia de control confirmó que la serie de muestras que se estaba ensayando incluía dos individuos homocigóticos que tenían dos bases G, dos individuos homocigóticos que tenían una base A y una base G, y dos individuos homocigóticos que tenía dos bases A.

Cada muestra individual se analizó del siguiente modo. Se extrajo el ácido nucleico de cada muestra de deposición individual. El ácido nucleico después se mezcló con perlas Dynal magnéticas recubiertas con estreptavidina, que proporcionaron una matriz en fase sólida. La mezcla de ácido nucleico y perlas se agitó con vórtice y se incubó para unir las perlas al ácido nucleico. El ácido nucleico después de ello se amplificó por PCR, que requería mezclar el molde de ácido nucleico con tampones de unión y lavado. Durante el proceso de PCR, se biotiniló el cebador inverso de PCR. El producto de PCR se desnaturalizó y se hizo monocatenario. La mezcla de ácido nucleico se agitó con vórtice. El sobrenadante se retiró, y se añadió tampón.

Las sondas de ácido nucleico se diseñaron para que fueran complementarias al ácido nucleico diana incluyendo las variantes polimórficas en el codón 1493 de la región de agrupación de mutaciones APC. Las sondas son de longitud uniforme de 17 pares de bases de longitud. Las sondas están diseñadas de modo que después de la hibridación de la sonda colocada en segunda posición desde el extremo libre del ácido nucleico diana (es decir, el extremo del ácido nucleico diana que no está unido a la perla) tiene un informador P32 en su extremo 5'. Las sondas y el ácido nucleico diana se hibridan a 59ºC durante una hora. La solución de hibridación era una mezcla de cloruro de tetrametilamonio (TMA) 3 molar; EDTA 1 mM; tampón fosfato 10 mM a un pH de 6,8; 5X de solución de Denhardt; 0,04 mg/ml de ARN de levadura; SDS al 0,1% de la mezcla y entre aproximadamente 0,04 micromolar y aproximadamente 0,64 micromolar de la mezcla de sondas. El tubo se expone a un imán que atrae las perlas magnéticas y retiene el ácido nucleico diana que está unido a las perlas y se retira el sobrenadante.

Después de la hibridación, las sondas no hibridadas se retiraron lavando la mezcla de ácido nucleico en condiciones que conservan los híbridos de ácido nucleico:sonda. La solución de hibridación se lavó una serie de veces en condiciones variables de tiempo y temperatura. La solución de lavado contenía una mezcla de cloruro de tetrametilamonio (TMA) 3 molar; EDTA 1 mM; tampón fosfato 10 mM a un pH de 6,8; y SDS al 0,1% de la mezcla. Después de cada lavado, el tubo se expone a un imán que atrae las perlas magnéticas y retiene el ácido nucleico diana que está unido a las perlas y se retira el sobrenadante. En el primer lavado, la solución de hibridación se mezcló con la solución de lavado a 59ºC durante 15 minutos. Después de ello, en el segundo lavado, la solución de hibridación se mezcló con la solución de lavado a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, durante 1 minuto. En el tercer lavado, la solución de hibridación se mezcló con la solución de lavado a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, durante aproximadamente 1 minuto.

En un tubo de ensayo, el ácido nucleico diana se expuso a 0,015 unidades por microlitro de la enzima S1, en el tampón que contenía acetato sódico 50 mM, NaCl 280 mM, y ZnSO4 4,5 mM, por microlitro de la reacción de corte durante treinta minutos a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC. La reacción es una reacción de 100 microlitros. La exposición a la enzima S1 escinde cualquier región monocatenaria del ácido nucleico diana. El tubo se expone a un imán que atrae las perlas magnéticas y retiene el ácido nucleico diana que está unido a las perlas. El sobrenadante se extrae por pipeteo del tubo y se mezcla con un colorante de carga.

El sobrenadante se procesa en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 6% a una velocidad de 1.200 voltios horas. El gel se expone a una cámara instantánea, que recoge la radiactividad. El gel se analizar para el tamaño de los fragmentos y cualquier corte en el ácido nucleico diana puede determinarse por el tamaño del producto en el gel.

Con referencia a la Figura 3, el carril 1 muestra los resultados experimentales donde las seis muestras que se estaban ensayando se expusieron a sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G. Las seis muestras incluyen dos individuos que tiene dos bases G, dos individuos que tienen una base A y una base G, y dos individuos que tienen dos bases

A. Con referencia a la muestra de los dos individuos que tienen dos bases G, el producto en el gel muestra que la exposición al agente, S1, no cortó la diana. El ácido nucleico diana no se cortó porque las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G hibridaron con el ácido nucleico diana de los dos individuos que tenían dos bases G. Con referencia de nuevo al carril 1, se expusieron las muestras de dos individuos que tenían una base A y una base G a las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G. Las sondas hibridaron con la variante G de los dos individuos que tenían una base A y una base G. Sin embargo, ninguna sonda hibridó con la variante polimórfica de la muestra diana donde el codón 1493 es una A y después de la exposición al agente S1, l región monocatenaria en el codón 1493 se cortó generando un producto en el gel. Finalmente, en el carril 1, se expusieron las muestras de dos individuos que tenían dos bases A a las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G. Ninguna sonda hibridó con la variante polimórfica de los dos individuos que tenían dos bases A, y la exposición al agente, S1, cortó la diana en la región de la variante polimórfica generando un producto en el gel.

Con referencia a la Figura 3, el carril 2 muestra los resultados experimentales donde las seis muestras que se estaban ensayando se expusieron a sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A. De nuevo, las seis muestras incluyen dos individuos que tienen dos bases G, dos individuos que tienen una base A y una base G, y dos individuos que tiene dos bases A. Con referencia a la muestras de los dos individuos que tienen dos bases G, el producto en el gel muestra que la exposición al agente, S1, cortó la diana en la región de la variante polimórfica dejando un producto en el gel. El ácido nucleico diana se cortó porque las sondas que incluyen la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A no lograron hibridar con el ácido nucleico diana de los dos individuos que tenían dos bases G. Con referencia al carril 2, se expusieron las muestras de dos individuos que tenían una base A y una base G a las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A. Las sondas hibridaron con la variante A de los dos individuos que tenían una base A y una base G. Sin embargo, ninguna sonda hibridó con la variante polimórfica de la muestra diana donde el codón 1493 es G y tras la exposición al agente S1, la región monocatenaria en el codón 1493 se cortó generando un producto en el gel. Finalmente, en el carril 2 se expusieron las muestras de dos individuos que tenían dos bases A a las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A. El producto en el gel muestra que la exposición al agente, S1, no cortó la diana. El ácido nucleico diana no se cortó porque las sondas diseñadas para ser complementarias a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A hibridaban con el ácido nucleico diana de los dos individuos que tenían dos bases A.

Con referencia a la Figura 3, el carril 3 muestra los resultados experimentales donde las seis muestras que se estaban ensayando se expusieron a dos series diferentes de sondas: una diseñada para ser complementaria a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A y una diseñada para ser complementaria a la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G. De nuevo, las seis muestras incluyen dos individuos que tienen dos bases G, dos individuos que tienen una base A y una base G, y dos individuos que tienen dos bases A. Con referencia de nuevo al carril 3, la exposición a las series de sondas diseñadas para ser complementarias tanto a la variante polimórfica A como a la variante polimórfica G tuvieron éxito en el bloqueo de la región del codón 1493 en las seis muestras. Por tanto, ambas sondas de variante polimórfica bloquen de forma satisfactoria las variantes polimórficas en los ácidos nucleicos diana ensayados y, de acuerdo con los métodos de la de la invención, puede detectarse cualquier otra alteración en la diana.

Finalmente, con referencia a la Figura 3, el carril 4 muestra los resultados experimentales donde, de nuevo, se ensayaron seis muestras, las muestras de dos individuos que tienen dos bases G, dos individuos que tienen una base A y una base G, y dos individuos que tienen dos bases A. Las seis muestras que se estaban ensayando se expusieron a sondas donde ninguna sonda estaba diseñada para ser complementaria a las variantes polimórficas presentes en las seis muestras. Con referencia de nuevo al carril 4, tras la exposición al agente S1, la región monocatenaria en el codón 1493 tanto para la variante polimórfica donde el codón 1493 es una A como para la variante polimórfica donde el codón 1493 es una G se cortaron generando un producto en el gel. Por tanto, de acuerdo con los métodos de la invención, pueden diseñarse sondas para bloquear el polimorfismo G → A en el codón 1493 de APC para posibilitar la detección de otras alteraciones en el ácido nucleico diana.

Ejemplo 3: Detección de mutaciones por una señal de un resto informador de la sonda

Este ejemplo no ilustra la invención reivindicada.

En otra realización, con referencia a la Figura 4A, se coloca un resto inactivador (34) en un extremo y se coloca un resto informador (32) en el otro extremo de cada una de las sondas (30) de modo que la ausencia de hibridación de una sonda provoque que el informador de una sonda adyacente no logre inactivarse produciendo una señal informadora (35). Por consiguiente, una alteración se detecta por la señal

(35) del resto informador (32) que se produce cuando una sonda (30) no logra hibridar con la diana en el sitio de la alteración. El resto informador (32) o informador puede detectarse mediante un lector de placa fluorescente o como alternativa con un aparato de gel equipado con detección fluorescente. No se requiere un agente de degradación para detectar la presencia o ausencia de mutación en el ácido nucleico diana en este método de la invención. Por consiguiente, puede evitarse el análisis en serie empleando este método de la invención.

La Figura 4B ilustra el resto informador (32) de una primera sonda (30) hibridada con el resto inactivador (34) de una segunda sonda (30). El resto inactivador

(34)

inactiva o suprime la señal (35) del resto informador (32). El resto inactivador (34) se conjuga a un brazo en un extremo de la sonda (30) y el resto informador (32) se conjuga a un brazo en el otro extremo de la sonda (30), y cada brazo puede incluir una secuencia. En una realización, las secuencias en el brazo conjugado al resto inactivador (34) están diseñadas para hibridar con el brazo conjugado a cualquier resto informador (32). En una realización, las secuencias en los brazos no son específicas para la secuencia complementaria al ácido nucleico diana. Las secuencias en cada brazo pueden variar entre aproximadamente 1 par de bases y aproximadamente 7 pares de bases.

La Figura 4C muestra un diagrama de organigrama que ilustra un método de la invención que usa sondas que tienen un resto informador (32) y un resto inactivador

(34)

y donde no hay mutaciones presentes en un ácido nucleico diana. De acuerdo con este método, cuando se mezcla junta una serie de sondas (30), como se ilustra en las Figuras 4A y 4B, por ejemplo, en solución, el brazo conjugado a cada resto inactivador (34) hibridará con el brazo conjugado a cada resto informador (32). Por consiguiente, cada resto informador (32) se inactiva por cada resto inactivador (34) adyacente y la mezcla de sondas (30) en solución no presenta señal informadora.

Después de ello, se expone un ácido nucleico diana (6) a la mezcla de sondas

(30)

para formar un producto de hibridación (20). De acuerdo con el método, las condiciones de hibridación posibilitan que solamente las sondas complementarias hibriden con el ácido nucleico diana (6). Cuando el producto de hibridación (20) no logra presentar ninguna señal, se detecta la ausencia de mutación en el ácido nucleico diana (6).

La Figura 5 muestra un diagrama de organigrama que ilustra un método de la invención que usa sondas que tienen un resto informador (32) y un resto inactivador

(34)

y donde está presente una mutación (22) en un ácido nucleico diana (8). De acuerdo con este método, cuando se prepara una mezcla de sondas (30), como se ha descrito anteriormente con referencia a las Figuras 4A-4C, la mezcla de sondas (30) no presenta señal informadora (35).

Después de ello, se expone un ácido nucleico diana (8) a la mezcla de sondas

(30)

para formar un producto de hibridación (20). Las condiciones de hibridación posibilitan que solamente las sondas complementarias (30) hibriden con el ácido

nucleico diana (8). Como ninguna sonda (30) será complementaria a la región que tiene una mutación (22), no sucederá hibridación en la región de la mutación (22) y la región de la mutación permanecerá monocatenaria. Cuando una sonda (30) no logra hibridar en la región de la mutación (22), entonces el resto informador (32) adyacente 5 a la región que tiene la mutación (22) presentará una señal (35), indicando la señal

(35) la presencia de mutación (22).

En los ejemplos descritos anteriormente, se describen realizaciones de la invención donde un ácido nucleico diana no contiene mutación por separado de realizaciones de la invención donde un ácido nucleico diana contiene una mutación.

10 Sin embargo, de acuerdo con la invención, una muestra puede ser heterogénea y contener moléculas de ácido nucleico diana que son mutantes o están alteradas además de moléculas de ácido nucleico diana que no son mutantes o no están alteradas. Los métodos de la invención son útiles para detectar un ácido nucleico diana

15 mutante o alterado en una mezcla heterogénea que contiene ácido nucleico diana no mutante o no alterado, porque el ácido nucleico no mutante o no alterado no impide la generación de una señal debida a la presencia del ácido nucleico mutante o alterado. En realizaciones preferidas, se realiza un ensayo de detección de la invención sobre una muestra o fracción de muestra que se ha enriquecido para el ácido nucleico diana

20 mutante o alterado usando métodos descritos en este documento o conocidos en la técnica.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Exact Sciences Corporation Shuber, Anthony

<120> Método para la detección de alteraciones.

<130> EXT-047PC

<150> US 09/809.713

<151> 15-03-2001

<150> US 09/988.491

<151> 20-11-2001

<160> 5

<170> PatentIn versión 3.0

<210> 1

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 ctccaccacc tcctcaaaca gctcaaacca agcgagaagt acctaaaaat a 51

<210> 2

<211> 17

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda diseñada para la región del codón 1450

<400> 2 cgcttggttt gagctgt

<210> 3

<211> 17

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sonda cadena arriba de la región de la mutación puntual 1450

<400> 3 ttgaggaggt ggtggag

17

<210> 4 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sonda cadena abajo de la mutación puntual 1450

<400> 4 tatttttagg tacttct

17

<210> 5 <211> 17 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 5 acagctcaaa ccaagtg

17

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

   a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica una agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que al menos un miembro de dicha pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios comprende un extremo con un donante y un extremo con un inactivador.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

   a) diluir una muestra biológica; y, b) separar dicha muestra biológica en fracciones de muestra separadas.

4. 4.

   Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

   a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de sondas que hibridan con una región de dicho ácido nucleico diana de modo que un hueco separa una o más de las sondas hibridadas adyacentes, si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente en condiciones que degradan ácidos nucleicos monocatenarios más grandes que dicho tamaño de hueco; y c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de las degradación dentro de dicha región monocatenaria de dicho ácido nucleico diana.

5. 5.

   Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana polimórfico que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

   a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana polimórfico, una pluralidad de sondas, comprendiendo dicha pluralidad sondas complementarias a cada variante polimórfica de dicho ácido nucleico diana, de modo que dichas sondas hibriden de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

6. 6.

   Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

   a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

7. 7.

   El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha alteración es una mutación asociada a enfermedad; y opcionalmente: (a) dicha enfermedad es cáncer; o (b) dicho método comprende adicionalmente la etapa de determinar la identidad de dicha alteración en dicho ácido nucleico diana.

8. 8.

   El método de la reivindicación 1 o reivindicación 6, en el que: (a) al menos un miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios comprende un marcador detectable; o (b) dicho ácido nucleico diana que se sospecha que está en dicha muestra biológica comprende un marcador detectable; y en cualquier caso (a) o

   (b) opcionalmente dicho marcador detectable se selecciona entre el grupo compuesto por una marca fluorescente, un isótopo radiactivo, y un marcador de peso molecular.
9. 9. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 6 en el que: (a) cada miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios es entre aproximadamente 8 y 30 nucleótidos de longitud; (b) cada miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos

   monocatenarios tiene una temperatura de fusión de hibridación aproximadamente equivalente con dicho ácido nucleico diana; (c) dicho ácido nucleico diana se une a un soporte sólido; y opcionalmente el extremo 5' de dicho ácido nucleico diana se une a dicho soporte sólido, o el extremo 3' de dicho ácido nucleico diana se une a dicho 5 soporte sólido; (d) dicha muestra biológica comprende un tejido o fluido corporal; (e) dicho agente es una enzima, y opcionalmente dicha enzima se selecciona entre el grupo compuesto por nucleasa S1, MutY, MutS y de fríjol mungo; (f) dicho agente es un agente químico; (g) dicha alteración es una mutación asociada a enfermedad y se selecciona entre el grupo compuesto por inserciones, deleciones, reordenamientos, 10 transiciones, traslaciones, transversiones, y sustituciones de nucleótidos; (h) dicha muestra biológica comprende un tejido o fluido corporal seleccionado entre el grupo compuesto por esputo, fluido pancreático, bilis, linfa, plasma, orina, fluido cefalorraquídeo, fluido seminal, saliva, aspirado del pezón de la mama, pus, tejido de biopsia, células fetales, y fluido amniótico; (i) dicha muestra biológica es una muestra

   15 de deposiciones; (j) dicha alteración es un polimorfismo de un único nucleótido; (k) dicha alteración es heredada; o (1) dicha alteración existe como una subpoblación en una muestra heterogénea.
10. 10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en

    20 el que el agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios escinde selectivamente ácido nucleico monocatenario.