JPH0323152B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 バクテリア（bacteria）、カビ（fungi）及び酵
母（yeast）の如き微生物を水性栄養培地中で培
養することによる個々の酵素の製造は周知されて
いる。特定の微生物の性質に依存して、製造され
た酵素は細胞外（extracellular）酵素、細胞内
（intracellular）酵素又はその混合物であること
が出来る。製造された酵素が細胞外酵素である場
合には、先ず酵素含有上澄液を微生物細胞から分
離し、次いで沈澱法、限外ろ過及び蒸発の如き周
知の方法により酵素を上澄液から回収することに
より一般に得られる。製造される酵素が細胞内酵
素である場合には、それらは先ず細胞から放出さ
れなければならない。これは化学的に及び／又は
機械的に行うことができる。一度酵素が溶液中に
入れられると、それらは前記周知の方法により回
収することもできる。

細胞外酵素は細胞内酵素とは異なつた組成及び
性質を有していることが知られている。細胞外酵
素は一般に例えば細胞内酵素よりは相当低い分子
量を有する。細胞から放出された細胞内酵素を含
有する溶液は細胞外酵素を含有する全発酵ビール
（全発酵液）（whole fermentation beer）中に存
在しない相当な量の他の細胞内物質も含有する。
これらの差はそれらが両方とも水性溶液中にある
場合ですらその回収及び精製方法を異ならしめる
ことがある。故に細胞内酵素に適当な回収方法は
必ずしも細胞外酵素にとつて有用ではない。

酵素の製造及び回収の効率及び便利さを改善す
るために、ポリエチレングリコールとデキストラ
ンの混合物を含有する２相栄養培地中での微生物
発酵により酵素を製造することが出来ることが知
られている。発酵の終了時には細胞外酵素は上部
ポリエチレングリコール相に濃縮されており、細
胞及び他の発酵生成物は下部デキストラン相に濃
縮されている。これはエンザイム アンド マイ
クロバイアルテクノロジー、第７巻、7333−338
（1985）［Enzyme and Microb.Technol.
Vol.7333−338（1985）］に記載されている。その
システムにおけるアルフアーアミラーゼの分配係
数は例えば最大４であつた。

上記方法の変法が米国特許第4508825号に記載
されている。それによれば細胞外酵素含有上澄液
は細胞から分離されそして細胞を含まない上澄液
はポリエチレングリコール及びカチオン性エピハ
ロヒドリン／ポリアミン共重合体又はデキストラ
ン重合体と混合させられて２相を形成する。この
方法はプロテアーゼがポリエチレングリコール相
に濃縮されておりそしてアミラーゼがカチオン性
共重合体又はデキストラン相に濃縮されている細
胞外プロテアーゼ及びアミラーゼを分離するのに
使用することが出来る。

２相酵素回収方法は細胞内酵素にも使用され
た。米国特許第4144130号は(1)高分子量の未置換
又は置換されたポリアルコール、ポリエーテル、
ポリエステル、ポリビニルピロリドン又は多糖と
無機塩の混合物又は(2)上記高分子量重合体の少な
くとも２種の混合物を使用して細胞内酵素が細胞
から放出された水性溶液から細胞内酵素を回収す
ることを記載している。例えばポリエチレングリ
コールと無機塩との混合物が使用される場合には
所望の細胞内酵素は上部ポリエチレングリコール
層に行き、細胞砕片（cell debris）及び他の発酵
生成物は下部塩含有層に行く。グリコール層に回
収された種々の酵素の分配係数は全発酵ビールを
処理した場合には約0.3であつた。分配係数は凍
結した細胞を水と混合しそして崩壊させてそれら
の酵素を放出させた場合には約３だけ増加した。

細胞を含まない上澄液からの酵素の沈澱におい
て無機塩を助長するためのポリエチレングリコー
ルの添加は米国特許第4016039号に記載されてい
る。

ポリエチレングリコールと無機塩とを２相法に
使用して少なくとも50の分配係数で全発酵ビール
から細胞外酵素を回収することが出来ることは先
行技術には示唆されたことはない。

本発明によれば、全発酵ブロスから細胞外酵素
を回収する方法において、微生物細胞と細胞外酵
素を含有する全発酵ブロスに、(a)ポリエチレング
リコール、ポリエチレングリコールのアミン誘導
体、ポリエチレングリコールのカルボキシレート
誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピ
レングリコールのアミン誘導体、ポリプロピレン
グリコールのカルボキシレート誘導体、ポリ（エ
チレングリコール）エステル、ポリエチレンイミ
ン、トリメチルアミノーポリエチレングリコー
ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン及びそれらの混合物から成る群から選ばれた重
合体と(b)無機塩との混合物を添加し、この全発酵
ブロスー重合体一塩混合物を酵素に富んだ重合体
相と酵素に乏しい塩相とに分離させ、そして交差
に富んだ生成物を回収することを特徴とする方法
が提供される。

本発明の方法の原料物質として有用な、細胞外
酵素を含有する全発酵ブロスは、当業界において
周知のものである。例えば、バチルス リケニホ
ルミス（ATCC14580；DSM13；NCIB9375；
NCTC10341）、バチルス アミロリクエフアシ
エンス（ATCC23350；DSM7）、バチルス ブブ
チリス（ATCC6051；DSM10；NCIB3610；
NCTC3610）及びムコールミエヘイ（けかび）
は、適当な栄養培地中で増殖させると、プロテア
ーゼ、アミラーゼ及び微生物レンネツトの如き細
胞外酵素を生産することが知られている。得られ
る細胞砕片、細胞外可溶性酵素及び他の発酵生成
物の混合物は可溶性酵素から細胞砕片を更に分離
することなく本発明の方法において使用すること
が出来る。本明細書において使用した“細胞砕
片”という用語は全細胞（whole cells）及び細
胞断片（cell fragments）を意味する。

次いで全発酵ブロスを重合体及び無機塩と混合
して２相系を形成する。所望の細胞外酵素は重合
体相に集まり、細胞砕片は塩相に集まるであろ
う。

適当な重合体にはポリエチレングリコール、ポ
リエチレングリコールのアミン誘導体、ポリエチ
レングリコールのカルボキシレート誘導体、ポリ
プロピレングリコール、ポリプロピレングリコー
ルのアミン誘導体、ポリプロピレングリコールの
カルボキシレート誘導体、ポリ（エチレングリコ
ール）エステル、ポリエチレンイミン、トリメチ
ルアミノーポリエチレングリコール、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン及びそれらの
混合物が包含される。好ましい重合体はポリエチ
レングリコールである。水性の全発酵ブロスに可
溶であるいかなる形態のポリエチレングリコール
も適当である。特に有用なポリエチレングリコー
ルは約3350の分子量を有する。それは室温で固体
でありそして工業生産規模で都合良く取り扱うこ
とができる。

無機塩はそのカチオンがナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム及びアンモニウムでありそして
そのアニオンが硫酸イオン（sulfates）、炭酸イ
オン（carbonates）、クエン酸イオン
（citrates）、塩化物イオン（chlorides）、リン酸
イオン（phosphates）及びそれらの混合物であ
る化合物であることができる。好ましい塩は塩化
ナトリウム及び硫酸ナトリウムである。

重合体及び無機塩は全発酵ブロス64−90％、重
合体１−15％及び無機塩８−35％、但し該百分率
は混合物の全重量を基準として重量によるもので
ある、を含有する全混合物を形成する量で全発酵
ブロスに加えられる。全混合物が全発酵ブロス73
−79％、重合体３−４％及び無機塩15−24％を含
有することが好ましい。

重合体と塩を添加した後２つの相が形成される
であろう。重合体相は普通は塩相の上にあるであ
ろう。２つの相は混合物を約５時間静かに放置す
ることによる沈降により形成することが出来る。
次いで酵素含有重合体相は例えばサイフオンによ
る吸い出し（siphoning）及びデカンテイング
（decanting）の如き標準的な液／液分離法によつ
て分離されて酵素を回収することが出来る。しか
しながら、相を分離するには遠心分離を使用する
のが好ましい。有用な分離装置は連続式固体ボー
ル遠心分離機（solid−bowl centrifuge）であ
る。最終の分離された重合体相の酵素の望ましい
濃度を達成するためには、酵素に富んだ重合体相
対酵素に乏しい塩相の容量比は0.12乃至0.15であ
ることが好ましい。

細胞外酵素を最も有効に回収するためには、重
合体相の何も捨てられるべき塩相に同伴されない
ように遠心分離機を操作するべきである。得られ
る集められた重合体相はその中に混合した幾らか
の同伴された塩相を有していてもよい。次いで混
合物は第２次遠心分離に付される。第２次遠心分
離においては遠心分離機は重合体相の何も塩相に
同伴されずしかも少量の塩相しか重合体相に同伴
されないように操作される。

そのように集められた酵素に富んだ重合体相は
酵素源として直接に使用することが出来る。ポリ
エチレングリコール相に回収されたアルカリ性プ
ロテアーゼは例えば酵素洗剤配合物に適してい
る。このグリコールは酵素の安定剤として有用で
ある。所望により、酵素は例えば沈澱、限外ろ過
又は蒸発の如き周知の方法により重合体から分離
させて実質的に重合体を含まない酵素生成物を生
成することができる。

本発明の他の好ましい態様においては、全発酵
ブロスは塩化カルシウム二水塩1.5−5.0％、第一
リン酸ナトリウム又は第一リン酸カリウム0.1−
1.2％及び水酸化カルシウム０−0.6％の混合物、
但し該百分率は発酵ビールの容量に対する添加物
の重量で計算した重量／容量基準による、で予備
処理される。この予備処理工程は細胞破片を凝集
させるのを助けそして重合体と無機塩をその後に
加えるとき細胞破片からの酵素の分離を改良す
る。好ましくは、プロテアーゼが回収される場合
には予備処理工程には塩化カルシウム二水塩1.5
−5.0％、及び第一リン酸ナトリウム又は第一リ
ン酸カリウム0.2−1.2％を使用するべきである。
アミラーゼが回収される場合には、予備処理工程
には塩化カルシウム二水塩1.5−5.0％、第一リン
酸ナトリウム又は第一リン酸カリウム0.1−1.0％
及び水酸化カルシウム0.1−0.6％を使用するべき
である。

分配係数は分離の有効性の目安として当業界で
は知られている。それは下部又は無機塩相中の酵
素活性濃度で割つた上部又は重合体相中の酵素活
性濃度として表される。各相の酵素活性は周知の
方法により測定することが出来る。本発明の方法
は公知の先行技術に対して十分な進歩を示す少な
くとも50の分配係数を達成することが出来る。

本発明を下記の実施例により更に説明する。

実施例 １ 6000ガロン（22712l）の発酵槽に下記の成分を
与えることによつてアルカリ性プロテアーゼの生
産に適した栄養培地を調整した： コムギグルテン 1500lb（681Kg） クエン酸ナトリウム 165lb（74.9Kg） 塩化カルシウム二水塩 165lb（74.9Kg） トウモロコシデンプン 5000lb（2270Kg） 大豆粉（Soy Meal） 2500lb（1135Kg） 熱安定性アルフアアミラーゼ 5lb（2.27Kg） 第一リン酸ナトリウム 400lb（181.6Kg） 第二リン酸ナトリウム 400lb（181.6Kg） 発泡防止剤 16.5ガロン（62.5l） 水を加えた合計 6000ガロン（22712l） 次いでこの培地にバチルスリケニフオルミスの
生きている細胞を接種しそして36℃で36時間発酵
させた。得られる全発酵ブロスに70％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム二水塩水溶液214ガロン（811l）
及び第一リン酸ナトリウム300lb（136Kg）を加え
た。これにより各添加剤の重量及び発酵ビールの
容量を基準として塩化カルシウム二水塩2.5％
（ｗ／ｖ）及び第一リン酸ナトリウム0.6％（ｗ／
ｖ）を含有する混合物が得られる。添加物におい
て水酸化ナトリウムの添加により混合しながら混
合物のPHを6.8−7.6に保持した。混合が終了した
後水酸化ナトリウムの添加によりPHを7.4−7.5調
節して凝集を達成した。次いで50重量％水性酢酸
溶液の添加によりPHを6.4−6.6に調節した。得ら
れる混合物に25−27℃で塩化ナトリウム11600lb
（5260Kg）を加えそして混合物を１時間撹拌して
総ての塩化ナトリウムを溶解した。次いで3350の
分子量を有するポリエチレングリコール3100lb
（1400Kg）及び硫酸ナトリウム4250lb（1930Kg）を
加えそして全ブロス温度を30−30℃に上昇させ
た。全ビールのPHは酢酸溶液の添加により6.0−
6.2に調節しそして全混合物を２時間撹拌した。
全混合物は塩化ナトリウム15％（ｗ／ｗ）、ポリ
エチレングリコール４％（ｗ／ｗ）、硫酸ナトリ
ウム5.5％（ｗ／ｗ）及び全発酵ブロス75.5％
（ｗ／ｗ）を含有していた。この百分率は発酵ビ
ールと添加剤の全混合物重量に対する添加剤の重
量で計算された。混合の後全混合物を上部ポリエ
チレングリコール相と下部の塩化ナトリウム−硫
酸ナトリウム−細胞破片相に分離した。上相容量
対下相容量の相比は0.15であつた。下相のプロテ
アーゼ活性の濃度で割つた上相のプロテアーゼ活
性の濃度は60−80の分配係数をもたらした。次い
で連続式固体ボール遠心分離機を使用して２つの
相を分離した。遠心分離機はポリエチレングリコ
ール相が捨てられる塩相に同伴されないように第
１次分離がなされるように調節された。グリコー
ル相は発酵ブロスの全酵素活性の90−92％を含有
していた。このグリコール相は約５−20容量％の
塩相同伴物も含んでいた。次いで上記の如く集め
られたグリコール相は、グリコール相に２容量％
より少ない塩相の同伴を許容するように設定され
た同様な装置を使用して第２次分離に付された。
塩相を捨てそしてそれはグリコール相の何も含ん
でいなかつた。次いで上記の如くして集められた
グリコール相を10℃の冷却したタンクに入れて痕
跡量の硫酸ナトリウムを除去した。少量の硫酸ナ
トリウム結晶を加えて硫酸ナトリウム結晶の成長
を誘発した。10℃で２時間穏やかに撹拌した後硫
酸ナトリウムを含まないグリコール相を排出させ
た。次いでそれを活性炭及びろ過助剤と混合しそ
してフイルタープレスを使用してろ過した。得ら
れるアルカリ性プロテアーゼに富んだグリコール
溶液は液体酵素洗剤配合物に直接使用するとが出
来る。

実施例 ２ 実施例１の方法を塩化カルシウム二水塩及び第
−リン酸ナトリウムを添加する工程を通して繰返
した。次いで得られる全発酵ブロス−添加剤混合
物を3350の分子量を有するポリエチレングリコー
ル2130lb（970Kg）及び硫酸ナトリウム10660lb
（4850Kg）と混合しそして全ブロス温度を30−32
℃に上昇させた。次いで、ポリエチレングリコー
ル３％（ｗ／ｗ）、硫酸ナトリウム15％（ｗ／ｗ）
及び全発酵ビール82％（ｗ／ｗ）を含有する全混
合物を１時間撹拌した。混合の後全混合物を上部
ポリエチレングリコール相と下部の硫酸ナトリウ
ム−細胞破片相に分離した。上相容量対下言容量
の相比は0.12であつた。下相のプロテアーゼ活性
の濃度で割つた上相のプロテアーゼ活性の濃度は
60−80の分配係数をもたらした。グリコール相の
アルカリ性プロテアーゼは無定形固体の形態にあ
つた。次いで実施例１に記載の如き遠心分離機を
使用して２つの相を分離して無定形固体プロテア
ーゼと２容量％より少ない塩相の同伴物とを含有
するグリコール相を生成させた。次いで固体を遠
心分離により回収し、そしてそれらは粒状酵素洗
剤製品の粒状プロテアーゼとして使用することが
できる。

実施例 ３ 6000ガロン（22712l）の発酵槽に下記の成分を
加えることによつて熱安定性アルフアミラーゼの
生産に適した栄養培地を調整した： 塩化カルシウム二水塩 22.5lb（10.2Kg） 第一リン酸カリウム 300lb（136.2Kg） 第二リン酸カリウム 700lb（317.8Kg） 硫酸アンモニウム 250lb（113.5Kg） クエン酸ナトリウム 100lb（45.4Kg） （トウモロコシ浸漬液） 1000lb（454Kg） ラクトース 7000lb（3178Kg） （綿実粉） 1500lb（681Kg） 大豆粉 2000lb（908Kg） 発泡防止剤 165ガロン（625l） 水を加えた全量 6000ガロン（22712l） 次いでこの培地にバチルス リケニフオルミス
の生きている細胞を接種しそして水酸化ナトリウ
ムの周期的添加によつてPHを7.05−7.15に保持し
ながら40℃で108−110時間発酵させた。得られる
全発酵ブロスに70％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム二
水塩水溶液343ガロン（1300l）、10％（ｗ／ｖ）
水酸化カルシウム水溶液240ガロン（980l）及び
第一リン酸カリウム60lb（27Kg）を加えた。これ
により各添加剤の重量及び発酵ブロスの容量を基
準として塩化カルシウム二水塩４％（ｗ／ｖ）、
水酸化カルシウム0.4％（ｗ／ｖ）及び第一リン
酸カリウム0.12％（ｗ／ｖ）を含有する混合物が
得られる。添加物において水酸化ナトリウムの添
加により混合しながら混合物のPHを7.6−8.4に保
持した。混合が終了した後水酸化ナトリウムの添
加によりPHを8.4−8.6に調節した。得られる混合
物に3350の分子量を有するポリエチレングリコー
ル2600lb（1180Kg）及び塩化ナトリウム7420lb
（3370Kg）を25−27℃で加え混合物を少なくとも
１時間撹拌した。次いで5940lb（2700Kg）の量の
硫酸ナトリウムを加え、発酵ブロス混合物を30−
32℃に加熱した。PHを水酸化ナトリウムの添加に
より7.9−8.1に調節しそして全混合物を少なくと
も２時間撹拌した。全混合物は塩化ナトリウム10
％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール3.5％
（ｗ／ｗ）、硫酸ナトリウム８％（ｗ／ｗ）及び全
発酵ビール78.5％（ｗ／ｗ）を含有していた。混
合の後全混合物を上部ポリエチレングリコール相
と下部の塩化ナトリウム一硫酸ナトリウム−細胞
破片相に分離した。上相容量対下相容量の相比は
0.12であつた。下相のアミラーゼ活性の濃度で割
つた上相のアミラーゼ活性の濃度は50−70の分配
係数をもたらした。次いで連続式固体ボール遠心
分離機を実施例１に記載の如く使用してアミラー
ゼに富んだグリコール相を回収し、次いでこれを
実施例１に記載の如くして精製してアミラーゼに
富んだグリコール生成物を生成した。

実施例 ４ 6000ガロン（22712l）の発酵槽に下記の成分を
加えることによつてアルフアミラーゼの生産に適
した栄養培地を調整した： 炭酸カルシウム 530lb（240.6Kg） 魚 粉 750lb（340.5Kg） （粉砕大豆粉） 2800lb（1271Kg） トウモロコシ浸漬液 1500lb（681Kg） ラクトース 7000lb（3178Kg） 第二リン酸アンモニウム 130lb（59Kg） 発泡防止剤 40ガロン（151.4l） 水を加えた全量 6000ガロン（22712l） 次いでこの培地にバチルス アミロリクエフア
シエンスの生きている細胞を接種しそして水酸化
ナトリウムの周期的添加によりPHを7.05−7.15に
保持しながら34℃で60時間発酵させた。得られる
全発酵ブロスに70％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム二
水塩水溶液257ガロン（973l）、10％（ｗ／ｖ）水
酸化カルシウム水溶液180ガロン（681l）及び第
一リン酸カリウム300lb（136Kg）を加えた。これ
により各添加剤の重量及び発酵ブロスの容量を基
準として塩化カルシウム二水塩３％（ｗ／ｖ）、
水酸化カルシウム0.3％（ｗ／ｖ）及び第一リン
酸カリウム0.6％（ｗ／ｖ）を含有する混合物が
得られる。添加物において水酸化ナトリウムの添
加により混合しながら混合物のPHを6.8−7.6に保
持した。混合が終了した後水酸化ナトリウムの添
加によりPHを7.4−7.6調節した。得られる混合物
に3350の分子量を有するポリエチレングリコール
2510lb（1140Kg）及び塩化ナトリウム7960lb（3600
Kg）を25−27℃で加えそして混合物を少なくとも
１時間撹拌した。次いで10700lb（4870Kg）の量の
硫酸ナトリウムを加え、そして発酵ブロス混合物
を30−32℃に加熱した。PHを水酸化ナトリウムの
添加により7.4−7.6に調節しそして全混合物を少
なくとも２時間撹拌した。全混合物は塩化ナトリ
ウム10％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール
3.15％（ｗ／ｗ）、硫酸ナトリウム13.5％（ｗ／
ｗ）及び全発酵ビール73.35％（ｗ／ｗ）を含有
していた。混合の後全混合物を相比0.12及び分配
係数50−70を有する実施例３に記載の如き２相に
分離した。相を実施例３に記載の如く処理してア
ミラーゼに富んだグリコール生成物を生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 全発酵ブロスから細胞外酵素を回収する方法
   において、微生物細胞と細胞外酵素を含有する全
   発酵ブロスに、(a)ポリエチレングリコール、ポリ
   エチレングリコールのアミン誘導体、ポリエチレ
   ングリコールのカルボキシレート誘導体、ポリプ
   ロピレングリコール、ポリプロピレングリコール
   のアミン誘導体、ポリプロピレングリコールのカ
   ルボキシレート誘導体、ポリ（エチレングリコー
   ル）エステル、ポリエチレンイミン、トリメチル
   アミノ−ポリエチレングリコール、ポリビニルア
   ルコール、ポリビニルピロリドン及びそれらの混
   合物から成る群から選ばれた重合体と(b)無機塩と
   の混合物を添加し、この全発酵ブロスー重合体一
   塩混合物を酵素に富んだ重合体相と酵素に乏しい
   塩相とに分離させ、そして酵素に富んだ生成物を
   回収することを特徴とする方法。 ２ 無機塩は、そのカチオンがナトリウム、カリ
   ウム、マグネシウム及びアンモニウムであり、そ
   してそのアニオンが硫酸イオン、炭酸イオン、ク
   エン酸イオン、塩化物イオン、リン酸イオン及び
   それらの混合物である化合物の群から選ばれたも
   のである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 全発酵ブロス、重合体及び無機塩の全混合物
   が、全発酵ブロス64−90％、重合体１−15％及び
   無機塩８−35％を含有し、ここに百分率は混合物
   の全重量を基準とした重量によるものである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 全発酵ブロス、重合体及び無機塩の全混合物
   が、全発酵ブロス73−79％、重合体３−４％及び
   無機塩15−24％を含有し、ここに百分率は混合物
   の全重量を基準とした重量によるものである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 重合体がポリエチレングリコールであり、そ
   して該無機塩が塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウ
   ムの混合物である特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ６ 重合体がポリエチレングリコールであり、そ
   して塩が硫酸ナトリウムである特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ７ 重合体が約3350の分子量を有するポリエチレ
   ングリコールである特許請求の範囲第４項記載の
   方法。 ８ 重合体と無機塩との混合物を加える前に塩化
   カルシウム二水塩1.5−5.0％、第一リン酸ナトリ
   ウム又は第一リン酸カリウム0.1−1.2％及び水酸
   化カルシウム０−0.6％の混合物、ここに該百分
   率は発酵ブロスの容量に対する添加剤の重量に基
   づいて計算した重量／容量基準である、と接触さ
   せる特許請求の範囲第４項記載の方法。 ９ 全発酵ブロスを塩化カルシウム二水塩1.5−
   5.0％と第一リン酸ナトリウム又は第一リン酸カ
   リウム0.2−1.2％の混合物と接触させる特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０ 全発酵ブロスを塩化カルシウム二水塩1.5
   −5.0％、水酸化カルシウム0.1−0.6％及び第一リ
   ン酸ナトリウム又は第一リン酸カリウム0.1−1.0
   ％の混合物と接触させる特許請求の範囲第８項記
   載の方法。 １１ 酵素に富んだ重合体相対酵素に乏しい塩相
   の容量比が0.12−0.15である特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 １２ 得られる相を連続式固体ボール遠心分離に
   より分離する特許請求の範囲第４項記載の方法。 １３ 適当な栄養培地中でバチルス リケニホル
   ミスの適当な菌株を発酵させて得られたバチルス
   リケニホルミス細胞と細胞外アルカリ性プロテ
   アーゼを含有する全発酵ブロスに塩化カルシウム
   二水塩2.5％及び第一リン酸ナトリウム又は第一
   リン酸カリウム0.6％、ここに百分率は発酵ブロ
   スの容量に対する添加剤の重量に基づいて計算し
   た重量／容量％である、を加え、ついで上記混合
   物にポリエチレングリコール３％及び硫酸ナトリ
   ウム15％、ここに百分率は発酵ブロス及び添加剤
   の全混合物重量を基準とした重量によるものであ
   る、を加えてアルカリ性プロテアーゼに富んだポ
   リエチレングリコール相及びアルカリ性プロテア
   ーゼに乏しい硫酸ナトリウム相を形成させ、そし
   てこの２つの相を分離してアルカリ性プロテアー
   ゼに富んだ生成物を回収することからなる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １４ 全発酵ブロスに塩化カルシウム二水塩及び
   第一リン酸ナトリウム又は第一リン酸カリウムを
   添加した後、混合物を塩化ナトリウム15％、ポリ
   エチレングリコール４％及び硫酸ナトリウム5.5
   ％、百分率は発酵ブロス及び添加剤の全混合物重
   量を基準とした重量によるものである、と接触さ
   せる特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ 適当な栄養培地中でバチルス リケニホル
   ミスの適当な菌株を発酵させて得られたバチルス
   リケニホルミス細胞と細胞外アルフアミラーゼ
   を含有する全発酵ブロスに水酸化カルシウム0.4
   ％及び第一リン酸ナトリウム又は第一リン酸カリ
   ウム0.12％、ここに百分率は発酵ブロスの容量に
   対する添加剤の重量に基づいて計算した重量／容
   量％である、を加え、ついで上記混合物にポリエ
   チレングリコール3.5％、塩化ナトリウム10％及
   び硫酸ナトリウム８％、ここに百分率は発酵ブロ
   ス及び添加剤の全混合物重量を基準とした重量に
   よるものである、を加えて、ミラーゼに富んだポ
   リエチレングリコール相及びアミラーゼに乏しい
   硫酸ナトリウム−硫酸ナトリウム相を形成させ、
   そしてこの２つの相を分離してアルカリ性プロテ
   アーゼに富んだ生成物を回収することからなる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １６ 適当な栄養培地中でバチルス アミロリク
   エフアシエンスの適当な菌株を発酵させて得られ
   たバチルス アミロリクエフアシエンス細胞と細
   胞外アルフアアミラーゼを含有する全発酵ブロス
   に塩化カルシウム二水塩３％、水酸化カルシウム
   0.3％及び第一リン酸ナトリウム又は第一リン酸
   カリウム0.6％、ここに百分率は発酵ブロスの容
   量に対する添加剤の重量に基づいて計算した重
   量／容量％である、を加え、ついで上記混合物に
   ポリエチレングリコール3.15％、塩化ナトリウム
   10％及び硫酸ナトリウム13.5％、ここに百分率は
   発酵ブロス及び添加剤の全混合物重量を基準とし
   た重量によるものである、を加えてアミラーゼに
   富んだポリエチレングリコール相及びアミラーゼ
   に乏しい塩化ナトリウム−硫酸ナトリウム相を形
   成させ、そしてこの２つの相を分離してアミラー
   ゼに富んだ生成物を回収することからなる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。