JP2002538096A - 生理活性複合体のリポソームへのカプセル化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、リポソーム形成前の逆ミセル中での生理活性剤の複合体生成を含む、核酸などのリポソームカプセル化生理活性剤の調製法ならびにこのようにして形成させたリポソームおよび核酸を細胞に送達させるための処方物の使用法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、複合体が形成される、中間物である両親媒性脂質によって安定化さ
れたエマルジョンを用い、ポリカチオン凝縮された核酸のような複合体をリポソ
ーム中にカプセル化する方法に関する。また、本発明は、このように形成された
リポソームカプセル化複合体に関する。本発明の方法は、これまで、脂質に対す
る化合物の高い比率において、リポソームに負荷（ｌｏａｄ、ロード）すること
が困難であった種々の化合物を負荷したリポソームを提供するのに適用すること
ができる。

【０００２】 （発明の背景） 医薬製剤として有用であるためには、生理活性剤が適当な治療有効量にて治療
部位に到達しなければならない。多くの生理活性剤および薬物はインビボで安定
であるが、他のものはしばしば分解してしまう。生理活性剤がそのターゲット部
位に到達するに先立ってそのような分解が起こると、治療量でない薬物がターゲ
ット部位に到達するであろう。他の薬物または生理活性剤はターゲットされてい
ない系によって取り込まれ、治療有効量でターゲット部位に到達する薬物または
生理活性剤が不足する。ある種の極性薬物は、ターゲットの細胞膜を通過できな
いので、細胞に侵入することが全くできない。これらの極性薬物が細胞に侵入で
きる唯一の方法は、エンドサイトーシスによって取り込まれ、それが細胞中の分
解的リソソーム酵素に暴露されることである。薬物または生理活性剤の治療上の
送達におけるさらにもう１つの問題は、しばしばいくつかの薬物または生理活性
剤に伴う毒性を回避しつつ、治療で十分な高い濃度の薬物または生理活性剤を投
与できないことである。これらの問題は多数の異なる方法によってアプローチさ
れてきた。薬物または生理活性剤がそれに伴う毒性を有しない場合、それは、分
解、ターゲットされていない器官による取り込みおよび治療薬物または生理活性
剤が必要な部位へのターゲッティングの欠如を占める十分な高い用量でそれは投
与することができる。しかしながら、多くの薬物または生理活性剤は、そのよう
な消費を行うには余りにも高価であるか、そのような高い投与量の投与を妨げる
毒性を有する。治療量の薬物または生理活性剤を投与するにおいて遭遇する問題
のいくつかを克服するために多くの方法が用いられてきた。

【０００３】 １つのそのような方法は、薬物または生理活性剤をリポソーム中にカプセル化
することである。いくつかの薬物または生理活性剤は、受動的な負荷（passive
loading）によって、または勾配負荷（gradient loading)によって治療上有効
量でリポソーム中にカプセル化できるが、これらの方法は、特異的化学的特性を
持つ薬物または生理活性剤、または比較的低濃度で投与することができる薬物ま
たは生理活性剤に制限される。弱塩基または弱酸のようないくつかの生理活性化
合物は、予め形成されたリポソームに遠くから負荷して、かなり濃縮された複合
体を形成することができる。遠隔負荷または勾配負荷と言われるこのタイプの負
荷は、薬物または生理活性剤がリポソームの脂質二層を一時的に通過できること
を要する。しかしながら、これは、その多くがリポソーム二層を通過できない全
ての生理活性分子に当てはまるものではない。

【０００４】 治療レベルの薬物または生理活性剤を投与しようとする試みが部分的にしか成
功していない１つの領域は遺伝子治療の領域である。遺伝子治療は、外来性遺伝
子の適当な細胞型への導入、続いての、治療に関連するレベルで細胞内での遺伝
子の発現を可能とすることを含む。そのような治療は、癌を治療するのに有用な
ものを含めた、種々の遺伝子の細胞への導入に対する基本的な研究から、比較的
短期間に進歩した（Ｄｕｑｕｅら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，１
３：２３１−２４２（１９９８）、Ｒｕｎｎｅｂａｕｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．，１７：２８８７−２８９０（１９９７））。ある場合には、裸の
ＤＮＡが細胞に取り込まれてきたが（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：
１４６５−１４６８（１９９０））、その大きなサイズおよび高い程度の負の電
荷のため、それは一般に不可能である。さらに、裸のＤＮＡは特異的細胞にター
ゲッティングするようにデザインできない。従って、一般に、成功した遺伝子治
療は、ＤＮＡおよび他の核酸を細胞に導入するために「ベクター」の利用性に頼
っている。

【０００５】 現在、ＤＮＡ送達系の２つの主な群、ウイルスおよび非ウイルスがある。レト
ロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスのような、複製欠陥ウイ
ルスを含めたウイルスベクターが、かくして、これまで、最も広く記載された遺
伝子送達ビヒクルであった（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，１６：３５−４０（１９９８））。しかしながら、それらの使用は、そ
れらのウイルス成分の免疫原性、複製コンピテント状態への復帰の潜在的危険性
、腫瘍形成突然変異の潜在的導入、ターゲッティングメカニズムの欠如、ＤＮＡ
能力の制限、大規模な生産の困難および他の因子によって妨げられてきた（例え
ば。ＬｅｅおよびＨｕａｎｇ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：８４８１−８
４８７（１９９６））。

【０００６】 ２つの主なタイプの非ウイルスビヒクルが、ウイルスベクターの代わりとして
開発されてきた。カチオン性脂質およびＤＮＡよりなるカチオン性リポソームと
ＤＮＡの複合体（または「リポプレックス」、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７））
は、かくして、これまで、遺伝子送達のためのウイルスベクターに対する最も広
く記載された代替物であった。しかしながら、遺伝子治療で用いた場合、そのよ
うなリポプレックスは、低い安定性、高い細胞毒性、非生分解性、ＤＮＡの貧弱
な凝縮および保護、血清感受性、大きなサイズおよび組織特異性の欠如を含めた
、いくつかの主な欠点に悩まされている。さらに、リポプレックスは正に荷電し
ているので、それは一般にはほとんどの細胞の負に荷電した表面と非特異的に相
互作用する。従って、そのようなリポプレックスをインビボで特異的部位にター
ゲッティングするのは不可能である。

【０００７】 リポプレックスおよびＤＮＡのもう１つの変形は、アニオン性リポソームに結
合したポリリシンの凝縮されたＤＮＡを含む（ＬｅｅおよびＨｕａｎｇ，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：８４８１−８４８７（１９９６））。これらは、活
性な構造を形成するのにある種のアニオン性脂質を必要とする。形成されたリポ
プレックスはＤＮＡを完全にはカプセル化せず、あるいは凝縮したＤＮＡの周り
に２以上の二層を形成しなければならない。後者の場合、細胞質への送達は、Ｄ
ＮＡが少なくとも３つの膜を横切ることを必要とするであろう。これはトランス
フェクションの効率を阻害すると予測される。前者の場合、安定性は、生理学的
塩溶液中でのＤＮＡの暴露によっても妥協して処理される。

【０００８】 リポソームはさらなるタイプの非ウイルスベクターの代替であり、リポプレッ
クスと一緒に用いるのにいくつかの利点を提供する。例えば、リポソーム二層は
カプセル化核酸の周りに形成され、それにより、環境ヌクレアーゼによる分解か
ら核酸を保護する。対照的に、リポプレックスは核酸をカプセル化せず、よって
、それを環境ヌクレアーゼから完全には隔離できない。さらに、リポソームは、
その水性区画において、核酸に加えた他の生理活性剤をカプセル化することがで
きる。対照的に、リポプレックスは水性容量をカプセル化しないのでそうできな
い。さらに、前記したリポプレックスの制限されたイオン性質とは反対に、リポ
ソームは中性に荷電しまたはアニオン性とすることができる。かくして、リポソ
ームは、送達ビヒクルそれ自体によって誘導される細胞毒性を回避し、注目する
特異的部位におけるその蓄積を増強するようにデザインすることができる。

【０００９】 リポソーム中に生理活性剤をカプセル化する概念は新しくはないが、いずれか
のレベルでリポソームにカプセル化するのは多くの剤は困難であり、その他のも
のは治療に効果的なレベルにおいてリポソームにカプセル化するのは困難である
ことが判明している。多くの小さな分子はリポソームにカプセル化できるが、漏
れ出す。かくして、いくつかの生理活性剤をカプセル化し、治療に効果的な時間
の間それを治療に効果的な用量でリポソーム内に保持させるのは困難であった。
例えば、特に大きな分子をリポソーム内の複合体にカプセル化するのは困難であ
った。また、多くの水溶性分子を治療剤として用いるのは困難であった。なぜな
らば、それは細胞膜に浸透できないからである。細胞膜に融合することができる
リポソームに安定にカプセル化されると、これらの薬物を治療上有効な用量でタ
ーゲット細胞に送達するのが可能である。本発明の方法は、そのような薬物また
は生理活性剤を含有するリポソームの治療上有用な形態への処方を可能とする。

【００１０】 これらの試みは核酸をリポソームにカプセル化するためになされ、これらはリ
ポソームの形成の逆相蒸発（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５５
： １０４３１−１０４３５（１９８０））、脱水と再水和（Ａｌｉｚｏら、Ｊ
Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ，７：４９７−５０３（１９９０））および凍結と解凍
（Ｍｏｎｎａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１３２９：
３９−５０（１９９７））方法の使用を含む。しかしながら、これらの方法の各
々は、精製物リポソーム中の空の小胞のかなりのパーセントをもたらす核酸の低
い出発濃度の要件、リポソーム中の十分な量のＤＮＡが所望のターゲット部位で
治療上に有効であるように再現性よくカプセル化できないこと、およびヌクレア
ーゼ媒介分解からのそのカプセル化された核酸の保護のためにビヒクルを最適化
させるのが困難であるようにいくつかの制約がある。

【００１１】 また、ＤＮＡを複合化剤によって複合化し、引き続いて、複合化ＤＮＡをリポ
ソーム中にカプセル化しようとする試みもなされてきた。複合化剤は、他の分子
と反応して該分子の沈殿または凝縮を引き起こす剤である。本発明でいうような
複合化剤は、生理活性剤上の電荷と反対の電荷を有する荷電分子よりなる群から
選択される。該複合化剤は、スペルミン、スペルミジン、ヘキサミンコバルト、
カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ポリリシン、ポリヒスチジン、プロタ
ミン、（ヘパリンおよびデキストラン硫酸のごとき）ポリアニオン、クエン酸イ
オンまたは硫酸イオンからなる群から選択することができる。例えば、電荷＋３
以上のポリカチオン、例えば、ポリアミン、ポリリシンおよびヘキサミンコバル
ト（ＩＩＩ）は、ＤＮＡ上の複数の負の電荷との相互作用を通じてＤＮＡ分子を
凝縮させることができるのが知られている（Ｃｈａｔｔｏｒａｊら、Ｊ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ，１２１：３２７−３３７（１９７８）；Ｇｏｓｕｌｅ ＬＣおよび
Ｓｃｈｅｌｌｍａｎ ＪＡ．Ｎａｔｕｒｅ２５９：３３３−３３５（１９７６）
；Ｖｉｔｅｌｌｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：３９６−４０４（１９９
６）；Ｗｉｄｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４４：４３１−４５３（１９
８０）；Ａｒｓｃｏｔｔら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３０：６１９−６３０（
１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８：２１９２−２１９６（１
９７９））。ポリアミン、例えば、スペルミジン（３＋）およびスペルミン（４
＋）は、他のタイプのポリカチオンとは異なり、全ての生細胞において天然では
生じないことが判明している（例えば、ＡｍｅｓおよびＤｕｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ Ｃｈｅｍ，２５３：７６９−７７５（１９６０）；ＴａｂｏｒおよびＴａｂ
ｏｒ；Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５３：７４９−７９０（１９８４）
）。高いポリアミンレベルが、活動的に増殖する動物細胞で存在することが知ら
れており、正常な細胞増殖に必須であると考えられている（ＡｍｅｓおよびＤｕ
ｂｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５３：７６９−７７５（１９６０）；Ｔａ
ｂｏｒおよびＴａｂｏｒ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５３：７４９−
７９０（１９８４）；Ｈａｆｎｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５４：１２
４１９−１２４２６（１９７９）；Ｐｅｇｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２３４：２
４９−２６２（１９８６））。

【００１２】 スペルミンが凝縮された線状ＤＮＡのリポソーム中へのリポソームカプセル化
はＴｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏら、Ｇｅｎｅ，６３：３２１−３３０（１９８８）に
よって試みられている。しかしながら、その中での出発ＤＮＡ濃度は低く、得ら
れたリポソームはリポソーム脂質に対してカプセル化ＤＮＡの低い比率を有する
結果であった（１マイクロモルの脂質当たり０．０２〜０．２マイクログラムＤ
ＮＡ）。さらに、分子内ＤＮＡ凝集の不存在下での線状ＤＮＡ分子のそのような
凝縮は、非現実的な精度までのスペルミン濃度に対する制御を必要とした。加え
て、Ｂａｅｚａら、Ｏｒｉ Ｌｉｆｅ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｓｐｈｅｒ，２１：２
２５−２５２（１９９２）およびＩｂａｎｅｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ，７４：６３３−６４３（１９９６）は、共に、スペルミンが凝縮され
たＳＶ４０プラスミドＤＮＡの１マイクロモル当たり１〜４マイクログラムのリ
ポソームへのカプセル化を報告している。しかしながら、それらの調製物はいず
れも、リポソーム形成に引き続いて高い塩の緩衝液に対して透析されなかった。
カプセル化ＤＮＡの報告された量は、現実には、かなりの％の未カプセル化ＤＮ
Ａを含みかねない。これらのリポソーム形成はＤＮＡａｓｅ分解に暴露されて、
リポソームに現実に隔離されたＤＮＡのパーセンテージを決定しなかったので、
報告された高い量は、恐らくは、現実にカプセル化されたＤＮＡに影響しない。

【００１３】 リポソームカプセル化核酸の効果的な調製および使用は、プロセスに由来する
空のリポソームのパーセンテージを最小化し、ＤＮＡ：リポソーム脂質の比率を
最大化するために、高濃度の核酸の懸濁液の使用を必要とする。しかしながら、
リポソーム形成の公知の方法の間における高濃度のＤＮＡの凝縮は、一般に、分
子内凝縮をもたらし、遺伝子送達に不適切な核酸ベースの構造の形成に至る。直
接的な複合化剤でのＤＮＡの凝縮によって形成された大きな凝集体をリポソーム
中に容易にはカプセル化できず、そのような大きな凝集体構造（細胞のサイズの
オーダー）は効果的に物質をターゲット細胞に送達できない。例えば、もし凝集
体が５００ｎｍより大きければ、それは、静脈内投与後にそのサイズのため循環
から迅速に除去される。他方、より大きな凝集体をインビトロで細胞に投与する
ことができる。しかしながら、時々、凝集体は細胞によって取り込まれるのには
余りにも大きい。

【００１４】 かくして、治療上有効量の種々の薬物をターゲット細胞に送達するには、得ら
れた治療生成物が治療上サイズ範囲になるように、リポソームにカプセル化すべ
き複合体のサイズをやはり制限する方法を提供しつつ、脂質二層を通ってのその
透過性を減少させるように複合化した生理活性剤を含有するリポソームの製法を
提供する必要があった。

【００１５】 （発明の概要） 本発明は、 （ａ）少なくとも１つの両親媒性脂質を１以上の有機溶媒に溶解させるステップ
と、 （ｂ）第１の分子および脂質を含む逆ミセルの形態のエマルジョンを形成するよ
うに、生理活性剤および複合化剤よりなる群から選択される第１の分子を含有す
る溶液を含む少なくとも１つの水性懸濁液をステップ（ａ）の脂質含有有機溶液
と合わせるステップと、 （ｃ）生理活性剤および複合化剤よりなる群から選択される第２の分子を含む第
２の水性懸濁液をステップ（ｂ）のエマルジョンに添加するステップと、ここで
、もし第１の分子が生理活性剤であれば、第２の分子は複合化剤であり、その逆
も成立し、 （ｄ）複合化剤を生理活性剤と接触させることにより、生理活性剤と複合化剤の
複合体を脂質安定化水滴内に形成させるように、ステップ（ｃ）のエマルジョン
をインキュベートするステップと、ここで、該複合体の直径が該液滴の直径より
大きくなく、 （ｅ）複合化生理活性剤および脂質を含むリポソームを形成するように、ステッ
プ（ｄ）の懸濁液から有機溶媒を除去するステップと を含む生理活性複合体をリポソーム中にカプセル化する方法を提供する。

【００１６】 本発明の方法は、リポソーム内で複合化剤と複合化した広い範囲の生理活性分
子を含有する治療上有用なリポソームの調製のために有用である。好ましくは、
リポソームは、本発明の方法によって種々の分子をカプセル化できる融合性リポ
ソームである。これらの融合性リポソームは細胞膜と融合することができ、治療
上有効量の生理活性剤の細胞および器官への送達するのを可能とする。加えて、
本発明の方法は１を超える生理活性剤がリポソーム中にカプセル化されるのを可
能とする。本発明の方法によって、１以上の生理活性剤は同時に同一リポソーム
中にカプセル化することができる。もし１を超える生理活性剤が本発明の方法に
よってリポソーム中にカプセル化されると、生理活性剤の各々は複合体の形態で
ある必要はない。

【００１７】 いくつかの生理活性剤は容易に脂質二層を通過し、従って、リポソームに安定
に隔離されない。生理活性剤と複合化剤とで複合体を形成することによって、生
理活性剤はリポソーム中に留まる。主な障害は、複合化された生理活性剤をリポ
ソーム中にカプセル化するのが問題であった。リポソーム中へのカプセル化に先
立って生理活性剤および複合化剤を溶液中で混合する場合、制御できないくらい
大きな多くの複合体がリポソームの効果的な負荷に必要な濃度で形成される。生
理活性剤は、そのような形成された複合体が、生理活性分子のサイズの減少、生
理活性剤の安定性の減少、生理活性剤の沈殿、生理活性剤の凝縮、または複合体
のサイズの増加のごとき物理的特性の変化をもたらすように、複合化剤に結合し
たいずれもの生理活性剤である。細胞膜と融合するリポソームは、膨大なカテゴ
リーの分子を細胞の内部に送達することができる。本発明の１つの利点は、逆ミ
セル中に生理活性剤の複合体を形成することによって、治療上有用なリポソーム
中にカプセル化できない不適当な大きな複合体の形成が妨げられることである。

【００１８】 リポソーム内での生理活性化合物を含む複合体の形成は、そのような複合体が
、所望のターゲット細胞への送達前にリポソームから漏出しそうにないことであ
る。さらに、複合体の形成は、脂質に対する生理活性剤の比率が高くて、送達が
効果的であるように、多量の生理活性剤をリポソーム内に濃縮することができる
。開示された方法は、エマルジョン内での生理活性物質と複合化剤との複合化、
続いての、生理活性剤および複合化剤の極端に大きな有害な凝集体（数ミクロン
を超える）の形成を防ぐようなリポソーム内へのカプセル化を提供する。

【００１９】 １つの具体例において、本発明の方法は、核酸複合体をカプセル化する方法を
提供した。例えば、ＤＮＡのごとき核酸を逆（逆転）ミセル内で凝縮剤と複合化
し、続いて、該ミセルからリポソームが形成される。前記したごとく、従来の試
みはＤＮＡをリポソームにカプセル化しようとするものであったが、該方法のい
ずれもが治療上有用なリポソームＤＮＡを効果的に調製するのに成功しなかった
。

【００２０】 本発明は、１マイクロモルのリポソーム脂質当たり少なくとも約０．５マイク
ログラムの核酸の量にて、凝縮した核酸を含むリポソームの製法を提供する。

【００２１】 リポソーム脂質成分は、好ましくは、一般に、約８０〜２０モル％の付加的な
脂質（additional lipid)に対して約２０〜８０モル％の誘導体化リン脂質の割
合で、誘導体化リン脂質および付加的な脂質を含む。好ましい誘導体化リン脂質
にはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とビオチンのコンジュゲート、Ｎ
−Ｃ１２ ＤＯＰＥのごときＮ−アセチル化ホスファチジルエタノールアミン（
ＮＡＰＥ）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ ＤＯＰＥのごときペプチ
ドとホスファチジルエタノールアミンのコンジュゲートを含む。該付加的な脂質
はリポソームに通常一体化された種々の脂質のいずれでもあり得る。しかしなが
ら、誘導体化リン脂質がＮＡＰＥである場合、該付加的な脂質は好ましくはホス
ファチジルコリン（例えば、ＤＯＰＣ）である。好ましくは、核酸はＤＮＡであ
る。

【００２２】 また、リポソームおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物の製法が提供
され、該組成物を用いて、核酸を動物の細胞に送達することができる。

【００２３】 他のおよびさらなる目的、特徴および利点は、以下の図面と組み合わせて採用
する開示の目的で掲げる本発明の好ましい具体例の以下の記載から明らかであろ
う。

【００２４】 （発明の詳細な記載） 以下は本出願を通じて使用される略語、および対応する用語である。ＰＥは、
ホスファチジルエタノールアミンを意味し、ＰＣは、ホスファチジルコリンを意
味し、ＥＰＣは、卵ホスファチジルコリンを意味し、ＤＯは、ジオレイル−を意
味し、ＤＯＰＣは、ジオレイルホスファチジルコリンを意味し、ＤＯＰＥは、ジ
オレイルホスファチジルエタノールアミンを意味し、ＮＡＰＥは、Ｎ−アシル化
ホスファチジルエタノールアミンを意味し、Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥは、Ｎ−ドデ
カノイルジオレイルホスファチジルエタノールアミンを意味し、ＡＡＰＶ ＤＯ
ＰＥは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ジオレイルホスファチジルエタノー
ルアミンを意味し、ＣＢＡＭは、カルセインブルーアセトキシメチルエステルを
意味し、ＰＢＳは、リン酸緩衝化生理食塩水を意味し、ＬＢＳは、低塩緩衝液を
意味し、ＨＢＳＳは、ハンクスのバランス塩溶液を意味し、ＥＧＦＰは、増強さ
れた緑色蛍光蛋白質を意味し、ＳＰＬＶは、安定な複数ラメラリポソームを意味
し、ＭＬＶは、複数ラメラリポソームを意味し、ＵＬＶは、単一ラメラリポソー
ムを意味し、ＬＵＶは、大きな単一ラメラリポソームを意味し、ＳＵＶは、小さ
な単一ラメラリポソームを意味し、ｄｓ ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡを意味し、Ｔ
ＥＭは、透過電子顕微鏡。

【００２５】 本発明は、 （ａ）少なくとも１つの両親媒性脂質を１以上の有機溶媒に溶解させるステッ
プと、 （ｂ）第１の分子および脂質を含む逆ミセルの形態であるエマルジョンを形成
するように、生理活性剤および複合化剤よりなる群から選択される第１の分子を
含有する溶液を含む少なくとも１つの水性懸濁液と、ステップ（ａ）の脂質含有
有機溶液とを組み合わせるステップと、 （ｃ）生理活性剤および複合化剤よりなる群から選択される第２の分子を含む
第２の水性懸濁液をステップ（ｂ）のエマルジョンに添加するステップと、ここ
で、もし第１の分子が生理活性剤であれば、第２の分子は複合化剤であり、また
はその逆であり、 （ｄ）複合化剤を生理活性剤と接触させることにより生理活性剤と複合化剤と
の複合体を脂質安定化水滴内に形成させるように、ステップ（ｃ）のエマルジョ
ンをインキュベートするステップと、ここで、該複合体の直径が該液滴の直径よ
りも大きくなく、 （ｅ）複合化された生理活性剤および脂質を含むリポソームを形成するように
、ステップ（ｄ）の懸濁液から有機溶媒を除去するステップと を含むことを特徴とする生理活性複合体をリポソーム中にカプセル化する方法
を提供する。

【００２６】 本発明の方法は、当該リポソーム内に複合化剤と複合化した広い範囲の生理活
性分子を含有する治療上有用なリポソームの調製で有用である。好ましくは、リ
ポソームは、本発明の方法が種々の分子をカプセル化できる融合性リポソームで
ある。これらの融合性リポソームは細胞膜と融合することができ、治療上有効量
の生理活性剤の細胞および器官への送達を可能とする。加えて、本発明の方法は
１を超える生理活性剤がリポソーム中にカプセル化されるのを可能とする。本発
明の方法によって、１以上の生理活性剤を同時に同一リポソーム中にカプセル化
することができる。もし１を超える生理活性剤が本発明の方法によってリポソー
ム中にカプセル化されるならば、生理活性剤の各々は複合体の形態である必要は
ない。

【００２７】 用語「生理活性剤」は、治療または診断目的で動物、好ましくはヒトに投与す
ることができるいずれの化合物または組成物も意味する。本発明の方法は、限定
されるものではないが、核酸、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド５’−三リ
ン酸（ａｒａＣＴＰ）のごときヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ、チト
クロームｃのごとき蛋白質、シスプラチン、Ｎ−ホスホノ−アセチル−Ｌ−アス
パラギン酸または５−フルオロオレチン酸のごとき極性抗癌剤、抗癌剤の極性ま
たは荷電誘導体、極性ペプチド、ブチレートのごときヒストンでアセチラーゼ阻
害剤のような水溶性膜−不透過剤を含めた生理活性剤をカプセル化するのに有用
である。また、生理活性剤は、限定されるものではないが、ＤＮＡおよびＲＮＡ
のごとき核酸と、アシクロビール、ジドブジンおよびインターフェロンのごとき
抗ウイルス剤と、アミノグリコシド、セファロスポリンおよびテトラサイクリン
のごとき抗菌剤と、ポリエン抗生物質、イミダゾールおよびトリアゾールのごと
き抗菌類剤と、フォリン酸、およびプリンおよびピリミジンアナログのごとき抗
代謝剤と、アントラサイクリン抗生物質および植物アルカロイドのごとき抗新形
成剤と、炭水化物、例えば、糖および澱粉と、アミノ酸、ペプチド、細胞受容体
蛋白質、免疫グロブリン、酵素、ホルモン、神経伝達物質および糖蛋白質のごと
き蛋白質と、色素と、放射線同位体および放射線同位体標識化合物のごとき放射
性標識と、放射線不透過化合物と、蛍光化合物と、散瞳化合物と、気管支拡張剤
と、局所麻酔剤等よりなる群から選択される剤を含む。

【００２８】 用語「生理活性複合体」は、各形成された複合体が、生理活性分子のサイズの
減少、生理活性剤の溶解度の減少、生理活性剤の沈殿、生理活性剤の凝縮、また
は複合体のサイズの増加のごとき物理的特性の変化をもたらすように、複合化剤
に複合したいずれの生理活性剤でもある。

【００２９】 逆ミセルを含有する油中水型エマルジョンは、以前は、酵素速度論を研究する
のに（例えば、Ｂｒｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３１０：７２１−７３９（１９
９５））およびリポソームを形成するのに（例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７５：４１９４−４１９８（１９７８）；
Ｇｒｕｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，２４：２８３３−２８４２（１９８４））用
いられてきたが、リポソームを負荷する目的で２つの化合物の複合化を変調する
ためのかかるエマルジョンの使用は以前には報告されていない。

【００３０】 エマルジョンは種々の方法で形成することができ、当業者の技量の範囲内のも
のである。音波処理、渦形成、機械的撹拌、静的混合、ホモゲナイゼーション、
注入、ミクロ流動化、コロイドミル、カーツ乳化剤および／またはカディーミル
を用いて、種々の順番の物質の添加を含めた種々のタイプのエマルジョンを調製
することができる。本発明のエマルジョンは、少なくとも１つの成分、生理活性
剤または複合化剤が、他の剤の水性分散液の添加前に脂質安定化エマルジョンの
水滴内に予め隔離されるような２つのステップで形成される。

【００３１】 脂質安定化エマルジョンからの溶媒の除去に際して、「リポソーム」が形成さ
れる。溶媒は、限定されるものではないが、回転蒸発および窒素のストリーミン
グを含めたいずれかの数の方法によって除去することができる。

【００３２】 「リポソーム」は、その各々が反対に向いた両親媒性脂質分子を含有する２つ
の単層を含む１以上の脂質二層を含む自己形成性構造である。両親媒性脂質は、
１つまたは２つの非極性（疎水性）アシル鎖に共有結合した極性（親水性）のヘ
ッドグループ（頭頂基）領域を含む。疎水性アシル鎖および周囲の水性媒体の間
のエネルギー的に不都合な接触は、その極性ヘッドグループ（頭頂基）が二層の
表面に向き、他方、アシル鎖が二層の内部に再び向くように、両親媒性脂質分子
を誘導してそれ自体を配置させる。アシル鎖が、水性環境と接触状態になること
から効果的に保護されるエネルギー的に安定な構造がかくして形成される。

【００３３】 リポソーム（例えば、Ｃｕｌｌｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ，５５９：３９９−４２０（１９８７）；Ｎｅｗ，１９９５）は単一の脂
質二層（単一ラメラリポソーム、「ＵＬＶ」）、または複数の脂質二層（マルチ
ラメラリポソーム、「ＭＬＶ」または「ＳＰＬＶ」）を有することができる。各
二層は水性区画を囲むか、あるいはそれをカプセル化する。水性容量の、脂質分
子の保護バリアー内へのこのカプセル化を仮定すれば、リポソームは、カプセル
化された分子、例えば、核酸を、因子、例えば、外部環境に存在するヌクレアー
ゼ酵素の分解効果から隔離することができる。カプセル化された内容のそのよう
な保護は、核酸分子の場合、例えば、図４に存在している結果、例９に記載した
アガロースゲル分析のタイプによって示される。

【００３４】 リポソームは、種々のサイズ、例えば、２５ｎｍと小さい、または１０，００
０ｎｍ以上と大きい平均直径を有することができる。サイズは多数の因子、例え
ば、測定し説明する当業者の技量の十分に範囲内にある、脂質組成および調製の
方法によって影響され、やはり当業者の技量内にある準−弾性光散乱のごとき多
数の技術によって測定される。

【００３５】 音波処理、ホモゲナイゼーション、フレンチプレス適応および粉砕のごとき、
やはり当業者の技量の範囲内にある種々の方法を用いて、より大きなリポソーム
からより小さなサイズのリポソームを調製することができる。押出（例えば、米
国特許第５，００８，０５０号参照）を用い、加圧下で規定され選択されたサイ
ズのフィルター孔にリポソームを通すことによって、リポソームのサイズを低下
させ、すなわち、所定の平均サイズを有するリポソームを生産することができる
。また、接線流動濾過（ＷＯ／８９／００８８４６）を用いて、リポソームのサ
イズを調節し、すなわち、より小さなサイズの不均一性、およびより均質な規定
されたサイズ分布を有するリポソームの集団を生産することができる。これらの
刊行物を引用する事により本明細書の一部をなすものとする。

【００３６】 本発明のリポソームは単一ラメラまたはオリゴラメラとすることができ、ここ
に記載された方法のいずれかによって製造されたリポソームのサイズと等しいサ
イズを有することができる。しかしながら本発明の好ましい具体例において、リ
ポソームは、約５０〜３００ｎｍの数平均サイズを有する単一ラメラリポソーム
である。

【００３７】 リポソームは、種々の源（天然および合成の双方）から得られた、種々の脂質
（両親媒性脂質および非両親媒性脂質）から構成される。適当なリポソーム脂質
は、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン（「ＰＣ」）、ホスファ
チジルエタノールアミン（「ＰＥ」）、ホスファチジルセリン（「ＰＳ」）、ホ
スファチジルグリセロール（「ＰＧ」）、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ
」）およびホスファチジン酸（「ＰＡ」）のごときリン脂質を含む。そのような
リン脂質は一般に２つのアシル鎖を有し、これらは共に飽和しており、共に不飽
和であり、または１つが飽和し、１つは不飽和であり、該鎖は、限定されるもの
ではないが、ミリステート、パルミテート、ステアレート、オレエート、リノレ
エート、リノレネート、アラキデート、アラキドネート、ベヘネートおよびリグ
ノセレート鎖を含む。 また、リン脂質は、適当な反応性基のそれへの付着によって誘導体化すること
ができる。そのような基は一般にアミノ基であり、よって、誘導体化されたリン
脂質は典型的にはホスファチジルエタノールアミンである。ＰＥへの付着に適し
た種々の部位は、限定されるものではないが、リポソームの生物学的膜への融合
性を増強するのに有用なアシル鎖（ＷＯ９８／１６１９９）、ターゲット細胞に
隣接するリポソームを脱安定化するのに有用なペプチド（ＷＯ９８／１６２４０
）、リポソームに対する抗体のごときターゲッティング部位を連結するのに有用
なビオチンおよびマレイミド部位（各々、米国特許第５，０５９，４２１号およ
び第５，３９９，３３１号）、ガングリオシド、ポリアルキルエーテル、ポリエ
チレングリコールおよび有機ジカルボン酸のごとき種々の分子を含む（例えば、
。米国特許第５，０１３，５５６号，第４，９２０，０１６号および第４，８３
７，０２８号）。前記引用の刊行物は引用する事により本明細書の一部をなすも
のとする。

【００３８】 従って、本発明の最も好ましい具体例において、本発明の方法によって調製さ
れたリポソームは、その内容物の送達を増強させるのに適合した誘導体化リン脂
質を含む。リポソームは、同様に付加的な脂質を含むことができるがそれを要求
されるものではなく、該付加的な脂質は、リポソーム学の分野の当業者に明らか
な多数の理由でリポソームに一体化される。そのような理由は、限定されるもの
ではないが、リポソームの安定化またはターゲッティング、ならびにリポソーム
の薬物動態学挙動のさらなる改変を含む。適当な付加的な脂質は、限定されるも
のではないが、リン脂質、糖脂質およびステロールを含めた、リポソーム中への
取り込みに適したとして通常認識される脂質のいずれも含む。

【００３９】 好ましくは、本発明のリポソームは、誘導体化リン脂質および付加的な脂質を
含む脂質成分を有する。誘導体化リン脂質は式：

【化１】 を有する。 （式中、Ｚはビオチン、マレイミド部位、Ｒ³で示される基および式Ｘ−Ｙを有
する基よりなる群から選択され、Ｘは単結合および基Ｒ⁴よりなる群から選択さ
れるリンカーであり、および、Ｙは細胞分泌ペプチダーゼの基質であるアミノ酸
配列を含む酵素切断可能ペプチドであり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は式−ＯＣ（
Ｏ）（ＣＨ₂）_n1（ＣＨ＝ＣＨ）_n2（ＣＨ₂）_n3（ＣＨ＝ＣＨ）_n4（ＣＨ₂）_n5（
ＣＨ＝ＣＨ）_n6（ＣＨ₂）_n7（ＣＨ＝ＣＨ）_n8（ＣＨ₂）_n9ＣＨ₃を有する基であ
り、ここに、ｎ１はゼロまた１〜２２の整数であり、ｎ３はゼロまたは１〜１９
の整数であり、ｎ５はゼロまたは１〜１６の整数であり、ｎ７はゼロまたは１〜
１３の整数であり、ｎ９はゼロまたは１〜１０の整数であり、および、ｎ２、ｎ
４、ｎ６およびｎ８の各々はゼロまたは１であり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ
５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の各々は各出現において同一または異なる）

【００４０】 Ｒ¹およびＲ²では、ｎ１＋２ｎ２＋ｎ３＋２ｎ４＋ｎ５＋２ｎ６＋ｎ７＋２ｎ
８＋ｎ９の合計は独立して、１２〜２２の整数であり、他方、Ｒ³およびＲ⁴では
、ｎ１＋２ｎ２＋ｎ３＋２ｎ４＋ｎ５＋２ｎ６＋ｎ７＋２ｎ８＋ｎ９の合計は、
独立して、２〜２２の整数である。該誘導体化リン脂質は、好ましくは、約２０
〜８０モルパーセントのリポソーム脂質を含む。

【００４１】 Ｒ³がＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_n1（ＣＨ＝ＣＨ）_n2（ＣＨ₂）_n3（ＣＨ＝ＣＨ）_n4（
ＣＨ₂）_n5（ＣＨ＝ＣＨ）_n6（ＣＨ₂）_n7（ＣＨ＝ＣＨ）_n8（ＣＨ₂）_n9ＣＨ₃であ
る場合、誘導体化リン脂質はＮ−アシル化ホスファチジルエタノールアミンであ
る（「ＮＡＰＥ」、ＷＯ９８／１６１９９参照）。好ましくは、Ｒ²は−ＯＣ（
Ｏ）（ＣＨ₂）_n1ＣＨ₃、より好ましくは−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）₁₀ＣＨ₃である。

【００４２】 好ましくは、誘導体化リン脂質はＮ−アシル化ＰＥである。そのようなＮＡＰ
Ｅは融合性リポソームを調製するのに有用であり、本発明の薬物または生理活性
剤複合体を含むリポソームを調製するのに好ましい。

【００４３】 ＮＡＰＥ誘導二層脱安定化は、二層を誘導して隣接する生物学的膜に融合させ
、よって、二層の融合性を増強する（Ｓｈａｎｇｇｕａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１３６８：１７１−１８３（１９９８））。今度は
、ある条件下で、例えば、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺のごとき適当な濃度の存在下で、
細胞をリポソームと組み合わせることによって、増強された融合性を用いて、細
胞膜を通過できない核酸または他の剤のごときカプセル化された生理活性剤を細
胞に送達することができる。リポソーム細胞の接触の結果、リポソームカプセル
化生理活性剤が細胞に放出され、および／またはリポソームおよび細胞膜の融合
の結果として直接細胞の細胞質に放出される。そのような送達はインビボおよび
インビトロのいずれかである。

【００４４】 Ｒ³がアシル鎖またはペプチドである場合、よって、誘導体化リン脂質がＮＡ
ＰＥまたはペプチドと脂質のコンジュゲートである場合、Ｒ¹およびＲ²の内の少
なくとも１つは、好ましくは、不飽和アシル鎖であり、すなわち、その中のｎ２
、ｎ４、ｎ６およびｎ８の内の少なくとも１つは１に等しい。不飽和アシル鎖は
、限定されるものではないが、パルミトレエート、オレエート、リノレエート、
リノレネートおよびアラキドネート鎖を含む。好ましくは、不飽和アシル鎖はオ
レエート鎖（「−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）₇ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂）₇ＣＨ₃」）である
。より好ましくは、Ｒ¹およびＲ²はともにオレエート鎖であり、すなわち、誘導
体化リン脂質は、

【化２】 （式中、ＺはＲ³またはＸ−Ｙである） である。最も好ましくは、誘導体化リン脂質は：

【化３】 であり、すなわち、「Ｎ−Ｃ１２ＤＯＰＥ」である。

【００４５】 誘導体化リン脂質がＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥである場合、リポソーム脂質は、好
ましくは、ホスファチジルコリン、好ましくは、少なくとも１つの不飽和アシル
鎖を有するＰＣ、最も好ましくはジオレオイルホスファチジルコリンを含む。好
ましくは、リポソーム脂質は約７０モル％のＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥおよび約３０
モル％のＤＯＰＣを含む。（すなわち、Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥおよびＤＯＰＣの
「７０：３０」処方であり、ここに、リポソーム脂質濃度はここでは比率をいい
、ここに、そのような比率は言及する特定の脂質のリポソーム脂質における相対
的パーセンテージの表示である）

【００４６】 また、リポソーム脂質は「ヘッドグループ（頭頂基）修飾脂質」、すなわち、
脂質を一体化させるリポソームへの血清蛋白質への結合を阻害することができる
部位をそれに付着させることによって誘導体化された極性基を有する脂質を含む
ことができる。かくして、ヘッドグループ（頭頂基）修飾脂質リポソームへの一
体化はその薬物動態学挙動を変化させ、従って、動物の循環にリポソームは長時
間留まり、さもなければ当てはまる（例えば、Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１４９：１８０（１９９３）；Ｇａｂｉｚｏｎ
ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１０（５）：７０３（１９９３）；Ｐａｒｋら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，２５７：１１０８（１９９２）；
Ｗｏｏｄｌｅら、米国特許第５，０１３，５５６号、Ａｌｌｅｎらの米国特許第
４，８３７，０２８号および第４，９２０，０１６号参照、これらの刊行物は引
用する事により本明細書の一部をなすものとする。 ）。

【００４７】 ヘッドグループ（頭頂基）修飾脂質は、典型的には、とりわけ、ホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）、例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン（「ＤＰＰＥ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノール
アミン（「ＰＯＰＥ」）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（
「ＤＯＰＥ」）である。そのような脂質は、一般に、ポリエチレングリコールで
、またはコハク酸またはグルタル酸（「ＧＡ」）またはその対応する無水物のご
とき有機ジカルボン酸で誘導体化されたヘッドグループ（頭頂基）を有する。脂
質担体に一体化されたヘッドグループ（頭頂基）修飾脂質の量は、一般に、当業
者によく知られ、あるいは過度の実験無くして決定できる当業者の技量内にある
多数の因子に依存する。これらは、限定されるものではないが、脂質のタイプお
よびヘッドグループ（頭頂基）修飾のタイプ、担体のタイプおよびサイズ、およ
び処方の意図した治療用途を含む。典型的には、ヘッドグループ（頭頂基）修飾
脂質含有脂質単体中の脂質の約５モル％〜約２０モル％はヘッドグループ（頭頂
基）修飾脂質である。

【００４８】 複合化剤は、一般に、限定されるものではないが、スペルミン、スペルミジン
、コバルトヘキサミン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ポリリシン、
ポリヒスチジン、プロタミン、ヘパリンおよびデキストラン硫酸のごときポリア
ニオン、クエン酸イオンおよび硫酸イオンを含めた生理活性剤に反対に荷電した
基を含む。また、当業者であれば、本発明の方法で有用な他の有用な複合化剤を
認識するであろう。

【００４９】 リポソームにカプセル化される凝縮核酸は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
およびｃＤＮＡを含めたＤＮＡ、あるいはＲＮＡであり、好ましくは、カプセル
化された核酸はＤＮＡ、好ましくは閉じた（環状）プラスミドＤＮＡである。凝
縮した核酸は、１マイクロモルのリポソーム脂質当たり少なくとも約０．５マイ
クログラムのレベルにて、または１マイクロモル当たり少なくとも約０．７５、
１．０、１．２５，１．５、１．７５または２マイクログラムにてリポソームに
カプセル化される。より好ましくは、リポソームは１マイクロモルの脂質当たり
約２マイクログラムの核酸〜１マイクロモル当たり約２０マイクログラムを含有
する。核酸に関してここに使用される「凝縮した(condensed)」とは、核酸スト
ランドがポリカチオンの不存在下の場合に当てはまるよりも密にパックされるよ
うに、１以上のポリカチオンと組み合わされた核酸をいう。そのようなパッキン
グは核酸がリポソームにカプセル化されるのを可能とするが、核酸をトランスフ
ェクト可能な転写が準備できた立体配座のままにする。

【００５０】 従って、本発明の好ましい具体例において、該方法は、約７０モル％のＮ−Ｃ
１２ ＤＯＰＥおよび約３０モル％のＤＯＰＣを含むリポソーム脂質および凝縮
ＤＮＡを含むリポソームを調製する。そのようなリポソームは１マイクロモルの
脂質当たり少なくとも約０．５マイクログラムの凝縮したＤＮＡを含有する。

【００５１】 本発明の方法によって供されたリポソームは、複合化された生理活性剤に加え
て１以上の生理活性剤を含有することができる。リポソームと会合できる生理活
性剤は、限定されるものではないが、アシクロビール、ジドブジンおよびインタ
ーフェロンのごとき抗ウイルス剤と、アミノグリコシド、セファロスポリンおよ
びテトラサイクリンのごとき抗菌剤と、ポリエン抗生物質、イミダゾールおよび
トリアゾールのごとき抗菌類剤と、フォリン酸、およびプリンおよびピリミジン
アナログのごとき抗代謝剤と、アントラサイクリン抗生物質および植物アルカロ
イドのごとき抗新形成剤と、コレステロールのごときステロールと、炭水化物、
例えば、糖および澱粉と、アミノ酸、ペプチド、細胞受容体蛋白質、免疫グロブ
リン、酵素、ホルモン、神経伝達物質および糖蛋白質のごとき蛋白質と、放射性
同位体および放射性同位体−標識化合物のごとき放射性標識と、放射線不透過化
合物と、蛍光化合物と、散瞳化合物と、気管支拡張剤と、局所麻酔剤等を含む。

【００５２】 リポソーム生理活性剤処方は、例えば、剤の毒性を緩衝することによって生理
活性剤の治療指数を増強することができる。また、リポソームは、生理活性剤が
動物の循環から除去される速度を低下させることができる。従って、生理活性剤
のリポソーム処方は、より少ない剤が所望の効果を達成するのに投与されること
を要することを意味する。

【００５３】 本発明のリポソームは、その内部内容物の実質的部分が保持されるように脱水
し、貯蔵し、次いで、復元することができる。リポソームの脱水は、一般に、リ
ポソーム二層の内部および外部表面双方における二糖のごとき親水性乾燥保護剤
の使用を必要とする（米国特許第４，８８０，６３５号参照。これらの刊行物は
引用する事により本明細書の一部をなすものとする。）。この親水性化合物は、
一般に、そのサイズおよび含有量が乾燥手法の間に、および引き続いての再水和
を通じて維持されるように、リポソーム中の脂質の再配置を妨げると考えられる
。かかる乾燥保護剤についての適当な質は、それが強力な水素結合アクセプター
であることであり、リポソーム二層成分の分子間間隔を保持する立体化学特徴を
保有することである。あるいは、もしリポソーム調製物が再水和に先立って凍結
されず、十分な水が再水和に引き続いての調製で留まれば、乾燥保護剤は省略す
ることができる。

【００５４】 また、ここに、医薬上許容される担体および本発明のリポソームを含む医薬組
成物が提供される。該組成物は、例えば、核酸の動物細胞への送達で有用である
。本明細書で用いる「医薬上許容される担体」は、脂質、およびリポソーム生理
活性剤処方を含めたリポソームの、ヒトを含めた動物への投与との関係での使用
に一般に受け入れられる媒体である。医薬上許容される担体は、限定されるもの
ではないが、使用される特定のリポソーム生理活性剤、その凝縮、安定性および
意図された生物利用性と、リポソーム組成物で治療されるべき病気、障害または
疾患と、対象、その年齢、サイズおよび一般的状態と、および組成物の投与の意
図された経路、例えば、鼻孔内、経口、目、局所、経皮、膣、皮下、***内、腹
腔内、静脈内、または筋肉内を含めた、決定し説明する当業者の十分に技量内で
ある多数の特徴に従って処方される（例えば、引用する事により本明細書の一部
をなすものとするＮａｉｍ（１９８５））。非経口生理活性剤投与で使用される
典型的な医薬上許容される担体は、例えば、Ｄ５Ｗ、５容量％のデキストロース
を含有する水溶液、および生理食塩水を含む。医薬上許容される担体は、例えば
、保存剤および抗酸化剤のごとき、含まれる活性成分の安定性を増強させるもの
を含有することができる。

【００５５】 さらに、ここに、（ａ）核酸および脂質を含む逆（逆転）ミセルの懸濁液を形
成するように、核酸の水性懸濁液を、脂質、例えば、誘導体化リン脂質および付
加的な脂質を含む有機溶液と接触させるステップと、（ｂ）ポリカチオンをミセ
ル懸濁液に添加して、逆ミセル内に核酸を濃縮するステップとと、次いで、（ｃ
）ステップ（ｂ）の懸濁液から有機溶媒を除去して、凝縮ミセルから核酸および
脂質を含むリポソームを形成させるステップを含むことを特徴とするリポソーム
中に核酸、例えば、ＤＮＡをカプセル化する方法が提供される。該カプセル化方
法によって達成されるリポソーム脂質に対する核酸の比率は、１マイクロモルの
脂質当たり少なくとも約０．５マイクログラムの核酸である。

【００５６】 本発明で有用な脂質は、前記したごとく、それ自身で、または付加的な脂質と
組み合わせて、リポソームへの取り込みで適したものと認識されるものである。
これらは、リン脂質、糖脂質、ステロイドおよびその誘導体を含む。本発明で使
用される有機溶媒は、リポソーム調製物の間に脂質を溶解させるのに有用な種々
の溶媒のいずれかであり、これらは、限定されるものではないが、メタノール、
エタノール、ジメチルスルホキシド、クロロホルム、およびその混合液を含む。
好ましくは、有機溶媒はクロロホルムである。

【００５７】 核酸を凝縮させるのに本発明で有用なポリカチオンは、核酸、他の生理活性剤
または薬物を凝縮させるのに使用することができる３以上のイミダゾール基を有
する化学化合物のいずれかであり、これらは、限定されるものではないが、ポリ
リシン、ポリアミン（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）、ヘキサミンコ
バルト（ＩＩＩ）、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン等を含む。好ましくは
、ポリカチオンはスペルミンである。本発明の実施で有用な核酸は、ＤＮＡ、例
えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ（線状または閉じたもの
）、ならびにＲＮＡを含む。核酸は、通常理解され、容易に実施される方法、例
えば、懸濁するマクロ分子の渦形成によって水性媒体に懸濁させることができる
。適当な水性媒体は、緩衝剤のごとき種々の添加剤の水性溶液であり、塩および
ヌクレアーゼ酵素のごときある種の成分を実質的に含まず、かかる媒体は、限定
されるものではないが、低塩緩衝液（「ＬＳＢ」、例えば、後記例３参照）を含
む。

【００５８】 リン脂質によって安定化された油中水型は逆ミセルを含む。逆ミセル（例えば
、Ｂｒｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：７２１−７３９（１９９５））は両
親媒性脂質ベースの構造であり、ここに、脂質の親水性ドメインはミセル表面内
部に隔離され、他方、脂質の疎水性ドメインは外部の周囲に整列する。

【００５９】 逆ミセルを持つエマルジョンは、前記したごとく、および後記図２に記載され
たごとく形成され、そうでなければ複合化剤の存在下でのその凝集およびリポソ
ームへの取り込みに対する不適当性に導く分子内接触からその中に隔離された核
酸を含めた生理活性剤を保護する。該プロセスは、所望の複合体を含有する得ら
れたリポソームのパーセンテージを最大化するように行われる。

【００６０】 エマルジョン内では、複合体は、エマルジョン中の凝集ミセルの水性区画間で
の、ポリカチオン、または生理活性剤のごとき添加された複合化剤の交換によっ
て形成される（例えば、Ｂｒｕら、ＦＥＢＳ，２８２：１７０−１７４（１９９
１）；Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎ
ｓ Ｉ，８３：９８５−１００６（１９８７）参照）。ＤＮＡ複合体のカプセル
化の場合、適当なポリカチオンは、核酸を凝集させるのに使用されるポリカチオ
ンのいずれかである。例えば、スペルミンおよびスペルミジンが、低いＤＮＡ濃
度においてのみ個々のプラスミドをインビトロで凝縮させて、凝縮したプラスミ
ドの凝集を回避するのに共に用いられてきた（例えば、引用する事により本明細
書の一部をなすものとするＣｈａｔｔｏｒａｊら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１２
１：３２７−３３７（１９７８）およびＧｏｓｕｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２５９
：３３３−３３５（１９７６）参照）。そのような濃度は、凝縮された核酸のリ
ポソームカプセル化が試みられたならば、かなりの数の空があったであろう、す
なわち非ＤＮＡ含有リポソームがあったであろうほど最小限十分であった。また
、ポリリシンおよびヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）は核酸凝縮で利用できる。

【００６１】 核酸を凝縮するのに適したポリカチオンの濃度は、十分な数の核酸の負の電荷
、例えば、ＤＮＡの場合には負の電荷の約９０％以上の中和がもたらされる（Ｗ
ｉｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８：２１９２−２１９６（１９７９））。当
業者であれば、適当なポリカチオン濃度または最適なポリカチオン濃度、濃縮す
べき核酸が与えられば、用いられるポリカチオン、核酸濃度およびポリカチオン
価を十分決定することができる。

【００６２】 さらに、決定し説明する当業者の技量内のさらなる因子は、核酸のごとき生理
活性剤の凝縮に適したポリカチオンの濃度に影響し得る。例えば、Ｎ−Ｃ１２
ＤＯＰＥのごときＮＰＰＥは、さらなるアシル鎖によって正味の負の電荷を担う
。よって、そのような脂質は正に荷電した分子と相互作用でき、それにより、核
酸凝縮に適したポリカチオンのプールを減少させる。

【００６３】 従って、そのような場合、そうでなければ核酸凝縮に必要な量の前記ポリカチ
オンを添加する必要があろう。そのような十分なさらなる量のポリカチオンは、
例えば、例４に記載した分注実験のタイプを含めた多数の手段によって決定する
ことができる。そのような実験は、核酸凝縮に必要なさらなるポリカチオン濃度
を示すデータ（図３参照）を提供する。例えば、例３で用いた核酸および脂質の
濃度でもってして、０．６ｍＭスペルミンはプラスミドＤＮＡ凝縮に十分である
が、この量は、前記した濃度において、ＮＡＰＥ Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥの存在
下で０．８５ｍＭまで増加した。しかしながら、これらよりも大きな、すなわち
、最小限必要なものよりも大きなポリカチオン濃度を用いることができる。例え
ば、再度、例として例３の条件を考慮し、エマルジョン中の８〜２０ｍＭの最終
スペルミン濃度が、核酸および脂質の電荷の中和に最適であることが判明した。

【００６４】 当業者であれば、本発明の実施に適した脂質および核酸の濃度を十分決定する
ことができる。例えば（後記例３参照）、２００ｎｍの球状リポソーム内に凝集
したプラスミドＤＮＡをカプセル化するには、１２５マイクロリットルのＬＳＢ
中の２００マイクログラムのｐＺｅｏＬａｃＺプラスミドＤＮＡを、３０マイク
ロモルのＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥおよびＤＯＰＣの７０：３０モル比組合せと組み
合わせた。

【００６５】 従って、本発明の好ましい具体例は、例えば、約１ｍＭ以上の濃度において、
プラスミドＤＮＡである凝縮した核酸、誘導体化リン脂質を含む脂質、例えば、
Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ、クロロホルムおよびスペルミンで実施する。

【００６６】 ここに、核酸のごとき生理活性剤で動物の細胞をトランスフェクトする方法が
さらに提供され、該方法は、複合化核酸を含有する本発明のリポソームと細胞と
を接触させるステップを含む。そのような接触はインビトロ（この場合、リポソ
ームを含む組成物は細胞を囲む細胞媒体に添加される）またはインビボ（この場
合、リポソームは、やはり医薬上許容される担体を含む医薬組成物にて投与され
、そのような組成物を動物に投与する標準的な手段のいずれかによって動物に投
与される）いずれかによるものである。

【００６７】 インビボ接触は、特に特異性またはターゲッティングが望まれる場合、リポソ
ームを特異的部位に向ける手段をリポソームに一体化させることによって、例え
ば、ストレプトアビジンを介して抗体をリポソームにコンジュゲートし、リポソ
ームの内容物を選択的にある部位で放出させることによって、例えば、ＮＡＰＥ
またはペプチドと脂質のコンジュゲートをリポソームに取り込むことによって、
および／またはその中にヘッドグループ（頭頂基）修飾脂質を取り込むことによ
り部位、例えば、腫瘍にリポソームを蓄積させることによって助けられる。

【００６８】 トランスフェクション効率、すなわち、リポソームカプセル化核酸分子を細胞
に導入する効率は、リポソーム二層を誘導して細胞膜に融合させる手段をリポソ
ームに取り込むことによって、インビトロまたはインビボで助けられる。そのよ
うな手段は、限定されるものではないが、ＮＡＰＥ、ペプチドと脂質のコンジュ
ゲートおよびイオン化可能脂質の取り込みを含む（ここに引用する事により本明
細書の一部をなすものとするＷＯ ８７／０７５３０およびＷＯ ９５／２７４
７８参照）。

【００６９】 トランスフェクション（インビトロまたはインビボ）は、それがその中で転写
され翻訳されるように、核酸を細胞に導入するのを助ける。外因性核酸導入によ
るそのような蛋白質発現を用いて、発現の欠如、またはその中の遺伝子の過剰発
現によって引き起こされた細胞中の多数の欠陥にアドレスし、またはそうでなけ
れば細胞蛋白質およびその発現を修飾することができる。ここに提供されるリポ
ソームカプセル化核酸での細胞のトランスフェクションは、かくして、蛋白質の
異常な、存在しないかもしれないが異常に低い、異常に高いまたは不適切な発現
によって特徴づけられる病気または障害を被る動物を治療するのに有用である。
そのような病気および障害は、例えば、限定されるものではないが、種々の癌お
よび遺伝子欠陥障害を含む。また、治療上関連するトランスフェクションは、以
前にはターゲット細胞で発現されていなかった蛋白質の発現をもたらすことがで
きる。

【００７０】 トランスフェクションの成功、および細胞中でのトランスフェクトされた核酸
の発現は、例えば、放射性ヌクレオチドを核酸に取り込むことによって、または
核酸によってコードされた蛋白質の発現を検出することによって、多数の方法（
これらは一般に、細胞中の核酸の物理的圧力の検出に依存する）で検出すること
ができる。これは、限定されるものではないが、蛋白質が検出可能な場合、蛍光
マーカー、または、蛋白質が選択可能な場合、例えば、細胞毒性剤に対する抵抗
性遺伝子を含めた多数の方法で達成することができる。

【００７１】 例えば、プラスミドｐＥＧＦＰ−１は、その存在が蛍光顕微鏡により検出され
る、増強した緑蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。従って、細胞の
このプラスミドによる成功裡のトランスフェクション（例１０〜１２参照）は、
細胞により示される蛍光の量を評価することにより容易に決定される。これらの
実験の結果（図８〜１２参照）、ＯＶＣＡＲ−３細胞のｐＥＧＦＰ−１プラスミ
ドによる成功裡のトランスフェクション、並びに、有意な比率のトランスフェク
ト細胞中のトランスフェクトプラスミドの高発現レベル。

【００７２】 かかる成功裡の発現は、トランスフェクトＤＮＡがポリカチオン濃縮された場
合にのみ観察され、スペルミンで処理していないサンプルは、全く、またはほと
んど蛍光を示さなかった（図８参照）。蛍光タンパク質発現の定量（図９）によ
り、ポリカチオン濃縮ＤＮＡによるトランスフェクションでは有意な発現レベル
が得られるが、スペルミンを用いずに処理したサンプルのトランスフェクション
では、定量可能な蛍光が得られないことが実証された。さらに、遊離、すなわち
非カプセル化ＤＮＡによるトランスフェクションでも、観察可能なまたは定量可
能な蛍光は生じなかった（図８ｃおよび図９ｃ）。

【００７３】 本発明は、以下の例からより良く理解され、これは、本明細書で以後の特許請
求の範囲に定義した本発明の単なる例である。

【００７４】 ［実施例］ ［例１−材料］ Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）−ホスファチジルエタノールアミン
（卵黄レシチンからエステル交換）、ＤＯＰＣ、ＥＰＣおよびＮ−Ｃ１２−ＤＯ
ＰＥは、アバンチ・ポーラー・リピッズ（アラバスター、ＡＬ）から購入した。
ＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞は、ＮＣＩ−フレデリック癌研究所（フレデリック、Ｍ
Ｄ）から購入した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミド、およびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α
コンピテント細胞は、クロンテック・ラボラトリーズ（パロアルト、ＣＡ）から
購入した。ｐＺｅｏＳＶＬａｃＺプラスミド、コンピテント細胞およびＨａｎａ
ｈａｎ'ｓＳ．Ｏ．Ｃ．は、インビトロゲン（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し
た。ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ＲＰＭＩ１６４０および熱失活胎児ウシ血
清およびリポフェクチンは、ギブコ／ＢＲＬ（グランドアイランド、ＮＹ）から
購入した。ＤＮａｓｅ非含有ＲＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩは
、ベーリンガーマンハイム（ＧｍｂＨ、独国）から購入した。アガロースは、Ｆ
ＭＣバイオプロダクツ（ロックランド、ＭＥ）から購入した。麦芽寒天、麦芽ト
リプトンおよび酵母抽出液は、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（デトロイト、ＭＩ）
から購入した。カルセインブルーアセトキシメチルエステル（ＣＢＡＭ）、Ｐｉ
ｃｏＧｒｅｅｎおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩダイは、モレキュラー・プローブズ
（オイゲン、ＯＲ）から得た。

【００７５】 ［例２−プラスミド精製］ ２つのプラスミドをこの研究に使用した：６．５ｋｂであり、ＳＶ４０初期エ
ンハンサープロモーターから哺乳動物細胞でβ−ガラクトシダーゼのｌａｃＺ遺
伝子を発現し、抗生物質ゼオシンを使用した哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉで
の選択の可能な、ｐＺｅｏＳＶＬａｃＺプラスミド、および、４．７ｋｂであり
、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターから増強緑蛍光タンパク質（Ｅ
ＧＦＰ）を発現し、カナマイシンを使用してＥ．ｃｏｌｉでの、およびＧ４１８
を使用して哺乳動物細胞での選択の可能な、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミド。プラ
スミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉから精製し（ＢａｕｍａｎｎおよびＢｌｏｏｍｆｉｅｌ
ｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：８８４〜８９０（１９９５））−２６
０ｎｍでの吸光度と２８０ｎｍでの吸光度の最終的な比は、全ての調製物におい
て１．９倍以上であり、アガロースゲル電気泳動により、期待されたサイズ範囲
のＤＮＡが示された。

【００７６】 ［例３−リポソーム−ＤＮＡ製剤］ サンプルは、２００μｇのＤＮＡを、１２５μｌのＬＳＢに希釈し、次いで、
得られた懸濁液を、３０μｍｏｌの７０：３０のモル比のＮ−Ｃ１２ＤＯＰＥと
ＤＯＰＣを含む、１ｍｌのＣＨＣｌ₃と、１３×１００のＰｙｒｅｘチューブ中
でボルテックスをかけながら合わせることにより調製した。サンプルを、最大パ
ワー下でバスソニケーター（ラボラトリーサプライズ社、ヒックスビル、ＮＹ）
中で１２秒間直ちに超音波処理にかけ、プラスミドＤＮＡと最初にエマルジョン
を形成した。続いて、様々な濃度のスペルミン（１６〜４０ｍｍｏｌ）を含む１
２５μｌのＬＳＢのアリコートを、ボルテックスと超音波をかけながら、このエ
マルジョンに加えた。スペルミンを含まないサンプルを、スペルミンを第二の１
２５μｌアリコートから削除する以外は、同じように調製した。ＥＰＣを含むサ
ンプルの調製も、７ｍＭもスペルミンを使用する以外は、同一であった。

【００７７】 得られたエマルジョンを、数分以内に、Ｒｏｔｏｖａｐ（ブーヒラボラトリウ
ムズ−テクニックＡＧ、スイス）上のフラスコに入れた。有機溶媒を、フラスコ
を最大速度で回転しながら除去し、真空をピンバルブで調節した。最初に、約６
００〜６５０ｍｍの真空を確立し、これを続いて過剰に泡立てることなく可能な
限り迅速に、最大真空に達するまで（約７３０ｍｍ）増加させ、次いで、フラス
コをさらに２５分間真空化した。フラスコに残ったフィルムを、１ｍｌのＬＳＢ
中３００ｍＭスクロースに再懸濁し、サンプルを、５回、０．４μｍのポリカー
ボネートメンブランフィルター（ポレティクス、リブモア、ＣＡ）を通して押出
した。次いで、サンプルを、一晩４℃で、Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺を含まないハンク平衡
塩緩衝液（ＨＢＳＳ）に対して透析した。

【００７８】 他の脂質組成物を使用して、本発明に従って濃縮ＤＮＡをカプセル化した。プ
ラスミドを濃縮し、上記の本例に記載のようにリポソームにカプセル化し、例１
２のように沈降させた。リポソームの脂質組成物は、１２．５：２．５：５０：
１２：１０．５：１０．５の比の、コレステロールヘミスクシネート：コレステ
ロール：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ
ノールアミン：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール
アミン：ジオレオイルジメチルアンモニウムプロパン：オレオイルアセテートで
あった。ペレット化および洗浄後、これらのリポソームのＤＮＡ／脂質比を例１
０のように決定した。典型的なＤＮＡ／脂質比は、脂質１μｍｏｌあたり、ＤＮ
Ａ１．４〜２．１μｇであった。

【００７９】 ［例４−スペルミン分配］ Ｎ−Ｃ１２−ＤＯＰＥは、潜在的に陽性荷電スペルミンと相互作用し、濃縮プ
ロセスに影響を及ぼし得る正味負荷電を有する。それ故、低塩透析実験でこの組
成物のＤＮＡとリポソームの間のスペルミン分配を試験することが必要であった
。陰性荷電リン脂質とＤＮＡの間のスペルミンの分配を測定するために設計され
た実験は、３チャンバー透析装置（Ｓｉａｌｏｍｅｄ、ＭＤ）を用いて実施し、
各チャンバーは２５０μｌの液体を含む。所望の量のスペルミンをＬＳＢに希釈
し、２つの１００，０００分子量カットオフ透析膜により隔てられた、中心チャ
ンバーに入れた。スペルミンチャンバーの一方の側のチャンバーは、４００μｇ
のｐＺｅｏＬａｃＺプラスミドＤＮＡを、全容量２５０μｌのＬＳＢに含んだ。
他方の側のチャンバーは、２５０μｌのＬＳＢのみ、または、例３に記載のよう
に調製した、空のＮ−Ｃ１２ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームを、
２５０μｌのＬＢＳ中、全脂質濃度３０ｍＭで含み、この配置では、スペルミン
のみが、３つ全てのチャンバーに近づける。スペルミンによるプラスミドＤＮＡ
の中和は凝集をもたらすことが知られているので（図１）、ＤＮＡ含有チャンバ
ー中の溶液の濁度を、スペルミン分配のモニタリングの手段として使用した。リ
ポソームが完全にＤＮＡからスペルミンを隔離すれば、ＤＮＡは凝集しないだろ
う。利用可能な陰性荷電脂質の量は、これらの実験でＤＮＡ上の陰性荷電の量の
約２倍であった。各透析装置は、１２インチの電動車輪上で一晩（約２０時間）
回転させた。次いで、ＤＮＡ含有チャンバーを、繰返しピペッティングしながら
引き出し、サンプルを混合し、２５０μｌの容量のキュベットに入れた。４００
ｎｍでの吸光度を使用して、緩衝液バックグラウンドに対する濁度をモニタリン
グした。

【００８０】 ＤＮＡ濁度のスペルミン滴定曲線を、リポソームの存在下および非存在下で透
析用に作成した（図３）。リポソームの存在による曲線のおよそのシフトを使用
して、各スペルミン分子が、それぞれ会合定数Ｋ_DNAおよびＫ_lipidと単純な平衡
で、４つのヌクレオチドリン酸基または４つのリン脂質に結合すると仮定して、
脂質とＤＮＡの相対的結合定数を計算した。低塩では、ＤＮＡからのスペルミン
の解離定数は、μｍｏｌ範囲であることが知られている（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、１８：２１９２〜２１９６（１９７９）；Ｇｏｓｕｌｅら、Ｊ Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ、１２１：３２７〜３３７（１９７８））。それ故、スペルミン
の遊離濃度は、これらの実験でＤＮＡ凝集に必要なｍｍｏｌスペルミン濃度では
無視できると捉えた。

【００８１】 ＤＮＡ凝集に必要なスペルミンによるＤＮＡリン酸基の分別中和のγは、リポ
ソームの非存在下で得られたデータに基づき、０．９と捉えた。これは、ＤＮＡ
濃縮に必要であると報告されたのと同じ数値であり、凝集は、高いＤＮＡ濃度で
の濃縮を伴うという以前の観察と一致する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
１８：２１９２〜２１９６（１９７９）；Ｇｏｓｕｌｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ
ｌ、１２１：３２７〜３３７（１９７８））。凝集時に［ＤＮＡ−スペルミン］
＝γ［ＤＮＡ］_totalおよび［脂質−スペルミン］＝曲線のシフトと仮定すると
、式 Ｋ_DNA／Ｋ_lipid＝［γ／（１−γ）］×［（脂質_total−シフト）／（シフト）
］ を使用できる。脂質_totalが、４で割ったリポソームの外側に曝露された陰性荷
電脂質の全濃度と捉える場合、見かけの平衡定数の比は１７８であり、すなわち
ＤＮＡに結合しているスペルミンは、脂質に結合しているよりもはるかにより強
い。結合定数の比および右の第一因子は定数である。それ故、右の最後の因子を
使用して、エマルジョンに使用したより高い有効濃度を含む、任意の全脂質濃度
のＤＮＡ濃縮のスペルミン滴定曲線のシフトを計算できる。

【００８２】 図３に提示したデータにより、リポソームの存在は、ＤＮＡ凝集曲線を僅かに
シフトさせることが実証される。従って、最初の２５０μｌのエマルジョン中の
約０．６ｍＭスペルミンは、プラスミドＤＮＡを濃縮するに十分であり、一方、
使用量のＮ−Ｃ１２−ＤＯＰＥの存在下でＤＮＡを濃縮するのに全０．８５ｍＭ
で十分であろう。それ故、プラスミドＤＮＡは、リポソームを不安定化し得る陰
性荷電脂質の中和を伴うことなく、これらの調製物中で真に濃縮できると期待さ
れる。

【００８３】 ［例５−リポソームサンプルの光学顕微鏡］ リポソームへカプセル化を可能とするためのＤＮＡの予備濃縮を試験した。溶
液の大きな濁度の変化により判断したところ大量の凝集が起こった。これは意外
ではなかった。なぜなら、類似の問題が報告されているからである。プラスミド
凝集物の光学顕微鏡観察（図１）を、１２５μｌのＬＳＢ中、２００μｇのｐＺ
ｅｏＬａｃＺプラスミドを使用して実施し、１２５μｌのＬＳＢ中の７ｍＭスペ
ルミンと穏やかに混合し、１５分間室温でインキュベートした。

【００８４】 顕微鏡観察（図１Ａ）により、凝集物は、一般に１μｍよりはるかに大きく、
しばしば５〜１０μｍであることが実証された。大きなサイズのこれらの凝集物
がさらに冷温電子顕微鏡により確認された（図１Ｂ）。この倍率で特に記述すべ
きは、おそらくスペルミンの誘導する部分的に秩序のある構造への濃縮の結果と
しての、規則的な繊維の列である。ドーナツ形の構造の始まりを示唆するいくつ
かの曲線棒も存在するが、完全なドーナツ形ではなかった。このように形成され
た凝集物は、大きすぎて送達系に有用ではなかった。

【００８５】 ＤＮＡを含むＮ−Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームのサ
イズの推定のために（図５）、平均直径２６９±７ｎｍのポリスチレンビーズ（
Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、パロアルト、ＣＡ）を、Ｈ₂Ｏで顕微鏡に
適切な濃度に希釈し、ＤＮＡを含むＮ−Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３
０）リポソームのサンプルを、さらに希釈することなく（約２０ｍＭ脂質）、押
出しおよび透析後に使用した。サンプルを、オリンパスＢＨ２蛍光顕微鏡（オリ
ンパス、レイクサクセス、ＮＹ）で１０００倍率で調べた。

【００８６】 結果を図５に示す。ＤＮＡ含有リポソーム粒子は、この倍率でサイズおよび形
状が比較的均一のようであり、サンプル粒子のおよそのサイズは、動的光散乱試
験から得られたものと非常に類似しているようであった。図１ＡでのこのＤＮＡ
含有リポソーム粒子と、スペルミン凝集ＤＮＡの比較により、リポソーム形成前
に本発明に記載の逆ミセルでＤＮＡを濃縮する利点が実証される。スピルミンが
水溶液中のＤＮＡと直接相互作用する場合に非常に大きな凝集物の証拠は全く観
察されず、エマルジョン濃縮法は、かかる凝集物形成を大きく阻害し得ることを
示す。

【００８７】 ［例６−光学散乱による粒子解析］ Ｎ−Ｃ１２ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ調製物は、準弾性光散乱により特徴づけられた
。粒子サイズ解析は、Ｎｉｃｏｍｐ３７０粒子サイズ解析器（粒子サイジングシ
ステム、サンタバーバラ、ＣＡ）を使用して実施した。サンプルを解析のために
約１０倍に希釈した。ガウス解析を、小胞モードで実施し、数加重平均を報告す
る。例３のように調製したスペルミン濃縮ｐＺｅｏＬａｃＺプラスミドＤＮＡの
データは、２２２．６ｎｍの数平均粒子サイズで、ガウスサイズ分布により適合
し得る。

【００８８】 ［例７−凍結割断ＴＥＭ］ カプセル化ＤＮＡを含む融合誘導Ｎ−Ｃ１２ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ調製物をさら
に、凍結割断ＴＥＭによりさらに特徴づけた。約２μｌのサンプルを、２つのＢ
ａｌｚｅｒｓ銅二重複製ホールダーの間に沈着させ、液体プロパン中で凍結させ
た。サンプルを、−１００℃、１０^-6〜１０^-7バールで割断し、Ｂａｌｚｅｒｓ
ＢＡＦ４００凍結割断装置中、白金（＜４５℃）および炭素で影をつけた。レプ
リカを５％漂白剤で一晩消化し、蒸留水で洗浄し、３００メッシュの格子にのせ
た。像をフィリップス３００ＴＥＭを用いて得た。

【００８９】 結果を図６に提示する。大半の粒子はサイズが小さく（４００ｎｍ以下）、Ｎ
ＩＣＯＭＰ結果と一致する。液体二重層を通る一般的な割断平面のために、内容
物の観察は、この技術では稀である。しかし、少数の粒子は、濃縮ＤＮＡを示し
得るいくつかのカプセル化構造を有するようであった。

【００９０】 ［例８−冷温透過型電子顕微鏡］ 冷温−ＥＭを使用して調製物のリポソーム性質を確認し、おそらく任意のカプ
セル化物質を可視化した。ＥＰＣサンプルおよびスペルミン凝集ＤＮＡのために
、穴のある炭素支持体で覆膜した銅格子を、さらに処理することなく使用した。
Ｎ−Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）ＤＮＡ含有リポソームサンプル
のために、穴のある炭素フィルムを含むＥＭ格子を、一滴の０．１ｍＭのポリリ
ジン溶液を格子表面に配置することにより陽性荷電とし、それを１分間静置した
。ポリリジンを除去し、格子を数滴の蒸留水で濯ぎ、次いで数滴のサンプル緩衝
液で濯ぐ。次いで、５μｌのサンプルのアリコートを格子に配置し、薄フィルム
にブロッティングし、直ちに液体エタンに沈めた。格子を使用するまで液体窒素
下で保存した。加速電圧１２０ｋＶで作動して、フィリップスＣＭ１２透過型電
子顕微鏡（Ｍａｈｗａｈ、ＮＪ）で観察した。６２６冷温ホールダー（Ｗａｒｒ
ｅｎｄａｌｅ、ＰＡ）を使用して、画像処理中、サンプル温度を−１７７℃から
−１７５℃に維持した。低い電子量条件下でホール上に保留した領域の電子顕微
鏡写真を記録した。３５，０００倍率または６０，０００倍率の倍率および１．
８〜２．５μｍの不足焦点の数値を使用した。

【００９１】 結果を図７に提示する。スペルミンを、Ｎ−Ｃ１２ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣリポソ
ームの手順から削除する場合、主に単ラメラの比較的小さいが構造的に異種なリ
ポソームが観察され（図７ａ）、Ｎｉｃｏｍｐ解析と一致した。多くのリポソー
ムが管状のようであり、これはおそらく調製手順中に生じた浸透圧勾配の結果で
あろう。いくつかのリポソームは、非濃縮ＤＮＡ（左矢印）をおそらく示す内部
の繊維様構造を示した。非カプセル化遊離繊維も見ることができる（右矢印）。

【００９２】 スペルミンを用いて調製したＤＮＡ含有Ｎ−Ｃ１２ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣリポソ
ームサンプル（図７ｂ、ｃ）はまた、サイズ、形状およびラメラ性について異種
であった。いくつかの粒子は、目に見えるカプセル化物質を含まない、正常な外
見のリポソームであった。しかし、他のものは、電子的に濃い十分に明確なドー
ナツ形の構造を含み（図７、矢印）、これは、スペルミンを含まないサンプルに
は見られなかった。かかる構造は、使用する具体的な脂質に関連せず（図７ｃ、
右矢印）、曲がった棒構造（図７ｃ、左矢印）も卵黄レシチン調製物に観察され
、これは、冷温ＥＭサンプル調製条件下でより安定な傾向があった。棒とトロイ
ド内の細かい線の間の空間は均一であり、多ラメラリポソーム（星）の２つの膜
の間の空間よりも有意に小さかった。これらのドーナツ形構造は、遊離ＤＮＡが
スペルミン（Ｃｈａｔｔｏｒａｊら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２１：３２７〜
３３７（１９７８））または他の濃縮剤（Ａｒｓｃｏｔｔら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ、３０：６１９〜６３０（１９９０）；ＧｏｓｕｌｅおよびＳｃｈｅｌｌ
ｍａｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２１：３２７〜３３７（１９７８））により
希釈溶液中で濃縮する場合に観察されたトロイドおよび棒に非常に似ている。棒
およびトロイド内の平行および同心状の細かい線も、プラスミド凝集物内に見ら
れる線に似ていた（図１ｂ）。

【００９３】 膜は、いくつかのドーナツ形構造の周囲に明確に観察できた（例えば図７ｂ）
。全ての観察されたトロイドは、非透過バリア内にカプセル化されるようである
。なぜなら、濃縮したＤＮＡトロイドは、リポソームが最終的に懸濁された高塩
緩衝液に存在できないからである。それ故、これらの調製物の大部分は、リポソ
ームでカプセル化されたプラスミドＤＮＡからなるようである。

【００９４】 ［例９−アガロースゲル解析］ プラスミドＤＮＡのＤＮａｓｅ消化からの保護は、スペルミンを用いて調製し
たリポソームでカプセル化したプラスミドＤＮＡおよびスペルミンを用いずに調
製した対照サンプルについて、アガロースゲル電気泳動により評価した。５０μ
ｌの所望の調製物のアリコートを、Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺を含まない１４５μｌのＨＢ
ＳＳに希釈し、１μｌの０．２Ｍ ＭｇＣｌ２＋２μｌのＤＮａｓｅＩ（２０単
位）を混合しながら加えた。６時間室温でインキュベートした後、２μｌの０．
５Ｍ ＥＤＴＡを加えて、反応を停止した。非消化対照について、５０μｌの各
サンプルのアリコートを、１５０μｌのＨＢＳＳ（ｗ／ｏ ^Ca2+／Ｍｇ２＋）と
混合した。次いで、サンプルをフェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール
で抽出し、記載のようにエタノールで沈降させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子ク
ローニング：実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー：コールドスプリングハーバー、ＮＹ、Ｂ４〜Ｂ５項（１９８９））。ペレッ
トを２０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶かし、その５μｌを０．８％アガロース
ゲルにのせた。ゲルを、３０分間、１：１０，０００希釈のストックＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＩ核酸ゲルステイン（モレキュラープローブズ）で染色し、フォトス
ペクトラム（登録商標）紫外線トランスイルミネーター（ライトボックス）で可
視化した。写真を、ポラロイドＭＰ４＋カメラシステムを用いてライトボックス
で撮影した。次いで、これらの写真をスキャンジェットＩＩＣ（登録商標）（ヒ
ューレットパッカード、パロアルト、ＣＡ）で走査し、アルダスホトスタイラー
（登録商標）（Ｕ−リードシステム、トランス、ＣＡ）でデジタル化した。

【００９５】 図４に提示した結果は、両方の調製物が、有意なＤＮＡ保護または見かけのカ
プセル化を可能とすることを実証する。

【００９６】 ［例１０−定量解析］ ＤＮＡ保護を定量するために、ＤＮＡを、各アリコートから抽出し、蛍光アッ
セイにより測定した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイ（Ｈａｕｇｌａｎｄ、蛍
光プローブおよび研究化学物質のハンドブック、第６版、モレキュラープローブ
ズ社、１６１〜１６２項（１９９６））を使用して、例９に示したフェノール／
クロロホルム手順により抽出したＤＮＡを定量した。作用溶液を、１００μｌの
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎストック（モレキュラープローブズ）を、２０ｍｌのＴＥ（
ｐＨ７．５）に添加することにより調製した。抽出したサンプルを、最初に、Ｔ
Ｅ（ｐＨ７．５）で１００倍に希釈した。次いで、１４μｌの希釈サンプルのア
リコートを、９８６μｌのＴＥ（ｐＨ７．５）および１ｍｌのＰｉｃｏＧｒｅｅ
ｎ作用溶液と混合した。混合物を暗闇で室温で４分間インキュベートした。Ｐｉ
ｃｏＧｒｅｅｎ蛍光を室温で、ＰＴＩアルファスキャンフルオロメーター（サウ
ス・ブルンスウィック、ＮＪ）で、励起波長４８０ｎｍで、発光波長５２０ｎｍ
で、＞５００ｎｍのハイパスフィルター（ショットグラステクノロジーズ、Ｄｕ
ｒｙｅａ、ＰＡ）で記録した。１ｍｌのＴＥ（ｐＨ７．５）および１ｍｌのＰｉ
ｃｏＧｒｅｅｎ作用溶液混合物の蛍光をブランクとして使用した。ＤＮａｓｅＩ
消化から保護されたＤＮＡの比率は、ブランクを差し引き、非消化サンプルを１
００％と考えることにより計算した。我々の実験条件下では、消化ＤＮＡからの
蛍光シグナルは重要ではなかった。

【００９７】 スペルミンを含むサンプルでは１０．１±５．６％のプラスミド保護を示し、
一方、スペルミンを含まないサンプルでは１９．０±４．５が保護された。

【００９８】 ［例１１−トランスフェクションアッセイ］ 次いで、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡをカプセル化しているリポソーム
調製物のトランスフェクション活性を試験した。ＯＶＣＡＲ３細胞を、１０％熱
失活胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０のそれぞれ１ｍｌまたは０．１ｍｌ／
ウェル中、１×１０⁵細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに、または、２×１０⁵細
胞／ｍｌを９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、２日間（約４０
〜４８時間）増殖させ、その後、トランスフェクションを実施し、この時点で、
細胞は集密であった。トランスフェクション溶液を、適切なリポソームまたはＤ
ＮＡサンプルを血清非含有培地に希釈することにより調製した。プレートを吸引
して培地を除去し、１回、ダルベッコリン酸緩衝食塩水で洗浄し、その後吸引し
た。

【００９９】 トランスフェクション溶液（２４ウェルプレートでは０．５ｍｌ／ウェル、９
６ウェルプレートでは０．１ｍｌ／ウェル）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを
含む透析サンプルを、血清非含有培地に１０倍希釈することにより調製し（特記
しない限り、約２ｍＭ全脂質）、次いで、ウェルに加えて、３７℃で３時間イン
キュベートした。ウェルを吸引し、１０％熱失活胎児ウシ血清を含む培地を各ウ
ェルに加えた。ＣＭＶプロモーター下での以前に実証された導入遺伝子のサイレ
ンシングのために（Ｔａｎｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８：
２１１７〜２１２４（１９９７）；Ｄｉｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３１：２
０１〜２０９（１９９７））、５μＭのヒストンデアセチラーゼ阻害剤のトリコ
スタチンＡを、各ウェルに加え、発現を増強した。最後の２つの図で提示した実
験では、別のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の５ｍＭ 酪酸ナトリウムを代わり
に使用した。

【０１００】 ３７℃で細胞培養インキュベーターで１８〜２２時間インキュベートした後、
培地を吸引し、０．５ｍｌのアリコートのダルベッコＰＢＳで洗浄した。１０×
対物レンズを使用してオリンパスＩＭＴ−２倒立顕微鏡を用いて、組織培養プレ
ート上にまだあるサンプルの顕微鏡写真を取った。ＰＢＳを吸引し、０．５ｍｌ
（９６ウェルプレートでは０．１ｍｌ）の５μＭのカルセインブルーアセトキシ
メチルエステル（ＣＢＡＭ）のＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、４０分間室温でイ
ンキュベートした。細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、吸引し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．
０）中０．５ｍｌ（９６ウェルプレートでは０．１ｍｌ）の１％Ｃ₁₂Ｅ₈を各ウ
ェルに加えた。次いで、サンプルを洗浄剤に溶かし、全生細胞数に関して、正し
い全ＥＧＦＰ蛍光について解読した。プレートの蛍光を、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩ
Ｉ蛍光プレートリーダー（パーセプティブ・バイオシステムズ、フレーミングハ
ム、ＭＡ）で測定した。生細胞に添加したカルセインブルーの解読を、３６０ｎ
ｍの励起および４６０ｎｍの発光で８０の増幅率で実施した。これらの解読は、
集密が観察されたレベルまで最初にプレーティングした細胞数と線形であると確
認された。図１０に示したデータについて、外部ＤＮＡから分離したリポソーム
ペレットを使用した（例１２）。ＲＰＭＩ１６４０中のＣａ²⁺およびＭｇ²⁺レベ
ルは、血清中より有意に低く、図１１および１２のデータは、Ｃａ²⁺およびＭｇ ²⁺ を含む血清非含有培地を補充した後にそれぞれトランスフェクション中に１．
２ｍＭおよび０．８ｍＭが得られた。

【０１０１】 細胞タンパク質１単位あたりのＥＧＦＰ蛍光へのおよその変換は、１％トリト
ン−１００洗浄剤で抽出した２４および９６ウェル実験で、ＯＶＣＡＲ−３細胞
の４８時間培養液の平均タンパク質濃度を測定することにより推定できる。ビシ
ンコニン酸アッセイ（ピアスケミカル社、ロックフォード、ＩＬ）を、ウシ血清
アルブミンと共に標準物質として使用した。図９について、棒「ａ」の１ウェル
あたりの全平均バックグラウンド修正蛍光解読は６７０単位であった。別のプレ
ートから、トランスフェクション時（４８時間）の１ウェルあたりの平均全細胞
タンパク質は、約８８．４μｇ／ウェルであり、２４ウェルプレート実験で、０
．５ｍｌの容量中、全細胞タンパク質１μｇあたり７．６蛍光単位を与えた。図
１０では、棒「ａ」のデータ（９６ウェル実験）は、１ウェルあたり約４２０単
位の平均バックグラウンド修正ＥＧＦＰ蛍光を示し、１ウェルあたり２７μｇの
平均全細胞タンパク質濃度であり、全容量０．１ｍｌ中、全細胞タンパク質１μ
ｇあたり１５．５蛍光単位を与えた。図１１では（９６ウェル実験）、棒「ａ」
蛍光解読は、細胞タンパク質１μｇあたり１０３蛍光単位であった。

【０１０２】 腹腔送達をモデルするために（図１１および１２のデータ）、トランスフェク
ションを、腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの腹腔から５０μｌの濃縮細胞非含有洗
浄液を（例１３）、上記のように増殖したＯＶＣＡＲ−３細胞と共に９６ウェル
プレートの各吸引ウェルに加えることにより実施した。各ウェルに、例３に記載
のように調製した、５０μｌのＮ−Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣリポソーム−Ｄ
ＮＡ製剤を加え、最終脂質濃度約１０ｍＭおよび最終カプセル化ＤＮＡ濃度約７
〜１４μｇ／ｍｌ（全ＤＮＡ６７μｇ／ｍｌ）とした。上記のようにインキュベ
ートを実施した。この場合、腹腔洗浄液を、濃縮ストックの添加により、およそ
のＣａ²⁺およびＭｇ²⁺の血清レベル（それぞれ１．２ｍＭおよび０．８ｍＭ）に
調整した。リポソーム−ＤＮＡ溶液も、リポソームを細胞に加えるすぐ前に、濃
縮ストックの添加により、同じＣａ²⁺およびＭｇ²⁺のレベルに調整した。

【０１０３】 図８および９のデータは、スペルミン濃縮プラスミドＤＮＡをカプセル化した
ＮＣ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０／３０）リポソームの製剤は、ＯＶＣＡＲ
−３細胞のトランスフェクションで活性であることを実証する。データにより、
活性は、スペルミン濃縮剤の存在およびリポソーム内のプラスミドＤＮＡのカプ
セル化に依存したことが示される。図１０のデータにより、トランスフェクショ
ン活性は、脂質カプセル化ＤＮＡには関連するが、遊離外部ＤＮＡには関連しな
いことが再度実証される。図１１および１２のデータは、トランスフェクション
はまた、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の腹腔内部位に見られる妨害する可能性のある物質
（例えば血清タンパク質）の存在下で起こり得ることを示す。

【０１０４】 ［例１２−プラスミドＤＮＡおよび脂質粒子の沈降］ カプセル化プラスミドＤＮＡのトランスフェクション活性を実証するために、
プラスミドＤＮＡをリポソームカプセル化ＤＮＡから分離することが必要であっ
た。以下の調製法を使用した。沈降させて外部ＤＮＡを除去することにより調製
したリポソームを実験に使用し、その結果を図１０に示す。沈降実験では、Ｎ−
Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームサンプルを、２００ｍＭ
のスクロースをＬＳＢに含める以外は、スペルミンを用いて例３の方法により調
製した。頭部の基を標識したリサミンローダミンＢホスファチジルエタノールア
ミン（Ｒｈ−ＰＥ）も、１０μｇ／ｍｌで脂質プローブとして加えた。次いで、
５００μｌの調製物のアリコートを、１６，０００×ｇで３時間遠心分離した。
ペレットを、Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺を含まない５００μｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した。
５０μｌの各画分のアリコートを、ＤＮａｓｅＩ消化用にとっておいた（例９）
。フェノール／ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈降後、各アリコート中のプラ
スミドＤＮＡを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイにより測定し（例１０）、これを
使用して、各画分中の保護プラスミドの比率および全プラスミドＤＮＡの比率を
計算した。

【０１０５】 脂質の分布の測定のために、４０μｌの各画分のアリコートを、全容量２ｍｌ
中、０．２％のＣ₁₂Ｅ₈に溶かし、蛍光を、５６０ｎｍの励起波長および５５０
±２０ｎｍのバンドパスフィルター（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｌｏｔ、Ｉｒｖｉｎｅ
、ＣＡ）、５９０ｎｍの発光波長でモニタリングした。対照として、空のＮ−Ｃ
１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームを上記のように調製した。
透析後、１００μｇのＥＧＦＰプラスミドを５００μｌのサンプルに加えた。次
いで、サンプルを遠心分離し、脂質およびプラスミドＤＮＡについて定量した。

【０１０６】 脂質の約８０％がこれらの条件下でペレット化したが、全ＤＮＡの僅か約１４
％がペレット化した。ペレット化した物質のトランスフェクション活性を図１０
に示す。トランスフェクション活性は、明らかに脂質ペレット、すなわちリポソ
ームカプセル化ＤＮＡと関連した。

【０１０７】 ［例１３−洗浄液］ 本明細書に記載の調製物のトランスフェクション活性に対する腹腔タンパク質
の効果を試験するために、洗浄液を下記のように調製した。細胞を含有しないの
６ｍｌのＨＢＳＳ洗浄液を、ＯＶＣＡＲ−３細胞を注射した７週間後にＳＣＩＤ
マウスから採取し、１０，０００分子量のカットオフ回転濃縮器を用いて１ｍｌ
に濃縮した。タンパク質回収率は約６０％である。ＨＢＳＳ中約１０ｍｇ／ｍｌ
のタンパク質を含むこの液体に、正常血清範囲内までＣａ²⁺およびＭｇ²⁺を補充
し、培養したＯＶＣＡＲ−３細胞に加え、同じＣａ／ＭｇレベルでＨＢＳＳ中の
リポソームと共に等容量で混合し、最終脂質濃度１０ｍＭとした。

【０１０８】 これらのトランスフェクション実験の結果を図１１および１２に示す。トラン
スフェクション効率に対する血清タンパク質の阻害効果は既知であるにも関わら
ず、かなりの活性が、本発明の方法により調製した製剤を使用してこれらの条件
下で残った。

【０１０９】 ［例１４−リポソームの負荷効率］ 予備濃縮ＤＮＡ法を用いたリポソームの負荷効率を、本明細書中に記載の方法
と比較した。リポソームをＩｂａｎｅｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．、７４、６３３〜６４３、１９９６に記載のように調製した。６６μｇ／ｍ
ｌのｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡを、ＴＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０））に溶解した。２ｍｌのこの溶液を、２ｍｌの２３
ｍＭスペルミジンＴＳ緩衝液と混合して、ＤＮＡを予備濃縮して非常に濁った溶
液を得た。これを、４℃で一晩保存した。翌日、全部で９μｍｏｌの脂質を１ｍ
ｌのジエチルエーテル中に溶解した。これに３３０μｌのＤＮＡおよびスペルミ
ジン溶液をボルテックスしながら添加した。直後に混合物をそれぞれ５秒間で３
回超音波処理した（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ
、カタログ番号Ｇ１１２ＳＯＩ）。次いで、ジエチルエーテルを３７℃のロータ
リーエバポレーターを用いて除去してリポソームを形成させた。４つのこのサン
プルを各脂質組成物について調製した。リポソームを２００，０００×ｇで３０
分間ペレット化した。上清を取り除き、５００μｌ以上のＴＳ緩衝液を添加し、
遠心分離を繰り返した。全部で３回のサイクル後、リポソームを０．４５μｍの
孔のＭＦメンブレンから押し出した。リポソームをこのポイントでのカプセル化
の同定に使用するか、リポソームの一部をＣａ²⁺またはＭｇ²⁺を含まないハンク
ス平衡塩類溶液に透析した。比較のために、リポソームを例３に記載のように調
製した。ＤＮＡカプセル化を例９および例１０に記載のように測定した。全消化
を６時間行った。脂質濃度をＨＰＬＣで測定した。コレステロール以外の全ての
成分を、アセトニトリル：メタノール：Ｈ₂ＳＯ₄＝１００：３：０．０５の移動
相でのＷａｔｅｒｓ Ｓｈｅｒｉｓｏｒｂシリカカラム（３μｍ）を用いて定量
し、ＵＶ吸収によって検出した。コレステロールを、メタノール：水＝９６：４
の移動相でのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（５μｍ）で定量
し、弾性散乱検出器を用いて検出した。試験した脂質組成物を、以下の表に示す
。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】 本明細書中に記載のように乳濁液中でのＤＮＡ濃縮によって調製されたリポソ
ームにより、予備濃縮ＤＮＡで調製したリポソームよりも非常に高いＤＮＡ比が
得られた。

【０１１２】 ［例１５−リポソームの層状性の同定］ ７０：３０Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣからなるリポソームおよびカプセ
ル化プラスミドＤＮＡを例３に記載のように調製し、例１２に記載のように沈降
および洗浄した。これらのリポソームはまた、全脂質の０．５モル％でＮＢＤプ
ローブを含んでいた。リポソームを、蛍光光度計キュベット中で撹拌しながらリ
ン酸緩衝化生理食塩水中で８０μＭの全脂質濃度に希釈した。ＮＢＤ蛍光を、４
５０ｎｍでの励起および５３０ｎｍでの発光で測定した。最終濃度が２０ｍＭの
亜ジチオン酸ナトリウムを、リポソームを含むキュベット中に注入して露出した
ＮＢＤプローブを減少させた。図１３は、約５０〜５５％のＮＢＤシグナルの消
失は調製中にリポソームが主に単層であった、すなわち、約半分の脂質プローブ
が膜不浸透性還元剤亜ジチオン酸ナトリウムに曝されていたことを示す。

【０１１３】 ［例１６−腫瘍内注射によるＳＣＩＤマウス中への皮下ヒト腫瘍のトランスフ
ェクション］ ヒトＯＶＣＡＲ−３細胞（２×１０⁶）を、ＳＣＩＤマウスに皮下注射し、平
均直径が約４〜７ｍｍに達するまで数週間成長させた。

【０１１４】 スペルミンを含むリポソーム、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミド、および７０ｍｏ
ｌｅ％のＮ−Ｃ１２−ＤＯＰＥ、および３０ｍｏｌｅ％のＤＯＰＣを、例３に記
載のように調製した。リポソーム膜はまた、蛍光リポソームマーカーとして０．
５ｍｏｌｅ％のローダミン−ＰＥを含んでいた。

【０１１５】 カルシウムもマグネシウムも含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の
全脂質濃度が約４０ｍＭの０．１１ｍｌのリポソーム溶液を、Ｃａ²⁺およびＭｇ ²⁺ レベルをそれぞれ１．２ｍＭおよび０．８ｍＭに調製した後に腫瘍の中心に直
接注射した。１日後、０．１１ｍｌの２０ｍＭ酪酸ナトリウムのＨＢＳＳ溶液を
同一の部位に注射した。２４時間後、腫瘍を切り出して凍結した。その後、−２
０℃の凍結切片作製器上で１４〜３０μｍの厚い切片を得て、ガラス製のカバー
ガラス上に置いて凍結させ、カバースリップを得た。凍結腫瘍サンプルを、Ｏ．
Ｃ．Ｔ．包埋媒体に包埋した。

【０１１６】 ｐＥＧＰＦ−Ｃ１プラスミドの導入遺伝子発現を、固定凍結組織の２０μｍ低
温切片の共焦点顕微鏡法によって評価した。凍結切片を、アルゴン／クリプトン
レーザーを具備したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０／Ｂｉｏｒａｄ ＭＲＣ １００
０共焦点顕微鏡を用いて試験した。（ＥＧＦＰについてＥｘ４８８ｎｍ、Ｅｍ５
１５；ローダミンについてはＥｘ ５６８、Ｅｍ５８５）。組織切片領域を、２
０倍に画像処理した。図の作成に画像強調を使用せずにカラースケールを適用し
た。図１４は、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｋプラスミド処理腫瘍から得た組織切片由来の
１対の蛍光画像を示す。下のパネルは、ローダミン標識リポソーム由来の赤色蛍
光を示す。非常に高い脂質シグナル（黄色）により、この切片はリポソーム注射
付近に存在するが示唆される。上のパネルは、導入遺伝子発現による緑色蛍光を
示す。発現プラスミド由来のシグナルが近くに存在するが、脂質シグナルの偶然
の一致ではなく、腫瘍中のプラスミドの真の発現を示すようである。図１５は、
ＥＧＦＰが発現した異なる腫瘍由来の異なる対の蛍光画像を示す。コントロール
腫瘍組織の低温切片由来の蛍光画像対を、図１６に示す。組織中の弱い、固有の
散在する緑色蛍光は上のパネルで認められるが、任意のコントロール組織切片に
は強い蛍光領域は認められなかった。いかなるコントロール腫瘍切片にも赤色蛍
光は存在しなかった。

【０１１７】 ［例１７−インビボでのマウス筋肉のトランスフェクション］ ｐＺｅｏＳＶＬａｃＺプラスミドをカプセル化したＮＣ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯ
ＰＣ（７０：３０）リポソームのトランスフェクション活性を、マウスの脚の筋
肉においてインビボで試験した。リポソームを、例３に記載のように調製した。
標準的な条件下に置いた雌ＤＢＡマウスを本実験に使用した。１日目に、ｐＺｅ
ｏＳＶＬａｃＺプラスミドを含む５０μｌのリポソームを、後ろ脚に直接注射し
た。注射部位は、脚の前大腿部付近であった。反対側の脚に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１
プラスミドを含むか未処理の５０μｌリポソームを投与した。２日目に、５０μ
ｌの２０ｍＭ酪酸ナトリウムのＨＢＳＳ溶液をリポソームで治療した脚に注射し
た。３日目にマウスを屠殺し、４つの切片（前脚、後ろ脚、前大腿部、後大腿部
）に脚の筋肉を切り出した。各切片由来の組織の半分の一方を液体プロパン中で
すぐに凍結し、他方の半分を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、３０％スク
ロースで凍結保護し、プロパン中で瞬間凍結した。

【０１１８】 Ｎ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームを介して送達させたｐ
ＺｅｏＳＶＬａｃＺプラスミドの導入遺伝子発現を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ発光β−
ｇａｌキットを用いて評価した。固定していない筋肉を解凍し、切片に切断し、
以下のようにホモゲナイズ（同質化）した。１５ｍｌ溶解緩衝液（９．１５ｍＬ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．８５ｍＬ ＫＨ₂ＰＯ₄、２０μｌ Ｔｒｉｔｏｎ×１００、
１０μｌ ＤＴＴ）を１ｍｇ湿組織に添加し、手動で５分間ホモゲナイズし、室
温で２０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、１４，０００ｒｐｍで
２分間スピンして組織破片をペレット化した。上清のアリコートを、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈが説明するようにβ−ガラクトシダーゼについて評価した。６０分後、Ｂ
ｅｒｔｈｏｌｄプレート照度計を用いて光度を読み取った。同型の異なる筋肉切
片について測定値を平均した。結果を図１７に示す。コントロール（対照）を超
える有意なβ−ガラクトシダーゼ活性の増加が前大腿部の筋肉切片に認められた
。後ろ脚および後大腿部筋肉にもわずかな増加が認められた。

【０１１９】 これらの結果は、Ｎ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームベク
ターを用いてマウスの筋肉に送達した場合のｐＺｅｏＳＶＬａｃＺプラスミドの
インビボトランスフェクションおよび導入遺伝子発現を示す。

【０１２０】 ［例１８−リポソーム濃縮したＤＮＡおよびカチオン性リポプレックスでのト
ランスフェクションの比較］ ［カチオン性リポプレックスの調製］ カチオン性脂質およびヘルパー脂質のプラスミドＤＮＡとの複合体を、使用直
前に調製した。リポフェクチンをＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ、Ｎ．Ｙ．）から購入した。リポフェクチンについて、脂質のみを無血清培地
で約４５分間インキュベートし、製造者（インビトロゲン）が提案するようにＤ
ＮＡと複合体生成させた。同体積の４μｇ／ｍｌ ＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌ
脂質または同体積の２０μｇ／ｍｌ ＤＮＡおよび２００μｇ／ｍｌ脂質をすべ
てＲＰＭＩ １６４０培地中で混合し、約１０〜１５分間インキュベートし、組
織培養プレートのウェルに添加した。細胞へのリポプレックスの添加直前に濃縮
ストックの添加によってＣａ²⁺およびＭｇ²⁺をそれぞれ１．２ｍＭおよび０．８
ｍＭの最終濃度に調整した。リポフェクチンに使用した脂質／ＤＮＡ比を、いく
つかの比を比較する最適化の基本とした。

【０１２１】 ＤＣ−コレステロール／ＤＯＰＥ（４／６）複合体を、本質的に以前に記載の
ように（Ｍｕｌｄｏｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２、１６２〜１６
７、１９９７）形成し、１５分以内に使用した。最適なＤＮＡ／脂質比を、全て
の実験に使用した（すなわち、４μｇ／ｍｌ ＤＮＡを同体積の２０μｇ／ｍｌ
脂質と混合するか、２０μｇ／ｍｌ ＤＮＡを同体積の１００μｇ／ｍｌ脂質と
混合した）。

【０１２２】 全ての他の複合体を、一製造者（インビトロゲン）のカチオン性脂質または脂
質混合物を用いて形成させた。これらを、製造者が指示するように１倍濃度およ
び指示する脂質／ＤＮＡ比で調製した。

【０１２３】 例１１に記載のようにトランスフェクションアッセイを行った。 ［カチオン性リポプレックスとの比較］ 外来ＤＮＡを含まないペレット化リポソームを、等しいＤＮＡ濃度でのカチオ
ン性リポプレックスとトランスフェクションについての直接比較に使用した。こ
れらのデータを、リポソーム治療（酪酸ナトリウム（導入遺伝子発現の無毒性ア
クチベーター）中でのインキュベーション後の全てのデータ（Ｔａｎｇら、Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、２１１７〜２１２４、１９９７；Ｗｈ
ｅｅｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２８０、１９９
６；Ｇｒｕｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４、２８３３〜２８４２、１９８４
））および生理学的Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺レベルと比較して表２に示す（全てのデ
ータを、全細胞内エステラーゼ活性に関して基準化した）。表２では、Ｎ−Ｃ１
２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣリポソームを１として細胞の生存度およびトランスフェ
クションを示す（すなわち、この実験系において１．０より大きな値はこれらの
パラメータのいずれかが高いファクターを示す）。ＮＣ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰ
Ｃ（７０：３０）リポソームのトランスフェクション活性は、一般に、これらの
条件下でのカチオン性リポプレックスで認められる範囲であった。リポプレック
スによっては有意に低い活性を示すものと有意に高い活性を示すものがあった。
３β「Ｎ−（ジメチルアミノエタン）−カルバモイル」コレステロールおよびジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＣ−ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ）を含
むリポプレックスが特に活性が高かった。しかし、全てのカチオン性リポプレッ
クスのように、これらの実験で特に高濃度で使用した特定の細胞と比較してリポ
ソームより有意に毒性が高かった。これは、リポプレックスでの治療後にカルセ
インブルー蛍光が低いこと（表２のデータ）および治療後に顕微鏡で細胞が丸く
***していることが認められることによって認められる（データ示さず）。いく
つかの場合、カチオン性リポプレックスのトランスフェクション効率は、実際に
はおそらくその毒性の結果としてより高い濃度のリポソームと比較して減少した
。リポソームにカプセル化したＤＮＡでは毒性は認められなかった。興味深いこ
とに、リポソームでの治療により、１０％と３０％との間の最終カルセインブル
ー蛍光が増加し、これはおそらく無血清培地中でのインキュベーションの影響か
らの保護の結果である。

【０１２４】 トランスフェクション効率が上記実験で使用したＤＮＡの比較的低いレベルで
飽和に達しているので、組織培養系においてこのリポソームによるプラスミドＤ
ＮＡ送達系の毒性が比較的低いことの重要性は完全に明らかではない。しかし、
インビボでの飽和は非常に異なると考えられる。大過剰のインビボでの非特異性
結合部位は、ターゲット細胞での有効な発現のための高レベルのＤＮＡおよび／
または多くの注射の使用を必要とし得る。その毒性により、この条件下でのカチ
オン性リポプレックスの使用には限界があるであろう。

【０１２５】 Ｏｖｃａｒ−３細胞を、洗浄リポソームペレット（図１０）または同量のｐＥ
ＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡを含む脂質複合体と無血清培地中で３時間インキ
ュベートした。全てのトランスフェクション手順を例１１に記載のように行い、
Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺をそれぞれ１．２ｍＭおよび０．８ｍＭに調整する。

【０１２６】

【表２】

【０１２７】 当業者は、目的を実行して記載のおよび固有の目的および利益を得るために本
発明が十分に適用されることを容易に認識する。本明細書中に記載の化合物、組
成物、方法、手順、および技術は、好ましい具体例として示されているか、例証
として意図されるか本発明の範囲を限定することを意図しない。これらの変更形
態および他の用途は、添付の特許請求の範囲の精神の範囲内に含まれることが当
業者に自明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はスペルミン−媒介プラスミドＤＮＡ凝集の顕微鏡写真である（１２５マ
イクロリットルのＬＳＢ中の２００マイクログラムのプラスミドＤＮＡを１２５
マイクロリットルのＬＳＢ中の７ｍＭスペルミンと温和に混合した）。（Ａ）室
温でのインキュベーションから１５分後における光学顕微鏡観察（棒線は１０ミ
クロンを表す）。（Ｂ）低温ＴＥＭ観察（棒線は１００ｎｍを表す）。

【図２】 図２はＤＮＡカプセル化の方法の模式図である。ＤＮＡの凝縮は（Ｉ）大量の
有機溶媒中でＤＮＡ周りに形成されたリン脂質−安定化水滴内で起こる。別々の
スペルミン−含有液滴は、一過性（ＩＩＩ）接触および交換によって、（ＩＩ）
スペルミンをＤＮＡ含有液滴に移動させる。エマルジョン内での凝縮（ＩＶ）の
後、小胞は、溶媒蒸発によって形成され、さらに、より小さなサイズに押し出さ
れる（Ｖ）。

【図３】 図３は、プラスミドＤＮＡのスペルミン媒介凝集に対するリポソームＮ−Ｃ１
２ ＤＯＰＥの効果を示す。平衡透析は３−チャンバー透析デバイスで行った（
例４参照）。左側の曲線はリポソーム無しでの透析からのものであり、他方、右
側にシフトした曲線は、リポソームを含むチャンバーを含んだ透析からのもので
ある。Ｘ軸：スペルミン濃度（ｍＭ）；ｙ軸：濁度（Ｏ．Ｄ．４００ｎｍ）。

【図４】 図４はＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）処方におけるプラスミ
ドＤＮＡ保護のアガロースゲル分析を示す。押出および透析後の各調製からのア
リコットを分け、その１つをＤＮａｓｅＩで消化した（例９参照）。レーン１。
スペルミン無しでの調製。レーン２。ＤＮａｓｅＩで消化した以外はレーン１に
同じ。レーン３。スペルミン有りでの調製。レーン４。ＤＮａｓｅＩで消化した
以外はレーン３に同じ。

【図５】 図５はｐＺｅｏＬａｃＺプラスミドおよびスペルミン（Ａ）−対−２６９±７
ｎｍの平均直径を持つポリスチレンビーズ（Ｂ）で例３に記載されたごとく調製
したＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）試料中の粒子の光学顕微鏡
写真を示す（棒線は１０ｎｍを表す）。

【図６】 図６は例３に記載したごとくプラスミドおよびスペルミンで調製したＮ−Ｃ１
２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）の凍結破砕ＴＥＭ顕微鏡写真（例７参照
）を示す。矢印は明らかにカプセル化された物質を含む粒子を示す（棒線は４０
０ｎｍを表す）。

【図７】 図７はスペルミン無し（ａ）またはスペルミン有り（ｂ）でのＮ−Ｃ１２ Ｄ
ＯＰＥ／ＤＯＰＣおよびｐＺｅｏＬａｃＺプラスミドを含むリポソームの低温Ｔ
ＥＭ顕微鏡写真（例８参照）を示し、該リポソームは例３に記載されたごとく調
製された。（ａ）においては、繊維様構造がリポソームの外部（星印）および明
らかに内部（矢印）で観察される。（ｂ）においては、矢印はポリカチオン凝集
プラスミドＤＮＡに似たトロイドを示す（（ａ）および（ｂ）中の棒線は１００
ｎｍを表す）。光学顕微鏡写真（ｃ）はスペルミンで作成されたＥＰＣ試料を表
す。トロイド（矢印）および曲がったロッド（星印）構造をマルチラメラリポソ
ーム（ポンドサイン）と比較する［棒線は５０ｎｍを表す］。

【図８】 図８は、Ｎ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）調製物でのトランス
フェクション（例１１参照）後における密集ＯＶＣＡＲ３細胞の蛍光光学顕微鏡
写真を示す。リポソーム試料は（ａ）スペルミン有りまたは（ｂ）無しにてｐＥ
ＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡで調製した（例３参照）。予め形成されたリポソ
ームの外部に添加されたスペルミン＋遊離ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡ無
しの空のＮ−Ｃ１ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）リポソームの試料（ｃ）
もまたテストした。試料ｃ中の空のリポソームに添加されたプラスミドＤＮＡの
量は、他の調製物の各々における全量と等しかった。等しいリポソーム濃度を実
験で用いた。

【図９】 図９はＥＧＦＰ蛍光レベルによって測定した、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１でトランスフ
ェクトしたＯＶＣＡＲ３細胞におけるＥＧＦＰ発現の定量を示す。トランスフェ
クション実験（ａ、ｂおよびｃ、例１１参照）は前記図面脚注におけると同一で
あった。加えて、テストした処方は：ｄ）スペルミンおよびｐＥＧＦＰ−Ｃ１プ
ラスミドで調製した卵ＰＣリポソーム（例３参照）、およびｄ）添加無しであっ
た。細胞を洗浄し、ＣＢＡＭで標識し、次いで、洗剤に溶解させてＥＧＦＰおよ
びカルセインブルーの蛍光で測定した（例１０参照、誤差棒線は±標準偏差であ
る）。

【図１０】 図１０はスペルミンおよびｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡで調製したＮ−
Ｃ１２−ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）の脂質ペレットでのトランスフェク
ション活性の会合を示す（例３参照）、最初のプラスミドＤＮＡおよびスペルミ
ン溶液は２００ｍＭスクロースを含有した。押出および透析の後、試料の半分を
さらなる取り扱い無くしてトランスフェクションで用い（ａ）、試料の残りから
の脂質粒子を遠心によってペレット化し、トランスフェクションで用いる前にＨ
ＢＳＳで一回洗浄した（ｂ）。２００ｍＭスクロースのみを含むＮ−Ｃ１２−Ｄ
ＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０：３０）もまた調製し、他の試料で用いたものと等しい
量での丁度透析前にプラスミドＤＮＡおよびスペルミンを共に外部添加した。こ
の空の試料（ｃ）のペレットは同一の方法で調製し、次いで、各試料の等しい脂
質量を、前の図面の脚注に記載された条件下でトランスフェクションで用いた。
一晩のインキュベーションの後に、細胞をＣＢＡＭで標識し、ＥＧＦＰおよびカ
ルセインブルーの蛍光を測定した（誤差棒線は±標準偏差である）。

【図１１】 図１１は緩衝液と比較したマウス腹水液におけるＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯ
ＰＣ（７０：３０）を介するトランスフェクションを示す。腹水は、例１３に示
すごとく、腫瘍−担持ＳＣＩＤマウスの洗浄から得た。細胞は、ほぼ３．５ｍｇ
／ｍｌの最終蛋白質濃度にて、ＨＢＳＳまたは腹水液を含むＨＢＳＳ中の最終濃
度１０ｍＭ全脂質にてプラスミドＤＮＡ含有リポソーム（ペレットではない）と
共にインキュベートした（例１１参照）。３時間のインキュベーションの後、ト
ランスフェクション溶液を血清およびブチレート含有媒体でほぼ２０時間で交換
した。ＥＧＦＰの発現をその蛍光を介して測定した（誤差棒線は±標準偏差を表
す）。

【図１２】 図１２は緩衝液またはマウス腹水液中のＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７
０：３０）リポソームでトランスフェクトした（例１１参照）ＯＶＣＡＲ−３細
胞の蛍光光学顕微鏡写真を示す。図１２の脚注に記載したごとく処理した細胞を
写真に取った。写真Ａは腹水液を含まないトランスフェクションを表し、写真Ｂ
は腹水液を含むトランスフェクションを示す：細胞はこれらの図で密集している
。

【図１３】 図１３はリポソームのラメラ性の蛍光プローブ測定を示す。

【図１４】 図１４はｐＥＧＦＰ−Ｃ１を含有するＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０
：３０）リポソームでインビボにてトランスフェクトしたＯＶＣＡＲ−３腫瘍の
蛍光顕微鏡写真を示す。パネルＡはＥＧＦＰの発現を示す。パネルＢはローダミ
ン標識リポソームからの赤色蛍光を示す。

【図１５】 図１５はｐＥＧＦＰ−Ｃ１を含有するＮ−Ｃ１２ ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（７０
：３０）リポソームでインビボにてトランスフェクトした図１４とは異なる部位
から取ったＯＶＣＡＲ−３腫瘍の蛍光顕微鏡写真を示す。パネルＡはＥＧＦＰの
発現を示す。パネルＢはローダミン標識リポソームからの赤色蛍光を示す。

【図１６】 図１６は対照腫瘍組織の蛍光顕微鏡写真を示す。パネルＡは散漫な緑色蛍光を
示す。パネルＢはローダミン標識リポソームからの赤色蛍光の欠如を示す。

【図１７】 図１７はインビボでのトランスフェクション後の筋肉組織中でのβ−ガラクト
シダーゼ活性の発現を示すグラフを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シャングァン，トン アメリカ合衆国ニュージャージー州08540， プリンストン，タフト・コート 17 (72)発明者 キャブラル‐リリー，ドナ アメリカ合衆国ニュージャージー州08540， プリンストン，キャナル・ロード 981エ イ (72)発明者 ジャノフ，アンドリュー アメリカ合衆国ペンシルヴァニア州19067， ヤードリー，カウンテス・ドライヴ 560 (72)発明者 アール，パトリック アメリカ合衆国ニュージャージー州08536， プリンストン，ブルックリン・コート ２ イー Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC27 DD49P DD63F FF35 FF43 GG27 4C084 AA13 MA01 MA05 MA24 MA66 NA10 NA12 ZB352 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA07 MA24 MA66 NA03 NA10 NA12 ZB26

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）少なくとも１つの両親媒性脂質を１以上の有機溶媒に
   溶解させるステップと、 （ｂ）生理活性剤および脂質を含むエマルジョンを形成するように、生理活性
   剤を含む第１の水性懸濁液をステップ（ａ）の脂質含有有機溶液と合わせるステ
   ップと、 （ｃ）複合化剤を含む第２の水性懸濁液をステップ（ｂ）のエマルジョンに添
   加するステップと、 （ｄ）複合化剤を生理活性剤と接触させることにより、生理活性剤と複合化剤
   との複合体を脂質安定化水滴内に形成するように、ステップ（ｃ）のエマルジョ
   ンをインキュベートするステップと、ここで、該複合体の直径は該水滴の直径よ
   りも大きくなく、 （ｅ）複合化された生理活性剤および脂質を含むリポソームを形成するように
   、ステップ（ｄ）の懸濁液から有機溶媒を除去するステップと を含むリポソーム中に生理活性複合体をカプセル化する方法。
2. 【請求項２】 （ａ）少なくとも１つの両親媒性脂質を１以上の有機溶媒に
   溶解させるステップと、 （ｂ）複合化剤および脂質を含むエマルジョンを形成するように、複合化剤を
   含む第１の水性懸濁液をステップ（ａ）の脂質含有有機溶液と合わせるステップ
   と、 （ｃ）生理活性剤を含む第２の水性懸濁液をステップ（ｂ）のエマルジョンに
   添加するステップと、 （ｄ）複合化剤を生理活性剤と接触させることにより、生理活性剤と複合化剤
   との複合体を脂質安定化水滴内に形成するように、ステップ（ｃ）のエマルジョ
   ンをインキュベートするステップと、ここで、該複合体の直径は該水滴の直径よ
   りも大きくなく、 （ｅ）複合化した生理活性剤および脂質を含むリポソームを形成するように、
   ステップ（ｄ）の懸濁液から有機溶媒を除去するステップと を含むリポソーム中に生理活性複合化をカプセル化する方法。
3. 【請求項３】 前記生理活性剤が、核酸である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記核酸が、ＤＮＡである請求項１に記載の方法。