JP2002325581A - 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 - Google Patents
核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法Info
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- JP2002325581A JP2002325581A JP2001168840A JP2001168840A JP2002325581A JP 2002325581 A JP2002325581 A JP 2002325581A JP 2001168840 A JP2001168840 A JP 2001168840A JP 2001168840 A JP2001168840 A JP 2001168840A JP 2002325581 A JP2002325581 A JP 2002325581A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 未知および既知の核酸の変異を迅速、容易
に、かつ低コストで求められる方法及びこれらを表示す
る方法を提供する。 【解決手段】 ２本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、１本鎖核酸に解離する温度点（Ｔｍ値）の差異及び
その特徴から核酸の変異を検出する方法によって課題を
解決した。得られた既存のＴｍ値、Ｔｍパターン及びこ
れらの変化をデータベースとして蓄積し、検体のＴｍ
値、Ｔｍパターン及びこれらの変化と比較照合すること
により、未知および既知の変異の検出を迅速、容易に、
かつ低コストで行うことが出来る。
に、かつ低コストで求められる方法及びこれらを表示す
る方法を提供する。 【解決手段】 ２本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、１本鎖核酸に解離する温度点（Ｔｍ値）の差異及び
その特徴から核酸の変異を検出する方法によって課題を
解決した。得られた既存のＴｍ値、Ｔｍパターン及びこ
れらの変化をデータベースとして蓄積し、検体のＴｍ
値、Ｔｍパターン及びこれらの変化と比較照合すること
により、未知および既知の変異の検出を迅速、容易に、
かつ低コストで行うことが出来る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、２本鎖核酸を加熱
し、１本鎖に解離する温度の差異及びその特徴から２本
鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変異を推定する核酸判
別法に関する。
し、１本鎖に解離する温度の差異及びその特徴から２本
鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変異を推定する核酸判
別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】２本鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変
異を検出する方法としては、従来から様々な方法が考案
され、実用化されてきた。この核酸の変異とは、主にそ
の塩基配列の塩基の変異、または長さの変異に関するも
のであり、それらを検出することにより判別されてき
た。
異を検出する方法としては、従来から様々な方法が考案
され、実用化されてきた。この核酸の変異とは、主にそ
の塩基配列の塩基の変異、または長さの変異に関するも
のであり、それらを検出することにより判別されてき
た。
【０００３】未知の核酸塩基配列変異の検出法として
は、対象とする塩基配列の部分をＰＣＲで増幅し、この
増幅産物を変性せず、直接、ポリアクリルアミドで電気
泳動し、その泳動度の差から変異を検出するＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ（ＰＣＲ−ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法があ
る。この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化
を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショ
ットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング
法などシークエンス技術を基本として未知の変異を検出
する方法も汎用されている。
は、対象とする塩基配列の部分をＰＣＲで増幅し、この
増幅産物を変性せず、直接、ポリアクリルアミドで電気
泳動し、その泳動度の差から変異を検出するＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ（ＰＣＲ−ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法があ
る。この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化
を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショ
ットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング
法などシークエンス技術を基本として未知の変異を検出
する方法も汎用されている。
【０００４】既知の核酸塩基配列変異の検出法として
は、核酸を制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に
意図的にＰＣＲプライマーの３’末端を配置し、ＰＣＲ
が行われるか否かで判別するＰＣＲ−ＡＳＰ（ＰＣＲ−
Ａｌｌｅｌｅ ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｉｍｅｒ）法や、
変異部分をＰＣＲで増幅し、これが制限酵素で切断可能
か否かで判別するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、変異部分をさらに蛍光標
識プローブで検出するタックマンプローブ法、最新の技
術としてＩｎｖａｄｅｒ法などがある。
は、核酸を制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に
意図的にＰＣＲプライマーの３’末端を配置し、ＰＣＲ
が行われるか否かで判別するＰＣＲ−ＡＳＰ（ＰＣＲ−
Ａｌｌｅｌｅ ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｉｍｅｒ）法や、
変異部分をＰＣＲで増幅し、これが制限酵素で切断可能
か否かで判別するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、変異部分をさらに蛍光標
識プローブで検出するタックマンプローブ法、最新の技
術としてＩｎｖａｄｅｒ法などがある。
【０００５】最近ではＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が個人に
最適な医療を提供することが出来るとの判断から、特に
既知の塩基変異の検出法としてＤＮＡチップ法などの方
法を用いて遺伝子の塩基配列の変異を検出する方法も開
発されているが、それらの方法に比較して時間的にも経
済的にもより一層効率的な変異検出法が求められてい
る。
ｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が個人に
最適な医療を提供することが出来るとの判断から、特に
既知の塩基変異の検出法としてＤＮＡチップ法などの方
法を用いて遺伝子の塩基配列の変異を検出する方法も開
発されているが、それらの方法に比較して時間的にも経
済的にもより一層効率的な変異検出法が求められてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現在ま
でに行われている核酸変異検出法は、いずれも熟練した
技術を必要とし、かつ検出には相応の時間とコストを必
要とする。特に未知の変異検出法は、高度な技術を習熟
した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負
担をかけてなし得る方法しか開発されていない。
でに行われている核酸変異検出法は、いずれも熟練した
技術を必要とし、かつ検出には相応の時間とコストを必
要とする。特に未知の変異検出法は、高度な技術を習熟
した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負
担をかけてなし得る方法しか開発されていない。
【０００７】又、既知の変異、未知の変異をいずれも検
出可能な方法は現在のところダイレクトシークエンス法
しかないが、同法は上述の方法の中でも特に実行者に対
し技術的、時間的及び金銭的な負担を強いるものであ
る。
出可能な方法は現在のところダイレクトシークエンス法
しかないが、同法は上述の方法の中でも特に実行者に対
し技術的、時間的及び金銭的な負担を強いるものであ
る。
【０００８】現在は様々の分野で遺伝子情報が必要とさ
れ、特にＳＮＰｓの概念が確立して以来、既知のＳＮＰ
ｓを検出するのと同様、未知のＳＮＰｓを効率良く、つ
まり高度な技術を必要とせず短時間に安価に核酸変異を
検出する方法の開発が待たれている。
れ、特にＳＮＰｓの概念が確立して以来、既知のＳＮＰ
ｓを検出するのと同様、未知のＳＮＰｓを効率良く、つ
まり高度な技術を必要とせず短時間に安価に核酸変異を
検出する方法の開発が待たれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】係る事情に鑑み発明者は
鋭意研究の結果、２本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、１本鎖に解離する温度点の差異及びその特徴から２
本鎖核酸の未知あるいは既知の変異を短時間に容易に安
価に推定する核酸変異検出法の発明に至った。
鋭意研究の結果、２本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱
し、１本鎖に解離する温度点の差異及びその特徴から２
本鎖核酸の未知あるいは既知の変異を短時間に容易に安
価に推定する核酸変異検出法の発明に至った。
【００１０】本発明の原理を説明すれば、検体中の２本
鎖核酸に温度をかけていくと、それらは各々１本鎖核酸
に解離する。この急激に解離する温度点をＴｍ（Ｍｅｌ
ｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値と呼ぶが、解離
温度及びスピードなどの特性は２本鎖核酸の塩基配列及
び塩基のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）間、グアニン
（Ｇ）とシトシン（Ｃ）間の結合強度に差があるために
各塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの含有率に左右される。又、この
解離する温度及びスピードは同じく２本鎖核酸の長さに
も左右されるため、マイクロサテライトのリピート数の
差異によっても変化する。従って対象とする２本鎖核酸
部分のＴｍ値あるいはＴｍパターンを異なる検体間で比
較し、異なった値あるいはパターンを示す検体に何らか
の未知の変異を推定することができる。また、予め正常
型・異常型のＴｍ値あるいはＴｍのパターンを作成して
おけば、検体核酸のＴｍ値あるいはＴｍのパターンを比
較照合することにより、異常型の存在を既知の変異とし
て検出することが可能である。
鎖核酸に温度をかけていくと、それらは各々１本鎖核酸
に解離する。この急激に解離する温度点をＴｍ（Ｍｅｌ
ｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値と呼ぶが、解離
温度及びスピードなどの特性は２本鎖核酸の塩基配列及
び塩基のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）間、グアニン
（Ｇ）とシトシン（Ｃ）間の結合強度に差があるために
各塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの含有率に左右される。又、この
解離する温度及びスピードは同じく２本鎖核酸の長さに
も左右されるため、マイクロサテライトのリピート数の
差異によっても変化する。従って対象とする２本鎖核酸
部分のＴｍ値あるいはＴｍパターンを異なる検体間で比
較し、異なった値あるいはパターンを示す検体に何らか
の未知の変異を推定することができる。また、予め正常
型・異常型のＴｍ値あるいはＴｍのパターンを作成して
おけば、検体核酸のＴｍ値あるいはＴｍのパターンを比
較照合することにより、異常型の存在を既知の変異とし
て検出することが可能である。
【００１１】前記の発明原理を、図面を用いて説明する
と図１及び図２の様になる。図１は横軸に温度、縦軸に
蛍光強度をとって示した２本鎖核酸溶解曲線であるが、
例えばＡ、Ｂ、Ｃの三種のＰＣＲ産物に温度をかけてい
くと２本鎖核酸は一定の温度で１本鎖核酸に解離してい
くために蛍光強度が徐々に低下していくが、この低下の
パターンは２本鎖核酸中のＧＣ含有量、長さ、立体構造
などにより規定されて各々独自の曲線となる。ここで急
激に解離の進行する温度を解離温度（Ｔｍ値）と呼ぶ。
と図１及び図２の様になる。図１は横軸に温度、縦軸に
蛍光強度をとって示した２本鎖核酸溶解曲線であるが、
例えばＡ、Ｂ、Ｃの三種のＰＣＲ産物に温度をかけてい
くと２本鎖核酸は一定の温度で１本鎖核酸に解離してい
くために蛍光強度が徐々に低下していくが、この低下の
パターンは２本鎖核酸中のＧＣ含有量、長さ、立体構造
などにより規定されて各々独自の曲線となる。ここで急
激に解離の進行する温度を解離温度（Ｔｍ値）と呼ぶ。
【００１２】図１を微分したものが図２に示す２本鎖核
酸解離曲線である。この図ではＴｍ値はピークとして表
示されるので、曲線間の違いが一層明らかとなる。２本
鎖核酸は各々独自の解離曲線を持つので予め実験的に作
成しておいた正常な核酸の解離曲線と比較することによ
って核酸変異を検出するのが本発明の原理となってい
る。
酸解離曲線である。この図ではＴｍ値はピークとして表
示されるので、曲線間の違いが一層明らかとなる。２本
鎖核酸は各々独自の解離曲線を持つので予め実験的に作
成しておいた正常な核酸の解離曲線と比較することによ
って核酸変異を検出するのが本発明の原理となってい
る。
【００１３】更に本発明では請求項１１に記載の方法に
よりＴｍ値あるいはＴｍピークをより明確にする方法に
ついて考案した。その原理を図３を用いて説明する。図
３において核酸に塩基異変（１）存在下においてアンチ
センスプライマー（２）とセンスプライマー（３）、
センスプライマー（４）及びセンスプライマー
（５）を用いて核酸増幅を行うと場合、アンチセンスプ
ライマーとセンスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴ
ｍ、センスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴｍ
、センスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴｍと
すると塩基変異の各Ｔｍ値に与える影響はＴｍ、Ｔｍ
、Ｔｍの順（Ｔｍ＜Ｔｍ＜Ｔｍ）で大きくな
る。
よりＴｍ値あるいはＴｍピークをより明確にする方法に
ついて考案した。その原理を図３を用いて説明する。図
３において核酸に塩基異変（１）存在下においてアンチ
センスプライマー（２）とセンスプライマー（３）、
センスプライマー（４）及びセンスプライマー
（５）を用いて核酸増幅を行うと場合、アンチセンスプ
ライマーとセンスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴ
ｍ、センスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴｍ
、センスプライマーとの間のＰＣＲ産物をＴｍと
すると塩基変異の各Ｔｍ値に与える影響はＴｍ、Ｔｍ
、Ｔｍの順（Ｔｍ＜Ｔｍ＜Ｔｍ）で大きくな
る。
【００１４】一般的にＴｍ値およびＴｍピークは、対象
範囲の塩基数が多いほど１塩基の変異が影響する程度は
小さく、対象範囲の塩基数が少ないほど１塩基の変異が
影響する程度は大きい。従って、図３のように核酸増幅
産物が変異を含み、且つ核酸増幅産物の塩基数の異なる
ＰＣＲプライマーセットを複数配置し、各々のＴｍ値あ
るいはＴｍピークを比較すると、これらは塩基数に応じ
て連続的な変化を示す。この連続的な変化は変異の有無
により異なるパターンを示すため、既知の変異を検出す
る目的であれば正常の連続パターンとの比較から、また
未知の変異を検出目的であれば特異な連続パターンを示
すものを選択することにより塩基変異の確認が可能とな
る。
範囲の塩基数が多いほど１塩基の変異が影響する程度は
小さく、対象範囲の塩基数が少ないほど１塩基の変異が
影響する程度は大きい。従って、図３のように核酸増幅
産物が変異を含み、且つ核酸増幅産物の塩基数の異なる
ＰＣＲプライマーセットを複数配置し、各々のＴｍ値あ
るいはＴｍピークを比較すると、これらは塩基数に応じ
て連続的な変化を示す。この連続的な変化は変異の有無
により異なるパターンを示すため、既知の変異を検出す
る目的であれば正常の連続パターンとの比較から、また
未知の変異を検出目的であれば特異な連続パターンを示
すものを選択することにより塩基変異の確認が可能とな
る。
【００１５】即ち、既知の変異の場合、Ｔｍでは変異
がある場合とない場合とのＴｍ値の変化はほとんどない
が、Ｔｍ、ＴｍのＴｍ値は連続的に変化が大きくな
る。又、未知の変異の場合は、ＴｍでＴｍ値の変化が
ほとんどなく、Ｔｍ、ＴｍのＴｍ値の変化が連続的
に大きくなることからその存在を推定することができ
る。いずれにせよ、変異の存在は１種類のプライマーセ
ットを用いた場合よりも明確になる。
がある場合とない場合とのＴｍ値の変化はほとんどない
が、Ｔｍ、ＴｍのＴｍ値は連続的に変化が大きくな
る。又、未知の変異の場合は、ＴｍでＴｍ値の変化が
ほとんどなく、Ｔｍ、ＴｍのＴｍ値の変化が連続的
に大きくなることからその存在を推定することができ
る。いずれにせよ、変異の存在は１種類のプライマーセ
ットを用いた場合よりも明確になる。
【００１６】本発明は、採取された検体からゲノムＤＮ
Ａを抽出して２本鎖核酸溶解曲線あるいは２本鎖核酸解
離曲線、又は核酸増幅を実施することによって核酸増幅
物の溶解曲線あるいは解離曲線を作成してＴｍ値を求め
る方法以外に検体を破壊する構成物、酵素反応阻害因子
を抑制する構成物などを含むダイレクトＰＣＲバッファ
ーなどを使用することによって検体からＤＮＡを抽出す
ることなく、直接ＰＣＲを行って核酸増幅を行う方法に
おいても本発明は有効である。
Ａを抽出して２本鎖核酸溶解曲線あるいは２本鎖核酸解
離曲線、又は核酸増幅を実施することによって核酸増幅
物の溶解曲線あるいは解離曲線を作成してＴｍ値を求め
る方法以外に検体を破壊する構成物、酵素反応阻害因子
を抑制する構成物などを含むダイレクトＰＣＲバッファ
ーなどを使用することによって検体からＤＮＡを抽出す
ることなく、直接ＰＣＲを行って核酸増幅を行う方法に
おいても本発明は有効である。
【００１７】検体からＤＮＡを抽出することなく、直接
ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレクトＰＣＲバッフ
ァーとして株式会社島津製作所製のＡｍｐｄｉｒｅｃｔ
が有用であるが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレクトＰＣＲバッフ
ァーとして株式会社島津製作所製のＡｍｐｄｉｒｅｃｔ
が有用であるが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
【００１８】本発明は、検出した変異を予め得られてい
た既知の遺伝子情報と照合し、Ｔｍ値あるいはＴｍパタ
ーン以外にその判定結果を直接表示する核酸変異検出表
示技術に応用出来る。又、本発明はＡＢＯ式血液型、Ｈ
ＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ）タイピング及び糖尿病性腎症関連ＳＮＰｓ（Ｄｉａ
ｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ）等の判定にも利用出来る。
た既知の遺伝子情報と照合し、Ｔｍ値あるいはＴｍパタ
ーン以外にその判定結果を直接表示する核酸変異検出表
示技術に応用出来る。又、本発明はＡＢＯ式血液型、Ｈ
ＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ）タイピング及び糖尿病性腎症関連ＳＮＰｓ（Ｄｉａ
ｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ）等の判定にも利用出来る。
【００１９】
【発明の実施の形態】次に、本発明の核酸変異検出法
を、既知の核酸を試料に用いて表１に示したＰＣＲ反応
液の処方で詳細に説明する。
を、既知の核酸を試料に用いて表１に示したＰＣＲ反応
液の処方で詳細に説明する。
【００２０】
【表１】
【００２１】試料の検体ＤＮＡを入れて、蒸留水Ｙμｌ
で合計が５０μｌとなるように処方した表１に示した反
応液を良く攪拌し、その全量５０μｌをＡＢＩ社製のリ
アルタイムＰＣＲ定量機ＧｅｎｅＡｍｐ５７００にセッ
トしてＰＣＲを開始する。ＰＣＲプロトコールは、９５
℃／５秒、５５℃／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイ
クル行う。
で合計が５０μｌとなるように処方した表１に示した反
応液を良く攪拌し、その全量５０μｌをＡＢＩ社製のリ
アルタイムＰＣＲ定量機ＧｅｎｅＡｍｐ５７００にセッ
トしてＰＣＲを開始する。ＰＣＲプロトコールは、９５
℃／５秒、５５℃／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイ
クル行う。
【００２２】ＰＣＲ終了後、２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅ
ｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、および該曲線を微分して得られた
２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕ
ｒｖｅ）が作成されるが、これらをいくつかの検体間で
比較し、異なったＴｍ値あるいはＴｍパターンを示す検
体に何らかの未知の変異を推定することが出来る。
ｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、および該曲線を微分して得られた
２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕ
ｒｖｅ）が作成されるが、これらをいくつかの検体間で
比較し、異なったＴｍ値あるいはＴｍパターンを示す検
体に何らかの未知の変異を推定することが出来る。
【００２３】又、予め正常型・異常型のＴｍ値あるいは
Ｔｍのパターンが作成してある場合、検体ＤＮＡのＴｍ
値あるいはＴｍのパターンを比較照合することにより、
異常型の存在を既知の変異として検出することが可能で
ある。
Ｔｍのパターンが作成してある場合、検体ＤＮＡのＴｍ
値あるいはＴｍのパターンを比較照合することにより、
異常型の存在を既知の変異として検出することが可能で
ある。
【００２４】リアルタイムＰＣＲ定量機は、ＡＢＩ社製
のＧｅｎｅＡｍｐ５７００に限定されるものでなく、何
れの製品でも構わない。又、蛍光色素は、インターカレ
ーターであればＳｙＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン）に
限定されない。尚、ＰＣＲプロトコルは使用するプライ
マーに合わせて適宜変更して実施する。
のＧｅｎｅＡｍｐ５７００に限定されるものでなく、何
れの製品でも構わない。又、蛍光色素は、インターカレ
ーターであればＳｙＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン）に
限定されない。尚、ＰＣＲプロトコルは使用するプライ
マーに合わせて適宜変更して実施する。
【００２５】
【実施例１】未知の変異の検出を、ヒトゲノムＷＯ０１
１０９２（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕ
ｍｂｅｒ）に登録されている遺伝子配列に未知の変異が
存在するか否かを本発明の方法を用いて複数検体のＴｍ
値およびＴｍのパターンを比較した。
１０９２（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕ
ｍｂｅｒ）に登録されている遺伝子配列に未知の変異が
存在するか否かを本発明の方法を用いて複数検体のＴｍ
値およびＴｍのパターンを比較した。
【００２６】ヒトゲノムＤＮＡを抽出試薬として日本ジ
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット１、 センスプライマー：５’−ＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＣＴＴＧＴＴＡ−３’（配列番号１）、 アンチアンチセンス：５’−ＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＣ
ＣＡＧＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２）、 プライマーセット２、 センスプライマー：５’−ＣＴＣＴＴＴＡＴＣＡＡＴＡ
ＣＴＴＣＡＣＡ−３’（配列番号３）、 アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＴＴＴＧＣＴＡＧ
ＡＴＧＴＡＡＡＴ−３’（配列番号４）、 プライマーセット３、 センスプライマー：５’−ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡ
ＡＡＡＣＣＴＴ−３’（配列番号５）、 アンチセンスプライマー：５’−ＡＧＴＡＡＴＡＣＴＡ
ＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号６）、
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット１、 センスプライマー：５’−ＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＣＴＴＧＴＴＡ−３’（配列番号１）、 アンチアンチセンス：５’−ＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＣ
ＣＡＧＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２）、 プライマーセット２、 センスプライマー：５’−ＣＴＣＴＴＴＡＴＣＡＡＴＡ
ＣＴＴＣＡＣＡ−３’（配列番号３）、 アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＴＴＴＧＣＴＡＧ
ＡＴＧＴＡＡＡＴ−３’（配列番号４）、 プライマーセット３、 センスプライマー：５’−ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡ
ＡＡＡＣＣＴＴ−３’（配列番号５）、 アンチセンスプライマー：５’−ＡＧＴＡＡＴＡＣＴＡ
ＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号６）、
【００２７】各プライマーの位置関係は図４に示す通り
である。図中、目的検索範囲（６）を含む検体に対して
プライマーセット１（７）、プライマーセット２（８）
及びプライマーセット３（９）を配置してＰＣＲを行
う。
である。図中、目的検索範囲（６）を含む検体に対して
プライマーセット１（７）、プライマーセット２（８）
及びプライマーセット３（９）を配置してＰＣＲを行
う。
【００２８】ＰＣＲはＡＢＩ社製のリアルタイムＰＣＲ
定量機ＧｅｎｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５
秒、５５℃／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルの
プロトコールで行った。検討は１検体につきプライマー
セット３種類で行い、総計３５検体を解析した。得られ
た結果を表２に示す。
定量機ＧｅｎｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５
秒、５５℃／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルの
プロトコールで行った。検討は１検体につきプライマー
セット３種類で行い、総計３５検体を解析した。得られ
た結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】表中、Ｔｍパターンの表記方法に関し、２
本鎖核酸解離曲線のピークが一つのものを１峰性、ピー
クが二つに分かれているものを２峰性と表記した。又、
明確なピークとならずにショルダーとして表示される場
合をノッチ形成と表記した。
本鎖核酸解離曲線のピークが一つのものを１峰性、ピー
クが二つに分かれているものを２峰性と表記した。又、
明確なピークとならずにショルダーとして表示される場
合をノッチ形成と表記した。
【００３１】表２から、遺伝子配列に未知の変異が存在
するかどうかを知る目的検索範囲（６）全てを含むプラ
イマーセット１（７）を用いた場合には３５検体中の１
検体に何らかの変異が推定された。更に目的検索範囲
（６）を絞ったプライマーセット２（８）及びプライマ
ーセット３（９）でも同一検体に何らかの変異が推定さ
れ、特に範囲の狭いプライマーセット３（９）ではＴｍ
値の変化だけでなく、明らかなＴｍパターンの変化も認
めた。従って目的検索範囲（６）のプライマーセット３
（９）の範囲に変異の存在が推定され、この部分のシー
クエンスで２塩基の変異が確認された。これにより、プ
ライマーセット１（７）、プライマーセット２（８）は
プライマーセット３（９）より塩基量が多いため、２塩
基変異のＴｍに与える影響が小さかったことも確認され
た。以上の結果からプライマーセット３（９）を用いた
場合、この部分の塩基変異をＳＮＰｓとしてＴｍ値およ
びＴｍパターンから検出することが可能となった。
するかどうかを知る目的検索範囲（６）全てを含むプラ
イマーセット１（７）を用いた場合には３５検体中の１
検体に何らかの変異が推定された。更に目的検索範囲
（６）を絞ったプライマーセット２（８）及びプライマ
ーセット３（９）でも同一検体に何らかの変異が推定さ
れ、特に範囲の狭いプライマーセット３（９）ではＴｍ
値の変化だけでなく、明らかなＴｍパターンの変化も認
めた。従って目的検索範囲（６）のプライマーセット３
（９）の範囲に変異の存在が推定され、この部分のシー
クエンスで２塩基の変異が確認された。これにより、プ
ライマーセット１（７）、プライマーセット２（８）は
プライマーセット３（９）より塩基量が多いため、２塩
基変異のＴｍに与える影響が小さかったことも確認され
た。以上の結果からプライマーセット３（９）を用いた
場合、この部分の塩基変異をＳＮＰｓとしてＴｍ値およ
びＴｍパターンから検出することが可能となった。
【００３２】本実施例では、検体からＤＮＡを抽出する
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして、株式会社島津製作所製のＡ
ｍｐｄｉｒｅｃｔを用いることも可能であり、この際に
は全血１μｌを直接検体として用いた。
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして、株式会社島津製作所製のＡ
ｍｐｄｉｒｅｃｔを用いることも可能であり、この際に
は全血１μｌを直接検体として用いた。
【００３３】又、本実施例では、各検体のＴｍ値および
Ｔｍパターンを既存のデータとしてデジタル化してコン
ピューターにインストールすることにより未知の検体か
ら得られたＴｍ値およびＴｍパターンを既存のデータと
照合して核酸変異の可能性を直接表示する機能が付加さ
れた。更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異
表示法が含まれる。
Ｔｍパターンを既存のデータとしてデジタル化してコン
ピューターにインストールすることにより未知の検体か
ら得られたＴｍ値およびＴｍパターンを既存のデータと
照合して核酸変異の可能性を直接表示する機能が付加さ
れた。更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異
表示法が含まれる。
【００３４】
【実施例２】既知の変異の検出を、ヒトゲノムＨｏｍｏ
Ｓａｐｉｅｎｓ ＡＢＯ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ（ＡＢＯ）Ｇｅｎｅ Ｅｘｏｎ ７：Ａ
Ｆ１８２７４６−ＡＦ１８２７５６（Ｇｅｎｂａｎｋ：
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）に登録されている
遺伝子配列について、既知の変異を本発明を応用したＴ
ｍ値およびＴｍパターンの比較から検出し、ＡＢＯ式血
液型の判定を行った。
Ｓａｐｉｅｎｓ ＡＢＯ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ（ＡＢＯ）Ｇｅｎｅ Ｅｘｏｎ ７：Ａ
Ｆ１８２７４６−ＡＦ１８２７５６（Ｇｅｎｂａｎｋ：
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）に登録されている
遺伝子配列について、既知の変異を本発明を応用したＴ
ｍ値およびＴｍパターンの比較から検出し、ＡＢＯ式血
液型の判定を行った。
【００３５】ヒトゲノムＤＮＡを抽出試薬として日本ジ
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー：５’−ＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＧＡ
ＧＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号７）、 アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡ
ＧＴＡＧＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号８）、 ＰＣＲはＡＢＩ社製のリアルタイムＰＣＲ定量機Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５秒、５５℃／１
０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルのプロトコールで
行った。ＡＢＯ式血液型の検討は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ
型、Ｏ型の各血液型４種類につき、夫々６検体を解析し
た。得られた結果を表３に示す。
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー：５’−ＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＧＡ
ＧＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号７）、 アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡ
ＧＴＡＧＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号８）、 ＰＣＲはＡＢＩ社製のリアルタイムＰＣＲ定量機Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５秒、５５℃／１
０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルのプロトコールで
行った。ＡＢＯ式血液型の検討は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ
型、Ｏ型の各血液型４種類につき、夫々６検体を解析し
た。得られた結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】表３の結果から各血液型は、本法を用いる
とＴｍ値およびＴｍパターンの特徴から容易に判別が可
能であった。
とＴｍ値およびＴｍパターンの特徴から容易に判別が可
能であった。
【００３８】本実施例では、検体からＤＮＡを抽出する
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして株式会社島津製作所製のＡｍ
ｐｄｉｒｅｃｔを用いることが可能であり、この際には
全血１μｌを直接検体とした。
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして株式会社島津製作所製のＡｍ
ｐｄｉｒｅｃｔを用いることが可能であり、この際には
全血１μｌを直接検体とした。
【００３９】又、本実施例では、各血液型のＴｍ値およ
びＴｍパターンを既存のデータとしてデジタル化し、コ
ンピューターにインストールすることにより、未知の検
体から得られたＴｍ値およびＴｍパターンを既存のデー
タと照合して血液型を直接表示する機能が付加された。
更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異表示法
が含まれる。
びＴｍパターンを既存のデータとしてデジタル化し、コ
ンピューターにインストールすることにより、未知の検
体から得られたＴｍ値およびＴｍパターンを既存のデー
タと照合して血液型を直接表示する機能が付加された。
更に、本発明には、この原理を応用した核酸変異表示法
が含まれる。
【００４０】
【実施例３】請求項１１に記載の複数プライマーを用い
た既知の変異の検出は、ヒトゲノムＷＯ０１１０９２
（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅ
ｒ）に登録されている遺伝子配列に未知の変異が存在す
るか否かを本発明を用いて複数検体中のＴｍ値及びＴｍ
のパターンを比較することによって実施した。
た既知の変異の検出は、ヒトゲノムＷＯ０１１０９２
（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅ
ｒ）に登録されている遺伝子配列に未知の変異が存在す
るか否かを本発明を用いて複数検体中のＴｍ値及びＴｍ
のパターンを比較することによって実施した。
【００４１】ヒトゲノムＤＮＡを抽出試薬として日本ジ
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー：５’−ＡＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧ
ＴＴＡＴＧＡＴＴ−３’（配列番号９）、 センスプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＡＡＧＴＴＡＴ
ＧＡＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１０）、 センスプライマー：５’−ＴＡＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣ
ＴＣＣＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１１）、 アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣ
ＴＴＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）、 尚、各プライマーの位置関係は図３に示した通りであ
る。ＰＣＲはＡＢＩ社製のリアルタイムＰＣＲ定量機Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５秒、５５℃
／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルのプロトコー
ルで行った。検討は正常型５検体、変異型５検体を試料
として解析した。得られた結果を表４に示す。表では、
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの組み
合わせをプライマーセット、センスプライマーの場
合をプライマーセット、センスプライマーの場合を
プライマーセットと表記した。
ーン社のＩｓｏｇｅｎ−ＬＳを使用して全血から常法に
従い抽出後、表１の処方に従い反応液を調整し、各々の
ゲノムＤＮＡ１μｇおよび下記塩基配列のプライマーセ
ットを使用した。 プライマーセット、 センスプライマー：５’−ＡＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧ
ＴＴＡＴＧＡＴＴ−３’（配列番号９）、 センスプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＡＡＧＴＴＡＴ
ＧＡＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１０）、 センスプライマー：５’−ＴＡＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣ
ＴＣＣＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１１）、 アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣ
ＴＴＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）、 尚、各プライマーの位置関係は図３に示した通りであ
る。ＰＣＲはＡＢＩ社製のリアルタイムＰＣＲ定量機Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ５７００を使用して９５℃／５秒、５５℃
／１０秒、７２℃／２０秒を４０サイクルのプロトコー
ルで行った。検討は正常型５検体、変異型５検体を試料
として解析した。得られた結果を表４に示す。表では、
センスプライマーとアンチセンスプライマーとの組み
合わせをプライマーセット、センスプライマーの場
合をプライマーセット、センスプライマーの場合を
プライマーセットと表記した。
【００４２】
【表４】
【００４３】図３に示した様にＰＣＲ産物の塩基数は、
プライマーセット＞プライマーセット＞プライマー
セットの順であることから塩基変異の各Ｔｍ値に与え
る影響はプライマーセット＜プライマーセット＜プ
ライマーセットの順となっていることが示された。
又、Ｔｍ値、Ｔｍパターン共に連続的に変化している。
この変化を見ることにより変異の存在がより明確に示さ
れた。変異が未知の場合でも、このようなプライマーセ
ットを組んで特異的な連続的変化が見られれば何らか変
異が存在する可能性が高く、故に本発明はスクリーニン
グとしても有用な方法であることが判明した。
プライマーセット＞プライマーセット＞プライマー
セットの順であることから塩基変異の各Ｔｍ値に与え
る影響はプライマーセット＜プライマーセット＜プ
ライマーセットの順となっていることが示された。
又、Ｔｍ値、Ｔｍパターン共に連続的に変化している。
この変化を見ることにより変異の存在がより明確に示さ
れた。変異が未知の場合でも、このようなプライマーセ
ットを組んで特異的な連続的変化が見られれば何らか変
異が存在する可能性が高く、故に本発明はスクリーニン
グとしても有用な方法であることが判明した。
【００４４】本実施例では、検体からＤＮＡを抽出する
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして株式会社島津製作所製のＡｍ
ｐｄｉｒｅｃｔを用いることも可能であり、この際は全
血１μｌを直接検体としてＰＣＲを実施した。
ことなく、直接ＰＣＲで核酸増幅を行う場合のダイレク
トＰＣＲバッファーとして株式会社島津製作所製のＡｍ
ｐｄｉｒｅｃｔを用いることも可能であり、この際は全
血１μｌを直接検体としてＰＣＲを実施した。
【００４５】本実施例では、各検体のＴｍ値およびＴｍ
パターン及びこれらの変化を既存のデータとしてデジタ
ル化し、コンピューターにインストールすることによっ
て未知の検体から得られたＴｍ値およびＴｍパターンお
よびこれらの変化を既存のデータと照合して変異の可能
性を直接表示する機能を付加した。本発明には、この原
理を応用した表示法も含まれる。
パターン及びこれらの変化を既存のデータとしてデジタ
ル化し、コンピューターにインストールすることによっ
て未知の検体から得られたＴｍ値およびＴｍパターンお
よびこれらの変化を既存のデータと照合して変異の可能
性を直接表示する機能を付加した。本発明には、この原
理を応用した表示法も含まれる。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、２本鎖核酸を加熱して１本鎖
核酸に解離する温度の差黒を利用して未知あるいは既知
の核酸塩基配列変異を検出する方法及び表示法に関する
もので、検体の２本鎖核酸溶解曲線及び該曲線を微分し
て求められる２本鎖核酸解離曲線のバターンから塩基変
異を容易に検出することが可能となる。本発明の方法を
利用することによって従来の検出法に比較して高度な技
術習得をすることなく、又、高価な装置を用いることな
く塩基変異の検出を可能とする。更に、本発明はＡＢＯ
式血液型、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ）タイピング及び糖尿病性腎症関連ＳＮ
Ｐｓ（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｒ
ｅｌａｔｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の判定にも利用出来る。
核酸に解離する温度の差黒を利用して未知あるいは既知
の核酸塩基配列変異を検出する方法及び表示法に関する
もので、検体の２本鎖核酸溶解曲線及び該曲線を微分し
て求められる２本鎖核酸解離曲線のバターンから塩基変
異を容易に検出することが可能となる。本発明の方法を
利用することによって従来の検出法に比較して高度な技
術習得をすることなく、又、高価な装置を用いることな
く塩基変異の検出を可能とする。更に、本発明はＡＢＯ
式血液型、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ）タイピング及び糖尿病性腎症関連ＳＮ
Ｐｓ（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｒ
ｅｌａｔｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の判定にも利用出来る。
【００４７】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ 〈１１０〉大島 譲二 〈１２０〉核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知
あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 〈１３０〉ＯＪ０１０４２７ 〈１４１〉２００１−４−２７ 〈１６０〉１２ 〈２１０〉１ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１ ｔｔｔｔｃｃｔｃｃｔ ｇｃｃｃｔｔｇｔａ ２０ 〈２１０〉２ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉２ ａａａａｇｇｇｔｔｔ ａｃｃａｇｇｔｔｔｇ ２０ 〈２１０〉３ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉３ ｃｔｃｔｔｔａｔｃａ ａｔａｃｔｔｃａｃａ ２０ 〈２１０〉４ 〈２１１〉１８ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉４ ｇｇｔｔｔｇｃｔａｇ ａｔｇｔａａａｔ １８ 〈２１０〉５ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉５ ａｃａｃａａａａａｃ ｔｃａａａａｃｃｔｔ ２０ 〈２１０〉６ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉６ ａｇｔａａｔａｃｔａ ｃｃｇｔｇａｔｔｃｔ ２０ 〈２１０〉７ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉７ ｔｇｇａｇａｃｇｇｃ ｇｇａｇａａｇｃａｃ ２０ 〈２１０〉８ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉８ ｃｃｃｃｃａｇｇｔａ ｇｔａｇａａａｔｃｇ ２０ 〈２１０〉９ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉９ ａｔａｔｃｃｃａａａ ａｇｔｔａｔｇａｔｔ ２０ 〈２１０〉１０ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１０ ｃｃｃａａａａｇｔｔ ａｔｇａｔｔｇａａｃ ２０ 〈２１０〉１１ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１１ ｔａｃｔｔｇｇｔｇｇ ｃｃｔｃｃｇａａｇａ ２０ 〈２１０〉１２ 〈２１１〉１８ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１２ ｇｇａｃａｃｃａａｃ ｔｔｔｔｃａｇｔ １８
あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 〈１３０〉ＯＪ０１０４２７ 〈１４１〉２００１−４−２７ 〈１６０〉１２ 〈２１０〉１ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１ ｔｔｔｔｃｃｔｃｃｔ ｇｃｃｃｔｔｇｔａ ２０ 〈２１０〉２ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉２ ａａａａｇｇｇｔｔｔ ａｃｃａｇｇｔｔｔｇ ２０ 〈２１０〉３ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉３ ｃｔｃｔｔｔａｔｃａ ａｔａｃｔｔｃａｃａ ２０ 〈２１０〉４ 〈２１１〉１８ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉４ ｇｇｔｔｔｇｃｔａｇ ａｔｇｔａａａｔ １８ 〈２１０〉５ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉５ ａｃａｃａａａａａｃ ｔｃａａａａｃｃｔｔ ２０ 〈２１０〉６ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉６ ａｇｔａａｔａｃｔａ ｃｃｇｔｇａｔｔｃｔ ２０ 〈２１０〉７ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉７ ｔｇｇａｇａｃｇｇｃ ｇｇａｇａａｇｃａｃ ２０ 〈２１０〉８ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉８ ｃｃｃｃｃａｇｇｔａ ｇｔａｇａａａｔｃｇ ２０ 〈２１０〉９ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉９ ａｔａｔｃｃｃａａａ ａｇｔｔａｔｇａｔｔ ２０ 〈２１０〉１０ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１０ ｃｃｃａａａａｇｔｔ ａｔｇａｔｔｇａａｃ ２０ 〈２１０〉１１ 〈２１１〉２０ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１１ ｔａｃｔｔｇｇｔｇｇ ｃｃｔｃｃｇａａｇａ ２０ 〈２１０〉１２ 〈２１１〉１８ 〈２１２〉ＤＮＡ 〈２１３〉Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 〈４００〉１２ ｇｇａｃａｃｃａａｃ ｔｔｔｔｃａｇｔ １８
【図面の簡単な説明】
【図１】温度に対する蛍光強度の関係で示した２本鎖核
酸溶解曲線の一例である。
酸溶解曲線の一例である。
【図２】２本鎖核酸溶解曲線を微分して得られた２本鎖
核酸解離曲線の一例である。
核酸解離曲線の一例である。
【図３】核酸変異の場所とプライマーの配置を示す模式
図である。
図である。
【図４】未知の核酸変異を検出する場合のプライマーセ
ットの位置関係を示す模式図である。
ットの位置関係を示す模式図である。
１ 塩基変異 ２ アンチセンスプライマー ３−５ センスプライマー ６ 目的検索範囲 ７−９ プライマーセット
Claims (16)
- 【請求項１】 未知の核酸変異の検出法であって、検体
からゲノムＤＮＡを抽出後リアルタイム定量ＰＣＲ法で
増幅し、増幅した２本鎖核酸を加熱した際に１本鎖核酸
へ変性する温度を観察した２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌ
ｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微分して得られた
２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕ
ｒｖｅ）を検体ごとに比較してゲノムＤＮＡの未知の変
異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項２】 未知の核酸変異の検出法であって、検体
からゲノムＤＮＡを核酸増幅法で増幅し、増幅した２本
鎖核酸を加熱した際に１本鎖核酸へ変性する温度を観察
した２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あ
るいは該曲線を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線
（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）を検体ごと
に比較してゲノムＤＮＡの未知の変異を推定することを
特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項３】 未知の核酸の変異検出法であって、検体
からゲノムＤＮＡを直接抽出し、２本鎖核酸を加熱した
際に１本鎖核酸へ変性する温度を観察した２本鎖核酸溶
解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微
分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａ
ｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）を検体ごとに比較してゲノムＤ
ＮＡの未知の変異を推定することを特徴とする核酸変異
検出法。 - 【請求項４】 上記検体からゲノムＤＮＡを抽出するこ
となく、ダイレクトＰＣＲバッファーなどを併用し、直
接リアルタイム定量ＰＣＲ法で増幅後、増幅した２本鎖
核酸を加熱した際に１本鎖核酸へ変性する温度を観察し
た２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、ある
いは該曲線を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄ
ｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）を検体ごとに比
較してゲノムＤＮＡの未知の変異を推定することを特徴
とする核酸変異検出法。 - 【請求項５】 上記検体からゲノムＤＮＡを抽出するこ
となく、ダイレクトバッファーなどを併用し、核酸増幅
法で増幅後、増幅した２本鎖核酸を加熱した際に１本鎖
核酸へ変性する温度を観察した２本鎖核酸溶解曲線（Ｍ
ｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微分して得ら
れた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｃｕｒｖｅ）を検体ごとに比較してゲノムＤＮＡの未知
の変異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項６】 上記検体からゲノムＤＮＡを抽出するこ
となく、ダイレクトバッファーなどを併用し、２本鎖核
酸を加熱した際に１本鎖核酸へ変性する温度を観察した
２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるい
は該曲線を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉ
ｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）を検体ごとに比較
してゲノムＤＮＡの未知の変異を推定することを特徴と
する核酸変異検出法。 - 【請求項７】 既知の核酸変異の検出法であって、上記
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて変異
型ゲノムＤＮＡの２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕ
ｒｖｅ）、あるいは該曲線を微分して得られた２本鎖核
酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）
を実験的に予め作成し、その比較からゲノムＤＮＡの既
知の変異を推定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項８】 未知あるいは既知の核酸変異検出法であ
って、上記請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を
用いて、人為的に合成したＤＮＡの変異の検出を２本鎖
核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲
線を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）との比較から推定するこ
とを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項９】未知あるいは既知の核酸変異検出法であっ
て、上記請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用
いて、ＲＮＡから逆転写法（ＲＴ−ＰＣＲ法など）など
で人為的に合成したＤＮＡの変異の検出を２本鎖核酸溶
解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微
分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａ
ｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）との比較から推定することを特
徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項１０】未知あるいは既知の核酸変異検出法であ
って、上記請求項１〜７いずれか１項に記載の方法を用
いて、混入ＤＮＡや未知遺伝子など予期せぬ核酸の存在
を２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、ある
いは該曲線を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄ
ｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）との比較から推
定することを特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項１１】 未知あるいは既知の核酸変異検出法で
あって、上記請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法
を用いて、更に一方のプライマー（例えばセンスプライ
マー）を数種類、他方のプライマー（例えばアンチセン
スプライマー）を１種類使用し、２本鎖核酸溶解曲線
（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微分して
得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏ
ｎ Ｃｕｒｖｅ）との比較から推定することを特徴とす
る核酸変異検出法。 - 【請求項１２】 上記請求項１〜１１のいずれか１項に
記載の方法を用いて１塩基変異、塩基欠失、塩基挿入、
マイクロサテライト変異などの核酸の変異を、２本鎖核
酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線
を微分して得られた２本鎖核酸解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃ
ｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）との比較から推定すること
を特徴とする核酸変異検出法。 - 【請求項１３】 上記請求項１〜１２のいずれか１項に
記載の方法を用いて検出した変異を、予め得られていた
既知の遺伝子情報と照合し、その判定結果を直接表示す
ることを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項１４】 上記請求項１〜１２のいずれか１項に
記載の方法を用いて検出した結果をＡＢＯ式血液型の判
定に利用することを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項１５】 上記請求項１〜１２のいずれか１項に
記載の方法を用いて検出した結果をＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ
Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）タイピングの
判定に利用することを特徴とする核酸変異検出表示法。 - 【請求項１６】 上記請求項１〜１２のいずれか１項に
記載の方法を用いて検出した結果を糖尿病性腎症関連Ｓ
ＮＰｓ（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ
Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の判定に利用することを
特徴とする核酸変異検出表示法。
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|---|---|---|---|
| JP2001168840A JP2002325581A (ja) | 2001-04-27 | 2001-04-27 | 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US7547514B2 (en) | 2004-07-28 | 2009-06-16 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods for monitoring genomic DNA of organisms |
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| JP2015509710A (ja) * | 2012-02-16 | 2015-04-02 | オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド | ポリマーの測定の解析 |
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| CN116042854A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-05-02 | 江苏中济万泰生物医药有限公司 | 一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法 |
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-
2001
- 2001-04-27 JP JP2001168840A patent/JP2002325581A/ja active Pending
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| US11401549B2 (en) | 2014-10-16 | 2022-08-02 | Oxford Nanopore Technologies Plc | Analysis of a polymer |
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