JP2003177114A - Ｄｎａ解析チップ、ｄｎａ解析チップ駆動装置、およびその方法 - Google Patents
Ｄｎａ解析チップ、ｄｎａ解析チップ駆動装置、およびその方法Info
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- JP2003177114A JP2003177114A JP2001376730A JP2001376730A JP2003177114A JP 2003177114 A JP2003177114 A JP 2003177114A JP 2001376730 A JP2001376730 A JP 2001376730A JP 2001376730 A JP2001376730 A JP 2001376730A JP 2003177114 A JP2003177114 A JP 2003177114A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多数の細菌叢を培養法により分析することが
極めて困難であり、分析可能な細菌の範囲も限定されて
いる。また、一定の単離された細菌、又は細菌叢の範囲
については分析が可能であるとしても、多数の細菌を培
養し同定するためには、時間と労力の掛かる作業であっ
た。 【解決手段】 本発明は、単離された細菌、又は細菌叢
のＤＮＡを解析する際に用いるＤＮＡ解析チップであっ
て、前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸
を特定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅
部と、前記核酸増幅部で増幅された核酸を電気泳動によ
り分画する電気泳動部と、を含み、前記核酸増幅部、及
び電気泳動部が同一基板上に形成されていることを特徴
とする。
極めて困難であり、分析可能な細菌の範囲も限定されて
いる。また、一定の単離された細菌、又は細菌叢の範囲
については分析が可能であるとしても、多数の細菌を培
養し同定するためには、時間と労力の掛かる作業であっ
た。 【解決手段】 本発明は、単離された細菌、又は細菌叢
のＤＮＡを解析する際に用いるＤＮＡ解析チップであっ
て、前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸
を特定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅
部と、前記核酸増幅部で増幅された核酸を電気泳動によ
り分画する電気泳動部と、を含み、前記核酸増幅部、及
び電気泳動部が同一基板上に形成されていることを特徴
とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料を１ヶ所に導
入することにより、その試料を構成する細菌層のＤＮＡ
を抽出した後、複数のプライマーを用いてその試料を独
立的に増幅した後、電気泳動を行ってＤＮＡを解析する
ことができるＤＮＡ解析チップ、ＤＮＡ解析チップ駆動
装置、およびその方法に関する。
入することにより、その試料を構成する細菌層のＤＮＡ
を抽出した後、複数のプライマーを用いてその試料を独
立的に増幅した後、電気泳動を行ってＤＮＡを解析する
ことができるＤＮＡ解析チップ、ＤＮＡ解析チップ駆動
装置、およびその方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人間の腸内には腸内細菌と呼ばれる常在
細菌類が存在し、この細菌類の分布状態を腸内細菌叢と
いう。腸内細菌には、Enterobacteriaceaeに属する大腸
菌と近縁のSalmonella等、また、Bacteroides、Eubacte
rium、Bifidobacterium、Peptostreptococcus、Clostri
dium、Lactobacillusなどが含まれる。
細菌類が存在し、この細菌類の分布状態を腸内細菌叢と
いう。腸内細菌には、Enterobacteriaceaeに属する大腸
菌と近縁のSalmonella等、また、Bacteroides、Eubacte
rium、Bifidobacterium、Peptostreptococcus、Clostri
dium、Lactobacillusなどが含まれる。
【０００３】これら腸内細菌は、食物の消化に補助的な
役割を果たす他、外来の病原菌の発育を抑制するなどの
体調の維持に役立っているが、このような細菌叢は、各
個体において一定ではなく、宿主の年齢、食物習慣など
により変化する。また、同一の個体においても、疾病や
精神的なストレスなどによって変化することが知られて
いる。
役割を果たす他、外来の病原菌の発育を抑制するなどの
体調の維持に役立っているが、このような細菌叢は、各
個体において一定ではなく、宿主の年齢、食物習慣など
により変化する。また、同一の個体においても、疾病や
精神的なストレスなどによって変化することが知られて
いる。
【０００４】こうした腸内細菌叢を分析する場合に、従
来は、培養法が利用されてきた。すなわち、被験者の糞
便などの試料を選択培地又は非選択培地などに植菌し、
各細菌の生育条件に合わせて、各培地を培養し、成長し
た細菌を染色等により細菌の性質に基づいて各腸内細菌
が同定されていた。
来は、培養法が利用されてきた。すなわち、被験者の糞
便などの試料を選択培地又は非選択培地などに植菌し、
各細菌の生育条件に合わせて、各培地を培養し、成長し
た細菌を染色等により細菌の性質に基づいて各腸内細菌
が同定されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、腸内細菌叢は
１００種類にも及ぶといわれており（「腸内フローラと
プロバイオティクス（INTESTINAL FLORA AND PROBIOTIC
S）」,Proceedings of V.Symposium of Intestinal Flo
ra,Tokyo,1996,学会出版センター）、これら多数の腸内
細菌叢を培養法により分析することが極めて困難であ
り、分析可能な細菌の範囲も限定されることになる。ま
た、一定の細菌叢の範囲については分析が可能であると
しても、多数の細菌を培養し同定するためには、時間と
労力の掛かる作業であった。
１００種類にも及ぶといわれており（「腸内フローラと
プロバイオティクス（INTESTINAL FLORA AND PROBIOTIC
S）」,Proceedings of V.Symposium of Intestinal Flo
ra,Tokyo,1996,学会出版センター）、これら多数の腸内
細菌叢を培養法により分析することが極めて困難であ
り、分析可能な細菌の範囲も限定されることになる。ま
た、一定の細菌叢の範囲については分析が可能であると
しても、多数の細菌を培養し同定するためには、時間と
労力の掛かる作業であった。
【０００６】一方、細菌にも、それぞれの細菌の特質が
記録された遺伝情報が、ＤＮＡとして染色体にコードさ
れている。これら細菌の特性の違いは、この遺伝情報を
司る染色体上の配列に反映され、細菌ごとに特徴的な配
列が存在する。
記録された遺伝情報が、ＤＮＡとして染色体にコードさ
れている。これら細菌の特性の違いは、この遺伝情報を
司る染色体上の配列に反映され、細菌ごとに特徴的な配
列が存在する。
【０００７】一例として、細菌のリボソーマルＲＮＡの
１６ＳｒＲＮＡサブユニットをコードした１６ＳｒＤＮ
Ａでは、細菌間で異なり、この配列の相違により細菌を
同定できることが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ
ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６５：１０２−１０９）。
１６ＳｒＲＮＡサブユニットをコードした１６ＳｒＤＮ
Ａでは、細菌間で異なり、この配列の相違により細菌を
同定できることが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ
ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６５：１０２−１０９）。
【０００８】そこで、本発明は、前記課題に鑑みてなさ
れたものであり、その目的は、腸内細菌間の核酸配列の
相違を利用して、試料を1ヶ所に導入することにより、
その試料のＤＮＡを抽出した後、複数のプライマーを用
いてその試料を独立的に増幅した後、電気泳動を行って
ＤＮＡを解析することができるＤＮＡ解析チップ、ＤＮ
Ａ解析チップ駆動装置、およびその方法を提供すること
にある。
れたものであり、その目的は、腸内細菌間の核酸配列の
相違を利用して、試料を1ヶ所に導入することにより、
その試料のＤＮＡを抽出した後、複数のプライマーを用
いてその試料を独立的に増幅した後、電気泳動を行って
ＤＮＡを解析することができるＤＮＡ解析チップ、ＤＮ
Ａ解析チップ駆動装置、およびその方法を提供すること
にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】請求項１に係る発明は、
単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡを解析する際に用
いるＤＮＡ解析チップであって、前記単離された細菌、
又は細菌叢を含む試料の核酸を特定のＰＣＲプライマー
を用いて増幅させる核酸増幅部と、前記核酸増幅部で増
幅された核酸を電気泳動により分画する電気泳動部と、
を含み、前記核酸増幅部、及び電気泳動部が同一基板上
に形成されていることを特徴とする。
単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡを解析する際に用
いるＤＮＡ解析チップであって、前記単離された細菌、
又は細菌叢を含む試料の核酸を特定のＰＣＲプライマー
を用いて増幅させる核酸増幅部と、前記核酸増幅部で増
幅された核酸を電気泳動により分画する電気泳動部と、
を含み、前記核酸増幅部、及び電気泳動部が同一基板上
に形成されていることを特徴とする。
【００１０】請求項２に係る発明は、請求項１記載のＤ
ＮＡ解析チップにおいて、前記核酸増幅部の前段に、前
記単離された細菌、又は細菌叢の試料を導入する試料導
入部と、該試料導入部に導入された試料から、該単離さ
れた細菌、又は細菌叢を構成するＤＮＡを抽出するＤＮ
Ａ抽出部と、を備えることを特徴とする。
ＮＡ解析チップにおいて、前記核酸増幅部の前段に、前
記単離された細菌、又は細菌叢の試料を導入する試料導
入部と、該試料導入部に導入された試料から、該単離さ
れた細菌、又は細菌叢を構成するＤＮＡを抽出するＤＮ
Ａ抽出部と、を備えることを特徴とする。
【００１１】請求項３に係る発明は、請求項１、２のい
ずれかに記載のＤＮＡ解析チップにおいて、前記核酸増
幅部と前記電気泳動部は連通しており、前記核酸増幅部
から前記電気泳動部に前記試料の移動を補助するための
通電電極を有していることを特徴とする。
ずれかに記載のＤＮＡ解析チップにおいて、前記核酸増
幅部と前記電気泳動部は連通しており、前記核酸増幅部
から前記電気泳動部に前記試料の移動を補助するための
通電電極を有していることを特徴とする。
【００１２】請求項４に係る発明は、請求項１から請求
項３のいずれかに記載の前記単離された細菌、又は細菌
叢は、被験者の腸内から得られた単離細菌、又は細菌叢
であることを特徴とする。
項３のいずれかに記載の前記単離された細菌、又は細菌
叢は、被験者の腸内から得られた単離細菌、又は細菌叢
であることを特徴とする。
【００１３】請求項５に係る発明は、請求項１から請求
項４のいずれかに記載のＤＮＡ解析チップの電気泳動部
から得られたデータを解析するＤＮＡ解析チップ駆動装
置であって、前記核酸増幅部に対応する位置に温度調整
部を設けることを特徴とする。
項４のいずれかに記載のＤＮＡ解析チップの電気泳動部
から得られたデータを解析するＤＮＡ解析チップ駆動装
置であって、前記核酸増幅部に対応する位置に温度調整
部を設けることを特徴とする。
【００１４】請求項６に係る発明は、請求項５に記載の
ＤＮＡ解析チップ駆動装置において、前記核酸増幅部に
は、核酸の増幅状態を検出する蛍光測定部を備えること
を特徴とする。
ＤＮＡ解析チップ駆動装置において、前記核酸増幅部に
は、核酸の増幅状態を検出する蛍光測定部を備えること
を特徴とする。
【００１５】請求項７に係る発明は、請求項５、６のい
ずれかに記載のＤＮＡ解析チップ駆動装置において、前
記電気泳動部には、該電気泳動部の泳動結果を検出する
蛍光測定部を備えることを特徴とする。
ずれかに記載のＤＮＡ解析チップ駆動装置において、前
記電気泳動部には、該電気泳動部の泳動結果を検出する
蛍光測定部を備えることを特徴とする。
【００１６】請求項８に係る発明は、単離された細菌、
又は細菌叢のＤＮＡを解析するＤＮＡ解析方法であっ
て、前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸
を特定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅
工程と、前記核酸増幅工程で増幅された核酸を電気泳動
により分画する電気泳動工程と、を含み、前記核酸増幅
工程、及び電気泳動工程が同一基板上で為されることを
特徴とする。
又は細菌叢のＤＮＡを解析するＤＮＡ解析方法であっ
て、前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸
を特定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅
工程と、前記核酸増幅工程で増幅された核酸を電気泳動
により分画する電気泳動工程と、を含み、前記核酸増幅
工程、及び電気泳動工程が同一基板上で為されることを
特徴とする。
【００１７】請求項９に係る発明は、請求項８記載のＤ
ＮＡ解析方法において、前記核酸増幅工程の前段に、前
記単離された細菌、又は細菌叢の試料を導入する試料導
入工程と、導入された試料から、該単離された細菌、又
は細菌叢を構成するＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程
と、を備えることを特徴とする。
ＮＡ解析方法において、前記核酸増幅工程の前段に、前
記単離された細菌、又は細菌叢の試料を導入する試料導
入工程と、導入された試料から、該単離された細菌、又
は細菌叢を構成するＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程
と、を備えることを特徴とする。
【００１８】請求項１０に係る発明は、請求項８、９の
いずれかに記載のＤＮＡ解析方法において、前記核酸増
幅工程、電気泳動工程が行われる際に前記試料の移動を
補助するために電極を通電することを特徴とする。
いずれかに記載のＤＮＡ解析方法において、前記核酸増
幅工程、電気泳動工程が行われる際に前記試料の移動を
補助するために電極を通電することを特徴とする。
【００１９】請求項１１に係る発明は、請求項８から請
求項１０のいずれかに記載の前記単離された細菌、又は
細菌叢は、被験者の腸内から得られた単離細菌、又は細
菌叢であることを特徴とする。
求項１０のいずれかに記載の前記単離された細菌、又は
細菌叢は、被験者の腸内から得られた単離細菌、又は細
菌叢であることを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態を
図面を用いて説明する。
図面を用いて説明する。
【００２１】図１は、ＤＮＡ抽出・精製部、リアルタイ
ムＰＣＲ部、及び電気泳動部をワンチップ化（同一基板
上に形成）されたＤＮＡ解析チップの概略構成図であ
る。
ムＰＣＲ部、及び電気泳動部をワンチップ化（同一基板
上に形成）されたＤＮＡ解析チップの概略構成図であ
る。
【００２２】１はサンプル導入部であり、このサンプル
導入部１に被験者の腸内から得た試料を導入する。
導入部１に被験者の腸内から得た試料を導入する。
【００２３】この試料を得るための前処理として、被験
者から試料、例えば糞便を採取し、この試料を生理食塩
水等に懸濁する。この懸濁液は、その後、フィルターな
どに通されて、細菌以外の不要な細胞などの固体が除去
され、単離された細菌、又は細菌叢懸濁液が調製され
る。この細菌の分離回収に用いるフィルターは、細菌と
それ以外の個体とを分離し得るサイズのものであれば特
に限定はない。また、好適には、このフィルターとし
て、径の異なる複数のフィルターを用い、粗い目のもの
から細かな目のフィルターを順次通すことにより、フィ
ルターの目詰まりを低減させることができる。例えば、
目の粗いフィルターとしてストマフィルター（グンゼ産
業）を、目の細かいフィルターとしてポリプロピレンス
クリーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（ＭＩＬＬＩＰ
ＯＲＥ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）な
どのメンブランフィルターを組み合わせて好適に利用す
ることもできる。
者から試料、例えば糞便を採取し、この試料を生理食塩
水等に懸濁する。この懸濁液は、その後、フィルターな
どに通されて、細菌以外の不要な細胞などの固体が除去
され、単離された細菌、又は細菌叢懸濁液が調製され
る。この細菌の分離回収に用いるフィルターは、細菌と
それ以外の個体とを分離し得るサイズのものであれば特
に限定はない。また、好適には、このフィルターとし
て、径の異なる複数のフィルターを用い、粗い目のもの
から細かな目のフィルターを順次通すことにより、フィ
ルターの目詰まりを低減させることができる。例えば、
目の粗いフィルターとしてストマフィルター（グンゼ産
業）を、目の細かいフィルターとしてポリプロピレンス
クリーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（ＭＩＬＬＩＰ
ＯＲＥ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）な
どのメンブランフィルターを組み合わせて好適に利用す
ることもできる。
【００２４】２は、ＤＮＡ抽出・精製部であり、このＤ
ＮＡ抽出・精製部２では、サンプル導入部１から導入さ
れた試料のＤＮＡを抽出・精製する。具体的には、ＤＮ
Ａ抽出・精製部２では、（１）導入された試料の温度を
例えば９５℃で１〜１０分間保持する、（２）導入され
た試料に界面活性剤（ＳＤＳ（Sodium Dodecylsulfat
e））を添加した後、例えば６０℃で１〜１０分間保持
する、（３）導入された試料に酵素（Proteinase K、Ac
hromopeptidase、Lysozymeのいずれか、或いは複数の混
合）を添加した後、例えば５５℃で１〜１０分間保持す
る、（４）導入された試料に界面活性剤（ＳＤＳ（Sodi
um Dodecylsulfate））及び酵素（Proteinase K、Achro
mopeptidase、Lysozymeのいずれか、或いは複数の混
合）を添加した後、例えば５５℃で１〜１０分間保持す
る、等の処理を行うことによりＤＮＡを抽出・精製する
ことができる。
ＮＡ抽出・精製部２では、サンプル導入部１から導入さ
れた試料のＤＮＡを抽出・精製する。具体的には、ＤＮ
Ａ抽出・精製部２では、（１）導入された試料の温度を
例えば９５℃で１〜１０分間保持する、（２）導入され
た試料に界面活性剤（ＳＤＳ（Sodium Dodecylsulfat
e））を添加した後、例えば６０℃で１〜１０分間保持
する、（３）導入された試料に酵素（Proteinase K、Ac
hromopeptidase、Lysozymeのいずれか、或いは複数の混
合）を添加した後、例えば５５℃で１〜１０分間保持す
る、（４）導入された試料に界面活性剤（ＳＤＳ（Sodi
um Dodecylsulfate））及び酵素（Proteinase K、Achro
mopeptidase、Lysozymeのいずれか、或いは複数の混
合）を添加した後、例えば５５℃で１〜１０分間保持す
る、等の処理を行うことによりＤＮＡを抽出・精製する
ことができる。
【００２５】３は、分岐部であり、この分岐部３にはＤ
ＮＡ抽出・精製部２の末端に設けられ、増幅を行うプラ
イマーの種類に対応して分岐路が設けられる。本実施の
形態では、分岐路を３本設けた例を述べたが、各分岐路
の構成は基本的に同一であるので、第１の分岐路４につ
いて以下説明する。尚、第１の分岐路４は、第１の分岐
路４ａ、及び第１の分岐路４ｂから構成されている。
ＮＡ抽出・精製部２の末端に設けられ、増幅を行うプラ
イマーの種類に対応して分岐路が設けられる。本実施の
形態では、分岐路を３本設けた例を述べたが、各分岐路
の構成は基本的に同一であるので、第１の分岐路４につ
いて以下説明する。尚、第１の分岐路４は、第１の分岐
路４ａ、及び第１の分岐路４ｂから構成されている。
【００２６】ところで、前述のＤＮＡ抽出・精製部２で
添加した、酵素、或いは界面活性剤は、後述するＰＣＲ
反応を阻害する要因となるものであるので、第１の分岐
路４ａ、及び／又はＤＮＡ抽出・精製部２の内側表面に
は、それらの酵素、或いは界面活性剤を除去するための
吸着剤を設けることが好ましい。
添加した、酵素、或いは界面活性剤は、後述するＰＣＲ
反応を阻害する要因となるものであるので、第１の分岐
路４ａ、及び／又はＤＮＡ抽出・精製部２の内側表面に
は、それらの酵素、或いは界面活性剤を除去するための
吸着剤を設けることが好ましい。
【００２７】５は、ＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬
導入部であり、このＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬
導入部５は第1の分岐路４ａにＰＣＲプライマー、酵
素、蛍光試薬を導入するためのものである。
導入部であり、このＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬
導入部５は第1の分岐路４ａにＰＣＲプライマー、酵
素、蛍光試薬を導入するためのものである。
【００２８】ここで用いられるＰＣＲプライマーは、特
定領域を増幅し得る特異的なプライマー対であればよ
く、さらに、特定領域を増幅しない、例えば、単一のプ
ライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同
時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Rand
om Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−
ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reacti
on) 法で用いられるプライマーや、RAPD法の増幅の確率
を制御することでDNA断片の種類数を少なくしたランダ
ムPCR法（特開平１１−３４１９８９号公報）で用いら
れるプライマーであってもよい。
定領域を増幅し得る特異的なプライマー対であればよ
く、さらに、特定領域を増幅しない、例えば、単一のプ
ライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同
時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Rand
om Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−
ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reacti
on) 法で用いられるプライマーや、RAPD法の増幅の確率
を制御することでDNA断片の種類数を少なくしたランダ
ムPCR法（特開平１１−３４１９８９号公報）で用いら
れるプライマーであってもよい。
【００２９】また、ＰＣＲ反応液は、例えば、（Ｃｈｒ
ｉｓｔｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．６５：１０２−１０９）に従って調製する
ことができる。具体的には、前記核酸懸濁液の一部に、
ＰＣＲ用のバッファを添加し、また、最終濃度、３ｍＭ
塩化マグネシウム、５％ＤＭＳＯ、各０．１ｍＭｄＮＴ
Ｐ、０．５ＵＴａｑ酵素となるように各酵素を添加して
反応液を調製する。
ｉｓｔｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．６５：１０２−１０９）に従って調製する
ことができる。具体的には、前記核酸懸濁液の一部に、
ＰＣＲ用のバッファを添加し、また、最終濃度、３ｍＭ
塩化マグネシウム、５％ＤＭＳＯ、各０．１ｍＭｄＮＴ
Ｐ、０．５ＵＴａｑ酵素となるように各酵素を添加して
反応液を調製する。
【００３０】ＰＣＲの反応条件は、例えば、９４℃で７
分間保温することにより、鋳型ＤＮＡを十分に変性さ
せ、その後、変性工程（９４℃、１分間）、アニーリン
グ工程（４５℃、１分間）、伸長工程（７２℃、１分
間）の３工程を３５サイクル繰り返し、最終的に１０分
間、７２℃に保温して伸長工程を実施する。
分間保温することにより、鋳型ＤＮＡを十分に変性さ
せ、その後、変性工程（９４℃、１分間）、アニーリン
グ工程（４５℃、１分間）、伸長工程（７２℃、１分
間）の３工程を３５サイクル繰り返し、最終的に１０分
間、７２℃に保温して伸長工程を実施する。
【００３１】次に、６は第１の分岐路４ｂに連通する電
気泳動部である。電気泳動部６では、第１の分岐路４ｂ
でＰＣＲ反応された試料（ＰＣＲ反応液）が電気泳動処
理される。
気泳動部である。電気泳動部６では、第１の分岐路４ｂ
でＰＣＲ反応された試料（ＰＣＲ反応液）が電気泳動処
理される。
【００３２】７は第１の分岐路４ｂに予め質量の分かっ
ている、複数のマーカを導入する内部標準マーカ導入部
である。この内部標準マーカは、目的とするＤＮＡの最
小質量より更に小さい質量のマーカ、及目的とするＤＮ
Ａの最大質量より更に大きい質量のマーカを導入するこ
とにより、各電気泳動部６での電気泳動後の泳動（分
画）パターンの誤差をそのマーカを基準として補正・比
較するために用いられるものである。
ている、複数のマーカを導入する内部標準マーカ導入部
である。この内部標準マーカは、目的とするＤＮＡの最
小質量より更に小さい質量のマーカ、及目的とするＤＮ
Ａの最大質量より更に大きい質量のマーカを導入するこ
とにより、各電気泳動部６での電気泳動後の泳動（分
画）パターンの誤差をそのマーカを基準として補正・比
較するために用いられるものである。
【００３３】更に、ＤＮＡ解析チップには、導入された
試料を移動し易くするために電圧を印加できるようにな
っている。そこで、試料の移動に沿って、例えば白金か
らなる、電極Ａ、電極Ｂ、電極Ｃ、電極Ｄ、電極Ｅ、電
極Ｆ、電極Ｇ、及び電極Ｈを設けている。
試料を移動し易くするために電圧を印加できるようにな
っている。そこで、試料の移動に沿って、例えば白金か
らなる、電極Ａ、電極Ｂ、電極Ｃ、電極Ｄ、電極Ｅ、電
極Ｆ、電極Ｇ、及び電極Ｈを設けている。
【００３４】前述のＤＮＡ解析チップでは、導入された
試料の単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡの抽出・精
製処理、ＰＣＲ反応処理、及び電気泳動処理を行うのみ
である。従って、温度設定、蛍光測定、試料を移動し易
くするための電圧印加の処理は、ＤＮＡ解析チップを載
置するＤＮＡ解析チップ駆動装置側に委ねられる。
試料の単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡの抽出・精
製処理、ＰＣＲ反応処理、及び電気泳動処理を行うのみ
である。従って、温度設定、蛍光測定、試料を移動し易
くするための電圧印加の処理は、ＤＮＡ解析チップを載
置するＤＮＡ解析チップ駆動装置側に委ねられる。
【００３５】次に、ＤＮＡ解析チップを解析するための
ＤＮＡ解析チップ駆動装置を説明する。図２は、ＤＮＡ
チップ駆動装置の概略構成図である。
ＤＮＡ解析チップ駆動装置を説明する。図２は、ＤＮＡ
チップ駆動装置の概略構成図である。
【００３６】図２において、１０、１１、１２、及び１
３は熱交換器からなる温度調整部であり、熱交換器１０
は試料からＤＮＡを抽出・精製する際に、また熱交換器
１１、１２、１３はＤＮＡをＰＣＲ増幅する際に所定温
度に保持するために用いられる。
３は熱交換器からなる温度調整部であり、熱交換器１０
は試料からＤＮＡを抽出・精製する際に、また熱交換器
１１、１２、１３はＤＮＡをＰＣＲ増幅する際に所定温
度に保持するために用いられる。
【００３７】１４、１５、１６、１７、１８，及び１９
は蛍光測定部であり、蛍光測定部１４、１６、１８は第
１の分岐路４ｂでＰＣＲ反応状態を測定するために用
い、また蛍光測定部１５、１７、１９は電気泳動処理後
の泳動パターンを波形データ、或いはバンドパターン
（波形の位置情報、及び波形の面積）を得るために用い
る。
は蛍光測定部であり、蛍光測定部１４、１６、１８は第
１の分岐路４ｂでＰＣＲ反応状態を測定するために用
い、また蛍光測定部１５、１７、１９は電気泳動処理後
の泳動パターンを波形データ、或いはバンドパターン
（波形の位置情報、及び波形の面積）を得るために用い
る。
【００３８】更に、熱交換器１０、１１，１２、及び１
３、並びに蛍光測定部１４，１５，１６，１７，１８、
及び１９は、ＤＮＡ解析チップ上には設けられておら
ず、ＤＮＡ解析チップ駆動装置に設けられている。
３、並びに蛍光測定部１４，１５，１６，１７，１８、
及び１９は、ＤＮＡ解析チップ上には設けられておら
ず、ＤＮＡ解析チップ駆動装置に設けられている。
【００３９】更に、ＤＮＡ解析チップ内のＤＮＡ抽出・
精製部２、第１の分岐路４、及び電気泳動部６を試料が
移動し易いようにするためにＤＮＡ解析チップ駆動装置
側にＤＮＡ解析チップを載置した際に、ＤＮＡ解析チッ
プに設けられた電極Ａ、電極Ｂ、電極Ｃ、電極Ｄ、電極
Ｅ、電極Ｆ、電極Ｇ、及び電極Ｈと電気的に接触するよ
う対向電極が設けられている。電極への通電順序は、電
極Ａ―電極Ｂ間、電極Ｃ―電極Ｄ間、電極Ｅ―電極Ｄ
間、電極Ｆ―電極Ｄ間、電極Ｇ―電極Ｈ間とすることに
よってスムーズに試料が移動する。
精製部２、第１の分岐路４、及び電気泳動部６を試料が
移動し易いようにするためにＤＮＡ解析チップ駆動装置
側にＤＮＡ解析チップを載置した際に、ＤＮＡ解析チッ
プに設けられた電極Ａ、電極Ｂ、電極Ｃ、電極Ｄ、電極
Ｅ、電極Ｆ、電極Ｇ、及び電極Ｈと電気的に接触するよ
う対向電極が設けられている。電極への通電順序は、電
極Ａ―電極Ｂ間、電極Ｃ―電極Ｄ間、電極Ｅ―電極Ｄ
間、電極Ｆ―電極Ｄ間、電極Ｇ―電極Ｈ間とすることに
よってスムーズに試料が移動する。
【００４０】ここで、図１に示したＤＮＡ解析チップ、
及び図２に示したＤＮＡ解析チップ駆動装置を組み合わ
せた使用状態を示すと図３となる。具体的な構成は、既
に説明したので、ここでは割愛する。
及び図２に示したＤＮＡ解析チップ駆動装置を組み合わ
せた使用状態を示すと図３となる。具体的な構成は、既
に説明したので、ここでは割愛する。
【００４１】図３に示したＤＮＡ解析チップ、及びＤＮ
Ａ解析チップ駆動装置を用いてＤＮＡ抽出処理から検索
処理までの流れを図４を用いて説明する。
Ａ解析チップ駆動装置を用いてＤＮＡ抽出処理から検索
処理までの流れを図４を用いて説明する。
【００４２】ステップＳ１では、被験者から試料、例え
ば糞便を採取し、ステップＳ２では、ＤＮＡ解析チップ
への前処理として、その試料を生理食塩水等に懸濁し、
この懸濁液は、その後、フィルターなどに通されて、細
菌以外の不要な細胞などの固体が除去され、単離された
細菌、又は細菌叢懸濁液が調製される。
ば糞便を採取し、ステップＳ２では、ＤＮＡ解析チップ
への前処理として、その試料を生理食塩水等に懸濁し、
この懸濁液は、その後、フィルターなどに通されて、細
菌以外の不要な細胞などの固体が除去され、単離された
細菌、又は細菌叢懸濁液が調製される。
【００４３】ステップＳ３では、熱交換器１０を所定温
度に保持した後、電極Ａ―電極Ｂを通電し、サンプル導
入部１から試料と共に界面活性剤、或いは酵素を導入し
てＤＮＡを抽出・精製し、その後電極Ｃ―電極Ｄを通電
することにより抽出・精製されたＤＮＡは分岐部３を介
して第１の分岐路４に流入する。
度に保持した後、電極Ａ―電極Ｂを通電し、サンプル導
入部１から試料と共に界面活性剤、或いは酵素を導入し
てＤＮＡを抽出・精製し、その後電極Ｃ―電極Ｄを通電
することにより抽出・精製されたＤＮＡは分岐部３を介
して第１の分岐路４に流入する。
【００４４】ステップＳ４においては、電極Ｅ―電極Ｄ
を通電し、ＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬導入部５
から所望のＰＣＲプライマー、酵素、蛍光試薬を導入し
た後、前述したＰＣＲ反応条件の下でＰＣＲ反応を行
う。このとき、熱交換器１１はＰＣＲ反応条件に合致す
るように調整されている。また、蛍光測定部１４はＰＣ
Ｒ反応状態を検出して、所望のＰＣＲ反応が行われてい
るか否かを測定する。
を通電し、ＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬導入部５
から所望のＰＣＲプライマー、酵素、蛍光試薬を導入し
た後、前述したＰＣＲ反応条件の下でＰＣＲ反応を行
う。このとき、熱交換器１１はＰＣＲ反応条件に合致す
るように調整されている。また、蛍光測定部１４はＰＣ
Ｒ反応状態を検出して、所望のＰＣＲ反応が行われてい
るか否かを測定する。
【００４５】この後、電極Ｆ―電極Ｄを通電しながら、
内部標準マーカ導入部７から、複数種類のマーカを導入
する。
内部標準マーカ導入部７から、複数種類のマーカを導入
する。
【００４６】次にステップＳ５では、電極Ｇ―電極Ｈを
通電しながら、ＰＣＲ反応液を電気泳動部６に誘導す
る。この電気泳動は、通常のアクリルアミドゲル又はア
ガロースゲルを用いた電気泳動を採用してもよい。
通電しながら、ＰＣＲ反応液を電気泳動部６に誘導す
る。この電気泳動は、通常のアクリルアミドゲル又はア
ガロースゲルを用いた電気泳動を採用してもよい。
【００４７】ステップＳ６では、、電気泳動後の泳動
（分画）パターンをコンピュータにより読み取らせ、こ
の分画パターンに基づいて、単離された細菌、又は細菌
叢の分析が行われる。
（分画）パターンをコンピュータにより読み取らせ、こ
の分画パターンに基づいて、単離された細菌、又は細菌
叢の分析が行われる。
【００４８】最後にステップＳ７においては、ＤＮＡ解
析チップ駆動装置のデータベース上のデータと前記被験
者の分画パターンと対比して、単離された細菌、又は細
菌叢に含まれる細菌の種類を直接同定することができ
る。
析チップ駆動装置のデータベース上のデータと前記被験
者の分画パターンと対比して、単離された細菌、又は細
菌叢に含まれる細菌の種類を直接同定することができ
る。
【００４９】
【発明の効果】以上の通り、本発明によれば、試料を1
ヶ所に導入することにより、その試料のＤＮＡを抽出し
た後、複数のプライマーを用いてその試料を独立的に増
幅した後、電気泳動を行ってＤＮＡを解析することがで
きるので、従来のように細菌毎に対応した培養を行う必
要がなく、単離された細菌、又は細菌叢を効率良く分析
することができる。
ヶ所に導入することにより、その試料のＤＮＡを抽出し
た後、複数のプライマーを用いてその試料を独立的に増
幅した後、電気泳動を行ってＤＮＡを解析することがで
きるので、従来のように細菌毎に対応した培養を行う必
要がなく、単離された細菌、又は細菌叢を効率良く分析
することができる。
【図１】ＤＮＡ抽出・精製部、リアルタイムＰＣＲ部、
及び電気泳動部をワンチップ化（同一基板上に形成）さ
れたＤＮＡ解析チップの概略構成図である。
及び電気泳動部をワンチップ化（同一基板上に形成）さ
れたＤＮＡ解析チップの概略構成図である。
【図２】ＤＮＡ解析チップを解析するためのＤＮＡ解析
チップ駆動装置概略構成図である。
チップ駆動装置概略構成図である。
【図３】ＤＮＡ解析チップ、及びＤＮＡ解析チップ駆動
装置を組み合わせた使用状態を示す図である。
装置を組み合わせた使用状態を示す図である。
【図４】ＤＮＡ解析チップ、及びＤＮＡ解析チップ駆動
装置を用いてＤＮＡ抽出処理から検索処理までの流れを
説明した図である。
装置を用いてＤＮＡ抽出処理から検索処理までの流れを
説明した図である。
１ サンプル導入部
２ ＤＮＡ抽出・精製部
３ 分岐部
４ 第１の分岐路
５ ＰＣＲプライマー・酵素・蛍光試薬導入部
６ 電気泳動部
７ 内部標準マーカ導入部
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｅ
Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
Ａ
Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ａ
３３１Ｋ
３１５Ｋ
３２５Ａ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 GA19 HA14
HA19
4B029 AA07 AA12 AA21 AA23 BB02
BB20 CC03 CC08 FA15
4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ06 QR08
QR14 QR32 QR38 QR42 QR56
QR75 QR82 QS16 QS25 QS34
QS39 QX02
Claims (11)
- 【請求項１】 単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡを
解析する際に用いるＤＮＡ解析チップであって、 前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸を特
定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅部
と、 前記核酸増幅部で増幅された核酸を電気泳動により分画
する電気泳動部と、を含み、 前記核酸増幅部、及び電気泳動部が同一基板上に形成さ
れていることを特徴とするＤＮＡ解析チップ。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ解析チップにおい
て、 前記核酸増幅部の前段に、前記単離された細菌、又は細
菌叢の試料を導入する試料導入部と、 該試料導入部に導入された試料から、該単離された細
菌、又は細菌叢を構成するＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出
部と、を備えることを特徴とするＤＮＡ解析チップ。 - 【請求項３】 請求項１、２のいずれかに記載のＤＮＡ
解析チップにおいて、 前記核酸増幅部と前記電気泳動部は連通しており、前記
核酸増幅部から前記電気泳動部に前記試料の移動を補助
するための通電電極を有していることを特徴とするＤＮ
Ａ解析チップ。 - 【請求項４】 請求項１から請求項３のいずれかに記載
の前記単離された細菌、又は細菌叢は、被験者の腸内か
ら得られた単離細菌、又は細菌叢であることを特徴とす
るＤＮＡ解析チップ。 - 【請求項５】 請求項１から請求項４のいずれかに記載
のＤＮＡ解析チップの電気泳動部から得られたデータを
解析するＤＮＡ解析チップ駆動装置であって、 前記核酸増幅部に対応する位置に温度調整部を設けるこ
とを特徴とするＤＮＡ解析チップ駆動装置。 - 【請求項６】 請求項５に記載のＤＮＡ解析チップ駆動
装置において、 前記核酸増幅部には、核酸の増幅状態を検出する蛍光測
定部を備えることを特徴とするＤＮＡ解析チップ駆動装
置。 - 【請求項７】 請求項５、６のいずれかに記載のＤＮＡ
解析チップ駆動装置において、 前記電気泳動部には、該電気泳動部の泳動結果を検出す
る蛍光測定部を備えることを特徴とするＤＮＡ解析チッ
プ駆動装置。 - 【請求項８】 単離された細菌、又は細菌叢のＤＮＡを
解析するＤＮＡ解析方法であって、 前記単離された細菌、又は細菌叢を含む試料の核酸を特
定のＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅工程
と、 前記核酸増幅工程で増幅された核酸を電気泳動により分
画する電気泳動工程と、を含み、 前記核酸増幅工程、及び電気泳動工程が同一基板上で為
されることを特徴とするＤＮＡ解析方法。 - 【請求項９】 請求項８記載のＤＮＡ解析方法におい
て、 前記核酸増幅工程の前段に、前記単離された細菌、又は
細菌叢の試料を導入する試料導入工程と、 導入された試料から、該単離された細菌、又は細菌叢を
構成するＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、を備える
ことを特徴とするＤＮＡ解析方法。 - 【請求項１０】 請求項８、９のいずれかに記載のＤＮ
Ａ解析方法において、 前記核酸増幅工程、電気泳動工程が行われる際に前記試
料の移動を補助するために電極を通電することを特徴と
するＤＮＡ解析方法。 - 【請求項１１】 請求項８から請求項１０のいずれかに
記載の前記単離された細菌、又は細菌叢は、被験者の腸
内から得られた単離細菌、又は細菌叢であることを特徴
とするＤＮＡ解析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001376730A JP2003177114A (ja) | 2001-12-11 | 2001-12-11 | Ｄｎａ解析チップ、ｄｎａ解析チップ駆動装置、およびその方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001376730A JP2003177114A (ja) | 2001-12-11 | 2001-12-11 | Ｄｎａ解析チップ、ｄｎａ解析チップ駆動装置、およびその方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003177114A true JP2003177114A (ja) | 2003-06-27 |
Family
ID=19184862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001376730A Pending JP2003177114A (ja) | 2001-12-11 | 2001-12-11 | Ｄｎａ解析チップ、ｄｎａ解析チップ駆動装置、およびその方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003177114A (ja) |
Cited By (10)
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| JP2005318822A (ja) * | 2004-05-07 | 2005-11-17 | Nipro Corp | 核酸検出容器 |
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-
2001
- 2001-12-11 JP JP2001376730A patent/JP2003177114A/ja active Pending
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