JP2002534975A

JP2002534975A - 高ｐＨにおいてのタンパク質の回収

Info

Publication number: JP2002534975A
Application number: JP2000594910A
Authority: JP
Inventors: アーイェラウストセン，マッズ; マシューシンプソン，クラーン; ヨーンオレイリュー，ミヒャエル
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2002-10-22
Also published as: DE60027406T2; US6316240B1; EP1149160A1; EP1149160B1; DE60027406D1; AU2093100A; ATE323759T1; CN1181197C; WO2000043502A1; DK1149160T3; CN1337999A

Abstract

(57)【要約】本発明は培養溶液からグリコシダーゼ又はペプチダーゼを、前記溶液内の非可溶化状態から前記溶液内の可溶化状態で回収するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は培養溶液からグリコシダーゼ又はペプチダーゼを、前記溶液内の非可
溶化状態から前記溶液内の可溶化状態で回収するための方法に関連する。

【０００２】背景技術培養溶液からの注目のタンパク質の回収は、有意な量の注目のタンパク質が可
溶化状態になっていることが障害となりうる。

【０００３】かかる問題は、例えば注目のタンパク質がスラッジ内の成分にそのまま結合し
ているか、又は有意な量の注目のタンパク質がその培養溶液からの回収の前に沈
殿もしくは結晶化していることにより、起こりうる。

【０００４】注目のタンパク質のスラッジ結合は、そのタンパク質が培養培地中の固形分、
例えば細胞固形分又は培地中のその他の固形成分と結合していることを意味する
。

【０００５】タンパク質の効率的な回収に関し、これは大きな問題となりうる。かかる問題を解決又は小さくするために様々な方法が適用されている。

【０００６】たいていの場合は低いもしくは可変的な回収率が許容され、その他の場合はこ
の問題は例えばイオン／非イオン界面活性剤、塩、消泡剤／脱泡剤、アルコール
、注目の酵素の基質又は基質類似体の添加を通じて軽減されている。

【０００７】たいていの場合はかかる技術は効率が低く、その他の場合は大量の試薬の添加
を要する複雑な手順が開発されている（例えば、液−液分離システム）。

【０００８】いくつかの例がリパーゼの回収において見い出せる。その酵素は発酵固形分及
び／又は回収において利用される潜在的なフィルター助材に極めて結合し易いも
のである。

【０００９】ＷＯ９７／２３６０４号には発酵ブロスからのリパーゼの回収のための方法
が記載されている。

【００１０】この記載の方法における必須の工程は非イオン界面活性剤及びアルコールの双
方の利用を含んで成り、かくして獲得できる最終組成物は微生物タンパク質（好
ましくはリパーゼ）、この非イオン界面活性剤及びこのアルコールを含んで成る
。例えばこのＷＯ９７／２３０６４の書類の請求項１を参照されたい。

【００１１】ＥＰ０５７４０５０Ａ１には発酵ブロスからの疎水性産物、好ましくは親
油性酵素の回収のための方法が記載されている（第３欄、第４７〜５０行参照の
こと）。この記載の方法における必須の工程はその工程における非イオン界面活
性剤及び塩の双方の使用を含んで成る。例えば、請求項１を参照されたい。

【００１２】 Journal of Biotechnology, 26 (1992) 111-142 はリパーゼの様々な精製戦略
についての当業界発表の参考文献である。第１２９頁には、リパーゼ精製が一般
にリパーゼの可溶化の問題によりしにくくなっていると述べている。この文献は
この問題を解決するための当業界の技術をまとめており、それは極めて複雑な精
製戦略、例えば液−液抽出、水性二相システム、特殊な膜処理、及び免疫沈殿を
含んで成る。

【００１３】ブロスの回収前に沈殿又は結晶化するタンパク質については、実際に効率的な
方法は今日存在していない。大量の可溶化剤による可溶化の例が典型的に試みら
れている（例えば尿素）。その他の例は固体−固体分離技術であり、それにおい
ては注目の沈殿又は結晶化タンパク質をブロス内のその他の固形分から分離させ
ている。かかる分離は往々にして不可能であり、また常に複雑である。

【００１４】発明の概要本発明により解決される課題は、有意な量の注目のグリコシダーゼ又はペプチ
ダーゼが培養溶液内で可溶化状態になっていない場合において、培養培地からグ
リコシダーゼ又はペプチダーゼを回収するための簡易且つ効率的な方法の提供に
ある。

【００１５】この解決手段は、有意な量の注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼがpH７．
５において当該培養溶液内で可溶化状態になっていない培養溶液内の注目のグリ
コシダーゼ又はペプチダーゼが極端なpH、即ち、pH９．５乃至pH１３のpH値の利
用により極めて効率的に回収できるという本発明者の同定に基づく。

【００１６】従って、本発明はグリコシダーゼ又はペプチダーゼを産生することができる細
胞を含んで成る培養溶液からグリコシダーゼ又はペプチダーゼを回収するための
方法に関連し、ここで当該注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼの８０％未満
はpH７．５において当該培養溶液内で可溶化状態にあり、ここで当該方法は：ａ）当該注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼを当該溶液のpHのpH９．５乃
至pH１３のpH値への調整により可溶化させ；そしてｂ）当該可溶化グリコシダーゼ又はペプチダーゼを当該細胞から回収し、そし
て当該注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼを含んで成る溶液を獲得する；ことを含んで成る。

【００１７】「培養溶液」とは、本明細書では注目のタンパク質とこの注目のタンパク質を
産生できる細胞とを含んで成る溶液を意味する。この培養溶液は任意の更なる成
分、特に細胞の発酵のために汎用の成分を含んで成りうる。本発明に従うと、こ
の培養溶液は好ましくは培養ブロスであろう。

【００１８】「ここで当該注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼの８０％未満はpH７．５
において当該培養溶液内で可溶化状態にあり」とは、ここで解決すべき一般的課
題に関連し、即ち、有意な量の注目のタンパク質が溶液となっていない注目のタ
ンパク質を回収することに関連する。

【００１９】「培養溶液」がこの基準を満たしているか否かは、この培養溶液の上清液内の
注目のタンパク質の濃度が、そのままで培養溶液内の注目のタンパク質の総濃度
の８０％未満の濃度であるかにより規定される。上清液は例えば細胞を除去する
のに十分な条件下で遠心分離により獲得される水性媒体をいう。

【００２０】濃度とは、リッター当りのタンパク質の量（乾燥質量）（例えばｇ／ｌ）又は
リッター当りのタンパク質の活性をいう。「pH７．５において」とは、本明細書では上清液が（好ましくは遠心分離によ
り）培養溶液からそのままpH７．５で分離されることを意味する。

【００２１】上清液及び培養溶液のそれぞれの中の注目のタンパク質の濃度は後にこのpH又
は別のpHでそのまま測定されうる。

【００２２】このことは注目の特定のタンパク質及び特定の培養溶液に依存し、そしてこれ
を決定する当業者の一般常識の範囲内であろう（このことについては更に説明す
る）。

【００２３】他方、「培養溶液」は次の基準を満たしているものでもよい： Prot._conc,sup./Prot._conc.Cul-sol×１００＜８０（pH７．５にて）；ここでProt._conc,sup.は培養溶液の上清液内の注目のタンパク質の濃度であり； Prot._conc.Cul-solは培養溶液そのままの中の注目のタンパク質の総濃度であ
る。

【００２４】好ましくは、この上清液内の注目のタンパク質の濃度は、全培養溶液そのまま
の中のタンパク質の濃度の７０％未満；より好ましくは５５％未満、更により好
ましくは４０％未満、そして最も好ましくは２５％未満である。

【００２５】注目のタンパク質の濃度を測定するための実際の方法は当業界に公知の標準的
な方法に従い、注目の特定のタンパク質に対して調整して実施する。

【００２６】この酵素の濃度を培養溶液の中でそのまま測定する場合、利用する方法はむろ
ん注目のタンパク質の不溶性画分を前記培養溶液内の注目のタンパク質の濃度の
実際の測定の前に可溶化する方法であろう。

【００２７】莫大な数のかかる方法、例えば高希釈率、ディタージェント、尿素等の添加を
利用する方法を含んで成る疎水性又は沈殿タンパク質を精製する方法が当業界に
おいて公知である。

【００２８】上記の基準に従って特定の方法を選定することは当業者の一般常識の範囲内に
ある。

【００２９】尚、ＷＯ９７／２０９２１号に開示のどの培養溶液もこの基準を満たしてい
ないことに注目すべきであり、なぜならその開示内容の課題は溶液となっていな
いタンパク質を回収する課題とは何ら関係がないからである。

【００３０】従って、ＷＯ９７／２０９２１の書類において開示されている特定の培養溶
液は全て、培養溶液の上清液中の注目のタンパク質が、培養溶液中の注目のタン
パク質のそのままの総濃度の８０％超の濃度を有する培養溶液である。

【００３１】この方法の長所は、本明細書に記載の通り、pHのpH９．５乃至pH１３の調整が
注目のタンパク質の可溶化を直接媒介する点にある。

【００３２】従って、固形分（例えば細胞）はこの固形分を遠心沈降させ、そしてその上清
液を回収するだけで注目のタンパク質から分離させることができうる。本明細書
に記載の方法はこれを、ＷＯ９７／２３６０４及びＥＰ０５７４０５０Ａ
１に記載の従来の方法における本質的な工程として記載されているイオン／非イ
オン界面活性剤、塩、消泡剤／脱泡剤及び特殊なアルコールの如き化合物を添加
することなく実施することを可能にする。

【００３３】更に、この方法は本発明の実施例１により示す通り、注目のタンパク質の非常
に高い最終収量を供する。

【００３４】本発明の態様を以下に示す。

【００３５】発明の詳細な説明グリコシダーゼ又はペプチダーゼを産生することができる細胞を含んで成る培
養溶液。ここで、当該注目のタンパク質の８０％超はpH７．５において当該培養
溶液内で可溶化状態になっていない（非可溶化状態）：

【００３６】上述の背景の章で説明した通り、注目のタンパク質は、例えばこの注目のタン
パク質がスラッジ内の成分に結合しているため及び／又は有意な量のこの注目の
タンパク質が培養溶液から回収する前に沈殿もしくは結晶化されることを理由に
培養溶液内で可溶化状態になっていないことがある。

【００３７】注目のタンパク質のスラッジ結合は、このタンパク質が培養溶液内の固形分、
例えば細胞固形分又は溶液内のその他の固形成分に結合しることを意味する。

【００３８】従って、本発明の好適な態様は、注目のタンパク質の２０％超がpH７．５において当該培養溶液内で可溶化状態
にないものが培養溶液内の固形分、例えば細胞固形分もしくは溶液内のその他の
固形成分に結合している方法；又は注目のタンパク質の２０％超がpH７．５において当該培養溶液内で可溶化状態
になっていないものが当該培養溶液内で沈殿もしくは結晶化している方法；に関連する。

【００３９】培養溶液は一般に発酵バッチに由来する。

【００４０】どのようにして実際の発酵を実施するかは本発明の回収方法にとっては比較的
本質的なものではない。

【００４１】従って、発酵時間、pH又はその他の特定の発酵条件は当業界公知の標準の条件
に従って実施してよい。好ましくは、発酵条件は注目のタンパク質の最大収率を
獲得するために調整する。

【００４２】更に、培養溶液は培養溶液の遠心沈降（遠心分離）画分であってよい。

【００４３】「培養溶液の遠心沈降画分」とは、培養溶液を遠心沈降した画分、例えば細胞
、不溶性基質及び不溶性発酵産物を意味する。この不溶性発酵産物は注目の不溶
性タンパク質を含んで成りうる。

【００４４】従って、更なる態様において、本発明は培養溶液が培養溶液の遠心沈降画分で
ある本発明の方法に関連する。

【００４５】培養溶液のこの遠心沈降した画分は、注目のタンパク質を本明細書記載の方法
に従って回収する前に水の如き水性溶液に懸濁又は希釈してよい。この懸濁又は
希釈は当業者の一般常識に従って実施されうる。

【００４６】更に、不溶性タンパク質の可溶化を媒介することで当業者に公知の任意の更な
る薬剤又は成分をこの培養溶液に更に添加してよい。かかる成分は注目のタンパ
ク質の沈殿又は結晶化への対抗を確実にする成分であってよい。

【００４７】かかる成分の例は塩、カルシウム、ポリオール、ディタージェント、脱泡剤、
消泡剤、又は注目のタンパク質の基質類似体／阻害剤である。かかる適当な成分
の更なる説明についてはＷＯ９７／２３６０４；ＥＰ０５７４０５０Ａ１
又はJournal of Biotechnology, 26 (1992) を参照のこと。

【００４８】更に、本明細書に記載の培養溶液は好ましくは化学規定培地を含んで成る溶液
である。化学規定培地から本質的に成るかかる培養溶液の更なる説明については
ＷＯ９８／３７１７９を参照のこと。

【００４９】pHの調整：当該培養溶液のpHは当業者公知の任意の適当な戦略を利用することにより調整
できうる。

【００５０】例えば、この任意の適当な塩基はpHの調整に利用できうる。好適な塩基は水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム、特に水酸化ナトリウム
である。

【００５１】本発明の工程ａ）に従うと、好ましくはこの培養溶液のpHはpH９．７５乃至pH
１３のpH値；より好ましくはpH１０乃至pH１３のpH値；更により好ましくはpH１
０．２５乃至pH１３のpH値；そして最も好ましくはpH１０．５乃至pH１３のpH値
に調整する。

【００５２】前述の通り、培養溶液は発酵バッチ由来の培養溶液であってよい。

【００５３】従って、pH調整は本発明の第一の観点の工程ａ）において特定するpH値を有す
る発酵バッチを供する発酵の最中に既に実施されていることがある。pHの調整を
いつ、そしてどのようにして行うかは本明細書記載の方法ではさほど重要でない
。重要なことは、この培養溶液が本明細書において特定する範囲内のpH値を有す
ることにある。

【００５４】本発明において記載の通りに調整されたpHは好ましくは注目のタンパク質の特
異的な特徴、特にこのタンパク質の安定特性に従って、この回収工程の際に維持
されるべきであろう。

【００５５】換言すれば、もし注目のタンパク質が高いpHにおいて比較的不安定なら、まず
本明細書に記載の通りにpHを調整してタンパク質を可溶化させ；しかる後に本発
明の第一の観点の項目ｂ）に従ってこの可溶化タンパク質の比較的迅速な回収を
行い；次いでその後すぐにそのpHを当該タンパク質が経時的に比較的安定なレベ
ルへと調整するか、又はそうでなければまずそのpHを高いpHに調整し、次いでそ
のタンパク質の可溶化の直後にpHをその分離の前に低めのpHに調整する。

【００５６】一方、もし注目のタンパク質が高いpHにおいて比較的安定であるなら、本発明
の第一の観点の項目ａ）のもとで記載の通りに調整したpHレベルを比較的長時間
にわたり維持しておいてよい。

【００５７】この特定の時間を最適化することは当業者の一般常識の範囲内にある。この調
整されたpHレベルは回収すべき注目のタンパク質の特異的な特徴との関連で維持
されるべきである。

【００５８】更に、本発明において解決すべき一般課題、即ち、有意な量の注目のタンパク
質が溶液となっていない注目のタンパク質を回収することは、注目のタンパク質
が比較的高収量で発現されるときに最も強調される。

【００５９】従って、本発明の好適な態様は、注目のタンパク質が２ｇのタンパク質（乾燥
質量）／kg培養培地以上の量；好ましくは３ｇのタンパク質（乾燥質量）／kg
培養培地以上の量；より好ましくは５ｇのタンパク質（乾燥質量）／kg培養培地
以上の量；そして最も好ましくは１０ｇのタンパク質（乾燥質量）／kg培養培地
以上の量で発現される培養溶液である。

【００６０】注目のタンパク質を産生できる細胞：注目のタンパク質を産生することができる細胞は原理的には任意の細胞、例え
ば微生物細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であってよい。

【００６１】好ましくは、かかる細胞は微生物細胞、そして特に細菌細胞又は真菌細胞であ
る。本発明は細菌細胞に特に適合する。

【００６２】細菌細胞は好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、そして真菌細胞は
好ましくは糸状菌細胞、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又は
フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）糸状菌細胞である。

【００６３】凝集剤の利用：好ましくは、本発明の工程ａ）における培養溶液は１又は複数種の凝集剤で更
に処理する。

【００６４】この凝集剤は実際のpH調整の前、最中又は後に培養溶液及び／又は発酵バッチ
／ブロスに添加してよい。

【００６５】凝集剤は当業界において公知であり、そして遠心分離、濾過又は膜濃縮／濾過
に特によく適合するタンパク質溶液（例えば、注目のタンパク質を産生する細胞
を含んで成る本明細書において規定する培養溶液）を供与するのに特に使用され
、なぜならタンパク質の線束（ｆｌｕｘ）及び純度が向上するからである。

【００６６】好ましくは、この凝集剤は可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物である。

【００６７】かかる可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物の凝集剤としての利用はＷＯ９６／
３８４６９から公知となっている。

【００６８】しかしながら、ＷＯ９６／３８４６９の第７頁、第１３〜１４行の開示内容
において、「発酵ブロスのpHはpH４〜pH９に保つことが重要である」と記載され
ている。

【００６９】従って、ＷＯ９６／３８４６９の開示では本質的特徴として４〜９のpH値を
有する溶液が記載されており、そのpH値は本発明の回収方法において利用されて
いるpHの範囲外である。

【００７０】好ましくは、この培養溶液は培養溶液１リッター当り０．０２モル〜１．２モ
ルのＡｌ／Ｆｅ化合物で処理し、より好ましくはこの培養溶液は培養溶液１リッ
ター当り０．０４モル〜１．０モルのＡｌ／Ｆｅ化合物で処理する。

【００７１】本発明に従うと、任意のＦｅもしくはＡｌ化合物、又は任意のその混合物、例
えばＡｌ₂ （ＳＯ₄ ）₃ 、ＮａＡｌＯ₂ 、Ｋ₂ Ａｌ₂ Ｏ₄ 、Ａｌ（ＮＯ₃ ）₃ 、
ＡｌＣｌ₃ 、Ａｌ−アセテート、Ａｌ−ホルメート、Ｆｅ₂ （ＳＯ₄ ）₃ 、Ｆｅ
（III ）ホルメート、Ｆｅ（III ）アセテート、Ｆｅ（II）ホルメート及びＦｅ
（II）アセテートが使用されうる

【００７２】好適な化合物はポリマーアルミニウムヒドロキシクロリド（例えばＢｏｌｉｄ
ｅｎより入手可能なＥＫＯＦＬＯＣＫ）、ポリマーアルミニウムクロロヒドレー
ト（Ｃａｌｇｏｎ社より入手可能）又はＮａＡｌＯ₂ である。

【００７３】安定化剤本発明に従うと、状泡によっては安定化剤（注目のタンパク質の高pHを寛容す
る能力を高めるため）又はプロテアーゼインヒビター（注目のタンパク質が分解
しないため）を添加することが良い考えであることがある。有用なプロテアーゼ
インヒビターは硼酸又はボロン酸、特にＷＯ９６／４１８５９に記載の４−ホ
ルミル−フェニル−ボロン酸でありうる。

【００７４】可溶化産物からの細胞の分離及び注目のタンパク質を含んで成る溶液の獲得：本発明の工程ｂ）に従う分離は任意の標準の公知の方法に従って実施してよい
。かかる方法は１又は複数の固体／液体分離技術、例えば遠心分離、濾過又はマ
イクロ濾過でありうる。

【００７５】注目のタンパク質：本発明の方法は任意の注目のタンパク質の回収に適用できうる。好ましくは、この注目のタンパク質は酵素、特にグリコシダーゼとして分類さ
れる酵素（ＥＣ３．２）又はペプチダーゼとして分類される酵素（ＥＣ３．４）
（ＥＣ番号付けはEnzyme Nomenclature, Recommendations (1992) of the Nomen
clatuve Commitlee of the International Union of Biochemistry and Molecul
ar Biologyに従う）。特に好適な酵素はアミラーゼ（特にα−アミラーゼ（ＥＣ
３．２．１．１））、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、ラクターゼ（ＥＣ３
．２．１．１０８）、キシログルカナーゼ、マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．２
５）及びプロテアーゼから成る群から選ばれる酵素；特にアミラーゼ、マンナナ
ーゼ及びプロテアーゼから成る群から選ばれる酵素である。この酵素の好適な群
は極めてよく沈殿及び／又は結晶化により回収の際に問題を示す。

【００７６】更に、注目のタンパク質（好ましくは注目の酵素）の組換ＤＮＡ技術により作
られたプロテインエンジニアリング変異体が特に注目されうる。

【００７７】これは、かかる変異体が沈殿又は結晶化するが如き、回収の際に予測できない
問題をかなり頻繁に示しうることによる。

【００７８】かかるプロテインエンジニアリングされた変異体はプロテアーゼ変異体又はア
ミラーゼ変異体、特に培養溶液中で高い疎水性及び／又は低い溶解性を有する変
異体でありうる。

【００７９】好ましくは、この注目のタンパク質は５℃、pH９．５において２０分のインキ
ュベーション後に８０％以上の残留活性を有する；より好ましくは５℃、pH１０
．０において２０分のインキュベーション後に８０％以上の残留活性を有する；
そして最も好ましくは５℃、pH１１において２０分のインキュベーション後に８
０％以上の残留活性を有するタンパク質である。

【００８０】実施例１ＷＯ９６／２３８７３に記載の通りにして製造したα−アミラーゼを発酵さ
せた。発酵の後、顕微鏡（４００×）で酵素結晶が培養溶液内にあることがわかる。

【００８１】この培養溶液のα−アミラーゼ活性を測定して１００％とした。この培養溶液をpH７．５で遠心分離させた。遠心分離の後、その上清液は２０．４％のα−アミラーゼ活性を有していた。

【００８２】従って、可溶化／（可溶化＋非可溶化）の関係は、（Prot.conc,sup./Prot.Conc,cul-sol）×１００＜８０）＝２０．４％／１００％×１００＝２０．４である（これは８０の限界値をはる
かに下まわる）。

【００８３】凝集：下記の化学品を１００ｇづつの２つの培養サンプルに加えた（撹拌条件下で）
：２００％の水；１％のＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ；０．２％のＮａＡｌＯ₂ ；０．
３％のＳｕｐｅｒｆｌｏｃＣ５２１及び０．３％のＳｕｐｅｒｆｌｏｃ
Ａ１３０。化学品の添加の間、一方のサンプルではpHをpH７．５に保ち、そして
第二のサンプルではpHをpH１０．５に保った。そのpHを７．５又は１０．５に約
１０分保った。温度は室温とした（約２０℃）。

【００８４】次いで２つのサンプルを遠心分離し、そして上清画分内のα−アミラーゼ活性
の収率を測定した。収率試験１（pH７．５）＝４５％収率試験２（pH１０．５）＝８０％

【００８５】上記の試験は、サンプルのアルカリ処理が産物の収率を著しく高めることを明
示した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月５日（２００１．３．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１２】 Journal of Biotechnology, 26 (1992) 111-142 はリパーゼの様々な精製戦略
についての当業界発表の参考文献である。第１２９頁には、リパーゼ精製が一般
にリパーゼの可溶化の問題によりしにくくなっていると述べている。この文献は
この問題を解決するための当業界の技術をまとめており、それは極めて複雑な精
製戦略、例えば液−液抽出、水性二相システム、特殊な膜処理、及び免疫沈殿を
含んで成る。アルカリ溶液内でのタンパク質の可溶化はＷＯ８３／０４４１８；ＥＰ０
１２２０８０；ＥＰ０３３１４６４；及びＥＰ０３７３３２５に開示されて
いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者オレイリュー，ミヒャエルヨーンデンマーク国，デーコー−1829 フレデリクスベルウセー，マビクスアレ 11 Ｆターム(参考） 4B050 FF03C FF03E LL02 LL04 LL05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリコシダーゼ（ＥＣ３．２）又はペプチダーゼ（ＥＣ３．
４）を産生することができる細胞を含んで成る培養溶液からグリコシダーゼ又は
ペプチダーゼを回収するための方法であって、ここで当該グリコシダーゼ又はペ
プチダーゼの８０％未満はpH７．５において当該培養溶液内で可溶化状態にあり
、当該方法は：ａ）当該注目のグリコシダーゼ又はペプチダーゼを当該培養溶液のpHのpH９．
５乃至pH１３のpH値への調整により可溶化させ；そしてｂ）当該可溶化グリコシダーゼ又はペプチダーゼを当該細胞から回収し、そし
て当該グリコシダーゼ又はペプチダーゼを含んで成る溶液を獲得する；ことを含んで成る方法。
【請求項２】 pH７．５において前記培養溶液内で可溶化状態にない前記グ
リコシダーゼ又はペプチダーゼが前記溶液内の細胞固形分又はその他の固形成分
の如き培養溶液内の固形分に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】 pH７．５において前記培養溶液内で可溶化状態にない前記グ
リコシダーゼ又はペプチダーゼが前記培養溶液内で沈殿及び／又は結晶化してい
る、請求項１記載の方法。
【請求項４】前記培養溶液のpHをpH９．７５乃至pH１３のpH値；より好ま
しくはpH１０乃至pH１３のpH値；更により好ましくはpH１０．２５乃至pH１３の
pH値；そして最も好ましくはpH１０．５乃至pH１３のpH値に調整する、請求項１
〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】請求項１の工程ａ）における培養溶液を前記pH調整の前、最
中又は後に１又は複数種の凝集剤で更に処理する、請求項１〜４のいずれか１項
記載の方法。
【請求項６】前記凝集剤が可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物、特にポリマ
ーアルミニウムヒドロキシクロリド、ポリマーアルミニウムクロロヒドレート又
はＮａＡｌＯ₂ である、請求項５記載の方法。
【請求項７】前記グリコシダーゼ又はペプチダーゼがプロテインエンジニ
アリングされた変異体である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】前記グリコシダーゼがアミラーゼ又はマンナナーゼである、
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】前記ペプチダーゼがプロテアーゼである、請求項１〜７のい
ずれか１項記載の方法。
【請求項１０】前記工程ｂ）における培養溶液のpHを分離の前に低めのpH
に調整する、請求項１記載の方法。