JP2002518313A - カチオン性両親媒性ミセル複合体 - Google Patents
カチオン性両親媒性ミセル複合体Info
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Abstract
(57)【要約】
標的哺乳動物細胞中への外来遺伝子および他の生物活性分子の効果的な導入は、当業者が未だに直面している課題である。例えば遺伝子治療は、患者の標的細胞へのトランスフェクションが成功することが必要である。本発明は、哺乳動物の標的細胞への生物活性分子の送達を促進する、カチオン性両親媒性化合物の新規なミセル複合体に関する。この新規なミセル複合体は、カチオン性両親媒性物質、生物活性分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体、および場合により共脂質からなる。本発明のさらなる面は、哺乳動物細胞への生物活性分子の送達を促進する方法における標的化物質の使用である。標的化物質は通常、特定の哺乳動物細胞を優先的に標的とするか、またはこれに結合する分子、ペプチド配列、または大きなタンパク質である。
Description
【０００１】 本発明は、哺乳動物の標的細胞への生物活性分子の送達（および／またはトラ
ンスフェクション）を促進する、カチオン性両親媒性化合物の新規なミセル複合
体に関する。さらに詳細には本発明は、これらのミセル複合体のユニークな性質
、並びに哺乳動物の所望の細胞への生物活性分子の送達を増強するためのカチオ
ン性両親媒性物質のミセルの製造方法と使用方法に関する。本発明の目標は、遺
伝子治療に使用できる新規な複合体を提供することである。本発明はまた、特定
の型の哺乳動物細胞への生物活性分子の送達を促進する標的化物質の使用に関す
る。
ンスフェクション）を促進する、カチオン性両親媒性化合物の新規なミセル複合
体に関する。さらに詳細には本発明は、これらのミセル複合体のユニークな性質
、並びに哺乳動物の所望の細胞への生物活性分子の送達を増強するためのカチオ
ン性両親媒性物質のミセルの製造方法と使用方法に関する。本発明の目標は、遺
伝子治療に使用できる新規な複合体を提供することである。本発明はまた、特定
の型の哺乳動物細胞への生物活性分子の送達を促進する標的化物質の使用に関す
る。
【０００２】 標的哺乳動物細胞中への外来遺伝子および他の生物活性分子の効果的な導入は
、当業者が未だに直面している課題である。遺伝子治療は、患者の標的細胞への
トランスフェクションが成功することが必要である。それ自体が実用上有用であ
るトランスフェクションは一般に、発現可能なポリヌクレオチド（例えば、遺伝
子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）を細胞中に導入するプロセスとして定義される
。このようにトランスフェクションされたコードポリヌクレオチドの発現が成功
すると、細胞内で正常タンパク質が産生される。目標は当然、異常な遺伝子が関
連する症状の矯正に至るに充分な発現を得ることである。
、当業者が未だに直面している課題である。遺伝子治療は、患者の標的細胞への
トランスフェクションが成功することが必要である。それ自体が実用上有用であ
るトランスフェクションは一般に、発現可能なポリヌクレオチド（例えば、遺伝
子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）を細胞中に導入するプロセスとして定義される
。このようにトランスフェクションされたコードポリヌクレオチドの発現が成功
すると、細胞内で正常タンパク質が産生される。目標は当然、異常な遺伝子が関
連する症状の矯正に至るに充分な発現を得ることである。
【０００３】 遺伝子治療の標的である疾患の例には、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ファブリ
ー病 、および筋ジストロフィーのような遺伝病を含む。代表的な後天性の標的
疾患は、（１）癌では−多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、卵巣癌および小細胞型
肺癌；（２）心臓血管症状では−進行性心不全、再狭窄、および血友病；および
（３）神経症状では−外傷性脳傷害がある。
ー病 、および筋ジストロフィーのような遺伝病を含む。代表的な後天性の標的
疾患は、（１）癌では−多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、卵巣癌および小細胞型
肺癌；（２）心臓血管症状では−進行性心不全、再狭窄、および血友病；および
（３）神経症状では−外傷性脳傷害がある。
【０００４】 一般的な致死性の遺伝子疾患である嚢胞性線維症は、遺伝子治療の標的である
疾患の具体例である。本疾患は、嚢胞性線維症膜貫通調節物質（cystic fibrosi
s transmembrane conductance regulator）（「ＣＦＴＲ」）として知られてい
るタンパク質をコードする遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異の存在によ
り引き起こされる。嚢胞性線維症は、慢性的喀痰産生、反復性感染および肺の破
壊を特徴とする（ボート，ティー・エフ（Boat, T.F.），マグローヒル社（McGr
aw-Hill, Inc.），１９８９，ｐ．２６４９−２６８０）。ＣＦＴＲ遺伝子の突
然変異がどのように臨床症状を引き起こすか正確には知られていないが（ウェル
シュ，エム・ジェイ（Welsh, M.J.）ら，Ｃｅｌｌ ７３：１２５１−１２５４
，１９９３）、不完全なＣｌ-分泌およびＮａ+吸収の上昇（ウェルシュ，エム・
ジェイ（Welsh, M.J.）ら，Ｃｅｌｌ ７３：１２５１−１２５４，１９９３；
クィントン，ピー・エム（Quinton, P.M.），ＦＡＳＥＢ Ｌｅｔｔ．４：２７
０９−２７１７，１９９０）が広範囲に記載されている。さらには、これらのイ
オン輸送における変化は、表面と腺上皮にわたる体液輸送の変化をもたらす（ジ
ャン，シー（Jiang, C.）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：４２４−４２７，１９
９３；ジャン，シー（Jiang, C.）ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（ロンドン），５
０１．３：６３７−６４７，１９９７；スミス，ジェイ・ジェイ（Smith, J.J.
）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：１１４８−１１５３，１９９３；
およびチャン，ワイ（Zhang, Y.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７０：Ｃ
１３２６−１３３５，１９９６）。気道表面液（ＡＳＬ）の水および塩含量に生
じたこれらの変化は、上皮細胞から分泌される殺菌性ペプチドの活性を減少させ
るか（スミス，ジェイ・ジェイ（Smith, J.J.），Ｃｅｌｌ，８５：２２９−２
３６，１９９６）、および／または粘液線毛クリアランスを障害し、従って反復
性肺感染と炎症を助長する。
疾患の具体例である。本疾患は、嚢胞性線維症膜貫通調節物質（cystic fibrosi
s transmembrane conductance regulator）（「ＣＦＴＲ」）として知られてい
るタンパク質をコードする遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異の存在によ
り引き起こされる。嚢胞性線維症は、慢性的喀痰産生、反復性感染および肺の破
壊を特徴とする（ボート，ティー・エフ（Boat, T.F.），マグローヒル社（McGr
aw-Hill, Inc.），１９８９，ｐ．２６４９−２６８０）。ＣＦＴＲ遺伝子の突
然変異がどのように臨床症状を引き起こすか正確には知られていないが（ウェル
シュ，エム・ジェイ（Welsh, M.J.）ら，Ｃｅｌｌ ７３：１２５１−１２５４
，１９９３）、不完全なＣｌ-分泌およびＮａ+吸収の上昇（ウェルシュ，エム・
ジェイ（Welsh, M.J.）ら，Ｃｅｌｌ ７３：１２５１−１２５４，１９９３；
クィントン，ピー・エム（Quinton, P.M.），ＦＡＳＥＢ Ｌｅｔｔ．４：２７
０９−２７１７，１９９０）が広範囲に記載されている。さらには、これらのイ
オン輸送における変化は、表面と腺上皮にわたる体液輸送の変化をもたらす（ジ
ャン，シー（Jiang, C.）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：４２４−４２７，１９
９３；ジャン，シー（Jiang, C.）ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（ロンドン），５
０１．３：６３７−６４７，１９９７；スミス，ジェイ・ジェイ（Smith, J.J.
）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：１１４８−１１５３，１９９３；
およびチャン，ワイ（Zhang, Y.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７０：Ｃ
１３２６−１３３５，１９９６）。気道表面液（ＡＳＬ）の水および塩含量に生
じたこれらの変化は、上皮細胞から分泌される殺菌性ペプチドの活性を減少させ
るか（スミス，ジェイ・ジェイ（Smith, J.J.），Ｃｅｌｌ，８５：２２９−２
３６，１９９６）、および／または粘液線毛クリアランスを障害し、従って反復
性肺感染と炎症を助長する。
【０００５】 粘膜下腺がＣＦ肺疾患の病態生理に寄与することを、いくつかの証拠が示唆し
ている。粘液線毛クリアランスの維持は、線毛運動、ＡＳＬ深度、およびムチン
含量の協調的調節を必要とする。ＡＳＬの量と組成は、上皮と粘膜下腺の両方に
より制御され、かつ細胞容量の推定値に基づくが、後者は粘膜分泌のより重要な
原因であると考えられる。最近の研究はまた、粘膜下腺の分泌細管の漿液細胞が
、ヒト気管支におけるＣＦＴＲ発現の支配的部位であること、および漿液細胞か
ら分泌される体液が、粘膜細胞により分泌されるムチンを流し出すことを示して
いる。粘膜下腺がＣＦ肺疾患の病態生理に寄与することを示唆する追加の証拠に
は、（１）ＣＦＴＲは、粘膜下腺の漿液細胞において支配的に発現されること（
エンゲルハート，ジェイ・エフ（Engelhardt, J.F.）ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
２：２４０−２４８，１９９２）、（２）ＣＦ患者からの気管粘膜下腺培養液は
、Ｃｌ-を分泌できないこと（フィンクバイナー，ダブリュー・イー（Finkbeine
r, W.E.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｌ−２０６−Ｌ−２１０，
１９９６；ヤマヤ，エム（Yamaya, M.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１
：Ｌ−４８５−Ｌ−４９０，１９９１；ヤマヤ，エム（Yamaya, M.）ら，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｌ−４９１−Ｌ−４９４，１９９１）、（３）非
ＣＦ被験者からの６０％を超える粘膜下腺培養液は、ベースライン分泌を示した
のに対して、ＣＦ患者からの培養液は、もっぱら体液を吸収したこと（ジャン，
シー（Jiang, C.）ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（ロンドン），５０１．３：６３
７−６４７，１９９７）、（４）粘膜下腺管の閉塞は、ＣＦ患者における最初の
肺症状であり、続いて著しい過形成と肥大が発現すること（オッペンハイマー，
イー・エイチ（Oppenheimer, E.H.）ら，ニューヨーク：Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９７５、ｐ．２４１−２７８）がある
。
ている。粘液線毛クリアランスの維持は、線毛運動、ＡＳＬ深度、およびムチン
含量の協調的調節を必要とする。ＡＳＬの量と組成は、上皮と粘膜下腺の両方に
より制御され、かつ細胞容量の推定値に基づくが、後者は粘膜分泌のより重要な
原因であると考えられる。最近の研究はまた、粘膜下腺の分泌細管の漿液細胞が
、ヒト気管支におけるＣＦＴＲ発現の支配的部位であること、および漿液細胞か
ら分泌される体液が、粘膜細胞により分泌されるムチンを流し出すことを示して
いる。粘膜下腺がＣＦ肺疾患の病態生理に寄与することを示唆する追加の証拠に
は、（１）ＣＦＴＲは、粘膜下腺の漿液細胞において支配的に発現されること（
エンゲルハート，ジェイ・エフ（Engelhardt, J.F.）ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
２：２４０−２４８，１９９２）、（２）ＣＦ患者からの気管粘膜下腺培養液は
、Ｃｌ-を分泌できないこと（フィンクバイナー，ダブリュー・イー（Finkbeine
r, W.E.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｌ−２０６−Ｌ−２１０，
１９９６；ヤマヤ，エム（Yamaya, M.）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１
：Ｌ−４８５−Ｌ−４９０，１９９１；ヤマヤ，エム（Yamaya, M.）ら，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｌ−４９１−Ｌ−４９４，１９９１）、（３）非
ＣＦ被験者からの６０％を超える粘膜下腺培養液は、ベースライン分泌を示した
のに対して、ＣＦ患者からの培養液は、もっぱら体液を吸収したこと（ジャン，
シー（Jiang, C.）ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（ロンドン），５０１．３：６３
７−６４７，１９９７）、（４）粘膜下腺管の閉塞は、ＣＦ患者における最初の
肺症状であり、続いて著しい過形成と肥大が発現すること（オッペンハイマー，
イー・エイチ（Oppenheimer, E.H.）ら，ニューヨーク：Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９７５、ｐ．２４１−２７８）がある
。
【０００６】 ＣＦの病態発生への粘膜下腺の関与を示唆する証拠は、ＣＦ肺疾患のための効
果的な遺伝子治療はこれらの構造物を標的にすべきことを、示唆している。ＣＦ
ＴＲ遺伝子を胚上皮に運ぶために多くの試みがするが、粘膜下腺細胞にはほとん
ど関心が払われなかった。さらに、アデノウイルスベクターの気管内投与後に低
レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現が、粘膜下腺において検出可能であったこと
が証明されているが（ピレウスキ，ジェイ・エム（Pilewski, J.M.）ら，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｌ６５７−６６５，１９９５）、腺トランスフェ
クションレベルは、胚上皮よりも低く、気道内腔からの距離に比例して著しく低
下した。
果的な遺伝子治療はこれらの構造物を標的にすべきことを、示唆している。ＣＦ
ＴＲ遺伝子を胚上皮に運ぶために多くの試みがするが、粘膜下腺細胞にはほとん
ど関心が払われなかった。さらに、アデノウイルスベクターの気管内投与後に低
レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現が、粘膜下腺において検出可能であったこと
が証明されているが（ピレウスキ，ジェイ・エム（Pilewski, J.M.）ら，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｌ６５７−６６５，１９９５）、腺トランスフェ
クションレベルは、胚上皮よりも低く、気道内腔からの距離に比例して著しく低
下した。
【０００７】 多くの型の生物活性分子の効果的な導入は困難であり、また開発されてきた全
ての方法が、適切な量の所望の分子を標的細胞中へ効率的に送達できたわけでは
ない。生物活性分子の細胞内送達のために標的とされる無損傷組織により提示さ
れる複雑な構造、挙動、および環境は、しばしばこういった送達を実質的に妨害
する。ウイルスベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ、脂質送達ビヒクル、
および裸のＤＮＡを含む多くの方法が、哺乳動物の細胞中にＤＮＡを送達するた
めに利用されている。現在までに、インビトロ、エクスビボ、およびインビボの
ＤＮＡの送達が、上述の方法の多くを使用して証明されている。
ての方法が、適切な量の所望の分子を標的細胞中へ効率的に送達できたわけでは
ない。生物活性分子の細胞内送達のために標的とされる無損傷組織により提示さ
れる複雑な構造、挙動、および環境は、しばしばこういった送達を実質的に妨害
する。ウイルスベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ、脂質送達ビヒクル、
および裸のＤＮＡを含む多くの方法が、哺乳動物の細胞中にＤＮＡを送達するた
めに利用されている。現在までに、インビトロ、エクスビボ、およびインビボの
ＤＮＡの送達が、上述の方法の多くを使用して証明されている。
【０００８】 ウイルスのトランスフェクションは比較的効率的であるが、宿主の免疫応答は
しばしば重大な問題となる。具体的には、ウイルスタンパク質は、細胞傷害性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）を活性化し、これがウイルス感染細胞を破壊することにより
、試験したインビボモデルの肺における遺伝子発現を終了させる。他の問題は、
抗ウイルス性中和抗体の発生のために、ウイルスベクターを反復投与すると遺伝
子転移が低下することである。これらの問題は現在、ベクターと宿主免疫系の両
方を修飾することが検討されている。さらに、非ウイルス性および非タンパク質
性ベクターが、代替アプローチとして注目されてきている。
しばしば重大な問題となる。具体的には、ウイルスタンパク質は、細胞傷害性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）を活性化し、これがウイルス感染細胞を破壊することにより
、試験したインビボモデルの肺における遺伝子発現を終了させる。他の問題は、
抗ウイルス性中和抗体の発生のために、ウイルスベクターを反復投与すると遺伝
子転移が低下することである。これらの問題は現在、ベクターと宿主免疫系の両
方を修飾することが検討されている。さらに、非ウイルス性および非タンパク質
性ベクターが、代替アプローチとして注目されてきている。
【０００９】 生物活性分子の細胞内送達を促進するように設計された化合物は、非極性およ
び極性環境（例えば、原形質膜、組織液、細胞内区画、および生物活性分子自体
の中または上）と相互作用しなければならないため、このような化合物は、典型
的には極性および非極性ドメインの両方を含むように設計される。このような両
方のドメインを有する化合物は、両親媒性物質と呼ばれ、このような細胞内送達
（インビトロの応用であろうとインビボの応用であろうと）を促進するための使
用が開示されてきた多くの脂質や合成脂質がこの定義を満たす。生物活性分子の
効率的送達に特に有望な両親媒性化合物の群は、カチオン性両親媒性物質である
。カチオン性両親媒性物質は、生理的ｐＨ付近で正に荷電可能な極性基を持って
おり、この性質は、両親媒性物質が例えばＤＮＡのような負に荷電したポリヌク
レオチドを含む、多くの型の生物活性分子とどのように相互作用するかを明確に
するのに重要であると、当該分野において理解されている。
び極性環境（例えば、原形質膜、組織液、細胞内区画、および生物活性分子自体
の中または上）と相互作用しなければならないため、このような化合物は、典型
的には極性および非極性ドメインの両方を含むように設計される。このような両
方のドメインを有する化合物は、両親媒性物質と呼ばれ、このような細胞内送達
（インビトロの応用であろうとインビボの応用であろうと）を促進するための使
用が開示されてきた多くの脂質や合成脂質がこの定義を満たす。生物活性分子の
効率的送達に特に有望な両親媒性化合物の群は、カチオン性両親媒性物質である
。カチオン性両親媒性物質は、生理的ｐＨ付近で正に荷電可能な極性基を持って
おり、この性質は、両親媒性物質が例えばＤＮＡのような負に荷電したポリヌク
レオチドを含む、多くの型の生物活性分子とどのように相互作用するかを明確に
するのに重要であると、当該分野において理解されている。
【００１０】 生物活性分子の細胞内送達において有用であると記載されているカチオン性両
親媒性化合物の例は、例えば、以下の参考文献に見い出されるが、これらの開示
内容は、参照することにより本質的に本明細書の一部とする。これらの参考文献
の多くはまた、このような応用に適したものにさせることが当該分野において理
解されているカチオン性両親媒性物質の性質、および細胞内送達を目的としてこ
のような両親媒性物質と治療用分子との複合体化により形成されると当該分野で
理解されている構造物の本質についての、有用な考察を含む。
親媒性化合物の例は、例えば、以下の参考文献に見い出されるが、これらの開示
内容は、参照することにより本質的に本明細書の一部とする。これらの参考文献
の多くはまた、このような応用に適したものにさせることが当該分野において理
解されているカチオン性両親媒性物質の性質、および細胞内送達を目的としてこ
のような両親媒性物質と治療用分子との複合体化により形成されると当該分野で
理解されている構造物の本質についての、有用な考察を含む。
【００１１】 （１）フェルグナー（Felgner）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）は、Ｎ−［１−（２，３−ジオ
レイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「
ＤＯＴＭＡ」）を含む正に荷電した合成カチオン性脂質を使用して、トランスフ
ェクションに適した脂質／ＤＮＡ複合体を形成することを開示している。フェル
グナー（Felgner）ら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２６９（４），２５５０−２５６１（１９９４）も参照の
こと。 （２）ベール（Behr）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６，６９８２−６９８６（１９８９）は、ジオクタデシルアミドログリシルスペ
ルミン（「ＤＯＧＳ」）を含む多くの両親媒性物質を開示している。 （３）エパンド（Epand）らの米国特許５，２８３，１８５号は、「ＤＣ−ｃｈ
ｏｌ」と呼ばれる、３β−［Ｎ−（Ｎ1，Ｎ1−ジメチルアミノエタン）カルバモ
イル］コレステロールを含む、追加のクラスおよび種を記載している。 （４）細胞中への生物活性分子の輸送を促進するさらなる化合物は、フェルグナ
ー（Felgner）らの米国特許第５，２６４，６１８号に開示されている。「ＤＭ
ＲＩＥ」１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチ
ルアンモニウムブロミド（以下に考察される）を含む、さらなる化合物の開示に
ついて、フェルグナー（Felgner）ら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（４），ｐｐ．２５５０−２５６
１（１９９４）も参照のこと。 （５）生物活性分子の細胞内送達に適した両親媒性物質への言及はまた、ゲベエ
フ（Gebeyehu）らの米国特許第５，３３４，７６１号およびフェルグナー（Felg
ner）ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），
５，６７−７５（１９９３）にも見い出される。 （６）ブリアム，ケイ・エル（Brigham, K.L.）、ビー・メイリック（B. Meyric
k）、ビー・クリストマン（B. Christman）、エム・マグヌソン（M. Magnuson）
、ジー・キング（G. King）およびエル・シー・ベリー（L.C. Berry）。「リポ
ソームビヒクルを使用する機能性原核生物遺伝子によるネズミ肺のインビボトラ
ンスフェクション」。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１，１
９８９。 （７）ガオ，エクス・エイ（Gao, X.A.）とエル・フワン（L. Huang）。「哺乳
動物細胞の効率的トランスフェクションのための新規なカチオン性リポソーム試
薬」。Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７９：２８
０−２８５，１９９１。 （８）ヨシムラ，ケイ（Yoshimura, K.）、エム・エイ・ローゼンフェルド（M.A
. Rosenfeld）、エイチ・ナカムラ（H. Nakamura）、イー・エム・シェラー（E.
M. Scherer）、エイ・パビラニ（A. Pavirani）、ジェイ・ピー・ルコック（J.P
. Lecocq）およびアール・ジー・クリスタル（R.G. Crystal）。「インビボ気管
内プラスミド介在遺伝子転移後のマウス肺におけるヒト嚢胞性線維症膜貫通調節
物質（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）遺伝子の発現
」。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３２３３−３２４０，１９９２。 （９）ジュー，エヌ（Zhu, N.）、ディー・リジット（D. Liggitt）、ワイ・リ
ウ（Y. Liu）およびアール・デブ（R. Debs）。「成体マウスへの静脈内ＤＮＡ
送達後の全身性遺伝子発現」。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１，１９
９３。 （１０）ソロディン，アイ（Solodin, I.）、シー・エス・ブラウン（C.S. Brow
n）、エム・エス・ブルーノ（M.S. Bruno）、シー・ワイ・チョウ（C.Y. Chow）
、イー・ジャン（E. Jang）、アール・ジェイ・デブ（R.J. Debs）およびティー
・ディー・ヒース（T.D. Heath）。「インビトロおよびインビボ遺伝子送達のた
めの新規なシリーズの両親媒性イミダゾリニウム化合物」。Ｂｉｏｃｈｅｍ．３
４：１３５３７−１３５４４，１９９５。 （１１）リー・イー・アール（Lee, E.R.）、ジェイ・マーシャル（J. Marshall
）、シー・エス・シーガル（C.S. Siegal）、シー・ジャン（C. Jiang）、エヌ
・エス・イウ（N.S. Yew）、エム・アール・ニコルズ（M.R. Nichols）、ジェイ
・ビー・ニエツプスキ（J.B. Nietupski）、アール・ジェイ・ジーグラー（R.J.
Ziegler）、エム・レーン（M. Lane）、ケイ・エックス・ワン（K.X. Wang）、
エヌ・シー・ワン（N.C. Wan）、アール・ケイ・シェウル（R.K. Scheule）、デ
ィー・ジェイ・ハリス（D.J. Harris）、エイ・イー・スミス（A.E. Smith）お
よびエス・エイチ・チェン（S.H. Cheng）。「肺への効率的遺伝子転移のための
カチオン性脂質の構造と処方の詳細な分析」。Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７
：１７０１−１７１７，１９９６。
ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）は、Ｎ−［１−（２，３−ジオ
レイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「
ＤＯＴＭＡ」）を含む正に荷電した合成カチオン性脂質を使用して、トランスフ
ェクションに適した脂質／ＤＮＡ複合体を形成することを開示している。フェル
グナー（Felgner）ら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２６９（４），２５５０−２５６１（１９９４）も参照の
こと。 （２）ベール（Behr）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６，６９８２−６９８６（１９８９）は、ジオクタデシルアミドログリシルスペ
ルミン（「ＤＯＧＳ」）を含む多くの両親媒性物質を開示している。 （３）エパンド（Epand）らの米国特許５，２８３，１８５号は、「ＤＣ−ｃｈ
ｏｌ」と呼ばれる、３β−［Ｎ−（Ｎ1，Ｎ1−ジメチルアミノエタン）カルバモ
イル］コレステロールを含む、追加のクラスおよび種を記載している。 （４）細胞中への生物活性分子の輸送を促進するさらなる化合物は、フェルグナ
ー（Felgner）らの米国特許第５，２６４，６１８号に開示されている。「ＤＭ
ＲＩＥ」１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチ
ルアンモニウムブロミド（以下に考察される）を含む、さらなる化合物の開示に
ついて、フェルグナー（Felgner）ら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（４），ｐｐ．２５５０−２５６
１（１９９４）も参照のこと。 （５）生物活性分子の細胞内送達に適した両親媒性物質への言及はまた、ゲベエ
フ（Gebeyehu）らの米国特許第５，３３４，７６１号およびフェルグナー（Felg
ner）ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），
５，６７−７５（１９９３）にも見い出される。 （６）ブリアム，ケイ・エル（Brigham, K.L.）、ビー・メイリック（B. Meyric
k）、ビー・クリストマン（B. Christman）、エム・マグヌソン（M. Magnuson）
、ジー・キング（G. King）およびエル・シー・ベリー（L.C. Berry）。「リポ
ソームビヒクルを使用する機能性原核生物遺伝子によるネズミ肺のインビボトラ
ンスフェクション」。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１，１
９８９。 （７）ガオ，エクス・エイ（Gao, X.A.）とエル・フワン（L. Huang）。「哺乳
動物細胞の効率的トランスフェクションのための新規なカチオン性リポソーム試
薬」。Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７９：２８
０−２８５，１９９１。 （８）ヨシムラ，ケイ（Yoshimura, K.）、エム・エイ・ローゼンフェルド（M.A
. Rosenfeld）、エイチ・ナカムラ（H. Nakamura）、イー・エム・シェラー（E.
M. Scherer）、エイ・パビラニ（A. Pavirani）、ジェイ・ピー・ルコック（J.P
. Lecocq）およびアール・ジー・クリスタル（R.G. Crystal）。「インビボ気管
内プラスミド介在遺伝子転移後のマウス肺におけるヒト嚢胞性線維症膜貫通調節
物質（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）遺伝子の発現
」。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３２３３−３２４０，１９９２。 （９）ジュー，エヌ（Zhu, N.）、ディー・リジット（D. Liggitt）、ワイ・リ
ウ（Y. Liu）およびアール・デブ（R. Debs）。「成体マウスへの静脈内ＤＮＡ
送達後の全身性遺伝子発現」。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１，１９
９３。 （１０）ソロディン，アイ（Solodin, I.）、シー・エス・ブラウン（C.S. Brow
n）、エム・エス・ブルーノ（M.S. Bruno）、シー・ワイ・チョウ（C.Y. Chow）
、イー・ジャン（E. Jang）、アール・ジェイ・デブ（R.J. Debs）およびティー
・ディー・ヒース（T.D. Heath）。「インビトロおよびインビボ遺伝子送達のた
めの新規なシリーズの両親媒性イミダゾリニウム化合物」。Ｂｉｏｃｈｅｍ．３
４：１３５３７−１３５４４，１９９５。 （１１）リー・イー・アール（Lee, E.R.）、ジェイ・マーシャル（J. Marshall
）、シー・エス・シーガル（C.S. Siegal）、シー・ジャン（C. Jiang）、エヌ
・エス・イウ（N.S. Yew）、エム・アール・ニコルズ（M.R. Nichols）、ジェイ
・ビー・ニエツプスキ（J.B. Nietupski）、アール・ジェイ・ジーグラー（R.J.
Ziegler）、エム・レーン（M. Lane）、ケイ・エックス・ワン（K.X. Wang）、
エヌ・シー・ワン（N.C. Wan）、アール・ケイ・シェウル（R.K. Scheule）、デ
ィー・ジェイ・ハリス（D.J. Harris）、エイ・イー・スミス（A.E. Smith）お
よびエス・エイチ・チェン（S.H. Cheng）。「肺への効率的遺伝子転移のための
カチオン性脂質の構造と処方の詳細な分析」。Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７
：１７０１−１７１７，１９９６。
【００１２】 さらに、最近発行されたいくつかの米国特許（その開示内容は、参照すること
により本質的に本明細書の一部とする）は、哺乳動物細胞にポリヌクレオチドを
送達するためのカチオン性両親媒性物質の有用性を記述している。（ブリアム（
Brigham）らの米国特許第５，６７６，９５４号、およびフェルグナー（Felgner
）らの米国特許第５，７０３，０５５号。）
により本質的に本明細書の一部とする）は、哺乳動物細胞にポリヌクレオチドを
送達するためのカチオン性両親媒性物質の有用性を記述している。（ブリアム（
Brigham）らの米国特許第５，６７６，９５４号、およびフェルグナー（Felgner
）らの米国特許第５，７０３，０５５号。）
【００１３】 上記参考文献で言及される化合物は、生物活性分子の細胞中への移入を促進す
ることが証明されているが、それによって提供される取り込み効率は改善して、
多くの治療応用、特に遺伝子治療を支持しうると考えられる。さらに、上記化合
物の必要量がより少なくなり、このような化合物またはその代謝物の毒性に関す
る懸念を低減することができるように、活性を改善することが要望されている。
ることが証明されているが、それによって提供される取り込み効率は改善して、
多くの治療応用、特に遺伝子治療を支持しうると考えられる。さらに、上記化合
物の必要量がより少なくなり、このような化合物またはその代謝物の毒性に関す
る懸念を低減することができるように、活性を改善することが要望されている。
【００１４】 活性が増強した別のクラスのカチオン性両親媒性物質は、例えば、１９９８年
５月５日に発行したシーゲル（Siegel）らの米国特許第５，７４７，４７１号、
１９９７年７月２２日に発行したハリス（Harris）らの米国特許第５，６５０，
０９６号、および１９９８年１月２２日公開のＰＣＴ公報ＷＯ９８／０２１９１
（これらの開示内容は、参照することにより本質的に本明細書の一部とする）に
記載されている。これらの特許はまた、本発明の実施に関連するカチオン性両親
媒性物質の調製法を開示している。
５月５日に発行したシーゲル（Siegel）らの米国特許第５，７４７，４７１号、
１９９７年７月２２日に発行したハリス（Harris）らの米国特許第５，６５０，
０９６号、および１９９８年１月２２日公開のＰＣＴ公報ＷＯ９８／０２１９１
（これらの開示内容は、参照することにより本質的に本明細書の一部とする）に
記載されている。これらの特許はまた、本発明の実施に関連するカチオン性両親
媒性物質の調製法を開示している。
【００１５】 活性の増強を引き起こす多くのカチオン性両親媒性物質およびウイルスベクタ
ーが存在するが、特定の哺乳動物細胞に対する脂質および非脂質送達ビヒクルの
結合および標的化の新しい方法が未だに探求されている。遺伝子治療、および生
物活性分子のインビボ、インビトロおよびエクスビボ送達の他の応用のための、
カチオン性両親媒性物質およびウイルスベクターを使用する際に非常に望まれる
因子は、特定の哺乳動物細胞に対して有効に標的とし、かつこれに結合する能力
である。現在まで、特定の細胞型を標的とする効果的な方法は欠如している。特
定の細胞を標的とする能力は、特定の症状を有効に治療するのに必要な、カチオ
ン性両親媒性物質、ウイルスまたは他の送達ビヒクル複合体の用量を減少させ、
それによって高用量の関数である毒性の問題を減少させる。その結果、所望の哺
乳動物細胞に送達される生物活性分子の効率と量を改善する方法は、有効な治療
処理としての、カチオン性両親媒性複合体、ウイルスベクター、および他の送達
ビヒクルの生存活性を増強するために望まれる。
ーが存在するが、特定の哺乳動物細胞に対する脂質および非脂質送達ビヒクルの
結合および標的化の新しい方法が未だに探求されている。遺伝子治療、および生
物活性分子のインビボ、インビトロおよびエクスビボ送達の他の応用のための、
カチオン性両親媒性物質およびウイルスベクターを使用する際に非常に望まれる
因子は、特定の哺乳動物細胞に対して有効に標的とし、かつこれに結合する能力
である。現在まで、特定の細胞型を標的とする効果的な方法は欠如している。特
定の細胞を標的とする能力は、特定の症状を有効に治療するのに必要な、カチオ
ン性両親媒性物質、ウイルスまたは他の送達ビヒクル複合体の用量を減少させ、
それによって高用量の関数である毒性の問題を減少させる。その結果、所望の哺
乳動物細胞に送達される生物活性分子の効率と量を改善する方法は、有効な治療
処理としての、カチオン性両親媒性複合体、ウイルスベクター、および他の送達
ビヒクルの生存活性を増強するために望まれる。
【００１６】 したがって、本発明は、哺乳動物細胞への生物活性分子の送達を促進する新規
なミセル複合体に関する。この新規なミセル複合体は、カチオン性両親媒性物質
、生物活性分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体、および場合によ
り中性、陽性、または陰性共脂質からなる。これらの新規なミセル複合体は、従
来のカチオン性両親媒性複合体には観察されないユニークな性質を持っているこ
とがある。例えば新規なミセル複合体によって、当業者は、このミセル複合体を
気道上皮細胞に優先的に結合させることができる。また、当業者は、このミセル
複合体を他の特定の細胞型に優先的に結合させることができるか、またはミセル
複合体による送達のために特定の哺乳動物細胞に標的化することができる。
なミセル複合体に関する。この新規なミセル複合体は、カチオン性両親媒性物質
、生物活性分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体、および場合によ
り中性、陽性、または陰性共脂質からなる。これらの新規なミセル複合体は、従
来のカチオン性両親媒性複合体には観察されないユニークな性質を持っているこ
とがある。例えば新規なミセル複合体によって、当業者は、このミセル複合体を
気道上皮細胞に優先的に結合させることができる。また、当業者は、このミセル
複合体を他の特定の細胞型に優先的に結合させることができるか、またはミセル
複合体による送達のために特定の哺乳動物細胞に標的化することができる。
【００１７】 本発明は、ＰＥＧ誘導体および場合により共脂質との混合ミセル複合体を形成
するための、カチオン性両親媒性物質の使用を提供する。生物活性分子の細胞内
送達を促進できる全てのカチオン性両親媒性物質は、本発明の実施において有用
である。本発明は、開示された両親媒性物質に限定されないが、本発明の実施に
おいて有用なカチオン性両親媒性物質の多くの例は、前に参照された刊行物に記
述されている。
するための、カチオン性両親媒性物質の使用を提供する。生物活性分子の細胞内
送達を促進できる全てのカチオン性両親媒性物質は、本発明の実施において有用
である。本発明は、開示された両親媒性物質に限定されないが、本発明の実施に
おいて有用なカチオン性両親媒性物質の多くの例は、前に参照された刊行物に記
述されている。
【００１８】 本発明の実施において、複合体が気道上皮細胞への結合に有効である、ミセル
複合体を提供される。理論により限定されるわけではないが、本ミセル複合体は
、ミセル複合体の電荷密度の差のため、従来の脂質複合体に比較すると、優先的
な結合を証明すると考えられる。
複合体を提供される。理論により限定されるわけではないが、本ミセル複合体は
、ミセル複合体の電荷密度の差のため、従来の脂質複合体に比較すると、優先的
な結合を証明すると考えられる。
【００１９】 従来の脂質複合体に比較すると、複合体が実質的により均質である本発明のミ
セル複合体も提供することができる。すなわち本発明のミセル複合体は、従来の
手段により調製される脂質複合体よりも狭い粒度分布曲線を有する。
セル複合体も提供することができる。すなわち本発明のミセル複合体は、従来の
手段により調製される脂質複合体よりも狭い粒度分布曲線を有する。
【００２０】 本発明の好適なミセル複合体はまた、従来の脂質複合体よりも安定である。ミ
セル調製物は、前日に調製して、何ら有害な影響なしに一晩貯蔵することができ
る。
セル調製物は、前日に調製して、何ら有害な影響なしに一晩貯蔵することができ
る。
【００２１】 さらに別の側面では、本発明は、カチオン性両親媒性物質と生物活性分子との
間の改良された結合効率を与える。改良された結合効率によって、調製物中に存
在する脂質当たりのＤＮＡがより多「積載（loading）」になる。ＰＥＧ誘導体
は、従来の脂質：生物活性分子の複合体を安定化し、かつ沈殿を防止することが
、当該分野において知られている。しかし、ＰＥＧ誘導体を含むミセル複合体は
、これもＰＥＧ誘導体を含む従来の脂質二重層複合体よりも、より多くの生物活
性分子を沈殿なしに積載することができる。すなわち従来のカチオン性両親媒性
複合体中のカチオン性両親媒性物質と比較すると、より多くの生物活性分子が、
ミセル複合体中の各カチオン性両親媒性物質と会合している。
間の改良された結合効率を与える。改良された結合効率によって、調製物中に存
在する脂質当たりのＤＮＡがより多「積載（loading）」になる。ＰＥＧ誘導体
は、従来の脂質：生物活性分子の複合体を安定化し、かつ沈殿を防止することが
、当該分野において知られている。しかし、ＰＥＧ誘導体を含むミセル複合体は
、これもＰＥＧ誘導体を含む従来の脂質二重層複合体よりも、より多くの生物活
性分子を沈殿なしに積載することができる。すなわち従来のカチオン性両親媒性
複合体中のカチオン性両親媒性物質と比較すると、より多くの生物活性分子が、
ミセル複合体中の各カチオン性両親媒性物質と会合している。
【００２２】 さらに別の側面では本発明は、カチオン性両親媒性物質、生物活性分子、ＰＥ
Ｇ誘導体、および場合により共脂質を含んでなる、ミセル脂質複合体の調製方法
を含む。生じる複合体は、均質、安定で、かつ気道上皮細胞への結合に有効であ
る。好適な実施態様では本複合体は、生物活性分子の全身性送達に有効である。
Ｇ誘導体、および場合により共脂質を含んでなる、ミセル脂質複合体の調製方法
を含む。生じる複合体は、均質、安定で、かつ気道上皮細胞への結合に有効であ
る。好適な実施態様では本複合体は、生物活性分子の全身性送達に有効である。
【００２３】 本発明はまた、ミセル複合体を投与して哺乳動物細胞へ生物活性分子を送達す
る方法を提供する。さらに、ミセル複合体の投与による哺乳動物細胞への遺伝子
のトランスフェクションを促進するための方法が提供される。
る方法を提供する。さらに、ミセル複合体の投与による哺乳動物細胞への遺伝子
のトランスフェクションを促進するための方法が提供される。
【００２４】 本発明のさらに別の側面では、本ミセル複合体は、特定の型の哺乳動物細胞へ
の生物活性分子の送達を促進する標的化物質を含んでよい。この標的化物質は、
脂質および非脂質法の両方に有効であり、本発明は、アデノウイルスを含むウイ
ルスベクター、および哺乳動物細胞中への生物活性分子の送達を実現するために
当該分野において利用されている他の方法における標的化物質の使用に加えて、
従来のおよびミセルカチオン性両親媒性物質の両方を含む、全ての脂質複合体に
おける標的化物質の使用を提供する。
の生物活性分子の送達を促進する標的化物質を含んでよい。この標的化物質は、
脂質および非脂質法の両方に有効であり、本発明は、アデノウイルスを含むウイ
ルスベクター、および哺乳動物細胞中への生物活性分子の送達を実現するために
当該分野において利用されている他の方法における標的化物質の使用に加えて、
従来のおよびミセルカチオン性両親媒性物質の両方を含む、全ての脂質複合体に
おける標的化物質の使用を提供する。
【００２５】 本発明はまた、ミセル複合体の薬剤組成物、および標的化物質との他の脂質お
よび非脂質複合体の薬剤組成物を提供する。ミセル複合体は、担体、充填剤、増
量剤、分散剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、および薬剤処方の分野で一般的な他
の賦形剤を含む、薬剤組成物中の活性成分であってよい。
よび非脂質複合体の薬剤組成物を提供する。ミセル複合体は、担体、充填剤、増
量剤、分散剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、および薬剤処方の分野で一般的な他
の賦形剤を含む、薬剤組成物中の活性成分であってよい。
【００２６】 本発明のさらなる特色および利点は、以下の説明中に記載され、そして一部は
説明から明らかになり、あるいは発明の実施により理解できる。本発明の目的お
よび他の利点は、説明および本明細書の請求の範囲さらには添付図面で具体的に
指摘される方法により実現および達成される。
説明から明らかになり、あるいは発明の実施により理解できる。本発明の目的お
よび他の利点は、説明および本明細書の請求の範囲さらには添付図面で具体的に
指摘される方法により実現および達成される。
【００２７】 本発明では、先行技術のカチオン性両親媒性化合物が、ＰＥＧ誘導体および場
合により共脂質を含む調製物において使用される。生じる調製物は、１つまたは
それ以上の生物活性分子と複合体を形成させる。この新規な調製物は、従来のカ
チオン性両親媒性調製物、他のカチオン性両親媒性調製物、および脂質担体では
見い出されないユニークでかつ驚くべき性質を示す。本発明の追加の側面は、新
しい調製物における標的化物質の使用である。標的化物質は、特定の哺乳動物細
胞への送達を促進する。本発明の実施は、理論によって限定されない。
合により共脂質を含む調製物において使用される。生じる調製物は、１つまたは
それ以上の生物活性分子と複合体を形成させる。この新規な調製物は、従来のカ
チオン性両親媒性調製物、他のカチオン性両親媒性調製物、および脂質担体では
見い出されないユニークでかつ驚くべき性質を示す。本発明の追加の側面は、新
しい調製物における標的化物質の使用である。標的化物質は、特定の哺乳動物細
胞への送達を促進する。本発明の実施は、理論によって限定されない。
【００２８】 カチオン性両親媒性物質、ＰＥＧ誘導体、および場合により共脂質の従来の複
合体は、当該分野において周知である。これらの従来の複合体は、カチオン性両
親媒性物質、ＰＥＧ誘導体、および場合により共脂質の脂質フィルムを調製する
ことにより形成される。次にこの脂質フィルムを水性媒体中で水和して脂質二重
層を形成させ、次に生物活性分子と複合体を形成させる。この方法により形成さ
れる従来のカチオン性両親媒性複合体は、通常直径４００〜５００nm（ナノメー
トル）であり、粒度が５０％またはそれ以上変動する。
合体は、当該分野において周知である。これらの従来の複合体は、カチオン性両
親媒性物質、ＰＥＧ誘導体、および場合により共脂質の脂質フィルムを調製する
ことにより形成される。次にこの脂質フィルムを水性媒体中で水和して脂質二重
層を形成させ、次に生物活性分子と複合体を形成させる。この方法により形成さ
れる従来のカチオン性両親媒性複合体は、通常直径４００〜５００nm（ナノメー
トル）であり、粒度が５０％またはそれ以上変動する。
【００２９】 本発明の好適な実施態様は、小さく、均質で、かつ安定な混合ミセル調製物ま
たはミセル複合体である。本発明の１つの実施態様は、従来のカチオン性両親媒
性複合体では見い出されない性質である気道上皮細胞への結合を示すミセル複合
体を企図する。本発明の実施において、ユニークかつ驚くべき性質を備えうるミ
セル複合体調製物は、新しい方法により調製される。本ミセル複合体は好ましく
は、カチオン性脂質を水和し、この水和カチオン性脂質をＰＥＧ誘導体（これも
ミセル脂質懸濁液を形成するために水和しておく）に加えることにより、調製す
ることができる。ミセルカチオン性脂質：ＰＥＧ：生物活性分子複合体は、ミセ
ルカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体溶液を生物活性分子に加えることにより、調製
される。脂質：生物活性分子およびカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体のモル比は、
広い範囲で変動してよく、使用されるカチオン性脂質、ＰＥＧ誘導体、および生
物活性分子に依存するであろう。またこの比は、投与部位および標的疾患の関数
として有意に変動してよい。ある実施態様では、脂質：生物活性分子のモル比は
、１：８である。別の好適な実施態様では、生物活性分子は、ＤＮＡである。
たはミセル複合体である。本発明の１つの実施態様は、従来のカチオン性両親媒
性複合体では見い出されない性質である気道上皮細胞への結合を示すミセル複合
体を企図する。本発明の実施において、ユニークかつ驚くべき性質を備えうるミ
セル複合体調製物は、新しい方法により調製される。本ミセル複合体は好ましく
は、カチオン性脂質を水和し、この水和カチオン性脂質をＰＥＧ誘導体（これも
ミセル脂質懸濁液を形成するために水和しておく）に加えることにより、調製す
ることができる。ミセルカチオン性脂質：ＰＥＧ：生物活性分子複合体は、ミセ
ルカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体溶液を生物活性分子に加えることにより、調製
される。脂質：生物活性分子およびカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体のモル比は、
広い範囲で変動してよく、使用されるカチオン性脂質、ＰＥＧ誘導体、および生
物活性分子に依存するであろう。またこの比は、投与部位および標的疾患の関数
として有意に変動してよい。ある実施態様では、脂質：生物活性分子のモル比は
、１：８である。別の好適な実施態様では、生物活性分子は、ＤＮＡである。
【００３０】 ミセル複合体はまた、調製物の一部として、中性、陽性、または陰性の共脂質
と共に調製することができる。共脂質は、脂質フィルムとしてＰＥＧ脂質と調製
され、単一の溶液として水和されるか、あるいは共脂質を脂質フィルムとして単
独で調製して、ＰＥＧ脂質と共に水和することができる。次にカチオン性脂質を
、水和型でＰＥＧ脂質と共脂質の溶液に加えることにより、ミセル脂質を形成し
、次にこれを使用して、生物活性分子とのミセル複合体を形成する。ある実施態
様では、脂質：生物活性分子のモル比は、１：８である。別の好適な実施態様で
は、生物活性分子は、ＤＮＡである。
と共に調製することができる。共脂質は、脂質フィルムとしてＰＥＧ脂質と調製
され、単一の溶液として水和されるか、あるいは共脂質を脂質フィルムとして単
独で調製して、ＰＥＧ脂質と共に水和することができる。次にカチオン性脂質を
、水和型でＰＥＧ脂質と共脂質の溶液に加えることにより、ミセル脂質を形成し
、次にこれを使用して、生物活性分子とのミセル複合体を形成する。ある実施態
様では、脂質：生物活性分子のモル比は、１：８である。別の好適な実施態様で
は、生物活性分子は、ＤＮＡである。
【００３１】 本発明の実施において、複合体が気道上皮細胞への結合に有効である、ミセル
脂質複合体が提供される。理論により限定されるわけではないが、本ミセル脂質
複合体は、ミセル複合体の電荷密度の差のため、従来の脂質複合体に比較すると
、優先的な結合を証明すると考えられる。
脂質複合体が提供される。理論により限定されるわけではないが、本ミセル脂質
複合体は、ミセル複合体の電荷密度の差のため、従来の脂質複合体に比較すると
、優先的な結合を証明すると考えられる。
【００３２】 従来の脂質複合体に比較すると、複合体が実質的により均質である本発明のミ
セル複合体も提供される。すなわち本実施態様では、本発明のミセル複合体は、
従来の手段により調製される脂質複合体よりも狭い粒度分布曲線を有する。例え
ば、従来の脂質複合体の粒度分布は、脂質、ＤＮＡ、および脂質：ＤＮＡ比に応
じて、５０％を超えて変動することもある。これに比較して本実施態様によるミ
セル複合体の粒度分布は、最大約２０％しか変動しない。
セル複合体も提供される。すなわち本実施態様では、本発明のミセル複合体は、
従来の手段により調製される脂質複合体よりも狭い粒度分布曲線を有する。例え
ば、従来の脂質複合体の粒度分布は、脂質、ＤＮＡ、および脂質：ＤＮＡ比に応
じて、５０％を超えて変動することもある。これに比較して本実施態様によるミ
セル複合体の粒度分布は、最大約２０％しか変動しない。
【００３３】 有意に均質度が高いことに加えて、本発明の好適なミセル複合体は、さらに多
くの生物活性分子を複合体に加えても、粒度が顕著に変化しない。例えば、ミセ
ル複合体中のカチオン性脂質対ｐＤＮＡおよびカチオン性脂質対ＰＥＧ誘導体対
共脂質の比を一定にして、一方ミセル複合体の一部であるｐＤＮＡ（すなわち、
ｐＤＮＡは溶液中で遊離していない）の量を増大させる実験を行った。好適なミ
セル複合体の粒度およびその粒度分布は、ミセル複合体中のｐＤＮＡの量が増大
しても、有意に変動しなかった。
くの生物活性分子を複合体に加えても、粒度が顕著に変化しない。例えば、ミセ
ル複合体中のカチオン性脂質対ｐＤＮＡおよびカチオン性脂質対ＰＥＧ誘導体対
共脂質の比を一定にして、一方ミセル複合体の一部であるｐＤＮＡ（すなわち、
ｐＤＮＡは溶液中で遊離していない）の量を増大させる実験を行った。好適なミ
セル複合体の粒度およびその粒度分布は、ミセル複合体中のｐＤＮＡの量が増大
しても、有意に変動しなかった。
【００３４】 本発明の好適なミセル複合体はまた、従来の脂質複合体よりも安定である。多
くの従来の脂質複合体は、特別な貯蔵法、または哺乳動物またはインビトロの細
胞への投与の直前に、送達すべきＤＮＡとの調製物の混合を必要とするという、
貯蔵および安定性の問題がある。例えば、従来のカチオン性脂質は、特別な条件
下で貯蔵しなければ、アシル交換反応により分解することが知られている。多く
の脂質：ＤＮＡ複合体もまた、複合体形成後まもなく溶液から沈殿することが知
られており、従って使用直前まで複合体の調製を延期することが必要である。使
用直前に調製物を作成する必要がある医薬生成物は、あまり現実的ではない。本
発明のミセル複合体は好ましくは、調製後まもなく溶液から沈殿することは無い
。例えば、ミセル調製物は、前日に調製して、何ら有害な影響なしに一晩貯蔵す
ることができる。当業者はまた、有意な沈殿を観察することなく、ミセル調製物
をボルテックス混合することができる。
くの従来の脂質複合体は、特別な貯蔵法、または哺乳動物またはインビトロの細
胞への投与の直前に、送達すべきＤＮＡとの調製物の混合を必要とするという、
貯蔵および安定性の問題がある。例えば、従来のカチオン性脂質は、特別な条件
下で貯蔵しなければ、アシル交換反応により分解することが知られている。多く
の脂質：ＤＮＡ複合体もまた、複合体形成後まもなく溶液から沈殿することが知
られており、従って使用直前まで複合体の調製を延期することが必要である。使
用直前に調製物を作成する必要がある医薬生成物は、あまり現実的ではない。本
発明のミセル複合体は好ましくは、調製後まもなく溶液から沈殿することは無い
。例えば、ミセル調製物は、前日に調製して、何ら有害な影響なしに一晩貯蔵す
ることができる。当業者はまた、有意な沈殿を観察することなく、ミセル調製物
をボルテックス混合することができる。
【００３５】 ミセル脂質溶液を生物活性分子に加えるとき、安定で均質な複合体を形成する
のに、最少量のＰＥＧ脂質が好ましい。必要なＰＥＧの最少量は、カチオン性脂
質と選択されるＰＥＧ脂質の特定の組合せに依存する。ミセル複合体を形成する
のに必要なＰＥＧの最少量を決定するための方法は、特に問わないが、１）懸濁
液が清澄〜不透明であり、粒子を含まないことを確認するために、生物活性分子
へのミセル脂質の添加後に脂質：生物活性分子複合体を観察；２）粒度に関して
粒子集団が実質的に均質であるかどうかを決定するために、整粒器を使用して調
製後にミセル脂質：生物活性分子複合体の整粒；および３）アガロースゲル電気
泳動におけるミセル複合体中の生物活性分子の挙動の分析、を含む。上述の方法
に関する詳細は、本明細書に添付される例に見い出すことができる。
のに、最少量のＰＥＧ脂質が好ましい。必要なＰＥＧの最少量は、カチオン性脂
質と選択されるＰＥＧ脂質の特定の組合せに依存する。ミセル複合体を形成する
のに必要なＰＥＧの最少量を決定するための方法は、特に問わないが、１）懸濁
液が清澄〜不透明であり、粒子を含まないことを確認するために、生物活性分子
へのミセル脂質の添加後に脂質：生物活性分子複合体を観察；２）粒度に関して
粒子集団が実質的に均質であるかどうかを決定するために、整粒器を使用して調
製後にミセル脂質：生物活性分子複合体の整粒；および３）アガロースゲル電気
泳動におけるミセル複合体中の生物活性分子の挙動の分析、を含む。上述の方法
に関する詳細は、本明細書に添付される例に見い出すことができる。
【００３６】 本発明の別の実施態様は、従来のカチオン整両親媒性複合体よりも直径が小さ
く、広範囲の脂質：ＤＮＡおよび脂質：ＰＥＧ比にわたって小さく安定なままで
あるミセル複合体に関する。小さく均質なミセル複合体を形成するには、最少量
のＰＥＧ誘導体が好ましい。本発明の好適な実施態様では、１つまたはそれ以上
のカチオン性両親媒性物質、１つまたはそれ以上のＰＥＧ誘導体、生物活性分子
、および場合により共脂質により調製されるミセル複合体は、直径が平均して約
２５〜２５０ナノメートルである。しかしミセル複合体の粒度は、使用されるカ
チオン性脂質、ＰＥＧ脂質、ＤＮＡの量と大きさ、および共脂質（存在する場合
）に依存する。
く、広範囲の脂質：ＤＮＡおよび脂質：ＰＥＧ比にわたって小さく安定なままで
あるミセル複合体に関する。小さく均質なミセル複合体を形成するには、最少量
のＰＥＧ誘導体が好ましい。本発明の好適な実施態様では、１つまたはそれ以上
のカチオン性両親媒性物質、１つまたはそれ以上のＰＥＧ誘導体、生物活性分子
、および場合により共脂質により調製されるミセル複合体は、直径が平均して約
２５〜２５０ナノメートルである。しかしミセル複合体の粒度は、使用されるカ
チオン性脂質、ＰＥＧ脂質、ＤＮＡの量と大きさ、および共脂質（存在する場合
）に依存する。
【００３７】 理論により限定されるわけではないが、ミセル複合体の電荷密度は、気道上皮
細胞に結合する本複合体の好適なユニークかつ驚くべき性質の原因であると考え
られる。高い電荷密度は、いくつかの細胞膜の高い親和性を引き起こすと考えら
れている。従ってミセル複合体の多くは、気道上皮細胞に結合する。単純なイン
ビトロ蛍光実験により、ミセル複合体が、露出した気道上皮細胞に強く結合する
ことを証明した。カチオン性両親媒性物質の従来の複合体（普通は直径４００〜
５００nm）は、同じ実験において強い結合を示さない。
細胞に結合する本複合体の好適なユニークかつ驚くべき性質の原因であると考え
られる。高い電荷密度は、いくつかの細胞膜の高い親和性を引き起こすと考えら
れている。従ってミセル複合体の多くは、気道上皮細胞に結合する。単純なイン
ビトロ蛍光実験により、ミセル複合体が、露出した気道上皮細胞に強く結合する
ことを証明した。カチオン性両親媒性物質の従来の複合体（普通は直径４００〜
５００nm）は、同じ実験において強い結合を示さない。
【００３８】 本発明のミセル複合体はまた、哺乳動物に投与するとき、従来のカチオン性脂
質複合体よりも毒性が低いと考えられる。例えば、マウスに静脈内注射すると、
カチオン性脂質ＧＬ−６７を用いて調製したミセル複合体は、これもＧＬ−６７
を用いて調製した従来のカチオン性脂質複合体よりも毒性が低かった。ミセル複
合体の低い毒性は、腫瘍細胞に送達する複合体の能力に大きな影響を与えない。
好適な実施態様では、ミセル複合体は、腫瘍細胞および特に腫瘍内皮細胞におけ
る同等な沈着を維持するが、一方哺乳動物の他の細胞については毒性が低い。
質複合体よりも毒性が低いと考えられる。例えば、マウスに静脈内注射すると、
カチオン性脂質ＧＬ−６７を用いて調製したミセル複合体は、これもＧＬ−６７
を用いて調製した従来のカチオン性脂質複合体よりも毒性が低かった。ミセル複
合体の低い毒性は、腫瘍細胞に送達する複合体の能力に大きな影響を与えない。
好適な実施態様では、ミセル複合体は、腫瘍細胞および特に腫瘍内皮細胞におけ
る同等な沈着を維持するが、一方哺乳動物の他の細胞については毒性が低い。
【００３９】 本発明の別の実施態様では、ミセル複合体は、脂質、または製剤の分野で組成
物および調製物をコーティングするために使用される他の組成物によりコーティ
ングされる。例えば、ミセル複合体をさらに別の疎水性種（例えば、中性脂質混
合物）と混合すると、複合体を障害することなく複合体の外側をコーティングで
きる。理論に限定されるわけではないが、ＤＮＡを効率的に濃縮するためにカチ
オン性脂質：ＰＥＧ誘導体を使用することが望ましい。生じるＤＮＡの小さく非
常に濃縮したパッケージ（例えばミセル複合体）は、次に共脂質または他のＰＥ
Ｇ誘導体のような他の種および脂質により取り囲まれ、そしてこれらが濃縮ＤＮ
Ａの荷電表面と相互作用しうる。これは、カチオン性脂質：ＤＮＡを免疫系から
防御および／またはマスクする。脂質：ＤＮＡ複合体の毒性の大部分は細菌が配
列を認識することによるため、コーティングは毒性を減少させる効果的な手段と
なろう。さらに、コーティングは、標的化物質の封入を促進して、特定の組織ま
たは細胞型への複合体の送達を可能にする。好適な実施態様では、コーティング
された複合体が全身に送達される。
物および調製物をコーティングするために使用される他の組成物によりコーティ
ングされる。例えば、ミセル複合体をさらに別の疎水性種（例えば、中性脂質混
合物）と混合すると、複合体を障害することなく複合体の外側をコーティングで
きる。理論に限定されるわけではないが、ＤＮＡを効率的に濃縮するためにカチ
オン性脂質：ＰＥＧ誘導体を使用することが望ましい。生じるＤＮＡの小さく非
常に濃縮したパッケージ（例えばミセル複合体）は、次に共脂質または他のＰＥ
Ｇ誘導体のような他の種および脂質により取り囲まれ、そしてこれらが濃縮ＤＮ
Ａの荷電表面と相互作用しうる。これは、カチオン性脂質：ＤＮＡを免疫系から
防御および／またはマスクする。脂質：ＤＮＡ複合体の毒性の大部分は細菌が配
列を認識することによるため、コーティングは毒性を減少させる効果的な手段と
なろう。さらに、コーティングは、標的化物質の封入を促進して、特定の組織ま
たは細胞型への複合体の送達を可能にする。好適な実施態様では、コーティング
された複合体が全身に送達される。
【００４０】 さらに、コーティングは、血流中のミセル複合体の滞留時間を延長するために
、または持効性機作として有用である。製剤の分野において知られている、他の
コーティングまたはコーティング剤の使用は、本発明の実施に含まれる。
、または持効性機作として有用である。製剤の分野において知られている、他の
コーティングまたはコーティング剤の使用は、本発明の実施に含まれる。
【００４１】 ミセル複合体中で使用されるカチオン性両親媒性物質 本発明は、細胞への生物活性分子の送達を促進するのに有用な、任意のカチオ
ン性両親媒性物質またはカチオン性脂質化合物の使用、およびこれらを含む組成
物を提供する。特に有用な両親媒性物質は、細胞、および特に遺伝子治療の目的
での患者の細胞中への生物活性のあるポリヌクレオチドの輸送を促進する。
ン性両親媒性物質またはカチオン性脂質化合物の使用、およびこれらを含む組成
物を提供する。特に有用な両親媒性物質は、細胞、および特に遺伝子治療の目的
での患者の細胞中への生物活性のあるポリヌクレオチドの輸送を促進する。
【００４２】 本発明の実施による幾つかの好適なカチオン性両親媒性物質は、米国特許第５
，７４７，４７１号および５，６５０，０９６号およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／０
２１９１（これらの開示内容は、参照することにより本質的に本発明の一部とさ
れる）に見い出すことができる。カチオン性両親媒性化合物に加えて、これら２
つの特許は、多くの好適な共脂質、生物活性分子、調製物、操作、投与経路、お
よび用量を開示している。
，７４７，４７１号および５，６５０，０９６号およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／０
２１９１（これらの開示内容は、参照することにより本質的に本発明の一部とさ
れる）に見い出すことができる。カチオン性両親媒性化合物に加えて、これら２
つの特許は、多くの好適な共脂質、生物活性分子、調製物、操作、投与経路、お
よび用量を開示している。
【００４３】 本発明の実施に関連して、カチオン性両親媒性物質は、生理的ｐＨ付近の溶液
中で１つまたはそれ以上の正の電荷を持つ傾向がある。本発明の実施に有用な代
表的なカチオン性両親媒性物質は、 および米国特許第５，７４７，４７１号（この開示内容は、参照することにより
本質的に本明細書の一部とする）に記載されるものを含む当該分野において既知
の他の両親媒性物質である。
中で１つまたはそれ以上の正の電荷を持つ傾向がある。本発明の実施に有用な代
表的なカチオン性両親媒性物質は、 および米国特許第５，７４７，４７１号（この開示内容は、参照することにより
本質的に本明細書の一部とする）に記載されるものを含む当該分野において既知
の他の両親媒性物質である。
【００４４】 ＰＥＧ誘導体 上で考察されたように驚くべきことに、カチオン性両親媒性組成物（従来のも
ミセルも両方）の安定性は、このような調製物にさらに少量の１つまたはそれ以
上の誘導体化ポリエチレングリコール化合物を加えることにより、実質的に改善
しうるということが確認されている。このような性能の強化は、貯蔵および操作
に対するカチオン性両親媒性調製物の安定性により測定するとき、特に明らかで
ある。
ミセルも両方）の安定性は、このような調製物にさらに少量の１つまたはそれ以
上の誘導体化ポリエチレングリコール化合物を加えることにより、実質的に改善
しうるということが確認されている。このような性能の強化は、貯蔵および操作
に対するカチオン性両親媒性調製物の安定性により測定するとき、特に明らかで
ある。
【００４５】 ＰＥＧ誘導体は、もともと従来のカチオン性両親媒性調製物を安定化するため
に使用された。理論により限定されるわけではないが、ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導
体の使用によって、より高い比の脂質対ＤＮＡを使用することができる。従来の
調製物を使用してより濃縮された脂質：ｐＤＮＡ複合体を調製しようとする従前
の試みにより、特にｐＤＮＡの大部分が脂質に結合しているような脂質：ｐＤＮ
Ａ比では、複合体が沈殿した。従来の調製物において高濃度で観察される沈殿は
、非二重層脂質成分からのカチオン性脂質成分の相分離に関連するものと考えら
れた。従来の脂質調製物を二重層の構造で維持しようとして、ＰＥＧ含有脂質が
、高ｐＤＮＡ濃度で複合体の沈殿を防止するのに有効であることが見い出された
。
に使用された。理論により限定されるわけではないが、ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導
体の使用によって、より高い比の脂質対ＤＮＡを使用することができる。従来の
調製物を使用してより濃縮された脂質：ｐＤＮＡ複合体を調製しようとする従前
の試みにより、特にｐＤＮＡの大部分が脂質に結合しているような脂質：ｐＤＮ
Ａ比では、複合体が沈殿した。従来の調製物において高濃度で観察される沈殿は
、非二重層脂質成分からのカチオン性脂質成分の相分離に関連するものと考えら
れた。従来の脂質調製物を二重層の構造で維持しようとして、ＰＥＧ含有脂質が
、高ｐＤＮＡ濃度で複合体の沈殿を防止するのに有効であることが見い出された
。
【００４６】 高濃度の脂質とＤＮＡで沈殿しない、安定な従来の調製物を形成するために、
わずかな小モル分率のＰＥＧ含有脂質を使用した。例えば、１．６mol％ ＰＥ
Ｇ−ＤＭＰＥで、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、２０mMを超えるｐＤＮＡ
濃度で安定化することができた。ＰＥＧ誘導体の使用に関するさらに多くの情報
については、下記参考文献が参照により本質的に本明細書の一部とされる。サイ
モン・ジェイ・イーストマン（Simon J. Eastman）ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，８，ｐｐ．７６５−７７３（１９９７）；サイモン・ジェイ・
イーストマン（Simon J. Eastman）ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
，ｐ．８，ｐｐ．３１３−３２２（１９９７）。
わずかな小モル分率のＰＥＧ含有脂質を使用した。例えば、１．６mol％ ＰＥ
Ｇ−ＤＭＰＥで、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、２０mMを超えるｐＤＮＡ
濃度で安定化することができた。ＰＥＧ誘導体の使用に関するさらに多くの情報
については、下記参考文献が参照により本質的に本明細書の一部とされる。サイ
モン・ジェイ・イーストマン（Simon J. Eastman）ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，８，ｐｐ．７６５−７７３（１９９７）；サイモン・ジェイ・
イーストマン（Simon J. Eastman）ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
，ｐ．８，ｐｐ．３１３−３２２（１９９７）。
【００４７】 続いてＰＥＧ誘導体はまた、新規なミセル調製物を調製するために使用するこ
とができた。ミセル複合体のＰＥＧ含有調製物は、ＰＥＧ誘導体を含むカチオン
性両親媒性物質の従来の調製物では見い出されない、生物活性分子に対する調製
物の親和性の改善を含むユニークな性質を示しうる。
とができた。ミセル複合体のＰＥＧ含有調製物は、ＰＥＧ誘導体を含むカチオン
性両親媒性物質の従来の調製物では見い出されない、生物活性分子に対する調製
物の親和性の改善を含むユニークな性質を示しうる。
【００４８】 改良された結合効率によって、調製物中に存在する脂質当たりのＤＮＡがより
多量またはより大きな「積載（loading）」になる。当該分野において、ＰＥＧ
誘導体は、脂質：生物活性分子の複合体を安定化し、かつ沈殿を防止することが
知られている。しかし、ＰＥＧ誘導体を含むミセル複合体は、これもＰＥＧ誘導
体を含む従来の脂質二重層複合体よりも、より多くの生物活性分子を沈殿なしに
積載することができる。すなわち従来のカチオン性両親媒性複合体中のカチオン
性両親媒性物質と比較すると、より多くの生物活性分子が、ミセル複合体中の各
カチオン性両親媒性物質と会合している。例えば、両親媒性物質：ｐＤＮＡの０
．１２５：１のモル比では、全てのｐＤＮＡは、ミセル複合体と会合しているよ
うである。従来のカチオン性両親媒性複合体は、全てのｐＤＮＡを完全に結合す
るために、両親媒性物質：ｐＤＮＡの０．７５：１〜１：１のモル比を必要とす
る。ミセル系のｐＤＮＡに対する高い親和性により、より少ないカチオン性両親
媒性物質を使用して、より多くのｐＤＮＡを送達することができる。
多量またはより大きな「積載（loading）」になる。当該分野において、ＰＥＧ
誘導体は、脂質：生物活性分子の複合体を安定化し、かつ沈殿を防止することが
知られている。しかし、ＰＥＧ誘導体を含むミセル複合体は、これもＰＥＧ誘導
体を含む従来の脂質二重層複合体よりも、より多くの生物活性分子を沈殿なしに
積載することができる。すなわち従来のカチオン性両親媒性複合体中のカチオン
性両親媒性物質と比較すると、より多くの生物活性分子が、ミセル複合体中の各
カチオン性両親媒性物質と会合している。例えば、両親媒性物質：ｐＤＮＡの０
．１２５：１のモル比では、全てのｐＤＮＡは、ミセル複合体と会合しているよ
うである。従来のカチオン性両親媒性複合体は、全てのｐＤＮＡを完全に結合す
るために、両親媒性物質：ｐＤＮＡの０．７５：１〜１：１のモル比を必要とす
る。ミセル系のｐＤＮＡに対する高い親和性により、より少ないカチオン性両親
媒性物質を使用して、より多くのｐＤＮＡを送達することができる。
【００４９】 ミセル複合体に関して、ミセル脂質溶液を生物活性分子に加えるとき、最少量
のＰＥＧ脂質が安定で均質な複合体を形成することができる。本発明の実施では
、ポリエチレングリコールの任意の誘導体が、ミセル複合体を調製するための調
製物の一部であってよい。複合体は、種々のＰＥＧ誘導体を使用して調製したが
、全てのそのＰＥＧ誘導体が、ある最小のカチオン性両親媒性物質：ＰＥＧ誘導
体の比で、小さく均質な複合体を形成することができた。本ミセル複合体は、一
旦小さく均質な複合体を形成するためのＰＥＧ脂質の最少量を決定すれば、広い
範囲のカチオン性脂質：ＰＥＧおよびカチオン性脂質：ＤＮＡの比を通して安定
かつ均質なままである。安定で均質な複合体を形成するためのＰＥＧの最少量を
、当業者には日常的に決定することができる。
のＰＥＧ脂質が安定で均質な複合体を形成することができる。本発明の実施では
、ポリエチレングリコールの任意の誘導体が、ミセル複合体を調製するための調
製物の一部であってよい。複合体は、種々のＰＥＧ誘導体を使用して調製したが
、全てのそのＰＥＧ誘導体が、ある最小のカチオン性両親媒性物質：ＰＥＧ誘導
体の比で、小さく均質な複合体を形成することができた。本ミセル複合体は、一
旦小さく均質な複合体を形成するためのＰＥＧ脂質の最少量を決定すれば、広い
範囲のカチオン性脂質：ＰＥＧおよびカチオン性脂質：ＤＮＡの比を通して安定
かつ均質なままである。安定で均質な複合体を形成するためのＰＥＧの最少量を
、当業者には日常的に決定することができる。
【００５０】 使用されるＰＥＧの最少量は、カチオン性脂質と選択されるＰＥＧ脂質の特定
の組合せに依存する。例えば、アシル鎖を含むカチオン性脂質（ＧＬ−８９）は
、ＧＬ−６７のようなコレステロールに基づく脂質よりも、生物活性分子との混
合によって沈殿しにくい。このことは、ＧＬ−６７のようなコレステロールに基
づく脂質が無効であることを示唆するのではなく、単に安定で均質なミセル複合
体を形成するために異なる比のカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体が使用されること
を示唆する。その結果、ＰＥＧ誘導体の存在なしに、ミセル調製物を形成するの
に充分に安定であるカチオン性脂質を選択することができる。
の組合せに依存する。例えば、アシル鎖を含むカチオン性脂質（ＧＬ−８９）は
、ＧＬ−６７のようなコレステロールに基づく脂質よりも、生物活性分子との混
合によって沈殿しにくい。このことは、ＧＬ−６７のようなコレステロールに基
づく脂質が無効であることを示唆するのではなく、単に安定で均質なミセル複合
体を形成するために異なる比のカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体が使用されること
を示唆する。その結果、ＰＥＧ誘導体の存在なしに、ミセル調製物を形成するの
に充分に安定であるカチオン性脂質を選択することができる。
【００５１】 本発明の実施において有用なポチエチレングリコールの誘導体は、ＰＥＧポリ
マーに結合した疎水性基を有する任意のＰＥＧポリマーを含む。例としては、Ｐ
ＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ
−ＤＰＰＥ、またはＰＥＧ−セラミドを含む。理論により限定されるわけではな
いが、好適なＰＥＧ含有脂質は、カチオン性脂質を安定化またはこれと相互作用
できる疎水性基に結合している任意のＰＥＧポリマー誘導体であると考えられる
。これの２つの非常に好適な種は、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン（ジＣ14）（「ＤＭＰＥ」）；およびジステアロイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ジＣ18）（「ＤＳＰＥ」）を含む。
マーに結合した疎水性基を有する任意のＰＥＧポリマーを含む。例としては、Ｐ
ＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ
−ＤＰＰＥ、またはＰＥＧ−セラミドを含む。理論により限定されるわけではな
いが、好適なＰＥＧ含有脂質は、カチオン性脂質を安定化またはこれと相互作用
できる疎水性基に結合している任意のＰＥＧポリマー誘導体であると考えられる
。これの２つの非常に好適な種は、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン（ジＣ14）（「ＤＭＰＥ」）；およびジステアロイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ジＣ18）（「ＤＳＰＥ」）を含む。
【００５２】 ＰＥＧポリマーの選択に関して、このポリマーが線状であり、１，０００〜１
０，０００の範囲の分子量を有するものが、本発明の好適な実施態様である。こ
れの好適な種は、１５００〜７０００の分子量を有するものを含み、２０００お
よび５０００が有用で市販されている大きさの例である。本発明の実施において
、販売業者から提供される誘導体化ＰＥＧ種を使用するのが便利であり、そして
このような製品中のＰＥＧに割り当てられる分子量は、しばしば分子量平均を表
しており、製品中には短い分子も長い分子も存在することに注意されたい。この
ような分子量範囲は、典型的には使用される合成法の結果であり、任意のこのよ
うな製品の使用は、本発明の実施に含まれる。
０，０００の範囲の分子量を有するものが、本発明の好適な実施態様である。こ
れの好適な種は、１５００〜７０００の分子量を有するものを含み、２０００お
よび５０００が有用で市販されている大きさの例である。本発明の実施において
、販売業者から提供される誘導体化ＰＥＧ種を使用するのが便利であり、そして
このような製品中のＰＥＧに割り当てられる分子量は、しばしば分子量平均を表
しており、製品中には短い分子も長い分子も存在することに注意されたい。この
ような分子量範囲は、典型的には使用される合成法の結果であり、任意のこのよ
うな製品の使用は、本発明の実施に含まれる。
【００５３】 また、（１）２つ以上の結合リン脂質を含むか、または（２）分岐ＰＥＧ配列
を含むか、または（３）修飾（１）と（２）の両方を含む、誘導体化−ＰＥＧ種
を使用することも本発明の実施に含まれる。
を含むか、または（３）修飾（１）と（２）の両方を含む、誘導体化−ＰＥＧ種
を使用することも本発明の実施に含まれる。
【００５４】 したがって、誘導体化ＰＥＧの好適な種は、 （ａ）ＰＥＧ(5000)−ＤＭＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール５０００
−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン； （ｂ）ＰＥＧ(2000)−ＤＭＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール２０００
−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン； （ｃ）ＰＥＧ(5000)−ＤＳＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール５０００
−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン； （ｄ）ＰＥＧ(2000)−ＤＳＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール２０００
−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン； を含む。
−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン； （ｂ）ＰＥＧ(2000)−ＤＭＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール２０００
−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン； （ｃ）ＰＥＧ(5000)−ＤＳＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール５０００
−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン； （ｄ）ＰＥＧ(2000)−ＤＳＰＥとも呼ばれる、ポリエチレングリコール２０００
−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン； を含む。
【００５５】 ＰＥＧのいくつかのリン脂質誘導体は、販売業者から入手できる。例えば、以
下の種：ジＣ１４：０、ジＣ１６：０、ジＣ１８：０、ジＣ１８：１、および１
６：０／１８：１は、アバンティ・ポーラー・リピッド（Avanti Polar Lipids
）（アラバスター（Alabaster）、アラバマ州、米国）から平均２０００または
平均５０００ＭＷのＰＥＧ誘導体として、カタログ番号、８８０１５０、８８０
１６０、８８０１２０、８８０１３０、８８０１４０、８８０２１０、８８０２
００、８８０２２０、８８０２３０、および８８０２４０として入手できる。
下の種：ジＣ１４：０、ジＣ１６：０、ジＣ１８：０、ジＣ１８：１、および１
６：０／１８：１は、アバンティ・ポーラー・リピッド（Avanti Polar Lipids
）（アラバスター（Alabaster）、アラバマ州、米国）から平均２０００または
平均５０００ＭＷのＰＥＧ誘導体として、カタログ番号、８８０１５０、８８０
１６０、８８０１２０、８８０１３０、８８０１４０、８８０２１０、８８０２
００、８８０２２０、８８０２３０、および８８０２４０として入手できる。
【００５６】 共脂質の選択 共脂質の使用は場合による。調製物に応じて、中性、陽性、または陰性の共脂
質をミセル複合体に含めることは、送達およびトランスフェクション能力を実質
的に増強しうる。代表的な共脂質は、当該分野において最も一般的に使用される
種であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジフ
ィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リゾ−ホスファチジルエタノール
アミン、他のホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾ
−ホスファチジルコリン、ホスファチジル−イノシトールおよびコレステロール
を含む。典型的には、カチオン性両親媒性物質対共脂質の好ましいモル比は、約
１：１である。しかし、考慮すべき範囲を超えることも含め、この比を変動させ
ることも本発明の実施に含まれるが、２：１から１：２の比が通常は好ましい。
ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンの使用は、「ＤＯＰＥ」の使用
と同様に、本発明の実施に非常に好ましい。
質をミセル複合体に含めることは、送達およびトランスフェクション能力を実質
的に増強しうる。代表的な共脂質は、当該分野において最も一般的に使用される
種であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジフ
ィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リゾ−ホスファチジルエタノール
アミン、他のホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾ
−ホスファチジルコリン、ホスファチジル−イノシトールおよびコレステロール
を含む。典型的には、カチオン性両親媒性物質対共脂質の好ましいモル比は、約
１：１である。しかし、考慮すべき範囲を超えることも含め、この比を変動させ
ることも本発明の実施に含まれるが、２：１から１：２の比が通常は好ましい。
ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンの使用は、「ＤＯＰＥ」の使用
と同様に、本発明の実施に非常に好ましい。
【００５７】 本発明の実施では、好適な調製物はまた、ＰＥＧ誘導体のモル比に関して定義
されるが、好ましい比は、選択されたカチオン性両親媒性物質により変動する。
本発明の実施の代表的な好適なミセル調製物は、約１：１：０．２５のカチオン
性両親媒性物質ＧＬ−６７：共脂質ＤＯＰＥ：ＰＥＧ5000のモル組成比を有する
。この好ましい例において、共脂質は、ジフィタノイルホスファチジルエタノー
ルアミン、またはＤＯＰＥであり、そしてＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧ2000またはＰ
ＥＧ5000のＤＭＰＥまたはＤＳＰＥ結合体である。
されるが、好ましい比は、選択されたカチオン性両親媒性物質により変動する。
本発明の実施の代表的な好適なミセル調製物は、約１：１：０．２５のカチオン
性両親媒性物質ＧＬ−６７：共脂質ＤＯＰＥ：ＰＥＧ5000のモル組成比を有する
。この好ましい例において、共脂質は、ジフィタノイルホスファチジルエタノー
ルアミン、またはＤＯＰＥであり、そしてＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧ2000またはＰ
ＥＧ5000のＤＭＰＥまたはＤＳＰＥ結合体である。
【００５８】 生物活性分子 本発明の実施において有用でありうる生物活性分子は、例えば、ゲノムＤＮＡ
、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、オリゴデオキシヌク
レオチド、ポリペプチドおよび低分子量薬物またはホルモンを含む。本発明の実
施において、当業者は、日常的な実験として、どの分子が哺乳動物細胞に有効に
送達されるかを決定することができる。当該分野では、一旦カチオン性両親媒性
複合体（または他の脂質または非脂質担体）による哺乳動物細胞への生物活性分
子の送達が証明されると、送達のための他の分子の選択は、日常的な作業になる
ことは周知である。
、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、オリゴデオキシヌク
レオチド、ポリペプチドおよび低分子量薬物またはホルモンを含む。本発明の実
施において、当業者は、日常的な実験として、どの分子が哺乳動物細胞に有効に
送達されるかを決定することができる。当該分野では、一旦カチオン性両親媒性
複合体（または他の脂質または非脂質担体）による哺乳動物細胞への生物活性分
子の送達が証明されると、送達のための他の分子の選択は、日常的な作業になる
ことは周知である。
【００５９】 標的化および標的化複合体 本発明のさらに別の側面は、哺乳動物の細胞中への生物活性分子の送達を実現
する任意の方法における標的化物質の使用である。好適な実施態様では、標的化
物質は、従来のおよびミセルカチオン性両親媒性調製物またはウイルスベクター
やアデノウイルスのようなウイルス性調製物と共に使用される。標的化物質は通
常、特定の哺乳動物細胞を優先的に標的とするか、またはこれに結合する分子、
ペプチド配列、または大きなタンパク質である。多くの標的化物質は、当該分野
において周知の分子である。例えば、ＲＧＤ配列を含むペプチドであるペルタク
チン（Pertactin）は、気道上皮細胞を優先的に標的とし、かつこれに結合する
。本発明の実施において、標的化物質またはリガンドは、担体複合体に結合して
いる。当該分野では、単一の標的化物質が特定の細胞を標的とするが、別の単位
への標的化物質の結合が、しばしば分子の標的化活性を変更または消失させるこ
とは周知である。しかしＰＥＧ誘導体への標的化物質の結合は、標的化物質の活
性を常に消失させるわけではない。したがって、ミセル複合体への標的化物質の
結合は、この物質の活性を保存し、そしてミセル複合体に標的化物質を結合させ
ることは、本発明の好適な実施態様である。
する任意の方法における標的化物質の使用である。好適な実施態様では、標的化
物質は、従来のおよびミセルカチオン性両親媒性調製物またはウイルスベクター
やアデノウイルスのようなウイルス性調製物と共に使用される。標的化物質は通
常、特定の哺乳動物細胞を優先的に標的とするか、またはこれに結合する分子、
ペプチド配列、または大きなタンパク質である。多くの標的化物質は、当該分野
において周知の分子である。例えば、ＲＧＤ配列を含むペプチドであるペルタク
チン（Pertactin）は、気道上皮細胞を優先的に標的とし、かつこれに結合する
。本発明の実施において、標的化物質またはリガンドは、担体複合体に結合して
いる。当該分野では、単一の標的化物質が特定の細胞を標的とするが、別の単位
への標的化物質の結合が、しばしば分子の標的化活性を変更または消失させるこ
とは周知である。しかしＰＥＧ誘導体への標的化物質の結合は、標的化物質の活
性を常に消失させるわけではない。したがって、ミセル複合体への標的化物質の
結合は、この物質の活性を保存し、そしてミセル複合体に標的化物質を結合させ
ることは、本発明の好適な実施態様である。
【００６０】 カチオン性両親媒性複合体、アデノウイルス、または他の担体への標的化物質
の結合は、所望の哺乳動物細胞に対して特異的標的化を可能にすることができる
。所望の哺乳動物細胞に対する標的化は、生物活性分子のより効率的な送達を可
能にして、従って標的哺乳動物細胞のトランスフェクションが増やすことができ
有利である。
の結合は、所望の哺乳動物細胞に対して特異的標的化を可能にすることができる
。所望の哺乳動物細胞に対する標的化は、生物活性分子のより効率的な送達を可
能にして、従って標的哺乳動物細胞のトランスフェクションが増やすことができ
有利である。
【００６１】 標的化物質に結合した脂質複合体は、上述の任意のカチオン性両親媒性物質、
ＰＥＧ誘導体、生物活性分子、および場合により共脂質を含んでもよい。さらに
ＰＥＧ誘導体が必要でなく、かつ標的化物質が場合により共脂質を含むカチオン
性両親媒性物質／生物活性分子の複合体に直接結合される調製物が存在する。脂
質複合体は、ミセルまたは従来の脂質調製物であってよい。標的化物質はまた、
ＰＥＧ誘導体、すなわちＰＥＧ−ＤＭＰＥに直接加えてもよい。さらに別の実施
態様では、標的化物質は、カチオン性ポリマーまたは脂質のような疎水性残基に
結合する。
ＰＥＧ誘導体、生物活性分子、および場合により共脂質を含んでもよい。さらに
ＰＥＧ誘導体が必要でなく、かつ標的化物質が場合により共脂質を含むカチオン
性両親媒性物質／生物活性分子の複合体に直接結合される調製物が存在する。脂
質複合体は、ミセルまたは従来の脂質調製物であってよい。標的化物質はまた、
ＰＥＧ誘導体、すなわちＰＥＧ−ＤＭＰＥに直接加えてもよい。さらに別の実施
態様では、標的化物質は、カチオン性ポリマーまたは脂質のような疎水性残基に
結合する。
【００６２】 当該分野で公知の任意の標的化物質が、本発明の実施において有用な場合があ
る。好適な標的化物質は、気道上皮細胞を標的とするＲＧＤ配列を含むペプチド
であるペルタクチン；気道の細胞上のＰ２Ｕ受容体を含むＰ２Ｕ受容体を標的と
するＵＤＰ／ＵＴＰ；気道および肝臓の内因性レクチンを標的とする乳糖；およ
び腫瘍内皮細胞を標的とするサイクリックＲＧＤペプチドを含む。他の好適な標
的化物質は、両親媒性ペプチドのペネトラチン（Penetratin）、ＬＤＬ受容体を
標的とする物質であるレクチン、マンノース−６−ＰＯ4 受容体を標的とするマ
ンノース−６−リン酸、および気道特異的１本鎖抗体を含む。
る。好適な標的化物質は、気道上皮細胞を標的とするＲＧＤ配列を含むペプチド
であるペルタクチン；気道の細胞上のＰ２Ｕ受容体を含むＰ２Ｕ受容体を標的と
するＵＤＰ／ＵＴＰ；気道および肝臓の内因性レクチンを標的とする乳糖；およ
び腫瘍内皮細胞を標的とするサイクリックＲＧＤペプチドを含む。他の好適な標
的化物質は、両親媒性ペプチドのペネトラチン（Penetratin）、ＬＤＬ受容体を
標的とする物質であるレクチン、マンノース−６−ＰＯ4 受容体を標的とするマ
ンノース−６−リン酸、および気道特異的１本鎖抗体を含む。
【００６３】 本発明の好適な側面において、ペプチドリガンドは、脂質：生物活性分子の複
合体に組み込んで、遺伝子転移系のトランスフェクション活性を増大させるか、
または気道上皮細胞への結合を改善することができる。
合体に組み込んで、遺伝子転移系のトランスフェクション活性を増大させるか、
または気道上皮細胞への結合を改善することができる。
【００６４】 ペプチド標的化物質の他の例は、ＨＡＶペプチドおよびＣＮＰ−２２ペプチド
を含む。ＨＡＶペプチドは、カドヘリン介在性細胞接着を調節するヒスチジン、
アラニンおよびバリンの配列を含む一連のペプチドである。理論により限定され
るわけではないが、カドヘリン複合体は、細胞−細胞接着を形成することにより
組織の完全性を維持し、体内の物理的および透過性障壁を生じさせる。カドヘリ
ンは、上皮、内皮細胞、神経および腫瘍細胞接着を調節することが証明されてい
る。細胞接着は、細胞間のカドヘリンの細胞外ドメインと、細胞内のカテニン（
catenin）タンパク質およびアクチン細胞骨格を含むカドヘリンの細胞質ドメイ
ンとの間の相互作用により達成される。ヒスチジン、アラニンおよびバリンのト
リペプチド（ＨＡＶ）は、カドヘリンの細胞外および細胞質ドメインに位置する
。ＨＡＶペプチドは、カドヘリン間のヘモフィリックな相互作用には決定的に重
要であり、カテニン（catenin）タンパク質を介するアクチン細胞骨格との相互
作用において重要な役割を果たしている。ＨＡＶペプチドは、線状であっても環
状であってもよい。
を含む。ＨＡＶペプチドは、カドヘリン介在性細胞接着を調節するヒスチジン、
アラニンおよびバリンの配列を含む一連のペプチドである。理論により限定され
るわけではないが、カドヘリン複合体は、細胞−細胞接着を形成することにより
組織の完全性を維持し、体内の物理的および透過性障壁を生じさせる。カドヘリ
ンは、上皮、内皮細胞、神経および腫瘍細胞接着を調節することが証明されてい
る。細胞接着は、細胞間のカドヘリンの細胞外ドメインと、細胞内のカテニン（
catenin）タンパク質およびアクチン細胞骨格を含むカドヘリンの細胞質ドメイ
ンとの間の相互作用により達成される。ヒスチジン、アラニンおよびバリンのト
リペプチド（ＨＡＶ）は、カドヘリンの細胞外および細胞質ドメインに位置する
。ＨＡＶペプチドは、カドヘリン間のヘモフィリックな相互作用には決定的に重
要であり、カテニン（catenin）タンパク質を介するアクチン細胞骨格との相互
作用において重要な役割を果たしている。ＨＡＶペプチドは、線状であっても環
状であってもよい。
【００６５】 本発明の実施において、ＨＡＶペプチドは、好ましくは気道の上皮細胞に結合
して、これに内在化されるため、生物活性分子を以下の細胞に送達するための標
的化物質として利用できる：１）上皮細胞、例えば、嚢胞性線維症膜貫通調節物
質（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）（ＣＦＴＲ）遺
伝子をＣＦ肺の気道上皮細胞に送達するための標的化物質として；２）内皮細胞
、例えば、内皮細胞にアポトーシスを引き起こしうる遺伝子を送達することによ
り、腫瘍周囲の脈管形成を阻害する；３）神経細胞；および４）腫瘍細胞。ＨＡ
Ｖはまた、例えば、１）リンカーおよび脂質を含むか含まないｐＤＮＡ複合体に
より、ポリ−Ｌ−リジンまたは線状／分岐ポリエチレンイミンまたは他のポリペ
プチドまたは（Ｘ）−ホスファチジルエタノールアミン（Ｘ−ＰＥ；例えば、Ｎ
−ＭＰＢ−ＰＥ）と化学的に結合させるか；または２）リンカーによりウイルス
ベクターと化学的に結合させることによって、生物活性分子を標的細胞にさらに
効率的に送達することもできる。また、負に荷電した非ウイルスまたはウイルス
ベクターの投与前の予備処理のために、結合体の正に荷電したＨＡＶを使用して
も、または負に荷電した非ウイルスまたはウイルスベクターと、結合した正に荷
電したＨＡＶの混合複合体を同時投与してもよい。
して、これに内在化されるため、生物活性分子を以下の細胞に送達するための標
的化物質として利用できる：１）上皮細胞、例えば、嚢胞性線維症膜貫通調節物
質（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）（ＣＦＴＲ）遺
伝子をＣＦ肺の気道上皮細胞に送達するための標的化物質として；２）内皮細胞
、例えば、内皮細胞にアポトーシスを引き起こしうる遺伝子を送達することによ
り、腫瘍周囲の脈管形成を阻害する；３）神経細胞；および４）腫瘍細胞。ＨＡ
Ｖはまた、例えば、１）リンカーおよび脂質を含むか含まないｐＤＮＡ複合体に
より、ポリ−Ｌ−リジンまたは線状／分岐ポリエチレンイミンまたは他のポリペ
プチドまたは（Ｘ）−ホスファチジルエタノールアミン（Ｘ−ＰＥ；例えば、Ｎ
−ＭＰＢ−ＰＥ）と化学的に結合させるか；または２）リンカーによりウイルス
ベクターと化学的に結合させることによって、生物活性分子を標的細胞にさらに
効率的に送達することもできる。また、負に荷電した非ウイルスまたはウイルス
ベクターの投与前の予備処理のために、結合体の正に荷電したＨＡＶを使用して
も、または負に荷電した非ウイルスまたはウイルスベクターと、結合した正に荷
電したＨＡＶの混合複合体を同時投与してもよい。
【００６６】 ＨＡＶペプチドはまた、細胞接着調節物質として使用してもよい。あるＨＡＶ
ペプチドは、細胞−細胞接着部を強力に破壊し、そしてあるものは細胞−細胞接
着部の形成を強力に防止する。これらの機能に基づいて、本ペプチドを単独で、
またはタイトジャンクション破壊物質（例えば、ＥＧＴＡまたはパルミトイル−
Ｌ−カルニチンまたはジメチルβ−シクロデキストリンまたはメチルβ−シクロ
デキストリンまたはα−シクロデキストリン）と組合せて使用することにより、
生物活性分子の以下の細胞への送達が改善される：１）上皮細胞、例えば、側底
膜への遺伝子取り込みを増強するための、ＣＦ肺の気道上皮における細胞−細胞
透過性障壁を通るＣＦＴＲ遺伝子の送達；２）内皮細胞、例えば、腫瘍細胞への
血液脳関門を通る遺伝子の送達；３）神経細胞、例えば、ベクターの移行を増大
させるため；４）腫瘍細胞、特に固形腫瘍（例えば、黒色腫）、多くの固形腫瘍
は、障壁内部で進展し、これによって中心部の細胞または注射部位から距離のあ
る細胞への遺伝子送達が制限されるため；および５）ベクターの移行を増大させ
るため、ベクターを含む局所注射による、筋肉、肝臓または他の全器官。
ペプチドは、細胞−細胞接着部を強力に破壊し、そしてあるものは細胞−細胞接
着部の形成を強力に防止する。これらの機能に基づいて、本ペプチドを単独で、
またはタイトジャンクション破壊物質（例えば、ＥＧＴＡまたはパルミトイル−
Ｌ−カルニチンまたはジメチルβ−シクロデキストリンまたはメチルβ−シクロ
デキストリンまたはα−シクロデキストリン）と組合せて使用することにより、
生物活性分子の以下の細胞への送達が改善される：１）上皮細胞、例えば、側底
膜への遺伝子取り込みを増強するための、ＣＦ肺の気道上皮における細胞−細胞
透過性障壁を通るＣＦＴＲ遺伝子の送達；２）内皮細胞、例えば、腫瘍細胞への
血液脳関門を通る遺伝子の送達；３）神経細胞、例えば、ベクターの移行を増大
させるため；４）腫瘍細胞、特に固形腫瘍（例えば、黒色腫）、多くの固形腫瘍
は、障壁内部で進展し、これによって中心部の細胞または注射部位から距離のあ
る細胞への遺伝子送達が制限されるため；および５）ベクターの移行を増大させ
るため、ベクターを含む局所注射による、筋肉、肝臓または他の全器官。
【００６７】 ２２個のアミノ酸を含むＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−２２）は、細
胞内グアニル酸シクラーゼドメインを含む膜貫通型受容体であるグアニル酸シク
ラーゼ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）受容体に結合して、これを活性化する。理論により限定
されるわけではないが、このペプチドの調節経路は、サイクリックＧＭＰ（ｃＧ
ＭＰ）により支配的に媒介されると考えられている。肺では、ＣＮＰ−２２の結
合および機能は、気道上皮細胞に優勢である。インビボの気道上皮細胞へのＣＮ
Ｐ−２２の特異的結合は、ｃＧＭＰレベル、活性ＣＦＴＲ依存性塩化物輸送を上
昇させ、そして繊毛搏動頻度を刺激する、ＣＮＰ−２２の機能能力により証明さ
れている。さらに、１６個のリジンと結合したＣＮＰ−２２（Ｋ１６−ＣＮＰ−
２２）は、マウスの気管および他の気道の、ある型の上皮細胞に結合する。
胞内グアニル酸シクラーゼドメインを含む膜貫通型受容体であるグアニル酸シク
ラーゼ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）受容体に結合して、これを活性化する。理論により限定
されるわけではないが、このペプチドの調節経路は、サイクリックＧＭＰ（ｃＧ
ＭＰ）により支配的に媒介されると考えられている。肺では、ＣＮＰ−２２の結
合および機能は、気道上皮細胞に優勢である。インビボの気道上皮細胞へのＣＮ
Ｐ−２２の特異的結合は、ｃＧＭＰレベル、活性ＣＦＴＲ依存性塩化物輸送を上
昇させ、そして繊毛搏動頻度を刺激する、ＣＮＰ−２２の機能能力により証明さ
れている。さらに、１６個のリジンと結合したＣＮＰ−２２（Ｋ１６−ＣＮＰ−
２２）は、マウスの気管および他の気道の、ある型の上皮細胞に結合する。
【００６８】 本発明の実施において、ＣＮＰ−２２を、標的化物質として使用してもよい。
例えば、マウス気管、他の気道、および肺へのアデノウイルスベクター（ＡｄＶ
）介在性遺伝子転移は、Ｋ１６−ＣＮＰ−２２で処理したマウスにおいて増大す
る。肺へのカチオン性脂質：ｐＤＮＡ介在性遺伝子転移の増強もまた、Ｋ１６−
ＣＮＰ−２２で処理したマウスで観察されている。ＣＮＰ−２２および／または
ＧＣ−Ｂ受容体はまた脳、子宮／卵管、小腸、結腸および腎臓でも同定されてい
るため、ＣＮＰ−２２ペプチドはまた、生物活性分子の送達のためにこれらの器
官を標的とするのに使用される。
例えば、マウス気管、他の気道、および肺へのアデノウイルスベクター（ＡｄＶ
）介在性遺伝子転移は、Ｋ１６−ＣＮＰ−２２で処理したマウスにおいて増大す
る。肺へのカチオン性脂質：ｐＤＮＡ介在性遺伝子転移の増強もまた、Ｋ１６−
ＣＮＰ−２２で処理したマウスで観察されている。ＣＮＰ−２２および／または
ＧＣ−Ｂ受容体はまた脳、子宮／卵管、小腸、結腸および腎臓でも同定されてい
るため、ＣＮＰ−２２ペプチドはまた、生物活性分子の送達のためにこれらの器
官を標的とするのに使用される。
【００６９】 また、ＣＮＰを１）リンカーにより、ポリ−Ｌ−リジン、線状／分岐ポリエチ
レンイミンまたは他のポリペプチドまたは（Ｘ）−ホスファチジルエタノールア
ミン（Ｘ−ＰＥ；例えば、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ）と化学的に結合させ、脂質を含む
か含まないｐＤＮＡを作るか、またはＣＮＰを２）リンカーによりウイルスベク
ターと化学的に結合させて、遺伝子を標的細胞にさらに効率的に送達することも
本発明の実施に含まれる。また、結合した正に荷電したＣＮＰは、負に荷電した
非ウイルスまたはウイルスベクターの投与前の予備処理のために使用しても、ま
たは負に荷電した非ウイルスまたはウイルスベクターと、結合した正に荷電した
ＣＮＰの混合複合体を同時投与してもよい。
レンイミンまたは他のポリペプチドまたは（Ｘ）−ホスファチジルエタノールア
ミン（Ｘ−ＰＥ；例えば、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ）と化学的に結合させ、脂質を含む
か含まないｐＤＮＡを作るか、またはＣＮＰを２）リンカーによりウイルスベク
ターと化学的に結合させて、遺伝子を標的細胞にさらに効率的に送達することも
本発明の実施に含まれる。また、結合した正に荷電したＣＮＰは、負に荷電した
非ウイルスまたはウイルスベクターの投与前の予備処理のために使用しても、ま
たは負に荷電した非ウイルスまたはウイルスベクターと、結合した正に荷電した
ＣＮＰの混合複合体を同時投与してもよい。
【００７０】 本発明の実施において、標的化物質を含む従来のおよびミセル複合体は、同じ
様式で、かつ標的化物質を含まない複合体と同じ方法を使用して、調製および投
与してもよい。同様に、カチオン性両親媒性物質：ＰＥＧ誘導体およびカチオン
性両親媒性物質：生物活性分子の比は、使用される脂質の型に依存する。
様式で、かつ標的化物質を含まない複合体と同じ方法を使用して、調製および投
与してもよい。同様に、カチオン性両親媒性物質：ＰＥＧ誘導体およびカチオン
性両親媒性物質：生物活性分子の比は、使用される脂質の型に依存する。
【００７１】 薬剤組成物の調製と投与方法 本発明は、生物活性分子の送達および／またはトランスフェクションを促進す
る薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、胃粘膜、心臓、肺、肝臓、お
よび腫瘍血管系、そして固形腫瘍のような組織および器官への生物活性分子の送
達を促進する。さらに本発明の組成物は、組織培養におけるような、インビトロ
で維持される細胞中への生物活性分子の移入を促進する。
る薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、胃粘膜、心臓、肺、肝臓、お
よび腫瘍血管系、そして固形腫瘍のような組織および器官への生物活性分子の送
達を促進する。さらに本発明の組成物は、組織培養におけるような、インビトロ
で維持される細胞中への生物活性分子の移入を促進する。
【００７２】 本発明の両親媒性物質を使用して治療量で細胞内に供給できる生物活性分子は
、（ａ）当該分野において既知の治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド；（ｂ）リボソーム
ＲＮＡ；（ｃ）遺伝子の転写産物を不活化するのに有用であり、例えば、悪性細
胞の増殖を調節するための治療物質として有用である、アンチセンスポリヌクレ
オチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）；（ｄ）リボザイム；および（ｅ）ホルモンおよ
び抗生物質のような低分子量生物活性分子を含む。
、（ａ）当該分野において既知の治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド；（ｂ）リボソーム
ＲＮＡ；（ｃ）遺伝子の転写産物を不活化するのに有用であり、例えば、悪性細
胞の増殖を調節するための治療物質として有用である、アンチセンスポリヌクレ
オチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）；（ｄ）リボザイム；および（ｅ）ホルモンおよ
び抗生物質のような低分子量生物活性分子を含む。
【００７３】 本発明のカチオン性両親媒性種、ＰＥＧ誘導体、および共脂質は、２つまたは
それ以上の種のカチオン性両親媒性物質またはＰＥＧ誘導体または共脂質を組合
せて使用して、標的細胞へのおよび／またはそれらの細胞下区画への生物活性分
子の移入を促進するように、配合される。本発明のカチオン性両親媒性物質はま
た、当該分野において既知の両親媒性物質で使用するのに配合することができる
。さらに標的化物質は、カチオン性両親媒性物質、ＰＥＧ誘導体、および共脂質
の任意の組合せに結合させられる。
それ以上の種のカチオン性両親媒性物質またはＰＥＧ誘導体または共脂質を組合
せて使用して、標的細胞へのおよび／またはそれらの細胞下区画への生物活性分
子の移入を促進するように、配合される。本発明のカチオン性両親媒性物質はま
た、当該分野において既知の両親媒性物質で使用するのに配合することができる
。さらに標的化物質は、カチオン性両親媒性物質、ＰＥＧ誘導体、および共脂質
の任意の組合せに結合させられる。
【００７４】 本発明の薬剤組成物の用量は、生物活性分子の半減期、生物活性分子の力価、
両親媒性物質の半減期、両親媒性物質またはその分解産物の有害作用の可能性、
投与経路、患者の症状などのような因子に応じて、変動する。このような因子は
、当業者には測定可能である。
両親媒性物質の半減期、両親媒性物質またはその分解産物の有害作用の可能性、
投与経路、患者の症状などのような因子に応じて、変動する。このような因子は
、当業者には測定可能である。
【００７５】 本発明のミセル複合体およびミセル複合体を含む薬剤組成物の非常に正確な用
量を供給するために、種々の投与方法を使用することができる。このような製剤
は、経口、静脈内、非経口、局所、経粘膜的に、または患者の体腔への製剤の注
射により、または生物分解性材料を含む徐放性製剤を使用することにより、また
は追加のミセル、ゲルおよびリポソームを使用するオンサイト送達により、投与
することができる。噴霧装置、粉末吸入器、およびエーロゾル化溶液は、呼吸器
管にこのような製剤を投与するために使用される代表的な方法である。また、全
身性送達のためにミセル複合体を使用することも本発明の実施に含まれる。
量を供給するために、種々の投与方法を使用することができる。このような製剤
は、経口、静脈内、非経口、局所、経粘膜的に、または患者の体腔への製剤の注
射により、または生物分解性材料を含む徐放性製剤を使用することにより、また
は追加のミセル、ゲルおよびリポソームを使用するオンサイト送達により、投与
することができる。噴霧装置、粉末吸入器、およびエーロゾル化溶液は、呼吸器
管にこのような製剤を投与するために使用される代表的な方法である。また、全
身性送達のためにミセル複合体を使用することも本発明の実施に含まれる。
【００７６】 さらに、本発明の治療用組成物は、一般に賦形剤（例えば、炭水化物の乳糖、
トレハロース、ショ糖、マンニトール、マルトースまたはガラクトース、および
無機または有機塩など）と共に処方することができ、また使用の前にこのような
賦形剤の存在下で凍結乾燥（次に再水和）してもよい。本発明の各複合体につい
ての最適化処方の条件は、製剤の分野における熟練者であれば決定することがで
きる。具体的な製剤の特定の賦形剤の最適濃度の選択には実験を必要とするが、
当業者であれば各製剤について決定することができる。
トレハロース、ショ糖、マンニトール、マルトースまたはガラクトース、および
無機または有機塩など）と共に処方することができ、また使用の前にこのような
賦形剤の存在下で凍結乾燥（次に再水和）してもよい。本発明の各複合体につい
ての最適化処方の条件は、製剤の分野における熟練者であれば決定することがで
きる。具体的な製剤の特定の賦形剤の最適濃度の選択には実験を必要とするが、
当業者であれば各製剤について決定することができる。
【００７７】 本発明のさらに他の側面は、送達用の生物活性分子との接触前の、または外複
合体が生物学的液体と接触する前の、本発明の複合体のカチオン性両親媒性物質
のプロトン化状態に関する。このような治療用組成物を形成または維持するため
に、完全にプロトン化された型、部分的にプロトン化された型、または遊離塩基
型の両親媒性物質を提供することは、本発明の実施に含まれる。
合体が生物学的液体と接触する前の、本発明の複合体のカチオン性両親媒性物質
のプロトン化状態に関する。このような治療用組成物を形成または維持するため
に、完全にプロトン化された型、部分的にプロトン化された型、または遊離塩基
型の両親媒性物質を提供することは、本発明の実施に含まれる。
【００７８】 例 例１−ミセルおよび従来のカチオン性脂質：生物活性分子複合体の調製 以下の例では、カチオン性脂質ミセル複合体を調製するのに使用される典型的
な操作を略述する。図１は、共脂質を含むカチオン性脂質ミセル複合体（ｂ）お
よび含まない複合体（ｃ）と比較される、従来のカチオン性脂質複合体（ａ）の
調製のための操作の略図である。本発明の実施は、本明細書に開示される操作法
に限定されるものではない。
な操作を略述する。図１は、共脂質を含むカチオン性脂質ミセル複合体（ｂ）お
よび含まない複合体（ｃ）と比較される、従来のカチオン性脂質複合体（ａ）の
調製のための操作の略図である。本発明の実施は、本明細書に開示される操作法
に限定されるものではない。
【００７９】 カチオン性脂質：ＰＥＧ脂質：ｐＤＮＡミセル複合体の調製 （１）ミセルカチオン性脂質：ＰＥＧ脂質溶液は、以下のとおり調製した。カチ
オン性脂質は、脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終カチオン性脂質濃度（典型的
ではあるが排他的ではない範囲は、０．２５〜１６mMカチオン性脂質）の４倍濃
度で水和した。ＰＥＧ含有脂質は、脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終ＰＥＧ脂
質濃度（典型的ではあるが排他的ではない範囲は、０．２５〜１６mMカチオン性
脂質）の４倍濃度で水和した。（ＰＥＧ脂質に関して、脂質アンカーの最大範囲
が利用されており、ＰＥＧヘッド基は、種々の大きさのどれであってもよい。）
いったん水和したら、カチオン性脂質を、１：１（容量：容量）比でＰＥＧ脂質
に加えた。これは典型的な方法であるが、カチオン性脂質：ＰＥＧ脂質の所望の
比が最終的に達成すれば、これは必須ではない。プラスミドＤＮＡは、脂質：ｐ
ＤＮＡ複合体の所望の最終ｐＤＮＡ濃度の２倍に希釈した。次にカチオン性脂質
：ＰＥＧ脂質：ｐＤＮＡ複合体は、ミセルカチオン性：ＰＥＧ脂質溶液をｐＤＮ
Ａに１：１比（容量：容量）で加えることにより調製した。
オン性脂質は、脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終カチオン性脂質濃度（典型的
ではあるが排他的ではない範囲は、０．２５〜１６mMカチオン性脂質）の４倍濃
度で水和した。ＰＥＧ含有脂質は、脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終ＰＥＧ脂
質濃度（典型的ではあるが排他的ではない範囲は、０．２５〜１６mMカチオン性
脂質）の４倍濃度で水和した。（ＰＥＧ脂質に関して、脂質アンカーの最大範囲
が利用されており、ＰＥＧヘッド基は、種々の大きさのどれであってもよい。）
いったん水和したら、カチオン性脂質を、１：１（容量：容量）比でＰＥＧ脂質
に加えた。これは典型的な方法であるが、カチオン性脂質：ＰＥＧ脂質の所望の
比が最終的に達成すれば、これは必須ではない。プラスミドＤＮＡは、脂質：ｐ
ＤＮＡ複合体の所望の最終ｐＤＮＡ濃度の２倍に希釈した。次にカチオン性脂質
：ＰＥＧ脂質：ｐＤＮＡ複合体は、ミセルカチオン性：ＰＥＧ脂質溶液をｐＤＮ
Ａに１：１比（容量：容量）で加えることにより調製した。
【００８０】 （２）共脂質を調製物の一部として、ミセルカチオン性脂質溶液も調製した。こ
れは（１）に上述のように行ったが、共脂質を脂質フィルムとしてＰＥＧ脂質と
配合し、単一溶液として水和するか、または代替法では共脂質を脂質フィルムと
して配合して、ＰＥＧ脂質で水和する。ＰＥＧ：共脂質溶液は、次に上記ＰＥＧ
脂質を代用することができる。
れは（１）に上述のように行ったが、共脂質を脂質フィルムとしてＰＥＧ脂質と
配合し、単一溶液として水和するか、または代替法では共脂質を脂質フィルムと
して配合して、ＰＥＧ脂質で水和する。ＰＥＧ：共脂質溶液は、次に上記ＰＥＧ
脂質を代用することができる。
【００８１】 ミセル複合体の分析 好ましくは最少量のＰＥＧ脂質を使用して、ミセル脂質溶液を生物活性分子に
加えると、安定で均質な複合体が形成された。さらに、必要なＰＥＧの最少量は
、カチオン性脂質と選択されるＰＥＧ脂質の特定の組合せに依存した。ミセル複
合体を形成するために使用されるＰＥＧの最少量を測定するための方法は、特に
問わないが、以下を含む： １）生物活性分子にミセル脂質を添加後、脂質：生物活性分子複合体が観察さ
れた。調製後にミセル複合体が観察されたら、懸濁液は清澄〜不透明であり、粒
子を含まなかった。粒子が観察されたら、本調製物は、好適な安定で均質なミセ
ル複合体を形成するためのＰＥＧの最少量には不足していた。これと比較すると
、従来のカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、全体に粒子を含まない不透明溶液
であった。 ２）ミセル脂質：生物活性分子複合体を、整粒器を使用して調製後、整粒した
。調製後にミセル複合体を整粒すると、粒子集団は粒度に関して実質的に均質で
あり、さらに好ましくは小さかった（好適な実施態様では直径約２５〜２５０nm
）。粒度集団が大きな不均質の粒子を含んでいたら、ＰＥＧ脂質の最少量は、調
製物中に存在していなかった。これと比較すると、従来のカチオン性脂質：ｐＤ
ＮＡ複合体では、全体に直径約２００〜８００nmの粒子が得られた。これらの懸
濁液は、粒度が非常に不均質になりやすく、複合体の粒度は、調製物中に使用さ
れるカチオン性脂質に大きく依存した。ミセル調製物で観察された小さく均質な
性状を示す従来のカチオン性脂質複合体は、全体に観察されなかった。 ３）アガロースゲル電気泳動で、ミセル複合体中の生物活性分子の挙動を分析
した。安定で均質なミセル複合体を形成するためのＰＥＧ脂質の最少量を使用す
ると、生物活性分子はアガロースゲル中に、遊離の生物活性分子とは異なる様式
で移動した（ただし、複合体化プラスミドに加えて「遊離」のプラスミドの集団
を視覚化することは可能であった）。もしＰＥＧ脂質の最少量を使用したのでな
かったら、ゲルにおいて視覚化されたプラスミドの大部分は、１）遊離ｐＤＮＡ
のように転移したか、または２）ゲルのウェル中に保持され、従ってゲルで可視
化されなかった。ＰＥＧ脂質の最少量が使用されたことに確信を持つために、こ
れらの２つ以上の試験を行った。
加えると、安定で均質な複合体が形成された。さらに、必要なＰＥＧの最少量は
、カチオン性脂質と選択されるＰＥＧ脂質の特定の組合せに依存した。ミセル複
合体を形成するために使用されるＰＥＧの最少量を測定するための方法は、特に
問わないが、以下を含む： １）生物活性分子にミセル脂質を添加後、脂質：生物活性分子複合体が観察さ
れた。調製後にミセル複合体が観察されたら、懸濁液は清澄〜不透明であり、粒
子を含まなかった。粒子が観察されたら、本調製物は、好適な安定で均質なミセ
ル複合体を形成するためのＰＥＧの最少量には不足していた。これと比較すると
、従来のカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、全体に粒子を含まない不透明溶液
であった。 ２）ミセル脂質：生物活性分子複合体を、整粒器を使用して調製後、整粒した
。調製後にミセル複合体を整粒すると、粒子集団は粒度に関して実質的に均質で
あり、さらに好ましくは小さかった（好適な実施態様では直径約２５〜２５０nm
）。粒度集団が大きな不均質の粒子を含んでいたら、ＰＥＧ脂質の最少量は、調
製物中に存在していなかった。これと比較すると、従来のカチオン性脂質：ｐＤ
ＮＡ複合体では、全体に直径約２００〜８００nmの粒子が得られた。これらの懸
濁液は、粒度が非常に不均質になりやすく、複合体の粒度は、調製物中に使用さ
れるカチオン性脂質に大きく依存した。ミセル調製物で観察された小さく均質な
性状を示す従来のカチオン性脂質複合体は、全体に観察されなかった。 ３）アガロースゲル電気泳動で、ミセル複合体中の生物活性分子の挙動を分析
した。安定で均質なミセル複合体を形成するためのＰＥＧ脂質の最少量を使用す
ると、生物活性分子はアガロースゲル中に、遊離の生物活性分子とは異なる様式
で移動した（ただし、複合体化プラスミドに加えて「遊離」のプラスミドの集団
を視覚化することは可能であった）。もしＰＥＧ脂質の最少量を使用したのでな
かったら、ゲルにおいて視覚化されたプラスミドの大部分は、１）遊離ｐＤＮＡ
のように転移したか、または２）ゲルのウェル中に保持され、従ってゲルで可視
化されなかった。ＰＥＧ脂質の最少量が使用されたことに確信を持つために、こ
れらの２つ以上の試験を行った。
【００８２】 アガロースゲル電気泳動によるミセル脂質：ｐＤＮＡ複合体の分析を、トリス
−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中の０．７％アガロースゲルを調製する
ことにより実施した。１ウェル当たり、０．２５〜１μgのｐＤＮＡを含む容量
のミセル脂質：ｐＤＮＡ複合体を充填した。ゲルは、約１時間１００Ｖで流した
。次にゲル中のｐＤＮＡを視覚化するために、ゲルを一晩１×ＳＹＢＲグリーン
核酸染色液（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes））または別の染色
液中で染色した。
−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中の０．７％アガロースゲルを調製する
ことにより実施した。１ウェル当たり、０．２５〜１μgのｐＤＮＡを含む容量
のミセル脂質：ｐＤＮＡ複合体を充填した。ゲルは、約１時間１００Ｖで流した
。次にゲル中のｐＤＮＡを視覚化するために、ゲルを一晩１×ＳＹＢＲグリーン
核酸染色液（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes））または別の染色
液中で染色した。
【００８３】 例２−ミセル複合体の粒度分布 図２および３では、従来のカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の粒度分布（図２
Ａと３Ａ）が、ミセル法により調製されたカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の粒
度分布（図２Ｂ、２Ｃ、３Ｂおよび３Ｃ）と比較されている。
Ａと３Ａ）が、ミセル法により調製されたカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の粒
度分布（図２Ｂ、２Ｃ、３Ｂおよび３Ｃ）と比較されている。
【００８４】 複合体の粒度分布は、マルバーン・ゼータ−サイザー４（Malvern Zeta-Sizer
4）による準弾性光散乱により測定した。複合体は、調製の１時間以内に整粒し
て、製造業者の推奨する計数率の５０〜２５０キロカウント／秒（KCPS）で測定
した。必要であれば、試料の計数率は、水で希釈して５０〜２５０KCPSの所望の
範囲に調整した。
4）による準弾性光散乱により測定した。複合体は、調製の１時間以内に整粒し
て、製造業者の推奨する計数率の５０〜２５０キロカウント／秒（KCPS）で測定
した。必要であれば、試料の計数率は、水で希釈して５０〜２５０KCPSの所望の
範囲に調整した。
【００８５】 図２Ａに示す結果について、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、従来の方法
で、カチオン性脂質ＧＬ−６７を利用して調製した。米国特許第５，７４７，４
７１号および５，６５０，０９６号（これらの開示は、参照することにより本質
的に本明細書の一部とされる）を参照のこと。簡単に述べると、カチオン性脂質
、共脂質、およびＰＥＧ脂質を含むカチオン性脂質調製物は、１）クロロホルム
から乾燥して脂質フィルムにしたか、または２）ｔ−ブタノール：水（９：１、
容量：容量）から凍結乾燥した。生じた調製物を次に蒸留水を使用して、複合体
中の３つの脂質の所望の最終濃度の２倍まで水和した。カチオン性脂質：ｐＤＮ
Ａ複合体は、ｐＤＮＡに等容量の脂質を加え、次に穏やかに混合して調製する。
図３Ａに示す粒度分布について、ＧＬ−６７をＧＬ−８９で置き換えて同じ操作
に従った。
で、カチオン性脂質ＧＬ−６７を利用して調製した。米国特許第５，７４７，４
７１号および５，６５０，０９６号（これらの開示は、参照することにより本質
的に本明細書の一部とされる）を参照のこと。簡単に述べると、カチオン性脂質
、共脂質、およびＰＥＧ脂質を含むカチオン性脂質調製物は、１）クロロホルム
から乾燥して脂質フィルムにしたか、または２）ｔ−ブタノール：水（９：１、
容量：容量）から凍結乾燥した。生じた調製物を次に蒸留水を使用して、複合体
中の３つの脂質の所望の最終濃度の２倍まで水和した。カチオン性脂質：ｐＤＮ
Ａ複合体は、ｐＤＮＡに等容量の脂質を加え、次に穏やかに混合して調製する。
図３Ａに示す粒度分布について、ＧＬ−６７をＧＬ−８９で置き換えて同じ操作
に従った。
【００８６】 図２Ｂと２Ｃでは、カチオン性脂質ＧＬ−８９を使用してカチオン性脂質：ｐ
ＤＮＡ複合体を、ミセル法により調製した。最初に、ミセルカチオン性脂質：Ｐ
ＥＧ脂質溶液を以下のとおり調製した。ＧＬ−８９は、カチオン性脂質：ｐＤＮ
Ａ複合体の所望の最終カチオン性脂質濃度の４倍濃度で水和した。ＰＥＧ含有脂
質もまた、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終ＰＥＧ脂質濃度の４倍
濃度で水和した。いったん水和したら、カチオン性脂質を１：１（容量：容量）
比でＰＥＧ脂質に加えた。次にプラスミドＤＮＡを、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ
複合体の所望の最終ｐＤＮＡ濃度の２倍まで希釈した。次にミセルカチオン性脂
質：ＰＥＧ脂質溶液をｐＤＮＡに１：１比（容量：容量）で加えることにより、
カチオン性脂質：ＰＥＧ脂質：ｐＤＮＡ複合体を調製した。図３Ｂおよび３Ｃに
示す粒度分布についてＧＬ−６７をＧＬ−８９で置き換えて同じ操作に従った。
ＤＮＡ複合体を、ミセル法により調製した。最初に、ミセルカチオン性脂質：Ｐ
ＥＧ脂質溶液を以下のとおり調製した。ＧＬ−８９は、カチオン性脂質：ｐＤＮ
Ａ複合体の所望の最終カチオン性脂質濃度の４倍濃度で水和した。ＰＥＧ含有脂
質もまた、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の所望の最終ＰＥＧ脂質濃度の４倍
濃度で水和した。いったん水和したら、カチオン性脂質を１：１（容量：容量）
比でＰＥＧ脂質に加えた。次にプラスミドＤＮＡを、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ
複合体の所望の最終ｐＤＮＡ濃度の２倍まで希釈した。次にミセルカチオン性脂
質：ＰＥＧ脂質溶液をｐＤＮＡに１：１比（容量：容量）で加えることにより、
カチオン性脂質：ＰＥＧ脂質：ｐＤＮＡ複合体を調製した。図３Ｂおよび３Ｃに
示す粒度分布についてＧＬ−６７をＧＬ−８９で置き換えて同じ操作に従った。
【００８７】 図２Ａおよび３Ａに見られるように、従来のカチオン性脂質複合体の粒度分布
は、例えばＧＬ−６７では２００nm〜１０００nmとかなり大きく変動する。従来
の複合体の粒度分布は、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ比の関数として有意に変動は
しない。図２Ｂおよび３Ｂでは、ミセル複合体は形成されるが、好適な安定で均
質なミセル複合体を形成するための最少量のＰＥＧ脂質は存在しない。その結果
、図２Ｂおよび３Ｂにおける粒度分布は、４００nmを超える粒度まで拡大してい
る。最後に、図２Ｃおよび３Ｃは、充分量のＰＥＧ脂質と共に調製された好適な
ミセル複合体の粒度分布が示す。好適なミセル複合体の粒度分布は、従来のカチ
オン性脂質複合体よりも有意に均質であり、また有効量のＰＥＧ脂質を欠いてい
るミセル脂質複合体よりも有意に均質である。
は、例えばＧＬ−６７では２００nm〜１０００nmとかなり大きく変動する。従来
の複合体の粒度分布は、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ比の関数として有意に変動は
しない。図２Ｂおよび３Ｂでは、ミセル複合体は形成されるが、好適な安定で均
質なミセル複合体を形成するための最少量のＰＥＧ脂質は存在しない。その結果
、図２Ｂおよび３Ｂにおける粒度分布は、４００nmを超える粒度まで拡大してい
る。最後に、図２Ｃおよび３Ｃは、充分量のＰＥＧ脂質と共に調製された好適な
ミセル複合体の粒度分布が示す。好適なミセル複合体の粒度分布は、従来のカチ
オン性脂質複合体よりも有意に均質であり、また有効量のＰＥＧ脂質を欠いてい
るミセル脂質複合体よりも有意に均質である。
【００８８】 有効量のＰＥＧ脂質を欠いているミセル複合体と、有効量のＰＥＧ脂質を含む
本発明の好適なミセル複合体の粒度分布における差の別の例を、図４に示す。有
効量のＰＥＧ脂質を加えると、粒度分布は有意に均質になる。
本発明の好適なミセル複合体の粒度分布における差の別の例を、図４に示す。有
効量のＰＥＧ脂質を加えると、粒度分布は有意に均質になる。
【００８９】 例３−気道上皮細胞への従来のおよびミセルカチオン性脂質複合体の結合 以下の例では、不等化正常ヒト気管支気道細胞の表面に結合する従来のおよび
ミセルカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体両方の能力を検討する。
ミセルカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体両方の能力を検討する。
【００９０】 気液界面での不等化正常ヒト上皮細胞の増殖 ヒトコラーゲン（シグマ（Sigma）、ヒト胎盤コラーゲン、＃７５２１）を０
．２％氷酢酸に５０mg／１００mLに溶解して、細胞培養フラスコをヒトコラーゲ
ンでコーティングした。溶解したら、コラーゲン溶液を０．４５μmフィルター
で濾過する。この濃縮した無菌ストックは４℃で６ヶ月貯蔵できる。溶液は、使
用前に数分間コラーゲンストックを無菌蒸留水で１：５（容量：容量）希釈する
ことにより、フラスコのコーティング用に調製した。希釈コラーゲンの適切な溶
液をフラスコに入れ（Ｔ７５フラスコには１２mL、Ｔ１５０フラスコには２４mL
、そして各ミリセル−ＰＣＦインサート（Millicell-PCF insert）には４００μ
L）、少なくとも２時間（好ましくは一晩）４℃で放置した。４℃でのインキュ
ベーション後、コラーゲンをフラスコ／インサートから取り出して、無菌ドラフ
トに入れて６〜１２時間乾燥した。フラスコ／インサートを、ペニシリン／スト
レプトマイシンを含む無菌リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
これらのフラスコは、室温で６ヶ月まで保持できる。
．２％氷酢酸に５０mg／１００mLに溶解して、細胞培養フラスコをヒトコラーゲ
ンでコーティングした。溶解したら、コラーゲン溶液を０．４５μmフィルター
で濾過する。この濃縮した無菌ストックは４℃で６ヶ月貯蔵できる。溶液は、使
用前に数分間コラーゲンストックを無菌蒸留水で１：５（容量：容量）希釈する
ことにより、フラスコのコーティング用に調製した。希釈コラーゲンの適切な溶
液をフラスコに入れ（Ｔ７５フラスコには１２mL、Ｔ１５０フラスコには２４mL
、そして各ミリセル−ＰＣＦインサート（Millicell-PCF insert）には４００μ
L）、少なくとも２時間（好ましくは一晩）４℃で放置した。４℃でのインキュ
ベーション後、コラーゲンをフラスコ／インサートから取り出して、無菌ドラフ
トに入れて６〜１２時間乾燥した。フラスコ／インサートを、ペニシリン／スト
レプトマイシンを含む無菌リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
これらのフラスコは、室温で６ヶ月まで保持できる。
【００９１】 １バイアルの正常ヒト気管支上皮細胞（クローンティクス（Clonetics））を
迅速に解凍して、５つのＴ１５０フラスコ（上述のようにヒトコラーゲンでプレ
−コーティングしておいた）に分配した。細胞をフラスコ中でＤＭＥＭ（ギブコ
（Gibco/BRL））：ＢＥＧＭ（クローンティクス（Clonetics））の１：１（容量
：容量）培地により５％ＣＯ2 環境で増殖させた。細胞は、８０〜９０％コンフ
ルエンスまで増殖させた。次に細胞を、上述のようにヒトコラーゲンでプレ−コ
ーティングしたミリセル−ＰＣＦインサート（Millicell-PCF insert）（２００
μl、２×１０5 細胞／２００μl培地で）に入れた。接種の２４時間後、培地を
インサート内側から除去して、インサートの外側の培地を新鮮培地と交換した。
次に、外側の培地を１日おきに交換することにより、細胞を気液界面条件で維持
した。気液界面条件に切り替えてから約５〜７日後、細胞に高いトランス−上皮
抵抗性が生じた。
迅速に解凍して、５つのＴ１５０フラスコ（上述のようにヒトコラーゲンでプレ
−コーティングしておいた）に分配した。細胞をフラスコ中でＤＭＥＭ（ギブコ
（Gibco/BRL））：ＢＥＧＭ（クローンティクス（Clonetics））の１：１（容量
：容量）培地により５％ＣＯ2 環境で増殖させた。細胞は、８０〜９０％コンフ
ルエンスまで増殖させた。次に細胞を、上述のようにヒトコラーゲンでプレ−コ
ーティングしたミリセル−ＰＣＦインサート（Millicell-PCF insert）（２００
μl、２×１０5 細胞／２００μl培地で）に入れた。接種の２４時間後、培地を
インサート内側から除去して、インサートの外側の培地を新鮮培地と交換した。
次に、外側の培地を１日おきに交換することにより、細胞を気液界面条件で維持
した。気液界面条件に切り替えてから約５〜７日後、細胞に高いトランス−上皮
抵抗性が生じた。
【００９２】 不等化正常ヒト気管支気道上皮細胞への従来のおよびミセル複合体の結合の検討 正常ヒト気管支気道上皮細胞は、上述のように気液界面で増殖させた。細胞は
気液界面で、約５日間か、または約１０００Ω/cm2 のトランス−上皮抵抗性が
生じるまで維持した。こうして細胞は、結合実験に使用する準備が整った。
気液界面で、約５日間か、または約１０００Ω/cm2 のトランス−上皮抵抗性が
生じるまで維持した。こうして細胞は、結合実験に使用する準備が整った。
【００９３】 プラスミドＤＮＡは、蛍光プローブのトト−１−ヨージド（Toto-1-iodide）
（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes））により、製造業者の説明書
に従ってトト−１−ヨージド対ｐＤＮＡの１：２００モル比で非共有結合で標識
した。ミセルおよび従来の脂質：ｐＤＮＡ複合体は、トト−１標識プラスミドを
使用する実験で使用するための所望の脂質：ｐＤＮＡ濃度の１０倍で調製した。
ミセル複合体は、上述のように調製した。従来の複合体は、従来の脂質フィルム
を望まれる最終的な実験脂質濃度の２０倍まで水で水和することにより調製した
。標識ｐＤＮＡは、望まれる最終的な実験ＤＮＡ濃度の２０倍で調製した。脂質
を標識ｐＤＮＡに加えて、１５分間複合体を形成させた。次に複合体をオプチメ
ム（Optimem）で１：１０（容量：容量）希釈した。
（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes））により、製造業者の説明書
に従ってトト−１−ヨージド対ｐＤＮＡの１：２００モル比で非共有結合で標識
した。ミセルおよび従来の脂質：ｐＤＮＡ複合体は、トト−１標識プラスミドを
使用する実験で使用するための所望の脂質：ｐＤＮＡ濃度の１０倍で調製した。
ミセル複合体は、上述のように調製した。従来の複合体は、従来の脂質フィルム
を望まれる最終的な実験脂質濃度の２０倍まで水で水和することにより調製した
。標識ｐＤＮＡは、望まれる最終的な実験ＤＮＡ濃度の２０倍で調製した。脂質
を標識ｐＤＮＡに加えて、１５分間複合体を形成させた。次に複合体をオプチメ
ム（Optimem）で１：１０（容量：容量）希釈した。
【００９４】 複合体（約３００μl）を、インサートの内側の気道上皮細胞の先端の膜に加
えて、３７℃で５％ＣＯ2 雰囲気下で１時間結合させた。次に複合体を細胞表面
から吸引し；細胞表面を０．５mL冷ＰＢＳで３回洗浄し；ＰＢＳ中２％パラホル
ムアルデヒドで１５分間固定し；そして０．５mL冷ＰＢＳで１回洗浄した。次に
インサートをインサートハウジングから切り出して、スライドに載せ、カバーガ
ラスを載せて、核の対比染色剤として２μg/mLのＤＡＰＩを含むイムノマウント
（Immunomount）（シャンドン−リップショー（Shandon-Lipshaw））にマウント
した。
えて、３７℃で５％ＣＯ2 雰囲気下で１時間結合させた。次に複合体を細胞表面
から吸引し；細胞表面を０．５mL冷ＰＢＳで３回洗浄し；ＰＢＳ中２％パラホル
ムアルデヒドで１５分間固定し；そして０．５mL冷ＰＢＳで１回洗浄した。次に
インサートをインサートハウジングから切り出して、スライドに載せ、カバーガ
ラスを載せて、核の対比染色剤として２μg/mLのＤＡＰＩを含むイムノマウント
（Immunomount）（シャンドン−リップショー（Shandon-Lipshaw））にマウント
した。
【００９５】 ５０：５０、７５：５０μMのカチオン性脂質：ｐＤＮＡ比で、気道細胞の先
端表面へのミセル複合体の強い結合が、全体に観察された。５０：５０、７５：
５０μMのカチオン性脂質：ｐＤＮＡ比で、同じ環境において、従来の複合体の
ほとんど結合がなかった。この方法は、本質的に任意の接着性細胞株に対して応
用可能であろう。
端表面へのミセル複合体の強い結合が、全体に観察された。５０：５０、７５：
５０μMのカチオン性脂質：ｐＤＮＡ比で、同じ環境において、従来の複合体の
ほとんど結合がなかった。この方法は、本質的に任意の接着性細胞株に対して応
用可能であろう。
【図１】 図１は、従来の脂質複合体（ａ）の処方のための操作を、共脂質を含むミセル
複合体（ｂ）および含まないミセル複合体（ｃ）と比較したものである。
複合体（ｂ）および含まないミセル複合体（ｃ）と比較したものである。
【図２】 図２は、従来のカチオン性脂質ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ複合体（ａ）（ＧＬ−６
７：ｐＤＮＡ（０．５：０．５）およびＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥ
Ｇ５０００（１：２：０．０５）の粒度分布を、ミセル複合体（（ｂ）と（ｃ）
）の粒度分布と比較したものである。（ｂ）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５
０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．５：２））は、好適な均質な複合体を形成する
のに必要な最少量のＰＥＧが欠如したミセル複合体の粒度分布を表し、一方（ｃ
）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．７５：２
））は、充分量のＰＥＧと共に調製されたミセル複合体の粒度分布を示す。
７：ｐＤＮＡ（０．５：０．５）およびＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥ
Ｇ５０００（１：２：０．０５）の粒度分布を、ミセル複合体（（ｂ）と（ｃ）
）の粒度分布と比較したものである。（ｂ）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５
０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．５：２））は、好適な均質な複合体を形成する
のに必要な最少量のＰＥＧが欠如したミセル複合体の粒度分布を表し、一方（ｃ
）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．７５：２
））は、充分量のＰＥＧと共に調製されたミセル複合体の粒度分布を示す。
【図３】 図３は、従来のカチオン性脂質ＧＬ−８９：ｐＤＮＡ複合体（ａ）（ＧＬ−８
９：ｐＤＮＡ（２：２）およびＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５００
０（１：１：０．００５）の粒度分布を、ミセル複合体（（ｂ）および（ｃ））
の粒度分布と比較したものである。（ｂ）（ＧＬ−８９：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０
００：ｐＤＮＡ（１．５：０．００２５：２））は、好適な均質な複合体を形成
するのに必要な最少量のＰＥＧが欠如したミセル複合体の粒度分布を表し、一方
（ｃ）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．２５
：２））は、充分量のＰＥＧと共に調製されたミセル複合体の粒度分布を示す。
９：ｐＤＮＡ（２：２）およびＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５００
０（１：１：０．００５）の粒度分布を、ミセル複合体（（ｂ）および（ｃ））
の粒度分布と比較したものである。（ｂ）（ＧＬ−８９：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０
００：ｐＤＮＡ（１．５：０．００２５：２））は、好適な均質な複合体を形成
するのに必要な最少量のＰＥＧが欠如したミセル複合体の粒度分布を表し、一方
（ｃ）（ＧＬ−６７：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００：ｐＤＮＡ（１．５：０．２５
：２））は、充分量のＰＥＧと共に調製されたミセル複合体の粒度分布を示す。
【図４】 図４は、共脂質およびＰＥＧ（ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ5000）の量が上昇
するときの、ミセルカチオン性脂質ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ複合体の粒度分布の変
化を示す。小さな均質かつ安定なミセル複合体を形成するには最少量のＰＥＧが
必要である。
するときの、ミセルカチオン性脂質ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ複合体の粒度分布の変
化を示す。小さな均質かつ安定なミセル複合体を形成するには最少量のＰＥＧが
必要である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月３０日（２０００．６．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ６１Ｋ 47/34 47/42 47/42 47/44 47/44 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 (72)発明者 イーストマン、サイモン、ジェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ハド ソン、 バーチウッド ロード ７ (72)発明者 ニュータプスキイ、ジニファー、ビー アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ミル ベリー、 ビクトリア １ (72)発明者 リー、エドワード、アール アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ナテ ィック、 ベイコン ストリート 56 (72)発明者 チュー、クイミン アメリカ合衆国 マサチューセッツ、メル ローズ、 フローレンス ストリート 110 (72)発明者 シュール、ロナルド、ケイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ホプ キントン、 イースト ストリート 25 (72)発明者 マーシャル、ジョン アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ホー プデール、 ノースロップ ストリート 25 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 HA17 4C076 AA19 AA95 CC15 DD15 DD16 DD53 DD63 EE23 EE41 4C084 AA01 AA13 AA17 BA03 MA24 NA13 ZA592 4C085 AA21 BB31 EE01 4C086 AA01 EA16 MA03 MA05 MA24 NA13 ZA59
Claims (30)
- 【請求項１】 ミセル複合体の製造方法であって、 ａ）少なくとも１つのカチオン性脂質を充分量のＰＥＧ誘導体と、実質的に均
質なミセル脂質が生成するのに適した量で合わせること； ｂ）実質的に均質なミセル脂質と少なくとも１つの生物活性分子を合わせてミ
セル複合体を形成すること を含んでなる、上記方法。 - 【請求項２】 ＰＥＧ誘導体を、工程ａ）の前に複合体化して共脂質にする
、請求項１記載のミセル複合体の製造方法。 - 【請求項３】 生物活性分子はＤＮＡである、請求項１記載のミセル複合体
の製造方法。 - 【請求項４】 少なくとも１つのカチオン性脂質およびＤＮＡは、１：８の
脂質：ＤＮＡ比で存在する、請求項４記載のミセル複合体の製造方法。 - 【請求項５】 ミセル複合体群の粒度分布は、ミセル複合体群中の複合体の
平均粒度に対して２０％未満の変動である、請求項１記載のミセル複合体の製造
方法。 - 【請求項６】 ミセル複合体を少なくとも１つの疎水性種でコーティングす
る工程をさらに含んでなる、請求項１記載のミセル複合体の製造方法。 - 【請求項７】 哺乳動物細胞を標的とする物質をさらに添加することを含ん
でなる、請求項１記載のミセル複合体の製造方法。 - 【請求項８】 標的化のための物質は、ＲＧＤを含むペプチド、ＵＤＰ／Ｕ
ＴＰ、乳糖、サイクリックＲＧＤペプチド、ペネトラチン、レクチン、ＬＤＬ受
容体を標的とする物質、マンノース−６−リン酸、ＨＡＶペプチド、ＣＮＰ−２
２ペプチド、および気道特異的１本鎖抗体から選択される、請求項７記載のミセ
ル複合体の製造方法。 - 【請求項９】 請求項１により生成されるミセル複合体。
- 【請求項１０】 請求項２により生成されるミセル複合体。
- 【請求項１１】 ミセル複合体は、哺乳動物細胞を標的とする物質をさらに
含んでなる、請求項９記載のミセル複合体。 - 【請求項１２】 標的化のための物質は、ＲＧＤを含むペプチド、ＵＤＰ／
ＵＴＰ、乳糖、サイクリックＲＧＤペプチド、ペネトラチン、レクチン、ＬＤＬ
受容体を標的とする物質、マンノース−６−リン酸、ＨＡＶペプチド、ＣＮＰ−
２２ペプチド、および気道特異的１本鎖抗体から選択される、請求項１１記載の
ミセル複合体。 - 【請求項１３】 ミセル複合体は、ミセル複合体をコーティングするための
疎水性種をさらに含んでなる、請求項９記載のミセル複合体。 - 【請求項１４】 生物活性分子はＤＮＡである、請求項９記載のミセル複合
体。 - 【請求項１５】 少なくとも１つのカチオン性脂質及びＤＮＡは、１：８の
脂質：ＤＮＡ比で存在する、請求項１４記載のミセル複合体。 - 【請求項１６】 ミセル複合体群の粒度分布は、ミセル複合体群中の複合体
の平均粒度に対して２０％未満の変動である、請求項９記載のミセル複合体。 - 【請求項１７】 哺乳動物の細胞をミセル複合体を含んでなる複合体と接触
させることを含んでなる、細胞に生物活性分子を送達する方法であって、ミセル
複合体は、 少なくとも１つのカチオン性脂質； 少なくとも１つの生物活性分子；および 少なくとも１つのＰＥＧ誘導体 を含んでなる、上記方法。 - 【請求項１８】 ミセル複合体は、共脂質をさらに含んでなる、請求項１７
記載の哺乳動物の細胞に生物活性分子を送達する方法。 - 【請求項１９】 少なくとも１つの生物活性分子はＤＮＡである、請求項１
７記載の哺乳動物の細胞に生物活性分子を送達する方法。 - 【請求項２０】 少なくとも１つのカチオン性脂質およびＤＮＡは、１：８
の脂質：ＤＮＡ比で存在する、請求項１９記載の哺乳動物の細胞に生物活性分子
を送達する方法。 - 【請求項２１】 ミセル複合体は、ミセル複合体をコーティングするための
疎水性種をさらに含んでなる、請求項１７記載の哺乳動物の細胞に生物活性分子
を送達する方法。 - 【請求項２２】 ミセル複合体は、哺乳動物細胞を標的とする物質をさらに
含んでなる、請求項１７記載の哺乳動物の細胞に生物活性分子を送達する方法。 - 【請求項２３】 標的化のための物質は、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＵＤ
Ｐ／ＵＴＰ、乳糖、サイクリックＲＧＤペプチド、ペネトラチン、レクチン、Ｌ
ＤＬ受容体を標的とする物質、マンノース−６−リン酸、ＨＡＶペプチド、ＣＮ
Ｐ−２２ペプチド、および気道特異的１本鎖抗体から選択される、請求項２２記
載の哺乳動物の細胞に生物活性分子を送達する方法。 - 【請求項２４】 細胞は気道上皮細胞である、請求項１７記載の哺乳動物の
細胞に生物活性分子を送達する方法。 - 【請求項２５】 少なくとも１つのカチオン性脂質； 少なくとも１つのＰＥＧ誘導体；および 少なくとも１つの生物活性分子 を含んでなるミセル複合体であって、該ミセル複合体を含んでなるミセル複合体
群の粒度分布は、実質的に均質な粒度分布を有する、上記複合体。 - 【請求項２６】 ミセル複合体は、さらに共脂質を含んでなる、請求項２５
記載のミセル複合体。 - 【請求項２７】 ミセル複合体群の実質的に均質な粒度分布は、ミセル複合
体群中の複合体の平均粒度に対して２０％未満の変動である、請求項２５記載の
ミセル複合体。 - 【請求項２８】 生物活性分子はＤＮＡである、請求項２５記載のミセル複
合体。 - 【請求項２９】 ミセル複合体は、哺乳動物細胞を標的とする物質をさらに
含んでなる、請求項２５記載のミセル複合体。 - 【請求項３０】 標的化のための物質は、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＵＤ
Ｐ／ＵＴＰ、乳糖、サイクリックＲＧＤペプチド、ペネトラチン、レクチン、Ｌ
ＤＬ受容体を標的とする物質、マンノース−６−リン酸、ＨＡＶペプチド、ＣＮ
Ｐ−２２ペプチドおよび気道特異的１本鎖抗体から選択される、請求項２９記載
のミセル複合体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8987998P | 1998-06-19 | 1998-06-19 | |
| US60/089,879 | 1998-06-19 | ||
| PCT/US1999/013875 WO1999065461A2 (en) | 1998-06-19 | 1999-06-18 | Cationic amphiphile micellar complexes |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002518313A true JP2002518313A (ja) | 2002-06-25 |
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ID=22220044
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000554341A Pending JP2002518313A (ja) | 1998-06-19 | 1999-06-18 | カチオン性両親媒性ミセル複合体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1085857A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002518313A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009153888A1 (ja) * | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 日本新薬株式会社 | 薬物担体 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2004508012A (ja) * | 2000-04-20 | 2004-03-18 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | エンドソーム膜不安定剤を用いたｓｐｌｐ媒介性トランスフェクションの強化方法 |
| JP4590519B2 (ja) * | 2006-09-22 | 2010-12-01 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 腸管吸収制御性リポソーム |
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| US5843473A (en) * | 1989-10-20 | 1998-12-01 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Method of treatment of infected tissues |
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| JP4335310B2 (ja) * | 1995-06-07 | 2009-09-30 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用 |
-
1999
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- 1999-06-18 CA CA002335638A patent/CA2335638A1/en not_active Abandoned
- 1999-06-18 WO PCT/US1999/013875 patent/WO1999065461A2/en not_active Application Discontinuation
- 1999-06-18 JP JP2000554341A patent/JP2002518313A/ja active Pending
- 1999-06-18 AU AU46984/99A patent/AU4698499A/en not_active Abandoned
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|---|---|---|---|---|
| WO2009153888A1 (ja) * | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 日本新薬株式会社 | 薬物担体 |
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