ES2336766T3 - Procedimiento de recubrimiento de particulas finas con pelicula lipidica. - Google Patents

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Masahiro c/o Pharmaceutical Res. Ins YAMAUCHI
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Takeshi c/o Pharmaceutical Research Inst. IWATA
Takaaki c/o Pharmaceutical Research Inst. UOCHI
Shiro c/o KYOWA HAKKO KOGYO CO. LTD AKINAGA
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Abstract

Un procedimiento para recubrir partículas finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta 1.000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que comprende las etapas de: preparar una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar en la que se suspende el complejo y se disuelve el lípido, en el que el lípido se selecciona de fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido sintético, y el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un políalquilenglicol; recubrir las partículas finas con la membrana lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la proporción del disolvente orgánico polar en la solución acuosa añadiendo agua o por evaporación del disolvente orgánico polar.

Description

Procedimiento de recubrimiento de partículas finas con película lipídica.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica.
Técnica anterior
Es un hecho muy conocido que un fármaco se contiene en partículas finas para potenciar el efecto del fármaco, y que las partículas finas incluyen, por ejemplo, liposoma, emulsión de grasa, etc. Sus aplicaciones clínicas se llevan a cabo principalmente mediante inyecciones, particularmente por administración intravascular. Se ha sabido que las partículas finas administradas al vaso sanguíneo interactúan con los componentes de la sangre y, como resultado de la Interacción, las propias partículas finas o el fármaco, se destruyen (desintegran), o las partículas finas se opsonizan luego de lo cual se eliminan de la sangre (se eliminan como una sustancia extraña a través de un sistema reticuloendotelial). Con el fin de evitar esa eliminación, se ha estudiado, por ejemplo, la modificación del liposoma con polietilenglicol, [Stealth Liposomes, ed. by D. D. Lasic and F. Martin, CRC Press Inc., Florida, 93-102 (1995)].
Además, con el fin de administrar un ácido nucleico tal como un oligonucleótido, ADN y ARN a células blanco, se ha usado frecuentemente un complejo de un ácido nucleico con liposoma que comprende un lípido catiónico (a partir de aquí denominado liposoma lipídico catiónico), un polímero básico tal como poli-L-lisina y poliamidaamina. Sin embargo, se ha sabido que, cuando se administra un complejo de liposoma lipídico catiónico con un ácido nucleico por vía intravenosa, éste se distribuye fácilmente desde la sangre al hígado, pulmón, etc. [Biochim. Biophys. Acta, 1281,139-149 (1996); J. Controíled Release, 41,121-130 (1996)]. Por otro lado, S. Li, et al. han informado que, cuando se pone en contacto suero de ratón con un complejo liposoma lipídico catiónico/ADN, se ha desarrollado un aumento en el tamaño del complejo, agregación, desintegración del liposoma y liberación y desintegración del ADN [Gene Therapy, 5, 930-937 (1998); Gene Therapy, 6, 585-594 (1999)]. Con el fin de resolver esos problemas, se estudió la modificación del liposoma lipídico catiónico con polietilenglicol, y O. Meyer, et al. prepararon un complejo de oligodesoxinucleótido (ODN) con liposoma lipídico catiónico que contiene poíietilenglicol-fosfatidiletanolamina (PEG-PE) [J. Biol. Chem., 273, 15621-15627 (1998)]. Sin embargo, cuando se puso en contacto con una solución acuosa al 50% de plasma humano durante 4 horas, el 35% del ODN se disoció. Con el fin de reducir la disociación, D. Stuart y T. Alien disolvieron previamente el liposoma lipídico catiónico en cloroformo, mezclaron el disolvente resultante con una solución acuosa de ODN y metanol, y transfirieron un complejo de liposoma lipídico catiónico/ODN a la fase clorofórmica y lo sometieron a separación centrífuga. Además, extrajeron la fase de cloroformo, agregaron a ésta lípido-PEG, lípido neutro y agua para formar una emulsión W/O. Han intentado incluir ODN dentro del liposoma completamente formando la emulsión W/O de un modo similar al procedimiento de evaporación de fase reversa de F. Szoka, et al. [Biochim. Biophys. Acta, 1463,219-229 (2000)]. En años recientes, sin embargo, el uso de cloroformo no se considera deseable en vista de la seguridad. Además, D. McPhail, et al. prepararon una suspensión de vesícula en vesícula en la cual la vesícula de quitosano se coloca en el liposoma agregando una suspensión de vesícula (vesícula de quitosano) de palmitoilquitosano y colesterol a una capa delgada de fosfatidilcolina de yema de huevo y colesterol [Int. J. Pharmaceutics, 200, 73-86 (2000)]. Sin embargo, no hay descripción sobre la eficiencia y, cuando se intuye a partir del procedimiento de preparación, la eficacia de inclusión se supuso que era tan baja como del orden de un pequeño porcentaje, lo que, según se presume, es la causa de un problema en su uso práctico. A partir de dichos puntos de vista también, la contención conveniente y altamente eficiente de partículas finas con el uso de una vesícula cerrada es muy útil cuando se busca aplicación al tratamiento médico.
Además, hay algunos casos en los que muchos péptidos y proteínas que son útiles en el cuidado médico se descomponen rápidamente en el cuerpo vivo por acción de las enzimas o similares o se eliminan del cuerpo vivo como resultado de la generación de un anticuerpo por administraciones frecuentes, por lo cual su efecto ya no se ejerce. Por lo tanto, con un objetivo de potenciar la estabilidad de esos péptidos y proteínas en el cuerpo vivo, se ha intentado incluirlas dentro de un liposoma. Como medio de contenerlos en el liposoma, se han conocido, por ejemplo, un procedimiento de preparación de liposomas diseñado por Bangham, et al. [J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)], un procedimiento de inyección de etanol [J. Cell Biol,, 66, 621 (1975)], un procedimiento de prensa francesa [FEBS Lett., 99, 210 (1979)], un procedimiento de congelamiento-descongelamiento [Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)], un procedimiento de evaporación en fase reversa [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,186 (1981)], un procedimiento de gradiente de pH (Patente Japonesa No. 2,572,554; Patente Japonesa No. 2,659,136; etc.) y similares. Para los compuestos de bajo peso molecular, un procedimiento de gradiente de pH es apropiado y también se ha contemplado un procedimiento mejorado de este tipo. Sin embargo, con respecto a péptidos y proteínas, no se ha logrado una contención invariablemente eficiente aún y, en el caso de la insulina marcada con fluorescencia, se contuvo hasta un grado de aproximadamente 5 a 40% pero no se contuvo en absoluto insulina sin marcar [Int. J. Pharmaceutics, 179, 85-95 (1999)]. Con el fin de potenciar el efecto terapéutico producido por péptidos y proteínas, es una exigencia desarrollar un procedimiento por el cual los péptidos y proteínas se contienen eficientemente dentro de vesículas cerradas.
Divulgación de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento seguro, conveniente y eficiente para recubrir partículas finas con membrana lipídica con el fin de estabilizar un medicamento etc. contenido en dichas partículas finas. Cuando las partículas finas están contenidas en vesículas cerradas que comprenden membrana de bicapa lipídica o multicapa usando el mencionado procedimiento de recubrimiento, se puede suprimir la afección producida por los componentes en el cuerpo vivo particularmente en la sangre o en el tracto gastrointestinal y por el sistema reticuloendotelial y además, puede suprimirse la afección durante el período de conservación producida por cada una de las partículas finas o por un medio de dispersión en eI que las partículas finas se dispersan.
Los presentes inventores han encontrado que un complejo que comprende un fármaco soluble en agua y el lípido catiónico formado a causa de interacción electrostática no es soluble en una solución acuosa de etanol y que, aunque el fosfolípido es soluble en una solución acuosa de etanol que tiene una alta concentración de etanol, forma un liposoma debido a la formación de una membrana lipídica en una solución acuosa de etanol que tiene una baja concentración de etanol. Como resultado de investigaciones intensivas adicionales, se ha encontrado que un complejo de un medicamento con lípido puede recubrirse con una membrana lipídica que comprende lípido con polietilenglicol y fosfolípidos, cuando un derivado polimérico soluble en agua tal como lípido con polietilenglicol se agrega anteriormente a un complejo de un fármaco soluble en agua con lípido, la mezcla se dispersa en una solución acuosa de etanol que tiene una alta concentración de etanol, lípido con polietilenglicol y fosfolípido se disuelven en el líquido resultante y luego el contenido de etanol se reduce gradualmente.
De este modo, la presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) hasta (19).
(1)
Un procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica, que comprende recubrir las partículas finas con membrana lipídica mediante la reducción de la proporción de un disolvente orgánico polar en una solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar donde las partículas finas se dispersan y el lípido se disuelve.
(2)
Un procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica, que comprende recubrir las partículas finas con membrana lipídica mediante la dispersión de partículas finas en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido A), disolviendo el lípido en un disolvente orgánico polar o una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente de la solución acuosa anterior que contiene un disolvente orgánico polar (líquido B), mezclar el líquido A y el líquido B en el líquido C, y reducir la proporción de un disolvente orgánico polar en el líquido C para obtener el líquido D.
(3)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2), en el que el líquido B es una solución que se prepara por disolución de un derivado polimérico soluble en agua (I) junto con el lípido.
(4)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2) o (3), en el que las concentraciones del disolvente orgánico polar en el líquido A y el líquido B son del 30% o más.
(5)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2) o (3), en el que las concentraciones del disolvente orgánico polar en el líquido A y el líquido B son del 60 al 90%.
(6)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (5), en el que la concentración del disolvente orgánico polar en el líquido D es 50% o menos.
(7)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (6), en el que las partículas finas son aquellas que contienen un derivado polimérico soluble en agua que es igual o diferente del derivado polimérico soluble en agua (I) mencionado en el punto anterior (3).
(8)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas son aquellas que contienen uno o más miem- bro(s) seleccionado(s) de un fármaco, sistema lipídico, liposoma, partículas finas en la emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas.
(9)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas son aquellas que contienen un fármaco.
(10)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en la emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas.
\newpage
(11)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con lípido catiónico.
(12)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con lípido aniónico.
(13)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento, fosfolípido que contiene liposomas y una sal sódica de sulfato de dextrano.
(14)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (8) hasta (13), en el que el fármaco es un fármaco seleccionado de un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y un compuesto polimérico.
(15)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (14), en el que el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un polialquilenglicol.
(16)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (15), en el que el alcohol es etanol.
(17)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (15) o (16), en el que el glicol es un propilenglicol.
(18)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (15) hasta (17), en el que el políalquilenglicol es polietilenglicol.
(19)
El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (3) hasta (18), en el que el derivado polimérico soluble en agua es uno o más miem- bro(s) seleccionado(s) de lípido con polietilenglicol, un alquil éter de polietilenglicol, un derivado de aceite de ricino de polietilenglicol, un éster de ácido graso de polietilenglicol sorbitano, un estearato de polietilenglicol, un co-polímero de etilenglicol con propilenglicol y un glicerol éster.
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Algunos ejemplos del disolvente orgánico polar en la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar usado en la presente invención son un alcohol tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol y ter-butanol; un glicol tal como glicerol, etilenglicol y propilenglicol; y políalquilenglicol tal como polietilenglicol.
Con respecto al elemento que constituye las partículas finas usadas en la presente invención, no hay limitación particular y sus ejemplos son un fármaco, sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico, una preparación de partículas finas y un derivado polimérico soluble en agua. Se los puede utilizar en forma independiente, como un complejo en el que se combinan dos o más de ellos, o como un complejo en el que se combinan uno o más de ellos y otro compuesto.
Para ser específicos, un ejemplo del complejo mencionado con anterioridad es un complejo de un fármaco con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas y, para ser más específicos, es un complejo de un ácido nucleico con lípido catiónico formado debido a interacción electrostática; un complejo de un ácido nucleico con polímero de carga positiva tal como poli-L-lisina; un complejo de una proteína alcalina que tiene un punto isoeléctrico elevado con lípido aniónico tal como ácido fosfatídico o polímero con carga negativa tal como ácido estireno-maleico; un complejo de una proteína ácida con polímero de carga positiva tal como lípido catiónico y poli-L-lisina; etc.
Con respecto al fármaco, sus ejemplos son sustancias que tienen una actividad farmacológica tal como una proteína incluyendo enzima, un péptido, un ácido nucleico incluyendo gen, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y un compuesto polimérico. Algunos ejemplos de la proteína incluyendo enzima y el péptido son bradiquinina, angiotensina, oxitocina, vasopresina, adrenocorticotropina (ACTH), calcitonina, insulina, glucagón, colecistoquinina, p-endorfina, factor inhibidor de melanocitos, hormona estimulante de melanocitos, antagonista de gastrina, neurotensina, somatostatina, brucina, ciclosporina, encefalina, transferrína, péptido RGD (Arg-Gly-Asp), hormona tiroides, hormona de crecimiento, hormona gonadotrópica, hormona luteinizante (LHRH), asparaginasa, arginasa, uricasa, carboxipeptidasa, glutaminasa, superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno de tejidos (t-PA), estreptoquinasa, interleucina, interferón, dipéptido de muramilo, timopoyetina, factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la colonia de micrófagos de granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), inhibidor de tripsina, lisozima, factor del crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento símil insulina (IGF), factor del crecimiento nervioso (NGF), factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento glíal (GGF), timosina y un anticuerpo específico {tal como anticuerpo del receptor anti-EGF); algunos ejemplos del gen que incluye ácido nucleico son ácidos nucleicos tales como oligonucleótido antisentido, ADN y ARN; algunos ejemplos del compuesto de bajo peso molecular, ácido \varepsilon-aminocaproico, hidrocloruro de arginina, L-aspartato de potasio, ácido tranexámico, sulfato de bieomicina, sulfato de vincristina, cefazolina de sodio, cefalotina de sodio, csticolina, citarabina, sulfato de gentamicina, hidrocloruro de vancomicina, sulfato de canamicina y sulfato de amicacina; algunos ejemplos del sacárido son sulfato sódico de condroitina, heparina sódica y dextrano fluorescefna; y algunos ejemplos del compuesto polimérico son polietilensuifonato de sodio, DIVEMA (copolímero de divinil éter con anhídrido maleico) y SMANCS (producto unido de un copolímero de anhídrido maleico-estireno con neocarzinostatina).
Algunos ejemplos de sistemas de lípidos son micelas esféricas, micelas inversas esféricas, micelas con forma de salchicha, micelas inversas con forma de salchicha, micela con forma de placa, micela inversa con forma de placa, hexagonal I, hexagonal II y producto asociado que comprende dos o más moléculas de lípido.
Algunos ejemplos del lípido que constituye el liposoma son fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido catiónico, y con preferencia se usa el fosfolípido. Dicho lípido puede modificarse con un detergente no iónico tal como Polisorbato 80, Pluronic F68 y monolaurato sorbitano (por ej., Span 20); detergentes catiónicos tales como cloruro de benzalconio; detergente aniónico tal como lauril sulfato de sodio; polisacárido tal como dextrano o uno de sus derivados; un derivado de polioxietileno tal como alcohol laurílico polioxietilenado y polietilenglicol (PEG); etc.
Algunos ejemplos del fosfolípido son fosfolípidos naturales o sintéticos tales como fosfatidilcolina (fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de yema de huevo, diestearoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, etc.), fosfatidiletanolamina (diestearoil fosfatidiletanolamina, dipalmitoil fosfatidiletanolamina, etc.), fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina, esfingomielina, fosfolípido polietilenglicolado, lecitina de yema de huevo, lecitina de soja y fosfolípido hidrogenado.
Algunos ejemplos del gliceroglicolípido son sulfoxiribosil glicérido, diglicosil diglicérido, digalactosil diglicérido, galactosil diglicérido y glicosil diglicérido.
Algunos ejemplos del esfingoglicolípido son galactosil cerebrósido, lactosil cerebrósido y gangliósido.
Algunos ejemplos del lípido catiónico son 1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano (DOTAP), cloruro de N-(2,3-dioleiloxipropan-1-il)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxia-
mido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietil amonio
(DMRIE), bromuro de 1,2-dioleoiloxipropil-3-dietilhidroxietilamonio (DORIE) y 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]-colesterol (DC-Chol).
En el liposoma, esos lípidos se usan, cada uno, ya sea en forma independiente o en conjunto. Cuando se usan en conjunto, los lípidos usados son, por ejemplo, lípidos que comprenden por lo menos dos componentes seleccionados de fosfatidilcolina de soja hidrogenada, fosfolípido polietilenglicolado y colesterol; lípidos que comprenden por lo menos dos componentes seleccionados de distearoil fosfatidilcolina, fosfolípido polietilenglicosilado y colesterol; lípidos que comprenden fosfatidilcolina de yema de huevo y DOTAR; lípidos que comprenden fosfatidilcolina de yema de huevo, DOTAP y fosfolípido polietilenglicosilado; lípidos que comprenden fosfatidilcolina de yema de huevo, DOTAP, colesterol y fosfolípido polietilenglicosilado; etc.
Además, en la preparación del liposoma, también pueden añadirse esterol o similares tales como colesterol como estabilizador de membrana, tocoferol o similares como antioxidante y estearilamina, fosfato de dicetilo, gangliósido y lípido catiónico tal como DOTMA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)], dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986 (1989)], DMRIE o DORIE [Methods, 5, 67-75 (1993)] y DC-Chol [Biochem. Biophys. Res. Commun., 179, 280-285 (1991)] como sustancia de carga, si es necesario, junto con el lípido.
No hay limitación particular para las partículas finas en la emulsión, y sus ejemplos específicos son partículas finas incluidas en todas las clases de emulsión de aceite en agua y emulsión agua/aceite/agua tal como una emulsión de grasa, una emulsión que comprende detergente no iónico y aceite de soja, una emulsión lipídica y una nano esfera lipídica.
No hay limitación particular para el polímero natural, y sus ejemplos específicos son albúmina, dextrano, quitosano, ácido desoxirribonucleico y similares.
No hay limitación particular para la sustancia polimérica sintética y sus ejemplos específicos son poli-L-lisina, polsetileneimina, ácido poliaspártico, un copolímero de estireno con ácido maleico, un copolímero de isopropilacrilamida con acrilpirrolidona, dendrímero modificado con PEG, ácido poliláctico, y ácido poliglicósico, ácido poliláctico polietilenglicolado, sulfato de dextrano y una de sus sales.
Aquí, la sal incluye sal de metal, sal de amonio, sal de adición con amina orgánica, sal de adición con aminoácido, etc. Algunos ejemplos de la sal de metal son sal de metales alcalinos tal como sal de litio, sal de sodio y sal de potasio; sal de metales alcalino térreos tal como sal de magnesio y sal de calcio; sal de aluminio; sal de zinc; etc. Algunos ejemplos de la sal de amonio son la sal de amonio, sal de tetrametilamonio, etc.; algunos ejemplos de la sal de adición con amina orgánica son las sales de adición de morfolina, piperidina, etc.; y algunos ejemplos de la sal de adición con aminoácidos son sales de adición de glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámíco, lisina, etc.
Algunos ejemplos del coloide metálico son coloides metálicos que contienen oro, plata, cobre, rodio, sílice, calcio, aluminio, hierro, indio, cadmio, bario, plomo, etc.
Con respecto al lípido catiónico, pueden ejemplificarse los mismos que se mencionaron con anterioridad.
Algunos ejemplos del lípido aniónico son fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y fosfatidilinositol.
Algunos ejemplos de la preparación de la partícula fina son micro esfera, microcápsula, nano cristal y micela polimérica de nanopartícula lipídica.
Con respecto a las partículas finas, pueden ejemplificarse preferiblemente aquellas incluidas en el liposoma.
Con respecto al tamaño de las partículas finas, uno de sus tamaños promedio de partícula es preferiblemente de varios nm hasta varias decenas de \mum y, más preferiblemente, desde 10 nm hasta 1.000 nm.
No hay limitación particular para el derivado polimérico soluble en agua usadas en la presente invención, y sus ejemplos son lípido con polietilenglicol tal como REG-PE, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina-N-(polietileneglicol 2000) (PEG-DSPE); alquil éter de polietilenglicol; un derivado de aceite de ricino de polioxietileno tal como aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 60 y Cremophor EL; un éster de ácido graso de polietilenglicol sorbitano tal como monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 80); un éster de ácido esteárico de polietilenglicol; un copolímero de etilenglicol con propilenglicol; un éster de glicerol; un derivado de polietilenimina; un derivado de alcohol polivinílico; un derivado de ácido poliacrílico; un derivado de poliacrilamida; un derivado de dextrano; un derivado de poliglicerol; un derivado de quitosano; un derivado de polivinilpirrolidona; un derivado de amida poliaspártica; un derivado de poli-L-lisina; un derivado de manano; y un derivado de pululano.
Algunos ejemplos del lípido usado para la membrana lipídica en la presente invención son fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido sintético, y preferiblemente se usa en particular el fosfolípido. Con respecto al fosfolípido, gliceroglicolípido y esfingoglicolípido, pueden mencionarse los mismos que se ejemplificaron con anterioridad y, con respecto al lípido sintético, pueden ejemplificarse fosfatidilcolina adicionada con flúor, detergente adicionado con flúor y bromuro de dialquilamonio.
Con respecto al procedimiento para la preparación de una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar en el que las partículas finas se dispersan y el lípido se disuelve para usarse en la presente invención, puede ejemplificarse un procedimiento en el que partículas finas se dispersan en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido A), el lípido se disuelve en un disolvente orgánico polar o una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente de la mencionada solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido B) y luego se mezclan el líquido A y el líquido B.
Con respecto al procedimiento para recubrir las partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con la presente invención, puede ejemplificarse específicamente el siguiente procedimiento.
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Etapa 1
Las partículas finas se dispersan (suspenden) en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar, preferiblemente en una solución acuosa que contiene un alcohol tal como etanol;
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Etapa 2
El lípido que se disuelve en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente de la solución acuosa que contiene el mencionado disolvente orgánico polar o, preferiblemente en la misma solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar o en el disolvente orgánico polar se añade a la suspensión preparada en la etapa 1, seguido de mezclado. En ese momento, un derivado polimérico soluble en agua puede añadirse en forma adicional a lo anterior y no hay limitación particular para la cantidad del derivado polimérico soluble en agua que se añadirá aquí; y
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Etapa 3
Se agregan pequeñas cantidades de agua a la solución mixta preparada en la etapa 2, se lleva a cabo diálisis o el disolvente orgánico polar se evapora para reducir la proporción del disolvente orgánico polar en la solución mixta por lo cual el lípido disuelto (lípido y el derivado polimérico soluble en agua, en el caso del derivado polimérico soluble en agua se añade en la etapa 2) se acumula sobre la superficies de las partículas finas, se forma una membrana lipídica sobre la superficie de las partículas finas y se preparan vesículas cerradas en las cuales las partículas finas están delimitadas/circunscriptas.
No hay limitación particular para la proporción del disolvente orgánico polar en la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar usado en el procedimiento de la presente invención en tanto se cumplan las condiciones de que las partículas finas estén presentes sin disolverse, y que los componentes que constituyen el recubrimiento de las partículas finas de la membrana lipídica se disuelva, aunque la proporción varía dependiendo del disolvente y las partículas finas usadas y el tipo de lípido usado, es preferiblemente 30% o más y, más preferiblemente, es 60 a 90%. Además, con respecto a la proporción del disolvente orgánico polar en la solución mixta luego de reducirse durante la etapa 3 mencionada con anterioridad, no hay limitación particular en tanto la proporción esté dentro de dicho grado en que el lípido disuelto (lípido y el derivado polimérico soluble en agua, en caso que se añada el derivado polimérico soluble en agua en la etapa 2) se acumula/n sobre la superficie de las partículas finas por lo cual puede formarse membrana lipídica sobre la superficie de las partículas finas y, preferiblemente, la concentración del disolvente orgánico polar en la solución acuosa es 50% o menor.
Aunque la proporción de las partículas finas usadas en la presente invención respecto de la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar o a la preparación obtenida por el procedimiento de la presente invención no se limita particularmente en tanto las mencionadas partículas finas puede recubrirse con la membrana lipídica, es preferiblemente 1 \mug/ml hasta 1 g/ml o, más preferiblemente, 0,1 a 500 mg/ml.
Aunque la proporción del lípido usada en la presente invención a la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar o a la preparación obtenida por el procedimiento de la presente invención no se limita particularmente en tanto las partículas finas puedan recubrirse con éste, es preferiblemente 1 \mug/ml hasta 1 g/ml o, más preferiblemente, 0,1 a 400 mg/ml.
Independientemente del tipo de las partículas finas usadas, es básicamente posible recubrir las partículas finas con la membrana lipídica por el mismo procedimiento que se mencionó con anterioridad.
Con respecto al disolvente orgánico polar y el lípido usados en la presente invención, pueden usarse los que se encuentran en el mercado.
Las partículas finas usadas en la presente invención se encuentran disponibles en el mercado o pueden fabricarse por procedimientos conocidos.
Por ejemplo, para la fabricación del liposoma que constituye las partículas finas, puede aplicarse un procedimiento conocido para la preparación del liposoma. Con respecto a un procedimiento conocido para la preparación of liposoma, puede ejemplificarse un procedimiento de preparación de liposomas descrito por Bangham, et al. [J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)], un procedimiento de inyección de etanol [J. Cell. Biol., 66, 621 (1975)], un procedimiento de prensa Francesa [FEBS Lett., 99, 210 (1979)], un procedimiento de congelamiento-descongelamiento [Arch, Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)], un procedimiento de evaporación de fase reversa [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194 (1978)] y un procedimiento de gradiente de pH (Patente Japonesa No. 2.572.554; Patente Japonesa No. 2.659.136; etc.).
La mejora en la calidad de la superficie de liposomas producida por el detergente no iónico, detergente catiónico, detergente aniónico, polisacárido o uno de sus derivados, un derivado de polioxietileno, etc. también puede llevarse a cabo en forma opcional, y también pueden utilizarse como partículas finas de la presente invención aquellos liposomas en los cuales la calidad de la superficie se mejora [Stealth Liposomes, ed. by D, D. Lasic and F. Martín, CRC Press Inc., Florida, 93-102 (1995)].
Con respecto a una solución para suspender el liposoma en la fabricación de las partículas finas que constituyen los liposomas, pueden usarse ácido, álcali, varias clases de tampones, solución salina fisiológica, solución de infusión de aminoácidos, etc., además de agua. También es posible agregar un antioxidante tal como ácido cítrico, ácido ascórbico, cisteína y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una suspensión de liposomas. Además es posible añadir glicerol, glucosa, cloruro de sodio, etc. como solución de isotonicidad.
También es posible que un fármaco y el lípido se disuelvan en un disolvente orgánico tal como etanol, que el disolvente se evapore de allí, se añada una solución salina fisiológica, o similares al residuo y que la mezcla se agite y sacuda para formar el liposoma.
Puede agregarse un derivado polimérico soluble en agua cuando el fármaco está contenido en el liposoma, cuando se forma un complejo del liposoma con el medicamento o después de eso.
No hay limitación particular para un tamaño de partícula promedio del liposoma y puede seleccionarse libremente a demanda. Algunos ejemplos de un procedimiento para ajustar el tamaño de partícula promedio son un procedimiento de extrusión y un procedimiento en el que se pulveriza un liposoma multilaminar grande (MLV) en forma mecánica usando Manton-gaulin, microfluidificadores, etc. [R. H. Muller, S. Benita, B. Bohm (ed.), "Emulsión and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs", High-Pressure Homogenization Techniques for the Production of Liposome Dispersions: Potential and Limitations, M. Brandl, 267-294 (1998) (Scientific Publishers, Stuttgart, Germany)].
Un procedimiento para la formación de un complejo combinado por dos o más miembros seleccionados de un fármaco que constituye las partículas finas, sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico, una preparación de partículas finas y un derivado polimérico soluble en agua puede ser un procedimiento en el que el fármaco solo se mezcla con lípidos, polímeros, etc. en agua y, en ese momento, la etapa de selección del tamaño de partículas, etapa aséptica, etc. pueden añadirse adicionalmente si es necesario. También es posible que la formación del complejo se lleve a cabo en varios disolventes tales como acetona y éter.
Con respecto a las partículas finas usadas en la presente invención y/o la membrana lipídica que recubre las partículas finas obtenidas por la presente invención, es posible que su superficie se modifique a través de una proteína tal como un anticuerpo, un sacárido, glicolípido, un aminoácido, un ácido nucleico y varios compuestos de bajo peso molecular y compuestos poliméricos, o que dicha sustancia se añada solo a las partículas finas y/o membrana de lípidos seguido del uso.
Por ejemplo, con el fin de aplicar al blanco, es posible que la membrana recubierta se someta además a una modificación de superficie de la membrana lipídica usando una proteína (incluyendo un anticuerpo), un péptido, un ácido graso, etc. [Stealth Liposomas, ed. by D. D. Lasic and F. Martín, CRC Press Inc., Florida, 93-102, (1995)].
Las partículas finas recubiertas con la membrana lipídica obtenidas por el procedimiento de la presente invención pueden usarse tal como están, o dependiendo de la finalidad de uso, condición de conservación, etc., pueden liofilizarse luego de la incorporación del excipiente tal como manitol, lactosa, trehalosa, maltosa o glicina. La conservación por congelamiento luego de la añadidura de un agente conservador de congelamiento tal como glicerol también es posible. Además, también es posible que la granulación, secado, etc. se lleven a cabo junto con un excipiente apropiado para la fabricación de una preparación oral tal como cápsulas, comprimidos o gránulos.
Las partículas finas recubiertas con la membrana lipídica obtenidas por el procedimiento de la presente invención pueden suspenderse usando ácido, álcali, varios buffers, solución salina fisiológica, solución de transfusión de aminoácidos, etc. además de agua. También es posible que se añada un antioxidante tal como ácido cítrico, ácido ascórbico, cisteína o EDTA a una suspensión de liposomas. Además es posible incorporar glicerol, glucosa, cloruro de sodio o similares como agente de isotonicidad.
La preparación obtenida por el procedimiento de la presente invención se usa generalmente como inyecciones pero también es posible que se use luego en la fabricación de preparaciones orales, gotas nasales, soluciones oftálmicas, preparaciones percutáneas, supositorios, preparaciones para inhalación o similares.
La preparación obtenida por la presente invención puede usarse con el objetivo de estabilización del fármaco en el cuerpo vivo de componentes tales como los componentes de la sangre o en la sangre o tractos gastrointestinales, reducción de efectos colaterales, aumento en la propiedad de acumulación a órganos blanco tal como tumor, mejora en la absorción per os o a través de la membrana mucosa, etc.
A continuación se mostrarán Ejemplos y Ejemplos Comparativos de la presente invención.
Mejor modo de llevar a cabo la invención Ejemplo 1
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de dextrano fluoresceína aniónica (FD) (fabricada por Molecular Probes), 60 mg de DOTAP (fabricado por Avanti) y 24 mg de PEG-DSPE (fabricado por Avanti), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo (EggPC) y 50 mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a la suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió una solución salina con buffer de fosfato (PBS) a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 1).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de una difracción de luz dinámica (DLS) [Un modelo ELS-800, Otsuka Electronics, Ltd.; de aquí en adelante se usó el mismo], se encontró que era
134 nm.
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Ejemplo 2
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD, 60 mg de DOTAP y 24 mg de PEG-DSPE, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de poficarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 120 mg de EggPC y 25 mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 2).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 179 nm.
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Ejemplo 3
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD, 60 mg de DOTAP y 24 mg de PEG-DSPE, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum por 20 veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 60 mg de EggPC y 12,5 mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 3).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 184 nm.
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Ejemplo 4
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD y 60 mg de DOTAP, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg de EggPC y 74 mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 4).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 131 nm.
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Ejemplo 5
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD y 60 mg de DOTAP, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg de EggPC en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 5).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 458 nm.
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Ejemplo 6
Se agregaron agua destilada (1,49 ml) y 0,01 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 mol/l) a 2,5 mg de insulina marcada con (FITC) isotiocianato de fluoresceína (F-Ins), 30 mg de DOTAP y 12 mg de PEG-DSPE, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 2 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 120 mg de EggPC y 25 mg de PEG-DSPE en 0,5 ml de etanol. Se añadió agua destilada (46 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110,000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 6).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 132 nm.
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Ejemplo 7
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,5 ml) se añadió 0,25 ml de una solución preparada disolviendo fosforotioato unido a isotiocianato de fluoresceína (F-PS) (fabricado por Sci Media) en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml, seguido del añadido de 1 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,25 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (120 mg/25 mg/ml). Se añadió agua destilada (23 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior seguido y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas. Se disolvió PEG-DSPE (la proporción de PEG-DSPE a EggPC es 50:120 (peso: peso)) en una pequeña cantidad de etanol (4% en volumen de la suspensión de liposomas) seguido de la mezcla con la suspensión de liposomas y aplicación de calor a 70ºC durante 2 minutos. Se añadió PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 7).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 111 nm.
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Ejemplo 8
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 10 mg/ml seguido del añadido de 0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,2 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior seguido y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos. hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 8).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 112 nm.
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Ejemplo 9
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido de 0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,2 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de manera que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 9).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 137 nm.
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Ejemplo 10
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 17,5 mg/ml seguido del añadido de 0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,2 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 10).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 132 nm.
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Ejemplo 11
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 20 mg/ml seguido del añadido de 0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,2 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 11).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 164 nm.
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Ejemplo 12
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,25 ml) se añadió 0,125 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,125 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/100 mg/ml). Se añadió agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 12).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 122 nm.
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Ejemplo 13
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,25 ml) se añadió 0,125 ml de una solución preparada disolviendo F-PS en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 0,125 ml de una solución de EggPC/PEG-DSPE/etanol (360 mg/150 mg/ml). Se añadió agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a re-suspensión para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 13).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 165 nm.
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Ejemplo 14
Se agitaron y batieron suspensiones de DOTAP (30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 125 ml de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 125 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 25 mg de aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 60 (fabricado por NOF CORPORATION) se disolvieron en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 \mul) se añadió a lo anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. Se disolvió PEG-DSPE (la proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de la suspensión de liposomas y la solución etanólica de PEG-DSPE se calentó a 70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 14).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 116 nm.
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Ejemplo 15
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP (30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una suspensión de liposoma donde et tamaño de partículas era de aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 250 \mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se añadió a 500 \mul de la suspensión seguido del añadido de 1 ml de etanol a lo anterior, A esta suspensión se añadió en forma adicional 250 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 25 mg de Cremophor EL (fabricado por Sigma) se disolvieron en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (23 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 \mul) se añadió a lo anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. Se disolvió PEG-DSPE (la proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de la suspensión de liposomas y la solución etanólica de pEG-DSPE se calentó a 70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 15).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 140 nm.
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Ejemplo 16
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP (30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 120 \mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 125 \mul de una solución donde 25 mg deTween 80 se disolvió en 1 ml de una solución etanólica de 120 mg/ml EggPC. Se añadió agua destilada (11,5 \mul) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. PEG-DSPE (proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) se disolvió en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de la suspensión de liposomas y la solución etanólica de PEG-DSPE se calentó a 70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 16).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 151 nm.
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Ejemplo 17
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP (30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 125 \mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 125 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC, 120 mg de.Span 20 (fabricado por Kanto Kagaku) y 50 mg de PEG-DSPE se disolvieron in 2 ml de etanol. Se añadió agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. PEG-DSPE (proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) se disolvió en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de las suspensiones de liposomas y la solución etanólica de PEG-DSPE se calentaron a 70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 17).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 131 nm.
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Ejemplo 18
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP (30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 250 \mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se añadió a 500 \mul de la suspensión seguido del añadido de 1 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma adicional 250 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 12,5 mg de Cremophor EL (fabricado por Sigma) se disolvieron en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (23 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. Se disolvió PEG-DSPE (la proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de las suspensiones de liposomas y la solución etanólica de PEG-DSPE se calentaron a 70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 18).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 133 nm.
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Ejemplo 19
A 589 mg de lecitina de yema de huevo (fabricada por QP CORPORATION) se añadió 11,8 ml de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio de 50 mmol/l, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 30 veces. La suspensión (40 ml) se mezcló con una solución mixta que comprende 1 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml de G-CSF (fabricado por Kyowa Hakko; Nartograstim; mulante G-CSF humano recombinado genéticamente) y 1 ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransuifato de sodio (fabricado por Merck), y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 usando soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l (fabricado por Kanto Kagaku). A 500 \mul de esta solución mixta se agregaron 753 \mul de etanol y luego 80 \mul de una solución etanólica de 50 mg/ml de lecitina de yema de huevo. Se añadió agua destilada (7 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 10% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua a lo anterior y se sometió a re-suspensión para conformar la cantidad total a 500 \mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 19).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 316 nm.
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Ejemplo 20
A 588 mg de lecitina de yema de huevo y 205 mg de PEG-DSPE se añadió una cantidad apropiada de etanol a temperatura ambiente para disolverla y luego se evaporó el etanol, seguido de secado al vacío. Se añadió a lo anterior 11,8 ml de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio de 50 mmol/l seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 30 veces. La suspensión (40 \mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 1 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml de G-CSF y 1 ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 usando soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l, A 500 \mul de esta solución mixta se añadió 753 \mul de etanol, y luego 80 \mul de etanol que contiene 50 mg/ml de lecitina de yema de huevo y 16,7 mg/ml de PEG-DSPE se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (7 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 10% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua a lo anterior y se sometió a re-suspensión para llegar a la cantidad total de 500 \mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposoma (Preparación 20).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 316 nm.
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Ejemplo 21
A 598 mg de lecitina de yema de huevo y 68,8 mg de éster de ácido graso de sacarosa (fabricado por Mitsubishi Chemical) se añadió una cantidad apropiada de etanol a temperatura ambiente para disolverla y luego se evaporó el etanol, seguido de secado al vacío. 12,0 ml de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio de 50 mmol/l se añadió a lo anterior seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 30 veces. La suspensión (40 \mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 1 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml de G-CSF y 1 ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 500 \mul de esta solución mixta se añadió 753 \mul de etanol, y luego 80 \mul de etanol donde 50 mg/ml de lecitina de yema de huevo y 4,5 mg/ml de éster de ácido graso de sacarosa se disolvieron y se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (7 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 10% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua a lo anterior y se sometió a re-suspensión para conformar la cantidad total a 500 \mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 21).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 242 nm.
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Ejemplo 22
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces. La suspensión (571 \mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 119 \mul de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio que contiene 1,4 mg/ml de G-CSF y 167 ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l, A 0,5 ml de esta solución mixta se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167 \mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo (EggPC; fabricado por NOF CORPORATION) y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (47 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua destilada a lo anterior y se sometió a re-suspensión, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 22).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 126 nm.
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Ejemplo 23
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,03 \mum durante 7 veces. La suspensión (286 \mul) se mezcló con 286 \mul de una solución mixta que comprende 119 \mul de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio que contiene 1,4 mg/ml de G-CSF y 167 \mul de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 0,25 ml de esta solución mixta se añadió 333 \mul de etanol, y luego 84 \mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (23,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la incorporación una solución acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 23).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 146 nm.
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Ejemplo 24
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. La suspensión (428 \mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 89 \mul de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio que contiene 1,4 mg/ml de G-CSF y 125 \mul de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 0,5 ml de esta solución mixta se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167 \mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (47 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo ta re-suspensión por la incorporación de una solución
acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 24).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 134 nm.
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Ejemplo 25
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. La suspensión (500 \mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 20 \mul de una solución de PBS que contiene 1.000.000 unidades/ml de interferón \alpha-2b (fabricado por Research Diagnostics), 150 \mul de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio y 80 \mul de agua destilada, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 0,5 ml de esta solución mixta se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167 \mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (47 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la incorporación una solución acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 25).
Cuando se midió el tamaño promedio de partícula del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 164 nm.
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Ejemplo Comparativo 1
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y 54 mg de colesterol (Col) en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Se añadió PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación a).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 134 nm.
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Ejemplo Comparativo 2
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y 54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Una solución etanólica de PEG-DSPE con una concentración de 1471 mg/ml (0,05 ml) se añadió a lo anterior seguido de aplicación de calor a 70ºC durante 5 minutos, luego de lo cual la superficie del liposoma se recubrió con PEG. Se añadió PBS a lo anterior para ajustar la concen-
tración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación b).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 143 nm.
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Ejemplo Comparativo 3
Se disolvieron fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) (300 mg), 100 mg de Col y 100 mg de PEG-DSPE en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 8 ml de una solución acuosa de FD (18,8 mg/ml). Se pasó la suspensión, a 70ºC, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 4 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 10 veces. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la incorporación de PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación c).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 149 nm.
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Ejemplo Comparativo 4
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y 54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al vacío. A la capa delgada resultante se agregaron 5 ml de una solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la incorporación de PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación d).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 141 nm.
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Ejemplo Comparativo 5
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y 54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Una solución etanólica de PEG-DSPE con una concentración de 1471 mg/ml (0,05 ml) se añadió a lo anterior seguido de aplicación de calor a 70ºC durante 5 minutos, luego de lo cual la superficie del liposoma se recubrió con PEG. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la incorporación de PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación e).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 139 nm.
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Ejemplo Comparativo 6
Se disolvió F-PS en PBS luego de lo cual se obtuvo una solución de F-PS (Preparación f).
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Ejemplo Comparativo 7
Se llevó a cabo un mezclado para preparar DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml), seguido de agitación por un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. A 0,5 ml de la suspensión se añadió 0,25 ml de una solución acuosa donde F-PS se disolvió en agua destilada en una cantidad de 15 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación g) en la cual la concentración total de lípidos fue de 28 mg/ml.
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 108 nm.
Ahora, se ilustrarán las ventajas de la presente invención a través de los siguientes Ejemplos de Prueba.
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Ejemplo de Prueba 1
Las preparaciones 1 a 5 preparadas en los Ejemplos 1 a 5 y las preparaciones a que se prepararon en los Ejemplos Comparativos 1 a 5 se sometieron a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad del FD en cada preparación y el FD en el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga, intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una lectora de microplacas fluorescentes. Además, la fosfatidilcolina (PC) en liposoma de cada preparación se cuantificó por medio de un procedimiento enzimático usando un Test de Fosfolípidos C Wako (fabricado por Wako Puré Chemical). Se calculó la concentración total de lípidos sobre la base de ta concentración de PC en vista de una tasa de inducción. La eficiencia de contención de FD en liposoma por lípido y la proporción de contención por separación centrífuga se calcularon con aplicación de las siguientes expresiones
(1) y (2).
(1)Eficiencia de contención por lípido (mg FD/mg total de lípidos) = (A^{1} - C^{1})/B^{1}
en la que
A^{1}: cantidad de FD en cada preparación (mg/ml)
B^{1}: cantidad total de lípidos en cada preparación (mg/ml)
C^{1}: cantidad de FD en el líquido sobrenadante (mg/ml)
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(2)Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{1} - C^{1}) + B^{1}]/(D^{1} + E^{1}) \ x \ 100
en la que
A^{1}: cantidad de FD en cada preparación (mg/ml)
B^{1}: cantidad total de lípidos en cada preparación (mg/ml)
C^{1}: cantidad de FD en el líquido sobrenadante (mg/ml)
D^{1}: tasa de inducción de FD (mg/ml) en los Ejemplos 1 a 5 o en los Ejemplos Comparativos 1 a 5
E^{1}: tasa de inducción de total de lípidos (mg/ml) en los Ejemplos 1 a 5 o en los Ejemplos Comparativos 1 a 5.
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El resultado se muestra en la Tabla 1 y Tabla 2.
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TABLA 1 Eficiencia de contención por lípido
1
TABLA 2 Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga
2 
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La Tabla 1 muestra que los liposomas de las preparaciones 1 a 5 tienen alta eficiencia de contención al igual que aquellas de las preparaciones a y c, sin embargo la (cantidad de FD)/(cantidad total de lípidos) en la etapa de inducción no se tiene en cuenta. Las cantidades de inducción en la fabricación de las preparaciones 1 a 5 y las preparaciones a hasta e son diferentes y, dado que se usa una gran cantidad de FD para el lípido para la fabricación particularmente en el caso de la preparación c, puede decirse que los liposomas de las preparaciones 1 a 5 y la preparación a son el liposoma donde la cantidad de FD para la cantidad total de lípidos es significativa cuando la tasa de inducción se tiene en cuenta.
La Relación de Contención como se muestra en la Tabla 2 es el porcentaje obtenido dividiendo el resultado de Tabla 1 por (cantidad de FD)/(cantidad total de lípidos) en la etapa de inducción, y refleja la (cantidad de FD)/(cantidad total de lípidos) en la etapa de inducción. La Tabla 2 muestra que Relación de Contención de FD es alta en los liposomas de las preparaciones 1 a 5 y a, mientras que la Relación de Contención es baja en los liposomas de las preparaciones b a e. Esto significa que, en los liposomas de las preparaciones b a e, hay mucho FD libre que no está contenido y, durante el proceso de preparación para la Relación de Contención, el FD libre se elimina. A partir del resultado, se entiende que, en el FD de inducción, una cantidad del FD que se incluye en el liposoma o se une levemente a (electrostáticamente adsorbido con) la superficie del liposoma es pequeña y el FD efectivamente utilizado es pequeño en las preparaciones b a e.
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Ejemplo de Prueba 2
Se añadió PBS (1,98 ml) a y se mezcló con cada uno de 0,02 ml de las preparaciones 1 a 5 fabricadas en los Ejemplos 1 a 5 y las preparaciones a hasta e fabricadas en los Ejemplos Comparativos 1 a 5, luego de lo cual se produjo una solución muestra. Inmediatamente después de mezclar, 0,5 ml de la solución de muestra se sometió a filtración con gel (Sepharose CL-4B: 0 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 2 ml; cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). Se separaron la fracción de liposoma y una fracción del componente que no se contiene en el liposoma y la intensidad de fluorescencia del eluato se midió de igual modo que en el Ejemplo de Prueba 1. La Relación de Contención por la filtración con gel se calculó por aplicación de la
fórmula (3).
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(3)Relación de Contención (%) por la filtración con gel = [F^{1}/F^{1} + G^{1})] \ x \ 100
en la que
F^{1}: cantidad de FD en la fracción de liposoma (mg)
G^{1}: cantidad de FD en la fracción del componente que no se contiene en el liposoma (mg)
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 3.
TABLA 3 Relación de Contención por Filtración con gel
3 
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En la filtración con gel, no sólo se elimina el FD libre sino también et FD que está levemente unido a (adsorbido electrostáticamente con) la superficie de liposoma. Además, cuando la estabilidad de la preparación es escasa, una parte de FD existente en la fase acuosa interna se filtra. La Tabla 3 muestra que las Relaciones de Contención de liposomas en las preparaciones 1 a 5, c y e son altas. Esto significa que FD está presente en abundancia en la fase acuosa interna del liposoma. Sin embargo, en la Tabla 3, (cantidad de FD)/(cantidad de total de lípidos) en la etapa de inducción no se tiene en cuenta y, en la preparación c, la fabricación se realiza usando un lote de FD para el lípido, por el cual la Relación de Contención es naturalmente alta. Por otro lado, en las preparaciones a, b y d, los valores son bajos y FD no se incluye sustancialmente en el liposoma, por lo cual puede decirse que son las preparaciones que tienen poca estabilidad.
La Tabla 2 muestra una propiedad de fabricación, mientras que la Tabla 3 muestra la estabilidad de liposoma. A partir de la Tabla 2 y Tabla 3, es obvio que la preparación a tiene una buena propiedad de fabricación pero no es muy estable y, por el contrario, las preparaciones c y e son estables pero la propiedad de fabricación es escasa. Además, es obvio que las preparaciones b y d tienen escasa propiedad de fabricación y estabilidad, mientras que las preparaciones 1 a 5 tienen buena propiedad de fabricación y estabilidad. Eso muestra que FD está sustancialmente contenido dentro del
liposoma o, en otras palabras, et complejo FD-lípido catiónico esté recubierto con lípido en las preparaciones 1 a 5.
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Ejemplo de Prueba 3
La preparación 6 preparada en el Ejemplo 6 se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad de la F-Ins en la preparación 6 y la F-Ins en el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga, intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una lectora de microplacas fluorescentes. Además, el PC en liposoma de la preparación se cuantificó por medio de un procedimiento enzimático usando a Fosfolípido C-Test Wako (fabricado por Wako Puré Chemical). Se calculó la concentración total de lípidos sobre la base de la concentración de PC en vista de una relación de inducción. La eficiencia de contención de F-Ins en liposoma por lípido y la Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga se calcularon por las siguientes expresiones (4) y (5).
(4)Eficiencia de contención por lípido (mg F-Ins/mg total de lípidos) = (A^{2} - C^{2})/B^{2}
en la que
A^{2}: cantidad de F-Ins en la preparación 6 (mg/ml)
B^{2}: cantidad total de lípidos en la preparación 6 (mg/ml)
C^{2}: cantidad de F-Ins en el líquido sobrenadante (mg/ml)
(5)Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{2} - C^{2}) / B^{2}]/(D^{2} + E^{2}) \ x \ 100
en la que
A^{2}: cantidad de F-Ins en la preparación 6 (mg/ml)
B^{2}: cantidad total de lípidos en la preparación 6 (mg/ml)
C^{2}: cantidad de F-Ins en el líquido sobrenadante (mg/ml)
D^{2}: tasa de inducción de F-Ins (mg/ml) en el Ejemplo 6
E^{2}: tasa de inducción de total de lípidos (mg/ml) en el Ejemplo 6.
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El resultado se muestra en la Tabla 4 y Tabla 5.
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TABLA 4 Eficiencia de contención por lípido
4 
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TABLA 5 Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga
5 
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La Tabla 4 muestra que, en la preparación 6, la eficiencia de contención de F-Ins en el liposoma por lípido es alta a pesar del hecho de que la cantidad de inducción de F-Ins por lípido es pequeña.
Con respecto a la Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga, la medición se conduce en tal aspecto que la F-Ins que se une débilmente a la superficie del liposoma queda contenida. La Tabla 5 muestra que en el liposoma de la preparación 6, la Relación de Contención es alta en el liposoma de la preparación 6 al igual que en los casos de liposomas de las preparaciones 1 a 5.
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Ejemplo de Prueba 4
Se añadió PBS (1,98 ml) y se mezcló con 0,02 ml de la preparación 6 fabricada en el Ejemplo 6, luego de lo cual se produjo una solución muestra. Inmediatamente luego de mezclar, 0,5 ml de la solución muestra se sometió a filtración con gel (Sepharose CL-4B; \diameter 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 2 ml; cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). La fracción de liposoma y una fracción del componente que no se contiene en el liposoma se separaron y la intensidad de fluorescencia del eluato se midió de igual modo que en el
Ejemplo de Prueba 3. La Relación de Contención por ta filtración con gel se calculó por aplicación de la fórmula (6).
(6)Relación de Contención (%) por la filtración con gel = [F^{2}/(F^{2} + G^{2})] \ x \ 100
en la que
F^{2}: cantidad de F-Ins en la fracción de liposoma (mg)
G^{2}: cantidad de F-Ins en la fracción del componente que no se contiene en el liposoma (mg).
El resultado se muestra en la Tabla 6.
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TABLA 6 Relación de Contención por filtración con gel
6 
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La Relación de Contención por filtración con gel se mide luego de la eliminación de F-Ins que se une suavemente a la superficie del liposoma. La Tabla 6 muestra que, en el caso del liposoma de la preparación 6, la relación de contención es alta y F-Ins está presente en forma abundante en la fase acuosa interna del liposoma al igual que en los casos de las preparaciones 1 a 5. De este modo, puede decirse que la preparación 6 es una preparación que tiene buena estabilidad donde F-Ins está sustancialmente incluido en el liposoma, lo que muestra que un complejo de F-Ins con lípido está recubierto con lípido.
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Ejemplo de Prueba 5
Las preparaciones 7 a 13 preparadas en los Ejemplos 7 a 13 se sometieron a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad de F-PS en cada preparación y el F-PS en el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga, intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una lectora de microplacas fluorescentes. Además, PC en liposoma de cada preparación se cuantificó por medio de un procedimiento enzimático usando una prueba Fosfolípido C-Test Wako (fabricado por Wako Puré Chemical). Se calculó la concentración total de lípidos sobre la base de la concentración de PC en vista de una relación de inducción. La eficiencia de contención de F-PS en liposoma por lípido y Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga se calcularon a través de las siguientes expresiones (7) y (8).
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(7)Eficiencia de contención por lípido (mg F-PS/mg total de lípidos) = (A^{3} - C^{3})/B^{3}
en la que
A^{3}: cantidad de F-PS en cada preparación (mg/ml)
B^{3}: cantidad total de lípidos en cada preparación (mg/ml)
C^{3}: cantidad de F-PS en el líquido sobrenadante (mg/ml)
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(8)Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{3} - C^{3}) / B^{3}]/(D^{3} + E^{3}) \ x \ 100
A^{3}: cantidad de F-PS en cada preparación (mg/ml)
B^{3}: cantidad total de lípidos en cada preparación (mg/ml)
C^{3}: cantidad de F-PS en el líquido sobrenadante (mg/ml)
D^{3}: tasa de inducción (mg/ml) de F-PS en los Ejemplos 7 a 13
E^{3}; tasa de inducción (mg/ml) del total de lípidos en los Ejemplos 7 a 13
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 7 y Tabla 8.
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TABLA 7 Eficiencia de contención por lípido
7 
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TABLA 8 Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga
8 
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La Tabla 7 muestra que, en las preparaciones 7 a 13, la eficiencia de contención de F-PS por lípido es alta.
En la Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga, la medición se conduce en tal respecto que también se incluye el F-PS que está unido débilmente a la superficie del liposoma. La Tabla 8 muestra que los liposomas de las preparaciones 7 a 13 son liposomas donde la Relación de Contención de F-PS es alta.
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Ejemplo de Prueba 6
Se añadió PBS (1,98 ml) a y se mezcló con 0,02 ml de las preparaciones 7 a 9, 11 y 12 fabricadas en los Ejemplos 7 a 9, 11 y 12, luego de lo cual se produjo una solución de muestra. Inmediatamente luego de mezclar, se sometió 0,5 ml de la solución de muestra a filtración con gel (Sepharose CL-4B; Ø 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 2 ml; cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). La fracción de liposoma y una fracción del componente que no se contiene en el liposoma se separaron y la intensidad de fluorescencia del eluato se midió por el mismo modo que en el Ejemplo de Prueba 5. La Relación de Contención por la filtración con gel se calculó por aplicación de la fórmula (9).
(9)Relación de Contención (%) por la filtración con gel = [F^{3}/(F^{3} + G^{3})] \ x \ 100
\newpage
en la que
F^{3}: cantidad de F-PS en la fracción de liposoma (mg)
G^{3}: cantidad de F-PS en la fracción del componente que no se contiene en el liposoma (mg).
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El resultado se muestra en la Tabla 9.
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TABLA 9 Relación de Contención por filtración con gel
9 
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La Relación de Contención por filtración con gel se midió luego de la eliminación de F-PS que se unió levemente a la superficie del liposoma. La Tabla 9 muestra que, en el caso de liposoma de las preparaciones 7 a 9, 11 y 12, la Relación de Contención es alta y F-PS está presente en forma abundante en la fase acuosa interna del liposoma. De este modo, puede decirse que las preparaciones 7 a 9, 11 y 12 son las preparaciones que tienen buena estabilidad donde F-PS se incluye sustancialmente en el liposoma, lo que muestra que un complejo de F-PS con lípido está recubierto con lípido.
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Ejemplo de Prueba 7
Se realizó la comparación para investigar la distribución de F-PS a un tumor. Se trasplantó una sección de tumor de 2 mm cuadrado de célula de cáncer de células renales Caki-1 humano bajo la piel del cuerpo del lado derecho de un ratón lampiño de seis semanas de vida (CLEA Japan) de una cepa BALB/cA Jcl-nu. Luego de 20 días a partir del trasplante, se agruparon los ratones en los cuales el volumen del tumor alcanzó los 102 a 349 mm^{3} de manera tal que cada grupo comprendía 3 ratones, y la preparación 7 fabricada en el Ejemplo 7 y la preparación f fabricada en el Ejemplo Comparativo 6 se administró desde la vena de la cola usando una jeringa (26G; 1 ml; fabricada por Terumo) a la dosis de 25 mg F-PS/kg. Se extirpó el tumor cada tanto, se homogeneizó el tumor y se midió la intensidad en el homogenato de igual modo que en el Ejemplo de Prueba 5. Se evaluó la distribución de F-PS calculando la cantidad de F-PS en el tumor (mg/g) en cada momento predeterminado.
El resultado se muestra en la Fig. 1.
La Fig. 1 muestra que, en los ratones a los cuales se administró la preparación 7, la cantidad de F-PS distribuida al tumor aumenta cuando se compara con el ratón al cual se administró la preparación f.
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Ejemplo de Prueba 8
La preparación 1 fabricada en el Ejemplo 1 se sometió a una observación morfológica usando microscopio electrónico. La preparación se añadió a una solución acuosa al 1% de molibdato de amonio (ajustado hasta un pH 7,3 usando amoníaco) para ajustar la concentración total de lípidos hasta 0,5 mg/ml. Esta se goteó sobre una malla (malla 400; Nisshin EM) a la cual se adjuntó membrana de colodión y, luego de aproximadamente 1 minuto, se absorbió el exceso de agua con papal de filtro seguido de secado. Se hizo una observación usando un microscopio de transmisión de electrones (tipo H-7000; Hitachi) con un voltaje de aceleración de 75 kV.
El resultado fue que, en la preparación 1, hubo una gran cantidad de partículas que tenían partículas cuya forma es diferente de la de la membrana que rodeaba la parte externa. De este modo, este resultado muestra que las partículas internas están recubiertas con una doble capa lipídica.
\newpage
Ejemplo de Prueba 9
La preparación 1 fabricada en el Ejemplo 1 y las preparaciones a y b fabricada en los Ejemplos Comparativos 1 y 2 se administraron (dosis: correspondientes a 10 mg del total de lípidos por kg) a ratas CD(SD)IGS macho bajo anestesia con uretano (peso corporal: 200 a 300 g; un grupo comprendía 2 o 3 ratas) administrado por la vena femoral. Se recolectó sangre de la vena yugular cada tanto usando una jeringa tratada con heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC durante 5 minutos). A partir de entonces, la intensidad fluorescente de FD en el plasma se midió de igual modo que en el Ejemplo de Prueba 1 y se calculó la concentración de FD.
El resultado se muestra en la Fig. 2.
La Fig. 2 muestra que, en las ratas a las cuales se administró la preparación 1, el nivel de concentración de FD en el plasma fue alto comparado con las ratas a las cuales se administró la preparación a o b. De este modo, se demostró que, debido al recubrimiento del complejo FD-lípidos con lípido, se mejora la retención en la sangre.
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Ejemplo de Prueba 10
Las preparaciones 7 a 13 fabricadas en los Ejemplos 7 a 13 y la preparación f fabricada en el Ejemplo Comparativo 6 se administraron (dosis: correspondiente a 10 mg del total de lípidos por kg) a ratas macho CD(SD)IGS (peso corporal: 200 a 300 g; un grupo formado por 2 ratas) bajo anestesia con uretano administrado por la vena femoral. Se recolectó sangre de la vena yugular cada tanto usando una jeringa tratada con heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC durante 5 minutos). A partir de entonces, se midió la intensidad fluorescente de F-PS en el plasma de igual modo que en el Ejemplo de Prueba 5 y se calculó la concentración de F-PS en el plasma.
El resultado se muestra en la Fig. 3.
La Fig. 3 muestra que, en las ratas a las cuales se administraron las preparaciones 7 a 13, el nivel de concentración de F-PS en el plasma fue alto comparado con las ratas a las cuales se administró la preparación f.
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Ejemplo de Prueba 11
La preparación 7 fabricada en el Ejemplo 7 y las preparaciones f a g fabricada en los Ejemplos Comparativos 6 a 7 se administraron (dosis: correspondiente a 10 mg de total de lípidos por kg) a ratones machos BALB/cA Jcl (peso corporal: 20 a 30 g; un grupo comprendía 2 o 3 ratones) de la vena de la cola. Bajo anestesia con éter, se recolectó sangre de la vena femoral usando una jeringa tratada con heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC durante 5 minutos). A partir de entonces, se midió la intensidad de fluorescencia de F-PS en el plasma del mismo modo que en el Ejemplo de Prueba 5 y se calculó la concentración de F-PS en el plasma.
El resultado se muestra en la Fig. 4.
La Fig. 4 muestra que, en los ratones a los cuales se administraron las preparaciones f a g, el F-PS desapareció rápidamente del plasma luego de su administración, mientras que en los ratones a los cuales se administró la preparación 7, el nivel en la concentración de F-PS en el plasma fue alto.
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Ejemplo de Prueba 12
Las preparaciones 13 a 18 fabricada en los Ejemplos 13 a 18 se sometieron a separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad de F-PS en cada preparación y F-PS en el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga, intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una lectora de microplacas fluorescentes. La Relación de Contención de F-PS a liposoma por Separación Ultracentrífuga se calculó por la siguiente
expresión (10).
(10)Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{4} - B^{4})]/B^{4} \ x \ 100
A^{4}: cantidad de F-PS en cada preparación (mg/ml)
B^{4}: cantidad de F-PS en el líquido sobrenadante (mg/ml).
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 10.
TABLA 10 Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba 13
Se añadió suero fetal bovino (FBS) (7,92 ml) a y se mezcló con cada una de 0,08 ml de las preparaciones 7 y 14 a 18 fabricadas en los Ejemplos 7 y 14 a 18, luego de lo cual se produjo una solución de muestra. Inmediatamente después de mezclar (hora 0) y luego de dejar reposar a 37ºC durante 6 a 168 horas, se tomaron muestras y 0,5 ml de cada una de las soluciones de muestras se sometió a filtración con gel (Sepharose CL-4B; 0 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de muestra añadida: 2 ml; cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). Se separaron la fracción de liposoma y una fracción del componente que no se incluyó en el liposoma. Con el fin de cuantificar F-PS en cada fracción, se midió la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm usando una lectora de microplacas fluorescentes. Se calculó la cantidad de F-PS que se filtró del liposoma con el uso de la expresión (11).
(11)Cantidad de F-PS filtrada (%) = [B^{5}/(A^{5} + B^{5})] \ x \ 100
A^{5}: cantidad de F-PS en la fracción de liposoma (mg)
B^{5}: cantidad de F-PS en el componente que no se contiene en el liposoma (mg).
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 11.
TABLA 11 Filtración de F-PS desde el Liposoma en FBS (% de Filtración)
11
La Tabla 11 muestra que el F-PS en las preparaciones 7 y 14 a 18 se filtra del liposoma con el transcurso del tiempo. De este modo, cuando las partículas finas se recubren con membrana lipídica usando el procedimiento de la presente invención, las partículas finas de un medicamento o similares contenidas en la membrana lipídica se filtran luego de acumularse en el sitio blanco en el cuerpo, luego de lo cual ahora es posible el logro de un efecto farmacéutico prolongado.
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Ejemplo de Prueba 14
Se llevó a cabo la filtración con gel de las preparaciones 19 a 21 fabricada en los Ejemplos 19 a 21. Se usó una suspensión de liposomas (0,5 ml) como solución de muestra y se añadió a una columna de filtración con gel (Sepharose CL-4B; \diameter 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 0,5 ml; cantidad de la fracción recolectada: aproximadamente 1,5 ml). Se separaron la fracción de liposomas y la fracción de G-CSF libre, y cada uno de estos se concentró por medio de evaporación centrífuga. Se añadió agua destilada a la fracción de liposoma concentrada para llevar el volumen total a 2 ml. A 200 \mul de la suspensión de liposomas se agregaron 50 \mul de un buffer fosfato 50 mmol/l de pH 7 que contiene 10% de lauril sulfato de sodio y 150 \mul de agua destilada, seguido de agitación. Además, se añadió 400 \mul de 2-propanol a lo anterior seguido de agitación de manera que el liposoma se destruyó completamente, y luego 800 \mul de la siguiente fase móvil I se añadió a lo anterior y se mezcló. Se llevó a cabo una separación centrífuga (10.000 x g durante 5 minutos) y el sobrenadante líquido se sometió a un análisis por HPLC. A la fracción de G-CSF libre concentrada se agregaron una solución acuosa al 50% de acetonitrilo que contiene 2% de Pluronic F 127 (fabricado por Sigma) y 0,5% de ácido trifluoroacético (TFA) para hacer el volumen total igual a 5 ml, que luego se sometió a análisis por HPLC.
Columna:
YMCpack ODS-AM, Ø 6,0 mm x 15 cm
Fase móvil:
I acetonitrilo al 50% que contiene 0,5% de TFA
\quad
II acetonitrilo al 80% que contiene 0,5% de TFA
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La proporción del líquido II luego del inicio del análisis se fijó en 0% durante 0 a 5 minuto(s), aumentó en forma lineal entre de 0% y 100% durante 5 a 35 minutos y se llevó a 100% durante el lapso de 35 a 45 minutos.
Detección: 280 nm
Temperatura para análisis: 30ºC
Caudal de flujo: 1 ml/minuto
Cantidad inyectada: 200 \mul
La Relación de Contención de G-CSF incluida en cada liposoma se calculó a través de la expresión (12).
(12)Relación de Contención (%) = A^{6}/(A^{6} + B^{6}) \ x \ 100
A^{6}: cantidad de G-CSF en la fracción de liposoma (\mug)
B^{6}: cantidad de G-CSF en la fracción de G-CSF libre (\mug).
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 12.
TABLA 12 Relación de Contención
12
La Tabla 12 muestra que las preparaciones 19 a 21 son aquellas en las cuales no hay G-CSF libre separado por filtración con gel.
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Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra la cantidad de F-PS distribuido al tumor. La abscisa muestra el tiempo (hora(s)) luego de la administración de la preparación, mientras que la ordenada muestra la cantidad de F-PS en el tumor.
La Fig. 2 muestra la concentración de FD in plasma. La abscisa muestra el tiempo (hora(s)) luego de la administración de la preparación, mientras que la ordenada muestra la concentración de FD en el plasma.
La Fig. 3 muestra la concentración de F-PS en el plasma. La abscisa muestra el tiempo (hora(s)) luego de la administración de la preparación, mientras que la ordenada muestra la concentración de F-PS en el plasma.
La Fig. 4 muestra la concentración de F-PS en el plasma. La abscisa muestra el tiempo (hora(s)) luego de la administración de la preparación, mientras que la ordenada muestra la concentración de F-PS en el plasma.
Los símbolos usados en la Fig. 1 a la Fig. 4 tienen los siguientes significados.
Fig. 1
- \bullet -:
grupo en el que se administró la preparación 7
- \medcirc -:
grupo en el que se administró la preparación f
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2
- \bullet -:
grupo en el que se administró la preparación 1
- \lozenge -:
grupo en el que se administró la preparación a
- \Delta -:
grupo en el que se administró la preparación b
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3
- \bullet -:
grupo en el que se administró la preparación 7
- \lozenge -:
grupo en el que se administró la preparación 8
- \blacklozenge -:
grupo en el que se administró la preparación 9
- \Delta -:
grupo en el que se administró la preparación 10
- \ding{115} -:
grupo en el que se administró la preparación 11
- \Box -:
grupo en el que se administró la preparación 12
- \blacksquare -:
grupo en el que se administró la preparación 13
- + -:
grupo en el que la preparación f se administró
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4
- \bullet -:
grupo en el que se administró la preparación 7
- + -:
grupo en el que se administró la preparación f
- \blacklozenge -:
grupo en el que se administró la preparación g.
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicabilidad en la industria
De acuerdo con la presente invención, ahora es posible el recubrimiento seguro, conveniente y eficiente de partículas finas con membrana lipídica.

Claims (13)

1. Un procedimiento para recubrir partículas finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta 1.000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que comprende las etapas de:
preparar una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar en la que se suspende el complejo y se disuelve el lípido,
en el que el lípido se selecciona de fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido sintético, y
el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un políalquilenglicol;
recubrir las partículas finas con la membrana lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la proporción del disolvente orgánico polar en la solución acuosa añadiendo agua o por evaporación del disolvente orgánico
polar.
2. Un procedimiento para recubrir partículas finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta 1,000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que comprende las etapas de:
suspender las partículas finas en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido A),
en el que el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un polialquilenglicol;
disolver el lípido en un disolvente orgánico polar o una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente de la solución acuosa anterior que contiene un disolvente orgánico polar (líquido B),
en el que el lípido se selecciona de fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido sintético, y
el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un polialquilenglicol;
mezclar el líquido A y el líquido B para obtener líquido C; y
recubrir las partículas finas con la membrana lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la proporción del disolvente orgánico polar en el líquido C añadiendo agua o por evaporación del disolvente orgánico polar para obtener el líquido D.
3. El procedimiento para recubrir de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las concentraciones del disolvente orgánico polar en el líquido A y el líquido B son de 60 a 90%.
4. El procedimiento para recubrir de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración del disolvente orgánico polar en el líquido D es 50% o menor.
5. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las partículas finas son aquellas que contienen uno o más miembro(s) seleccionado(s) de lípido con polietilenglicol, un alquil éter de polietilenglicol, un derivado de aceite de ricino con polietilenglicol, un éster de ácido graso de polietilenglicol sorbitano, estearato de polietilenglicol, un copolímero de etilenglicol con propilenglicol y un éster de glicerol.
6. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las partículas finas son un complejo de un medicamento con lípido catiónico.
7. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las partículas finas son un complejo de un medicamento con lípido aniónico.
8. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de tas reivindicaciones 1 a 5, en el que las partículas finas son un complejo de un medicamento, fosfolípido que contiene liposomas y una sal sódica de sulfato de dextrano.
\newpage
9. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el fármaco es un fármaco seleccionado de un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y un compuesto polimérico.
10. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el alcohol es etanol.
11. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el glicol es un propilenglicol.
12. El procedimiento para recubrir de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol.
13. Las partículas finas que pueden obtenerse por el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
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