WO2003083106A1 - Procede permettant de tester un acide nucleique cible et kit associe - Google Patents

Procede permettant de tester un acide nucleique cible et kit associe Download PDF

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WO2003083106A1
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target nucleic
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Yoshiyuki Hotta
Ayako Hasegawa
Satoru Ito
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Fujirebio Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a target nucleic acid and a kit therefor.
  • the method of the present invention is useful for detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) and for determining the conjugate type of a gene.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Nucleic acid mutations are determined by cleaving the isolated nucleic acid with a restriction enzyme and detecting the nucleic acid fragment on a gel (eg, agarose, acrylamide, etc.) by electrophoresis.
  • a restriction enzyme e.g, agarose, acrylamide, etc.
  • electrophoresis e.g., electrophoresis
  • this method requires a long time for cleavage of the nucleic acid by the restriction enzyme and requires time and labor by reelectrophoresis.
  • the use of carcinogenic ethylene bromide requires special consideration for its disposal.
  • the method described in Cytometry 39: 131-140 (2000) describes that a target nucleic acid, a fluorescent dye-labeled probe complementary to the target nucleic acid, a base sequence portion complementary to the target nucleic acid adjacent to the labeled probe, A probe having a base sequence complementary to the particle-immobilized probe is hybridized, ligated with a ligase, then hybridized with the particle-immobilized probe, and the fluorescence intensity of the labeled probe bound to the particle is measured with a flow cytometer. It is a method of measuring with. If a mutant sequence exists between the adjacent sequences of the two probes, ligation is not established, the labeled probe does not bind to the particles, and no fluorescence is observed. The presence or absence of the target nucleic acid is determined using the difference. This measurement method has the disadvantage that it takes time to perform the hybridization again after the ligation operation.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring a target nucleic acid, which can easily detect SNP and quantify a target nucleic acid in a short time without requiring a skilled technique.
  • the present inventors have conducted intensive studies and, as a result, have found that a target nucleic acid is hybridized with the target nucleic acid. Reacting the immobilized probe and the labeled probe to measure the target nucleic acid by measuring the label bound to the support, and the end of the region where the immobilized probe hybridizes. By further reacting the region with an unlabeled probe that hybridizes to the overlapping region, surprisingly, the specificity of the reaction between the immobilized probe and the target nucleic acid is increased, and differences between single nucleotides can be identified. The inventors have found that it is possible and completed the present invention.
  • the present invention provides a target nucleic acid, a labeled probe comprising a labeled nucleic acid which hybridizes with the target nucleic acid, and a base complementary to a region in the target nucleic acid which is different from the region to which the labeled probe hybridizes.
  • An unlabeled probe consisting of a nucleic acid having a sequence and a nucleic acid having a base sequence complementary to a region in the target nucleic acid that is different from the region to which the labeled probe hybridizes are bound to a support. Reacting with the solid-phased probe, and measuring the label of the labeled probe bound to the support, wherein the non-labeled 1 probe hybridizes.
  • a method for measuring a target nucleic acid wherein an end region of a region and an end region of a region where the immobilized probe hybridizes is provided.
  • the present invention applies the above-described method of the present invention to a test sample containing a target nucleic acid or a mutant nucleic acid having a single nucleotide polymorphism in the target nucleic acid.
  • a method for detecting a single nucleotide polymorphism which comprises determining whether the target nucleic acid is a mutant nucleic acid.
  • the present invention applies the above-described method of the present invention to a test sample containing a normal gene and an abnormal gene containing a single nucleotide mutation polymorphism, which are alleles. It is intended to provide a method for judging the zygosity of a gene, which comprises judging the zygosity of the gene in a test sample from a measurement result. Furthermore, the present invention provides a nucleic acid measurement kit used at least for the method of the present invention, the kit comprising at least the labeled probe, the unlabeled probe, and the solid-phased probe.
  • a method for measuring a target nucleic acid which can easily detect SNP and quantify a target nucleic acid in a short time. According to the method of the present invention, it is possible to discriminate a difference of only one base, and it is possible to discriminate a conjugate type of an allele having a difference of only one base.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequences of the target nucleic acids and various probes used in the examples of the present invention, and the regions to be hybridized.
  • Fig. 3 is a graph showing the change in fluorescence intensity according to the position of the unlabeled probe.
  • the numbers on the horizontal axis indicate the positions of the unlabeled probes corresponding to the base sequence of FUT III DMA.
  • the 5 'side and the 3' side of the immobilized probe indicate the number of overlapping bases.
  • FIG. 4 is a graph showing a change in fluorescence intensity over time depending on whether or not an unlabeled probe is added.
  • FIG. 5 is a graph showing the difference in fluorescence intensity depending on the genotype (homotype and heterotype) of the target nucleic acid.
  • the method of the present invention comprises the steps of annealing target nucleic acid 10, labeled probe 12, immobilized probe 14, and unlabeled probe 16 to form target nucleic acid 10, labeled
  • the probe 12, the immobilized probe 14 and the unlabeled probe 16 are each hybridized, and the support nucleic acid 10 is immobilized on the support 18 on which the immobilized probe 14 is immobilized.
  • the target nucleic acid 10 in the test sample is measured by measuring the label 19 of the labeled probe 12 bound thereto.
  • the target nucleic acid 10 is a nucleic acid to be measured, and is not limited at all. Examples include, but are not limited to, genomic genes and cDNA of humans and other organisms, genes of pathogenic microorganisms and viruses, and the like. Since the method of the present invention is a highly specific method capable of discriminating even a single base difference, it can be applied to the detection of SNP. In some cases, it is especially effective.
  • the target nucleic acid may be DNA or RNA, or may be an artificial nucleic acid capable of hybridizing with these.
  • the target nucleic acid is PC It may be a nucleic acid amplified by a nucleic acid amplification method such as R, or a non-amplified nucleic acid.
  • “measurement” includes both detection and quantification.
  • the size of the target nucleic acid is not particularly limited, it usually has a size of 40 bases or more, preferably 60 bases or more because it is necessary to hybridize with three types of probes. Although there is no particular upper limit on the size of the target nucleic acid, it is usually preferably about 100 to 500 bases.
  • the labeled probe 12 is a label that labels a nucleic acid that hybridizes with a region in the target nucleic acid.
  • the labeled probe preferably has a base sequence complementary to a region in the target nucleic acid to which it hybridizes (hereinafter, may be referred to as a “labeled probe hybridizing region”). if it shall be target nucleic acid Haiburidizu in hybrida I See Chillon conditions of phased probe and the target nucleic acid, usually 1 0% or less, especially 5 0/0 non-complementary nucleotide in the number of degrees below May be included.
  • the size of the labeled probe is not particularly limited as long as it has a size effective for detecting the target nucleic acid, and is preferably 15 bases or more, particularly preferably about 20 to 50 bases. .
  • the label bound to the labeled probe may be any label as long as the probe can be measured, and any label used in a conventional labeled probe can be employed. That is, fluorescent labels, radioactive labels, enzyme labels, biotin labels and the like can be mentioned. Of these, fluorescent labels are preferred because they can be measured safely without using expensive equipment and do not interfere with hybridization with the target nucleic acid.
  • the label may be attached to any part of the probe, and such attachment can be performed by a well-known method. Further, the probe may be DNA or RNA, or may be an artificial nucleic acid capable of hybridizing with these.
  • the immobilized probe 14 is a region within the target nucleic acid 10 that is different from the labeled probe hybridizing region (hereinafter, may be referred to as “immobilized probe hybridizing region J”).
  • a nucleic acid having a complementary base sequence is immobilized on a support.
  • the size of the immobilized probe is not particularly limited, and has a size effective for detecting the target nucleic acid. 15 bases or more are preferable. About 20 to 50 bases is preferred. Any support can be used as long as it can immobilize nucleic acids.Polystyrene particles, glass particles, latex particles, etc., and a magnetic force is applied by blending them with a fiber, etc. Examples thereof include magnetic particles and the inner wall of a microplate well.
  • the support is preferably bound to the end of the nucleic acid so that the hybridization between the immobilized probe and the target nucleic acid is not hindered.
  • the solid-phase immobilization of the nucleic acid on the support can be carried out by a well-known method.Polystyrene particles or the like having a functional group such as a carboxyl group bonded to the surface thereof for easy binding of the nucleic acid are commercially available. Any commercially available particles for immobilizing nucleic acids can be preferably used.
  • the nucleic acid of the immobilized probe 14 may be directly bound to the support 18 or may be supported via a spacer region having a base sequence not involved in hybridization with the target nucleic acid. It may be attached to the body, As described above, the present invention also refers to a case where a nucleic acid having a sequence complementary to a solid-phased probe hybridizing region is indirectly bound to a support via a spacer region.
  • the unlabeled probe 16 is a nucleic acid having a base sequence complementary to a region different from the labeled probe hybridizing region in the target nucleic acid 10.
  • the size of the unlabeled probe is not particularly limited, and may have a size effective for detecting the target nucleic acid, and is preferably 15 bases or more, and particularly preferably about 20 to 50 bases.
  • the unlabeled probe hybridizing region and the immobilized probe hybridizing region have overlapping end regions (hereinafter, this overlapping portion is referred to as “overlapping region J”.
  • the overlapping region is indicated by reference numeral 20 in A of Fig. 1.
  • the size of the overlapping region is not particularly limited, but is preferably 1 to 5 bases, and more preferably 1 to 3 bases.
  • the method of the present invention exhibits an excellent effect that, when a mutant form of the target nucleic acid, particularly SNP, is present, the target nucleic acid can be specifically measured by distinguishing such single nucleotide mutation.
  • the immobilized probe is set so that the site where this mutation occurs is located in the immobilized probe hybridizing region. It is preferable that the mutated site is located one base (adjacent to the end of the overlapping region) to 5 bases away from the overlapping region 20.
  • the site of the mutated base on the target nucleic acid 10 is denoted by c
  • the base in the solid-phased probe 14 that matches Y is denoted by X.
  • a nucleic acid that is mutated from a target nucleic acid is called a mutant type
  • the mutant type does not necessarily mean an abnormal type.
  • an abnormal type is used as a target nucleic acid for the purpose of detecting an abnormal type gene, the normal type becomes a mutant type.
  • the 5'-end region of the immobilized probe hybridizing region and the 3'-end region of the unlabeled probe hybridizing region overlap.
  • these probes may be set so that the 3 'terminal region of the immobilized probe hybridizing region and the 5' terminal region of the unlabeled probe hybridizing region overlap ( However, in this case, the 3 ′ side of the nucleic acid of the solid-phased probe is immobilized on the support).
  • the labeled probe hybridizing region may be at any position that does not overlap with the unlabeled probe hybridizing region and the immobilized probe hybridizing region.
  • the target nucleic acid 10 is hybridized with the labeled probe 12, the immobilized probe 14, and the unlabeled probe 16.
  • kinds of nucleic acids may be reacted simultaneously, target nucleic acid 10 may be sequentially reacted with an arbitrary probe, or target nucleic acid 10 may be reacted with any two types of probes. Thereafter, a third probe may be reacted.
  • the reaction conditions are not particularly limited and are appropriately selected depending on the size of the probe and the like.Hybridization under the condition where the target nucleic acid 10, the immobilized probe 14 and the unlabeled probe 16 coexist is performed.
  • the sorption reaction is usually carried out at 30 ° C. to 60 ° C.
  • the hybridization reaction under the condition that either the immobilized probe 14 or the unlabeled probe 12 does not exist can be performed in the same manner as described above, or under the condition of cooling from high temperature to low temperature. May go.
  • the target nucleic acid 10, the labeled probe 12, and the unlabeled probe 16 are reacted first, and then the solid-phased probe 14 is reacted.
  • the reaction between the lobe 12 and the unlabeled probe 16 is performed under the condition that the reaction solution is ice-cooled from the denaturation temperature (95 ° C).
  • the target nucleic acid and the probe can be hybridized because the temperature always passes through the temperature at which hybridization occurs.
  • the label 19 bound to the support 18 is measured.
  • the measurement of the label 19 can be performed by a well-known method corresponding to each label. If the support 18 is particles, collect the support 18 by centrifugation or magnetic force (in the case of magnetic particles), and then measure the label.
  • the target nucleic acid 10 is present in the test sample, the labeled probe 12 is bound to the support 18 via the nucleic acid portion of the target nucleic acid 10 and the immobilized probe 14 and the target nucleic acid 10 is present. Otherwise, the target nucleic acid 10 in the test sample can be detected by measuring the label 19 bound to the support 18 because it is not bound to the support 18.
  • the target nucleic acid 10 can be quantified by quantifying the label 19. It is also possible.
  • the nucleic acid in the test sample can be a target nucleic acid or a mutation based on the measurement results. It is possible to determine whether it is a type nucleic acid. This will be described with reference to FIG. 1B, 10 ′ indicates a mutated nucleic acid in which the base Y in the target nucleic acid 10 in FIG. 1A has a base mutation, and a base in which the base Y has been mutated is indicated by ⁇ .
  • the mutant nucleic acid 10 ′ having a single base mutation and the immobilized probe 14 do not hybridize as shown in FIG. 1B, or a part of the immobilized probe 14 hybridizes. Even so, the number of the immobilized probes that hybridize becomes smaller than the number of the immobilized probes that hybridize to the target nucleic acid so as to be discernible. For this reason, the amount of the label bound to the support 18 is reduced to an identifiable level, and therefore, it is possible to determine whether the nucleic acid contained in the test sample is a target nucleic acid or a mutant.
  • the method of the present invention makes it possible to determine whether the target gene is homozygous or heterozygous.
  • the amount of labeling measured when the target nucleic acid is homozygous is the largest, followed by the case where the target nucleic acid and the mutant form are heterozygous, followed by the case where the mutant form is homozygous Is the least. Therefore, by measuring the amount of the label bound to the support according to the method of the present invention, it becomes possible to determine the junction type of the allele.
  • the present invention also provides a kit for nucleic acid measurement which includes at least the labeled probe, the unlabeled probe, and the immobilized probe, and is used in the method of the present invention. These components are as described above.
  • the kit may further contain a buffer solution and the like used for the reaction.
  • the FUTI II gene transfers fucose to the sugar chain terminus to allow blood group antigens and cancer-associated antigens (GA1
  • MO BI0 ULTRA CLEAN DNA Purification kit: Catalog # 12100-300> was followed by measuring the concentration from the absorbance at A260 to prepare. The combinations of the primers used for the amplification of the nucleic acid containing each mutated portion are shown below.
  • Nucleic acids targeted to the mutated portion of the 59th base have a sense side of 1-2 0th atggatcccctgggtgcagc: 20mer>, antisense side 180 to 200th ag caggatcaggagggtggg: 1st to 200th 200bp> using 20mer> primer, targeting mutation at 508th base
  • the sense side is 407 to 431 # @ ⁇ acttggagccaccccctaactgcca: 25mer>
  • the antisense side is 588 to 612
  • the tgagtccggcttccagttggacacca: 25mer> primer is 407 to 612
  • polystyrene particles (Bangs Laboratories, Inc., Catalog Code: PC06N, Polymer Description: P (S / 5.5 ° / oDVB / 5% IVIMA)) with a carboxyl modification on the surface having a diameter of 5.5 jum were used.
  • a probe (Amersham Biosciences, Inc.) was prepared that had a sequence complementary to the target nucleic acid that did not overlap with the immobilized probe and the unlabeled probe and that had a fluorescent (CY3) label on the 5 'side of the probe (Amersham Bioscience) ( Figure 2a) , b, c, d base sequence 2, SEQ ID NOs: 1, 8, 13, 14).
  • aqueous solution (total 10 I) containing the sample nucleic acid (800 fmol), unlabeled probe (50 pmol) and labeled probe dpmol) was heat denatured (95 ° C; 5 minutes), cooled on ice (1 minute), and then solidified.
  • phased particles approximately 100,000 particles suspended in 10 IOXSSC, final concentration 5xSSC
  • hybridize with the target nucleic acid 40 ° C; 2 hours, but 0 to 2 hours for a time-dependent study
  • the mixture was centrifuged (15000 rpm, 2 minutes) to remove the reaction solution. Then, wash with TBS-Triton (ed. Tris-CI, 0.2 ° /.
  • the target nucleic acid is the wild-type FUTIII gene (1 in Figure 2-a: 59>; 1 to 200 bp), and the immobilized particles correspond to the 56th to 75th sequences of the FUTIII gene.
  • Unlabeled probe that has a different number of bases from the 5 'of the probe and the 3' of the probe of the immobilized particle using a probe having the antisense sequence (4 in Figure 2-a)
  • the probe sequence of the immobilized particles was changed from the 1062th to the 1081st antisense of the FUT I11 gene.
  • Side tgaaccaagGGgctttgctg, SEQ ID NO: 16
  • an antisense probe ctgcgcaccgtctggtacct ⁇ SEQ ID NO: 15
  • a labeled probe gcaggccttgcagaaatcca g; 14 4) (d in Fig. 2).
  • the fluorescence intensity of the target nucleic acid increased with time, and a sharp increase in the fluorescence intensity was observed as compared to the sample without the unlabeled probe (Fig. 4).
  • the FUT II gene has homozygous and heterozygous forms of each genotype. Therefore, it was described whether it is possible to determine whether the target nucleic acid is homozygous or heterozygous.
  • the fluorescence intensity is (Le 59> / Le 59>)> (WT 59> / Le 59>) > (WT ⁇ 59> / WT ⁇ 59>) (a in Fig. 5), when the 508th mutant nucleic acid was used as the target nucleic acid (Fig. 2- c- 1) (Le ⁇ 508> / Le ⁇ 508 »> (WT ⁇ 508> / Le ⁇ 508 »> (WT ⁇ 508> / WT ⁇ 508>) (Fig.
  • the presence of the target nucleic acid is determined in the order of the target nucleic acid homotype, the target nucleic acid and non-target nucleic acid heterotype, and the non-target nucleic acid homotype in descending order of fluorescence intensity. And genotype (homo, hetero) could be determined.
  • a-3 The unlabeled probe used to examine the change in the hybridization specificity of the target nucleic acid (a-1) and immobilized probe (a-14) by designing the unlabeled probe
  • b-3 Unlabeled probe added to enhance the specificity of hybridization between target nucleic acid (b-1) and immobilized probe (b-4)
  • c-2 CY3-labeled probe for detecting target nucleic acid Le (508)
  • c-3 Unlabeled probe added to enhance the specificity of hybridization between target nucleic acid (c-11) and immobilized probe (c-14)
  • d-3 Unlabeled probe added to enhance the specificity of hybridization between target nucleic acid (d-1) and immobilized probe (d-4)

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Description

明細書
標的核酸の測定方法及びそのためのキット
技術分野
本発明は、 標的核酸の測定方法及びそのためのキットに関する。 本発明の方法 は、 一塩基変異多型 (SNP)の検出や遺伝子の接合型の判定に有用である。
背景技術
核酸の変異の判定は、 単離した核酸を制限酵素によって切断し、 ゲル （ァガ口 ース、 アクリルアミドなど） 上で核酸断片を電気泳動によって検出する方法で行 われている。 しかし、 この手法は、 制限酵素による核酸の切断に時間がかかリ電 気泳動による手間が要する。 さらに、 発癌性のエチレンブロマイドを使用するた め、 その廃棄には特別の配慮を必要とする。
他に DMAシークェンス、 DNAチップなどの技術による SNP解析も行われている が、 熟練した技術の必要性ゃコストなどの欠点がある。
また、 Cytometry 39： 131-140 (2000)に記載された方法は、 標的核酸と、 標的 核酸に相補的な蛍光色素標識プローブと、 標識プローブに隣接した標的核酸と相 補的な塩基配列部分および粒子固相化プローブと相補的な塩基配列を持つプロ一 ブをハイブリダィズし、 ライゲースによるライゲーシヨンを行い、 次に粒子固相 化プローブとハイブリダィズさせ、 粒子に結合した標識プローブの蛍光強度をフ ローサイ トメータで測定する方法である。 二つのプローブの隣接配列に変異配列 が存在するとライゲーシヨンは成立せず、 粒子には標識プローブが結合せず、 蛍 光は観察されない。 その差を用い標的核酸の有無を判定する。 この測定法はライ ゲーシヨン操作後、 再度ハイプリダイゼーシヨン操作を行うため時間がかかる欠 点を有する。
発明の開示
従って、 本発明の目的は、 熟練した技術を要することなく、 簡便に短時間で S NPの検出や標的核酸の定量を行うことができる標的核酸の測定方法を提供する ことである。
本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 標的核酸と、 該標的核酸とハイブリダィズ する固相化プローブ、 および標識プローブとを反応させ、 支持体に結合された標 識を測定することにより標的核酸を測定する方法を採用するとともに、 固相化プ ローブがハイブリダィズする領域の端部領域に、 端部が重複する領域とハイプリ ダイズする非標識プローブをさらに反応させることにより、 驚くべきことに、 固 相化プローブと標的核酸との反応の特異性が高まり、 一塩基の相違も識別可能に なることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 標的核酸と、 標的核酸とハイブリダィズする、 標識され た核酸から成る標識プローブと、 標的核酸内の領域であって前記標識プローブが ハイブリダィズする領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸から成 る非標識プローブと、 標的核酸内の領域であって前記標識プローブがハイプリダ ィズする領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸が支持体に結合さ れて成る固相化プローブとを反応させ、 前記支持体に結合された前記標識プロ一 ブの標識を測定することを含む標的核酸の測定方法であって、 前記非標¾1プロ一 ブがハイプリダイズする領域の端部領域と、 前記固相化プローブがハイプリダイ ズする領域の端部領域とが重複している、 標的核酸の測定方法を提供する。 また、 本発明は、 標的核酸又は標的核酸の一塩基変異多型を有する変異型核酸を含む被 検試料に対して上記本発明の方法を適用し、 測定結果から被検試料中の核酸が標 的核酸か変異型核酸かを判定することを含む、 一塩基変異多型の検出方法を提供 する。 さらに、 本発明は、 正常型遺伝子と、 一塩基変異多型を含む異常型遺伝子 とが対立遺伝子になっている、 該遺伝子を含む被検試料に対して上記本発明の方 法を適用し、 測定結果から被検試料中の前記遺伝子の接合型を判定することを含 む、 遺伝子の接合型の判定方法を提供する。 さらに、 本発明は、 前記標識プロ一 ブと、 前記非標識プローブと、 前記固相化プローブとを少なくとも含み、 上記本 発明の方法に用いられる核酸測定用キットを提供する。
本発明により、 簡便に短時間で SNPの検出や標的核酸の定量を行うことができ る標的核酸の測定方法が提供された。 本発明の方法によれば、 わずか 1塩基の相 違を識別することが可能であり、 また、 わずか 1塩基の相違を有する対立遺伝子 の接合型の判別が可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の方法を説明するための模式図である。
図 2は、 本発明の実施例で用いた標的核酸及び各種プローブの塩基配列及びハ イブリダィズする領域を示す図である。
図 3は、 非標識プローブの位置による蛍光強度の変化を示したグラフである （ 横軸の数字は FUT I I I DMAの塩基配列に対応する非標識プローブの位置を示し、 カツコ内は非標識プローブの 5'側と固相化プローブの 3'側が重複する塩基数を現 している）
図 4は、 非標識プローブの添加の有無による経時的な蛍光強度の変化を示した グラフである。
図 5は、 標的核酸の遺伝子型 （ホモ型、 ヘテロ型） による蛍光強度の違いを示 したグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法の一例を図 1の Aに示す模式図に基づき説明する。 上述の通り、 本発明の方法は、 標的核酸 1 0と、 標識プローブ 1 2と、 固相化プローブ 1 4と、 非標識体プローブ 1 6とをァニールすることにより、 標的核酸 1 0と、 標識プロ ーブ 1 2、 固相化プローブ 1 4及び非標識体プローブ 1 6とをそれぞれハイプリ ダイズさせ、 固相化プローブ 1 4を固相化している支持体 1 8に、 標的核酸 1 0 を介して結合された標識プローブ 1 2の標識 1 9を測定することにより、 被検試 料中の標的核酸 1 0を測定するものである。
以下、 各構成要素について詳細に説明する。 標的核酸 1 0は、 測定しようとす る核酸であり、 何ら限定されるものではない。 例として、 ヒ卜やその他の生物の ゲノミック遺伝子、 c D N A、 病原性の微生物やウィルスの遺伝子等を挙げるこ とができるがこれらに限定されるものではない。 本発明の方法は、 一塩基の相違 さえ識別することができる特異性の高い方法であるので、 SNPの検出に適用可能 であるから、 標的核酸が、 このような SNPを検出しょうとする核酸である場合に は特に威力を発揮する。 標的核酸は、 D N Aでも R N Aでもよく、 また、 これら とハイブリダィズすることが可能な人工核酸であってもよい。 標的核酸は、 P C Rのような核酸増幅法で増幅されたものであってもよいし、 増幅されていない核 酸であってもよい。 なお、 本明細書において、 「測定」 には、 検出と定量の両者 が包含される。 標的核酸のサイズは、 特に限定されないが、 3種類のプローブと ハイブリダィズする必要があるので、 通常、 4 0塩基以上、 好ましくは 6 0塩基 以上のサイズを有する。 標的核酸のサイズの上限は特にないが、 通常、 1 0 0〜 5 0 0塩基程度が好ましい。
標識プローブ 1 2は、 標的核酸内の一領域とハイブリダィズする核酸を標識し たものである。 標識プローブは、 これがハイブリダィズする標的核酸内の領域 （ 以下、 「標識プローブハイブリダィズ領域」 ということがある） と相補的な塩基 配列を有していることが好ましいが、 非標識プローブ及び固相化プローブと標的 核酸とのハイブリダィゼーシヨン条件下において標的核酸とハイブリダィズでき るものであれば、 通常 1 0 %以下、 特に 5 0/0以下程度の数の非相補的なヌクレオ チドを含んでいてもよい。 標識プローブのサイズは、 特に限定されるものではな く、 標的核酸の検出に有効なサイズを有していればよく、 1 5塩基以上が好まし く、 特に 2 0〜 5 0塩基程度が好ましい。 標識プローブに結合される標識は、 プ ローブを測定できるものであればいずれのものであってもよく、 従来の標識プロ —ブに用いられているいずれの標識をも採用することができる。 すなわち、 蛍光 標識、 放射標識、 酵素標識、 ビォチン標識等を挙げることができる。 これらのう ち、 高価な装置を用いることなく安全に測定可能で、 標的核酸とのハイブリダィ ゼーシヨンに干渉しない点から、 蛍光標識が好ましい。 標識は、 プローブのどの 部分に結合してもよく、 このような結合は周知の方法により行うことができる。 また、 プローブは、 D N Aでも R N Aでもよく、 また、 これらとハイブリダィズ することが可能な人工核酸であってもよい。
固相化プローブ 1 4は、 前記標的核酸 1 0内の領域であって前記標識プローブ ハイブリダィズ領域とは異なる領域 （以下、 「固相化プローブハイブリダィズ領 域 J と言うことがある） と相補的な塩基配列を有する核酸を、 支持体上に固相化 したものである。 固相化プローブのサイズは、 特に限定されるものではなく、 標 的核酸の検出に有効なサイズを有していればよく、 1 5塩基以上が好ましく、 特 に 2 0〜5 0塩基程度が好ましい。 支持体としては、 核酸を固相化できるもので あればいずれのものであってもよく、 ポリスチレン粒子、 ガラス粒子、 ラテック ス粒子等の粒子、 これらにフヱライ ト等を配合して磁力を与えた磁性粒子、 マイ クロプレートのゥエルの内壁等を挙げることができる。 固相化プローブと標的核 酸とのハイブリダィゼーシヨンが妨げられないように、 支持体は核酸の末端に結 合することが好ましい。 核酸の支持体への固相化は、 周知の方法により行うこと ができ、 核酸を結合しやすいようにカルボキシル基等の官能基を表面に結合した ポリスチレン粒子等が市販されているので、 このような市販の核酸固相化用粒子 を好ましく用いることができる。 なお、 固相化プローブ 1 4の核酸は、 支持体 1 8に直接結合されていてもよいし、 標的核酸とのハイブリダィゼーシヨンに関与 しない塩基配列を有するスぺーサー領域を介して支持体に結合されていてもよし、。 このように、 固相化プローブハイブリダィズ領域と相補的な配列を有する核酸が、 スぺーサー領域を介して間接的に支持体に結合されている場合も、 本発明で言う
「相補的な塩基配列を有する核酸が支持体に結合されて」 いる場合に該当する。 非標識プローブ 1 6は、 標的核酸 1 0内の、 標識プローブハイブリダィズ領域 とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸である。 非標識プローブのサイ ズは、 特に限定されるものではなく、 標的核酸の検出に有効なサイズを有してい れぱよく、 1 5塩基以上が好ましく、 特に 2 0 ~ 5 0塩基程度が好ましい。
非標識プローブハイブリダィズ領域と、 固相化プローブハイブリダィズ領域と は、 互いの端部領域が重複している （以下、 この重複している部分を 「重複領域 J と言うことがある） 。 重複領域は、 図 1の A中、 参照番号 2 0で示されている。 重複領域のサイズは、 特に限定されないが、 1塩基〜 5塩基が好ましく、 さらに 1塩基〜 3塩基が好ましい。 このような重複領域 2 0を設けることにより、 固相 化プローブ 1 4と標的核酸 1 0との反応の特異性が高まり、 一塩基の相違でも識 別できるようになる。
本発明の方法は、 標的核酸の変異型、 とりわけ SNPが存在する場合に、 このよ うな一塩基変異を区別して標的核酸を特異的に測定できるという優れた効果を発 揮するものであるが、 このような変異を区別して標的核酸を特異的に測定する場 合には、 この変異が起きる部位が、 固相化プローブハイブリダィズ領域中に位置 するように、 固相化プローブを設定する。 変異している部位が、 重複領域 2 0か ら 1塩基 （重複領域の端部に隣接する） ないし 5塩基離れた位置にあることが好 ましい。 なお、 図 1の A中、 標的核酸 1 0上の、 変異する塩基の部位を Yで示す c また、 Yに対合する固相化プローブ 1 4内の塩基を Xで示す。 なお、 本明細書の 説明においては、 標的核酸と変異している核酸を変異型と呼んでおり、 変異型が 必ずしも異常型を意味するわけではない。 異常型の遺伝子の検出を目的にして異 常型を標的核酸とする場合には、 正常型が変異型になる。
なお、 図 1の Aに示す例では、 固相化プローブハイブリダィズ領域の 5 ' 末端 領域と、 非標識プローブハイブリダィズ領域の 3 ' 末端領域とが重複しているが、 これとは逆に固相化プローブハイブリダィズ領域の 3 ' 末端領域と、 非標識プロ ーブハイブリダィズ領域の 5 ' 末端領域とが重複するようにこれらのプローブを 設定してもよい （ただし、 この場合には、 固相化プローブの核酸の 3 ' 側が支持 体に固相化される） 。 また、 標識プローブハイブリダィズ領域は、 非標識プロ一 ブハイブリダィズ領域及び固相化プローブハイブリダィズ領域と重複しない任意 の位置でよい。
上記の通り、 本発明の方法では、 標的核酸 1 0と、 標識プローブ 1 2、 固相化 プローブ 1 4及び非標識プローブ 1 6とをハイブリダィズさせるものであるが、 ハイプリダイゼーション反応は、 これら 4種類の核酸を同時に反応させてもよい し、 標的核酸 1 0と、 任意のプローブとを逐次的に反応させてもよいし、 標的核 酸 1 0と、 任意の 2種類のプローブを反応させた後、 第 3のプローブを反応させ てもよい。 反応条件は、 特に限定されず、 プローブのサイズ等に応じて適宜選択 されるが、 標的核酸 1 0と、 固相化プローブ 1 4と、 非標識プローブ 1 6とが共 存する条件下におけるハイブリダィゼーシヨン反応は、 通常、 3 0 °C〜6 0 °Cで 1 0分間以上であればよく、 好ましくは、 4 0 °C〜 5 0 °Cで 1 0分間〜 6 0分間 程度行う。 固相化プローブ 1 4と非標識プローブ 1 2のいずれかが存在しない条 件下におけるハイブリダィゼーション反応は、 上記の条件と同様に行うこともで きるし 高温から低温に冷却する条件下で行ってもよい。 例えば、 下記実施例で は、 先に標的核酸 1 0と、 標識プローブ 1 2と、 非標識プローブ 1 6とを反応さ せ、 その後、 固相化プローブ 1 4を反応させているが、 標的核酸 1 0と、 標識プ ローブ 1 2と、 非標識プローブ 1 6との反応は、 反応液を変性温度 （9 5 °C) か ら氷冷する条件下で行っている。 高温から低温に冷却すると、 ハイブリダィゼー シヨンが起きる温度を必ず通過するので、 標的核酸とプローブとをハイブリダィ ズさせることができる。
ハイブリダィゼーシヨン反応後、 支持体 1 8に結合された標識 1 9を測定する。 標識 1 9の測定は、 各標識に応じた周知の方法により行うことができる。 支持体 1 8が粒子の場合には、 支持体 1 8を遠心分離や磁力 （磁性粒子の場合） を用い て集めた後、 標識を測定する。 被検試料中に標的核酸 1 0が存在する場合、 標識 プローブ 1 2は標的核酸 1 0及び固相化プローブ 1 4の核酸部分を介して支持体 1 8に結合され、 標的核酸 1 0が存在しない場合には、 支持体 1 8に結合されな いので、 支持体 1 8に結合された標識 1 9を測定することにより、 被検試料中の 標的核酸 1 0を検出することができる。 また、 支持体 1 9に結合される標識 1 9 の量は、 被検試料中の標的核酸 1 0の量が多ぐなるほど多くなるので、 標識 1 9 を定量することにより標的核酸 1 0を定量することも可能である。
標的核酸又は標的核酸の一塩基変異多型を有する変異型核酸を含む被検試料に 対して上記した本発明の方法を適用することにより、 測定結果から被検試料中の 核酸が標的核酸か変異型核酸かを判定することが可能である。 これを図 1の Bを 参照して説明する。 図 1の B中、 1 0 ' は、 図 1の Aにおける標的核酸 1 0内の 塩基 Yがー塩基変異を起こした変異型核酸を示し、 塩基 Yが変異した塩基を〇で 示す。 このように、 一塩基が変異した変異型核酸 1 0 ' と固相化プローブ 1 4と は図 1の Bに示すようにハイプリダイズしないか、 又は一部の固相化プローブ 1 4がハイブリダィズするにしても、 ハイブリダイズする固相化プロ一ブの数が、 標的核酸にハイプリダイズする固相化プローブの数よりも識別可能な程度に少な くなる。 このため、 支持体 1 8に結合する標識の量が識別可能な程度に少なくな リ、 従って、 被検試料中に含まれる核酸が、 標的核酸か変異型かを判定すること ができる。 さらに、 正常型遺伝子と、 一塩基変異多型を含む異常型遺伝子とが対立遺伝子 になっている、 該遺伝子を含む被検試料に対して上記本発明の方法を適用するこ とにより、 測定結果から被検試料中の前記遺伝子の接合型を判定することが可能 になる。 従って、 本発明の方法により、 目的の遺伝子が、 ホモ接合かへテロ接合 かを判定することが可能になる。 標的核酸がホモ接合になっている場合に測定さ れる標識量が最も多く、 標的核酸と変異型とがへテロ接合になっている場合が次 に多く、 変異型がホモ接合になっている場合が最も少ない。 従って、 本発明の方 法に従って、 支持体に結合された標識量を測定することにより、 対立遺伝子の接 合型を判定することが可能になる。
本発明は、 また、 前記標識プローブと、 前記非標識プローブと、 前記固相化プ ローブとを少なくとも含み、 上記本発明の方法に用いられる核酸測定用キットを も提供する。 これらの構成要素は先に説明した通りである。 キットは、 さらに反 応に用いる緩衝液等を含んでいてもよい。
実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
標的核酸であるフコース転位酵素 3 (FUTI I I) 遺伝子
FUTI I I遺伝子は糖鎖末端にフコースを転移して血液型抗原や癌関連抗原 （GA1
9-9) の合成に関係している遺伝子で、 野生型 （WT) と変異型 （Le1、 Le2、 Le3) の 4種類が知られている。 変異の部位として 59、 508、 1067番目の塩基が知られ ている。 （Cancer Res. 58, 512-518(1998), 蛋白質 核酸 酵素 Vol.43 No.16
(1998))
1. 標的核酸の調製
各 FUTI 11遺伝子を錶型として用い、 ポリメラーゼ ·チェーン■ リアクション (PGR) 法 （94°C, 1分間、 55°C， 1分間、 72°C, 1分間を 30サイクル） にてそれぞ れの核酸を増幅し、 精製く MO BI0： ULTRA CLEAN DNA Purification kit ： Catalo g #12100- 300〉後に A260にて吸光度より濃度を測定して調製を行った。 以下に各 変異部分を含む核酸の増幅に用いたプライマーの組み合せを示す。 59番目の塩 基の変異部分を標的とした核酸 （WTく 59>または Leく 59〉） は、 センス側を 1から 2 0番目く atggatcccctgggtgcagc： 20mer〉、 アンチセンス側を 180から 200番目く ag caggatcaggagggtggg： 20mer>のプライマーを用いて 1から 200番目く 200bp>まで を増幅し、 508番目の塩基の変異部分を標的とした核酸 （WTく 508>または Le〈508> ) は、 センス側を 407から 431 # @ <acttggagccaccccctaactgcca： 25mer>、 アン チセンス側 588から 612番目 く tgagtccggcttccagttggacacca： 25mer>のプライマ 一を用いて 407から 612番目〈206bp〉までを増幅し、 1067番目の塩基の変異部分 を標的とした核酸 （WT<1067〉または Leく 1067» は、 センス側 887から 906番目く tccagagccccaaggacctg 20mer〉、 アンチセンス側 1086から 1068番目く tcaggtgaac caagccgct 19mer〉のプライマ一を用いて 887から 1086番目く 200bp〉までを増幅し た。
2. 固相化プローブの調製
FUTI 11遺伝子の塩基配列に相補的かつ変異の出現する位置を 3' 末端側から 4 から 6塩基目にくるようにプローブを設計し、 5' 末端にアミノ基を結合させた 固相化用プローブ （図 2の a, b, c, dの塩基配列 4 : 20mer、 配列番号 7, 10, 11, 16) (アマシャム バイオサイエンス社）を作製し、 粒子へ固相化した （固相化粒 子） 。
粒子は、 径が 5.5jumの表面にカルボキシルが修飾されたポリスチレン粒子 （ Bangs Laboratories, Inc. Catalog Code ： PC06N, Polymer Description ： P(S /5.5°/oDVB/5%IVIMA) ) を使用した。
固相化プローブの粒子への固相化は、 約 108個粒子を 0.1M MES(2-[N-モルホリ ノ]エタンスルホン酸） （pH4.5) 25μ Iに懸濁し、 固相化用プローブ （約 100pmo \/μ I) 5μ I および EDC (1-ェチル -3- (ジメチルァミノプロピル）カルポジイミ ド '塩酸塩） （10mg/ml) 1.25 i I を添加して 37°C、 1時間反応 （粒子のカルボキ シル基と固相化用プローブのァミノ基との縮合反応） させることで固相化粒子を 作製し、 0.02% Tween20 (商品名） 溶液で洗浄し、 0.1% SDS溶液洗浄後、 0.1M M ES (pH4.5) 溶液に置換し 4°Cで保存した。
3. 非標識プローブの調製
試料核酸と固相化したプローブとのハイブリダィズにおいて、 非標識プローブ を固相化プローブの 3' 側のどの位置に配置するか記載する。 固相化プローブの 3' 側の塩基配列と非標識プローブの 5' 側の塩基配列が 1塩基離れたプローブ から 3塩基重複するプローブ （約 20mer) (アマシャム バイオサイエンス社）を 調製した（図 2の a, b, c, dの塩基配列 3、 配列番号 2〜6, 9, 12, 15)。
4. 標識プローブの調製
固相化プローブおよび非標識プローブと重複しない標的核酸と相補的な配列を 持つプローブでこのプローブの 5'側に蛍光 （CY3) 標識したプローブ (アマシャム バイオサイエンス社）を調製した（図 2の a, b, c, dの塩基配列 2、 配列番号 1, 8,13,14)。
5. 測定方法
試料核酸 (800fmol)、 非標識プローブ (50pmol)と標識プローブ dpmol) の入つ た水溶液 (全量 10 I )を熱変性 （95°C ; 5分間） し、 氷上 （1分間） で冷却後、 固相化粒子 （10 Iの IOXSSCに懸濁させた約 10万粒子、 最終濃度 5xSSC) を 添加し、 標的核酸とハイブリダィズ （40°C ; 2時間、 但し、 経時的な検討では 0 〜2時間） させ、 遠心 （15000rpm, 2分間） し反応液を除去した。 その後、 TBS-T riton (編 Tris-CI, 0.2°/。 NaCI, 0.1% NaN2, 0.01% TritonX-100, pH7.2) 50 U Iで洗浄し、 再び遠心して測定用の緩衝液 （Beckman Coulter社、 フローサイ トメ 卜リー専用シース液、 P/N8599600) 200 jt/ Iに懸濁、 フローサイトメ一ター (Beckman Coulter 社、 EPICS-PROFILE II) を用いて粒子上の蛍光強度を測定し、 その蛍光強度より標的核酸の有無を同定した。
6. 非標識プローブの位置
FUTIII遺伝子の野生型 （図 2-a中 1：訂く 59>； 1〜200の 200bp) を標的とする 核酸とし、 固相化粒子には FUTIII遺伝子の 56番目から 75番目の配列に対応す るアンチセンス側の配列 （図 2-a中 4) を有するプローブを用い、 プローブの 5 'と固相化粒子のプローブの 3' 側と異なる塩基の重複数を持つ非標識プローブ
(図 2の a中 3、 配列番号 2〜6)と標識プローブ （図 2- a中 2) を用い検出を試み た。 固相化プローブの 3' 側の塩基と非標識プローブの 5' 側の塩基が 1から 3 塩基が重複した時、 標的核酸ではない変異型 （図 2-b中 1:Leく 59〉； 1〜200の 20 Obp) の虽光強度にはほとんど変化が観察されなかったにもかかわらず標的核酸 である WTく 59>には蛍光強度の上昇が観察された。 ことから、 固相化プローブの 3 ' 側の塩基と非標識プローブの 5' 側の塩基が 1から 3塩基重複させることで特 異的なハイブリダィズの向上する効果があることが示された （図 3) 。
7. 非標識プローブの効果
FUT I I I遺伝子の 1067番目の変異遺伝子 (Le<1067>； 887〜籠の 200bp) を 標的核酸とし、 固相化粒子のプローブの配列を FUT I 1 1遺伝子の 1062番目から 1 081番目のアンチセンス側 （tgaaccaagGGgctttgctg、 配列番号 1 6 ) 、 非標識プ ローブを固相化プローブの 3' 側と 3塩基重複するアンチセンス側のプローブ （ ctgcgcaccgtctggtacct ^ 配列番号 1 5 ) と標識プローブ (gcaggccttgcagaaatcca g、 配列番号 1 4 ) (図 2の d) を用いて検討した。 試料核酸に非標識プローブ を添加することで経時的に標的とする核酸の蛍光強度が、 非標識プローブを添加 しない試料に比べ蛍光強度の急激な上昇が観察された （図 4) 。 一方、 標的では ない野生型 （WT<1067>； 887〜1086の 200bp) の核酸では蛍光強度に変化は観察 されなかった。 非標識プローブが標的とする核酸と固相化粒子との特異的なハイ ブリダィズの効率を改善していることが示された。
8. 標的核酸の検出
FUT I I I遺伝子には、 各遺伝子型のホモ型とヘテロ型が存在する。 そこで標的 核酸のホモおよびへテロの判定が可能であるか記載した。
FUT I I I遺伝子の 59番目の変異核酸を標的核酸とした時 (図 2の b中 1 )蛍光強 度は (Leく 59〉/Leく 59〉）> (WTく 59〉/Leく 59>) > (WTく 59>/WT〈59〉） (図 5の a) 、 508番 目の変異核酸を標的核酸とした時 (図 2- c -1 ) (Le<508>/Le<508» > (WT<508>/Le く 508» > (WT〈508〉/WT<508〉） （図 5の b) 、 1067番目の変異核酸を標的核酸とし た時（図 2- d -1 )、 （Leく 1067〉/Leく 1067» > (WT<1067〉/Leく 1067〉） > (WTく 1067VWT く 1067〉） （図 5の c) となった。 （用いた標識体 （CY3) プローブ、 非標識プロ一 ブおよび固相化用プローブの塩基配列は図 2の b, c, dを参照）
蛍光強度の大きい方から、 標的とする核酸のホモ型、 標的とする核酸と標的と しない核酸のへテロ型、 標的としない核酸のホモ型の順となり、 標的核酸の有無 および遺伝子型 （ホモ、 ヘテロ） の判断が可能であった。
なお、 図 2の a, b,c,d中の各参照番号の意味するところを以下にまとめて示す。 例えば、 図 2の a中の 1を 「a- 1」 のように記載する。
a— 1 ： 標的核酸、 野生型 （WT(59))
a— 2 ： 標的核酸である WT (59) を検出するための GY3標識プローブ
a— 3 ： 非標識プローブの設計によって標的核酸 （a— 1) と固相化プローブ （a 一 4) のハイブリダィズの特異性の変化を検討するために用いた非標識プロ ーブ
a— 4 ： WT (59) の検出用固相化プローブ
b-1 ： 標的核酸、 変異型 （Le(59))
b-2 ： 標的核酸である Le (59) を検出するための CY3標識プローブ
b— 3 ： 標的核酸 （b— 1) と固相化プローブ （b— 4) のハイブリダィズの特異性 を高めるために添加する非標識プローブ
b— 4 ： Le (59) の検出用固相化プローブ
c-1 ： 標的核酸、 変異型 （Le(508))
c-2 ： 標的核酸である Le (508) を検出するための CY3標識プローブ
c-3 ： 標的核酸 （c一 1) と固相化プローブ （c一 4) のハイブリダィズの特異性 を高めるために添加する非標識プローブ
c-4 ： Le (508) の検出用固相化プローブ
d-1 ： 標的核酸、 変異型 （Le(1067))
d-2 ： 標的核酸である Le (1067) を検出するための GY3標識プローブ
d— 3 ： 標的核酸 （d— 1) と固相化プローブ （d— 4) のハイブリダィズの特異性 を高めるために添加する非標識プローブ
d-4 ： Le (1067) の検出用固相化プローブ

Claims

請求の範囲
1 . 標的核酸と、 該標的核酸とハイブリダィズする、 標識された核酸から成る 標識プローブと、 前記標的核酸内の領域であって前記標識プローブがハイブリダ ィズする領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸から成る非標識プ ローブと、 標的核酸内の領域であって前記標識プローブがハイブリダィズする領 域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸が支持体に結合されて成る固 相化プローブとを反応させ、 前記支持体に結合された前記標識プローブの標識を 測定することを含む標的核酸の測定方法であって、 前記非標識プローブがハイブ リダイズする領域の端部領域と、 前記固相化プローブがハイプリダイズする領域 の端部領域とが重複している、 標的核酸の測定方法。
2 . 重複している領域の塩基数が 1塩基ないし 5塩基である請求項 1記載の方 法。
3 . 重複している領域の塩基数が 1塩基ないし 3塩基である請求項 2記載の方 法。
4. 前記非標識プローブの 5 ' 末端領域がハイブリダィズする領域と、 前記固 相化プローブの 3 ' 末端領域がハイブリダィズする領域とが重複している請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の方法。
5. 標的核酸の変異型が存在し、 変異している部位が、 前記固相化プローブが ハイブリダィズする領域内に位置する請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の 方法。
6. 前記変異している部位が、 前記重複している領域から 1塩基ないし 5塩基 離れた位置にある請求項 5記載の方法。
7 . 標的核酸又は標的核酸の一塩基変異多型を有する変異型核酸を含む被検試 料に対して請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法を適用し、 測定結果か ら被検試料中の核酸が標的核酸か変異型核酸かを判定することを含む、 一塩基変 異多型の検出方法。
8 . 正常型遺伝子と、 一塩基変異多型を含む異常型遺伝子とが対立遺伝子にな つている、 該遺伝子を含む被検試料に対して請求項 1ないし 6のいずれか 1項に 記載の方法を適用し、 測定結果から被検試料中の前記遺伝子の接合型を判定する ことを含む、 遺伝子の接合型の判定方法。
9 . 前記標識プローブと、 前記非標識プローブと、 前記固相化プローブとを少 なくとも含み、 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法に用いられる核酸 測定用キット。
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