DE60036861T2

DE60036861T2 - Verkapselung biologisch aktiver komplexe in liposomen

Info

Publication number: DE60036861T2
Application number: DE60036861T
Authority: DE
Inventors: Paul Princeton Junction MEERS; Tong Princeton SHANGGUAN; Donna Princeton CABRAL-LILLY; Andrew Yardley JANOFF; Patrick Princeton AHL
Original assignee: Transave LLC
Current assignee: Transave LLC
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: EP1156783A1; HUP0200114A2; WO2000051565A9; CN1349402A; ES2295018T3; NZ513829A; AU3715900A; NO20014231L; ATE376413T1; BR0008711A; CA2362485A1; NO20014231D0; PL351487A1; JP2002538096A; EA200100856A1; WO2000051565A1; CZ20013103A3; ZA200107205B; EP1156783B1; US20090068256A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung ist auf ein Verfahren zur Einkapselung von Komplexen, wie mit Polykationen kondensierten Nukleinsäuren, in Liposome unter Verwendung einer durch amphipathische Lipide stabilisierten Emulsion als Zwischenstufe gerichtet, innerhalb welcher sich der Komplex bildet. Diese Erfindung ist auch auf die so gebildeten, in Liposomen eingekapselten Komplexe gerichtet. Das Verfahren dieser Erfindung ist anwendbar, um Liposome bereitzustellen, die mit verschiedenen Verbindungen beladen sind, bei denen es zuvor schwierig gewesen war, sie in hohen Verhältnissen von Verbindung zu Lipid in Liposomen zu einzuführen.
Hintergrund der Erfindung
Um als pharmazeutische Präparate nützlich zu sein, müssen bioaktive Mittel in der Lage sein, den Ort der Therapie in einer adäquaten, therapeutisch wirksamen Menge zu erreichen. Während viele bioaktive Mittel und Arzneimittel in vivo stabil sind, werden andere oftmals abgebaut. Wenn ein solcher Abbau stattfindet, bevor das Arzneimittel oder bioaktive Mittel seinen Zielort erreicht, wird eine nicht-therapeutische Menge von Arzneimittel den Zielort erreichen. Andere Arzneimittel oder bioaktive Mittel werden durch Nicht-Ziel-Systeme aufgenommen, was wiederum zum Fehlen einer therapeutischen Menge eines Arzneimittels oder bioaktiven Mittels, welche den Zielort erreicht, in therapeutisch wirksamen Mengen führt. Bestimmte polare Arzneimittel können in Zellen aufgrund ihrer Unfähigkeit, die Membran der Zielzellen zu durchqueren, überhaupt nicht eintreten. Die einzige Art und Weise, auf die diese polaren Arzneimittel in eine Zelle eintreten können, ist durch Aufnahme mittels des Prozesses der Endozytose, was diese abbauenden lysosomalen Enzymen in der Zelle aussetzt. Noch ein anderes Problem bei der therapeutischen Abgabe von Arzneimitteln oder bioaktiven Mitteln besteht in der Unfähigkeit, eine ausreichend hohe Konzentration des Arzneimittels oder bioaktiven Mittels, um therapeutisch zu sein, zu verabreichen, während Toxizitäten, die mit einigen Arzneimitteln oder bioaktiven Mitteln oftmals assoziiert sind, vermieden werden. Diesen Problemen hat man sich durch eine Anzahl unterschiedlicher Methoden angenommen. Wenn ein Arzneimittel oder bioaktives Mittel keine damit assoziierte Toxizität aufweist, kann es in ausreichend hohen Dosen verabreicht werden, um einen Abbau, Entfernung durch Nicht-Ziel-Organe und fehlendes zielgerichtetes Ansteuern des Orts, wo das therapeutische Arzneimittel oder bioaktive Mittel benötigt wird, zu berücksichtigen. Jedoch sind viele Arzneimittel oder bioaktive Mittel entweder zu teuer, um eine solche Verschwendung zu ermöglichen, oder weisen Toxizitäten auf, die eine Verabreichung von solchen hohen Dosierungen verhindern. Es sind zahlreiche Verfahren verwendet worden, um einige der Probleme, auf welche man beim Verabreichen von therapeutischen Mengen von Arzneimitteln oder bioaktiven Mitteln stößt, zu überwinden.
Ein solches Verfahren ist die Einkapselung von Arzneimitteln oder bioaktiven Mitteln in Liposomen. Obwohl einige Arzneimittel oder bioaktive Mittel in Liposomen in therapeutisch wirksamen Dosen durch passive Beladung oder durch Gradientenbeladung eingekapselt werden können, sind diese Verfahren entweder auf Arzneimittel oder bioaktive Mittel mit speziellen chemischen Eigenschaften oder auf Arzneimittel oder bioaktive Mittel, die in relativ niedrigen Konzentrationen verabreicht werden können, beschränkt. Einige bioaktive Verbindungen, wie schwache Basen oder schwache Säuren, können örtlich entfernt in vorab hergestellte Liposome geladen werden, um hochkonzentrierte Komplexe zu bilden. Diese Art der Beladung, welche als örtlich entfernte bzw. getrennte oder Gradienten-Beladung bezeichnet wird, erfordert, dass das Arzneimittel oder bioaktive Mittel zeitweilig in der Lage ist, durch die Lipiddoppelschicht des Liposoms hindurchzutreten. Dies ist jedoch nicht für alle bioaktiven Moleküle der Fall; viele von diesen können durch die liposomale Doppelschicht nicht hindurchtreten.
Ein Gebiet, in welchem Versuche, therapeutische Konzentrationen von Arzneimitteln oder bioaktiven Mitteln zu verabreichen, nur teilweise erfolgreich gewesen sind, ist das Gebiet der Gentherapie. Die Gentherapie umfasst das Einführen eines exogenen Gens in einen geeigneten Zelltyp, gefolgt von der Ermöglichung der Expression des Gens innerhalb der Zelle in therapeutisch relevanten Konzentrationen. Eine solche Therapie hat sich in einem relativ kurzen Zeitraum von Grundlagenforschung bis zu der Einführung von verschiedenen Genen, einschließlich jenen, die zur Behandlung von Krebserkrankungen nützlich sind (Duque et al., Histol. Histopathol., 13: 231–242 (1998); Runnebaum et al., Anticancer Res., 17: 2887–2890 (1997)), fortentwickelt. Obwohl nackte DNA in einigen Fällen in Zellen aufgenommen worden ist (Wolff et al., Science, 247: 1465–1468 (1990)), kann sie dies aufgrund ihrer großen Größe und des hohen Ausmaßes von negativer Ladung generell nicht; darüber hinaus kann nackte DNA nicht so gestaltet werden, dass sie zielgerichtet spezielle Zellen ansteuern wird. Dementsprechend beruht eine erfolgreiche Gentherapie im Allgemeinen auf der Verfügbarkeit von „Vektoren" zum Einführen von DNA und anderen Nukleinsäuren in Zellen.
Gegenwärtig gibt es zwei hauptsächliche Gruppen von DNA-Abgabesystemen, virale und nicht-virale. Virale Vektoren, einschließlich replikationsdefekten Viren, wie Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren, sind dementsprechend bei weitem die am umfangreichsten beschriebenen Genabgabevehikel gewesen (Robbins et al., Trends in Biotech., 16: 35–40 (1998)). Jedoch ist ihre Verwendung durch die Immunogenität von deren viralen Komponenten, das potentielle Risiko einer Rückmutation zu einem replikationsfähigen bzw. -kompetenten Stadium, die potentielle Einführung von tumorerzeugenden Mutationen, das Fehlen von Targeting-Mechanismen (Zielgerichtetheit verleihenden Mechanismen), Einschränkungen beim DNA-Aufnahmevermögen, Schwierigkeiten bei der Herstellung in großem Maßstab und andere Faktoren behindert worden (siehe z. B. Lee und Huang, J. Biol. Chem., 271: 8481–8487 (1996)).
Als Alternativen zu viralen Vektoren sind zwei hauptsächliche Arten von nicht-viralen Vehikeln entwickelt worden. Kationische Liposom-DNA-Komplexe (oder „Lipoplexe", Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987)), welche aus kationischen Lipiden und DNA bestehen, sind bislang die am umfangreichsten beschriebene Alternative zu viralen Vektoren für die Genabgabe gewesen. Jedoch leiden solche Lipoplexe unter mehreren bedeutenden Nachteilen, wenn sie in der Gentherapie verwendet werden, einschließlich geringer Stabilität, hoher Zytotoxizität, fehlender biologischer Abbaubarkeit, schlechter Kondensation und schlechtem Schutz von DNA, Serumempfindlichkeit, großer Größe und fehlender Gewebespezifität. Da die Lipoplexe darüber hinaus positiv geladen sind, zeigen sie im Allgemeinen eine nicht-spezifische Wechselwirkung mit den negativ geladenen Oberflächen der meisten Zellen; es ist dementsprechend im Allgemeinen nicht möglich, solche Lipoplexe in vivo mit Zielgerichtetheit gegenüber speziellen Stellen auszustatten.
Eine andere Variante von Lipoplexen und DNA umfasst mit Polylysin kondensierte DNA, welche an anionische Liposomen gebunden ist (Lee und Huang, J. Biol. Chem., 271: 8481–8487 (1996)). Diese benötigen bestimmte anionische Lipide, um die aktive Struktur zu bilden. Die gebildeten Lipoplexe kapseln entweder die DNA nicht vollständig ein oder müssen zwei oder mehrere Doppelschichten um die kondensierte DNA herum bilden. In dem letztgenannten Falle würde eine Abgabe an das Zytoplasma erfordern, dass die DNA zumindest drei Membranen durchquert. Es würde erwartet werden, dass dies die Transfektionseffizienz hemmt. in dem erstgenannten Falle könnte die Stabilität durch Exposition der DNA in physiologischen Salzlösungen beeinträchtigt werden.
Liposome sind eine zusätzliche Art einer nicht-viralen Vektor-Alternative und bieten im Vergleich zu den Lipoplexen mehrere Vorteile für eine solche Verwendung.
Beispielsweise bilden sich liposomale Doppelschichten um eingekapselte Nukleinsäuren herum, wodurch die Nukleinsäuren vor einem Abbau durch Nukleasen in der Umgebung geschützt werden; im Gegensatz dazu kapseln Lipoplexe Nukleinsäuren nicht ein und können diese folglich vor Nukleasen in der Umgebung nicht vollständig abkapseln. Darüber hinaus können Liposome in ihren wässrigen Kompartimenten zusätzlich zu Nukleinsäuren andere bioaktive Mittel einkapseln; im Gegensatz dazu können Lipoplexe dies nicht, da sie kein wässriges Volumen einkapseln. Darüber hinaus können Liposome so hergestellt werden, dass sie neutral geladen oder anionisch sind, im Gegensatz zu der beschränkten ionischen Natur der vorerwähnten Lipoplexe. Dementsprechend können Liposome so gestaltet werden, dass Zytotoxizitäten, die durch das Abgabevehikel selbst induziert werden, vermieden werden und ihre Anhäufung an speziellen Orten von Interesse verstärkt wird.
Obwohl das Konzept einer Einkapselung von bioaktiven Mitteln in Liposomen nicht neu ist, sind viele Mittel in Liposomen schwierig in einer jeglichen Konzentration einzukapseln gewesen und andere haben sich in Liposomen als schwierig in Konzentrationen, die therapeutisch wirksam wären, einzukapseln erwiesen. Viele kleine Moleküle können in Liposomen eingekapselt werden, lecken jedoch heraus. Es ist dementsprechend auch schwierig gewesen, einige bioaktive Mittel einzukapseln und dies derart, dass sie innerhalb des Liposoms in einer therapeutisch wirksamen Dosis für eine therapeutisch wirksame Zeit zurückgehalten werden. Es ist beispielsweise schwierig gewesen, besonders große Moleküle in einem Komplex innerhalb eines Liposoms einzukapseln. Es ist auch schwierig gewesen, viele wasserlösliche Moleküle als therapeutische Mittel zu verwenden, da sie nicht in der Lage sind, die Zellmembran zu durchdringen. Wenn sie stabil in Liposome, die mit Zellmembranen verschmelzen können, eingekapselt werden, ist es möglich, diese Arzneimittel in therapeutisch wirksamen Dosen in die Zielzellen abzugeben. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Bildung von Liposomen, die solche Arzneimittel oder bioaktive Mittel in einer therapeutisch nützlichen Form enthalten.
Es sind mehrere Versuche unternommen worden, um Nukleinsäuren in Liposomen einzukapseln, wobei diese die Verwendung der Umkehrphasen-Verdampfungs-(Fraley et al., J. Biol. Chem., 255: 10431–10435 (1980)), Dehydratisierung-Rehydratisierungs-(Alizo et al., J. Microencap., 7: 497–503 (1990)) und Einfrier-Auftau-Methoden (Monnard et al., Biochem. Biophys. Acta, 1329: 39–50 (1997)) zur Liposomenherstellung umfassen. Jedoch weist jedes von diesen Verfahren mehrere Einschränkungen auf, einschließlich Erfordernissen von niedrigen Ausgangskonzentrationen von Nukleinsäure, was zu signifikanten Prozentsätzen von leeren Vesikeln bei den hergestellten Liposomen, einer Unfähigkeit, reproduzierbar ausreichende Mengen von DNA in Liposomen, um an dem gewünschten Zielort therapeutisch wirksam zu sein, einzukapseln, und Schwierigkeiten bei der Optimierung der Vehikel für einen Schutz von den darin eingekapselten Nukleinsäuren vor einem Nuklease-vermittelten Abbau führt.
Es sind auch Versuche unternommen worden, DNA mit Komplexbildnern zu komplexieren und nachfolgend die komplexierte DNA in Liposomen einzukapseln. Komplexbildner sind Mittel, die mit anderen Molekülen reagieren, wobei sie die Präzipitation oder Kondensation der Moleküle bewirken. Komplexbildner, die bei der praktischen Ausführung der Erfindung nützlich sind, werden aus der Gruppe bestehend aus geladenen Molekülen, die eine entgegengesetzte Ladung zu der Ladung an dem bioaktiven Mittel haben, ausgewählt. Der Komplexbildner kann aus der Gruppe von geladenen Molekülen, bestehend aus Spermin, Spermidin, Hexamin-Cobalt, Calciumionen, Magnesiumionen, Polylysinen, Polyhistidinen, Protaminen, Polyanionen, wie Heparin und Dextransulfat, Citrationen oder Sulfationen, ausgewählt werden. Beispielsweise sind Polykationen mit der Ladung +3 oder höher, z. B. Polyamine, Polylysin und Hexamin-Cobalt(III), bekanntermaßen (siehe Chattoraj et al., J. Mol. Biol., 121: 327–337 (1978); Gosule LC und Schellman JA. Nature 259: 333–335 (1976); Vitello et al., Gene Therapy, 3: 396–404 (1996); Widom et al., J. Mol. Biol., 144: 431–453 (1980); Arscott et al., Biopolymers, 30: 619–630 (1990); Wilson et al., Biochem., 18: 2192–2196 (1979)) in der Lage, DNA-Moleküle durch Wechselwirkung mit einer Mehrzahl von negativen Ladungen an der DNA zu kondensieren. Es ist festgestellt worden, dass Polyamine, z. B. Spermidin (3+) und Spermin (4+), anders als andere Arten von Polykationen von Natur aus in allen lebenden Zellen vorkommen (siehe z. B. Ames und Dubin, J. Biol. Chem., 253: 769–775 (1960); Tabor und Tabor, Annu. Rev. Biochem., 53: 749–790 (1984)). Es ist bekannt, dass hohe Polyamin-Konzentrationen in aktiv proliferierenden Zellen vorkommen, und es wird angenommen, dass diese essentiell sind, um normales Zellwachstum aufrechtzuerhalten (Ames und Dubin, J. Biol. Chem., 253: 769–775 (1960); Tabor und Tabor, Annu. Rev. Biochem., 53: 749–790 (1984); Hafner et al., J. Biol. Chem., 254: 12419–12426 (1979); Pegg, Biochem. J., 234: 249–262 (1986)).
Die Liposom-Einkapselung von mit Spermin kondensierter linearer DNA in Liposome ist von Tikchonenko et al., Gene, 63: 321–330 (1988), versucht worden. Jedoch war dabei die DNA-Ausgangskonzentration niedrig mit der Folge, dass die resultierenden Liposome ebenfalls ein niedriges Verhältnis von eingekapselter DNA zu liposomalem Lipid (0,02–0,2 Mikrogramm DNA pro Mikromol Lipid) aufwiesen. Darüber hinaus erforderte eine solche Kondensation von linearen DNA-Molekülen in Abwesenheit einer intermolekularen DNA-Aggregation eine Steuerung der Spermin-Konzentrationen bis zu einem unpraktikablen Ausmaß an Genauigkeit. Zusätzlich berichten Baeza et al., Ori Life Evol Biosphere, 21: 225–252 (1992) und Ibanez et al., Biochem Cell Biol., 74: 633–643 (1996) beide über die Einkapselung von 1–4 Mikrogramm pro Mikromol von mit Spermin kondensierter SV40-Plasmid-DNA in Liposome. Jedoch wurde keine von deren Präparationen nach der Liposomen-Bildung gegen Puffer mit hoher Salzkonzentration dialysiert, so dass die berichteten Mengen von eingekapselter DNA tatsächlich einen signifikanten Prozentsatz von nicht eingekapselter DNA enthalten könnten. Da diese liposomalen Formulierungen keinem DNAase-Abbau ausgesetzt wurden, um den Prozentsatz von DNA, welcher tatsächlich in den Liposomen abgekapselt bzw. sequestriert vorliegt, zu bestimmen, spiegeln die hohen berichteten Mengen wahrscheinlich nicht tatsächlich eingekapselte DNA wieder.
Eine effiziente Herstellung und Verwendung von in Liposomen eingekapselten Nukleinsäuren erfordert die Verwendung von hochkonzentrierten Suspensionen von Nukleinsäuren, um den Prozentsatz von leeren Liposomen, die aus dem Verfahren resultieren, zu minimieren und um die DNA:liposomales Lipid-Verhältnisse zu maximieren. Jedoch führt die Kondensation von DNA in hohen Konzentrationen im Zuge von bekannten Verfahren zur Liposomenherstellung im Allgemeinen zu einer intermolekularen Aggregation, was zur Bildung von auf Nukleinsäure basierenden Strukturen, welche für eine Genabgabe ungeeignet sind, führt. Große Aggregate, die durch Kondensation von DNA direkt mit einem Komplexbildner gebildet werden, können nicht leicht in Liposomen eingekapselt werden und solche großen Aggregatstrukturen (in der Größenordnung von Zellen) können Materialien an Zielzellen nicht effizient abgeben. Wenn beispielsweise die Aggregate größer als 500 nm sind, werden sie nach intravenöser Verabreichung aus dem Blutkreislauf aufgrund ihrer Größe schnell entfernt. Andererseits können größere Aggregate an Zellen in vitro verabreicht werden. Jedoch sind manchmal die Aggregate zu groß, um durch Zellen aufgenommen zu werden.
Dementsprechend war es notwendig, um verschiedene Arzneimittel in therapeutisch wirksamen Mengen in Zielzellen abzugeben, ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die bioaktive Mittel, welche derart komplexiert sind, dass ihre Permeabilität durch die Lipid-Doppelschicht verringert wird, enthalten, bereitzustellen, während ein Verfahren bereitgestellt wird, das auch die Große des in dem Liposom einzukapselnden Komplexes begrenzt, so dass das resultierende therapeutische Produkt in einem therapeutischen Größenbereich liegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Einkapseln eines bioaktiven Komplexes in einem Liposom bereit, welches die Schritte umfasst:

(a) Lösen mindestens eines amphipathischen Lipids in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln;
(b) Vereinigen mindestens einer wässrigen Suspension, die eine Lösung umfasst, welche ein erstes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem bioaktiven Mittel und einem Komplexbildner, enthält, mit der Lipid-haltigen organischen Lösung von Schritt (a), um eine Emulsion in Form einer umgekehrten Mizelle, welche das erste Molekül und das Lipid umfasst, zu bilden;
(c) Zugabe einer zweiten wässrigen Suspension, die ein zweites Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem bioaktiven Mittel und einem Komplexbildner, wobei, wenn das erste Molekül ein bioaktives Mittel ist, das zweite Molekül ein Komplexbildner ist und umgekehrt, umfasst, zu der Emulsion von Schritt (b);
(d) Inkubieren der Emulsion von Schritt (c), um zu ermöglichen, dass der Komplexbildner mit dem bioaktiven Mittel in Kontakt tritt, wodurch ein Komplex des bioaktiven Mittels mit dem Komplexbildner innerhalb der Lipid-stabilisierten Wassertröpfchen gebildet wird; wobei der Durchmesser des Komplexes nicht größer ist als der Durchmesser des Tröpfchens; und
(e) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Suspension von Schritt (d), um Liposomen zu bilden, welche das komplexierte bioaktive Mittel und das Lipid umfassen.

Das Verfahren der Erfindung ist nützlich für die Herstellung von therapeutisch nützlichen Liposomen, welche ein breites Spektrum von bioaktiven Molekülen, welche innerhalb des Liposoms mit einem Komplexbildner komplexiert sind, umfassen. Die Liposomen sind vorzugsweise fusogene Liposome, die durch das Verfahren der Erfindung verschiedene Moleküle einkapseln können. Diese fusogenen Liposome sind in der Lage, mit Zellmembranen zu verschmelzen und die Abgabe von bioaktiven Mitteln in therapeutisch wirksamen Mengen an Zellen und Organe zu ermöglichen. Zusätzlich ermöglicht das Verfahren der Erfindung auch, dass mehr als ein bioaktives Mittel in einem Liposom eingekapselt wird. Ein oder mehrere bioaktive Mittel können durch das Verfahren der Erfindung in denselben Liposomen zum gleichen Zeitpunkt eingekapselt werden. Wenn mehr als ein bioaktives Mittel durch das Verfahren der Erfindung in einem Liposom eingekapselt wird, ist es nicht notwendig, dass jedes der bioaktiven Mittel in Form von Komplexen vorliegt.
Einige bioaktive Mittel treten leicht durch die Lipid-Doppelschicht hindurch und liegen dementsprechend nicht stabil in Liposomen abgekapselt bzw. sequestriert vor. Durch Bildung von Komplexen der bioaktiven Mittel mit einem Komplexbildner bleibt das bioaktive Mittel in den Liposomen. Eine hauptsächliche Hürde war das Problem einer Einkapselung von komplexierten bioaktiven Mitteln in Liposome gewesen. Wenn das bioaktive Mittel und der Komplexbildner vor der Einkapselung in Liposome in Lösung gemischt werden, werden bei den Konzentrationen, welche für eine effiziente Beladung von Liposomen erforderlich sind, viele Komplexe, die unkontrollierbar groß sind, gebildet. Der Begriff bioaktiver Komplex ist ein jegliches bioaktives Mittel, welches an einen Komplexbildner gebunden ist, so dass der so gebildete Komplex zu einer Veränderung der physikalischen Eigenschaften führt, wie eine Verringerung der Größe des bioaktiven Moleküls, eine Verringerung der Löslichkeit des bioaktiven Mittels, eine Ausfällung der bioaktiven Mittel, ein Kondensieren des bioaktiven Mittels oder eine Erhöhung der Größe des Komplexes. Liposome, die mit Zellmembranen verschmelzen, sind in der Lage, ein riesiges Spektrum von Molekülen in das Innere von Zellen abzugeben. Ein Vorteil der Erfindung ist, dass durch Bilden des Komplexes des bioaktiven Mittels in den umgekehrten Mizellen die Bildung von ungeeignet großen Komplexen, welche nicht in der Lage sind, in therapeutisch nützlichen Liposomen eingekapselt zu werden, verhindert wird.
Die Bildung von Komplexen, welche eine bioaktive Verbindung innerhalb von Liposomen umfassen, hat den Vorteil, dass solche Komplexe vor der Abgabe an die gewünschte Zielzelle weniger wahrscheinlich aus dem Liposom heraus lecken. Darüber hinaus kann die Bildung eines Komplexes eine große Menge des bioaktiven Mittels innerhalb des Liposoms derart konzentrieren, dass das Verhältnis von bioaktivem Mittel zu Lipid hoch ist und die Abgabe effizient ist. Das offenbarte Verfahren ermöglicht die Komplexierung von bioaktiven Materialien mit Komplexbildnern innerhalb einer Emulsion, gefolgt von einer Einkapselung innerhalb eines Liposoms in einer Weise, die die Bildung von extrem großen, nachteiligen Aggregaten, die größer als einige Mikrometer sind, des bioaktiven Mittels und des Komplexbildners verhindert.
In einer Ausführungsform hat das Verfahren der Erfindung ein Verfahren, um Nukleinsäure-Komplexe einzukapseln, bereitgestellt. Beispielsweise werden Nukleinsäuren, wie DNA, mit einem Kondensationsmittel innerhalb von umgekehrten (invertierten) Mizellen komplexiert, gefolgt von einer Bildung von Liposomen aus den Mizellen. Während, wie oben beschrieben, frühere Versuche unternommen worden sind, DNA in Liposomen einzukapseln, war keines der Verfahren erfolgreich, effizient therapeutisch nützliche liposomale DNA herzustellen.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Liposoms, welches eine kondensierte Nukleinsäure in Mengen von mindestens etwa 0,5 Mikrogramm Nukleinsäure pro Mikromol liposomales Lipid umfasst, bereit.
Die Lipid-Komponente der Liposome umfasst vorzugsweise ein derivatisiertes Phospholipid und ein zusätzliches Lipid, im Allgemeinen in Verhältnissen von etwa 20–80 mol-% derivatisiertes Phospholipid zu etwa 80–20 mol-% zusätzlichem Lipid. Bevorzugte derivatisierte Phospholipide umfassen: Phosphatidylethanolamin (PE)-Biotin-Konjugate; N-acylierte Phosphatidylethanolamine (NAPEs), wie N-C12-DOPE; und Peptid-Phosphatidylethanolamin-Konjugate, wie Ala-Ala-Pro-Val-DOPE. Das zusätzliche Lipid kann ein jegliches von verschiedenen Lipiden, die üblicherweise in Liposome eingebaut werden, sein; wenn jedoch das derivatisierte Phospholipid ein NAPF ist, ist das zusätzliche Lipid vorzugsweise ein Phosphatidylcholin (z. B. DOPC). Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA.
Auch bereitgestellt wird hier ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche das Liposom und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst; die Zusammensetzung kann verwendet werden, um die Nukleinsäure an die Zellen eines Tieres abzugeben.
Andere und weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile werden ersichtlich werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zum Zwecke der Offenbarung angegeben werden, wenn sie in Verbindung mit den folgenden Zeichnungen herangezogen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Mikrophotographien einer Spermin-vermittelten Plasmid-DNA-Aggregation (200 Mikrogramm Plasmid-DNA in 125 Mikrolitern LSB wurden sanft mit 7 mM Spermin in 125 Mikrolitern LSB gemischt). (A) Lichtmikroskop-Beobachtung nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur (Balken repräsentiert 10 Mikrometer). (B) Kryo-TEM-Beobachtung (Balken repräsentiert 100 nm).
2. Schematische Darstellung des Verfahrens zur DNA-Einkapselung. Eine Kondensation von DNA tritt auf (I) innerhalb von Phospholipid-stabilisierten Wassertröpfchen, die sich um die DNA herum in einem in großer Menge vorliegenden organischen Lösungsmittel gebildet haben. Getrennte Spermin enthaltende Tröpfchen transferieren (II) Spermin in die DNA enthaltenden Tröpfchen durch vorübergehenden (III) Kontakt und Austausch. Nach Kondensation innerhalb der Emulsion (IV) werden durch Lösungsmittelverdampfung Vesikel gebildet und weiter zu kleineren Größen extrudiert (V).
3. Wirkung von liposomalem N-C12-DOPE auf die Spermin-vermittelte Aggregation von Plasmid-DNA. In einer Drei-Kammer-Dialysevorrichtung wurde eine Gleichgewichtsdialyse ausgeführt (siehe Beispiel 4). Die Kurve links stammt von Dialysen ohne Liposome, während die nach rechts verschobene Kurve von Dialysen stammt, die eine Kammer mit Liposomen umfasste. X-Achse: Spermin-Konzentration (mM); y-Achse: Trübung (O.D. 400 nm).
4. Agarose-Gelanalyse eines Plasmid-DNA-Schutzes in N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Formulierungen – ein Aliquot von jedem Präparat nach Extrusion und Dialyse wurde aufgeteilt und ein Teil mit DNase I verdaut (siehe Beispiel 9). Bahn 1. Präparat ohne Spermin. Bahn 2. Identisch mit Bahn 1, aber mit DNase I verdaut. Bahn 3. Präparat mit Spermin. Bahn 4. Identisch mit Bahn 3, aber mit DNase I verdaut.
5. Lichtmikrophotographien der Partikel in einer N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Probe, die wie in Beispiel 3 beschrieben mit pZeoLacZ-Plasmid und Spermin (A) hergestellt worden ist, gegenüber Polystyrolkügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 269 ± 7 nm (B) (Balken repräsentieren 10 nm).
6. Gefrierbruch-TEM-Mikrophotographien (siehe Beispiel 7) von N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Proben, die mit Plasmid und Spermin hergestellt worden sind, wie in Beispiel 3 beschrieben. Der Pfeil deutet auf das Partikel mit offensichtlich eingekapseltem Material (Balken repräsentiert 400 nm).
7. Kryo-TEM-Mikrophotographien (siehe Beispiel 7) von Liposomen mit N-C12-DOPE/DOPC und dem pZeoLacZ-Plasmid ohne Spermin (a) oder mit Spermin (b), wobei die Liposome hergestellt worden sind, wie in Beispiel 3 beschrieben. In (a) werden faserartige Strukturen außerhalb (Stern) und offensichtlich innerhalb (Pfeil) von Liposomen festgestellt. In (b) deutet ein Pfeil auf ein Toroid, das mit Polykation kondensierter Plasmid-DNA ähnelt (Balken in (a) und (b) repräsentieren 100 nm). Die Mikrophotographie (c) repräsentiert eine mit Spermin hergestellte EPC-Probe. Toroid(Pfeil) und gebogener Stab-(Stern)-Strukturen werden mit multilamellaren Liposomen (Pfund-Zeichen) verglichen [Balken repräsentiert 50 nm].
8. Fluoreszenz-Mikrophotographien von konfluenten OVCAR3-Zellen nach Transfektion (siehe Beispiel 11) mit den N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Präparaten. Liposomale Proben wurden hergestellt (siehe Beispiel 3) mit pEGFP-C1-Plasmid-DNA (a) mit Spermin oder (b) ohne Spermin; eine Probe (c) von leeren N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen ohne Spermin plus freie pEGFP-C1-Plasmid-DNA, die außen zu den vorab hergestellten Liposomen zugesetzt worden war, wurde auch getestet. Die Menge von Plasmid-DNA, die zu den leeren Liposomen in Probe c hinzugesetzt worden war, war gleich der Gesamtmenge in jedem der anderen Präparate. In den Experimenten wurden gleiche Liposomenkonzentrationen verwendet.
9. Quantifizierung der EGFP-Expression in mit pEGFP-C1 transfizierten OVCAR 3-Zellen, wie anhand des EGFP-Fluoreszenzniveaus gemessen. Die Transfektionsexperimente (a, b und c, siehe Beispiel 11) waren die gleichen wie in der Legende der vorherigen Figur. Zusätzlich waren getestete Formulierungen: d) Ei-PC-Liposome, die mit Spermin und p-EGFP-C1-Plasmid hergestellt worden sind (siehe Beispiel 3); und e) keine Zugaben. Die Zellen wurden gewaschen und mit CBAM markiert und dann in Detergens gelöst, um die Fluoreszenz von EGFP und Calceinblau zu messen (siehe Beispiel 10; Fehlerbalken sind ± Standardabweichung).
10. Assoziation der Transfektionseffizienz mit dem Lipidpellet von N-C12-DOPE/DOPC (70:30), hergestellt mit Spermin und pEGFP-C1-Plasmid-DNA (siehe Beispiel 3); die anfängliche Plasmid-DNA- und Spermin-Lösungen enthielten 200 mM Sucrose. Nach Extrusion und Dialyse wurde die Hälfte der Probe für eine Transfektion ohne weitere Handhabung verwendet (a) und die Lipidpartikel aus dem Rest der Probe wurden durch Zentrifugation pelletiert und einmal mit HBSS gewaschen, bevor sie für eine Transfektion verwendet wurden (b). Es wurde auch eine N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Probe mit nur den 200 mM Sucrose hergestellt und sowohl Plasmid-DNA als auch Spermin wurden beide von Außen unmittelbar vor der Dialyse in einer Menge gleich jener, die in den anderen Proben verwendet worden ist, zugesetzt. Das Pellet von dieser leeren Probe (c) wurde auf die gleiche Weise hergestellt, dann wurde eine gleiche Lipidmenge von jeder der Proben für eine Transfektion unter den in den vorherigen Figurenlegenden beschriebenen Bedingungen verwendet. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit CBAM markiert und die Fluoreszenz von EGFP und Calceinblau wurde gemessen (Fehlerbalken sind ± Standardabweichung).
11. Transfektion über N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposome in Maus-Ascites-Flüssigkeit verglichen mit Puffer. Ascites wurde aus der Spülung einer einen Tumor tragenden SCID-Maus erhalten, wie in Beispiel 13 beschrieben. Zellen wurden mit Plasmid-DNA enthaltenden Liposomen (kein Pellet) in einer Endkonzentration von 10 mM Gesamtlipid in HBSS oder HBSS mit Ascites-Flüssigkeit in einer Protein-Endkonzentration von etwa 3,5 mg/ml inkubiert (siehe Beispiel 11). Nach 3 h Inkubation wurde die Transfektionslösung durch Serum und Butyrat enthaltendes Medium für etwa 20 h ersetzt. Die Expression von EGFP wurde über seine Fluoreszenz gemessen (Fehlerbalken sind ± Standardabweichung).
12. Fluoreszenz-Mikrophotographien von OVCAR-3-Zellen, die (siehe Beispiel 11) mit N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen in Puffer oder Maus-Ascites-Flüssigkeit transfiziert worden sind. Es wurden wie in der Legende zu 12 beschrieben behandelte Zellen photographiert. Photographie A repräsentiert eine Transfektion ohne peritoneale Ascites-Flüssigkeit und Photographie B mit peritonealer Ascites-Flüssigkeit; in diesen Ansichten sind die Zellen konfluent.
13. Bestimmung der Liposomen-Lamellarität mittels fluoreszierender Sonden.
14. Fluoreszenz-Mikrophotographien eines OVCAR-3-Tumors, der in vivo mit N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen, welche pEGFP-C1 enthalten, transfiziert worden sind. Feld A zeigt die Expression von EGFP. Feld B zeigt die rote Fluoreszenz von Rhodamin-markierten Liposomen.
15. Fluoreszenz-Mikrophotographien eines OVCAR-3-Tumors, welcher aus einer unterschiedlichen Stelle als 14 entnommen worden sind, der in vivo mit N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen, welche pEGFP-C1 enthalten, transfiziert worden ist. Feld A zeigt die Expression von EGFP. Feld B zeigt die rote Fluoreszenz von Rhodamin-markierten Liposomen.
16. Fluoreszenz-Mikrophotographien von Kontroll-Tumorgewebe. Feld A zeigt diffuse grüne Fluoreszenz. Feld B zeigt das Fehlen von roter Fluoreszenz von Rhodaminmarkierten Liposomen.
17. Graph, welcher die Expression von β-Galactosidase-Aktivität in Muskelgewebe nach einer Transfektion in vivo zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es folgen Abkürzungen und die entsprechenden Begriffe, die quer durch diese Anmeldung hindurch verwendet werden: PE, Phosphatidylethanolamin; PC, Phosphatidylcholin; EPC, Ei-Phosphatidylcholin; DO-, Dioleoyl-; DOPC, Dioleoylphosphatidylcholin; DOPE, Dioleoylphosphatidylethanolamin; NAPF, N-acyliertes Phosphatidylethanolamin; N-C12-DOPE, N-Dodecanoyldioleoylphosphatidylethanolamin; AAPV-DOPE, Ala-Ala-Pro-Val-Dioleoylphosphatidylethanolamin; CBAM, Calceinblauacetoxymethylester; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; LSB, Puffer mit geringer Salzkonzentration („low salt buffer"); HBSS, Hanks balancierte Salzlösung („Hank's balanced salt solution"); EGFP, „enhanced green fluorescence Protein"; SPLV, stabile plurilamellare Liposome; MLVs, multilamellare Liposome; ULVs, unilamellare Liposome; LUVs, große unilamellare Liposome; SUVs, kleine unilamellare Liposome; ds DNA, doppelsträngige DNA; TEM, Transmissionselektronenmikroskopie.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Einkapseln eines bioaktiven Komplexes in einem Liposom bereit, welches die Schritte umfasst:

(a) Lösen mindestens eines amphipathischen Lipids in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln;
(b) Vereinigen mindestens einer wässrigen Suspension, die eine Lösung umfasst, welche ein erstes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem bioaktiven Mittel und einem Komplexbildner, enthält, mit der Lipid-haltigen organischen Lösung von Schritt (a), um eine Emulsion in Form einer umgekehrten Mizelle, welche das erste Molekül und das Lipid umfasst, zu bilden;
(c) Zugabe einer zweiten wässrigen Suspension, die ein zweites Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem bioaktiven Mittel und einem Komplexbildner, wobei, wenn das erste Molekül ein bioaktives Mittel ist, das zweite Molekül ein Komplexbildner ist oder umgekehrt, umfasst, zu der Emulsion von Schritt (b);
(d) Inkubieren der Emulsion von Schritt (c), um zu ermöglichen, dass der Komplexbildner mit dem bioaktiven Mittel in Kontakt tritt, wodurch ein Komplex des bioaktiven Mittels mit dem Komplexbildner innerhalb der Lipid-stabilisierten Wassertröpfchen gebildet wird; wobei der Durchmesser des Komplexes nicht größer ist als der Durchmesser des Tröpfchens; und
(e) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Suspension von Schritt (d), um Liposomen zu bilden, welche das komplexierte bioaktive Mittel und das Lipid umfassen.

Das Verfahren der Erfindung ist nützlich für die Herstellung von therapeutisch nützlichen Liposomen, welche ein breites Spektrum von bioaktiven Molekülen, welche innerhalb des Liposoms mit einem Komplexbildner komplexiert sind, umfassen. Die Liposomen sind vorzugsweise fusogene Liposome, die durch das Verfahren der Erfindung verschiedene Moleküle einkapseln können. Diese fusogenen Liposome sind in der Lage, mit Zellmembranen zu verschmelzen und die Abgabe von bioaktiven Mitteln in therapeutisch wirksamen Mengen an Zellen und Organe zu ermöglichen. Zusätzlich ermöglicht das Verfahren der Erfindung auch, dass mehr als ein bioaktives Mittel in einem Liposom eingekapselt wird. Ein oder mehrere bioaktive Mittel können durch das Verfahren der Erfindung in denselben Liposomen zum gleichen Zeitpunkt eingekapselt werden. Wenn mehr als ein bioaktives Mittel durch das Verfahren der Erfindung in einem Liposom eingekapselt wird, ist es nicht notwendig, dass jedes der bioaktiven Mittel in Form von Komplexen vorliegt.
Der Begriff „bioaktive Mittel" bezeichnet eine jegliche Verbindung oder Stoffzusammensetzung, die an Tiere, vorzugsweise Menschen, zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verabreicht werden kann. Das Verfahren der Erfindung ist nützlich zum Einkapseln von bioaktiven Mitteln, einschließlich, aber nicht beschränkt auf wasserlösliche, Membranen nicht durchdringende Mittel, wie Nukleinsäuren, Nukleotid- oder Nukleosid-Analoga, wie Cytosin-β-D-arabinofuranosid-5'-triphosphat (araCTP), Proteine, wie Cytochrom c, polare Antikrebsmittel, wie Cisplatin, N-Phosphonoacetyl-L-asparaginsäure oder 5-Fluororotsäure, polare oder geladene Derivate von Antikrebsmitteln, polare Peptide, Histondeacetylase-Inhibitoren, wie Butyrat, etc. Bioaktive Mittel umfassen auch Mittel, die aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, antiviralen Mitteln, wie Acyclovir, Zidovudin und den Interferonen; antibakteriellen Mitteln, wie Aminoglycoside, Cephalosporine und Tetracycline; antifungalen Mitteln, wie Polyen-Antibiotika, Imidazole und Triazole; antimetabolischen Mitteln, wie Folsäure und Purin- und Pyrimidinanaloga; antineoplastischen Mitteln, wie die Anthracyclin-Antibiotika und Pflanzenalkaloide; Kohlenhydraten, z. B. Zuckern und Stärken; Aminosäuren; Peptiden; Proteinen, wie Zellrezeptorproteine, Immunglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glycoproteine; Farbstoffen; radioaktiven Markierungen, wie Radioisotope und mittels Radioisotopen markierte Verbindungen; strahlenundurchlässigen Verbindungen; fluoreszierenden Verbindungen; pupillenerweiternden Mitteln; bronchienerweiternden Mitteln; Lokalanästhetika und dergleichen ausgewählt werden, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff bioaktiver Komplex ist ein jegliches bioaktives Mittel, das an einen Komplexbildner derart gebunden ist, dass der daraus gebildete Komplex zu einer Veränderung der physikalischen Eigenschaften, wie einer Verringerung der Größe des bioaktiven Moleküls, einer Verringerung der Löslichkeit des bioaktiven Mittels, einer Ausfällung der bioaktiven Mittel, einer Kondensation des bioaktiven Mittels oder einer Erhöhung der Größe des Komplexes, führt.
Wasser-in-Öl-Emulsionen, welche umgekehrte Mizellen enthalten, sind zuvor verwendet worden, um Enzymkinetiken zu untersuchen (z. B. Bru et al., Biochem. J., 310: 721–739 (1995)) und um Liposomen zu bilden (z. B. Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978); Gruner et al., Biochem., 24: 2833–2842 (1984)), aber über die Verwendung von solchen Emulsionen, um die Komplexierung von zwei Verbindungen zu dem Zweck, Liposome zu beladen, zu modulieren, ist zuvor nicht berichtet worden.
Emulsionen können durch verschiedene Methodiken, die ohne weiteres innerhalb der Möglichkeiten von gewöhnlichen Fachleuten auf diesem Gebiet liegen, gebildet werden. Beschallung, Vortexen, mechanisches Rühren, statisches Mischen, Homogenisierung, Einspritzen, Mikrofluidisierung, Kolloidmühlen, Druckemulgatoren und/oder Kady-Mühlen können verwendet werden, um Emulsionen verschiedener Arten herzustellen, was verschiedene Reihenfolgen der Zugabe von Materialien mit einschließt. Die Emulsionen der Erfindung werden in zwei Schritten gebildet, so dass wenigstens eine Komponente, das bioaktive Mittel oder der Komplexbildner, vorab vor der Zugabe der wässrigen Dispersion des anderen Mittels innerhalb der Wassertröpfchen der Lipidstabilisierten Emulsion abgekapselt bzw. sequestriert wird.
Nach Entfernung von Lösungsmittel aus der Lipid-stabilisierten Emulsion werden „Liposome" gebildet. Lösungsmittel kann durch eine beliebige Anzahl von Methoden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Rotationsverdampfen und Durchströmenlassen von Stickstoff, entfernt werden.
„Liposomen" sind sich selbst zusammenlagernde Strukturen, welche eine oder mehrere Lipid-Doppelschichten umfassen, von denen jede zwei Einzelschichten, welche entgegengesetzt orientierte amphipathische Lipidmoleküle enthält, umfasst. Amphipathische Lipide umfassen eine polare (hydrophile) Kopfgruppen-Region, die kovalent mit einer oder zwei nicht-polaren (hydrophoben) Acylketten verknüpft ist. Energetisch ungünstige Kontakte zwischen den hydrophoben Acylketten und dem umgebenden wässrigen Medium induzieren, dass die amphipathischen Lipidmoleküle sich derart anordnen, dass ihre polaren Kopfgruppen in Richtung der Oberfläche der Doppelschicht orientiert sind, während die Acylketten sich in Richtung des Inneren der Doppelschicht reorientieren. So wird eine energetisch stabile Struktur gebildet, in welcher die Acylketten vor dem Inkontaktkommen mit der wässrigen Umgebung effektiv abgeschirmt sind.
Liposome (siehe z. B. Cullis et al., Biochim. Biophys. Acta, 559: 399–420 (1987); New, 1995) können eine einzelne Lipiddoppelschicht (unilamellare Liposome, „ULVs") oder eine Mehrzahl von Lipiddoppelschichten (multilamellare Liposome, „MLVs" oder SPLVs") aufweisen. Jede Doppelschicht umgibt oder kapselt ein wässriges Kompartiment ein. Angesichts dieser Einkapselung von wässrigem Volumen innerhalb einer schützenden Barriere von Lipidmolekülen sind Liposomen in der Lage, eingekapselte Moleküle, z. B. Nukleinsäuren, von den abbauenden Wirkungen von Faktoren, z. B. Nukleaseenzymen, die in der äußeren Umgebung vorhanden sind, abzukapseln. Ein solcher Schutz von eingekapseltem Inhalt wird in dem Falle von Nukleinsäuremolekülen beispielsweise gezeigt durch die Art von Agarose-Gelelektrophorese, die in Beispiel 9 erläutert wird, deren Ergebnisse in 4 aufgeführt sind.
Liposomen können verschiedene Größen aufweisen, z. B. einen durchschnittlichen Durchmesser von lediglich 25 nm oder bis zu 10.000 nm oder mehr. Die Größe wird durch verschiedene Faktoren, z. B. die Lipidzusammensetzung und das Herstellungsverfahren, beeinflusst, welche zu bestimmen und zu berücksichtigen ohne weiteres im Vermögen von gewöhnlichen Fachleuten auf dem Gebiet liegt, und wird durch verschiedene Techniken bestimmt, wie quasi-elastische Lichtstreuung, die ebenfalls innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute liegt.
Verschiedene Methodiken, die ebenfalls ohne Weiteres im Vermögen von gewöhnlichen Fachleuten auf diesem Gebiet liegen, wie Beschallung, Homogenisierung, Anwendung der French-Press und Mahlen, können verwendet werden, um ausgehend von größeren Liposomen Liposome einer geringeren Größe herzustellen. Es kann eine Extrusion (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,008,050 ) verwendet werden, um die Größe von Liposomen zu verringern, d. h. um Liposome mit einer vorher festgelegten mittleren Größe herzustellen, indem die Liposome unter Druck durch Filterporen einer definierten, ausgewählten Größe gepresst werden. Tangentialflussfiltration ( WO 89/008846 ) kann auch verwendet werden, um die Größe von Liposomen gleichmäßig zu machen, d. h. um eine Population von Liposomen mit weniger Größenheterogenität und einer homogeneren definierten Größenverteilung herzustellen. Der Inhalt von diesen Dokumenten wird in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen.
Liposome dieser Erfindung können unilamellar oder oligolamellar sein und können eine Größe haben, welche gleich jener von Liposomen ist, die durch ein jegliches der Verfahren, die vorstehend aufgeführt worden sind, hergestellt worden sind. Jedoch sind in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Liposome unilamellare Liposome mit einem Größen-Zahlenmittel von etwa 50–300 nm.
Liposome werden gebildet aus verschiedenen Lipiden, sowohl amphipathischen als auch nicht-amphipathischen, die ausgehend von verschiedenen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, erhalten werden. Geeignete liposomale Lipide umfassen, ohne Einschränkung, Phospholipide, wie Phosphatidylcholine („PCs"), Phosphatidylethanolamine („PEs"), Phosphatidylserine („PSs"), Phosphatidylglycerole („PGs"), Phosphatidylinositole („Pls") und Phosphatidsäuren („PAs"). Solche Phospholipide weisen im Allgemeinen zwei Acylketten auf, wobei diese entweder beide ungesättigt sind oder eine gesättigt und eine ungesättigt ist; diese Ketten umfassen, ohne Einschränkung: Myristat-, Palmitat-, Stearat-, Oleat-, Linoleat-, Linolenat-, Arachidat-, Arachidonat-, Behenat- und Lignocerat-Ketten.
Phospholipide können auch durch die Anheftung einer geeigneten reaktiven Gruppe daran derivatisiert werden. Eine solche Gruppe ist im Allgemeinen eine Aminogruppe und daher sind derivatisierte Phospholipide typischerweise Phosphatidylethanolamine. Die verschiedenen Gruppierungen, die für eine Anheftung an PEs geeignet sind, umfassen, ohne Einschränkung: Acylketten ( WO 98/16199 ), die für das Verstärken der Verschmelzbarkeit von Liposomen mit biologischen Membranen nützlich sind; Peptide ( WO 98/16240 ), die für das Destabilisieren von Liposomen in der Nähe von Zielzellen nützlich sind; Biotin- und Maleimido-Gruppierungen ( U.S.-Patente Nr. 5,059,421 bzw. 5,399,331 ), die für das Anheften von Zielgerichtetheit vermittelnden Molekülen („Targeting-Molekülen"), wie Antikörpern, an Liposome nützlich sind; und verschiedene Moleküle, wie Ganglioside, Polyalkylether, Polyethylenglycole und organische Dicarbonsäuren (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,013,556 , 4,920,016 und 4,837,028 ). Der Inhalt der oben erwähnten Dokumente wird in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen.
Dementsprechend umfassen in den am meisten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung die Liposome, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt worden sind, ein derivatisiertes Phospholipid, das so adaptiert ist, dass die Abgabe von deren Inhalt verstärkt wird. Die Liposome können auch ebenso zusätzliche Lipide umfassen, dies ist aber nicht unbedingt erforderlich, wobei diese zusätzlichen Lipide in die Liposome aus verschiedenen Gründen, die gewöhnlichen Fachleuten auf dem Gebiet der Liposomenforschung ersichtlich sind, inkorporiert werden. Solche Gründen umfassen, ohne Einschränkung, das Stabilisieren oder Ausstatten der Liposome mit Zielgerichtetheit („Targeting") wie auch eine weitere Veränderung des pharmakokinetischen Verhaltens der Liposome. Geeignete zusätzliche Lipide umfassen jegliche von jenen Lipiden, die üblicherweise als geeignet für ein Einbringen in Liposome anerkannt sind, einschließlich, ohne Einschränkung, Phospholipiden, Glycolipiden und Sterolen.
Vorzugsweise weisen die Liposome dieser Erfindung eine Lipidkomponente, die ein derivatisiertes Phospholipid und ein zusätzliches Lipid umfasst, auf. Das derivatisierte Phospholipid hat die Formel:
worin: Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, einer Maleimid-Gruppierung, einer als R³ bezeichneten Gruppe und einer Gruppe mit der Formel X-Y; X ein Linker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und der Gruppe R⁴, ist; und Y ein durch ein Enzym abspaltbares Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die das Substrat einer durch Zellen sekretierten Peptidase ist, ist. Jedes von R¹, R², R³ und R⁴ ist eine Gruppe mit der Formel -OC(O)(CH₂)_n1(CH=CH)_n2(CH₂)_n3(CH=CH)_n4(CH₂)_n5(CH=CH)_n6(CH₂)_n7(CH=CH)_n8(CH₂)_n9-CH₃, worin: n1 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist; n3 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 19 ist; n5 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist; n7 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 13 ist; n9 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; und jedes von n2, n4, n6 und n8 Null oder 1 ist. Jedes von n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 und n9 ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden.
Für R¹ und R² ist die Summe von n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 unabhängig eine ganze Zahl von 12 bis 22, wohingegen für R³ und R⁴ die Summe von n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 22 ist. Das derivatisierte Phospholipid umfasst vorzugsweise etwa 20 bis 80 Molprozent des liposomalen Lipids.
Wenn R³ -C(O)(CH₂)_n1(CH=CH)_n2(CH₂)_n3(CH=CH)_n4(CH₂)_n5(CH=CH)_n6(OH₂)_n7(CH=CH)_n8(CH₂)_n9-CH₃, ist, ist das derivatisierte Phospholipid ein N-acyliertes Phosphatidylethanolamin („NAPE", siehe WO 98/16199 ). Vorzugsweise ist R³ dann – OC(O)(CH₂)_n1CH₃, mehr bevorzugt -OC(O)(CH₂)₁₀CH₃.
Das derivatisierte Phospholipid ist vorzugsweise ein N-acyliertes PE. Solche NAPEs sind nützlich bei der Herstellung von fusogenen Liposomen und sind bevorzugt, um Liposome, welche die Arzneimittel- oder bioaktives Mittel-Komplexe der Erfindung umfassen, herzustellen.
Eine NAPE-induzierte Doppelschicht-Destabilisierung induziert, dass die Doppelschichten mit biologischen Membranen in der Nähe verschmelzen, und verstärkt folglich die Fusogenität der Doppelschichten (Shangguan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1368: 171–183 (1998)). Eine verstärkte Fusogenität kann wiederum verwendet werden, um eingekapselte bioaktive Mittel, wie Nukleinsäuren und andere Mittel, die die Zellmembran nicht durchqueren können, an Zellen abzugeben, indem die Zellen mit den Liposomen zusammengegeben werden unter Bedingungen, z. B. dem Vorhandensein von geeigneten Konzentrationen, wie Ca²⁺ und Mg² ⁺. Ein Liposom-Zell-Kontakt führt zu einer örtlichen Freisetzung der in den Liposomen eingekapselten bioaktiven Mittel an die Zellen und/oder direkt in das Zytoplasma der Zellen als Ergebnis einer Fusion oder Verschmelzung zwischen Liposom und Zellmembranen. Eine solche Abgabe erfolgt entweder in vivo oder in vitro.
Wenn R³ die Acylkette oder das Peptid ist und folglich wenn das derivatisierte Phospholipid ein NAPE oder Peptid-Lipid-Konjugat ist, ist wenigstens eines von R¹ und R² vorzugsweise eine ungesättigte Acylkette, d. h wenigstens eines von n2, n4, n6 und n8 darin ist gleich 1. Ungesättigte Acylketten umfassen, ohne Einschränkung, Palmitoleat-, Oleat-, Linoleat-, Linolenat- und Arachidonat-Ketten. Die ungesättigte Acylkette ist vorzugsweise eine Oleatkette („OC(O)(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃"). Mehr bevorzugt sind sowohl R¹ als auch R² Oleatketten, d. h. das derivatisierte Phospholipid ist dann:
wobei Z R³ oder X-Y ist. Am meisten bevorzugt ist das derivatisierte Phospholipid dann:
d. h. „N-C12-DOPE".
Wenn das derivatisierte Phospholipid N-C12-DOPE ist, umfasst das liposomale Lipid vorzugsweise auch ein Phosphatidylcholin, vorzugsweise ein PC mit wenigstens einer ungesättigten Acylkette und am meisten bevorzugt Dioleoylphosphatidylcholin. Das liposomale Lipid umfasst vorzugsweise etwa 70 mol-% N-C12-DOPE und etwa 30 mol-% DOPC (d. h. ist eine „70:30-Formulierung von N-C12-DOPE und DOPC, wobei die liposomalen Lipidkonzentrationen hier durch das Verhältnis angegeben werden und wobei solche Verhältnisse eine Angabe der relativen Prozentsätze in dem liposomalen Lipid der jeweiligen Lipide, auf die verwiesen wird, sind).
Das liposomale Lipid kann auch ein „Kopfgruppen-modifiziertes Lipid" umfassen, d. h. ein Lipid mit einer polaren Gruppe, die durch die Anheftung einer Gruppierung, welche in der Lage ist, die Bindung von Serumproteinen an ein Liposom, welches das Lipid beinhaltet, zu inhibieren, daran derivatisiert ist. Das Einbauen von Kopfgruppenmodifizierten Lipiden in Liposome verändert dementsprechend deren pharmakokinetisches Verhalten, so dass die Liposome für einen längeren Zeitraum im Blutkreislauf eines Tiers verbleiben, als dies ansonsten der Fall sein würde (siehe z. B. Blume et al., Biochim. Biophys Acta., 1149: 180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res., 10(5): 703 (1993); Park et al., Biochim. Biophys. Acta., 257: 1108 (1992); Woodle et al., U.S.-Patent Nr. 5,013,556 ; Allen et al., U.S.-Patente Nr. 4,837,028 und 4,920,016; wobei der Inhalt dieser Dokumente in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Kopfgruppen-modifizierte Lipide sind typischerweise Phosphatidylethanolamine (PEs), beispielsweise unter anderem Dipalmitoylphosphatidylethanolamin ("DPPE"), Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin („POPE") und Dioleoylphosphatidylethanolamin („DOPE"). Solche Lipide haben Kopfgruppen, die im Allgemeinen mit einem Polyethylenglycol oder mit einer organischen Dicarbonsäure, wie Bernsteinsäure oder Glutarsäure („GA"), oder deren entsprechenden Anhydriden derivatisiert sind. Die Menge des Kopfgruppen-modifizierten Lipids, das in den Lipid-Träger inkorporiert wird, hängt im Allgemeinen ab von einer Anzahl von Faktoren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind oder bezüglich welcher es innerhalb des Vermögens von diesem liegt, sie ohne unangemessene Experimentierarbeit zu bestimmen. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: die Art von Lipid und die Art der Kopfgruppenmodifizierung; die Art und Größe des Trägers; und die beabsichtigte therapeutische Verwendung der Formulierung. Typischerweise bestehen etwa 5 Molprozent bis etwa 20 Molprozent des Lipids in einem Kopfgruppen-modifiziertes Lipid enthaltenden Lipidträger aus Kopfgruppen-modifiziertem Lipid.
Komplexbildner umfassen im Allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf eine Gruppe, die bezogen auf das bioaktive Mittel entgegengesetzt geladen ist, einschließlich Spermin, Spermidin, Cobalt-Hexamin, Calciumionen, Magnesiumionen, Polylysine, Polyhistidine, Protamine, Polyanionen, wie Heparin und Dextransulfat, Citrationen und Sulfationen. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird auch andere nützliche Komplexbildner, die in dem Verfahren der Erfindung nützlich sind, erkennen.
Kondensierte Nukleinsäuren, die in dem Liposom eingekapselt sind, sind DNA, einschließlich genomischer DNA, Plasmid-DNA und cDNA; oder RNA; die eingekapselte Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA, mehr bevorzugt geschlossene (zirkuläre) Plasmid-DNA. Kondensierte Nukleinsäuren sind in den Liposomen in Konzentrationen von mindestens etwa 0,5 Mikrogramm pro Mikromol liposomales Lipid oder mindestens etwa 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75 oder 2 Mikrogramm pro Mikromol eingekapselt. Mehr bevorzugt enthalten die Liposomen etwa 2 Mikrogramm Nukleinsäure pro Mikromol Lipid bis etwa 20 Mikrogramm pro Mikromol. „Kondensiert", wie hier in Verbindung mit Nukleinsäuren verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuren, die mit einem oder mehreren Polykationen derart kombiniert worden sind, dass die Nukleinsäurestränge dichter gepackt sind, als dies in Abwesenheit der Polykationen der Fall wäre. Eine solche Packung erlaubt, dass Nukleinsäuren in Liposome eingekapselt werden, belässt jedoch die Nukleinsäuren in einer transfektionsfähigen, transkriptionsbereiten Konformation.
Dementsprechend stellt in bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung das Verfahren Liposome, umfassend eine kondensierte DNA und liposomales Lipid, welches etwa 70 mol-% N-C12-DOPE und etwa 30 mol-% DOPC umfasst, bereit. Solche Liposomen enthalten wenigstens etwa 0,5 Mikrogramm kondensierte DNA pro Mikromol Lipid.
Durch das Verfahren der Erfindung bereitgestellte Liposome können ein oder mehrere bioaktive Mittel zusätzlich zu dem komplexierten bioaktiven Mittel enthalten.
Bioaktive Mittel, die mit Liposomen assoziiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: antivirale Mittel, wie Acyclovir, Zidovudin und die Interferone; antibakterielle Mittel, wie Aminoglycoside, Cephalosporine und Tetracycline; antifungale Mittel, wie Polyen-Antibiotika, Imidazol und Triazole; antimetabolische Mittel, wie Folsäure und Purin- und Pyrimidin-Analoga; antineoplastische Mittel, wie die Anthracyclin-Antibiotika und Pflanzenalkaloide; Sterole, wie Cholesterol; Kohlenhydrate, z. B. Zucker und Stärken; Aminosäuren, Peptide, Proteine, wie Zellrezeptorproteine, Immunglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glycoproteine; Farbstoffe; radioaktive Markierungen, wie Radioisotope und Radioisotop-markierte Verbindungen; strahlenundurchlässige Verbindungen; fluoreszierende Verbindungen; pupillenerweiternde Verbindungen; bronchienerweiternde Mittel; Lokalanästhetika und dergleichen.
Liposomale Formulierungen von bioaktiven Mitteln können die therapeutische Breite des bioaktiven Mittels vergrößern, beispielsweise indem die Toxizität des Mittels abgepuffert wird. Liposome können auch die Rate, mit welcher ein bioaktives Mittel aus dem Blutkreislauf von Tieren beseitigt wird, verringern. Dementsprechend kann eine liposomale Formulierung von bioaktiven Mitteln bedeuten, dass weniger des Mittels verabreicht werden muss, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.
Das Liposom dieser Erfindung kann dehydratisiert, aufbewahrt und dann rekonstituiert werden derart, dass ein substantieller Anteil von dessen innerem Inhalt darin zurückgehalten wird. Eine Dehydratisierung von Liposomen erfordert im Allgemeinen die Verwendung eines hydrophilen Trocknungsschutzmittels, wie eines Disaccharid-Zuckers, sowohl an den inneren als auch äußeren Oberflächen der Doppelschichten der Liposome (siehe U.S.-Patent Nr. 4,880,635 , dessen Inhalt in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird). Es wird allgemein angenommen, dass diese hydrophile Verbindung die Umlagerung der Lipide in Liposomen verhindert, so dass deren Größe und Inhalt während der Trocknungsprozedur und durch eine nachfolgende Rehydratisierung hindurch aufrechterhalten bleiben. Geeignete Qualitäten für solche Trocknungsschutzmittel sind, dass sie starke Wasserstoffbindungsakzeptoren sind und stereochemische Merkmale aufweisen, die den intermolekularen Abstand der Komponenten der Liposomen-Doppelschicht bewahren. Alternativ kann das Trocknungsschutzmittel weggelassen werden, wenn das Liposomen-Präparat vor der Dehydratisierung nicht eingefroren wird und nach der Dehydratisierung ausreichend Wasser in dem Präparat verbleibt.
Auch bereitgestellt wird hier eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und das Liposom dieser Erfindung umfasst. Die Zusammensetzung ist beispielsweise bei der Abgabe von Nukleinsäuren an die Zellen eines Tiers nützlich. „Pharmazeutisch annehmbare Träger", wie hier verwendet, sind jene Medien, die allgemein für eine Verwendung in Verbindung mit der Verabreichung von Lipiden und Liposomen, einschließlich liposomalen Formulierungen von bioaktiven Mitteln, an Tiere, einschließlich Menschen, annehmbar sind. Pharmazeutisch annehmbare Träger werden im Allgemeinen formuliert gemäß einer Anzahl von Faktoren, die ohne weiteres innerhalb des Vermögens des gewöhnlichen Fachmanns zu bestimmen und zu berücksichtigen sind und umfassen, ohne Einschränkung: das jeweilige verwendete liposomale bioaktive Mittel, seine Konzentration, Stabilität und beabsichtigte biologische Verfügbarkeit; die Erkrankung, Störung oder der Zustand, die mit der liposomalen Zusammensetzung behandelt werden; das Individuum, sein Alter, Größe und allgemeiner Zustand; und die für die Zusammensetzung beabsichtigte Verabreichungsroute, z. B. nasal, oral, ophthalmisch, topisch, transdermal, vaginal, subkutan, intramammär, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär (siehe beispielsweise Nairn (1985), dessen Inhalt in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird). Typische pharmazeutisch annehmbare Träger, die bei einer parenteralen Verabreichung von bioaktiven Mitteln verwendet werden, umfassen beispielsweise D5W, eine wässrige Lösung, welche 5 % (Gew./Vol.) Dextrose enthält, und physiologische Kochsalzlösung. Pharmazeutisch annehmbare Träger können zusätzliche Bestandteile enthalten, beispielsweise jene, die die Stabilität der enthaltenen Wirkstoffe erhöhen, wie Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel.
Weiter bereitgestellt wird hier ein Verfahren zum Einkapseln einer Nukleinsäure, z. B. DNA, in einem Liposom, welches die Schritte umfasst: (a) Zusammengeben einer wässrigen Suspension der Nukleinsäure mit einer organischen Lösung, welche ein Lipid, z. B. ein derivatisiertes Phospholipid und ein zusätzliches Lipid, umfasst, um eine Suspension von umgekehrten (invertierten) Mizellen, welche die Nukleinsäure und das Lipid umfassen, zu bilden; (b) Zugabe eines Polykations zu der mizellaren Suspension, um die Nukleinsäure innerhalb der umgekehrten Mizellen zu kondensieren; und (c) Entfernen des organischen Lösungsmittel aus der Suspension von Schritt (b), um aus den umgekehrten Mizellen Liposome, welche die Nukleinsäure und das Lipid umfassen, zu bilden. Das Verhältnis von Nukleinsäure zu liposomalem Lipid, das durch das Einkapselungsverfahren erzielt wird, beträgt mindestens etwa 0,5 Mikrogramm Nukleinsäure pro Mikromol Lipid.
Lipide, die bei der praktischen Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, sind, wie hier vorstehend beschrieben, jene Lipide, die als geeignet für ein Einbauen in Liposome, entweder für sich allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Lipiden, anerkannt sind; diese umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sterole und deren Derivate. Organische Lösungsmittel, die in diesem Verfahren verwendet werden, sind jegliche von verschiedenen Lösungsmitteln, die beim Lösen von Lipiden im Verlauf der Liposomenherstellung nützlich sind; diese umfassen, ohne Einschränkung, Methanol, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Chloroform und Mischungen davon. Das organische Lösungsmittel ist vorzugsweise Chloroform.
Polykationen, die in dem Verfahren der Erfindung nützlich sind, um Nukleinsäuren zu kondensieren, sind jegliche der chemischen Verbindungen, welche drei oder mehrere ionisierbare Gruppen aufweisen, die verwendet werden können, um Nukleinsäuren, andere bioaktive Mittel oder Arzneimittel zu kondensieren; diese umfassen, ohne Einschränkung, Polylysin, Polyamine (z. B. Spermin und Spermidin), Hexamin-Cobalt(III), Polyhistidin, Polyethylenimin und dergleichen. Das Polykation ist vorzugsweise Spermin. Nukleinsäuren, die bei der praktischen Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, umfassen DNA, z. B. genomische DNA, cDNA und Plasmid-DNA, lineare oder geschlossene, wie auch RNA. Nukleinsäuren werden in wässrigen Medien durch allgemein verstandene und leicht in der Praxis ausgeführte Verfahren, z. B. Vortexen, von suspendierten Makromolekülen suspendiert. Geeignete wässrige Medien sind wässrige Lösungen von verschiedenen Zusatzstoffen, wie Pufferungsmitteln, und sind im Wesentlichen frei von bestimmten Bestandteilen, wie Salzen und Nuklease-Enzymen; solche Medien umfassen, ohne Einschränkung, Puffer mit geringem Salzgehalt („low salt buffer”, „LSB", siehe nachfolgendes Beispiel 3).
Wasser-in-Öl-Emulsionen, die durch Phospholipide stabilisiert werden, enthalten umgekehrte Mizellen. Umgekehrte Mizellen (siehe Bru et al., Biochem. J., 310: 721–739 (1995)) sind auf amphipathischem Lipid basierende Strukturen, in denen die hydrophilen Domänen der Lipide innerhalb der Oberflächen der Mizellen abgekapselt bzw. sequestriert sind, während die hydrophoben Domänen der Lipide um die Außenseite herum angeordnet sind.
Emulsionen mit umgekehrten Mizellen werden gebildet, wie oben und in 2 unten beschrieben, schirmen bioaktive Mittel, einschließlich Nukleinsäuren, die darin abgekapselt bzw. sequestriert sind, vor den intermolekularen Kontakten ab, die ansonsten zu deren Aggregation in Gegenwart von Komplexbildnern und fehlender Eignung für einen Einbau in Liposome führen würden. Das Verfahren wird derart ausgeführt, dass der Prozentsatz der resultierenden Liposome, die die gewünschten Komplexe enthalten, maximiert wird.
Innerhalb der Emulsion werden Komplexe durch den Austausch von zugesetzten Komplexbildnern, wie Polykationen, oder bioaktiven Mitteln zwischen dem wässrigen Kompartiment der reversen Mizellen in der Emulsion gebildet (siehe z. B. Bru et al., FEBS, 282: 170–174 (1991); Fletcher et al., J. Chem. Soc. Faraday Trans. I, 83: 985–1006 (1987)). In dem Falle einer Einkapselung von DNA-Komplexen sind geeignete Polykationen jegliche von jenen Polykationen, die nützlich sind, um Nukleinsäuren zu kondensieren. Beispielsweise sind sowohl Spermin als auch Spermidin (siehe z. B. Chattoraj et al., J. Mol. Biol., 121: 327–337 (1978) und Gosule et al., Nature, 259: 333–335 (1976), deren Inhalt in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird) in vitro verwendet worden, um indivduelle Plasmide zu kondensieren, aber nur bei niedrigen DNA-Konzentrationen, um eine Aggregation der kondensierten Plasmide zu vermeiden. Solche Konzentrationen waren ausreichend minimal, dass, wäre eine Liposomen-Einkapselung der kondensierten Nukleinsäuren versucht worden, es eine signifikante Anzahl von leeren, d. h. nicht DNA enthaltenden Liposomen gegeben hätte. Polylysin und Hexamin-Cobalt(III) stehen ebenfalls für eine Nukleinsäure-Kondensation zur Verfügung.
Konzentrationen von Polykationen, die für das Kondensieren von Nukleinsäuren geeignet sind, sind jene Konzentrationen, die zu der Neutralisation einer ausreichenden Anzahl von negativen Ladungen der Nukleinsäure führen, z. B. etwa 90% oder mehr der negativen Ladungen im Falle von DNA (Wilson et al., Biochem., 18: 2192–2196 (1979)). Gewöhnliche Fachleute auf diesem Gebiet sind ohne Weiteres in der Lage, geeignete oder optimale Polykation-Konzentrationen angesichts der zu kondensierenden Nukleinsäure, des verwendeten Polykations, der Nukleinsäurekonzentrationen und der Polykation-Valenz zu bestimmen.
Darüber hinaus können zusätzliche Faktoren, die ohne weiteres innerhalb des Vermögens von gewöhnlichen Fachleuten auf diesem Gebiet zu bestimmen und zu berücksichtigen sind, die Konzentrationen von Polykationen, die für die Kondensation von bioaktiven Mitteln, wie Nukleinsäuren, geeignet sind, beeinflussen. Beispielsweise tragen NAPEs, wie N-C12-DOPE, eine negative Nettoladung aufgrund der zusätzlichen Acylkette; folglich können solche Lipide mit positiv geladenen Molekülen Wechselwirken, wodurch der Pool von Polykationen, der für eine Nukleinsäurekondensation zur Verfügung steht, verringert wird.
Dementsprechend kann es in solchen Fällen erforderlich sein, eine Polykation-Menge über jener, die ansonsten für eine Nukleinsäure-Kondensation benötigt würde, zuzugeben. Solche ausreichenden zusätzlichen Mengen von Polykationen können durch verschiedene Mittel oder Maßnahmen bestimmt werden, einschließlich beispielsweise der Art von Verteilungsexperimenten, die in Beispiel 4 erläutert wird. Solche Experimente liefern Daten (siehe 3), welche die zusätzlichen Polykation-Konzentrationen, die für eine Nukleinsäure-Kondensation erforderlich sind, zeigen. Beispielsweise war bei den Konzentrationen von Nukleinsäure und Lipid, die in Beispiel 3 verwendet wurden, 0,6 mM Spermin für eine Plasmid-DNA-Kondensation ausreichend, aber diese Menge erhöhte sich in Gegenwart des NAPF N-C12-DOPE in der angegebenen Konzentration auf 0,85 mM. Es können jedoch Polykation-Konzentrationen, die höher als diese sind, d. h. höher als minimal erforderlich, verwendet werden – beispielsweise wurde, wieder mit Blick auf die Bedingungen von Beispiel 3 als exemplarisch, eine Spermin-Endkonzentration von 8–20 mM in der Emulsion als optimal für eine Nukleinsäure- und Lipid-Ladungsneutralisation festgestellt.
Gewöhnliche Fachleute sind ohne weiteres in der Lage, Lipid- und Nukleinsäurekonzentrationen zu bestimmen, die für die praktische Ausführung dieser Erfindung geeignet sind. Beispielsweise (siehe Beispiel 3 unten) wurden, um kondensierte Plasmid-DNA innerhalb von kugelförmigen 200 nm-Liposomen einzukapseln, 200 Mikrogramm pZeoLacZ-Plasmid-DNA in 125 Mikrolitern LSB mit 30 Mikromolen einer Kombination von N-C12-DOPE und DOPC im Molverhältnis 70:30 zusammengegeben.
Dementsprechend werden bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung in der Praxis ausgeführt mit einer kondensierten Nukleinsäure, welche Plasmid-DNA ist, einem Lipid, welches ein derivatisiertes Phospholipid, z. B. N-C12-DOPE, umfasst, Chloroform und Spermin, z. B. in einer Konzentration von etwa 1 mM oder höher.
Noch weiter bereitgestellt wird hier ein Verfahren zum Transfizieren der Zellen eines Tiers mit einem bioaktiven Mittel, wie einer Nukleinsäure, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, die Zellen mit einem Liposom dieser Erfindung, welches die komplexierte Nukleinsäure enthält, in Kontakt zu bringen. Ein solches Kontaktieren erfolgt entweder in vitro, in welchem Falle eine Zusammensetzung, welche das Liposom umfasst, zu dem Kulturmedium, welches die Zellen umgibt, hinzugegeben wird, oder in vivo, in welchem Falle das Liposom in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, verabreicht wird und man dies an das Tier durch ein(e) jegliche(s) der Standardmittel oder Standardmaßnahmen zur Verabreichung solcher Zusammensetzung an Tiere verabreicht.
Ein Kontakt in vivo, speziell wenn Spezifität oder Zielgerichtetheit gewünscht wird, wird unterstützt, indem in das Liposom ein Mittel eingebaut wird, um entweder das Liposom zu einem speziellen Ort zu dirigieren, z. B. durch Konjugieren eines Antikörpers mit den Liposomen über Streptavidin, was bewirkt, dass der Inhalt des Liposoms bevorzugt an einem bestimmten Ort freigesetzt wird, z. B. durch den Einbau von NAPEs oder Peptid-Lipid-Konjugaten in die Liposome, und/oder indem bewirkt wird, dass sich die Liposome an Stellen, z. B. Tumoren, anhäufen, indem in diese ein an der Kopfgruppe modifiziertes Lipid eingebaut wird.
Die Transfektionseffizienz, d. h. die Effizienz der aktuellen Einführung eines in Liposomen eingekapselten Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle, wird unterstützt, entweder in vitro oder in vivo, indem in die Liposome ein Mittel eingebaut wird, um zu bewirken, dass die Doppelschichten des Liposoms mit den Membranen der Zellen verschmelzen. Solche Mittel umfassen, ohne Einschränkung, den Einbau von NAPEs, Peptid-Lipid-Konjugaten und ionisierbaren Lipiden (siehe WO 87/07530 und WO 95/27478 , deren Inhalt in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird).
Die Transfektion, in vitro oder in vivo, zielt darauf ab, Nukleinsäuren in Zellen einzuführen derart, dass sie darin transkribiert und translatiert werden. Eine solche Proteinexpression mittels einer Einführung von exogener Nukleinsäure kann verwendet werden, um sich einer Anzahl von Defekten in der Zelle, die durch das Fehlen einer Expression oder durch die Überexpression eines Gens darin bewirkt werden, anzunehmen oder um auf andere Weise zelluläre Proteine und deren Expression zu modifizieren. Die Transfektion von Zellen mit den in Liposomen eingekapselten Nukleinsäuren, die hier bereitgestellt werden, ist dementsprechend nützlich, um Tiere, die an Erkrankungen oder Störungen, die durch eine abnormale, sei sie nicht vorhanden, abnormal niedrig, abnormal hoch oder unangemessen, Expression eines Proteins gekennzeichnet sind, leiden, zu behandeln. Solche Erkrankungen und Störungen umfassen beispielsweise und ohne Einschränkung verschiedene Krebserkrankungen und Gendefekterkrankungen. Eine therapeutisch relevante Transfektion kann auch zu der Expression eines Proteins, das in den Zielzellen zuvor nicht exprimiert worden ist, führen.
Der Transfektionserfolg und die Expression der durch Transfektion eingeführten Nukleinsäure in einer Zelle können auf verschiedene Weisen nachgewiesen werden, wobei diese im Allgemeinen entweder von dem Nachweis des körperlichen Vorhandenseins der Nukleinsäure in der Zelle, z. B. durch Einbau von radioaktiven Nukleotiden in die Nukleinsäure, abhängen, oder durch Nachweisen der Expression des Proteins, das durch die Nukleinsäure kodiert wird. Dies kann auf verschiedene Weisen bewerkstelligt werden, einschließlich, ohne Einschränkung, wenn das Protein ein nachweisbarer, z. B fluoreszierender, Marker ist oder wenn das Protein ein selektierbarer Marker ist, z. B. ein Marker einer Resistenz gegen ein zytotoxisches Mittel.
Beispielsweise enthält das Plasmid pEGFP-1 eine DNA-Sequenz, die das „enhanced green fluorescent protein" (verstärkte grüne fluoreszierende Protein) kodiert, dessen Vorhandensein durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wird. Dementsprechend wird eine erfolgreiche Transfektion von Zellen mit diesem Plasmid (siehe Beispiele 10–12) leicht bestimmt, indem die Quantität der Fluoreszenz, die diese Zellen zeigen, bestimmt wird. Die Ergebnisse von diesen Experimenten (siehe 8- 12) (waren) sowohl die erfolgreiche Transfektion von OVCAR-3-Zellen mit dem Plasmid pEGFP-1 wie auch das hohe Expressionsausmaß des transfizierten Plasmids in einem signifikanten Prozentsatz der transfizierten Zellen.
Eine solche erfolgreiche Expression wurde nur beobachtet, wenn die transfizierte DNA mit Polykation kondensiert worden war; nicht mit Spermin verarbeitete Proben zeigten keine oder nahezu keine Fluoreszenz (siehe 8). Eine Quantifizierung der Expression von fluoreszierendem Protein (9) zeigte, dass eine Transfektion mit Polykation-kondensierter DNA zu signifikanten Expressionsniveaus führte, während eine Transfektion durch Proben, die ohne Spermin weiterverarbeitet worden waren, nicht zu einer quantifizierbaren Fluoreszenz führte. Darüber hinaus führte eine Transfektion mit freier, d. h. nicht eingekapselter DNA ebenfalls zu keiner beobachtbaren oder quantifizierbaren Fluoreszenz (8c und 9c).
Diese Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die lediglich exemplarisch für die Erfindung, wie sie in den danach folgenden Ansprüchen definiert wird, sind, besser verstanden.
Beispiele
Beispiel 1 – Materialien
N-(Lissamin-Rhodamin B-sulfonyl)-phosphatidylethanolamin (ausgehend von Ei-PC umgeestert), DOPC, EPC und N-C12-DOPE wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) erworben. OVCAR 3-Eierstockkarzinomzellen wurden vom NCI-Frederick Cancer Research Laborstory (Frederick, MD) erworben. Das Plasmid pEGFP-C1 und kompetente E. coli-DH5α-Zellen wurden von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) erworben. Das Plasmid pZeoSVLacZ, kompetente Zellen und Hanahan's S.O.C. wurden von Invitrogen (San Diego, CA) erworben. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), RPMI 1640 und hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und Lipofectin wurden von Gibco/BRL (Grand Island, NY) erworben. DNase-freie RNase und RNase-freie DNase I wurden von Boehringer Mannheim (GmbH, Deutschland) erworben. Agarose wurde von FMC Bioproducts (Rockland, ME) erworben. Bacto-Agar, Bacto-Trypton und Hefeextrakt wurden von DIFCO Laboratories (Detroit, MI) erworben. Calceinblau-acetoxymethylester(CBAM), PicoGreen- und SybrGreen I-Farbstoffe stammten von Molecular Probes (Eugene, OR).
Beispiel 2 – Plasmidreinigung:
In dieser Untersuchung wurden zwei Plasmide verwendet: das Plasmid pZeoSVLacZ, das 6,5 kb groß ist und das IacZ-Gen für β-Galactosidase in Säugetierzellen ausgehend von dem frühen Enhancer-Promotor von SV40 exprimiert, welches eine Selektion in Säugetierzellen und E. coli unter Verwendung des Antibiotikums Zeocin erlaubt; und das Plasmid pEGFP-C1, welches 4,7 kb groß ist und das „enhanced green fluorescent Protein" (EGFP) ausgehend von einem „immediate early"-Promotor des humanen Zytomegalievirus exprimiert, weiches eine Selektion in E. coli unter Verwendung von Kanamycin und in Säugetierzellen unter Verwendung von G418 erlaubt. Plasmide wurden aus E. coli gereinigt (Baumann und Bloomfield, Biotechniques, 19: 884–890 (1995)) – das endgültige Verhältnis der O. D. bei 260 nm zu der O. D. bei 280 nm war für alle Präparationen größer als 1,9; eine Agarose-Gelelektrophorese zeigte DNA in dem erwarteten Größenbereich an.
Beispiel 3 – Liposomale DNA-Formulierungen:
Proben wurden hergestellt, indem 200 μg DNA in 125 μl LSB verdünnt wurden und die resultierenden Suspensionen dann mit 1 ml CHCl₃, enthaltend 30 μmol eines 70:30-Molverhältnisses von N-C12-DOPE und DOPC, in einem 13 × 100-Pyrex-Röhrchen mit Vortexen zusammengegeben wurden. Die Probe wurde unverzüglich 12 s in einem Bad-Beschallungsgerät (Laborstory Supplies Co., Hicksville, NY) bei maximaler Energie beschallt, um zuerst eine Emulsion mit Plasmid-DNA zu bilden. Nachfolgend wurde ein 125 μl-Aliquot von LSB, enthaltend verschiedene Konzentrationen von Spermin (16 bis 40 millimolar) zu dieser Emulsion unter Vortexen und Beschallen zugegeben. Proben ohne Spermin wurden auf die gleiche Weise hergestellt mit der Ausnahme, dass Spermin aus dem zweiten 125 μl-Aliquot weggelassen worden war. Die Herstellung der Proben mit EPC war ebenfalls identisch mit der Ausnahme, dass 7 mM Spermin verwendet wurden.
Die resultierenden Emulsionen wurden innerhalb von wenigen Minuten in einen Kolben auf einem Rotovap (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Schweiz) gegeben. Organisches Lösungsmittel wurde entfernt, während der Kolben mit seiner maximalen Geschwindigkeit rotiert wurde, während das Vakuum mit einem Nadelventil moduliert wurde. Anfänglich wurde ein Vakuum von etwa 600–650 mm etabliert, wobei dieses nachfolgend so schnell wie möglich ohne übermäßige Blasenbildung erhöht wurde, bis das maximale Vakuum erreicht wurde (etwa 730 mm); der Kolben wurde dann weitere 25 min evakuiert. Der an dem Kolben zurückbleibende Film wurde in 1 ml 300 mM Sucrose in LSB resuspendiert und die Probe wurde fünfmal durch 0,4 μm-Polycarbonat-Membranfilter (Poretics, Livermore, CA) extrudiert. Die Probe wurde dann gegen „Hank's balanced salt buffer" (HBSS) ohne Ca²⁺/Mg²⁺ über Nacht bei 4°C dialysiert.
Es wurden andere Lipidzusammensetzungen verwendet, um kondensierte DNA gemäß der Erfindung einzukapseln. Plasmide wurden kondensiert und in Liposomen eingekapselt, wie in diesem Beispiel oben beschrieben, und wie in Beispiel 12 sedimentiert. Die Lipidzusammensetzung der Liposome war Cholesterolhemisuccinat:Cholesterol:1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin:Dioleoyldimethylammoniumpropan:Oleoylacetat in einem Verhältnis von 12,5:2,5:50:12:10,5:10,5. Nach Pelletieren und Waschen wurde das DNA/Lipid-Verhältnis für diese Liposome wie in Beispiel 10 bestimmt. Typische DNA/Lipid-Verhältnisse waren 1,4-2,1 μg DNA pro Mikromol Lipid.
Beispiel 4 – Spermin-Verteilung:
N-C12-DOPE trägt eine negative Nettoladung, die potentiell mit positiv geladenem Spermin Wechselwirken und den Kondensationsprozess beeinflussen könnte. Dementsprechend war es notwendig, die Spermin-Verteilung zwischen DNA und Liposomen dieser Zusammensetzung in einem Dialyseexperiment gegen Puffer mit geringem Salzgehalt („low salt buffer”) zu testen. Experimente, die gestaltet waren, um die Verteilung von Spermin zwischen negativ geladenen Phospholipiden und DNA zu messen, wurden mit einer Drei Kammer-Dialysevorrichtung (Sialomed, MD) ausgeführt – jede Kammer enthielt 250 μl Flüssigkeit. Die gewünschte Menge Spermin wurde in LSB verdünnt und in die zentrale Kammer, die von zwei Dialysemembranen mit einem Molekulargewicht-Rückhaltevermögen von 100.000 flankiert wurde, gegeben. Die Kammer auf einer Seite der Spermin-Kammer enthielt 400 μg pZeoLacZ-Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 250 μl LSB. Die Kammer auf der anderen Seite enthielt entweder 250 μl LSB allein oder leere N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposome, hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit einer Gesamt-Lipidkonzentration von 30 mM in 250 μl LSB – in dieser Anordnung hat nur Spermin Zugang zu allen drei Kammern. Da bekannt ist, dass eine Neutralisation von Plasmid-DNA durch Spermin zu einer Aggregation führt (1), wurde die Trübung der Lösung in der DNA enthaltenden Kammer als ein Mittel zum Überwachen der Spermin-Verteilung verwendet. Wenn die Liposome Spermin vollständig von der DNA abkapselten, würde die DNA nicht aggregieren. Die Menge von verfügbarem negativ geladenem Lipid war in diesen Experimenten ungefähr das Doppelte der Menge an negativer Ladung an der DNA. Jede Dialysevorrichtung wurde über Nacht (etwa 20 h) an einem motorisierten 12 Zoll-Rad rotiert. Die DNA enthaltende Kammer wurde dann mit wiederholtem Pipettieren, um die Probe zu mischen, entfernt und sie wurde in eine Küvette mit einem Volumen von 250 μl gegeben. Die Absorption bei 400 nm wurde verwendet, um die Trübung gegen den Puffer-Hintergrund zu überwachen.
Spermin-Titrationskurven der DNA-Trübung wurden für Dialysen mit und ohne vorhandene Liposome konstruiert (3). Die ungefähre Verschiebung der Kurve aufgrund des Vorhandenseins von Liposomen wurde verwendet, um die relativen Bindungskonstanten für die Lipide und die DNA zu berechnen unter der Annahme, dass jedes Spermin-Molekül an vier Nukleotid-Phosphatgruppen oder vier Phospholipide bindet, in einfachen Gleichgewichten mit Assoziationskonstanten K_DNA bzw. K_Lipid. Bei geringer Salzkonzentration liegt die Dissoziationskonstante für Spermin von DNA bekanntermaßen im mikromolaren Bereich (Wilson et al., Biochem., 18: 2192–2196 (1979); Gosule et al., J. Mol Biol., 121: 327–337 (1978)). Dementsprechend wurde die freie Konzentration von Spermin bei den millimolaren Spermin-Konzentrationen, die für eine DNA-Aggregation in diesen Experimenten erforderlich waren, als vernachlässigbar angenommen.
Die stufenweise Neutralisierung der Phosphatgruppen der DNA durch Spermin, die für eine DNA-Aggregation erforderlich war, 7, wurde basierend auf den Daten, die in Abwesenheit von Liposomen erhalten wurden, zu 0,9 angenommen. Dies ist der gleiche Wert, von dem berichtet worden war, dass er für eine DNA-Kondensation benötigt wird, in Übereinstimmung mit der früheren Beobachtung, dass eine Aggregation die Kondensation bei hohen DNA-Konzentrationen begleitet (Wilson et al., Biochem., 18: 2192–2196 (1979); Gosule et al., J. Mo. Biol., 121: 327–337 (1978)). Unter der Annahme von [DNA-Spm] = γ[DNA]_gesamt am Aggregationspunkt und [Lipid-Spm] = die Verschiebung in der Kurve kann man die Gleichung verwenden KDNA/KLipid = [γ/(1-γ)] × [(Lipidgesamt – Verschiebung)/(Verschiebung)].
Wenn das Lipid_gesamt als die gesamte Konzentration von negativ geladenem Lipid, das auf der Außenseite der Liposome exponiert ist, geteilt durch vier angenommen wird, ist das Verhältnis der offensichtlichen Gleichgewichtskonstanten 178, d. h. die Spermin-Bindung an DNA ist viel avider als die Bindung an die Lipide. Das Verhältnis von Bindungskonstanten und der erste Faktor auf der rechten Seite sind Konstanten. Dementsprechend kann der letzte Faktor auf der rechten Seite verwendet werden, um die Verschiebung in der Spermin-Titrationskurve für eine DNA-Kondensation für eine jegliche Lipid-Gesamtkonzentration, einschließlich der höheren effektiven Konzentration, die in den Emulsionen verwendet wird, zu berechnen.
Die in 3 aufgeführten Daten zeigen, dass das Vorhandensein der Liposome die Kurve für die DNA-Aggregation nur geringfügig verschiebt. Dementsprechend war ungefähr 0,6 mM Spermin in den anfänglichen 250 μl Emulsion ausreichend, um die Plasmid-DNA zu kondensieren, während eine Gesamtkonzentration von 0,85 mM ausreichend sein würde, um die DNA in Gegenwart der verwendeten Menge von N-C12- DOPE zu kondensieren. Es würde dementsprechend erwartet werden, dass die Plasmid-DNA in diesen Präparationen wahrhaft kondensiert werden kann ohne die Komplikation einer Neutralisation der negativ geladenen Lipide, welche die Liposome destabilisieren könnte.
Beispiel 5 – Lichtmikroskopie von Liposomen-Proben:
Die vorab erfolgende Kondensation der DNA für eine potentielle Einkapselung in Liposome wurde getestet. Es trat eine massive Aggregation auf, wie anhand einer starken Trübungsveränderung der Lösung beurteilt wurde. Dies war nicht unerwartet, da über ähnliche Probleme berichtet worden war. Eine Lichtmikroskopie von Plasmid-Aggregaten (1) wurde ausgeführt unter Verwendung von 200 μg pZeoLacZ-Plasmid in 125 μl LSB, sanft mit 7 mM Spermin in 125 μl LSB gemischt, und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die mikroskopische Beobachtung (1A) zeigte, dass die Aggregate im Allgemeinen viel größer als 1 μm und oftmals sogar 5–10 μm groß waren. Die große Größe von diesen Aggregaten wurde weiter durch Kryo-Elektronenmikroskopie bestätigt (1B). Bei dieser Vergrößerung sind besonders die regelmäßigen Anordnungen von Fasern zu erwähnen, vielleicht als ein Ergebnis einer Spermin-induzierten Kondensation zu einer partiell geordneten Struktur. Es gab auch einige gebogene Stäbe, welche die Anfangsstadien von toroidalen Strukturen nahe legen, aber keine vollständigen Toroide. Auf diese Weise gebildete Aggregate waren zu groß, um für ein Abgabesystem nützlich zu sein.
Für eine Abschätzung der Größe von N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen, welche DNA enthalten, (5) wurden Polystyrol-Kügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 269 ± 7 nm (Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA) mit H₂O bis auf eine für die Mikroskopie geeignete Konzentration verdünnt und Proben der DNA enthaltenden N-C12-DOPE/DOPC (70:30))-Liposome wurden nach Extrusion und Dialyse ohne weitere Verdünnung (etwa 20 mM Lipid) verwendet. Die Proben wurden unter einem Olympus-BH-2-Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Lake Success, NY) bei 1000-facher Vergrößerung untersucht.
Die Ergebnisse sind in 5 aufgeführt. Die DNA enthaltenden Liposomen-Partikel erschienen bei dieser Vergrößerung relativ gleichförmig in Größe und Gestalt und die ungefähre Größe von Probenpartikeln erschien sehr ähnlich zu jenen, die aus dynamischen Lichtstreuungsuntersuchungen erhalten worden waren. Ein Vergleich von dieser Probe von DNA enthaltenden Liposomen-Partikeln mit der mittels Spermin aggregierten DNA in 1A zeigt den Vorteil einer Kondensation der DNA in den umgekehrten Mizellen gemäß der Erfindung vor der Bildung der Liposome. Es gab keinen Hinweis auf die sehr großen Aggregate, die beobachtet wurden, wenn Spermin direkt mit DNA in wässriger Lösung wechselwirkte, was anzeigt, dass das Emulsionskondensationsverfahren die Bildung von solchen Aggregaten in großem Umfang inhibieren könnte.
Beispiel 6 – Partikelanalyse durch Lichtstreuung:
Die N-C12-DOPE/DOPC-Präparationen wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung charakterisiert. Eine Partikelgrößenanalyse wurde ausgeführt unter Verwendung eines Nicomp 370-Partikelgrößenanalysators („particle size analyzer”) (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Proben wurden für die Analyse ungefähr zehnfach verdünnt. In dem Vesikel-Modus wurde eine Gaußsche Analyse ausgeführt und es sind zahlenmäßig gewichtete Durchschnittswerte angegeben. Die Daten für mit Spermin kondensierte pZeoLacZ-Plasmid-DNA, hergestellt wie in Beispiel 3, konnten durch eine Gaußsche Größenverteilung mit einem Partikelgrößen-Zahlenmittel von 222,6 nm in Übereinstimmung gebracht werden.
Beispiel 7 – Gefrierbruch-TEM:
Die fusogenen N-C12-DOPE/DOPC-Präparationen mit eingekapselter DNA wurden weiter durch Gefrierbruch-TEM charakterisiert. Etwa 2 μl Probe wurden zwischen zwei Doppel-Replika-Halter aus Kupfer von Balzers eingebracht und in flüssigem Propan eingefroren. Die Probe wurde bei –100°C, 10^–6–10^–7 bar gebrochen und mit Platin (< 45°C) und Kohlenstoff in einer BAF 400-Gefrierbruch-Vorrichtung von Balzers schräg bedampft. Replika wurden mit 5% Bleichlauge über Nacht verdaut, mit destilliertem Wasser gewaschen und auf 300 Mesh-Netze aufgebracht. Die Bilder wurden mit einem Philips 300-TEM erhalten.
Die Ergebnisse sind in 6 aufgeführt. Die meisten der Partikel waren von kleiner Größe (weniger als 400 nm), was mit NICOMP-Ergebnissen konsistent war. Aufgrund der vorherrschenden Bruchebene durch Lipid-Doppelschichten ist die Beobachtung von Inhalt aus dem Inneren bei dieser Technik selten. Jedoch schien eine geringe Anzahl der Partikel einige eingekapselte Strukturen, die kondensierte DNA repräsentieren könnten, aufzuweisen.
Beispiel 8 – Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie
Kryo-EM wurde verwendet, um die liposomale Natur der Präparationen zu bestätigen und um möglicherweise jegliche eingekapselten Materialien sichtbar zu machen. Für EPC-Proben und Spermin-aggregierte DNA wurden Kupfer-Netze, die mit einem löchrigen Kohlenstoffträger beschichtet waren, ohne weitere Behandlung verwendet. Für DNA enthaltende N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomenproben wurden EM-Netze mit einer löchrigen Kohlenstofffolie positiv geladen gemacht, indem ein Tropfen einer 0,1 mM Polylysin-Lösung auf die Netzoberfläche gegeben wurde und man diesen eine Minute verweilen ließ. Das Polylysin wurde abgetupft und das Netz mit mehreren Tropfen destilliertem Wasser, gefolgt von mehreren Tropfen Probenpuffer, gespült. Dann wurde ein 5 μl-Aliquot von Probe auf das Netz gegeben, zu einem dünnen Film abgetupft und unverzüglich in flüssiges Ethan eingetaucht. Die Netze wurden unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis sie verwendet wurden. Sie wurden an einem Philips-CM12-Transmissionselektronenmikroskop (Mahwah, NJ), das mit einer Beschleunigungsspannung von 120 kV betrieben wurde, betrachtet. Ein 626-Kryohalter (Warrendale, PA) wurde verwendet, um die Probentemperatur während der Bildgebung zwischen –177°C und –175°C zu halten. Elektronenmikrophotographien wurden unter Bedingungen einer niedrigen Elektronendosis aufgezeichnet von Flächen, die sich über Löchern befanden. Es wurden 35.000-fache oder 60.000-fache Vergrößerungen und Unterfokus-Werte von 1,8–2,5 μm verwendet.
Die Ergebnisse sind in 7 aufgeführt. Wenn Spermin aus der Prozedur für die N-C12-DOPE/DOPC-Liposome weggelassen wurde, wurden primär unilamellare, relativ kleine, aber strukturell heterogene Liposome beobachtet (7a), was mit der Nicomp-Analyse konsistent war. Eine Anzahl von Liposomen erschien tubulär, wahrscheinlich als Ergebnis des osmotischen Gradienten, der während der Herstellungsprozedur erzeugt wurde. Einige Liposome zeigten innerliche faserartige Strukturen, welche möglicherweise unkondensierte DNA repräsentierten (linker Pfeil). Nicht-eingekapselte freie Fasern konnten ebenfalls festgestellt werden (rechter Pfeil).
DNA enthaltende N-C12-DOPE/DOPC-Liposom-Proben, die mit Spermin hergestellt worden sind (7b, c) waren ebenfalls heterogen in Größe, Gestalt und Lamellarität. Einige Partikel waren normal aussehende Liposome ohne sichtbares eingekapseltes Material. Jedoch enthielten andere elektronisch dichte, gut definierte toroidale Strukturen (7b, Pfeile), die in den Proben ohne Spermin nicht festgestellt wurden. Solche Strukturen standen in keiner Beziehung zu dem jeweiligen verwendeten Lipid, da toroidale (7c, rechter Pfeil) und gebogene Stab-Strukturen (7c, linker Pfeil) auch in Ei-PC-Präparationen, die dazu neigten, unter den Kryo-EM-Probenvorbereitungsbedingungen stabiler zu sein, beobachtet wurden. Der Abstand zwischen den feinen Linien innerhalb der Stäbe und Toroide war gleichförmig und signifikant kleiner als der Abstand zwischen zwei Membranen in multilamellaren Liposomen (Stern). Diese toroidalen Strukturen weisen eine große Ähnlichkeit auf zu den Toroiden und Stäben, die beobachtet werden, wenn freie DNA durch Spermin (Chattoraj et al., J. Mo. Biol., 121: 327–337 (1978)) oder andere kondensierende Mittel (Arscott et al., Biopolymers, 30: 619–630 (1990); Gosule und Schellman, J. Mo. Biol., 121: 327–337 (1978)) in verdünnten Lösungen kondensiert wird. Die parallelen und konzentrischen feinen Linien, die innerhalb der Stäbe und Toroide sichtbar sind, ähnelten auch den Linien, die innerhalb der Plasmid-Aggregate festgestellt werden (1 b).
Membranen konnten klar um einige der toroidalen Strukturen herum beobachtet werden (z. B. 7b). Es ist wahrscheinlich, dass alle der beobachteten Toroide innerhalb einer für Ionen undurchlässigen Barriere eingekapselt sind, da kondensierte DNA-Toroide in dem Puffer mit hoher Salzkonzentration, in welchem die Liposome schließlich suspendiert wurden, nicht existieren können. Es würde dementsprechend scheinen, dass ein Hauptanteil von diesen Präparationen aus liposomal eingekapselter Plasmid-DNA besteht.
Beispiel 9 – Aqarose-Gelanalyse:
Der Schutz von Plasmid-DNA vor einem DNase-Verdau wurde durch Agarose-Gelelektrophorese für liposomal eingekapselte Plasmid-DNA, die mit Spermin hergestellt worden ist, und eine Kontrollprobe, die ohne Spermin hergestellt worden ist, ausgewertet. Ein 50 μl-Aliquot der gewünschten Präparation wurde in 145 μl HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ verdünnt und 1 μl von 0,2 M MgCl2 plus 2 μl DNase I (20 Einheiten) wurden unter Mischen zugegeben. Nach einer sechsstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 2 μl 0,5 M EDTA zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Für unverdaute Kontrollen wurde ein 50 μl-Aliquot von jeder Probe mit 150 μl HBSS (m/o Ca²⁺/Mg²⁺) gemischt. Proben wurden dann mit Phenol/CHCl3/Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, wie beschrieben (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory: Cold Spring Harbor, NY, S. B4–B5 (1989)). Das Pellet wurde in 20 μl TE (pH 8,0) gelöst, wovon 5 μl auf ein 0,8%-iges Agarosegel aufgeladen wurden. Die Gele wurden mit einer 1:10000-Verdünnung von „SYBR Green I nucleic acid gel stain"-Stammlösung (Molecular Probes) 30 min gefärbt und auf einem FotoSpectrum^® „ultraviolet transilluminator" (Leuchtkasten) sichtbar gemacht. Photographien wurden auf dem Leuchtkasten mit einem Polaroid-MP 4+-Kamerasystem aufgenommen. Diese Photographien wurden dann auf einem ScanJet IIC^® (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) gescannt und mit Aldus Photostyler^® (U-Lead Systems, Torrance, CA) digitalisiert.
Die Ergebnisse sind in 4 aufgeführt, zeigen, dass beide Präparationen einen signifikanten DNA-Schutz oder eine offensichtliche Einkapselung ermöglichten.
Beispiel 10 – Quantifizierungsanalyse:
Um den DNA-Schutz zu quantifizieren, wurde DNA aus jedem Aliquot extrahiert und durch einen Fluoreszenzassay gemessen. Es wurden PicoGreen-Fluoreszenzassays (Haugland, Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 6. Aufl., Molecular Probes, Inc., S. 161–162 (1996)) verwendet, um DNA zu quantifizieren, die durch die Phenol/Chloroform-Prozedur, die in Beispiel 9 erläutert worden ist, extrahiert worden war. Eine Arbeitslösung wurde hergestellt, indem 100 μl PicoGreen-Stammlösung (Molecular Probes) zu 20 ml TE (pH 7,5) zugegeben wurden. Die extrahierte Probe wurde zuerst 100-fach mit TE (pH 7,5) verdünnt. Dann wurde ein 14 μl-Aliquot der verdünnten Probe mit 986 μl TE (pH 7,5) und 1 ml PicoGreen-Arbeitslösung gemischt. Die Mischung wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 4 min inkubiert. Die PicoGreen-Fluoreszenz wurde bei Raumtemperatur an einem PTI-Alphascan-Fluorometer (South Brunswick, NJ) mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm mit einem > 500 nm-Hochpassfilter (Schott Glass Technologies, Duryea, PA) aufgezeichnet. Die Fluoreszenz von 1 ml TE (pH 7,5) und 1 ml PicoGreen-Arbeitslösungs-Mischung wurde als Leerwert verwendet. Der Prozentsatz von DNA, der vor dem DNase I-Verdau geschützt war, wurde berechnet, indem der Leerwert abgezogen wurde und die unverdaute Probe als 100% angenommen wurde. Unter unseren Versuchsbedingungen war das Fluoreszenzsignal ausgehend von verdauter DNA unsignifikant.
Die Probe mit Spermin zeigte 10,1 ± 5,6 Prozent Plasmid-Schutz, während 19,0 ± 4,5 in der Probe ohne Spermin geschützt waren.
Beispiel 11 – Transfektionsassays:
Dann wurde die Transfektionsaktivität der liposomalen Präparationen, welche pEGFP-C1-Plasmid-DNA einkapselten, getestet. OVCAR3-Zellen wurden in einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro ml in Platten mit 24 Vertiefungen oder in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro ml in Platten mit 96 Vertiefungen in 1 ml bzw. 0,1 ml pro Vertiefung von RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ausplattiert. Man ließ die Zellen zwei Tage (ungefähr 40–48 h) sich vermehren, bevor Transfektionen ausgeführt wurden; an diesem Punkt befanden sich die Zellen bei Konfluenz. Transfektionslösungen wurden durch Verdünnung von geeigneten Liposom- oder DNA-Proben in serumfreiem Medium hergestellt. Die Platten wurden abgesaugt, um Medium zu entfernen, und einmal mit „Dulbecco's Phosphate buffered saline" (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen, gefolgt von Absaugen.
Transfektionslösungen (0,5 ml pro Vertiefung für Platten mit 24 Vertiefungen, 0,1 ml pro Vertiefung für Platten mit 96 Vertiefungen) wurden durch zehnfache Verdünnung von dialysierten Proben, welche das pEGFP-C1-Plasmid enthielten, in serumfreiem Medium (ungefähr 2 mM Gesamtlipid, sofern nicht anders angegeben) hergestellt und wurden dann zu den Vertiefungen zugegeben und bei 37°C 3 h inkubiert. Die Vertiefungen wurden abgesaugt und Medium, welches 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Aufgrund der zuvor demonstrierten Abschaltung von Transgenen unter dem CMV-Promotor (Tang et al., Human Gene Therapy, 8: 2117–2124 (1997); Dion et al., Virology, 231: 201–209 (1997)) wurden 5 μm des Histon-Deacetylaseinhibitors Trichostatin A zu jeder Vertiefung hinzugegeben, um die Expression zu verstärken. In den in den letzten beiden Figuren präsentierten Experimenten wurde stattdessen ein anderer Histon-Deacetylaseinhibitor, 5 mM Natriumbutyrat, verwendet.
Nach Inkubation bei 37°C in einem Zellkulturinkubator für 18–22 h wurde das Medium abgesaugt und es wurde mit 0,5 ml-Aliquots von Dulbecco's PBS gewaschen. Mikrophotographien wurden von den noch auf Gewebekulturplatten befindlichen Proben mit einem umgekehrten Olympus-IMT-2-Mikroskop unter Verwendung des 10×-Objektivs aufgenommen. Das PBS wurde abgesaugt und es wurde 0,5 ml (0,1 ml für Platten mit 96 Vertiefungen) von 5 μM Calceinblau-acetoxymethylester (CBAM) in PBS zu jeder Vertiefung hinzugegeben und 40 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen, es wurde abgesaugt und 0,5 ml (0,1 ml für Platten mit 96 Vertiefungen) von 1% C₁₂E₈ in TE-Puffer (pH 8,0) wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Proben wurden dann in Detergens gelöst und es erfolgten Ablesungen für eine korrigierte gesamte EGFP-Fluoreszenz bezogen auf die Gesamtanzahl von lebenden Zellen. Die Fluoreszenz der Platten wurde in einem „Cytofluor II fluorescent plate reader" (Cytofluor II-Fluoreszenzplattenlesegerät; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) gemessen. Ablesungen für Calceinblau, mit welchem sich lebende Zellen beladen hatten, erfolgten bei einer Anregung bei 360 nm und Emission von 460 nm mit einem Verstärkungsfaktor („gain") von 80. Es wurde verifiziert, dass diese Ablesungen linear mit der Anzahl von ursprünglich ausplattierten Zellen bis zu einer Konzentration, wo Konfluenz beobachtet wurde, verliefen. Für die in den 10 gezeigten Daten wurde ein ausgehend von externer DNA hergestelltes liposomales Pellet verwendet (Beispiel 12). Da die Ca² ⁺- und Mg² ⁺-Konzentrationen in RPMI 1640 signifikant geringer als in Serum sind, wurden die Daten in 11 und 12 erhalten, nachdem das serumfreie Medium mit Ca²⁺ und Mg² ⁺, um während der Transfektion 1,2 bzw. 0,8 mM zu erzielen, ergänzt worden war.
Eine angenäherte Umwandlung in EGFP-Fluoreszenz pro Einheit zelluläres Protein konnte abgeschätzt werden, indem die durchschnittlichen Proteinkonzentrationen von 48 h-Kulturen der OVCAR-3-Zellen in 24 und 96 Vertiefungs-Experimenten, die mit 1% Triton-100-Detergens extrahiert wurden, gemessen wurden. Ein Bicinchoninsäure-Assay (Pierce Chemical, Rockford, IL) wurde mit Rinderserumalbumin als Standard verwendet. Für 9 war der Balken „a", die gesamte, durchschnittliche, bezüglich des Hintergrunds korrigierte Fluoreszenzablesung pro Vertiefung, 670 Einheiten. Ausgehend von einer getrennten Platte betrug das durchschnittliche gesamte zelluläre Protein pro Vertiefung zum Transfektionszeitpunkt (48 h) etwa 88,4 μg/Vertiefung, was 7,6 Fluoreszenzeinheiten pro μg gesamtes zelluläres Protein in einem Volumen von 0,5 ml für die Experimente in Platten mit 24 Vertiefungen ergibt. In 10 repräsentieren die Daten für den Balken „a" (Experiment in 96 Vertiefungen) eine durchschnittliche, bezüglich des Hintergrunds korrigierte EGFP-Fluoreszenz von etwa 420 Einheiten pro Vertiefung mit einer durchschnittlichen gesamten zellulären Proteinkonzentration von 27 μg pro Vertiefung, was 15,5 Fluoreszenzeinheiten pro μg von gesamtem zellulärem Protein in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml ergibt. In 11 (Experiment in 96 Vertiefungen) entsprach der Balken (a), Fluoreszenzablesung, 103 Fluoreszenzeinheiten pro μg zelluläres Protein.
Um eine intraperitoneale Abgabe im Modell nachzuempfinden (Daten in 11 und 12), wurde die Transfektion ausgeführt, indem zuerst 50 μl einer konzentrierten zellfreien Spülungsflüssigkeit aus der Bauchfellhöhle von Tumor tragenden SCID-Mäusen (Beispiel 13) zu jeder abgesaugten Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit OVCAR-3-Zellen, die, wie oben beschrieben, kultiviert worden waren, hinzugegeben wurden. Zu jeder Vertiefung wurden 50 μl einer N-C12-DOPE/DOPC-Liposom-DNA-Formulierung, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden ist und resultierend in einer endgültigen Lipidkonzentration von etwa 10 mM und einer endgültigen eingekapselten DNA-Konzentration von etwa 7–14 μg/ml (Gesamt-DNA von 67 μg/ml), hinzugegeben. Inkubationen wurden ausgeführt, wie oben beschrieben. In diesem Falle wurde die peritoneale Spülungsflüssigkeit auf näherungsweise Serumkonzentrationen von Ca²⁺ und Mg²⁺ (1,2 mM bzw. 0,8 mM) durch Zugabe einer konzentrierten Stammlösung eingestellt. Auch die liposomale DNA-Lösung wurde auf die gleichen Konzentrationen von Ca²⁺ und Mg²⁺ durch Zugabe der konzentrierten Stammlösung unmittelbar vor der Zugabe der Liposomen zu den Zellen eingestellt.
Die Daten in den 8 und 9 zeigen, dass die Formulierung von NC12-DOPE/DOPC (70/30)-Liposomen, welche Spermin-kondensierte Plasmid-DNA einkapseln, bei der Transfektion von OVCAR-3-Zellen aktiv war. Die Daten zeigen, dass die Aktivität von dem Vorhandensein des Spermin-Kondensationsmittels und von der Einkapselung der Plasmid-DNA innerhalb der Liposome abhängig war. Die Daten in 10 zeigen wieder, dass die Transfektionsaktivität mit Lipid-eingekapselter DNA und nicht mit freier, extern vorliegender DNA assoziiert ist. Die Daten in den 11 und 12 zeigen, dass eine Transfektion auch in Gegenwart der potentiellen interferierenden Substanzen (z. B. Serumproteine), die an dem intraperitonealen Ort der OVCAR-3-Tumore gefunden werden, stattfinden kann.
Beispiel 12 – Sedimentation von Plasmid-DNA und Lipid-Partikeln:
Um die Transfektionsaktivität der eingekapselten Plasmid-DNA zu zeigen, war es erforderlich, freie Plasmid-DNA von in Liposomen eingekapselter DNA zu trennen. Es wurde das folgende Herstellungsverfahren eingesetzt. Liposomen, die durch Sedimentation, um externe DNA zu entfernen, hergestellt worden sind, wurden in den Experimenten verwendet, deren Ergebnisse in 10 gezeigt sind. Für Sedimentationsexperimente wurden N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen-Proben durch das Verfahren von Beispiel 3 mit Spermin hergestellt mit der Ausnahme, dass 200 mM Sucrose in den LSB mit aufgenommen wurde. An der Kopfgruppe markiertes Lissamin-Rhodamin B-phosphatidylethanolamin (Rh-PE) wurde auch als eine Lipidsonde in einer Konzentration von 10 μg/ml zugegeben. Ein 500 μl-Aliquot der Präparation wurde dann bei 16000 × g 3 h zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde das Pellet in HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ resuspendiert. Die Suspension wurde bei 16000 × g 3 h zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 μl HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ resuspendiert. Aliquots von 50 μl von jeder Fraktion wurden für einen DNase I-Verdau herangezogen (Beispiel 9). Nach Phenol/CHCl₃-Extraktion und Ethanol-Präzipitation wurde die Plasmid-DNA in jedem Aliquot durch den PicoGreen-Assay gemessen (Beispiel 10) und verwendet, um den Prozentsatz von geschütztem Plasmid und den Prozentsatz von gesamter Plasmid-DNA in jeder Fraktion zu berechnen.
Für eine Messung der Verteilung von Lipiden wurde ein 40 μl-Aliquot von jeder Fraktion in 0,2% C₁₂E₈ in einem Gesamtvolumen von 2 ml gelöst und die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 560 nm mit einem 550 ± 20 nm-Bandpassfilter (Melles Griot, Irvine, CA) und einer Emissionswellenlänge von 590 nm überwacht. Als Kontrolle wurden leere N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposome hergestellt, wie oben. Nach einer Dialyse wurden 100 μg EGFP-Plasmid zu 500 μl der Probe hinzugegeben. Die Probe wurde dann zentrifugiert und hinsichtlich Lipiden und Plasmid-DNA quantifiziert.
Näherungsweise 80% von dem Lipid pelletierten unter diesen Bedingungen, während nur etwa 14% der gesamten DNA pelletierten. Die Transfektionsaktivität des pelletierten Materials ist in 10 gezeigt. Die Transfektionsaktivität war klar mit dem Lipidpellet, d. h. mit der in Liposomen eingekapselten DNA, assoziiert.
Beispiel 13 – Spülungsflüssigkeit:
Um die Wirkung der intraperitonealen Proteine auf die Transfektionsaktivität der hier beschriebenen Präparationen zu testen, wurde eine Spülungsflüssigkeit hergestellt, wie nachfolgend beschrieben. Eine zellfreie 6 ml HBSS-Spülung wurde von einer SCID-Maus 7 Wochen nach Injektion von OVCAR-3-Zellen genommen und wurde mittels einer Zentrifugationsaufkonzentrierungsvorrichtung („spin concentrator”) mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 10.000 auf 1 ml aufkonzentriert. Die Protein-Rückgewinnung beträgt etwa 60%. Diese Flüssigkeit, welche etwa 10 mg/ml Protein in HBSS umfasst, wurde mit Ca²⁺ und Mg²⁺ bis innerhalb des normalen Serumbereichs ergänzt, zu kultivierten OVCAR-3-Zellen hinzugesetzt und in einem gleichen Volumen mit Liposomen in HBSS mit der gleichen Ca/Mg-Konzentration sanft gemischt, um eine endgültige Lipidkonzentration von 10 mM zu erhalten.
Die Ergebnisse von diesen Transfektionsexperimenten sind in den 11 und 12 gezeigt. Trotz der bekannten inhibitorischen Wirkungen von Serumproteinen auf die Transfektionseffizienz blieb unter diesen Bedingungen bei Verwendung der Formulierung, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt worden ist, substantielle Aktivität erhalten.
Beispiel 14 – Liposom-Beladungseffizienz:

Die Effizienz der Beladung von Liposomen unter Verwendung eines Verfahrens unter Verwendung von vorab kondensierter DNA wurde mit dem hier beschriebenen Verfahren verglichen. Liposome wurden hergestellt, wie von Ibanez et al., Biochem. Cell Biol., 74: 633–643 (1996), beschrieben. pEGFP-Plasmid-DNA wurde in einer Konzentration von 66 μg/ml in TS-Puffer (10 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7,0) gelöst. 2 ml von dieser Lösung wurden mit 2 ml 23 mM Spermidin in TS-Puffer gemischt, um die DNA vorzukondensieren, was eine sehr trübe Lösung ergab. Diese wurde über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde eine Gesamtmenge von 9 μmol Lipid in 1 ml Diethylether gelöst. Dazu wurden 330 μl der DNA- und Spermidin-Lösung unter Vortexen zugesetzt. Die Mischung wurde dann unverzüglich dreimal jeweils 5 s beschallt (Laboratory Supply sonicator #G112SOI). Der Diethylether wurde dann unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 37°C entfernt, um Liposome zu bilden. Vier derartige Proben wurden für jede Lipidzusammensetzung hergestellt. Die Liposome wurden bei 200000 × g 30 min pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und 500 μl mehr TS-Puffer zugegeben und die Zentrifugation wiederholt. Nach drei Gesamtzyklen wurden die Liposome durch MF-Membranen mit 0,45 μm-Poren extrudiert. Liposome wurden zur Bestimmung der Einkapselung an diesem Punkt verwendet oder ein Teil von diesen wurde gegen „Hanks balanced salt solution" ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ dialysiert. Zum Vergleich wurden auch Liposome hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die DNA-Einkapselung wurde gemessen, wie in den Beispielen 9 und 10 beschrieben. Alle Verdaue erfolgten für 6 h. Die Lipid-Konzentration wurde durch HPLC gemessen. Alle Komponenten außer Cholesterol wurden unter Verwendung einer Waters-Sherisorb-Siliciumdioxid-Säule (3 μm) mit einer mobilen Phase aus Acetonitril:Methanol:H₂SO₄, 100:3:0,05, quantifiziert und anhand von UV-Absorption detektiert. Cholesterol wurde an einer Phenomenex Luna-C18-Säule (5 μm) mit einer mobilen Phase von 96:4 Methanol:Wasser gemessen und durch einen elastische Lichtstreuungs-Detektor detektiert. Die getesteten Lipidzusammensetzungen sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Tabelle 1 DNA/Lipid-Verhältnis: (μg DNA/μmol gesamtes Lipid)*

Formulierung	Vor Verdau	Nach Verdau

Literaturwerte:**
EPC:CHOL (1:1)	1,00
EPC:Hirn-PS:CHOL (4:1:5)	2,87
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	2,64
EPC:Cardiolipin:CHOL (5:1:4)	2,53

Niedriger Salzgehalt „Low Salt" (10 mM Tris):
EPC:CHOL (1:1)	0,52	0,07
EPC:Hirn-PS:CHOL (4:1:5)	0,70	0,01
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	0,48	0,04
EPC:Cardiolipin:CHOL (5:1:4)	0,78	0,09

Isotonische Salzlösung nach Herstellung:
EPC:CHOL (1:1)	0,42	0,10
EPC:Hirn-PS:CHOL (4:1:5)	0,78	0,08
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	1,63	0,16
EPC:Cardiolipin:CHOL (5:1:4)	0,65	0,20
TLC 70:30-Formulierung	8,53	0,59

* Lipid-Rückgewinnung, durch HPLC abgeschätzt. DNA quantifiziert durch Extraktion und PicoGreen-Assay.
** Ibanez, M., Gariglio, P., Chavez, P., Santiago, C.W. und Baeza, I. (1996) „Spermidinecondensed DNA and cone shaped lipids improve delivery and expression of exogenous DNA transfer by liposomes", Biochem. Cell Biol., 74: 633–643 (1996).

Durch Kondensation von DNA innerhalb einer Emulsion, wie hier beschrieben, hergestellte Liposome führten zu viel höheren DNA:Lipid-Verhältnissen als Liposome, die mit vorab kondensierter DNA hergestellt wurden.
Beispiel 15 – Bestimmung der Lamellarität von Liposomen:
Aus 70:30 N-C12-DOPE/DOPC bestehende und Plasmid-DNA einkapselnde Liposome wurden hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben, und wie in Beispiel 12 sedimentiert und gewaschen. Diese Liposome enthielten auch eine NBD-Sonde in einer Konzentration von 0,5 mol-% des gesamten Lipids. Liposome wurden auf 80 μM Gesamt-Lipidkonzentration in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in einer gerührten Fluorometer-Küvette verdünnt. Die NBD-Fluoreszenz wurde mit Anregung bei 450 nm und Emission bei 530 nm gemessen. Eine Endkonzentration von 20 mM Natriumdithionit wurde in die Küvette mit den Liposomen eingespritzt, um exponierte NBD-Sonde zu reduzieren. 13 zeigt, dass etwa 50–55% des NBD-Signals verschwanden, was anzeigt, dass die Liposomen in der Präparation primär unilamellar waren, d. h. etwa die Hälfte der Lipid-Sonden war dem Membranen nicht durchdringenden Reduktionsmittel, Natriumdithionit, ausgesetzt.
Beispiel 16 – Transfektion eines subkutanen humanen Tumors in SCID-Mäusen durch intratumorale Injektion.
Humane OVCAR-3-Zellen (2 × 10⁶) wurden subkutan in SCID-Mäuse injiziert und man ließ sie sich mehrere Wochen vermehren, bis ein durchschnittlicher Durchmesser von etwa 4–7 mm erreicht war.
Spermin, das pEGFP-C1-Plasmid und 70 mol-% N-C12-DOPE und 30 mol-% DOPC enthaltende Liposome wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Die liposomalen Membranen enthielten auch 0,5 mol-% Rhodamin-PE als fluoreszierenden Liposomen-Marker.
0,11 ml einer Liposomen-Lösung in „Hanks Balanced Salt Solution" ohne Calcium oder Magnesium (HBSS) mit einer Gesamt-Lipidkonzentration von etwa 40 mM wurde direkt in das Zentrum der Tumore nach Einstellung von Ca²⁺ – und Mg²⁺-Konzentrationen auf 1,2 bzw. 0,8 mM injiziert. Einen Tag später wurde 0,11 ml von 20 mM Natriumbutyrat in HBSS an den gleichen Stellen injiziert. Nach 24 h wurden Tumore herausgeschnitten und eingefroren. Später wurden 14–30 μm dicke Schnitte an einem Kryostat-Instrument bei –20°C erhalten und gefroren auf Glas-Deckplättchen aufgebracht und mit einem Deckgläschen gesichert. Gefrorene Tumorproben wurden in O.C.T.-Einbettungsmediums eingedeckt.
Die Transgen-Expression des pEGFP-C1-Plasmids wurde durch konfokale Mikroskopie von 20 μm-Kryoschnitten des fixierten gefrorenen Gewebes bestimmt. Die gefrorenen Schnitte wurden unter Verwendung des konfokalen Olympus-BX50/Biorad MRC1000-Mikroskops mit einem Argon/Krypton-Laser (Anr. 488 nm, Em. 515 für EGFP; Anr. 568, Em. 585 für Rhodamin) untersucht. Bereiche von Gewebeschnitten wurden mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Es wurden keine Bildverstärkungen verwendet, aber es wurde eine Farbskala für die Figurenerstellung angewendet. 14 zeigt ein Paar von fluoreszierenden Bildern von einem Gewebeschnitt, der aus einem mit dem pEGFP-C1-Plasmid behandelten Tumor gewonnen worden war. Das untere Feld zeigt rote Fluoreszenz von den Rhodamin-markierten Liposomen. Das sehr hohe Lipid-Signal (gelb) legt nahe, dass dieser Schnitt nahe der Bildfläche der Liposomen-Injektion lag. Das obere Feld zeigt grüne Fluoreszenz aufgrund der Transgen-Expression. Das Signal von dem exprimierten Plasmid liegt nahe bei, fällt aber nicht zusammen mit dem Lipidsignal und scheint eine wahre Expression des Plasmids in dem Tumor zu repräsentieren. 15 zeigt ein anderes Paar von fluoreszierenden Bildern von einem unterschiedlichen Tumorschnitt mit exprimiertem EGFP. Ein fluoreszierendes Bildpaar von einem Kryoschnitt von Kontroll-Tumorgewebe ist in 16 gezeigt. Schwache, diffuse grüne Fluoreszenz, die in dem Gewebe inhärent vorhanden ist, ist in dem oberen Feld sichtbar, es wurde aber in keinem Kontroll-Gewebeschnitt irgendeine Fläche von intensiver Fluoreszenz gefunden. Es gab in keinem Kontroll-Tumorschnitt irgendeine rote Fluoreszenz.
Beispiel 17 – Transfektion von Mäuse-Muskel in vivo
Die Transfektionsaktivität von NC12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomen, welche das pZeoSVLacZ-Plasmid einkapseln, wurde in vivo im Mäuse-Unterschenkelmuskel getestet. Die Liposomen wurden hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Weibliche DBA-Mäuse, die unter Standardbedingungen gehalten wurden, wurden für dieses Experiment verwendet. 50 μl Liposomen, welche das pZeoSVLacZ-Plasmid enthielten, wurden direkt in einen hinteren Beinmuskel am Tag eins injiziert. Der Injektionsort lag nahe der Vorderseite des Oberschenkels des Beins. Das gegenüberliegende Bein erhielt entweder 50 μl Liposome mit pEGFP-C1-Plasmid oder keine Behandlung. Am Tag 2 wurden 50 μl 20 mM Natriumbutyrat in HBSS in die mit Liposom behandelten Beine injiziert. Die Mäuse wurden am Tag 3 getötet und der Beinmuskel als vier Abschnitte herauspräpariert: vorderer Unterschenkel, hinterer Unterschenkel, vorderer Oberschenkel und hinterer Oberschenkel. Eine Hälfte des Gewebes von jedem Abschnitt wurde unverzüglich in flüssigem Propan eingefroren, während die andere Hälfte in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 30% Sucrose-Gefrierschutzmittel behandelt, dann in Propan schockgefroren wurde.
Die Transgen-Expression des pZeoSVLacZ-Plasmids, das über die N12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposome abgegeben worden war, wurde unter Verwendung des lumineszierenden β-gal-Kits von Clontech bestimmt. Unfixierter Muskel wurde aufgetaut, in Stücke geschnitten und, wie folgt, homogenisiert. 15 ml Lysepuffer (9,15 ml K₂HPO₄, 0,85 ml KH₂PO₄, 20 μl Triton X100, 10 μl DTT) wurden zu jedem 1 mg feuchtem Gewebe zugegeben und 5 min mit der Hand homogenisiert, dann bei Raumtemperatur 20 min inkubiert. Die Proben wurden dann 2 min bei 14000 Upm zentrifugiert, um Geweberückstände zu pelletieren. Aliquots der Überstände wurden auf β-Galactosidase-Aktivität untersucht, wie von Clontech instruiert. Licht-Ablesungen wurden nach 60 min unter Verwendung eines Berthold-Plattenluminometers gemessen. Es wurden Durchschnittswerte der Ablesungen für unterschiedliche Muskelschnitte der gleichen Art ermittelt. Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt. Eine signifikante Zunahme der β-Galactosidase-Aktivität gegenüber der Kontrolle wurde in Muskelschnitten von dem vorderen Oberschenkel gefunden. Geringfügige Anstiege wurden auch im hinteren Unterschenkel- und hinteren Oberschenkelgewebe festgestellt.
Diese Ergebnisse zeigen die in vivo-Transfektion und Transgen-Expression von pZeoSVLacZ-Plasmiden, wenn sie an Mäuse-Muskel unter Verwendung des N12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposomenvektors abgegeben werden.
Beispiel 18 – Vergleich einer Transfektion mit liposomaler kondensierter DNA und kationischem Lipoplex.
Herstellung von kationischen Lipoplexen:
Komplexe von kationischen Lipiden und Helfer-Lipiden mit Plasmid-DNA wurden kurz vor der Verwendung hergestellt. Lipofectin wurde von Gibco BRL (Grand Island, N.Y.) erworben. Für Lipofectin wurde das Lipid allein in serumfreiem Medium für etwa 45 min vor der Komplexierung mit DNA inkubiert, wie vom Hersteller (Invitrogen) vorgeschlagen. Gleiche Volumen von 4 μg/ml DNA und 40 μg/ml Lipid oder gleiche Volumen von 20 μg/ml DNA und 200 μg/ml Lipid, alle in serumfreiem RPMI 1640-Medium, wurden gemischt und man ließ sie etwa 10–15 min vor einer Zugabe zu Vertiefungen der Gewebekulturplatten inkubieren. Ca²⁺ und Mg²⁺ wurden auf eine Endkonzentration von 1,2 mM bzw. 0,8 mM durch Zugabe einer konzentrierten Stammlösung unmittelbar vor der Zugabe der Lipoplexe zu den Zellen eingestellt. Das Verhältnis von Lipid/DNA, das für Lipofectin verwendet wurde, basierte auf einer Optimierung unter Vergleich von mehreren Verhältnissen.
DC-Cholesterol/DOPE (4/6)-Komplexe wurden im Wesentlichen, wie zuvor beschrieben (Muldoon et al., Biotechniques 22, 162–167 (1997)), hergestellt und innerhalb von 15 min verwendet. Das optimierte DNA/Lipid-Verhältnis wurde in allen Experimenten verwendet, d. h. 4 μg/ml DNA wurde mit einem gleichen Volumen von 20 μg/ml Lipid gemischt oder 20 μg/ml DNA wurde mit einem gleichen Volumen von 100 μg/ml Lipid gemischt.
Alle anderen Komplexe wurden hergestellt unter Verwendung eines Satzes von kationischen Lipiden oder Lipidmischungen von einem einzigen Hersteller (Invitrogen). Diese wurden, wie vom Hersteller vorgeschlagen, in der 1x-Konzentration und in den vorgeschlagenen Lipid/DNA-Verhältnissen hergestellt. Transfektionsassays wurden ausgeführt, wie in Beispiel 11 beschrieben.
Vergleich mit kationischen Lipoplexen:
Die pelletierten Liposome, die frei von externer DNA waren, wurden für einen direkten Transfektionsvergleich mit kationischen Lipoplexen bei gleichen DNA-Konzentrationen verwendet. Diese Daten sind in Tabelle 2 bezogen auf die Liposomen-Behandlung (alle Daten nach Inkubation in Natriumbutyrat, einem nicht-toxischen Aktivator der Transgen-Expression (Tang et al., Human Gene Therapy, 8: 2117–2124 (1997); Wheeler et al., Biochim. Biophys. Acta 1280 (1996); Gruner et al., Biochem. 24: 2833–2842 (1984)) und bei physiologischen Ca²⁺- und Mg² ⁺-Konzentrationen aufgeführt; alle Daten wurden in Hinblick auf die gesamte intrazelluläre Esteraseaktivität normalisiert). In Tabelle 2 werden die Zelllebensfähigkeit und die Transfektion für die N-C12-DOPE/DOPC-Liposome als 1,0 angenommen, d. h. Zahlen über 1,0 repräsentieren den Faktor, um welchen einer von diesen Parametern in dem Testsystem höher ist. Die Transfektionsaktivität der N-C12-DOPE/DOPC (70:30)-Liposome lag im Allgemeinen im Bereich von jener, die für kationische Lipoplexe unter diesen Bedingungen gefunden wird. Einige Lipolexe ergaben eine beträchtlich geringere und einige eine beträchtlich höhere Aktivität. Lipoplexe, welche 3β[N-(Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DC-chol/DOPE) enthielten, waren besonders aktiv. Jedoch waren sie wie alle kationischen Lipoplexe beträchtlich toxischer als die Liposome für die jeweiligen Zellen, die in diesen Experimenten verwendet wurden, speziell bei der höheren Konzentration. Dies konnte anhand der geringeren Calceinblau-Fluoreszenz nach Behandlung mit den Lipoplexen (Tabelle 2, Daten) wie auch der mikroskopischen Beobachtung von abgerundeten und aufgebrochenen Zellen nach einer Behandlung (Daten nicht gezeigt) beobachtet werden. In mehreren Fällen nahm die Transfektionseffizienz von kationischen Lipoplexen tatsächlich bezogen auf Liposome bei der höheren Konzentration ab, wahrscheinlich als ein Ergebnis von deren Toxizität. Mit der in Liposomen eingekapselten DNA wurde keine Toxizität beobachtet. Interessanterweise bewirkte eine Behandlung mit den Liposomen gewöhnlich eine Zunahme der endgültigen Calceinblau-Fluoreszenz zwischen 10 und 30 Prozent, möglicherweise als ein Ergebnis eines Schutzes vor den Wirkungen der Inkubation in serumfreiem Medium.
Die Bedeutung der relativ geringen Toxizität dieses liposomalen Plasmid-DNA-Abgabesystems ist in den Gewebekultursystemen nicht vollständig offensichtlich, da die Transfektionseffizienz bei den relativ geringen Konzentrationen von DNA, welche in den obigen Experimenten verwendet werden, eine Sättigung erreicht. Jedoch wird erwartet, dass die Situation in vivo sehr stark verschieden ist. Der große Überschuss von nichtspezifischen Bindungsstellen in vivo könnte die Verwendung von hohen Konzentrationen von DNA und/oder eine Mehrzahl von Injektionen für eine effiziente Expression in den Zielzellen erforderlich machen. Es könnte eine Grenze für die Verwendung von kationischen Lipoplexen in dieser Situation aufgrund von deren Toxizität geben.

Ovcar-3-Zellen wurden mit gewaschenen liposomalen Pellets (wie in 10) oder Lipid-Komplexen mit gleichen Mengen von pEGFP-C1-Plasmid-DNA 3 h in serumfreiem Medium inkubiert. Alle Transfektionsprozeduren waren, wie in Beispiel 11 beschrieben, und umfassen eine Einstellung von Ca²⁺- und Mg² ⁺-Konzentrationen auf 1,2 bzw. 0,8 mM. Tabelle 2

Lipid/ Mischurig^a	relatives Zellüberleben 2 μg/ml DNA^b	Std. abw.	relative Transfektion 2 μg/ml DNA^b,c	Std. abw.	relatives Zellüberleben 10 μg/ml DNA^b	Std. abw.	relative Transfektion 10 μg/ml DNA^b,c	Std. abw.
1	0,631	0,078	0,619	0,203	0,313	0,011	0,942	0,222
2	0,651	0,084	0,987	0,216	0,401	0,009	0,794	0,207
3	0,639	0,059	0,833	0,272	0,352	0,006	1,186	0,267
4	0,739	0,078	1,655	0,382	0,297	0,017	1,327	0,395
5	0,618	0,070	0,096	0,064	0,460	0,011	0,091	0,024
6	0,704	0,077	1,050	0,224	0,366	0,008	1,182	0,266
7	0,660	0,069	0,096	0,030	0,431	0,008	0,802	0,231
8 (Lipofectin)	0,708	0,089	1,651	0,381	0,139	0,014	0,325	0,077
9 (DC-chol/DOPE)	1,095	0,101	4,930	0,991	0,383	0,032	2,451	0,627

^a Kationisches Lipid-Komplexe wurden mit den folgenden Lipiden hergestellt: #1 – 1:1-Mischung von Tris-((2-glutaroyl-4-amino-N-dioctadecylamin)-4'-(2,5-diaminopentanoyl-(2'',5''-diaminopropylethyl))amin, Trifluoracetat und 2-Amino-(2',2'-dimethyl)ethyl-methylphosphonsäure-O-octadecyl-(1'-heptadecyl)ester, Trifluoracetat (Pfx-1); #2 – 2,5-Diaminopentanoyl-glycyl-glycyl-N-octadecyl-(1'-heptadecyl)amid, Trifluoracetat (Pfx-2); #3 – 1:1-Mischung von 2,5-Diaminopentanoyl-(2',3'-di-3-aminopropyl)-2-aminoacetyl-2-aminoacetyl-N-octadecyl-(1'-heptadecyl)amid, Trifluoracetat und DOPE (Pfx-3); #4 – 1:1-Mischung von 2-Amino-(2',2'-dimethyl)ethylmethylphosphonsäure-O-octadecyl-(1'-heptadecyl)ester, Trifluoracetat und 2,5-Diaminopentanoyl-2-aminoacetyl-N-dioctadecylamid, Trifluorid (Pfx-4); #5 – 1:1-Mischung von 2,5-Diaminopentanoyl-(2,5-di-3-aminopropyl)-glutaroyl-N-octadecyl-(1'-heptadecyl)amid, Trifluoracetat und 2,5-Diaminopentanoyl-(2,2,5,5-tetra-3-aminopropyl)-glycyl-N-dioctadecylamin, Trifluoracetat (Pfx-5); # 6 – 1:1-Mischung von 2,5-Diaminopentanoyl-(2,5-di-3-aminopropyl)-1,2-diaminoethyl-O-octadecyl-(1'-heptadecyl)-carbaminsäure, Trifluorid und DOPE (Pfx-7); # 7 – Bis-(2,5-diaminopentanoyl-(2,5-di-3-aminopropyl)-cystyl-N-dioctadecylamin)disulfid, Trifluoracetat (Pfx-8); # 8 – Lipofectin; # 9 – DC-Cholesterol/DOPE 4/6.
^b Die Daten sind ausgedrückt bezogen auf die N-Acyl-PE enthaltenden Liposome, welche als 1,0 angenommen werden, d. h. die Zahlen repräsentieren den Faktor, um welchen jeder Lipoplex mehr oder weniger toxisch oder aktiv ist. Daten aus mehr als einer Reihe von Experimenten wurden unter Verwendung von Lipid #2 als Standard verglichen.
^c Die Transfektionseffizienz wurde durch EGFP-Fluoreszenz wie in 11 gemessen und hinsichtlich der gesamten Zell-Esteraseaktivität, wie sie sich in der gesamten Fluoreszenz von Calceinblau wiederspiegelt, korrigiert (siehe Beispiel 11).

Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht verstehen, dass die Erfindung gut angepasst ist, um die Gegenstände auszuführen und die erwähnten Ziele und Vorteile wie auch jene, die darin inhärent vorliegen, zu erhalten. Die Verbindungen, Zusammensetzungen, Verfahren, Prozeduren und Techniken, die hier beschrieben werden, werden als repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen aufgeführt oder sollen exemplarisch sein und sind nicht als Einschränkungen bezüglich des Umfangs der Erfindung gedacht. Veränderungen darin und andere Verwendungen werden den Fachleuten auf diesem Gebiet einfallen, die vom Geist der beigefügten Ansprüche umfasst werden.

Claims

Verfahren zum Einkapseln eines bioaktiven Komplexes in einem Liposom, welches die Schritte umfasst: (a) Lösen mindestens eines amphipathischen Lipids in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln; (b) Vereinigen einer ersten wässrigen Suspension, die eine Nukleinsäure umfasst, mit der Lipid-haltigen organischen Lösung von Schritt (a), um eine Emulsion zu bilden, welche die Nukleinsäure in dem Lipid umfasst; (c) Zugabe einer zweiten wässrigen Suspension, die ein Polykation umfasst, zu der Emulsion von Schritt (b); (d) Inkubieren der Emulsion von Schritt (c), um zu ermöglichen, dass das Polykation mit der Nukleinsäure in Kontakt tritt, wodurch ein Komplex der Nukleinsäure mit dem Polykation innerhalb der Lipid-stabilisierten Wassertröpfchen gebildet wird; wobei der Durchmesser des Komplexes nicht größer ist als der Durchmesser des Tröpfchens; und (e) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Suspension von Schritt (d), um Liposome zu bilden, welche die komplexierte Nukleinsäure und das Lipid umfassen.
Verfahren zum Einkapseln eines bioaktiven Komplexes in einem Liposom, welches die Schritte umfasst: (a) Lösen mindestens eines amphipathischen Lipids in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln; (b) Vereinigen einer ersten wässrigen Suspension, die ein Polykation umfasst, mit der Lipid-haltigen organischen Lösung von Schritt (a), um eine Emulsion zu bilden, welche das Polykation und das Lipid umfasst; (c) Zugabe einer zweiten wässrigen Suspension, die eine Nukleinsäure umfasst, zu der Emulsion von Schritt (b); (d) Inkubieren der Emulsion von Schritt (c), um zu ermöglichen, dass das Polykation mit der Nukleinsäure in Kontakt tritt, wodurch ein Komplex der Nukleinsäure mit dem Polykation innerhalb der Lipid-stabilisierten Wassertröpfchen gebildet wird; wobei der Durchmesser des Komplexes nicht größer ist als der Durchmesser des Tröpfchens; und (e) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Suspension von Schritt (d), um Liposome zu bilden, welche die komplexierte Nukleinsäure und das Lipid umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Nukleinsäure DNA ist.