JP2002537804A - 望ましいモルホロジーを有する結晶を速やかに得るための方法 - Google Patents

望ましいモルホロジーを有する結晶を速やかに得るための方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、望ましい結晶モルホロジー(たとえば正方形)が得られるように出発温度を選定する、という結晶化法を提供する。さらなる核形成を引き起こすほど充分ではなく、結晶が望ましい仕方ではあるが異なった動力学(たとえば、より高い結晶化速度)で成長し続ける、という温度シフトを導入する。この結果、このプロセスによって、望ましいモルホロジーを有する結晶生成物がより高い結晶化速度で得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は結晶化に関する。さらに詳細には、本発明は、所望のモルホロジーを
有する蛋白質結晶を得るための方法に関する。
【０００２】 発明の背景 酵素物質を精製・調製するための1つの手段としての酵素の析出と結晶化に対
して活発な研究活動が行われている。たとえば、米国特許第4,659,667号では、
酵素の等電点付近のpHにて酵素含有溶液を過飽和状態になるまで濃縮し、結晶化
を起こさせ、そして結晶化した最終物質を回収することによって、溶液から酵素
を回収するための方法が開示されている。結晶化は、濃縮して酵素が自然に結晶
化させることによって、充分に種結晶を入れることによって、撹拌することによ
って、あるいは容器の内表面を引っ掻くことによってなされる。α-アミラーゼ
の結晶化が例示されている。
【０００３】 PCT公開番号WO89/08703では、少なくとも約40g/リットルの濃縮スブチリシン
溶液にハロゲン化物塩(たとえば、塩化ナトリウムや塩化カルシウム)を加えるこ
とによってスブチリシンを結晶化させるための方法が開示されている。
【０００４】 EP506,866では、比較的高純度の酵素を含んだ液体と少なくとも約5g/リットル
という濃度の酵素とを含有する水溶液を出発物質として使用すること、および酵
素を非晶形にて析出させるのに必要な濃度よりかなり低い濃度の溶液に、非ハロ
ゲン化物タイプの易溶性塩を結晶化剤として加えることを特徴とする、酵素を結
晶化させるための方法が開示されている。ある特定のスブチリシン酵素の30℃ま
での温度での結晶化が例示されている。プロテアーゼ物質の精製を容易にするた
めに(但し、結晶化に対しては有効ではない)硫酸ナトリウムが使用されている。
【０００５】 酵素結晶化の分野におけるこのような進歩にもかかわらず、大規模生産に適し
た低コストで且つ効率的なプロテアーゼの結晶化法が業界では依然として求めら
れている。望ましいモルホロジーを有する結晶を工業的規模で速やかに得ること
ができれば、大きなコスト低減につながるので、業界にとって極めて重要である
。
【０００６】 発明の概要 本発明の1つの態様は、所望のモルホロジーを有する結晶(たとえば、正方形板
状体、六角形結晶、または長方形結晶など)を速やかに得るための結晶化法を提
供する。一般には、望ましいモルホロジーは、結晶が、他の生成しうる結晶モル
ホロジーの場合よりも高い強度を示すようなモルホロジーである(たとえば、細
長い針状体または棒状体に対して、正方形もしくは長方形の板状体あるいは正方
形もしくは長方形の立方形状体)。1つの実施態様においては、正方形板状体結晶
が得られるように出発温度が選定される。出発温度は、たとえば室温未満の温度
(たとえば20℃未満)であってよい。次いで、結晶が正方形板状体上にて異なった
動力学(たとえば、より高い結晶化速度)で成長し続けるよう、好ましくはさらな
る核形成をできるだけ抑えるか又は起こさせない仕方で温度のシフトまたは上昇
を果たす。温度のシフトは、たとえば、少なくとも室温までである(たとえば約2
0〜60℃)。この結果、本発明の方法により、望ましいモルホロジーを有する結晶
質物質がより高い結晶化速度にて得られる。
【０００７】 本発明の方法は、所望のモルホロジーを有する蛋白質(たとえば酵素)の結晶を
速やかに得るのに特に有用である。1つの実施態様においては、本発明の方法を
使用して、酵素含有溶液から25時間未満で少なくとも約90%の結晶化を達成でき
、このとき酵素結晶は、主として正方形板状のモルホロジーを有する。
【０００８】 本発明の他の特徴、態様、および利点は、図面と特許請求の範囲を参照しつつ
下記の詳細な説明を読めば明らかである。 発明の詳細な記述 本発明は、望ましい結晶モルホロジー(たとえば正方形板状体)が得られるよう
に出発温度を選択する(たとえば室温未満)という結晶化法を提供する。結晶が、
望ましい態様ではあるが異なった動力学(たとえば、より高い結晶化速度)で成長
し続ける、という温度シフトを導入する(たとえば室温以上まで)。この結果、本
発明の方法により、望ましいモルホロジーを有する結晶物質がより高い結晶化速
度で得られる。
【０００９】 所望のモルホロジーを有する結晶が出発温度でいったん生成し始めたら、さら
なる核形成を最小限に抑えるか又は完全に起こらなくするような適切な温度シフ
トを選択することができ、これによって所望するモルホロジー以外のモルホロジ
ーを有する結晶の形成を防ぐことができる。たとえば、ある時間にわたって別個
の工程にて温度を上げることができる(たとえば、約25分にわたって5分ごとに約
4℃上昇)。あるいは、さらなる核形成を最小限に抑える連続的なランピング・プ
ロフィール(ramping profile)を定めることもできる。このようなランピング・
プロフィールは、一定の割合の上昇(たとえば、約10分のシフト時間にわたって2
℃/分)を示してもよいし、あるいはシフト時間に対する割合が変化してもよい(
たとえば、10分に関して1℃/分から、5分に関して2℃/分に変化)。
【００１０】 結晶化法を使用して蛋白質を回収する際には、温度、pH、使用する塩の種類、
結晶化のための時間、および結晶のモルホロジーを含めて、所望のモルホロジー
を有する結晶が得られるようバランスさせなければならない多くのファクターが
ある。
【００１１】 本発明の範囲内に含まれる蛋白質としては、医薬用として重要な蛋白質(たと
えば、ホルモンや他の治療用蛋白質)および工業的に重要な蛋白質(たとえば酵素
)がある。
【００１２】 好ましい酵素としては、基質(たとえばステイン)を加水分解できる酵素がある
。これらの酵素は加水分解酵素として知られており、プロテアーゼ(bacterial,
fungal, acid, neutral or alkaline)、アミラーゼ(αまたはβ)、リパーゼ、セ
ルラーゼ、およびこれらの混合物があるが、これらに限定されない。特に好まし
い酵素はスブチリシンとセルラーゼである。最も好ましいのは、米国特許第4,76
0,025号、ヨーロッパ特許130756B1、およびヨーロッパ特許出願WO91/06637(これ
らの特許文献を参照により本明細書に含める)に記載されているようなスブチリ
シンである。本発明において使用できる他の酵素としては、オキシダーゼ、トラ
ンスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、およびイソ
メラーゼなどがある。
【００１３】 プロテアーゼのアミノ酸の1種以上が除去、置き換え、または処理されたDNA配
列から誘導される遺伝学的に変性を施したプロテアーゼも、本発明の範囲内であ
ると考えられる。このような変性プロテアーゼは、たとえばPCT公開番号WO95/10
615および米国特許第5,185,258号に開示されている。
【００１４】 本発明の結晶化法を使用して回収される酵素は、それぞれその初期活性を少な
くとも80%保持するのが好ましく、少なくとも90%保持するのがさらに好ましく、
そして少なくとも95%保持するのが最も好ましい。
【００１５】 細胞を培養するための発酵手順および蛋白質を製造するための発酵手順は、当
業界において公知である。蛋白質はたとえば、バッチ法、フェッド-バッチ法(fe
d-batch process)、および連続フロー法を含めて、固体培養によっても深部培養
によっても製造することができる。発酵ブロスからの蛋白質の採集と精製も、当
業界に公知の手順によって行うことができる。
【００１６】 本発明の方法のための出発物質として作用する水溶液は、適切な微生物の発酵
によって得られる発酵ブロスから誘導される。発酵ブロスは一般に、細胞、種々
の懸濁固体、他のバイオマス汚染物質、および所望のプロテアーゼ物質を含めた
細胞破片を含有しており、これらは当業界に公知の手段によって発酵ブロスから
除去するのが好ましい。このような除去を行って細胞を含有しない濾液を得るの
に適した方法としては、遠心分離、濾過、透析、精密濾過、回転減圧濾過、また
は他の公知のプロセス等の従来の固体-液体分離法がある。プロテアーゼ酵素を
発酵ブロスから直接結晶化させることも、あるいは細胞非含有の濾液から結晶化
させることも本発明の範囲内であるが、限外濾過、蒸発、または沈殿等の方法を
使用して、結晶化の前に発酵ブロスまたは細胞非含有濾液をさらに濃縮するのが
好ましい。
【００１７】 酵素の場合、当業界にて従来から知られているように、培地中にある特定の成
分が含まれていると、成分酵素の結晶化が起こりにくくなる。このため、濾過発
酵ブロスをさらに精製して、たとえば濾過ブロスをカラム精製(column purifica
tion)により処理することによって、結晶化を妨げることのある不純物を除去す
るのが有利であることが多い。さらに、微生物が成長する培地を調節することに
よって、このような不純物の量を制限することができる。たとえば、Northrupら
による“Crystalline Enzymes, Columbia University Press, p.254 (1948)”に
記載のように、ムチン様物質(たとえば多糖類)が結晶化プロセスに対して有害と
なることが多い。従って、予備的発酵培地からこのような多糖類成分を除去する
ことによって、あるいは発酵ブロスからこのような成分を精製することによって
、その後の結晶化をうまく果たすことができるようになる。これとは別に、これ
らの物質は、濾液を強酸、水酸化銅、アルコール、またはアセトンで処理するこ
とによって除去することができる。プロテアーゼ含有発酵ブロスを精製する際に
は、結晶化を容易にするために硫酸アルミニウムを使用するのが好ましい。
【００１８】 ある特定のプロテアーゼやグルコースイソメラーゼ等の酵素も含めて、多くの
異なった蛋白質は、異なった温度で異なったモルホロジーを示す。一般には、よ
り低い温度において見られる結晶モルホロジーが好ましいモルホロジーである。
本発明によれば、このファクターを使用して、好ましい結晶モルホロジーを有す
る結晶をより高い結晶化速度にて得ることができる。
【００１９】 好ましい結晶モルホロジーは、結晶が取り扱われるときに簡単には崩壊しない
ようなモルホロジーである。棒状体結晶は、正方形、長方形、または六角形の結
晶に比べて壊れやすい。
【００２０】 以下に実施例を挙げて説明するが、これらの実施例によって本発明が限定され
ることはない。 実施例 実施例1 バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の発酵により誘導される変種プロ
テアーゼの発酵ブロスの限外濾過液濃縮物を含む水溶液を調製した。本発明の目
的に適した変種プロテアーゼの調製法が米国特許第5,185,258号に記載されてい
る。限外濾過は、スパイラル限外濾過装置にて10kDの分子量カットオフを有する
ポリスルホン膜を使用して行った。こうして得られたプロテアーゼ溶液における
活性酵素の濃度は約52g/リットルであった。プロテアーゼの濃度は、Estellらに
よる“J. Biol. Chem. 260: 6518-6521 (1985)”に記載の方法によって決定する
ことができる。このブロスを使用して、以下の全ての結晶化実験を行った。
【００２１】 異なった温度プロフィールを使用する、バチルスから得られる変種プロテアー ゼの結晶化 前述のような、バチルス・サブチリスから誘導される変種プロテアーゼの発酵
ブロスの限外濾過液濃縮物を含む水溶液を、下記のように調製して結晶を得た。
【００２２】 1. 限外濾過液濃縮物を所望の出発温度に平衡化した(表1)。 2. 穏やかに撹拌しながら5%NaClを加えた。 3. 実験2(4時間後に実験#1からサンプル抜き取り、穏やかにミキシングしな
がら22℃でインキュベートした)を除く全ての実験に対して、溶液を指定の温度
らに保持した。
【００２３】 4. サンプルを顕微鏡で調べながら、所定時間にわたって結晶の性質を観察し
た。 5. 上澄み液中に残存している活性物質を所定時間にわたって分析し、結晶化
率(%)を算出した。
【００２４】
【表１】 特定の理論で拘束されるつもりはないけれども、実験2では、初期において低
温であることが正方形の核の形成をもたらしたが、いったん高温に維持されると
、一部の結晶が棒状に成長した、と考えられる。これらのことが組み合わさった
結果、長方形の板状体と幾らかの棒状体が生成した。
【００２５】 本明細書の開示内容を読めば、当業者にとっては、本発明の精神と範囲を逸脱
することなく上記説明および実施例に対する他の種々の変形や改良形が明らかで
あり、従って、このような変形や改良形も全て特許請求の範囲内に含まれる。本
明細書中に引用した全ての出版物および特許の全内容を参照により本明細書に含
める。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、ほぼ室温(22℃)で約19.5時間保持した溶液から結晶化させたときに得
られたプロテアーゼ結晶を示している顕微鏡写真である。
【図２】 図2は、約30℃で約19.5時間保持した溶液から結晶化させたときに得られたプ
ロテアーゼ結晶を示している顕微鏡写真である。
【図３】 図3は、約15℃で約19.5時間保持した溶液から結晶化させたときに得られたプ
ロテアーゼ結晶を示している顕微鏡写真である。
【図４】 図4は、本発明の開示内容に従って得られたプロテアーゼ結晶を示している顕
微鏡写真であり、この場合、約15℃にて約4時間で結晶化を開始させ、次いで温
度が、さらなる18時間で約22℃にシフトするまで結晶化を続けた。相当数の正方
形板状結晶が認められる点に留意のこと。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ， ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 蛋白質を含有する水溶液を調製する工程; (b) 前記水溶液に塩を加えて蛋白質/塩溶液を形成する工程; (c) 前記蛋白質/塩溶液を約4℃〜20℃の温度にて維持する工程; (d) 結晶核を形成させる工程; および (e) 工程(d)の溶液を約22℃〜60℃の温度にて維持して、より速やかな結晶化
    を起こさせる工程; を含む、蛋白質を結晶化させるための方法。
  2. 【請求項２】 工程(e)の後に、所望のモルホロジーを有する蛋白質結晶を
    前記溶液から回収する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記蛋白質が酵素であり、回収された結晶の酵素がその初期
    活性の少なくとも約90%を保持している、請求項2記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記水溶液が、選択された微生物の発酵によって得られる発
    酵ブロスから誘導される、請求項1記載の方法。
  5. 【請求項５】 発酵ブロス中に存在する細胞破片を除去して細胞を含有しな
    い濾液を得る、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記水溶液を結晶化の前に濃縮する、請求項4記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記水溶液が発酵ブロスの限外濾過液濃縮物である、請求項
    4記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記蛋白質が酵素である、請求項1記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記酵素が加水分解酵素である、請求項8記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セル
    ラーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、
    ヘミセルラーゼ、イソメラーゼ、およびこれらの混合物からなる群から選ばれる
    、請求項8記載の方法。
  11. 【請求項１１】 工程(e)の結晶化によって所望のモルホロジーを有する結
    晶が得られ、このとき前記モルホロジーが、正方形、長方形、および六角形から
    なる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
  12. 【請求項１２】 結晶の少なくとも一部が正方形板状体である、請求項11記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 工程(c)において、前記水溶液を約4℃〜20℃の前記温度に
    て約5時間以下にわたって保持する、請求項1記載の方法。
  14. 【請求項１４】 工程(e)において、前記水溶液を約22℃〜60℃の前記温度
    にて約20時間以下にわたって保持する、請求項1記載の方法。
  15. 【請求項１５】 (a) 酵素を含有する溶液を約22℃以下の第1の温度にて維
    持する工程; (b) 前記溶液を前記第1の温度に保持しながら、所望のモルホロジーを有する
    結晶を形成させる工程; および (c) 前記所望のモルホロジーを有する結晶の結晶化速度が増大するよう、工
    程(b)の溶液を前記第1の温度より高い第2の温度にて維持する工程; を含む、酵素を含有する溶液から酵素を結晶化させるための方法。
  16. 【請求項１６】 工程(c)の後に、前記所望のモルホロジーを有する結晶を
    回収する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記溶液中の酵素の少なくとも約90%が、工程(b)の開始後
    の約25時間以内に結晶化される、請求項15記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記第1の温度が20℃未満である、請求項15記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記第2の温度が少なくとも20℃である、請求項17記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 請求項15記載の方法に従って得られる酵素結晶。
JP2000602762A 1999-03-05 2000-03-03 望ましいモルホロジーを有する結晶を速やかに得るための方法 Pending JP2002537804A (ja)

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US60/123,147 1999-03-05
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