JP2002325581A - 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 - Google Patents
核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法Info
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- JP2002325581A JP2002325581A JP2001168840A JP2001168840A JP2002325581A JP 2002325581 A JP2002325581 A JP 2002325581A JP 2001168840 A JP2001168840 A JP 2001168840A JP 2001168840 A JP2001168840 A JP 2001168840A JP 2002325581 A JP2002325581 A JP 2002325581A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 未知および既知の核酸の変異を迅速、容易
に、かつ低コストで求められる方法及びこれらを表示す
る方法を提供する。 【解決手段】 2本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、1本鎖核酸に解離する温度点(Tm値)の差異及び
その特徴から核酸の変異を検出する方法によって課題を
解決した。得られた既存のTm値、Tmパターン及びこ
れらの変化をデータベースとして蓄積し、検体のTm
値、Tmパターン及びこれらの変化と比較照合すること
により、未知および既知の変異の検出を迅速、容易に、
かつ低コストで行うことが出来る。
に、かつ低コストで求められる方法及びこれらを表示す
る方法を提供する。 【解決手段】 2本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、1本鎖核酸に解離する温度点(Tm値)の差異及び
その特徴から核酸の変異を検出する方法によって課題を
解決した。得られた既存のTm値、Tmパターン及びこ
れらの変化をデータベースとして蓄積し、検体のTm
値、Tmパターン及びこれらの変化と比較照合すること
により、未知および既知の変異の検出を迅速、容易に、
かつ低コストで行うことが出来る。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、2本鎖核酸を加熱
し、1本鎖に解離する温度の差異及びその特徴から2本
鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変異を推定する核酸判
別法に関する。
し、1本鎖に解離する温度の差異及びその特徴から2本
鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変異を推定する核酸判
別法に関する。
【0002】
【従来の技術】2本鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変
異を検出する方法としては、従来から様々な方法が考案
され、実用化されてきた。この核酸の変異とは、主にそ
の塩基配列の塩基の変異、または長さの変異に関するも
のであり、それらを検出することにより判別されてき
た。
異を検出する方法としては、従来から様々な方法が考案
され、実用化されてきた。この核酸の変異とは、主にそ
の塩基配列の塩基の変異、または長さの変異に関するも
のであり、それらを検出することにより判別されてき
た。
【0003】未知の核酸塩基配列変異の検出法として
は、対象とする塩基配列の部分をPCRで増幅し、この
増幅産物を変性せず、直接、ポリアクリルアミドで電気
泳動し、その泳動度の差から変異を検出するPCR−S
SCP(PCR−SingleStrand Conf
ormation Polymorphism)法があ
る。この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化
を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショ
ットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング
法などシークエンス技術を基本として未知の変異を検出
する方法も汎用されている。
は、対象とする塩基配列の部分をPCRで増幅し、この
増幅産物を変性せず、直接、ポリアクリルアミドで電気
泳動し、その泳動度の差から変異を検出するPCR−S
SCP(PCR−SingleStrand Conf
ormation Polymorphism)法があ
る。この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化
を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショ
ットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング
法などシークエンス技術を基本として未知の変異を検出
する方法も汎用されている。
【0004】既知の核酸塩基配列変異の検出法として
は、核酸を制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に
意図的にPCRプライマーの3’末端を配置し、PCR
が行われるか否かで判別するPCR−ASP(PCR−
Allele SpecificPrimer)法や、
変異部分をPCRで増幅し、これが制限酵素で切断可能
か否かで判別するPCR−RFLP(PCR−Rest
riction Fragment Length P
olymorphism)法、変異部分をさらに蛍光標
識プローブで検出するタックマンプローブ法、最新の技
術としてInvader法などがある。
は、核酸を制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に
意図的にPCRプライマーの3’末端を配置し、PCR
が行われるか否かで判別するPCR−ASP(PCR−
Allele SpecificPrimer)法や、
変異部分をPCRで増幅し、これが制限酵素で切断可能
か否かで判別するPCR−RFLP(PCR−Rest
riction Fragment Length P
olymorphism)法、変異部分をさらに蛍光標
識プローブで検出するタックマンプローブ法、最新の技
術としてInvader法などがある。
【0005】最近ではSNPs(Single Nuc
leotide Polymorphism)が個人に
最適な医療を提供することが出来るとの判断から、特に
既知の塩基変異の検出法としてDNAチップ法などの方
法を用いて遺伝子の塩基配列の変異を検出する方法も開
発されているが、それらの方法に比較して時間的にも経
済的にもより一層効率的な変異検出法が求められてい
る。
leotide Polymorphism)が個人に
最適な医療を提供することが出来るとの判断から、特に
既知の塩基変異の検出法としてDNAチップ法などの方
法を用いて遺伝子の塩基配列の変異を検出する方法も開
発されているが、それらの方法に比較して時間的にも経
済的にもより一層効率的な変異検出法が求められてい
る。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現在ま
でに行われている核酸変異検出法は、いずれも熟練した
技術を必要とし、かつ検出には相応の時間とコストを必
要とする。特に未知の変異検出法は、高度な技術を習熟
した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負
担をかけてなし得る方法しか開発されていない。
でに行われている核酸変異検出法は、いずれも熟練した
技術を必要とし、かつ検出には相応の時間とコストを必
要とする。特に未知の変異検出法は、高度な技術を習熟
した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負
担をかけてなし得る方法しか開発されていない。
【0007】又、既知の変異、未知の変異をいずれも検
出可能な方法は現在のところダイレクトシークエンス法
しかないが、同法は上述の方法の中でも特に実行者に対
し技術的、時間的及び金銭的な負担を強いるものであ
る。
出可能な方法は現在のところダイレクトシークエンス法
しかないが、同法は上述の方法の中でも特に実行者に対
し技術的、時間的及び金銭的な負担を強いるものであ
る。
【0008】現在は様々の分野で遺伝子情報が必要とさ
れ、特にSNPsの概念が確立して以来、既知のSNP
sを検出するのと同様、未知のSNPsを効率良く、つ
まり高度な技術を必要とせず短時間に安価に核酸変異を
検出する方法の開発が待たれている。
れ、特にSNPsの概念が確立して以来、既知のSNP
sを検出するのと同様、未知のSNPsを効率良く、つ
まり高度な技術を必要とせず短時間に安価に核酸変異を
検出する方法の開発が待たれている。
【0009】
【課題を解決するための手段】係る事情に鑑み発明者は
鋭意研究の結果、2本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、1本鎖に解離する温度点の差異及びその特徴から2
本鎖核酸の未知あるいは既知の変異を短時間に容易に安
価に推定する核酸変異検出法の発明に至った。
鋭意研究の結果、2本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、1本鎖に解離する温度点の差異及びその特徴から2
本鎖核酸の未知あるいは既知の変異を短時間に容易に安
価に推定する核酸変異検出法の発明に至った。
【0010】本発明の原理を説明すれば、検体中の2本
鎖核酸に温度をかけていくと、それらは各々1本鎖核酸
に解離する。この急激に解離する温度点をTm(Mel
ting Temperature)値と呼ぶが、解離
温度及びスピードなどの特性は2本鎖核酸の塩基配列及
び塩基のアデニン(A)とチミン(T)間、グアニン
(G)とシトシン(C)間の結合強度に差があるために
各塩基A、G、C、Tの含有率に左右される。又、この
解離する温度及びスピードは同じく2本鎖核酸の長さに
も左右されるため、マイクロサテライトのリピート数の
差異によっても変化する。従って対象とする2本鎖核酸
部分のTm値あるいはTmパターンを異なる検体間で比
較し、異なった値あるいはパターンを示す検体に何らか
の未知の変異を推定することができる。また、予め正常
型・異常型のTm値あるいはTmのパターンを作成して
おけば、検体核酸のTm値あるいはTmのパターンを比
較照合することにより、異常型の存在を既知の変異とし
て検出することが可能である。
鎖核酸に温度をかけていくと、それらは各々1本鎖核酸
に解離する。この急激に解離する温度点をTm(Mel
ting Temperature)値と呼ぶが、解離
温度及びスピードなどの特性は2本鎖核酸の塩基配列及
び塩基のアデニン(A)とチミン(T)間、グアニン
(G)とシトシン(C)間の結合強度に差があるために
各塩基A、G、C、Tの含有率に左右される。又、この
解離する温度及びスピードは同じく2本鎖核酸の長さに
も左右されるため、マイクロサテライトのリピート数の
差異によっても変化する。従って対象とする2本鎖核酸
部分のTm値あるいはTmパターンを異なる検体間で比
較し、異なった値あるいはパターンを示す検体に何らか
の未知の変異を推定することができる。また、予め正常
型・異常型のTm値あるいはTmのパターンを作成して
おけば、検体核酸のTm値あるいはTmのパターンを比
較照合することにより、異常型の存在を既知の変異とし
て検出することが可能である。
【0011】前記の発明原理を、図面を用いて説明する
と図1及び図2の様になる。図1は横軸に温度、縦軸に
蛍光強度をとって示した2本鎖核酸溶解曲線であるが、
例えばA、B、Cの三種のPCR産物に温度をかけてい
くと2本鎖核酸は一定の温度で1本鎖核酸に解離してい
くために蛍光強度が徐々に低下していくが、この低下の
パターンは2本鎖核酸中のGC含有量、長さ、立体構造
などにより規定されて各々独自の曲線となる。ここで急
激に解離の進行する温度を解離温度(Tm値)と呼ぶ。
と図1及び図2の様になる。図1は横軸に温度、縦軸に
蛍光強度をとって示した2本鎖核酸溶解曲線であるが、
例えばA、B、Cの三種のPCR産物に温度をかけてい
くと2本鎖核酸は一定の温度で1本鎖核酸に解離してい
くために蛍光強度が徐々に低下していくが、この低下の
パターンは2本鎖核酸中のGC含有量、長さ、立体構造
などにより規定されて各々独自の曲線となる。ここで急
激に解離の進行する温度を解離温度(Tm値)と呼ぶ。
【0012】図1を微分したものが図2に示す2本鎖核
酸解離曲線である。この図ではTm値はピークとして表
示されるので、曲線間の違いが一層明らかとなる。2本
鎖核酸は各々独自の解離曲線を持つので予め実験的に作
成しておいた正常な核酸の解離曲線と比較することによ
って核酸変異を検出するのが本発明の原理となってい
る。
酸解離曲線である。この図ではTm値はピークとして表
示されるので、曲線間の違いが一層明らかとなる。2本
鎖核酸は各々独自の解離曲線を持つので予め実験的に作
成しておいた正常な核酸の解離曲線と比較することによ
って核酸変異を検出するのが本発明の原理となってい
る。
【0013】更に本発明では請求項11に記載の方法に
よりTm値あるいはTmピークをより明確にする方法に
ついて考案した。その原理を図3を用いて説明する。図
3において核酸に塩基異変(1)存在下においてアンチ
センスプライマー(2)とセンスプライマー(3)、
センスプライマー(4)及びセンスプライマー
(5)を用いて核酸増幅を行うと場合、アンチセンスプ
ライマーとセンスプライマーとの間のPCR産物をT
m、センスプライマーとの間のPCR産物をTm
、センスプライマーとの間のPCR産物をTmと
すると塩基変異の各Tm値に与える影響はTm、Tm
、Tmの順(Tm<Tm<Tm)で大きくな
る。
よりTm値あるいはTmピークをより明確にする方法に
ついて考案した。その原理を図3を用いて説明する。図
3において核酸に塩基異変(1)存在下においてアンチ
センスプライマー(2)とセンスプライマー(3)、
センスプライマー(4)及びセンスプライマー
(5)を用いて核酸増幅を行うと場合、アンチセンスプ
ライマーとセンスプライマーとの間のPCR産物をT
m、センスプライマーとの間のPCR産物をTm
、センスプライマーとの間のPCR産物をTmと
すると塩基変異の各Tm値に与える影響はTm、Tm
、Tmの順(Tm<Tm<Tm)で大きくな
る。
【0014】一般的にTm値およびTmピークは、対象
範囲の塩基数が多いほど1塩基の変異が影響する程度は
小さく、対象範囲の塩基数が少ないほど1塩基の変異が
影響する程度は大きい。従って、図3のように核酸増幅
産物が変異を含み、且つ核酸増幅産物の塩基数の異なる
PCRプライマーセットを複数配置し、各々のTm値あ
るいはTmピークを比較すると、これらは塩基数に応じ
て連続的な変化を示す。この連続的な変化は変異の有無
により異なるパターンを示すため、既知の変異を検出す
る目的であれば正常の連続パターンとの比較から、また
未知の変異を検出目的であれば特異な連続パターンを示
すものを選択することにより塩基変異の確認が可能とな
る。
範囲の塩基数が多いほど1塩基の変異が影響する程度は
小さく、対象範囲の塩基数が少ないほど1塩基の変異が
影響する程度は大きい。従って、図3のように核酸増幅
産物が変異を含み、且つ核酸増幅産物の塩基数の異なる
PCRプライマーセットを複数配置し、各々のTm値あ
るいはTmピークを比較すると、これらは塩基数に応じ
て連続的な変化を示す。この連続的な変化は変異の有無
により異なるパターンを示すため、既知の変異を検出す
る目的であれば正常の連続パターンとの比較から、また
未知の変異を検出目的であれば特異な連続パターンを示
すものを選択することにより塩基変異の確認が可能とな
る。
【0015】即ち、既知の変異の場合、Tmでは変異
がある場合とない場合とのTm値の変化はほとんどない
が、Tm、TmのTm値は連続的に変化が大きくな
る。又、未知の変異の場合は、TmでTm値の変化が
ほとんどなく、Tm、TmのTm値の変化が連続的
に大きくなることからその存在を推定することができ
る。いずれにせよ、変異の存在は1種類のプライマーセ
ットを用いた場合よりも明確になる。
がある場合とない場合とのTm値の変化はほとんどない
が、Tm、TmのTm値は連続的に変化が大きくな
る。又、未知の変異の場合は、TmでTm値の変化が
ほとんどなく、Tm、TmのTm値の変化が連続的
に大きくなることからその存在を推定することができ
る。いずれにせよ、変異の存在は1種類のプライマーセ
ットを用いた場合よりも明確になる。
【0016】本発明は、採取された検体からゲノムDN
Aを抽出して2本鎖核酸溶解曲線あるいは2本鎖核酸解
離曲線、又は核酸増幅を実施することによって核酸増幅
物の溶解曲線あるいは解離曲線を作成してTm値を求め
る方法以外に検体を破壊する構成物、酵素反応阻害因子
を抑制する構成物などを含むダイレクトPCRバッファ
ーなどを使用することによって検体からDNAを抽出す
ることなく、直接PCRを行って核酸増幅を行う方法に
おいても本発明は有効である。
Aを抽出して2本鎖核酸溶解曲線あるいは2本鎖核酸解
離曲線、又は核酸増幅を実施することによって核酸増幅
物の溶解曲線あるいは解離曲線を作成してTm値を求め
る方法以外に検体を破壊する構成物、酵素反応阻害因子
を抑制する構成物などを含むダイレクトPCRバッファ
ーなどを使用することによって検体からDNAを抽出す
ることなく、直接PCRを行って核酸増幅を行う方法に
おいても本発明は有効である。
【0017】検体からDNAを抽出することなく、直接
PCRで核酸増幅を行う場合のダイレクトPCRバッフ
ァーとして株式会社島津製作所製のAmpdirect
が有用であるが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
PCRで核酸増幅を行う場合のダイレクトPCRバッフ
ァーとして株式会社島津製作所製のAmpdirect
が有用であるが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
【0018】本発明は、検出した変異を予め得られてい
た既知の遺伝子情報と照合し、Tm値あるいはTmパタ
ーン以外にその判定結果を直接表示する核酸変異検出表
示技術に応用出来る。又、本発明はABO式血液型、H
LA(Human Leukocyte Antige
n)タイピング及び糖尿病性腎症関連SNPs(Dia
betic Nephropathy Related
Single Nucleotide Polymo
rphism)等の判定にも利用出来る。
た既知の遺伝子情報と照合し、Tm値あるいはTmパタ
ーン以外にその判定結果を直接表示する核酸変異検出表
示技術に応用出来る。又、本発明はABO式血液型、H
LA(Human Leukocyte Antige
n)タイピング及び糖尿病性腎症関連SNPs(Dia
betic Nephropathy Related
Single Nucleotide Polymo
rphism)等の判定にも利用出来る。
【0019】
【発明の実施の形態】次に、本発明の核酸変異検出法
を、既知の核酸を試料に用いて表1に示したPCR反応
液の処方で詳細に説明する。
を、既知の核酸を試料に用いて表1に示したPCR反応
液の処方で詳細に説明する。
【0020】
【表1】
【0021】試料の検体DNAを入れて、蒸留水Yμl
で合計が50μlとなるように処方した表1に示した反
応液を良く攪拌し、その全量50μlをABI社製のリ
アルタイムPCR定量機GeneAmp5700にセッ
トしてPCRを開始する。PCRプロトコールは、95
℃/5秒、55℃/10秒、72℃/20秒を40サイ
クル行う。
で合計が50μlとなるように処方した表1に示した反
応液を良く攪拌し、その全量50μlをABI社製のリ
アルタイムPCR定量機GeneAmp5700にセッ
トしてPCRを開始する。PCRプロトコールは、95
℃/5秒、55℃/10秒、72℃/20秒を40サイ
クル行う。
【0022】PCR終了後、2本鎖核酸溶解曲線(Me
lt Curve)、および該曲線を微分して得られた
2本鎖核酸解離曲線(Dissociation Cu
rve)が作成されるが、これらをいくつかの検体間で
比較し、異なったTm値あるいはTmパターンを示す検
体に何らかの未知の変異を推定することが出来る。
lt Curve)、および該曲線を微分して得られた
2本鎖核酸解離曲線(Dissociation Cu
rve)が作成されるが、これらをいくつかの検体間で
比較し、異なったTm値あるいはTmパターンを示す検
体に何らかの未知の変異を推定することが出来る。
【0023】又、予め正常型・異常型のTm値あるいは
Tmのパターンが作成してある場合、検体DNAのTm
値あるいはTmのパターンを比較照合することにより、
異常型の存在を既知の変異として検出することが可能で
ある。
Tmのパターンが作成してある場合、検体DNAのTm
値あるいはTmのパターンを比較照合することにより、
異常型の存在を既知の変異として検出することが可能で
ある。
【0024】リアルタイムPCR定量機は、ABI社製
のGeneAmp5700に限定されるものでなく、何
れの製品でも構わない。又、蛍光色素は、インターカレ
ーターであればSyGreen(サイバーグリーン)に
限定されない。尚、PCRプロトコルは使用するプライ
マーに合わせて適宜変更して実施する。
のGeneAmp5700に限定されるものでなく、何
れの製品でも構わない。又、蛍光色素は、インターカレ
ーターであればSyGreen(サイバーグリーン)に
限定されない。尚、PCRプロトコルは使用するプライ
マーに合わせて適宜変更して実施する。
【0025】
【実施例1】未知の変異の検出を、ヒトゲノムWO01
1092(Genbank:Accession Nu
mber)に登録されている遺伝子配列に未知の変異が
存在するか否かを本発明の方法を用いて複数検体のTm
値およびTmのパターンを比較した。
1092(Genbank:Accession Nu
mber)に登録されている遺伝子配列に未知の変異が
存在するか否かを本発明の方法を用いて複数検体のTm
値およびTmのパターンを比較した。
【0026】ヒトゲノムDNAを抽出試薬として日本ジ
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット1、 センスプライマー:5’−TTTTCCTCCTGCC
CTTGTTA−3’(配列番号1)、 アンチアンチセンス:5’−AAAAGGGTTTAC
CAGGTTTG−3’(配列番号2)、 プライマーセット2、 センスプライマー:5’−CTCTTTATCAATA
CTTCACA−3’(配列番号3)、 アンチセンスプライマー:5’−GGTTTGCTAG
ATGTAAAT−3’(配列番号4)、 プライマーセット3、 センスプライマー:5’−ACACAAAAACTCA
AAACCTT−3’(配列番号5)、 アンチセンスプライマー:5’−AGTAATACTA
CCGTGATTCT−3’(配列番号6)、
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット1、 センスプライマー:5’−TTTTCCTCCTGCC
CTTGTTA−3’(配列番号1)、 アンチアンチセンス:5’−AAAAGGGTTTAC
CAGGTTTG−3’(配列番号2)、 プライマーセット2、 センスプライマー:5’−CTCTTTATCAATA
CTTCACA−3’(配列番号3)、 アンチセンスプライマー:5’−GGTTTGCTAG
ATGTAAAT−3’(配列番号4)、 プライマーセット3、 センスプライマー:5’−ACACAAAAACTCA
AAACCTT−3’(配列番号5)、 アンチセンスプライマー:5’−AGTAATACTA
CCGTGATTCT−3’(配列番号6)、
【0027】各プライマーの位置関係は図4に示す通り
である。図中、目的検索範囲(6)を含む検体に対して
プライマーセット1(7)、プライマーセット2(8)
及びプライマーセット3(9)を配置してPCRを行
う。
である。図中、目的検索範囲(6)を含む検体に対して
プライマーセット1(7)、プライマーセット2(8)
及びプライマーセット3(9)を配置してPCRを行
う。
【0028】PCRはABI社製のリアルタイムPCR
定量機GeneAmp5700を使用して95℃/5
秒、55℃/10秒、72℃/20秒を40サイクルの
プロトコールで行った。検討は1検体につきプライマー
セット3種類で行い、総計35検体を解析した。得られ
た結果を表2に示す。
定量機GeneAmp5700を使用して95℃/5
秒、55℃/10秒、72℃/20秒を40サイクルの
プロトコールで行った。検討は1検体につきプライマー
セット3種類で行い、総計35検体を解析した。得られ
た結果を表2に示す。
【0029】
【表2】
【0030】表中、Tmパターンの表記方法に関し、2
本鎖核酸解離曲線のピークが一つのものを1峰性、ピー
クが二つに分かれているものを2峰性と表記した。又、
明確なピークとならずにショルダーとして表示される場
合をノッチ形成と表記した。
本鎖核酸解離曲線のピークが一つのものを1峰性、ピー
クが二つに分かれているものを2峰性と表記した。又、
明確なピークとならずにショルダーとして表示される場
合をノッチ形成と表記した。
【0031】表2から、遺伝子配列に未知の変異が存在
するかどうかを知る目的検索範囲(6)全てを含むプラ
イマーセット1(7)を用いた場合には35検体中の1
検体に何らかの変異が推定された。更に目的検索範囲
(6)を絞ったプライマーセット2(8)及びプライマ
ーセット3(9)でも同一検体に何らかの変異が推定さ
れ、特に範囲の狭いプライマーセット3(9)ではTm
値の変化だけでなく、明らかなTmパターンの変化も認
めた。従って目的検索範囲(6)のプライマーセット3
(9)の範囲に変異の存在が推定され、この部分のシー
クエンスで2塩基の変異が確認された。これにより、プ
ライマーセット1(7)、プライマーセット2(8)は
プライマーセット3(9)より塩基量が多いため、2塩
基変異のTmに与える影響が小さかったことも確認され
た。以上の結果からプライマーセット3(9)を用いた
場合、この部分の塩基変異をSNPsとしてTm値およ
びTmパターンから検出することが可能となった。
するかどうかを知る目的検索範囲(6)全てを含むプラ
イマーセット1(7)を用いた場合には35検体中の1
検体に何らかの変異が推定された。更に目的検索範囲
(6)を絞ったプライマーセット2(8)及びプライマ
ーセット3(9)でも同一検体に何らかの変異が推定さ
れ、特に範囲の狭いプライマーセット3(9)ではTm
値の変化だけでなく、明らかなTmパターンの変化も認
めた。従って目的検索範囲(6)のプライマーセット3
(9)の範囲に変異の存在が推定され、この部分のシー
クエンスで2塩基の変異が確認された。これにより、プ
ライマーセット1(7)、プライマーセット2(8)は
プライマーセット3(9)より塩基量が多いため、2塩
基変異のTmに与える影響が小さかったことも確認され
た。以上の結果からプライマーセット3(9)を用いた
場合、この部分の塩基変異をSNPsとしてTm値およ
びTmパターンから検出することが可能となった。
【0032】本実施例では、検体からDNAを抽出する
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして、株式会社島津製作所製のA
mpdirectを用いることも可能であり、この際に
は全血1μlを直接検体として用いた。
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして、株式会社島津製作所製のA
mpdirectを用いることも可能であり、この際に
は全血1μlを直接検体として用いた。
【0033】又、本実施例では、各検体のTm値および
Tmパターンを既存のデータとしてデジタル化してコン
ピューターにインストールすることにより未知の検体か
ら得られたTm値およびTmパターンを既存のデータと
照合して核酸変異の可能性を直接表示する機能が付加さ
れた。更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異
表示法が含まれる。
Tmパターンを既存のデータとしてデジタル化してコン
ピューターにインストールすることにより未知の検体か
ら得られたTm値およびTmパターンを既存のデータと
照合して核酸変異の可能性を直接表示する機能が付加さ
れた。更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異
表示法が含まれる。
【0034】
【実施例2】既知の変異の検出を、ヒトゲノムHomo
Sapiens ABO Glycosyltran
sferase(ABO)Gene Exon 7:A
F182746−AF182756(Genbank:
Accession Number)に登録されている
遺伝子配列について、既知の変異を本発明を応用したT
m値およびTmパターンの比較から検出し、ABO式血
液型の判定を行った。
Sapiens ABO Glycosyltran
sferase(ABO)Gene Exon 7:A
F182746−AF182756(Genbank:
Accession Number)に登録されている
遺伝子配列について、既知の変異を本発明を応用したT
m値およびTmパターンの比較から検出し、ABO式血
液型の判定を行った。
【0035】ヒトゲノムDNAを抽出試薬として日本ジ
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー:5’−TGGAGACGGCGGA
GAAGCAC−3’(配列番号7)、 アンチセンスプライマー:5’−CCCCCAGGTA
GTAGAAATCG−3’(配列番号8)、 PCRはABI社製のリアルタイムPCR定量機Gen
eAmp5700を使用して95℃/5秒、55℃/1
0秒、72℃/20秒を40サイクルのプロトコールで
行った。ABO式血液型の検討は、A型、B型、AB
型、O型の各血液型4種類につき、夫々6検体を解析し
た。得られた結果を表3に示す。
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー:5’−TGGAGACGGCGGA
GAAGCAC−3’(配列番号7)、 アンチセンスプライマー:5’−CCCCCAGGTA
GTAGAAATCG−3’(配列番号8)、 PCRはABI社製のリアルタイムPCR定量機Gen
eAmp5700を使用して95℃/5秒、55℃/1
0秒、72℃/20秒を40サイクルのプロトコールで
行った。ABO式血液型の検討は、A型、B型、AB
型、O型の各血液型4種類につき、夫々6検体を解析し
た。得られた結果を表3に示す。
【0036】
【表3】
【0037】表3の結果から各血液型は、本法を用いる
とTm値およびTmパターンの特徴から容易に判別が可
能であった。
とTm値およびTmパターンの特徴から容易に判別が可
能であった。
【0038】本実施例では、検体からDNAを抽出する
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして株式会社島津製作所製のAm
pdirectを用いることが可能であり、この際には
全血1μlを直接検体とした。
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして株式会社島津製作所製のAm
pdirectを用いることが可能であり、この際には
全血1μlを直接検体とした。
【0039】又、本実施例では、各血液型のTm値およ
びTmパターンを既存のデータとしてデジタル化し、コ
ンピューターにインストールすることにより、未知の検
体から得られたTm値およびTmパターンを既存のデー
タと照合して血液型を直接表示する機能が付加された。
更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異表示法
が含まれる。
びTmパターンを既存のデータとしてデジタル化し、コ
ンピューターにインストールすることにより、未知の検
体から得られたTm値およびTmパターンを既存のデー
タと照合して血液型を直接表示する機能が付加された。
更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異表示法
が含まれる。
【0040】
【実施例3】請求項11に記載の複数プライマーを用い
た既知の変異の検出は、ヒトゲノムWO011092
(Genbank:Accession Numbe
r)に登録されている遺伝子配列に未知の変異が存在す
るか否かを本発明を用いて複数検体中のTm値及びTm
のパターンを比較することによって実施した。
た既知の変異の検出は、ヒトゲノムWO011092
(Genbank:Accession Numbe
r)に登録されている遺伝子配列に未知の変異が存在す
るか否かを本発明を用いて複数検体中のTm値及びTm
のパターンを比較することによって実施した。
【0041】ヒトゲノムDNAを抽出試薬として日本ジ
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー:5’−ATATCCCAAAAG
TTATGATT−3’(配列番号9)、 センスプライマー:5’−CCCAAAAGTTAT
GATTGAAC−3’(配列番号10)、 センスプライマー:5’−TACTTGGTGGCC
TCCGAAGA−3’(配列番号11)、 アンチセンスプライマー:5’−GGACACCAAC
TTTTCAGT−3’(配列番号12)、 尚、各プライマーの位置関係は図3に示した通りであ
る。PCRはABI社製のリアルタイムPCR定量機G
eneAmp5700を使用して95℃/5秒、55℃
/10秒、72℃/20秒を40サイクルのプロトコー
ルで行った。検討は正常型5検体、変異型5検体を試料
として解析した。得られた結果を表4に示す。表では、
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの組み
合わせをプライマーセット、センスプライマーの場
合をプライマーセット、センスプライマーの場合を
プライマーセットと表記した。
ーン社のIsogen−LSを使用して全血から常法に
従い抽出後、表1の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムDNA1μgおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー:5’−ATATCCCAAAAG
TTATGATT−3’(配列番号9)、 センスプライマー:5’−CCCAAAAGTTAT
GATTGAAC−3’(配列番号10)、 センスプライマー:5’−TACTTGGTGGCC
TCCGAAGA−3’(配列番号11)、 アンチセンスプライマー:5’−GGACACCAAC
TTTTCAGT−3’(配列番号12)、 尚、各プライマーの位置関係は図3に示した通りであ
る。PCRはABI社製のリアルタイムPCR定量機G
eneAmp5700を使用して95℃/5秒、55℃
/10秒、72℃/20秒を40サイクルのプロトコー
ルで行った。検討は正常型5検体、変異型5検体を試料
として解析した。得られた結果を表4に示す。表では、
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの組み
合わせをプライマーセット、センスプライマーの場
合をプライマーセット、センスプライマーの場合を
プライマーセットと表記した。
【0042】
【表4】
【0043】図3に示した様にPCR産物の塩基数は、
プライマーセット>プライマーセット>プライマー
セットの順であることから塩基変異の各Tm値に与え
る影響はプライマーセット<プライマーセット<プ
ライマーセットの順となっていることが示された。
又、Tm値、Tmパターン共に連続的に変化している。
この変化を見ることにより変異の存在がより明確に示さ
れた。変異が未知の場合でも、このようなプライマーセ
ットを組んで特異的な連続的変化が見られれば何らか変
異が存在する可能性が高く、故に本発明はスクリーニン
グとしても有用な方法であることが判明した。
プライマーセット>プライマーセット>プライマー
セットの順であることから塩基変異の各Tm値に与え
る影響はプライマーセット<プライマーセット<プ
ライマーセットの順となっていることが示された。
又、Tm値、Tmパターン共に連続的に変化している。
この変化を見ることにより変異の存在がより明確に示さ
れた。変異が未知の場合でも、このようなプライマーセ
ットを組んで特異的な連続的変化が見られれば何らか変
異が存在する可能性が高く、故に本発明はスクリーニン
グとしても有用な方法であることが判明した。
【0044】本実施例では、検体からDNAを抽出する
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして株式会社島津製作所製のAm
pdirectを用いることも可能であり、この際は全
血1μlを直接検体としてPCRを実施した。
ことなく、直接PCRで核酸増幅を行う場合のダイレク
トPCRバッファーとして株式会社島津製作所製のAm
pdirectを用いることも可能であり、この際は全
血1μlを直接検体としてPCRを実施した。
【0045】本実施例では、各検体のTm値およびTm
パターン及びこれらの変化を既存のデータとしてデジタ
ル化し、コンピューターにインストールすることによっ
て未知の検体から得られたTm値およびTmパターンお
よびこれらの変化を既存のデータと照合して変異の可能
性を直接表示する機能を付加した。本発明には、この原
理を応用した表示法も含まれる。
パターン及びこれらの変化を既存のデータとしてデジタ
ル化し、コンピューターにインストールすることによっ
て未知の検体から得られたTm値およびTmパターンお
よびこれらの変化を既存のデータと照合して変異の可能
性を直接表示する機能を付加した。本発明には、この原
理を応用した表示法も含まれる。
【0046】
【発明の効果】本発明は、2本鎖核酸を加熱して1本鎖
核酸に解離する温度の差黒を利用して未知あるいは既知
の核酸塩基配列変異を検出する方法及び表示法に関する
もので、検体の2本鎖核酸溶解曲線及び該曲線を微分し
て求められる2本鎖核酸解離曲線のバターンから塩基変
異を容易に検出することが可能となる。本発明の方法を
利用することによって従来の検出法に比較して高度な技
術習得をすることなく、又、高価な装置を用いることな
く塩基変異の検出を可能とする。更に、本発明はABO
式血液型、HLA(Human Leukocyte
Antigen)タイピング及び糖尿病性腎症関連SN
Ps(Diabetic Nephropathy R
elated Single Nucleotide
Polymorphism)等の判定にも利用出来る。
核酸に解離する温度の差黒を利用して未知あるいは既知
の核酸塩基配列変異を検出する方法及び表示法に関する
もので、検体の2本鎖核酸溶解曲線及び該曲線を微分し
て求められる2本鎖核酸解離曲線のバターンから塩基変
異を容易に検出することが可能となる。本発明の方法を
利用することによって従来の検出法に比較して高度な技
術習得をすることなく、又、高価な装置を用いることな
く塩基変異の検出を可能とする。更に、本発明はABO
式血液型、HLA(Human Leukocyte
Antigen)タイピング及び糖尿病性腎症関連SN
Ps(Diabetic Nephropathy R
elated Single Nucleotide
Polymorphism)等の判定にも利用出来る。
【0047】
SEQUENCE LISTING 〈110〉大島 譲二 〈120〉核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知
あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 〈130〉OJ010427 〈141〉2001−4−27 〈160〉12 〈210〉1 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉1 ttttcctcct gcccttgta 20 〈210〉2 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉2 aaaagggttt accaggtttg 20 〈210〉3 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉3 ctctttatca atacttcaca 20 〈210〉4 〈211〉18 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉4 ggtttgctag atgtaaat 18 〈210〉5 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉5 acacaaaaac tcaaaacctt 20 〈210〉6 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉6 agtaatacta ccgtgattct 20 〈210〉7 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉7 tggagacggc ggagaagcac 20 〈210〉8 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉8 cccccaggta gtagaaatcg 20 〈210〉9 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉9 atatcccaaa agttatgatt 20 〈210〉10 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉10 cccaaaagtt atgattgaac 20 〈210〉11 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉11 tacttggtgg cctccgaaga 20 〈210〉12 〈211〉18 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉12 ggacaccaac ttttcagt 18
あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 〈130〉OJ010427 〈141〉2001−4−27 〈160〉12 〈210〉1 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉1 ttttcctcct gcccttgta 20 〈210〉2 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉2 aaaagggttt accaggtttg 20 〈210〉3 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉3 ctctttatca atacttcaca 20 〈210〉4 〈211〉18 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉4 ggtttgctag atgtaaat 18 〈210〉5 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉5 acacaaaaac tcaaaacctt 20 〈210〉6 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉6 agtaatacta ccgtgattct 20 〈210〉7 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉7 tggagacggc ggagaagcac 20 〈210〉8 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉8 cccccaggta gtagaaatcg 20 〈210〉9 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉9 atatcccaaa agttatgatt 20 〈210〉10 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉10 cccaaaagtt atgattgaac 20 〈210〉11 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉11 tacttggtgg cctccgaaga 20 〈210〉12 〈211〉18 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉12 ggacaccaac ttttcagt 18
【図面の簡単な説明】
【図1】温度に対する蛍光強度の関係で示した2本鎖核
酸溶解曲線の一例である。
酸溶解曲線の一例である。
【図2】2本鎖核酸溶解曲線を微分して得られた2本鎖
核酸解離曲線の一例である。
核酸解離曲線の一例である。
【図3】核酸変異の場所とプライマーの配置を示す模式
図である。
図である。
【図4】未知の核酸変異を検出する場合のプライマーセ
ットの位置関係を示す模式図である。
ットの位置関係を示す模式図である。
1 塩基変異 2 アンチセンスプライマー 3−5 センスプライマー 6 目的検索範囲 7−9 プライマーセット
Claims (16)
- 【請求項1】 未知の核酸変異の検出法であって、検体
からゲノムDNAを抽出後リアルタイム定量PCR法で
増幅し、増幅した2本鎖核酸を加熱した際に1本鎖核酸
へ変性する温度を観察した2本鎖核酸溶解曲線(Mel
t Curve)、あるいは該曲線を微分して得られた
2本鎖核酸解離曲線(Dissociation Cu
rve)を検体ごとに比較してゲノムDNAの未知の変
異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項2】 未知の核酸変異の検出法であって、検体
からゲノムDNAを核酸増幅法で増幅し、増幅した2本
鎖核酸を加熱した際に1本鎖核酸へ変性する温度を観察
した2本鎖核酸溶解曲線(Melt Curve)、あ
るいは該曲線を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線
(Dissociation Curve)を検体ごと
に比較してゲノムDNAの未知の変異を推定することを
特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項3】 未知の核酸の変異検出法であって、検体
からゲノムDNAを直接抽出し、2本鎖核酸を加熱した
際に1本鎖核酸へ変性する温度を観察した2本鎖核酸溶
解曲線(Melt Curve)、あるいは該曲線を微
分して得られた2本鎖核酸解離曲線(Dissocia
tion Curve)を検体ごとに比較してゲノムD
NAの未知の変異を推定することを特徴とする核酸変異
検出法。 - 【請求項4】 上記検体からゲノムDNAを抽出するこ
となく、ダイレクトPCRバッファーなどを併用し、直
接リアルタイム定量PCR法で増幅後、増幅した2本鎖
核酸を加熱した際に1本鎖核酸へ変性する温度を観察し
た2本鎖核酸溶解曲線(Melt Curve)、ある
いは該曲線を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線(D
issociation Curve)を検体ごとに比
較してゲノムDNAの未知の変異を推定することを特徴
とする核酸変異検出法。 - 【請求項5】 上記検体からゲノムDNAを抽出するこ
となく、ダイレクトバッファーなどを併用し、核酸増幅
法で増幅後、増幅した2本鎖核酸を加熱した際に1本鎖
核酸へ変性する温度を観察した2本鎖核酸溶解曲線(M
elt Curve)、あるいは該曲線を微分して得ら
れた2本鎖核酸解離曲線(Dissociation
Curve)を検体ごとに比較してゲノムDNAの未知
の変異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項6】 上記検体からゲノムDNAを抽出するこ
となく、ダイレクトバッファーなどを併用し、2本鎖核
酸を加熱した際に1本鎖核酸へ変性する温度を観察した
2本鎖核酸溶解曲線(Melt Curve)、あるい
は該曲線を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線(Di
ssociation Curve)を検体ごとに比較
してゲノムDNAの未知の変異を推定することを特徴と
する核酸変異検出法。 - 【請求項7】 既知の核酸変異の検出法であって、上記
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法を用いて変異
型ゲノムDNAの2本鎖核酸溶解曲線(Melt Cu
rve)、あるいは該曲線を微分して得られた2本鎖核
酸解離曲線(Dissociation Curve)
を実験的に予め作成し、その比較からゲノムDNAの既
知の変異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項8】 未知あるいは既知の核酸変異検出法であ
って、上記請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法を
用いて、人為的に合成したDNAの変異の検出を2本鎖
核酸溶解曲線(Melt Curve)、あるいは該曲
線を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線(Disso
ciation Curve)との比較から推定するこ
とを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項9】未知あるいは既知の核酸変異検出法であっ
て、上記請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法を用
いて、RNAから逆転写法(RT−PCR法など)など
で人為的に合成したDNAの変異の検出を2本鎖核酸溶
解曲線(Melt Curve)、あるいは該曲線を微
分して得られた2本鎖核酸解離曲線(Dissocia
tion Curve)との比較から推定することを特
徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項10】未知あるいは既知の核酸変異検出法であ
って、上記請求項1〜7いずれか1項に記載の方法を用
いて、混入DNAや未知遺伝子など予期せぬ核酸の存在
を2本鎖核酸溶解曲線(Melt Curve)、ある
いは該曲線を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線(D
issociation Curve)との比較から推
定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項11】 未知あるいは既知の核酸変異検出法で
あって、上記請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法
を用いて、更に一方のプライマー(例えばセンスプライ
マー)を数種類、他方のプライマー(例えばアンチセン
スプライマー)を1種類使用し、2本鎖核酸溶解曲線
(Melt Curve)、あるいは該曲線を微分して
得られた2本鎖核酸解離曲線(Dissociatio
n Curve)との比較から推定することを特徴とす
る核酸変異検出法。 - 【請求項12】 上記請求項1〜11のいずれか1項に
記載の方法を用いて1塩基変異、塩基欠失、塩基挿入、
マイクロサテライト変異などの核酸の変異を、2本鎖核
酸溶解曲線(Melt Curve)、あるいは該曲線
を微分して得られた2本鎖核酸解離曲線(Dissoc
iation Curve)との比較から推定すること
を特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項13】 上記請求項1〜12のいずれか1項に
記載の方法を用いて検出した変異を、予め得られていた
既知の遺伝子情報と照合し、その判定結果を直接表示す
ることを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項14】 上記請求項1〜12のいずれか1項に
記載の方法を用いて検出した結果をABO式血液型の判
定に利用することを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項15】 上記請求項1〜12のいずれか1項に
記載の方法を用いて検出した結果をHLA(Human
Leukocyte Antigen)タイピングの
判定に利用することを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項16】 上記請求項1〜12のいずれか1項に
記載の方法を用いて検出した結果を糖尿病性腎症関連S
NPs(Diabetic Nephropathy
Related Single Nucleotide
Polymorphism)の判定に利用することを
特徴とする核酸変異検出表示法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001168840A JP2002325581A (ja) | 2001-04-27 | 2001-04-27 | 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001168840A JP2002325581A (ja) | 2001-04-27 | 2001-04-27 | 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002325581A true JP2002325581A (ja) | 2002-11-12 |
Family
ID=19010993
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001168840A Pending JP2002325581A (ja) | 2001-04-27 | 2001-04-27 | 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2002325581A (ja) |
Cited By (8)
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---|---|---|---|---|
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US7547514B2 (en) | 2004-07-28 | 2009-06-16 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods for monitoring genomic DNA of organisms |
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JP2015509710A (ja) * | 2012-02-16 | 2015-04-02 | オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド | ポリマーの測定の解析 |
US10131943B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-11-20 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Analysis of a polynucleotide via a nanopore system |
US10689697B2 (en) | 2014-10-16 | 2020-06-23 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Analysis of a polymer |
CN116042854A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-05-02 | 江苏中济万泰生物医药有限公司 | 一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法 |
US11921103B2 (en) | 2011-09-23 | 2024-03-05 | Oxford Nanopore Technologies Plc | Method of operating a measurement system to analyze a polymer |
-
2001
- 2001-04-27 JP JP2001168840A patent/JP2002325581A/ja active Pending
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