JP2002515243A - 多価ｔ細胞受容体複合体 - Google Patents

多価ｔ細胞受容体複合体

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Abstract

(57)【要約】 ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための合成多価Ｔ細胞受容体複合体であり、前記ＴＣＲ複合体は前記ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的な複数のＴ細胞受容体を含んでなる。Ｔ細胞受容体は、可溶性の、再生された組換えＴ細胞受容体であることが好ましい。合成多価Ｔ細胞受容体複合体は、治療剤を輸送するため、ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出するために用いることができ、そのような使用のための方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は多価形態のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および、主要組織適合複合体（
ＭＨＣ）存在下において表面に提示される特異的なペプチド抗原を運搬する細胞
を検出するためのこれらの使用に関する。また本発明は、ＴＣＲ多量体を用いた
標的細胞への運搬方法、特に、治療薬剤の運搬に関する。
【０００２】 一般的背景 １．細胞表面での抗原提示 ＭＨＣ分子は、細胞表面での認識のため、適応する免疫系の細胞アームにより
、短いタンパク質フラグメント、ペプチド抗原を提示する特殊化されたタンパク
質複合体である。
【０００３】 クラスＩＭＨＣは、種々の重鎖および一定の軽鎖、β２ミクログロブリンを有
する二量体タンパク質複合体である。細胞内で加工され、ＭＨＣのバインディン
グクレフト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｌｅｆｔ）にローディングされ、ＭＨＣ重鎖に
より複合体が膜に固定される細胞表面に輸送されるペプチドを、クラスＩＭＨＣ
は提示する。ペプチドは、通常、長さにして８〜１１のアミノ酸であるが、ＭＨ
Ｃに結合された時にペプチドにローディングされる弓なりの程度に依存する。Ｍ
ＨＣ重鎖の膜末端のα１およびα２ドメインで形成されるバインディングクレフ
トは「閉鎖した」末端を有し、結合しうるペプチドの長さに非常に厳しい制限を
賦課する。
【０００４】 クラスIIＭＨＣも、α鎖（重鎖）およびβ鎖（軽鎖）を有する二量体タンパク
質であり、双方ともに可変の糖タンパク質であり、膜貫通ドメインにおいて細胞
内に固定される。クラスＩＭＨＣ同様、クラスII分子も、１２〜２４のアミノ酸
からなるより長いペプチドが内部に挿入されるバインディングクレフトを形成す
る。ペプチドはエンドサイトーシスによって細胞外環境から取り込まれ、後に細
胞表面に輸送されるクラスII複合体内にローディングされる前に加工される。
【０００５】 各細胞は最大６種類のクラスＩ分子および同様の種類のクラスII分子において
ペプチドを提示し、提示されるＭＨＣ複合体の総数は細胞あたり１０5〜１０6の
範囲である。クラスＩ分子で提示されるペプチドの種類は、一般的には１０００
〜１００００であると推定され、これらの９０％は、細胞あたり１０〜１００個
のコピーが存在する（Ｈｕｎｔ，Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｈ
ｉｃｚ，Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ａｐｐｅ
ｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｈｕｃｚｋｏ，Ｂｏｄｎａｒ ｅｔ ａｌ．
， １９９３）。最も多いペプチドは、提示される全ペプチドの０．４〜５％を
構成すると考えられている、即ち最大２００００もの同一の複合体が１つの細胞
に存在しうる。最も多い単一のペプチド複合体の平均数は、細胞あたり２０００
〜４０００の範囲内であるようであり、認識可能なＴ細胞エピトープの典型的な
提示レベルは、細胞あたり１００〜５００複合体の範囲である（概要は（Ｅｎｇ
ｅｌｈａｒｄ，１９９４）参照）。
【０００６】 ２．抗原提示細胞の認識 ＭＨＣ−ペプチドように広範な種類の細胞が抗原を提示することができ、その
特性を有する細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）として知られる。特定の抗原を提示
する細胞のタイプは、抗原が最初に免疫系の細胞と、何処で、どのように、遭遇
するかに依存する。ＡＰＣには、リンパ節および脾臓のＴ細胞領域に大量に見出
される嵌合性樹状細胞、皮膚中のランゲルハンス細胞、リンパ組織のＢ細胞領域
中の濾胞樹状細胞、単球、マクロファージ、および他の単球／マクロファージ系
列細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞、並びに典型的なＡＰＣではないがＡＰＣにように
作用しうる内皮細胞や線維芽細胞のような種々の他の細胞が含まれる。
【０００７】 抗原提示細胞は、自己ペプチドに反応するＴ細胞を確実に根絶やしにする（陰
性選択）ために設計された選択手段が施される場所である胸腺（Ｔ細胞）中で成
熟したリンパ球亜群によって認識される。また、提示されたＭＨＣ変種を認識す
る能力を有さないＴ細胞は、成熟することができない（陽性選択）。
【０００８】 Ｔ細胞による特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の認識は、ジスルフィド結合に
よって結合した１本のα鎖および１本のβ鎖を有するヘテロ二量体糖タンパク質
であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって媒介される。両鎖は膜貫通ドメインにお
いて膜に固定され、短い細胞質テールを有する。抗体遺伝子において観察される
ものと同様の組換えプロセスによって、ＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子は、ドメイ
ンに結合する細胞外抗原に莫大な多様性（１０13〜１０15の種々の可能性）を生
む、Ｖ（Ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｊ（Ｊｏｉｎｉｎｇ）、Ｄ（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
）、およびＣ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ）要素により再配列される。ＴＣＲはγ鎖およ
びδ鎖を有する、異なる形態でも存在する。しかし、これらはＴ細胞の約５％存
在するにすぎない。
【０００９】 抗体とＴＣＲは、特異的に抗原を認識するただ２タイプの分子である。したが
って、ＴＣＲはＭＨＣで提示される特定のペプチド抗原に対する唯一の受容体で
あり、外来ペプチドはしばしば、細胞内部での唯一の異常の徴候である。
【００１０】 ＴＣＲは莫大な多様性をもって発現し、それぞれのＴＣＲは１または２、３の
ＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的である。ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチドリガ
ンドとの接触は極めて短い時間であり、通常１秒の半分未満である。ＴＣＲ／Ｍ
ＨＣ−ペプチドだと推定されるＴ細胞と標的細胞との付着は、補受容体リガンド
接触の数と同様、いくつのＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド接触が用いられるかに依存
している。
【００１１】 Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）が直接物理的に接触してい
る時に起こり、抗原特異的なＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との会合によって誘導され
る。ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介する際に含まれるＣＤ３複合体の不変タンパ
ク質に会合する、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヘテロ二量体の細
胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδ型で存在し、これらは構造的
に類似であるが解剖学上の位置は全く異なるものであり、おそらく機能も全く異
なる。受容体の細胞外部位は、２つの膜近位の定常ドメイン、および、抗体の相
補性決定領域（ＣＤＲ）に類似する多形性の高いループを形成する２つの膜遠位
の可変ドメインからなる。ＴＣＲ分子のＭＨＣ結合部位を形成し、ペプチド特異
性を決定するのがこれらのループである。ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIリガン
ドも免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であるが、抗原提示のために
分化しており、高い多形性ペプチド結合部位を有し、それらによりＡＰＣ細胞表
面において短いペプチドフラグメントの種々のアレイを提示することが可能にな
る。
【００１２】 近年、これらの相互作用の具体例について、構造的な特性が決定されている（
Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｇａｒｃｉａ，Ｄｅｇ
ａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｄｉｎｇ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９８
）。ネズミおよびヒトクラスＩｐＭＨＣ−ＴＣＲ複合体の結晶構造は、そのｐＭ
ＨＣリガンド上でのＴＣＲの対角配向を示唆しており、界面での形状相補性が少
ないことを示している。ＣＤＲ３ループは、ペプチド残基と独占的に接触する。
配位されたＴＣＲ構造と配位されていないＴＣＲ構造の比較からも、ＴＣＲ Ｃ
ＤＲループにある程度の可変性があることが提示されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ
ａｎｄ Ｂｉｄｄｉｓｏｎ １９９９）。
【００１３】 Ｔ細胞活性モデルにより、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との界面でのその
ようなタンパク質−タンパク質相互作用が、ウイルス感染した標的細胞の殺傷の
ような反応をどのように発生させるか、を説明しようと試みられている。ＴＣＲ
−ｐＭＨＣ相互作用の物理的特性は、これらのモデルの多くにおいて臨界値とし
て含まれる。例えば、ＴＣＲ解離レートの定量的変化が、完全なまたは部分的な
Ｔ細胞活性や拮抗作用のような受容体進入機構の生物学的結果における定性的な
変化に反映されることが見出されている（Ｍａｔｓｕｉ，Ｂｏｎｉｆａｃｅ ｅ
ｔ ａｌ．１９９４；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｂｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９
９６；Ｄａｖｉｓ，Ｂｏｎｉｆａｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）。
【００１４】 ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用は、低い親和性および比較的遅い反応速度を有する
ことが示されている。多くの研究においては、Ｂａｉｃｏｒｅ（商標）のような
バイオセンサー技術が用いられており（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．
１９９９；Ｗｙｅｒ，Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ． １９９９）、それらは表
面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を利用するものであり、直接タンパク質−タンパク質
相互作用の親和性およびリアルタイムの反応速度測定をすることが可能になる（
Ｇａｒｃｉａ，Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｄａｖｉｓ，Ｂｏｎｉｆａ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）。しかしながら、研究されている受容体は、異反
応性ＴＣＲや人工免疫抗原に対する反応性が高められたものである。
【００１５】 ３．ＭＨＣペプチド複合体とのＴＣＲおよびＣＤ８相互作用 クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体によって拘束される（例えば、認識する）Ｔ
細胞の極めて大部分は、活性化のために補受容体ＣＤ８の進入をも必要とし、一
方クラスIIＭＨＣによって拘束されるＴ細胞はＣＤ４の進入を必要とする。Ｔ細
胞活性化における補受容体の正確な機能は、まだ完全にははっきりしていない。
活性化を制御する重要なメカニズムおよびパラメーターもまだである。しかしな
がら、ＣＤ８およびＣＤ４の双方は、Ｔ細胞活性化の特性を決定するごく初期の
チロシンリン酸化現象に含まれるキナーゼｐ５６lckと会合する細胞質ドメイン
を有する。ＣＤ８は二量体受容体であり、αα型や、より一般的なαβ型で発現
する。ＣＤ４は単量体である。ＣＤ８受容体においては、α鎖のみがｐ５６lck
と会合する。
【００１６】 ＴＣＲやＣＤ８のＭＨＣへの結合を制御する物理的パラメーターの近年の測定
は、受容体の可溶性変種を用いており、ＴＣＲによる結合が認識現象を支配して
いることを示している。ＴＣＲは、補受容体と比較してＭＨＣに対して非常に高
い親和性を有している（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｗｙｅｒ，Ｗｉ
ｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００１７】 ＭＨＣと受容体とのそれぞれの相互作用は、例えば３７℃といった生理的温度
では非常に短時間である。ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用の半減期の大体の
数値は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１（ＨＬＡ−Ａ２）によって提示されたインフルエ
ンザウイルス”マトリックス”ペプチドに対して特異的なヒトＴＣＲを用いて測
定したところ、０．７秒である。このＭＨＣ／ペプチド複合体とのＣＤ８αα相
互作用の半減期は０．０１秒未満であるか、少なくとも１８倍は早い。
【００１８】 ４．可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体の生産 可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体は、抗原提示細胞の表面の分子をパパインで開
裂することによってまず得られた（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８５）。この取り組みによって結晶化のための物質が提供さ
れたが、クラスＩ分子の場合は、近年、Ｅ．ｃｏｌｉにおける重鎖および軽鎖を
それぞれ発現させ、合成ペプチドの存在下で再生する代用法がある（Ｇａｒｂｏ
ｃｚｉ，Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｍａｄｄｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｄｄｅｎ，Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ．，
１９９３；Ｒｅｉｄ ＭｃＡｄａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｒｅｉｄ，Ｓｍ
ｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，１９
９６；Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｏ，Ｔｏｒｍｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。こ
の取り組みは従来の方法よりもいくつかの利点を有する、即ち、低コストでより
高い収率が得られ、ペプチド同定を非常に正確に制御することができ、また、最
終生成物はより均一である。さらに、例えば、タンパク質標識と融合させるなど
といった、変性された重鎖または軽鎖を容易に発現させることができる。
【００１９】 ５．ＭＨＣ−ペプチド四量体 ペプチド−ＭＨＣとＴＣＲおよびＣＤ８とのそれぞれの結合現象の半減期が短
いため、検出方法の発展に際して、この相互作用を使用するのは好適ではない。
この問題は、ペプチド−ＭＨＣ複合体の四量体分子を用いる新規技術によって克
服された（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。多量体の相互作用の高い
結合力により、単量体のペプチド−ＭＨＣ複合体の結合から得られるものに比べ
て、Ｔ細胞に結合している分子の半減期は劇的に長くなる。この技術はＷＯ９６
／２６９６２にも記載されている。
【００２０】 ペプチド−ＭＨＣ複合体多量体は、合成ペプチド、β２ミクログロブリン（通
常、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現）、および可溶性ＭＨＣ重鎖（これもＥ．ｃｏｌ
ｉにおいて発現）を用いて生成される。ＭＨＣ重鎖は膜貫通ドメインの開始点に
おいて切りとられ、膜貫通ドメインは細菌性変性酵素ＢｉｒＡに対する認識配列
を構成するタンパク質標識で置き換えられる（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐ
ｂｅｌｌ，１９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８１；Ｓ
ｃｈａｔｚ，１９９３）。ＢｉｒＡは、やや過剰の認識配列におけるリシン残基
のビオチン化に触媒作用を及ぼす（Ｓｃｈａｔｚ，１９９３）が、特異性は十分
に高く、タンパク質の大部分は標識における特異的な部位でのみビオチン化され
ることが保証される。ビオチン化されたタンパク質は、その後共有結合的にそれ
ぞれビオチンとの４つの結合部位を有するアビジン、ストレプトアビジン、また
はエクストラアビジン（Ｓｉｇｍａ）と結合することができ、結果的にペプチド
−ＭＨＣ複合体の四量体分子となる（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）
。
【００２１】 ６．ＭＨＣ−ペプチド四量体とＴ細胞の染色 ＷＯ９６／２６９６２およびＡｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）にも
、四量体分子に調製された可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体を用いて、特定の特異
性を有するＴ細胞を染色するための技術が記載されている。この技術は、Ｔ細胞
の検出および定量において科学的な意義を有し（Ｃａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９８；Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；ＭｃＨｅｙｚｅｒ Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｍｕｒａｌｉ Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ
ａｌ．，１９９８；Ｏｇｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、診断における可能性を
有しているかもしれない（概要は、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｏ’Ｃａｌｌ
ａｇｈａｎ，１９９８参照）。可溶性タンパク質を用いて測定したように、ＭＨ
ＣとＴＣＲまたはＣＤ８との相互作用の半減期は、例えば１秒未満といったよう
に非常に短いが、四量体とは安定した結合が形成され、染色を検出することがで
きる。これは、四量体とＴ細胞との多量体相互作用の高い結合力に起因するもの
である。
【００２２】 ７．可溶性ＴＣＲ 可溶性ＴＣＲの生産は、最近になって幾つかのグループによって開示されたも
のである。一般的には、全ての方法はＴＣＲの切りとられた型を開示するもので
あり、細胞外ドメインまたは細胞外ドメインと細胞質ドメインとのみを含むもの
である。したがって、全てのケースにおいて、膜貫通ドメインは発現したタンパ
ク質から削除される。多くの報告は、それらの方法に従って生産されたＴＣＲは
ＴＣＲ特異的抗体によって認識されることを示しているが（抗体によって認識さ
れる組換えＴＣＲの一部は正確に折りたたまれることを示している）、低い濃度
でも安定で、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識しうる可溶性ＴＣＲを高い収率で生
産しうるものはない。
【００２３】 結晶化しうる物質を生産する最初の取り組みは、真核細胞中での発現を使用し
たものであるが、該物質を生産するのは極めて高価である（Ｇａｒｃｉａ，Ｄｅ
ｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｒｃｉａ，Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．
，１９９６）。結晶化しうる物質を生産する他の取り組みは、従来ＭＨＣ−ペプ
チド複合体のために用いられていたものと同様のＥ．ｃｏｌｉ発現系を用いたも
のである（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｒｂ
ｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。後者の方法は、ＴＣＲ鎖の細胞
外部位の発現を含み、鎖間ジスルフィド結合の形成に含まれるシステイン残基の
すぐ前で切りとられ、インビトロで再生が生じるが、一般的に適用不可能である
ことが判明した。殆どのヘテロ二量体ＴＣＲは、このような方法で生産された場
合は、α鎖とβ鎖との間の低い親和性のため不安定なようである。
【００２４】 さらに、可溶性ＴＣＲの技術科された生産に関する幾つかの他の記載もある。
これらの幾つかは、ＴＣＲのαまたはβ鎖の一方の発現を記載しているに過ぎな
い。従って、ＭＨＣ−ペプチド特異性結合を維持しないタンパク質が生成される
（Ｃａｌａｍａｎ，Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｉｓｈｉｉ，Ｎａ
ｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。β鎖結晶は、α鎖なしに、単独または超
抗原に結合して得られている（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｂｏｕｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，
１９９５；Ｂｏｕｌｏｔ，Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｆｉｅｌ
ｄｓ，Ｍａｌｃｈｉｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００２５】 他の報告は、ヘテロ二量体γ／δまたはα／βＴＣＲの発現のための方法を記
載している（Ｃｏｒｒ，Ｓｌａｎｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｅｉｌａｔ
，Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｒｅｂａｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｍａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９１；Ｉｓｈｉｉ，Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｎｅｃｋｅ
ｒ，Ｒｅｂａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｐｙｒａｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９６；Ｗｅｂｅｒ，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
９２）。幾つかのケースにおいては、ＴＣＲは単鎖融合タンパク質として発現し
ている（Ｂｒｏｃｋｅｒ，Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｒｅｇｏｉ
ｒｅ，Ｍａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｓｃ
ｈｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。他の方策は、Ｉｇヒンジおよび一定の
ドメインに融合したキメラタンパク質としてＴＣＲ鎖を発現させるものである（
Ｅｉｌａｔ，Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗｅｂｅｒ，Ｔｒａｕ
ｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。他のキメラＴＣＲタンパク質は、互
いに高い親和性と特異性を有する高次コイルを形成するように設計された配列で
発現しており、従って、ＴＣＲα−β接触が安定化し、溶解度を高められる。こ
の方策は、バキュロウイルス発現系およびＥ．ｃｏｌｉの双方から可溶性ＴＣＲ
を生産するものとして報告されている（Ｃｈａｎｇ，Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，１
９９４；Ｇｏｌｄｅｎ，Ｋｈａｎｄｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【００２６】 ＴＣＲリガンドを認識し得る可溶性ＴＣＲを作製するための方法が、ここには
記載されている。該方法の好ましい実施形態によれば、ＴＣＲの細胞外フラグメ
ントはｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの”ロイシンジッパー”への融合体として別
個に発現し、その後インビトロで再生される。該ＴＣＲ鎖は鎖間ジスルフィド結
合を形成せず、天然のＴＣＲで結合を形成する際に含まれるシステイン残基の前
でそれらは切りとられる。その代わりに、α鎖とβ鎖とのヘテロ二量体の接触は
、天然のタンパク質においてヘテロ二量体化を媒介する２つのロイシンジッパー
フラグメントによって支持される。
【００２７】 ８．ＴＣＲを用いた検出 Ｔ細胞による抗原提示細胞のペプチド特異的な認識は、多数の低い親和性受容
体／リガンド相互作用によって得られた結合力に基づくものである。これらはＴ
ＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用および幾つかの補受容体／リガンド相互作用を
含む。クラスIIに拘束される、およびクラスＩに拘束されるＴ細胞のＣＤ４およ
びＣＤ８補受容体も、それぞれリガンドとしてＭＨＣを保持するが、ペプチドは
保持しない。しかしながら、ＣＤ４およびＣＤ８が相互作用するＭＨＣ上のエピ
トープは、ＴＣＲと相互作用するエピトープとは重複しない。
【００２８】 この認識メカニズムは、接触半減期が治療的に使用されるような方法において
、抗原提示細胞のペプチド特異的な認識が可溶性ＴＣＲによって媒介されうると
いった可能性を開くものである。しかしながら、補受容体の支持なしに、多数の
ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用の結合力によって得られた安定性が、そのよ
うな目的に対して有効であるかどうかは明らかでなかった。可溶性ＴＣＲによる
抗原提示細胞の染色は、Ｐｌａｋｓｉｎらによって報告されている（Ｐｌａｋｓ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。この結果は、いわゆる一重鎖ＴＣＲ、ＴＣＲ
から得られるα鎖およびβ鎖の４つのドメインのうち３つからなる単一のタンパ
ク質、を用いて得られるものである。しかしながら、染色は抗原提示細胞を化学
的に変性し、その後架橋されたＴＣＲで培養することによって遂行され、インビ
ボでは実際的でない取り組みである。さらに、この方法はペプチドの水準を説得
力をもって検出するだけであり（約１００μＭのペプチドで抗原提示細胞を培養
する）、これらはインビボで提示されるペプチドの水準と比較して非常に大きい
。
【００２９】 Ｔ細胞の特異的な染色は、ＭＨＣ−ペプチド四量体、”相互の(reciprocal)”
状態、を用いて遂行することができるという事実（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９６）により、適切なペプチド抗原を表面に提示する細胞に比較的安定し
て接触することがＴＣＲ多量体によって媒介される、という概念の支持にいくら
かは資すると考えられる。しかしながら、ＴＣＲ多量体による抗原提示細胞の認
識よりもＭＨＣ多量体−ペプチドによるＴ細胞の認識を好む３つの重要な条件が
あるため、これは実際のところ事例とはならないと考えられる。
【００３０】 ｉ）ＭＨＣ多量体−ペプチド複合体は、Ｔ細胞表面においてＴＣＲおよびＣＤ
４またはＣＦ８補受容体の双方に接触することが可能である。ＴＣＲ多量体はＴ
ＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド接触のみに依存する。
【００３１】 ii）Ｔ細胞表面におけるＴＣＲの濃度は、抗原提示細胞の表面におけるＭＨＣ
−ペプチドの濃度と比較して非常に高い（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，１９９４）。
【００３２】 iii）抗原提示細胞は、多数の異なるＭＨＣ−ペプチド複合体をそれらの表面
に提示する（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，１９９４）が、Ｔ細胞は通常１つのα／βま
たはγ／δ結合のみを発現する。
【００３３】 ９．リポソームへのタンパク質の付着 リポソームは、水性の体積部分を取り込んでいる脂質分子の二重層からなる脂
質小胞である。脂質二重層は膜脂質からなるが、通常はリン脂質のみではない。
リン脂質分子は両親媒性特性を有し、従って結晶状態または極性溶媒中において
凝集し、一般的なリオトロピック液晶対称形に配列した構造になる。水溶液にお
いては、リン脂質分子は、通常自己閉鎖球または楕円構造を形成し、１または幾
つかのリン酸脂質二重層はそれらの内部に溶媒の一部を取り込んでいる。
【００３４】 生物学的には、リポソームに取り込まれた活性化合物は、外部環境から保護さ
れ、徐々に放出して持続的な効果を有する。
【００３５】 表面のタンパク質によって特定の部位へ方向付けられたリポソームによる薬剤
輸送は、甚大な治療上の可能性を有している（Ａｌｌｅｎ，１９９７；Ｌａｎｇ
ｅｒ，１９９８）。特に、特定の部位における薬剤の遅々とした放出は薬剤の効
力を高め、その一方、投与される全体量を減ずることができる。そのような応用
のためのリポソームの使用は急速に発達しつつあり、甚大なデータが、例えばそ
れらの血流中での循環能力に関して（Ｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、
それらの生存時間に関して（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、生
じつつある。特に有用な特性は、リポソームに運搬される薬剤は経口投与するこ
とができるという点かもしれない（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ，１９９７
；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）
。
【００３６】 幾つかの報告は、リポソームへの抗体の付着を開示している（Ａｈｍａｄ ａ
ｎｄ Ａｌｌｅｎ，１９９２；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｈａｎｓ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。米国特許第５，６２０，６８９号には、Ｂリ
ンパ球またはＴリンパ球において選択された抗原に結合する有効な抗体または抗
体フラグメントが、ポリエチレングリコール鎖で表面コーティングされたリポソ
ームにおける膜脂質の末端に付着している、いわゆる”イムノリポソーム”が開
示されている。しかしながら、抗体−抗原相互作用は、通常、非常に高い親和性
を有し、この理由により多価標的化には適切でないかもしれない。
【００３７】 本発明 本発明の目的は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を標的化するための手段を手
供することである。
【００３８】 本発明の特別な目的は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体、特にインビボで独占
的に提示される訳ではないＭＨＣ−ペプチド複合体の検出が可能な形態のＴＣＲ
を提供することである。
【００３９】 本発明のさらなる目的は、インビボにおいて特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体の
発現部位へ剤を、特に治療剤を運搬することができる、標的化された運搬媒体を
提供することである。
【００４０】 驚くべきことに、本発明者らによって、ＴＣＲがインビボでの標的化目的のた
めに非常に有効に使用され得ることが見出され、標的化目的のためにＴＣＲ分子
を用いる方法が首尾よく発明された。
【００４１】 本発明は、一の観点においては、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための合
成多価Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を提供するものであり、ここでＴＣＲ複合
体はＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的な複数のＴ細胞受容体を含む。
【００４２】 本発明は、主としてＴ細胞の９５％に存在するαβＴＣＲに関するものである
。
【００４３】 他の観点において、本発明は、非多量体化Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて
、増強された結合能力を持つ、多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体
を含む、または、のみからなる多価ＴＣＲ複合体を提供するものである。Ｔ細胞
受容体多量体は、二つ以上のＴＣＲヘテロ二量体を含み得る。
【００４４】 他の観点において、本発明は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法を提供
するものであり、その方法とは、 （ｉ） （ａ）複数のＴ細胞受容体を含む合成多価Ｔ細胞受容体複合体、および
／または、（ｂ）非多量体のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて増強された結合
能力を有する多量体化されたＴ細胞受容体ヘテロ二量体を含む、多価Ｔ細胞受容
体複合体を準備すること（ここで前記Ｔ細胞受容体は前記ＭＨＣ−ペプチド複合
体に特異的である）、 （ii） 前記多価ＴＣＲ複合体とＭＨＣ−ペプチド複合体とを接触させること、
および、 （iii） 前記多価ＴＣＲ複合体のＭＨＣ−ペプチド複合体に対する結合を検出
すること、を含む。
【００４５】 さらに他の観点において、本発明は、標的細胞に治療剤を輸送するための方法
を提供するものであり、その方法とは： （ｉ）（ａ）複数のＴ細胞受容体を含む合成多価Ｔ細胞受容体複合体、および／
または、（ｂ）非多量体のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて増強された結合能
力を有する多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体を含む合成多価Ｔ細
胞受容体複合体を準備することと（ただし、前記Ｔ細胞受容体は前記ＭＨＣ−ペ
プチド複合体に特異的であり、前記多価ＴＣＲ複合体は前記多価ＴＣＲ複合体と
会合する前記治療剤を含んでなる）、 (ii) 前記多価ＴＣＲ複合体と潜在性な標的細胞とを、前記Ｔ細胞受容体の前記
標的細胞への付着を許容する条件下において接触させること、 を含む。
【００４６】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体（または多量体結合部分）は、インビトロまた
はインビボにおける特殊な抗原を提示する細胞の捕獲または標的化に関して、そ
れら自体の範囲内で有用であり、このような用途を持つさらに多価のＴＣＲ複合
体製造のための中間体としても有用である。多価ＴＣＲ複合体にはこのように、
インビボでの使用に関して、薬剤的に許容されうる配合が提供される。
【００４７】 本発明の文脈において、多価ＴＣＲ複合体は、それが生物体中に見出されない
または天然型ではない場合、例えば非代謝性および／または核がない場合、“合
成”である。従って、例えばＴＣＲが多量体の形態または例えばリポゾーム等の
脂質二重層中に存在する場合が好ましい。ＴＣＲ複合体は、Ｔ細胞を分離し、例
えばその複合体が核を含まないように、細胞内成分を除去することによって形成
することも可能である。続いて、得られた“ゴースト”Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体
を含むＴ細胞膜だけを有する。このようなゴーストＴ細胞は、Ｔ細胞を界面活性
剤で溶解させ、細胞内成分を膜から分離し（例えば遠心分離により）、続いて界
面活性剤を除去し膜を再構成することによって形成することができる。
【００４８】 その最も簡単な形態において、本発明による多価ＴＣＲ複合体は、好ましくは
リンカー分子を介して、互いに（例えば共有結合またはその他の結合によって）
会合する、二または三または四またはそれ以上のＴ細胞受容体分子の多量体を含
む。適切なリンカー分子としては、アビジン、ストレプトアビジンおよびエクス
トラアビジンのような多価付着分子が含まれ、これらはそれぞれ、ビオチンに対
する４つの結合部位を持っている。従って、ビオチン化されたＴＣＲ分子から、
複数のＴＣＲ結合部位を持つＴ細胞受容体の多量体に合成することができる。多
量体におけるＴＣＲ分子の数は、多量体を調製するために用いられたリンカー分
子の量に関連するＴＣＲ量に依って決まり、さらにその他の任意のビオチン化さ
れた分子の存在／非存在にも依存する。好ましい多量体は、三量体または四量体
ＴＣＲ複合体である。
【００４９】 特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を捕獲または標的化するのに
用いられる多価ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ三量体または四量体よりもかなり大きい
構造であることが好ましい。その構造は直径が１０ｎｍ〜１０μｍの範囲である
ことが好ましい。各構造は、その構造中の二つ以上のＴＣＲ分子が、同時に細胞
上の二つ以上のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することができるように、十分離
れた距離で多価ＴＣＲ分子を提示し、このようにして細胞に対する多量結合部位
の結合力を増強している。
【００５０】 本発明において、用いられる好適な構造は、リポゾームや固形構造のような膜
構造を含み、それらは好ましくはビーズのような粒子であり、例えばラテックス
ビーズである。Ｔ細胞受容体分子で外部から被覆されうる他の構造も適切である
。構造は、個々のＴ細胞受容体分子より、むしろＴ細胞受容体複合体多量体で被
覆される方が好ましい。
【００５１】 リポゾームの場合、Ｔ細胞受容体分子は、膜の外側に付着されるか、または膜
内に埋没している。後者の場合、膜貫通ドメインの一部またはすべてを含むＴ細
胞受容体分子が使用され得る。前者の場合、可溶性Ｔ細胞受容体分子が好ましい
。Ｔ細胞受容体の可溶形態は通常、天然型から膜貫通ドメインを削除することに
よって誘導される。タンパク質は、細胞質および膜貫通ドメインの双方を除去す
ることによって切りとられる。また、細胞質ドメインの一部または全部を維持し
、膜貫通ドメインだけを削除してもよい。タンパク質は、タンパク質分解性の開
裂によって、または、遺伝子的に行われる切りとりまたは部分的削除の形態によ
って、望ましい形態を成形するために、改変することができる。
【００５２】 一般的に、可溶性Ｔ細胞受容体は、全４つの分子の外部ドメインを含み、それ
はαおよびβ可変ドメインならびにαおよびβ定常ドメインである。しかしなが
ら、可変ドメインのＭＨＣ−ペプチド結合特性を保持している各種ＴＣＲの可溶
形態を想定することができる。例えば、結合部位を著しく乱さないように、一の
または他の定常ドメインを除くことが可能かもしれない。
【００５３】 本発明の多価ＴＣＲ複合体は、非多量体のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて
増強された結合能力を有する多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体を
含むことが好ましい。再生された組換えＴ細胞受容体は： ｉ）第一の異種のＣ−末端二量体化ペプチドを有する組換えＴ細胞受容体のαま
たはγ鎖の細胞外ドメイン；および ii）前記第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体
化ドメインを形成する第二のＣ−末端二量体化ペプチドを有する組換えＴ細胞受
容体のβまたはδ鎖の細胞外ドメイン を含む。
【００５４】 このような組換えＴＣＲは、クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体およびクラスII
ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するためのものであってもよい。
【００５５】 好ましくは、組換えＴＣＲのヘテロ二量体化ドメインは、いわゆる“高次コイ
ル”または“ロイシンジッパー”である。これらの用語は、ヘテロ二量体を形成
するために特異的に互いに相互作用するらせんペプチド対を説明するのに用いら
れている。その相互作用は、それぞれのジッパーペプチドの一端に沿って相補的
な疎水性残基が存在することによって起こる。ペプチドの特性としては、ヘテロ
二量体の形成がヘリックスのホモ二量体の形成より非常に好ましい、というもの
である。ロイシンジッパーは、合成的にまたは天然的に発生させることができる
。合成ロイシンは、天然に生じるロイシンジッパーよりも格段に高い結合親和性
を持つように設計されうるが、これは必ずしも利点とは限らない。実際には、本
発明で用いられる好ましいロイシンジッパーは、天然的に生じたロイシンジッパ
ーまたは類似の結合親和性を持つロイシンジッパーである。ｃ−ｊｕｎおよびｃ
−ｆｏｓタンパク質からのロイシンジッパーが、好適な結合親和性を有するロイ
シンジッパーの例である。他の適切なロイシンジッパーは、ｍｙｃおよびｍａｘ
タンパク質からのものが含まれる（Ａｍａｔｉ，Ｄａｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，１
９９２）。好適な特性を有する他のロイシンジッパーを、容易に設計することも
できる（Ｏ’Ｓｈｅａ，ｅｔ ａｌ，１９９３年）。
【００５６】 本発明の多量体結合部位における可溶性ＴＣＲは、ｃ−ｊｕｎ（α鎖）および
ｃ−ｆｏｓ（β鎖）からのヘテロ二量体化ドメインに相当する約４０アミノ酸ロ
イシンジッパー融合体を有することが好ましい（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓ
ｋｉ，ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ
，１９９２，Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９５）。より長い
ロイシンジッパーを使用してもよい。ヘテロ二量体化特異性は、少しのロイシン
ジッパードメインからなる非常に短いフラグメントにおいてでさえも維持されて
いるようであり（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ，１９９２）
、より短いｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントで同様の利益を得ることも
可能である。このようなより短いフラグメントは、例えば、少なくとも８個のア
ミノ酸からなる。従って、ロイシンジッパードメインは、８〜６０個の範囲のア
ミノ酸長さを有しうる。
【００５７】 ロイシンジッパー対における特異性の分子的な原理は、十分に特徴が解かって
おり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，１９８８；ＭｃＫ
ｎｉｇｈｔ，１９９１）、ロイシンジッパーは、当業者によって設計、加工され
、ホモ二量体、ヘテロ二量体または三量体複合体を形成しうる（Ｌｕｍｂ ａｎ
ｄ Ｋｉｍ，１９９５；Ｎａｕｔｉｙａｌ，Ｗｏｏｌｆｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，１
９９５；Ｂｏｉｃｅ，Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｃｈａｏ，
ｅｔ ａｌ，１９９６）。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパーに比べ
てより高い親和性を持つ、設計されたロイシンジッパーまたは他のヘテロ二量体
化ドメインは、いくつかの系において可溶性ＴＣＲを発現するのに有利である。
しかしながら、以下に詳細に述べるように、可溶性ＴＣＲがインビトロで折りた
たまれる場合には、非生産的なタンパク質凝集の形成を減少させるために、折り
たたみ中に可溶化剤が含まれることが好ましい。この現象の一つの解釈は、ロイ
シンジッパードメインの折りたたみの反応速度が、ＴＣＲ鎖に対するものよりも
早く、折りたたまれていないＴＣＲαおよびβ鎖の二量体化を導き、続いてタン
パク質凝集を引き起こす、というものである。可溶化剤を含ませることで折りた
たみ過程を遅らせ、凝集を阻害することによって、両融合ドメインの折りたたみ
が完了するまで溶液中でタンパク質を維持することができる。それゆえ、ｃ−ｆ
ｏｓおよびｃ−ｊｕｎロイシンジッパーと同等の可溶性ＴＣＲの収率を得るため
に、より高い可溶化剤濃度が必要とするかもしれない。
【００５８】 安定なホモおよびヘテロタンパク質二量体を形成するために、種々の生物系に
おいて多様な方法が用いられ、これらの各方法には、基本的には、二量体化ドメ
インを遺伝子的に改変されたタンパク質にするための選択枝が提供される。ロイ
シンジッパー（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｚｉｆｆ １９８９）は、おそ
らく最も一般的な二量体化モジュールであり、遺伝子的に設計されたタンパク質
二量体の製造に広く使われている。従って、酵母のサッカロミセス セレビジエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの転写活性化タン
パク質であるＧＣＮ４のロイシンジッパーは、多くのヘテロタンパク質の直接的
なホモ二量体化に使用されている（Ｈｕ，Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，１９９３
；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｍｏｎｔｅｌｉｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，１９９８）。好
ましい方法は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓロイシンジッパー対のような、ヘテロ二量体複合
体の形成をさせるジッパーを用いることである（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ａｎｄ Ｌ
ｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，１９９６；Ｒｉｌｅｙ，Ｒａｌｓｔｏｎ．ｅｔ ａｌ，１
９９６）。
【００５９】 ヘテロ二量体化ドメインは、ロイシンジッパーに限られない。すなわち、それ
は、ジスルフィド架橋−形成要素を提供することもできる。あるいは、ＳＨ３ド
メインおよび疎水性／プロリンリッチのカウンタードメインを提供することもで
き、これらはシグナルローディングに関与するタンパク質間で見られるタンパク
質−タンパク質相互作用を担う（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒにより再調査（Ｓｃ
ｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ １９９４）。シグナルローディングカスケードに関与す
るタンパク質間で見出される他の天然のタンパク質−タンパク質相互作用は、翻
訳後に改変されたアミノ酸とこのような改変された残基を特異的に認識するタン
パク質モジュールとの間の関係に依存している。このような翻訳後改変アミノ酸
およびタンパク質モジュールは、ヘテロ二量体化ドメインを形成しうる。このタ
イプのタンパク質対の例としては、上皮成長因子受容体または血小板由来成長因
子のようなチロシンリン酸化受容体およびＧＲＢ２のＳＨ２ドメイン等が挙げら
れる（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄａｌｙ，ｅｔ ａｌ，１９９２；Ｂｕｄａｙ
ａｎｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ，１９９３）。科学の全分野において、新規の二量体
化分子が活発に探索されており（Ｃｈｅｖｒａｙ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，１
９９２）、完全な人工分子の製造方法が現在開発されている（Ｚｈａｎｇ，Ｍｕ
ｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ，１９９９）。
【００６０】 好ましい組換えＴＣＲにおいては、天然のαおよびβＴＣＲ鎖における２つの
システイン残基間および天然のγおよびδ鎖間において形成される鎖内のジスル
フィド結合が欠けている。これは、例えば、二量体化ドメインをシステイン残基
上でＴＣＲ受容体鎖に融合させ、これらの残基を組換えタンパク質から遮断する
ことによって達成できる。他の例においては、一またはそれ以上のシステイン残
基が、ジスルフィド結合形成に関与しない他のアミノ酸残基で置換される。機能
的ＴＣＲのインビトロにおける折りたたみに有害かもしれないため、これらのシ
ステイン残基は取り入れなくてもよい。
【００６１】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体の、好適な再生された組換えＴＣＲのαおよび
β鎖またはγおよびδ鎖の再生は、適切な再生条件下においてインビトロで起こ
る。特殊な実施形態において、正しいコンホメーションを持つ組換えＴＣＲは、
尿素のような可溶化剤を含む再生バッファー中で可溶化ＴＣＲ鎖を再生すること
によって得られる。尿素は少なくとも０．１Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも２
．５Ｍまたは約５Ｍの濃度で存在することが好ましい。使用できる代わりの可溶
化剤は、グアニジンであり、０．１Ｍ〜８Ｍ、好ましくは少なくとも１Ｍまたは
少なくとも２．５Ｍの濃度で存在する。再生の前に、システイン残基の完全な還
元を確実にするため還元剤を使用することが好ましい。さらに、ＤＴＴやグアニ
ジンのような変性剤を必要に応じて使用できる。種々の変性剤および還元剤を再
生段階の前に使用することができる（例えば、尿素、β−メルカプトエタノール
）。例えばシステイン／システアミン酸化還元対、ＤＴＴまたはβ−メルカプト
エタノール／空気の酸素、および還元型および酸化型のシステイン等などの、代
わりの酸化還元対を、再生中に使用してもよい。
【００６２】 組換えＴＣＲ鎖は、ＴＣＲドメインと二量体ペプチドとの間に配置された可変
性リンカーを有することが好ましい。適切な可変性リンカーは、グリシンを含む
標準的なペプチドリンカーを含み、例えばグリシンまたはセリンを含むリンカー
が挙げられる。鎖内ジスルフィド結合を形成しているシステイン残基に近いＣ−
末端を切りとることが、αおよびβ鎖が細胞性ＴＣＲ中のこれらの残基を介して
近接しているため有益であると思われる。それゆえ、ヘテロ二量体化ドメインへ
ＴＣＲ鎖からのゆがみのない移行をするためには、相対的に短いリンカー配列の
みが必要とされる。リンカー配列はＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｇｌ
ｙが好適に使用される。しかしながら、リンカー配列は多様である。例えば、リ
ンカーは完全に省略されるか、または一つの残基に減じられ、この場合グリシン
残基が好ましい。α−β鎖の安定性を低下させ、ＴＣＲの細胞外ドメインから二
量体化ペプチドを分離させるプロテアーゼの攻撃から保護するのであれば、より
長い変種のリンカーを可溶性ＴＣＲに用いることもできる。
【００６３】 可溶性組換えＴＣＲは必ずしもα−βＴＣＲではない。発生の初期のみに発現
する不変のα鎖（Ｐｒｅ−ＴＣＲ）を含むＴＣＲ分子に加えて、γ−δ、α−δ
およびγ−βＴＣＲ分子も含まれる。γ−δＴ細胞受容体を発現する細胞と逆に
、Ｐｒｅ−ＴＣＲはα−βＴ細胞受容体を発現する細胞系統を規定する（概要は
、Ａｉｆａｎｔｉｓ，Ａｚｏｇｕｉ，ｅｔ ａｌ，１９９８；ｖｏｎ Ｂｏｅｈ
ｍｅｒ，Ａｉｆａｎｔｉｓ，ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｗｕｒｃｈ，Ｂｉｒｏ，ｅ
ｔ ａｌ，１９９８）参照）。Ｐｒｅ−ＴＣＲは、不変のＰｒｅ−ＴＣＲα鎖と
対をなすＴＣＲβ鎖と共に発現され（Ｓａｉｎｔ Ｒｕｆ，Ｕｎｇｅｗｉｓｓ，
ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９９５
）、細胞にα−βＴ細胞結合をさせるようである。Ｐｒｅ−ＴＣＲの役割は、そ
れゆえに胸腺発達の間、重要であると考えられている（Ｒａｍｉｒｏ，Ｔｒｉｇ
ｕｅｒｏｓ，ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【００６４】 組換えＴＣＲの標準的な改変を、適切になすことができる。例えば、誤った鎖
間または鎖内のペアリングを防ぐために、β鎖の定常ドメイン中の不対システイ
ン残基を改変することが含まれる。
【００６５】 シグナルペプチドを削除することができる。なぜなら成熟受容体中で、または
そのリガンド結合能力に対してなんの用途もなく、実際、ＴＣＲがリガンドを認
識することを妨害するからである。多くの場合において、成熟ＴＣＲ鎖からシグ
ナルペプチドが除去された開裂部位を想定できるが、実験的には決定されていな
い。わずかの、例えば１０程度まで、Ｎ−末端のアミノ酸が長いまたは短い発現
ＴＣＲ鎖を製造することは、可溶性ＴＣＲの機能において重要ではないであろう
。オリジナルのタンパク質配列に存在しないある種の付加を加えることができる
。例えば、ＴＣＲの抗原結合部位の正しい構造および折りたたみの妨害をしない
のであれば、ＴＣＲ鎖の精製を補助する短い標識配列を付加できる。
【００６６】 Ｅ．ｃｏｌｉでの発現において、翻訳を開始させるためメチオニン残基を、予
想される成熟タンパク質配列のＮ−末端開始点に付加することができる。
【００６７】 ＴＣＲ鎖の可変ドメインにおけるすべての残基が、抗原の特異性および機能性
に重要というわけではない。従って、かなりの数の変異を、抗原の特異性および
機能性に影響を与えることなく、この領域にローディングすることができる。
【００６８】 一方、ペプチド抗原またはＨＬＡ重鎖ポリペプチド、即ち、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ
領域を構成する残基、への接触形成に関与するある種の残基を、リガンドに対す
るＴＣＲの親和性を増強する残基で置換することもできる。ペプチド−リガンド
に対するほとんどのＴＣＲの親和性が低いとすれば、そのような置換は可溶性Ｔ
ＣＲの特異性および機能性の潜在能力を増強させるために非常に有用である。こ
の例においては、ペプチド−ＭＨＣリガンドに対する可溶性ＴＣＲの親和性が決
定される。そのような測定は、ＴＣＲにおいてローディングされる変異の効果を
分析するために使用されうるものであり、従って、ＴＣＲの活性を増強させる置
換を有するＴＣＲの同定のためにも使用されうる。
【００６９】 抗原特異性および機能性のためには、ＴＣＲ鎖の定常ドメインの全ての残基が
必須なわけではない。従って、かなりの変異を抗原特異性に影響を及ぼすこの領
域にローディングすることができる。以下の実施例１７においては、ＴＣＲβ鎖
の定常ドメインにおける２つのアミノ酸を置換しても、ＴＣＲのＨＬＡ−ペプチ
ドリガンドへの結合能力に関しては検出される結果がないことを示している。
【００７０】 ＴＣＲβ鎖は細胞または天然のＴＣＲにおいて対をなしていないシステイン残
基を含む。この残基の変異によりインビトロでの可溶性ＴＣＲの再生効率が増大
する。このシステイン残基をセリンまたはアラニンで置換することは、インビト
ロでの再生効率に対して、著しく正の影響を有する。他のアミノ酸で置換するこ
とで、同様の正の影響、またはより大きな影響を得られる可能性もある。
【００７１】 上述したように、天然のＴＣＲにおいて鎖間ジスルフィド結合を形成するシス
テイン残基は、再生における問題を避けるために存在しないことが好ましい。し
かしながら、これらのシステイン残基配列はＴＣＲにおいては天然の設計であり
、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパードメインに対してこの配列が機
能的であることが示されており（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、これ
らのシステイン残基は、ＴＣＲが再生されるのであれば、含まれていても構わな
い。
【００７２】 定常ドメインはペプチド−ＭＨＣリガンドとの接触に直接関与しないため、Ｃ
−末端切りとり部位を、機能性を失うことなく相当変更することができる。例え
ば、定常ドメインが完全に削除された機能性を有する可溶性ＴＣＲを生成するこ
とも可能であろう。原理的には、ポリペプチドがより短いほど、可変領域または
可変領域と定常領域のごく短いフラグメントのみからなる可溶性ＴＣＲの発現お
よび折りたたみは容易である。しかしながら、この方策は好適ではない。それは
、２つの鎖の加工されたＣ−末端の距離がいくらか離れるので、ヘテロ二量体化
ドメインにより、α−β鎖対形成に付加的な安定性を供与することが複雑化し、
長いリンカー配列が必要となるからである。鎖間ジスルフィド結合を形成するシ
ステイン部位のすぐ前のヘテロ二量体化ドメインを融合する利点は、αおよびβ
鎖が細胞レセプターにおいて近接して保持されることであり、これは望ましいこ
とである。このように、この部位で融合することにより、ＴＣＲ構造にねじれが
加えられないようになる。
【００７３】 ここで好ましいとされているものよりも大きい定常ドメインのフラグメントを
有する機能的な可溶性ＴＣＲを生成することも可能である。つまり、これらの定
常ドメインは鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインのすぐ前で切りとられ
る必要がない。例えば、膜貫通ドメインを除く定常ドメイン全体が含まれうる。
この場合には、細胞ＴＣＲにおいて鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン
残基を発達させることが有益であろう。
【００７４】 ヘテロ二量体化ドメインによる鎖間安定性の補助に加えて、鎖間ジスルフィド
結合を形成するシステイン残基の結合を用いることもできる。一つの可能性とし
ては、通常のジスルフィド結合を生じさせるために、システイン残基を除去せず
に、鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基に近接するαまたはβ鎖を
切りとることである。他の可能性は、αまたはβ鎖の膜貫通ドメインのみを切除
することである。αおよびβ鎖のより短いフラグメントが発現した場合は、２つ
の鎖の折りたたみにより近接するように残基が運ばれるアミノ酸部位における置
換として加工することが可能であり、ジスルフィド結合に関して好適である。
【００７５】 ＴＣＲの精製は種々の多様な方法を用いて遂行することができる。イオン交換
の代用方法を用いることもでき、ゲルろ過クロマトグラフィーやアフィニティー
クロマトグラフィーなどの他のタンパク質精製法を用いることもできる。
【００７６】 組換えＴＣＲを生成する方法においては、シャペロンタンパク質などの他のタ
ンパク質構成要素を再生混合物に添加することによって、折りたたみ効率を増大
させることができる。固定化ミニシャペロンを用い、タンパク質にカラムを通過
させることによって、再生の改善を遂行できる（Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，Ｇｏｌ
ｂｉｋ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，Ｇａｒｃｉａ ｅｔ
ａｌ．１９９９）。
【００７７】 具体例として記載した方法に加えて、ＴＣＲをビオチン化する代用方法も可能
である。例えば、化学的ビオチン化を用いることができる。ビオチン標識配列に
おいてはある種のアミノ酸が必須であるが、他のビオチン化標識を用いることも
可能である（Ｓｃｈａｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９３）。
【００７８】 ビオチン化にあたり使用される混合物は多岐に渡る。酵素は、Ｍｇ−ＡＴＰお
よび低いイオン強度を必要とするが、これらの条件の双方は多様であり、例えば
高いイオン強度を用いて、反応時間を長くすることが可能である。ＴＣＲの多量
体を形成するために、アビジンまたはストレプトアビジン以外の分子を用いるこ
とも可能である。多価形態でビオチンを結合する分子であれば、いかなるものも
好適である。代わりに、完全に異なる結合を考案してもよい（キレート化された
ニッケルイオンに対するポリ−ヒスチジン標識のようなもの（Ｑｕｉａｇｅｎ
Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇｕｉｄｅ １９９９，Ｃｈａｐｔｅｒ ３ “Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ａｓｓａｙ”ｐ．３５−３７）。標識は、潜在的なペプチド−ＭＨＣ複
合体との相互作用における立体障害量を最低限にするために、タンパク質のＣ−
末端方向に配置されることが好ましい。
【００７９】 例えば診断目的に関して、多価ＴＣＲ複合体を検出できるように、検出可能な
標識を含ませることができる。好適な標識は、各種公知の検出可能な標識から選
択することができる。好適な標識の類型としては、蛍光、感光性、酵素、エピト
ープ、磁気性、および、微粒子（例えば金）の標識が含まれる。インビトロにお
ける使用に際しては、ＦＩＴＣなどのような蛍光標識が特に好ましい。インビボ
における使用に際しては、柔軟な組織を貫通する放射線を放出する放射性核種の
ような、哺乳類に投与した後に外部から画像化するのに適した標識が好ましい。
標識は多価ＴＣＲ複合体に、好適な全ての部位で付着または組み込むことができ
る。リポソームの場合は、膜に付着したり、組み込んだり、膜の内部に取り込ん
だりすることができる。微粒子またはビーズの場合は、標識は微粒子やビーズそ
のものに設けることができ、例えばＴ細胞分子においては、外部に付着すること
ができる。好都合なことに、標識は、Ｔ細胞レセプター複合体が形成される多価
リンカー分子に付着することができる。形成された四量体ＴＣＲにおいては、ビ
オチン化されたヘテロ二量体、蛍光ストレプトアビジン（商業的に入手可能）を
検出可能な標識を生成するために用いることができる。蛍光標識が付された四量
体は、ＦＡＣＳ分析における使用、例えばＴＣＲが特異性を有するペプチドを運
搬する抗原提示細胞を検出するために使用する際に好適であろう。
【００８０】 多価ＴＣＲ複合体を検出することができる他の方法としては、ＴＣＲ−特異性
抗体、特にモノクローナル抗体を用いるものがある。βＦｌ、αＦｌのような商
業的に入手可能なアンチＴＣＲ抗体が多種存在し、それらはβおよびα鎖の定常
領域をそれぞれ認識する。
【００８１】 治療に応用するにあたっては、治療剤が本発明に係る多価ＴＣＲ複合体に付着
されるまたは組み込まれる。好ましい実施形態としては、治療用途に関する多価
ＴＣＲ複合体はＴ細胞レセプターで表面が覆われたリポソームであり、治療剤は
、リポソーム内部に取り込まれる。Ｔ細胞レセプターの特異性により、リポソー
ムに含有された薬剤を腫瘍やウイルス感染した細胞のような所望の標的部位に局
在化させることができる。これは、種々の状況、特に腫瘍に対して有用である。
全部の腫瘍細胞が抗原を提示する訳ではないため、全部の腫瘍細胞が免疫系で検
出されないためである。多価ＴＣＲ複合体によって、化合物は、局所的にその効
果を発揮するように運搬されうるが、結合している細胞にのみではない。従って
、ある特定の方策として、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を有する多価ＴＣＲ
複合体に会合または結合した抗腫瘍分子を想定できる。
【００８２】 治療剤としては、例えば、細胞を殺すために用いられる有毒な成分などや、イ
ンターロイキンやサイトカインなどの免疫を促進させる剤が挙げられる。種々の
トキシンを該使用のために用いることができ、例えば、放射性化合物、酵素（例
えばペルフォリン）、化学療法化合物（例えばシスプラチン）が挙げられる。
【００８３】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体の一実施例としては、３つのＴＣＲ分子と、１
つのペルオキシダーゼ分子を有する四量体が挙げられる。これは、３：１のモル
比でＴＣＲと酵素とを混合し、四量体を生成させ、正しい分子比からならない複
合体から所望の多量体を単離することによって得られる。立体障害により分子の
所望する機能が劣らない、または著しく劣る訳でないならば、混合される分子は
いかなる分子の組み合わせをも含むことができる。混合される四量体においては
、立体障害が生じにくいとの理由により、ストレプトアビジン分子の結合部位の
配置が好適である。
【００８４】 本発明の目的は、同一の特異性を有する複数のＴ細胞受容体を有する多価ＴＣ
Ｒ複合体を提供することであるが、異なる特異性を有する複数のＴ細胞受容体が
存在する可能性を除外するものではない。実際、同時に２またはそれ以上の異な
るＭＨＣ−ペプチド複合体を標的化する可能性などのように、２またはそれ以上
の異なる特異性を有するＴ細胞受容体も有用かもしれない。同一の外来抗原はＨ
ＬＡのタイプによって別様に加工され、提示されうるため、このようなものは例
えば、異なるＨＬＡのタイプを有する別の個体における標的抗原の検出を確実に
するために有用でありうる。
【００８５】 同様に、Ｔ細胞受容体の結合能力と異なる結合能力を有する分子を含ませるこ
とも想定される。そのような分子は、多価ＴＣＲ複合体が標的に到達してしまえ
ば、標的能力を改善したり、有用な機能を発揮するかもしれない。有用な修飾分
子の例としては、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣ−ペプチド複合体の認識を助長する
ＣＤ８や、免疫調節効果を有する受容体などが含まれる。
【００８６】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体において、好適なＭＨＣ−ペプチド標的の例と
しては、ＨＴＬＶ−１エピトープなどのウイルス性エピトープ（例えば、ＨＬＡ
−Ａ２、ＨＴＬＶ−１によって制限されるＴａｘペプチドは白血病に関連する）
、ＨＩＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＣＭＶエピトープ、メラノーマエピト
ープ、および他の腫瘍特異的なエピトープ、並びに、例えばリウマチ性関節炎な
どの自己免疫疾病と関連するエピトープなどが含まれるがこれらに限定されるも
のではない。
【００８７】 より詳しくは、本発明に係るＴ細胞受容体で表面が覆われたリポソームは（「
人工Ｔ細胞」としても記載される）、以下のように構成することができる。
【００８８】 「人工Ｔ細胞」の製造 リポゾームの製造に関しては、いくつかの方法がある。最も簡単な方法として
は、乾燥リン脂質膜を、過量の溶媒の入っている丸底フラスコ中に置き、穏やか
にまたは激しく振盪する方法がある（Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ，１９６５）
。他の方法としては、多重膜小胞（ＭＬＶｓ）の超音波処理（Ｈｕａｎｇ，１９
６９）、フレンチプレスを介したＭＬＶの懸濁（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚｔ，ｅｔ
ａｌ，１９７９）、または脂質の界面活性剤可溶化が含まれる。界面活性剤は、
透析、クロマトグラフィー、吸着、限外ろ過、または遠心分離により除去するこ
とができる（Ｂｒｕｎｎｅｒ，ｅｔ ａｌ，１９７６）。
【００８９】 通常は改変された脂質を介してリポゾームの表面に会合しているタンパク質に
関していくつかの技術が記載されている。このような方法のひとつは、ビオチン
化脂質を用いることである。ここでは、例えばアビジン、ストレプトアビジンま
たはエクストラアビジンを介してビオチン化脂質に結合し得るビオチン化Ｔ細胞
受容体を製造する方法を説明する。他の結合方法は、抗体をリポゾームへ付着さ
せるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いており（Ｈａｎｓｅｎ，ｅ
ｔ ａｌ，１９９５）、Ｓ−スクシンイミジル−Ｓ−チオアセテート（ＳＡＴＡ
）の使用も説明されている（Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ，１９９８）。
【００９０】 これらの技術により、２０〜１００ｎｍ範囲の大きさをもつ小さい単一層小胞
が製造される。安定性の問題、及び、より広い範囲の材料の取り込みを可能にす
るために、より大きい単一層小胞の調製方法が開発されてきた。これらには、デ
ハイドレーション−レハイドレーションリポゾーム（Ｔａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｇ
ｏｒｉａｄｉｓ，ｅｔ ａｌ，１９９０）、逆相エバポレーション（Ｓｚｏｋａ
ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ，１９７８）、または
凍結−融解による吸い出し（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，１９８５）、が含まれる
。これらの方法を用いて、６５〜８０％もの封入効率が達成される。
【００９１】 見出された当初は、リポゾームは不安定であったが、近年、より高性能な形態
脂質および誘導された脂質を用いることによってこのような問題は克服されてき
た（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９４を参照）。例えばドキソルビシン（Ａｈ
ｍａｄ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９２；Ａｈｍａｄ，ｅｔ ａｌ
，１９９３）、タンパク質／抗原（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｃｏｈ
ｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９１）またはインスリン（Ｅｄｅｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ
，１９９６）のような薬剤のパッケージングは、確立された技術とみなされてい
る。
【００９２】 リポゾームに結合したＴＣＲ多量体の利点 この技術の一般的な利点は、以下の点にまとめられる。
【００９３】 リポゾームは廉価で、製造が容易であり、標準的な技術をもちいて容易にロー
ディングでき、多くの治療化合物を容易にローディングできる。ビオチン化脂質
を含むリポゾームを製造するための剤は、例えば、米国のアバンティ ポーラー
リピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）
から容易に入手できる。
【００９４】 リポゾームおよびタンパク質は生体分解性である。
【００９５】 ＴＣＲおよび脂質は、非免疫抗原性であり、それゆえに二次免疫応答を起こさ
ない。
【００９６】 「人工Ｔ細胞」の利点 抗原提示細胞を捕獲し、この目的でこれらを使用し、このような細胞へ化合物
を輸送する能力において、リポゾームに結合したＴＣＲおよびリポゾーム−結合
ＴＣＲ多量体は、ＴＣＲ四量体を超えるいくつかの利点を持つことが予測される
。これらは以下の点にまとめられる。
【００９７】 リポゾームに結合したＴＣＲの自由な側方運動により、ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプ
チドの接触を妨害し得るいかなる立体障害をも防ぐことができる。実際、リポゾ
ームの脂質に結合したＴＣＲの側方運動により、Ｔ細胞膜でのその運動能力が記
憶される。
【００９８】 リポゾームの表面での可変性により、実際の細胞膜の可変性が記憶され、四量
体または他の単純な複合体で得られるものよりも、潜在的に優れた接触表面を得
ることができる。
【００９９】 かなり多くのＴＣＲが、リポゾームに結合でき、それゆえに高い結合力を有す
る結合が保証される。ＴＣＲ四量体を用いると、結合は最大４つのＴＣＲ／ＭＨ
Ｃ−ペプチド接触によって得られる十分な表面結合力に依るものとなる。
【０１００】 インビボおよびインビトロ両方での使用について、リポゾームに結合したＴＣ
Ｒは、ＴＣＲの分解による機能の喪失を起こしにくい。これは四量体または他の
単純なＴＣＲ複合体に比べて、リポゾームに結合し得るＴＣＲがかなり多いとい
うことによる。
【０１０１】 ＴＣＲの脂質における濃度は、異なる比率のビオチン化および非ビオチン化脂
質を混合することによって制御することができる。同様に、例えばＰＥＧ−誘導
（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｈａｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ，１９９５）
またはＳＡＴＡ−誘導（Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ，１９９８）脂質の
ようなタンパク質へ結合するのに役立つ他の改変を有する脂質を、異なる比率で
混合することができる。これにより、抗原提示細胞に対する相互作用の強さを、
異なる親和性を有するＴＣＲや、抗原提示細胞における優勢なペプチドエピトー
プに適合させることができる。
【０１０２】 多数の分子がリポゾームに結合する潜在能力により、一つ以上のＴＣＲを用い
て多価ＭＨＣ−ペプチド特異性を有するリポゾームを創造する可能性が開かれる
。例えば、同じ病気に関する異なるエピトープに特異的な２またはそれ以上のＴ
ＣＲを、その病気に冒された細胞を検出するために複数の特異性を与えるリポゾ
ーム上に結合させる、ということが想定できる。
【０１０３】 同様に、ＴＣＲは、抗原提示細胞付近で他の望ましい機能を働かせうる他の分
子またはタンパク質と共に混合され得る。例えば、サイトカインもしくはサイト
カイン受容体、特異的抗体、超抗原、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の
ような補受容体、またはペプチドは、このような状況において有用な特性を持ち
うる。この応用は、ある種の抗原提示細胞近辺に剤を局在化することに関して、
非常に広い潜在力を持っている。
【０１０４】 多価ＴＣＲ複合体で標的化されうる薬剤および病気の実施例 多くの病気の治療は、多価ＴＣＲ複合体の特異性により薬剤を局在化すること
によって潜在的に増強することができ、リポゾームに結合したＴＣＲの使用は特
に有効であろう。
【０１０５】 例えばＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶのような、そのための薬剤が存在する
ウイルス性の病気は、感染細胞付近で放出される薬剤が有益であろう。ガンにお
いては、腫瘍または転移の付近での局在化により、毒または免疫増強薬の効果を
増強させることができる。自己免疫病においては、免疫抑制剤が遅々と放出され
、より長い時間に渡り局地的な効果をもつ一方、免疫容量全体への影響は最小限
である。移植の拒否反応を防ぐために、免疫抑制剤の効果を同じ方法で最大限利
用することができる。ワクチンの運搬に関しては、ワクチン抗原は専門化された
抗原提示細胞付近で局在化され、このようにして抗原の有効性を増強することが
できる。この方法はまた、画像化の目的にも応用することができる。
【０１０６】 本発明の各観点の好ましい特徴は、必要であれば変更を加えて他の各観点に合
わせることができる。ここで言及した先行技術文献は、法律によって許容される
最大限の範囲を組み入れている。
【０１０７】 さらに本発明は、以下の実施例において説明されるが、これらはいかなる方法
においても本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０８】 参照は、以下に添付された図面に対して作成された。
【０１０９】 実施例 以下の実施例においては、以下に示す一般的な方法および材料が使用された。
【０１１０】 材料 制限酵素（ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、Ｂｓｕ３６I、ＸｍａI）は
ニューイングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）より得た。
【０１１１】 トリスｐＨ８．１は、いずれもＵＳＢより得られたトリス塩基（Ｔｒｉｓ ｂ
ａｓｅ）およびトリスＨＣｌの等部を用いて２Ｍストック溶液として調製した。
【０１１２】 ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）は０．５Ｍストック溶液として調製し、ｐＨは５Ｍ
ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を用いて８．０に調整した。
【０１１３】 酸化型および還元型グルタチオンは、シグマより得た。
【０１１４】 シスタミンおよびシステアミンは、シグマより得た。
【０１１５】 塩化ナトリウムはＵＳＢより得、４Ｍストック溶液として調製した。
【０１１６】 プラスミド精製用のミニプレップキットは、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より
得た。
【０１１７】 ＰＣＲ精製キットは、キアゲンより得た。
【０１１８】 ＤＴＴは、シグマより得た。
【０１１９】 グアニジンは、フルカ（Ｆｌｕｋａ）より得た。
【０１２０】 尿素は、シグマより得た。
【０１２１】 ＲＰＭＩ培地は、シグマより得た。
【０１２２】 ＰＢＳは、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）より得た錠剤から調製した。
【０１２３】 グリセロールはＢＤＨより得た。
【０１２４】 一般的な方法 細菌用培地（ＴＹＰ培地）は以下のようにして調製した。
【０１２５】 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）１６０ｇ、トリプトン（ディフコ）１６０ｇ、Ｎａ
Ｃｌ（ＵＳＢ）５０ｇおよびＫ2ＨＰＯ4（ＢＤＨ）２５ｇを、２リットルの脱塩
水に溶解させた。この溶液の２００ｍｌを分取したものを１０×２Ｌ円錐状フラ
スコ中に入れ、１リットルになるまで脱塩水８００ｍｌを加えて調製した。フラ
スコを４層のアルミニウムホイルで覆い、標識して加圧滅菌した。冷却後、その
フラスコを使用前に直射日光を避けて室温で保存した。
【０１２６】 タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅクーマシー結合アッセイおよび標準タンパク
質としてＢＳＡを用いて測定した。簡潔にいえば、水１ｍｌ中における０〜２５
μｇＢＳＡ標準を、４ｍｌプラスチックキュベット中に２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（
Ｐｉｅｒｃｅ）のストック溶液を調製した。約１０μｇの未知のタンパク質を、
同じ方法にて水で１ｍｌまで調製した。Ｐｉｅｒｃｅクーマシー剤１ｍｌをそれ
ぞれのキュベットに加え、その内容物を完全に混合した。ベックマンＤＵ−５３
０ＵＶスペクトロフォトメーターを用いて、５９５ｎｍで１５分以内、光学密度
を測定した。ＢＳＡ標準から得られた結果においては、線形回帰が観察され（線
形は、ＢＳＡ２５μｇまで良好であった）、未知タンパク質濃度はこれらの結果
を用いて内挿することによって推定された。
【０１２７】 ゲルろ過クロマトグラフィーを、コンピュータコントローラを備えたファルマ
シアＦＰＬＣシステムを用いて行った。タンパク質溶出は、２８０ｎｍの波長に
おける吸収を測定するＵＶ−ＭIIシステムを用いて観察された。小さいスケール
の分離では、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＨＲ１０／３０カラ
ムが用いられ、サンプルは１ｍｌループを用いてローディングした。流出する前
にＰＢＳ３０ｍｌでカラムを平衡化し、サンプルを０．５ｍｌ／ｍｉｎで流出さ
せて１ｍｌのフラクションを収集した。大きいスケールの分離では、スーパーデ
ックス７５または２００ＰＧ２６／６０カラムが１０ｍｌスーパーループととも
に用いられた。この場合、５または１０ｍｌのサンプルが収集され、カラムは４
ｍｌ／ｍｉｎで流出させた。すべての分離は室温で行われた。
【０１２８】 イオン交換クロマトグラフィーを、バイオキャド スプリント システム（Ｂ
ｉｏｃａｄ Ｓｐｒｉｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（パーキン−エルマー）を用いて行
った。陽イオン交換では、２０ＨＳまたは５０ＨＳカラムが用いられた。陰イオ
ン交換では、１０ＨＱ、２０ＨＱ、または５０ＨＱカラムが用いられた。カラム
は推奨されるバッファーを６−ウェイミキサーに取り付けて使用された。少量サ
ンプル（５〜２５ｍｌ）は５ｍｌの注入ループを用いて注入した。大量サンプル
（＞１００ｍｌ）はバッファーラインのいずれか一つを用いて注入した。カラム
使用において、溶出相の間に１ｍｌの量を収集した。タンパク質溶出は、２８０
ｎｍにおけるインラインの吸収によって測定された。
【０１２９】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、バイオラッ
ド ミニ−プロテインIIゲルセットを用いて行った。ゲルは以下の方法で実施す
る前に流入した。ゲル板の組み立てが準備され、漏洩について調べた。次に以下
の混合物を調製した：１２％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％アク
リルアミド／０．８％ビスアクリルアミドストック溶液（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）由来）、０．３７５ＭトリスｐＨ８．８（同じｐＨの１
．５Ｍストック由来）、０．１％ＳＤＳ（１０％ＳＤＳストック溶液由来）、０
．０５％過硫酸アンモニウム（４℃で保存された、同様のものの１０％ストック
溶液由来）、および０．１％ＴＥＭＥＤ（シグマ）。この混合物を迅速にゲル板
組み立て体に注ぎいれ、水−飽和ブタノールを上部に重層して平坦な上部表面を
確かめた。ゲルをセットし終わった後（最低でも１０〜１５分）、スタッキング
ゲルを以下のように混合した。４％アクリルアミド（前出のストックより）、０
．１２５ＭトリスｐＨ６．８（同じｐＨの０．５Ｍストックより）０．１％ＳＤ
Ｓ、０．０５％過硫酸アンモニウム、および０．２％ＴＥＭＥＤ。ブタノールを
分解ゲルの表面からティッシュで吸収することによって除去し、スタッキングゲ
ル混合物を分解ゲルの上に注ぎいれた。ゲルコームを、空気泡がゲル中に入らな
いように注意しながら即座に挿入し、スタッキングゲルを最低５分固めさせた。
【０１３０】 次にそのゲルをゲル装置に取り付け、ランニングバッファー（３ｇ／ｌ トリ
ス−塩基、１４．４ｇ／ｌ グリシン、１ｇ／ｌ ＳＤＳ（１０×濃縮ストック
溶液を希釈））を、陽極および陰極の装置に注ぎいれた。ゲルコームを除去した
後、ウェルをランニングバッファーで洗浄し、残留したアクリルアミド混合物が
ウェルの底部で固まるのを防いだ。サンプルはその一部と、以下の混合物とを１
：１で混合することによって調製した：４％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ トリスｐＨ
６．８、２０％グリセロール、１０％ β−メルカプトエタノール、１％ ブロ
モフェノールブルー（シグマ）。次にサンプルは９５℃で２分加熱され、スタッ
キングゲルのウェルに２５μｌまでローディングする前に、冷却した。通常、良
好な染色およびゲルのランニングを確かめるために、約１〜１０μｇのタンパク
質をローディングした。ローディング後、そのゲルを２００Ｖの定電圧で、約４
０分間、またはブロモフェノールブルー染料がゲルの端から約５ｍｍになるまで
泳動した。
【０１３１】 電気泳動が完了した後、そのゲルを装置から取り外し、１０％酢酸、４０％メ
タノール、５０％水中のクーマシーＲ−２５０（シグマ）の０．１％溶液へ慎重
に浸した。次に、ゲルを少なくとも３０分穏やかに攪拌し、その後、１０％酢酸
、４０％メタノール、５０％水中のクーマシーＲ−２５０（シグマ）を数回換え
てバックグラウンドが透明になるまで脱色した。次にゲルを水中に保存し、ライ
トボックス、デジタルカメラおよび感熱式プリンターを備えたＵＶＰゲルドキュ
メンティションシステムを用いて記録した。
【０１３２】 実施例１−組換え可溶性ＴＣＲ ヘテロ二量体ＴＣＲ分子の組換え可溶性形態を、図１で概説するように製造し
た。それぞれの鎖は膜−遠位、および−近位免疫グロブリンドメインを含み、こ
れらは短い可変性リンカーを介して、ヘテロ二量体の安定性を補助している高次
コイルに融合している。
【０１３３】 ＴＣＲ定常ドメインは、インビボで鎖同士の（ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ）ジスル
フィド結合を形成するシステイン残基の前で切りとられた。その結果、非共有結
合の四次的な接触により二つの鎖は対を形成し、これは図２ｂにおいて確認され
る。Ｆｏｓ−Ｊｕｎジッパーペプチドへテロ二量体も、使用されるリンカーに対
してＮ−末端のすぐ近くに鎖同士のジスルフィドを形成することができるように
（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、互いに関連する二つの鎖の配列が最
適であることが予期された。融合タンパク質は、それぞれの構造を壊すことを防
ぐために、分離した成分のそれぞれと適合する方法で結合されることが必要であ
る。
【０１３４】 ＨＬＡ−Ａ２におけるインフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６エピ
トープに特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードするｃＤＮＡは、以
前に述べられているような固定されたＰＣＲ（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ，１９９１
）によって、Ｖβ１７＋ヒトＣＬＴクローン（ＪＭ２２）から得た。
【０１３５】 アルファおよびベータＴＣＲ−ジッパー構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） ｐＪ
Ｍ２２α−ＪｕｎおよびｐＪＭ２２β−Ｆｏｓは、標準的なＰＣＲ技術を用いて
それぞれの鎖の可変および定常ドメインを増幅し、真核性転写因子 Ｊｕｎおよ
びＦｏｓそれぞれから生産物をロイシンジッパードメインにスプライシングする
ことによって、それぞれ構築した（図１参照）。これら４０のアミノ酸長さの配
列は、共有結合的な鎖同士の結合を必要としないで、合成ペプチドから折りたた
まれるときに特異的なヘテロ二量体化をする（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９
８９）。
【０１３６】 プライマーは、３’の近くから開始コドンにおいて高いＡＴ含量を有するよう
に設計され（ｍＲＮＡ二次構造を不安定化させるために）、さらに発現を最小化
するため、Ｅ．ｃｏｌｉコドン選択を用いた（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ）。再生の際
の誤ったジスルフィド結合の防止を確認するため、ＴＣＲベータ定常ドメインに
おける余分なシステインはセリンに変異された。
【０１３７】 ＤＮＡ構造物は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＧＭＴ７に別々に結合させた。
プラスミドダイジェストおよびＤＮＡ配列により、構造が正しいことが確認され
た。
【０１３８】 詳しくは、以下の方法を用いた。
【０１３９】 ＴＣＲジッパー鎖の発現および変性封入体の精製：ＧＦＧ０２０およびＧＦＧ
０２１、ＪＭ２２α−ＪｕｎおよびＪＭ２２−βＦｏｓをそれぞれ含むｐＧＭＴ
７発現プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳにそれぞれ形質転換さ
れ、アンピシリン耐性シングルコロニーを、ＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／
ｍｌ）培地で、ＯＤ600０．４まで３７℃で培養し、その後０．５ｍＭ ＩＰＴ
Ｇでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、ベックマンＪ−６Ｂを用い、
４０００ｒｐｍで３０分遠心分離することによって、細胞を収集した。細胞の沈
殿を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＮａＥＤ
ＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１０ｍＭ ＤＴＴを含み、ｐＨ８
．０であるバッファー中に再懸濁した。一晩の凍結−融解過程の後、再懸濁した
細胞を、標準の１２ｍｍ直径プローブを用いたミルソニックス（Ｍｉｌｓｏｎｉ
ｘ）ＸＬ２０２０で、１分間バーストで計１０分、超音波処理した。封入体の沈
殿は、ベックマンＪ２−２１遠心機で、１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離す
ることによって回収した。次に３種の界面活性剤の洗浄が行われ、細胞の破片や
細胞膜成分を除去した。その都度、その封入体沈殿はトリトンバッファー（５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５％トリトン−Ｘ１００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴ
Ｔ、ｐＨ８．０）で均質化し、その後ベックマンＪ２−２１遠心機で、１３００
０ｒｐｍ、１５分間遠心分離することによって沈殿化した。次に、界面活性剤お
よび塩は、以下のバッファー：５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＮａＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０で同様
の洗浄を行うことによって除去された。最終的に、ＪＭ２２−αＪｕｎおよびＪ
Ｍ２２−βＦｏｓ封入体沈殿が、それぞれ３〜４時間、４℃で、尿素溶液（５０
ｍＭ ＭＥＳ、８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．５
）中に溶解された。不溶性材料は、ベックマンＪ２−２１で、１３０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離することによって沈殿させ、その上清を１ｍｌずつ等分し、
−７０℃で保存した。尿素中に可溶化させた封入体は、ブラッドフォード ダイ
−バインディング アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｄｙｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａ
ｓｓａｙ）（バイオラッド）を用いて定量した。それぞれの鎖に対して、精製さ
れた封入体の約１００ｍｇの収量は、１リットルの培養液から得られたものであ
る。それぞれの封入体（ＪＭ２２α−Ｊｕｎ、ＪＭ２２β−Ｆｏｓ）は約２０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で尿素溶液中に可溶化しており、ゲル解析からこの形態で約９０
％の純度を持つことが推定された。
【０１４０】 ＴＣＲジッパー融合タンパク質の共再生（ｃｏ−ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ） 標準再生バッファー（１００ｍＭ トリス ｐＨ８．５、１Ｍ Ｌ−アルギニ
ン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチ
オン、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を用いた初期再生実験により、深刻なタンパク質
沈殿が生じたが、これはジッパードメインの存在に依存していた。この現象がジ
ッパー二量体化の解離定数より低い濃度で生じる（すなわち、ほとんどのジッパ
ーへリックスが単量体であることが期待される）という事実により、付加的な作
用力は誤った折りたたみの種を安定化している、ということが示唆された。もっ
とも考えられ得る説明は、初めにアルファ−ヘリカル ジッパードメインが完全
に折りたたまれ、それらの一時的なヘテロ二量体化により、より複雑な免疫グロ
ブリンドメインの部分的に折りたたまれた中間体の鎖同士の凝集が誘導される、
ということである。それゆえに再生バッファーは、５Ｍ尿素を含むように改変さ
れており、これは部分的に折りたたまれた免疫グロブリンドメイン間の疎水性相
互作用を妨げ、個々の鎖がヘテロ二量体化前に完全に折りたたまれるようにする
ためである。この過程は、沈殿の発生を防ぐには十分なものであり、正しく折り
たたまれたＴＣＲ−ジッパーへテロ二量体を以下の方法を用いて満足のいく収率
で回収することができる。
【０１４１】 ＴＣＲ−ジッパー鎖ＪＭ２２α−ＪｕｎおよびＪＭ２２β−Ｆｏｓの尿素−可
溶化ストックは、共再生を薄弱化することによって再生された。それぞれの可溶
化封入体鎖の約３０ｍｇ（すなわち１μモル）を凍結ストックから融解して、さ
らにＤＴＴ（４μモル／ｍｌ）のパルスを加えてシステイン残基の完全な還元を
確かめた。次にサンプルを混合し、その混合物は１５ｍｌのグアニジン溶液（６
Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に希釈
し、完全な鎖の変性を確認した。次に、完全に還元および変性したＴＣＲ−ジッ
パー鎖を含むグアニジン溶液を、以下の再生バッファー１リットル中に注入した
：１００ｍＭ トリスｐＨ８．５，４００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオン、５Ｍ 尿素、
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ。その溶液を２４時間放置した。次にその再生を２回、す
なわち第一に１０リットルの１００ｍＭ尿素で、第二に１０リットルの１００ｍ
Ｍ 尿素、１０ｍＭ トリスｐＨ８．０で透析を行った。再生および透析のステ
ップ両方は６〜８℃で行った。
【０１４２】 再生されたＴＣＲ−ジッパーの精製 透析された再生物をＰＯＲＯＳ １０ＨＱ分析用陰イオン交換カラム上に７回
の２００ｍｌ分取でローディングし、バイオキャド（ＢｉｏＣａｄ）ワークステ
ーション（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、カラム体
積の５０倍以上で、０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配で、結合したタンパク質
を溶出させることによって、ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚｉｐを、分解生産物や
不純物から分離した。非共有結合的に会合したヘテロ二量体は、約１００ｍＭ
ＮａＣｌで単一のピークとして溶出した。ピークフラクション（一般的に１００
〜３００μｇ／ｍｌの濃度でヘテロ二量体を含む）は４℃で保存され、その後貯
めて濃縮された。ヘテロ二量体の収率は約１５％である。
【０１４３】 再生ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚｉｐの特徴づけ 陰イオン交換により精製されたＪＭ２２ｚｉｐヘテロ二量体は、スーパーデッ
クス２００ゲルろ過サイジングカラム（ファルマシア）により約７０ｋＤａのタ
ンパク質として溶出する。ゲルろ過ステップを表面プラスモン共鳴結合解析の前
に行うことが特に重要であり、なぜなら正確な親和性および反応速度測定は単量
体の相互作用が生じることに依存しているからである。この方法において、分析
に用いられる可溶化タンパク質フラクションからより高いオーダーの凝集を排除
することができる。特に、凝集は人為的に遅い会合および解離速度定数が検出さ
れる原因となる。
【０１４４】 それぞれの鎖の酸化状態は、図２に示す還元／非還元ゲル解析によって考察さ
れた。ＳＤＳの存在下で、非共有結合的に会合したヘテロ二量体は、アルファお
よびベータ鎖に解離する。ＤＴＴがローディングバッファーに使用された場合、
その二つの鎖は３１ｋＤａマーカーの前後を泳動する。このような変性が起こら
ない場合、両方の鎖は単一種のように振舞うが、しかしそれぞれの移動度は増加
する。これはそれぞれの鎖が単一の、ジスルフィド結合種を形成したことを示し
ている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【０１４５】 再生受容体の抗体反応性は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００マシーン（ビアコア）で
、表面プラスモン共鳴を用いて試験された。ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚは、標
準的なアミンカップリング方法を用いて、ｐＨ５．５でデキストランマトリック
ス（ＣＭチップ）結合表面に固定された。ベータ鎖（Ｖβ１７）に特異的な様々
な領域の抗体は、固定された受容体に特異的に会合し、正確なコンホメーション
を伴う。
【０１４６】 安定性： アルファ−Ｊｕｎおよびベータ−Ｆｏｓロイシンジッパー融合体として発現し
た可溶化ＴＣＲは、数ヶ月を経過しても安定であり、したがってクラスＩ ＭＨ
Ｃによって提示された特異的抗原の検出に対して安定である。
【０１４７】 実施例２−ヒトＴＣＲ−ウイルス性ペプチドＭＨＣのカイネティクスおよび親
和性の研究 再生ＴＣＲ−ジッパーのペプチド−ＭＨＣ複合体への特異的結合： 表面プラスモン共鳴バイオセンサー（ビアコア）を、ＴＣＲ−ジッパー（ＪＭ
２２ｚｉｐ、ＨＬＡ−Ａ２インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ５８−６６
複合体に特異的）のそのペプチド−ＭＨＣリガンドに対する結合を分析するのに
用いた（図３を参照）。我々は単一のｐＭＨＣ複合体（以下に説明した）を製造
することによってこれを促進させた。その複合体は半方向性の方法でストレプト
アビジンで覆われた結合表面に固定することができ、可溶性Ｔ細胞受容体の４個
までの異なるｐＭＨＣ（別々のフローのセル上に固定された）への結合を効果的
に試験することができる。ＨＬＡ複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子
の正確なレベルを簡単に処理することができる。
【０１４８】 このような固定化複合体は、Ｔ細胞受容体（図３を参照）および補受容体ＣＤ
８ααの両方に結合することができ、これらの両方を可溶性相に注入することが
できる。ＴＣＲ−ジッパーの特異的結合は、低濃度（少なくとも４０μｇ／ｍｌ
）でさえ得られ、ＴＣＲジッパーが比較的安定であることを意味している。ＪＭ
２２ｚのｐＭＨＣ結合特性は、ＴＣＲが可溶性相または固定化相のいずれかにお
いて使用されている場合、質的および定量的に類似していることが観察される。
これは可溶性種の部分的な活性に対する重要なコントロールであり、さらに非ビ
オチン化ｐＭＨＣ複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同様な活性を持つこ
とを示唆している。
【０１４９】 化学的にビオチン化されたＨＬＡ複合体の調製 可溶性、組換えシングルペプチドクラスＩＨＬＡ複合体の製造方法は、既に説
明されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９２）。これらは、β−２
−ミクログロブリンドメインを化学的にビオチン化し、そのためストレプトアビ
ジン被覆結合チップに固定化することができ、表面プラスモン結合の研究に用い
られるＨＬＡ複合体を製造するために、改変されてきた。
【０１５０】 β−２−ミクログロブリンが発現し、４０ｍｇが標準再生バッファー（１００
ｍＭ トリス ｐＨ８．０、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ 還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオン、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ）中で再生し、これらは本質的に説明されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ
ａｌ，１９９２）。任意のゲルろ過ステップの後、タンパク質を０．１Ｍ ホ
ウ酸ナトリウム ｐＨ８．８で交換し、最終的に５〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した
。β−２−ミクログロブリンもまた、ブラッドフォードアッセイ（バイオラッド
）を用いて定量された。過量の５Ｍビオチンヒドロキシスクシンイミド（シグマ
）をＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍｌに調製されたストックから添加された。反応は
室温で１時間行われ、２０μｌの１Ｍ 塩化アンモニウム／ビオチンエステル２
５０μｇを用いて止めた。再生ＨＬＡ複合体は、スーパーデックス２００ ゲル
ろ過サイジングカラム（ファルマシア）を用いて、遊離ビオチンおよび遊離ビオ
チン化ベータ−２−ミクログロブリンから分離された。ストレプトアビジンは、
標準的なアミンカップリング方法によって固定化された。
【０１５１】 結論： このように、実施例１で説明したタンパク質再生方法によって、安定で、正確
に折りたたまれ、機能的な組換え受容体融合タンパク質を製造することができ、
これらは光学的バイオセンサーを用いる生物物理学的解析に適している。これに
より、ヒトＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用の詳細な親和性およびカイネティクスの解
析を実行するのに用いられる剤が提供された。Ｔ細胞補受容体ＭＨＣおよびＴＣ
Ｒ−ｐＭＨＣ相互作用のそれぞれにおける効果もまた研究されている。使用され
ている組換え技術は、原則的にはマウスおよびヒトＴＣＲの両方、クラスＩ制限
およびII制限に対して許容されるものであり、ＴＣＲの範囲で類似の解析が可能
となるであろう。これにより、例えば抗ウイルス応答におけるＴＣＲ親和性の期
間、優勢的に選択された受容体の特性、および、受容体の引き金（ｔｒｉｇｇｅ
ｒｉｎｇ）に関する速度論的な必要条件等の、様々な疑問を処理することができ
る。この方法はまた、結晶化の試みより前に、ＴＣＲのリガンド特異性を確かめ
る方法も提供しており、さらに他の細胞表面受容体の組換え体を製造するための
意味も含まれている。
【０１５２】 実施例３−可溶化Ｔ細胞受容体のビオチン化および四量体化 実施例１で説明した精製した可溶性ＴＣＲ２．５ｍｌ（〜０．２ｍｇ／ｍｌ）
は、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア）を用いてビオチン化反応バッファー（１
０ｍＭ トリス ｐＨ８．０、５ｍＭ ＮａＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）
へバッファー交換した。溶出物（３．５ｍｌ）は、セントリコン コンセントレ
ーター（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を用い、１０ｋＤａ分子量を分離して１ｍ
ｌに濃縮した。これにＡＴＰをストック（０．１ｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０に調節）
から加えて５ｍＭに調製した。プロテアーゼ阻害剤のカクテル（ロイペプチン、
ペプスタチンおよびＰＭＳＦ（０．１ｍｌ））を添加し、さらに１ｍＭビオチン
（０．２Ｍストックより加えられた）および５μｇ／ｍｌ酵素（０．５ｍｇ／ｍ
ｌストックより）を添加した。次に、この混合物を室温で一晩培養した。１０ｍ
Ｍ トリス ｐＨ８．０、５ｍＭ ＮａＣｌで透析することによって（２００倍
体積、２回の交換、４℃）、過量のビオチンを溶液から除去した。次にそのタン
パク質を、ニトロセルロース上にブロッティングし、続いて５％スキムミルク粉
末でブロッキングされ、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（バイオラッド）を
用いて検出することによって、結合したビオチンの存在を試験した。ビオチン化
可溶性ＴＣＲの四量体化は、エクストラアビジン−ＲＰＥまたはエクストラアビ
ジン−ＦＩＴＣ結合体（シグマ）のいずれかを用いた。ビオチン−可溶性ＴＣＲ
の濃度は、クーマシー結合タンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定し、０
．２２４ｍｇ／ｍｇの可溶性ＴＣＲに対するエクストラアビジン結合体の比率を
計算し、比率１：４でビオチン化ＴＣＲによるエクストラアビジンの飽和を遂行
した。このエクストラアビジン結合体は、全添加量の１０分の１を１分量として
、氷上で少なくとも１分量を１５分間隔で添加した（エクストラアビジンの飽和
を確認するため）。可溶性ＴＣＲ四量体は、暗所、４℃で保存された。その四量
体は数ヶ月を経過しても安定であった。
【０１５３】 −可溶性α／βＴＣＲの発現、再生および部位特異的ビオチン化 ａ）ＴＣＲαおよびβ鎖の製造 ヘテロ二量体ＴＣＲ分子の組換え可溶性形態は、図７の概説のように製造した
。それぞれの鎖は、膜−遠位および−近位免疫グロブリンドメインを含み、これ
らは短い可変性リンカーを介して、ヘテロ二量体の安定化を助ける高次コイルモ
チーフへ融合している。
【０１５４】 図４〜６および１１〜１４は、異なる特異性を持つＴＣＲからの様々なＴＣＲ
アルファおよびベータ鎖に関するＤＮＡコード配列およびそれに対応するアミノ
酸配列を示している。この実施例は、図４〜６の配列によって表現されたＴＣＲ
に焦点を当てているが、開示された方法は図１１〜１４で示されたＴＣＲを用い
て同様に実行することができる。
【０１５５】 ＴＣＲ定常ドメインは、インビボで鎖内のジスルフィド結合を形成するシステ
イン残基の前で切りとられる。その結果、非共有結合の四次的な接触により二つ
の鎖は対になる。Ｆｏｓ−Ｊｕｎジッパーペプチドへテロ二量体も、使用された
リンカーに対してＮ−末端に近接した鎖同士のジスルフィドを形成することがで
きることから（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、互いに関連する二つの
鎖の配列が最適であることが予想される。融合タンパク質は、それぞれの構造を
壊すことを防止するために、分離した各成分と適合する手法で結合されることが
必要である。
【０１５６】 ＨＬＡ−Ａ２におけるインフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６エピ
トープに特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードするｃＤＮＡは、以
前に述べられているような固定されたＰＣＲ（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ，１９９１
）によって、Ｖβ１７＋ヒトＣＬＴクローン（ＪＭ２２）から得られた。
【０１５７】 アルファおよびベータＴＣＲ−ジッパー構造、ｐＪＭ２２α−Ｊｕｎおよびｐ
ＪＭ２２β−Ｆｏｓは、標準的なＰＣＲ技術を用いてそれぞれの鎖の可変および
定常ドメインを増幅し、ロイシンジッパードメイン上で、真核性転写因子 Ｊｕ
ｎおよびＦｏｓそれぞれから生産物をスプライシングすることによって、それぞ
れ構築した。これら４０のアミノ酸長さの配列は、共有結合的な鎖内の結合を必
要とすることなく、合成ペプチドから折りたたまれるときに特異的なヘテロ二量
体化を示す（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）。
【０１５８】 プライマーは、３’の近くから開始コドンにおいて高いＡＴ含量を有するよう
に設計されており（ｍＲＮＡ二次構造を不安定化させるために）、さらにＥ．ｃ
ｏｌｉコドン選択を用いており、これは発現を最小化するためである（Ｇａｏ
ｅｔ ａｌ）。再生の間に誤ったジスルフィド結合が発生することを確認するた
めに、ＴＣＲベータ定常ドメインにおける余分なシステインはセリンに変異され
た。
【０１５９】 融合したＤＮＡおよびタンパク質の配列は、図４および５に示される。このＴ
ＣＲのβ鎖の部位特異的ビオチン化を可能にするために、いわゆる“ビオチン−
標識”をコードするＤＮＡ配列を、可溶性Ｖβ１７を発現する遺伝子の３’末端
に形成した。以下のＰＣＲプライマーは、このＤＮＡ構築を形成するために用い
られた。
【０１６０】
【化１】
【０１６１】 生じたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄIII（ニューイングラ
ンド バイオラブス）で消化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド
バイオラブス）を用いてベクターｐＧＭＴ７７にライゲーションした（Ｓｔｕｄ
ｉｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９０）。図６は、この構築において挿入されたＤＮＡ
配列および推測されるタンパク質配列を示す。
【０１６２】 ｂ）ＴＣＲ鎖の発現 ＨＬＡ−Ａ*０２０１によって提示されるインフルエンザウイルスマトリック
スペプチドに特異的なＴＣＲの発現および再生を以下のように行った。
【０１６３】 ＴＣＲαおよびβ鎖を、ＴＹＰ倍地（１．６％ バクト−トリプトン（ｂａｃ
ｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、１．６％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．
２５％ Ｋ2ＨＰＯ4）中で、ベクターｐＧＭＴ７の条件下において、それぞれＥ
．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳ中で発現させた。発現は対数期の中間で
、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導され、３〜５時間後、遠心分離によってバクテリ
アを収穫した。バクテリアの細胞を、“溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆ
ｅｒ）”（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ トリス ｐＨ８、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム
、１０％グリセロール）で再懸濁することによって溶解し、次に１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および２０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩを添加し、氷上で２０分間培養し、
１０×３０秒のバーストで、プローブソニケーター（ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａ
ｔｏｒ）を用いて超音波破砕した。次に、封入体中のタンパク質を、１５，００
０ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって封入体を沈殿させることにより、“トリ
トンバッファー”（０．５％ トリトンＸ−１００，５０ｍＭ トリス ｐＨ８
，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％アジ化ナトリウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２
ｍＭ ＤＴＴ）で数回（通常３回）洗浄して、ダンス型ホモジナイザーでそれら
を再懸濁することによって精製した。５０ｍＭ トリス ｐＨ８、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴの溶液で一回洗浄することによ
り標品から界面活性剤を除き、そのタンパク質は尿素バッファー（２０ｍＭ ト
リス ｐＨ８，８Ｍ 尿素，１０％グリセロール，５００ｍＭ ＮａＣｌ，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）で可溶化させた。４℃で一晩、転倒式に混合
した後、その溶液を遠心分離によって清澄させ、可溶化タンパク質を−７０℃で
保存した。そのタンパク質濃度をクーマシー結合分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって
測定した。
【０１６４】 ｃ）ＴＣＲの再生 それぞれ等しい量の尿素−可溶化タンパク質を、さらに‘グアニジンバッファ
ー’（６Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ ５．５，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で変性させた。この溶液は、氷上
で再生バッファー（５Ｍ 尿素，１００ｍＭ トリス ｐＨ８，４００ｍＭ Ｌ
−アルギニン，５ｍＭ 還元グルタチオン，０．５ｍＭ 酸化グルタチオン，０
．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に加えられ、迅速に混合した。４℃で１２時間を超過した
後、その溶液を１０倍量の水、次に１０倍量の１０ｍＭ トリス ｐＨ８，１０
０ｍＭ 尿素で透析した。プロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦをすべての段階で添加
し、ＴＣＲ上のビオチン化標識のタンパク質分解によるロスを最小化した。
【０１６５】 ｄ）ＴＲＣの精製 ＴＣＲの希釈溶液を、０．４５ミクロンフィルターでろ過して凝集タンパク質
を除去し、次にＰＯＲＯＳ １０ＨＱカラム上にローディングした。再生ＴＣＲ
を、１０ｍＭ トリス ｐＨ８中の塩化ナトリウムの勾配で溶出させ、１ｍｌの
フラクションを回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＴＣＲを含むフラクショ
ンは貯蔵され、３０ｋＤａの分子量を分離する遠心分離濃縮器を用いて濃縮され
た。
【０１６６】 ｅ）ＴＣＲのビオチン化 １ｍｌのＴＣＲ溶液を、緩衝化ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ビオチ
ンを用いて７．５ｍＭ ＡＴＰ濃度に調製し、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプス
タチンを含むプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。最終的に、酵素ＢｉｒＡを
最終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加し、その反応を室温で一晩行った。次に
ＴＣＲはゲルろ過で遊離ビオチンから分離された。ビオチン化ＴＣＲを含むフラ
クションは貯蔵され、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えられたタンパク質濃度
も測定された。図７は、可溶性ビオチン化ＴＣＲの概略図を示す。
【０１６７】 実施例５−ＴＣＲ四量体およびＴＣＲ被覆ビーズの製造 ビオチン化ＴＣＲを四量体化するために、エクストラアビジン（シグマ）を１
：４のモル比で添加した。蛍光標識したエクストラアビジンを細胞ラベリング実
験に用いた。段階的に添加することで、ビオチン化反応における多少の不完全お
よびタンパク質測定における多少の不正確を見込んで、エクストラアビジンの飽
和を達成した。エクストラアビジン添加の合間に氷上で１５分結合させ、最後の
添加が終了した後、４℃で少なくとも一晩放置した。その溶液の少量のサンプル
を、調製したスーパーデックス２００カラム（ファルマシア）でゲルろ過するこ
とによって、四量体形成を確認した。次にＴＣＲ四量体溶液は、プロテアーゼ阻
害剤カクテルおよび０．０５％ アジ化ナトリウムの存在下で、４℃で保存され
た。ＴＣＲ四量体の製造に関しては、図４〜７を参照。
【０１６８】 可溶性ＴＣＲで様々なタイプのビーズや他の固形支持体を被覆するために、同
様のアプローチを用いることができる。アビジン／ストレプトアビジン被覆ビー
ズは、商業的な材料（例えば、ダイナル（ＤＹＮＡＬ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ
）のダイナビーズ、ミルテニ バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ
Ｌｔｄ．，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＭＡＣ
Ｓ）より得ることができ、直径約４．５μｍ〜６５μｍの広範囲のサイズで利用
できる。ビオチン−ストレプトアビジンを介したダイナビーズ上のＭＨＣ−ペプ
チド複合体の固定化は、以前に説明されている（Ｖｅｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ，１
９９７）精製されたビオチン化タンパク質は、４℃で例えば３０分間、ストレプ
トアビジン−被覆ビーズとともに培養され、その後ビーズは洗浄されて結合して
いないタンパク質を除去する。これらのＭＨＣ−ペプチド被覆ビーズは、ＴＣＲ
を発現している細胞系を刺激するのに用いられると、抗原特異的応答を誘発した
。同様に、ＴＣＲの四量体または単量体ビオチン化ＴＣＲを、アビジン／ストレ
プトアビジン−被覆ビーズ上に固定し、また、非ビオチン化ＴＣＲは、アンチＴ
ＣＲ抗体を覆うまたは直接的な化学架橋または他の適切な手段によって固定化す
ることができる。
【０１６９】 実施例６−リポソームおよび薬剤パッケージングの製造 無菌の、内毒素を試験された脂質および他の成分は、例えばシグマ ケミカル
社またはアバンティ ポーラー リピッズ社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉ
ｐｉｄｓ Ｉｎｃ．米国）から、商業的に入手できる。
【０１７０】 リポソームは、小胞形成脂質およびビオチン化された小胞形成脂質の混合物か
ら調製できる。リポゾーム形成に関する様々な適切な方法が存在する。次に、ビ
オチン化Ｔ細胞受容体を、例えばアビジン、ストレプトアビジンまたはエクスト
ラアビジンを介してリポソームの外側に結合させる。検出可能な標識および／ま
たは治療剤は、膜自身に結合させる、または、膜中の水性部分中に捕獲される。
【０１７１】 実施例７−特異性が既知のＴ細胞系またはＴ細胞クローンからの、Ｔ細胞受容
体遺伝子の分子クローニング 細胞からのＴＣＲ遺伝子の分子クローニングに関する方法および手順は、すべ
てのα鎖およびすべてのβ鎖についてそれぞれ同一であり、それゆえにこの実施
例において一つのみ説明される。
【０１７２】 適切な数のＴ細胞を（一般的には１００万〜５００万個）、‘ｍＲＮＡキャプ
チャーキット（ｍＲＮＡ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）’（ベーリンガー マンハ
イム）の溶解バッファーで溶解させた。ｍＲＮＡはビオチン化オリゴ−ｄＴをｍ
ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズすることによって、キット剤を用いて単
離した。次に、ビオチンをストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに結合
することによって、ハイブリダイズされた複合体を捕獲した。ｍＲＮＡをＰＣＲ
チューブに固定化した後、説明されてあるように（‘ｍＲＮＡキャプチャーキッ
ト’のためのベーリンガー マンハイム マニュアル）、ＡＭＶ逆転写酵素（ス
トラタジーン）を用いてｃＤＮＡを作成した。
【０１７３】 ｃＤＮＡがまだ固定している状態で、ポリ−Ｇテールをターミナルトランスフ
ェラーゼ酵素（ベーリンガー マンハイム）を用いて３’末端に作成した。次に
、高性能熱安定性ポリメラーゼｐｆｕ（クローンされたもの、ストラタジーン）
を含むＰＣＲリアクションミックスを加えるが、これはＰＣＲ産物におけるエラ
ーの危険性を最小化するために用いられる。ＰＣＲ反応は、ポリ−Ｃ‘アンカー
プライマー’（図１５Ａ）ならびにそれぞれのＴＣＲ定常領域でアニーリングす
るαおよびβ鎖特異的プライマー（それぞれ図１５ＢおよびＣ）を用いて行われ
た。９５℃で１分の変性、５０℃で１分のアニーリング、および７２℃で５分の
伸長が３０サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＴＣＲ遺伝子フラグメントを増幅した
。
【０１７４】 ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーを含むＸｈｏＩおよびＸｍａＩ制限酵素サイ
ト（すべての酵素はニューイングランド バイオラブスより購入した）を用いて
、ブルースクリプト シークエンシング ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＫＳ−、ストラタジーン）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ株のＸＬ−
１Ｂｌｕｅにライゲーションミックスを形質移入させた後、それぞれの鎖の数種
のクローンをＤＮＡ配列解析により選択した。これはビッグダイTMターミネータ
ー（ＢｉｇＤｙｅTM ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）（アプライド バイオシステム
ズ社）を用いてＡＢＩ３７７プリズムオートマチックシーケンサーで行った。
【０１７５】 実施例８−ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コイル（‘ロイシ
ンジッパー’）領域をコードしたＤＮＡフラグメントの分子クローニング ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コイル（‘ロイシンジッパー
’）領域をコードしたＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてヒトＤＮＡを
用いて作成し、プライマーは図１６に示される。ＰＣＲ反応は、クローンされた
ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含む反応バッファー中で、９５℃、１
分の変性、５８℃、１分のプライマーアニーリング、および７２℃、２分の伸長
が３０サイクルの条件で行った。
【０１７６】 ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントは、唯一のＸｈｏＩおよびＸｍａＩ
制限部位を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ−（ストラタジーン）にライ
ゲーションされ、ｐＢＪ１０７およびｐＢＪ１０８をそれぞれ得た（図１７）。
そのｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントのＤＮＡ配列は、ビッグダイTMタ
ーミネーター（アプライド バイオシステムズ社）を用いたＡＢＩ３７７プリズ
ムオートマチックシーケンサーでなされたＤＮＡ配列解析によって確認した。
【０１７７】 次に、配列解析されたｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントは、唯一のＸ
ｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、Ｔ７ポリメラーゼ発現ベクター、ｐ
ＧＭＴ７（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、１９９０）のポ
リリンカー領域にサブクローニングされた。
【０１７８】 実施例９−安定な可溶性ＴＣＲの製造のための、ＴＣＲ−ロイシンジッパー融
合タンパク質の設計 ＴＣＲαおよびβ鎖の細胞外フラグメントを共再生させる試みは、インビボで
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むように切断されており、限ら
れた成功しか収めていない（データは示さず。発現方法ならびに再生のための一
般的な方法および材料については実施例１２を参照）。しかしながら、ＴＣＲα
およびβ鎖が、鎖同士のジスルフィド結合を形成しているシステイン残基の直前
、すなわちＮ−末端側で切断される場合、スーパーデックスＧ−７５カラム（フ
ァルマシア）による分析クロマトグラフィーによって、再生反応で用いられた量
の約１〜２％タンパク質の少量フラクションは、切りとられたα／βヘテロ二量
体の予想分子サイズを持つ複合体に再生する、ということが示された（方法の参
照として、Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９６も参照）。
【０１７９】 不正確なジスルフィド結合の形成は、インビトロでの再生中にタンパク質の不
可逆的な誤った折りたたみの原因となるため、このようなことが生じる可能性は
、細胞ＴＣＲ中で対をなしていないＴＣＲβ定常領域中のシステイン残基を変異
させることによって最小化されるようにした。システイン残基はセリンまたはア
ラニン残基で置換される。これらの変異ステップに用いられた合成ＤＮＡプライ
マーを図１８に示す。ＴＣＲαおよび変異β鎖の共折りたたみ（co-folding)は
、いずれも鎖同士のジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直前で切断さ
れており、ヘテロ二量体、正確な分子量のタンパク質フラクションの収率におけ
る劇的な改善を示し、一般的に総タンパク質量の１５〜３０％を構成する。しか
しながら、これらの可溶性ＴＣＲが一晩保存される場合、その一部分の分析によ
り、ヘテロ二量体ＴＣＲに相当する分子量を持つフラクションは、単量体ＴＣＲ
αおよびβ鎖に相当する分子量の二つのピークに分けられる、ということが示さ
れた。似たような観察結果が可溶性ＴＣＲの希釈によって生じ、これによって、
数時間より長い時間またはタンパク質の希釈を必要とするような分析に対して、
α／β鎖の安定性が低く、不十分となることが示された。結論としては、可溶性
ＴＣＲを製造するこれらの方法によって、極端に限定された安定性を持つ受容体
しか作成できなかった。
【０１８０】 ＴＣＲα／β鎖の安定性を改良し、再生の際に潜在的にヘテロ二量体形成を補
助するために、優先的にヘテロ二量体を形成することが知られているｃ−ｊｕｎ
およびｃ−ｆｏｓの‘ロイシンジッパー’ドメインにＴＣＲ鎖を融合させた（Ｏ
’Ｓｈｅａ， Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｓｃｈｕｅｒｍａ
ｎｎ，Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋ
ｉ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９
５）。融合ＴＣＲに関する二つの設計を試験した。
【０１８１】 その一つにおいて、ロイシンジッパーを、システイン残基のちょうど後、ＴＣ
Ｒαおよびβ鎖中で鎖同士のジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直後
、すなわちＣ−末端に融合した。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパー
ペプチドもまた、使用されたリンカーに対しＮ−末端近傍の鎖同士のジスルフィ
ド結合を形成することができることため（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．１９８９）、互いに関連し、かつ鎖同士のジスルフィド結合に関連
している二つの鎖の配列は、最適になるように予期された。
【０１８２】 他の設計において、ロイシンジッパーは、、ＴＣＲαおよびβ鎖中で鎖同士の
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直前、すなわちＮ−末端で融合さ
れた（図１９）。このように、第二の設計において、システイン残基は組換え受
容体からはずされている。
【０１８３】 これらの設計のＴＣＲ−ジッパー（ＴＣＲ−ｚ）鎖を用いた再生実験において
、図１９に示した設計のように、鎖同士でジスルフィド結合を形成するシステイ
ン残基がＴＣＲαおよびβ鎖から除かれている場合に、ヘテロ二量体、可溶性受
容体の収率がより良いことが見出された。
【０１８４】 実施例１０−ＴＣＲ−ロイシンジッパータンパク質に関するＤＮＡ発現ベクタ
ーの構築 この実施例は、５個のＴＣＲのαおよびβ鎖に関する発現ベクターの構築を説
明している。説明されている方法および設計は、任意のヒトまたは動物のＴＣＲ
遺伝子に対して適合するべきである。ここで説明した５個のＴＣＲはすべて、Ｍ
ＨＣクラスＩエピトープによって制限されているにもかかわらず、その方法はＭ
ＨＣクラスIIで制限されたＴＣＲのためのクローニングおよび発現ベクター構築
に等しく用いることができる。すべてのベクターは、図１９に示した設計に従っ
て可溶性ＴＣＲの再生をねらったタンパク質を発現するが、ただし二つのＴＣＲ
はＣ−末端にビオチン化可能な標識配列を有して発現することを除く（以下、お
よび図２８、２９および３０を参照）。クローニング方法は、すべてのＴＣＲα
およびβ鎖それぞれに対して同じである。
【０１８５】 ＴＣＲαおよびβ鎖のリーダー、またはシグナル、ペプチド配列の範囲を、Ｔ
ＣＲアンカーＰＣＲ生産物を含むプラスミドから得られた配列データの分析から
推測した（実施例７を参照）。これを基礎にして、リーダー配列を含まないＴＣ
Ｒ鎖の発現に関するＰＣＲフラグメントを作成するための５’プライマーを設計
した（図２０）。すべての５’プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉで翻訳されるように
、成熟ＴＣＲタンパク質配列のすぐ前にメチオニン残基をコードしている。サイ
レント突然変異、ＣまたはＧ塩基のＡまたはＴへの置換（図２０）は、かなりの
数の遺伝子の５’近傍のコドンにローディングされ、これはＥ．ｃｏｌｉでの発
現レベルを不利に阻害し得るｍＲＮＡ二次構造を形成する傾向を減少させるため
である（ＰＣＴ／ＧＢ ９８／０３２３５；（Ｇａｏ，Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ
．１９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１８６】 ヒトＪＭ２２インフルエンザ マトリックス ペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１
（ペプチド配列はＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）のＶα０．２およびＶβ１７鎖で制限さ
れたＴＣＲ、００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１（ペプチ
ド配列は、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）のヒトＶα２３およびＶβ５．１鎖で制限され
たＴＣＲ、および、Ｆ５ ＮＰペプチド−Ｈ２−Db（ペプチド配列は、ＡＳＮＥ
ＮＭＤＡＭ）のマウスＶα４およびＶβ１１鎖をコードした遺伝子を、実施例７
で説明したようなＴＣＲアンカーＰＣＲ産物を含むプラスミドを用いて、ＰＣＲ
によって増幅した。ＨＬＡ−Ａ０２０１（ペプチド配列は、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ
）によって提示されるＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチドに特異的なヒトＡ６（Ｖ(
２．３／Ｖ(１２．３）およびＢ７（Ｖ(１７．２／Ｖ(１２．３）ＴＣＲに関す
る遺伝子は、プラスミドの形態で得られ（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６；Ｄｉｎｇ，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９９８）、これらは、
これらのＴＣＲ鎖の発現ベクター構築のためにＰＣＲ産物を作成するのに使用し
た。これらのＴＣＲに関する遺伝子を、ｃ−ｆｏｓロイシンジッパー−ビオチン
化可能な標識融合フラグメントに関する配列を含む発現ベクターにクローニング
した（実施例１１参照）。
【０１８７】 ＰＣＲ反応は、標準バッファー条件でｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）
を用い、９５℃で１分の変性、６０℃で１分のプライマーアニーリング、および
７２℃で６分の伸長が２５サイクルで実行した。ＰＣＲ産物は、酵素ＮｄｅＩお
よびＸｍａＩで消化された制限部分であり、ｃ−ｊｕｎ（ＴＣＲα鎖）およびｃ
−ｆｏｓ（ＴＣＲβ鎖）インサートを含むｐＧＭＴ７ベクターに結合させた（実
施例８参照）。
【０１８８】 図２１〜３０は、ＴＣＲ−ｚインサートの配列およびｐＧＭＴ７ベクターによ
って発現する予想タンパク質配列を示している。図３１は、折りたたみおよび可
溶性ＴＣＲの機能に検出可能な影響を及ぼさないような、定常領域における変異
を含むＡ６ＴＣＲβ鎖の配列を示す（実施例１２および１３を参照）。
【０１８９】 実施例１１−ｃ−ｆｏｓロイシンジッパー−ビオチン化可能フラグメントに融
合したＴＣＲβ鎖の発現のための、ＤＮＡベクターの構築 可溶性ＴＣＲを、固定化すること、または検出もしくは受容体への付着を可能
にするためには、さらなる機能的融合成分を伴ったタンパク質を製造することが
できるかどうかが役に立つ。これにより、例えば多量体として生産されるような
、可溶性ＴＣＲを誘導すること、または、高い選択性を有する検出もしくは受容
体／受容体複合体への他の機能の付加が可能になる。
【０１９０】 この実施例においては、インビボでＥ．ｃｏｌｉ中、またはインビトロで酵素
ＢｉｒＡと共に、特異的にビオチン化されうる融合ポリペプチドを組み込まれた
ＴＣＲβ鎖のための発現ベクターの構築を説明する（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ １９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ １９８
１；Ｈｏｗａｒｄ，Ｓｈａｗ．，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａ
ｌｌａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）。実施例１３および１
４で示したように、これらの可溶性ＴＣＲ融合体は、‘ビオチン化標識’（ＢＴ
−標識）と融合していないＴＣＲβ鎖と同じ方法および似たような収率で、α鎖
と共に発現され折りたたむことができる。これらの結果により、ここで説明され
た可溶性ＴＣＲは、多数の異なるポリペプチドと、融合パートナーとして共に発
現することに適しているらしいことが説明される。
【０１９１】 Ｔ細胞受容体β鎖は、下記のように、ｆｏｓロイシンジッパー配列にビオチン
−標識配列Ｃ−末端を有するｐＧＭＴ７発現ベクター中にサブクローニングした
。
【０１９２】
【化２】
【０１９３】 構造の末端の配列は以下のようであった（図３２も参照）。
【０１９４】
【化３】
【０１９５】 二つのアプローチが、ビオチン標識を有する可溶性ＴＣＲを生産するのに用い
られた。ＴＣＲを制限したヒトＪＭ２２インフルエンザマトリックスペプチド−
ＨＬＡ−Ａ０２０１の場合において、クローニングされたβ鎖−ｃ−ｆｏｓロイ
シンジッパー融合体を、図３３に示した合成ＤＮＡプライマーを用いた３’末端
で修飾して、ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いる標準ＰＣＲ反応を
用いて、ＨｉｎｄIII部位がインサートされたＢａｍＨＩ部位をローディングし
た。
【０１９６】 ＮｄｅＩ部位を有するオリジナルの５’プライマー（図２０）を、フォワード
プライマーとして用いた。生成したＰＣＲ産物は、ビオチン−標識配列を含む修
飾されたｐＧＭＴ７ベクターにクローニングされ（図３２）、上述した内容の構
築を形成する。このプラスミドはＪＭＢ００２として知られる。
【０１９７】 クローニングされたＴＣＲの、ＨＴＬＶ−１エピトープＬＬＦＧＹＰＶＹＶを
制限されたＨＬＡ−Ａ０２０１に対する特異性は、Ａ６ ｔａｘ ＴＣＲ（Ｖ(
２．３／Ｖ(１２．３）として知られており、図２０で示したフォワードおよび
リバースプライマーを用いたＰＣＲを用いて分離される。このＴＣＲβ鎖は、ｃ
−ｆｏｓ−ＢＴフラグメントを含むｐＧＭＴ７ベクター（ＪＭＢ００２）のＮｄ
ｅＩおよびＸｍａＩ部位にクローニングされた。
【０１９８】 融合発現ベクターを構築した後、サブクローニングが進行している間に間違い
がローディングされていないことを確かめるためにＤＮＡ配列解析を行った（す
べての配列解析はオックスフォード ユニバーシティの生化学部 ＤＮＡシーク
エンシング ファシリティー（ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐｔ．
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、ＡＢＩ３７７プリズム
シーケンサーおよびＡＢＩ ビックダイ蛍光ターミネーターを用いてなされた
）。公開されている配列と比較すると ｔａｘ ＴＣＲβ鎖に二つのエラーがあ
ることがわかり、さらに調査すると、我々は、我々が受け取ったオリジナルのプ
ラスミドにこの両方が存在することを発見した。これら二つのエラーの両方がＴ
ＣＲβ鎖における唯一のＢｓｕ３６Ｉサイトの３’であるため、これを（正しい
）ＪＭＢ００２プラスミドにクローニングするのに用いた。 ｔａｘ ＴＣＲβ
鎖の両方のバージョンは、α鎖と共に発現され折りたたまれ、Ｂｉａｃｏｒｅを
用いて比較された。両方のバージョンのタンパク質は、類似した見かけの親和性
で ｔａｘペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子に特異的に結合した（実施例２０参照
）。サブクローニング実験において、β鎖の正しいバージョンのみが用いられた
。
【０１９９】 実施例１２−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＣＲ鎖の発現および封入体の精製 ＴＣＲαおよびβ鎖は、ＴＹＰ倍地中、ベクターｐＧＭＴ７の条件下で、Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳ中でそれぞれ発現させ、６００ｎｍで０．
２〜０．６の光学濃度（ＯＤ）の時に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質
生産を誘導した。誘導は一晩続けられ、バクテリアはベックマンＪ−６Ｂ遠心分
離機を用いて、４０００ｒｐｍで遠心分離することによって、収穫された。
【０２００】 次にバクテリア細胞沈殿を‘溶解バッファー’（１０ｍＭ トリスｐＨ８．１
，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，１０％グリセ
ロール）中で再懸濁した。その混合物を氷上で冷却し、以下のものを加えた：２
０μｇ／ｍｌリゾチーム，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，および２０μｇ／ｍｌ ＤＮ
アーゼＩ。続いて、最小で１時間、氷上でインキュベーションした。
【０２０１】 次に１２ｍＭプローブソニケーター（ミルソニックス（Ｍｉｌｓｏｎｉｘ）Ｘ
Ｌ２０２０）を用い、混合物を冷やすためにインターバルを３０秒おいて、最大
出力で３０秒を５バースト行って超音波破砕した。その間、氷水を用いて温度を
維持した。次にその混合物は５倍量の‘トリトン洗浄バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，０．５％ ト
リトンＸ−１００，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ アジ化ナトリウム，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭ ＤＴＴ）で希釈した。最短で１時間、氷上で培養し
た後、次にその混合物を、ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心器を用いて３５００ｒｐｍ
で遠心分離し、上清を捨てた。その沈殿を、小さいプラスチックディスポーザブ
ルピペットを用いて‘再懸濁バッファー’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，１
００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中で再懸濁した。
次にベックマンＪ２−２１遠心分離器で、８０００ｒｐｍで遠心分離し、その上
清を捨てた。次にその沈殿を、手動ホモジナイザーを用いて、‘グアニジンバッ
ファー’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，６．０Ｍ 塩酸グアニジン，１００
ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＤＴＴ）中で再懸濁した。低
速の遠心分離で不溶性物質を取り除いた後、その上清を等分して−７０℃で保存
した。バクテリア培養液１リットル当り１００ｍｇのおよその収率が、継続的に
得られた。
【０２０２】 精製された封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、グアニジンバッファー中の封入
体標品２μlを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで希釈し、１００℃、２
分間加熱することによってなされた。まだ温かいうちにゲルにローディングし、
グアニジン／ＳＤＳ混合物がローディングの際に沈殿することを防いだ。この方
法で精製された封入体タンパク質は、この方法で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥのク
ーマシー染色により、約９０％の純度と判断された（図３４を参照）。
【０２０３】 実施例１３−ＴＣＲヘテロ二量体の再生および精製 等しい比率を有する尿素−可溶化タンパク質を、さらに３７℃で、‘グアニジ
ンバッファー’（６Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．
５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中で変性した。タンパク質の混合物
を、総タンパク質濃度が６０ｍｇ／Ｌになるように迅速に混合しながら、氷冷再
生バッファー（１００ｍＭ トリス ｐＨ８．１，０．４Ｍ 塩酸Ｌ−アルギニ
ン，５．０Ｍ 尿素，５ｍＭ 還元グルタチオン，０．５ｍＭ 酸化グルタチオ
ン）に注入した。少なくとも５時間氷上で培養し再生をさせた後、その混合物を
、１０倍量の脱塩水で２４時間、次に１０倍量の１０ｍＭ トリス ｐＨ８．１
で２４時間透析した。
【０２０４】 次に透析した再生タンパク質を、０．４５μニトロセルロースメンブレン(ワ
ットマン)でろ過して凝集タンパク質（再生中に副産物として生産された）を除
去した。次にビオチン−標識された可溶性ＴＣＲの精製は、バイオキャド スプ
リント システム（Ｂｉｏｃａｄ Ｓｐｒｉｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＯ
ＲＯＳ ２０ＱＨカラムにローディングすることによってなされた。約５００ｍ
ｌの再生タンパク質溶液を１ラン当りローディングすることができ、タンパク質
の溶出はビス−トリス−プロパンバッファーｐＨ８．０の塩化ナトリウム濃度勾
配溶液によって実施した。約１００ｍＭの塩化ナトリウム濃度でタンパク質が溶
出し、該当フラクションは即座に氷冷され、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加え
た。フラクションはクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２０５】 実施例１４−ビオチン化可能β鎖を有するＴＣＲヘテロ二量体の再生および精
製 ビオチン−標識されたＴＣＲβ鎖は、等量の発現されたα鎖と混合され、可溶
性Ｔ細胞受容体として精製された。ヘテロ二量体ＴＣＲ−β−ＢＴは、実施例１
３でＴＣＲに関して説明されているのと同じ方法に従って再生した（図３７を参
照）。
【０２０６】 実施例１５−ビオチン−標識された可溶性ＴＣＲｚ−ＢＴのビオチン化 タンパク質含有フラクションは、１０Ｋを分離する遠心分離濃縮器（ウルトラ
フリー、ミリポア）を用いて２．５ｍｌに濃縮した。１０ｍＭトリス ｐＨ８．
１、５ｍＭ ＮａＣｌ、で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムバッファーを用いて
バッファーを交換し、さらにプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。遠心分離濃
縮器を再び用いてタンパク質を１ｍｌまで濃縮した。この１ｍｌのビオチン−標
識された可溶性ＴＣＲに対して、以下のものを加えた：７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
，５ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ビオチン，２．５μｇ／ｍｌ Ｂｉ
ｒＡ ビオチン化酵素。次にビオチン化反応を、室温（２０〜２５℃）で一晩進
行させた。
【０２０７】 次に酵素的にビオチン化された可溶性ＴＣＲを、ファルマシアＰＦＬＣシステ
ムを用いて、スーパーデックス２００ＨＲカラム（ファルマシア）でゲルろ過す
ることによって、残留した未反応ビオチンから分離した（図３８を参照）。カラ
ムはＰＢＳで平衡化され、１ｍｌフラクションは回収され、即座に氷上で冷やさ
れ、再びプロテアーゼ阻害剤カクテルで保護した。タンパク質濃度は、クーマシ
ー−結合分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて推定され、次にビオチン化タンパク質は
４℃で１ヶ月まで、または−２０℃でより長い期間保存された。
【０２０８】 ビオチン化反応の効率を、ビオチン化タンパク質のウェスタンブロッティング
を用いて調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、前述した方法を用いて泳動した。し
かし、染色の代わりに、ゲルは、セミフォア セミ−ドライ エレクトロブロッ
ティング装置（ＳｅｍｉＰｈｏｒ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｅｌｅｃｔｏｂｌｏｔｔ
ｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ：Ｈｏｅｆｅｒ）を用いてＰＶＤＦメンブレン（バ
イオラッド）上にブロッティングした。６層のフィルターペーパー（ワットマン
４Ｍ）からなるブロッティングスタックをゲルのサイズに切り、トランスファ
ーバッファー（２５ｍＭ トリス塩基，１５０ｍＭ グリシン）に浸し、次に前
もってメタノールで湿らせたＰＶＤＦメンブレン、次にトランスファーバッファ
ーに浸し、さらにゲルをトランスファーバッファー中で５分間、ゆっくり攪拌し
て、次に６層以上の浸されたフィルターペーパーを重ねた。そのスタックはすべ
ての気泡をロールアウトするために試験管を用いてゆっくり圧力をかけられ、約
１０ｍｌの追加のトランスファーバッファーを、導電力を補助するために加えた
。陰極をそのスタックの上部に設置し、装置を介して定電流５０ｍＡで１時間、
電流を流した。次にそのメンブレンを、ＰＢＳ−Ｔバッファー（ＰＢＳ＋０．０
５％トゥイーン−２０）の２％ゼラチン（バイオラッド）溶液中で、１時間以上
、室温で穏やかに攪拌しながら培養した。一晩の培養には、バクテリアの増殖を
防ぐために０．０１％アジ化ナトリウムも含ませた。そのメンブレンをＰＢＳ−
Ｔを数回（４〜５回）換えることで洗浄し、次にＰＢＳ−Ｔの１％ゼラチン溶液
で１：１０００に希釈されたアビジン−ＨＲＰ結合体（シグマ）で、３０分以上
、室温でおだやかに攪拌しながら染色した。次にＰＢＳ−Ｔを数回換えることで
メンブレンを洗浄し、その後Ｏｐｔｉ−４ＣＮ（バイオラッド）で検出した。こ
れはＨＲＰの存在下で、結合したＨＲＰの存在によって示されるように、相関す
るタンパク質が存在する場所でメンブレンを染色する可溶性青色染料を形成する
反応をする剤である。アビジン−ＨＲＰ結合体が染色に使用されている場合には
、ビオチン−含有タンパク質の存在を確かめる。
【０２０９】 図３９は、このような方法でいくつかのビオチン化ＴＣＲに関してなされたブ
ロットを示している。このブロットで使用された標準は、ビオチン化された広範
囲の分子量マーカー（バイオラッド）であった。そのブロットにより、ＢｉｒＡ
酵素と反応したビオチン化標識を含むＴＣＲの、高いレベルのビオチン化がはっ
きり示された。
【０２１０】 実施例１６−ビオチン化された可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体の製造 ビオチン化可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体は、実施例２で説明したように製造
される。
【０２１１】 実施例１７−可溶性ＴＣＲおよびＭＨＣ−ｆｌｕ−ペプチドの特異的結合の分
析 可溶性ＴＣＲのＪＭ２２ｚは、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミ
ノ酸残基５８〜６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）からなる免疫優勢抗原を提示するＨ
ＬＡ−Ａ２ ＭＨＣ分子に特異的である。ＪＭ２２ｚのクローニング、発現およ
び精製は、実施例７、１０、１１および１３、ならびに、図３５および３６にお
いて説明されている。ＪＭ２２ｚおよびそのリガンド／ＭＨＣ複合体（ＨＬＡ−
Ａ２−ｆｌｕ）の相互作用、または、重要でないＨＬＡ−Ａ２ペプチド組み合わ
せ、実施例１３で説明されている生産物を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００TM表面プラ
スモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーで分析した。ＳＰＲは、スモールフローセ
ル中のセンサー表面近くで、応答単位（ＲＵ）で発生する屈折率の変化、受容体
とリガンドとの相互作用を検出しそれらの親和性とカイネティクスパラメーター
を分析するために用いられる成分を測定する。プローブフローセルは、架橋され
たビオチン間の結合を介した別々のフローセルにおける個々のＨＬＡ−Ａ２−ペ
プチド複合体を、フローセルの活性化表面に化学的に架橋されたβ２ｍおよびス
トレプトアビジンへ固定することによって調製した。次に一定流速で、異なるフ
ローセルの表面上にＪＭ２２ｚを通過させることによって分析を行い、それに対
するＳＰＲ応答を測定した。初めは、５μｌ／分の一定流速で、２８μＭのＪＭ
２２ｚが３つの異なる表面上を通過することによって相互作用の特異性を確認し
た。第一に、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの２８００ＲＵで被覆されたもの、第二にＨ
ＩＶ逆転写酵素（ＨＬＡ−Ａ２−ｐｏｌ：ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）からの無関係な
ペプチドで折りたたまれたＨＬＡ−Ａ２の４２００ＲＵで被覆されたもの、およ
び、第三にＣＤ５の４３００ＲＵで被覆されたのもの（図４０ａを参照）。ＨＬ
Ａ−Ａ２−ｐｏｌ上の、一定流速および異なる濃度の可溶性ＪＭ２２ｚの注入は
、バックグラウンドの共鳴を定義するために用いられた（図４０ａ）。これらの
コントロール測定の値は、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕで得られた値から差し引かれ（
図４０ｂ）、解離定数Ｋｄとして表現された結合親和性を計算するために用いら
れた（図４０ｃ）。ＪＭ２２ｚおよび関連するＭＨＣ分子のＫｄは、３７℃で１
５±４μＭ（ｎ＝７）、２５℃で６．６±２μＭ（ｎ＝１４）と測定された。プ
ローブフローセルに固定化されたＴＣＲおよびＭＨＣ−ペプチド複合体を用いた
測定において、２５℃で５．６±４μＭ（ｎ＝３）のように類似したＫｄが得ら
れた。相互作用のオン−レイト（ｏｎ−ｒａｔｅ）は、３７℃で、６．７×１０ 4 〜６．９×１０4Ｍ-1ｓ-1と測定され、一方でオフ−レイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ
）は１．１ｓ−１であった（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，１９９９）
。
【０２１２】 実施例１８−可溶性マウスＴＣＲおよびマウスＭＨＣ Ｈ２−Ｄb−ＮＰ間の
特異的結合に関する分析 本実験において、我々は、マウスＭＨＣ Ｈ２−Ｄb ＭＨＣ分子（ＭＨＣ
Ｈ２−Ｄb−ＮＰ）によって提示されたインフルエンザウイルス核タンパク質（
ａａ．３６６−３７４：ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ）から得られたペプチドに特異的な
マウスＴＣＲ、Ｆ５を用いた。用いられたＭＨＣ重鎖遺伝子は、天然タンパク質
のアミノ酸１〜２８０およびＢｒｉＡ酵素によって認識される１３アミノ酸配列
のみをコードしたセンス鎖において、わずかに修飾されていた。生じるタンパク
質は、酵素的にビオチン化することができる（Ｓｃｈａｔｚ １９９３；Ｏ’Ｃ
ａｌｌａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ＳＰＲは、固定化
ＭＨＣ Ｈ２−Ｄb−ＮＰに特異的な可溶性ＴＣＲを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ２
０００TMＳＰＲバイオセンサーで分析し、リガンドＭＨＣ−ペプチド結合に特異
的に結合することが示された（データは示さず）。
【０２１３】 実施例１９−ビオチン化可溶性ｔａｘ ＴＣＲと、ビオチン化可溶性変異型ｔ
ａｘ−ＴＣＲとの結合の比較 ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲは、実施例１２〜１４で調製され、Ｂｉａｃ
ｏｒｅ２０００分析を、インフルエンザマトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦ
ＴＬ）またはＨＴＬＶ ｔａｘ１１〜１９ペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ）のい
ずれかと再生されたビオチン化ｐＭＨＣ複合体を用いて実施例１７で実施した。
ビオチン化可溶性ＴＣＲを、計１分間、５μｌ／分で、すべての細胞の上に流し
た。図４１は、第一に、ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲの、次にビオチン化可
溶性変異型ｔａｘ−ＴＣＲの、ＨＴＬＶ ｔａｘ１１〜１９ペプチド−ＭＨＣ複
合体（Ａ）に対する結合を示している。天然型または変異型ｔａｘ−ＴＣＲのい
ずれも、インフルエンザマトリックスペプチド−ＭＨＣ複合体（Ｂ／Ｃ）または
ＯＸ６８モノクローナル抗体コントロール（Ｄ）のいずれとも結合しないことが
示された。それゆえ、我々は、天然型および変異型ビオチン化可溶性ＴＣＲの両
方は、ｔａｘ−ｐＭＨＣ複合体に効果的にかつ特異的にはっきり結合し、結合の
程度において非常にわずかな差異しか示さない、ということを結論付けた。
【０２１４】 実施例２０−ＴＣＲ−およびＣＤ８補受容体の、固定化ＭＨＣペプチド複合体
の同時結合の分析 ＣＤ８およびＣＤ４は、表面糖タンパク質であり、ＴＣＲと同じＭＨＣ分子に
同時に結合することによってＴＣＲの補受容体として機能すると考えられる。Ｃ
Ｄ８は細胞障害性Ｔ細胞に特徴的であり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、一方で
ＣＤ４はヘルパーリンケージのＴ細胞で発現され、ＭＨＣクラスII分子と結合す
る。ＣＤ８は、二つの同一なα鎖またはαおよびβ鎖のいずれかからなる二量体
である。ホモ二量体のαα−ＣＤ８分子は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３２３５；（
Ｇａｏ，Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ
．１９９８）で記載されているものに従って製造した。本実施例において、我々
は、可溶性ＴＣＲおよびＣＤ８分子が、固定化ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ複合体へ同
時に結合することを説明する。図４２Ａでわかるように、結合応答は単に付加的
である。ＴＣＲ応答の値（白丸）を、結合応答の値（黒丸）から差し引くことで
、１２０μＭ ＣＤ８のみの応答の値（白三角）に非常に近い値（白四角）を得
た。図４２Ｂは、ＴＣＲ−ＭＨＣ−ペプチド相互作用の反応速度は、ＣＤ８の同
時結合によって影響されないことを示している。観察された付加的な結合は、Ｔ
ＣＲおよびＣＤ８は、ＭＨＣペプチド複合体と、別々の界面で結合することを示
している。実施例はまた、いくつかの場合において、一つの分子の特異的結合は
、他の分子の特異的結合に影響を及ぼすものではなく、状況は他の分子の結合に
関して異なると強く思われる。
【０２１５】 実施例２１−固定化ビオチン化可溶性ＴＣＲからのＴＣＲ四量体の形成 ＴＣＲ四量体の形成は、アビジンもしくはストレプトアビジンまたはそれらの
誘導体を用いて達成される。アビジン（雌鳥の卵より）は、通常、高い等電点を
もち、それにより中性ｐＨで高い正電荷を持ち、これは多くの他のタンパク質お
よび表面への非特異的結合の原因となる。それゆえにアビジンはしばしば等電点
を低くするために商業的に改変され、それによりそれはストレプトアビジン（微
生物原料より）により近い性質を示す。この形態において、それはエクストラア
ビジン（シグマ）またはニュートラアビジン（モレキュラー プローブス）とし
て知られている。これらのどちらか、またはストレプトアビジンは、例えばＦＡ
ＣＳスキャニングのための蛍光標識等の標識を含むように改変することができる
。
【０２１６】 ＴＣＲ四量体は、エクストラアビジン／ストレプトアビジンの最終濃度を総ビ
オチン化可溶性ＴＣＲ濃度の４分の１を用いて形成された。濃度がそれほど正確
でない場合でもエクストラアビジンまたはストレプトアビジンのほとんどがＴＣ
Ｒで飽和し得るように、エクストラアビジン／ストレプトアビジンを、氷上で等
量ずつ加えた。ＴＣＲ四量体は、スーパーデックス２００ＨＲカラム（ファルマ
シア）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した（図４３および
４４）。ＴＣＲのアビジンへの結合は、結合していないＴＣＲおよびエクストラ
アビジン／ストレプトアビジンのコントロールサンプルを別々に泳動することに
よって確かめられた。ＴＣＲ四量体は、より高い分子量に一致する保持体積でカ
ラムから溶出した。改変されていないエクストラアビジンに関して、製造された
ＴＣＲ四量体のおよその分子量を（標準タンパク質の既知の分子量と比較するこ
とによって）、完全なＴＣＲ四量体の計算された分子量の３０５，０００と比較
して、〜２８５，０００と決定された。
【０２１７】 実施例２２−ビオチン化単量体ＴＣＲおよびＴＣＲ四量体のＭＨＣペプチドへ
の結合の分析 ペプチドＭＨＣ複合体は、インフルエンザマトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦ
ＶＦＴＬ）またはＨＴＬＶ ｔａｘペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ）、組換えＨ
ＬＡ−Ａ２重鎖および組換え化学的ビオチン化β−２−ミクログロブリンを用い
た実施例１６によって調製した。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００TMＳＰＲバイオセンサ
ーを、ＴＣＲ、ＴＣＲ四量体およびｐＭＨＣ複合体との間の分子相互作用を測定
するのに用いた。ビオチン化ｐＭＨＣ複合体を、ＣＭ−５チップ表面上へ融合し
たストレプトアビジンへアミンカップリングによって固定化した。ＯＸ６８はビ
オチン化モノクローナル抗体であり、サー ウィリアム ダン スクール オブ
パソロジー（Ｓｉｒ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄｕｎｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐａ
ｔｈｏｌｏｇｙ）のドクター．Ｐ．アントン ファン デル メルヴェ（Ｄｒ．
Ｐ． Ａｎｔｏｎ ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ）によって提供された。これ
は細胞のひとつにおいて、非特異的コントロールタンパク質として使用された。
【０２１８】 ｐＭＨＣ複合体の固定化の次に、残留ビオチン−結合部位を、１０ｍＭビオチ
ンで飽和させた。これは、ビオチン化ＴＣＲが、特異的なＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互
作用よりむしろ、それらのビオチン化を介してストレプトアビジンで覆われたチ
ップに結合することを防ぐのに必要である。次に可溶性ビオチン化ＴＣＲは、約
１ｍｇ／ｍｌの濃度でチップ上を流れ、ＴＣＲ四量体は約５０μｇ／ｍｌの濃度
でその上を流れる。
【０２１９】 図４５は、可溶性ビオチン化ｆｌｕ−ＴＣＲおよびｆｌｕ−ＴＣＲ四量体のｐ
ＭＨＣ複合体への結合を示しており、図４６は、可溶性ビオチン化およびｔａｘ
−ＴＣＲ四量体の同様なｐＭＨＣ複合体への結合を示している。ビオチン化ｓＴ
ＣＲおよびＴＣＲ四量体の両方は、それらの特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体に対
する完全な特異性、強い結合を示しているが、すべての非特異的ペプチドＭＨＣ
複合体に対してということではない。ＴＣＲの多量体化によって生じた親和性の
増加は、ｓＴＣＲおよびＴＣＲ四量体のそれぞれのオフ−レイトにおいて、両方
のＴＣＲに関して観察することができる。両方のＴＣＲに関するオフ−レイトは
、数秒から数時間へ増加する（オフ−レイトの正確な測定は、再結合効果のため
に不可能であった。）。
【０２２０】 いくつかのビオチン化可溶性ＴＣＲの永久的な結合は、標品中に凝集タンパク
質が存在していることにより生じる両方の場合において観察された。両方の場合
において、このレベルの強い結合は、フローセル上に注入されたＴＣＲ四量体の
総量が注入されたビオチン化可溶性ＴＣＲの量の約４分の１であったことに留意
すると、ＴＣＲ四量体に比べて非常に低かった（５μｌ×１ｍｇ／ｍｌに比べて
２５μｌ×０．０５ｍｇ／ｍｌ）。
【０２２１】 実施例２３−ＴＣＲ四量体を用いた抗原提示細胞の染色 細胞染色実験は、ＨＬＡ−Ａ２とホモ接合性であるＴ２と呼ばれるＢ細胞系で
なされ、ペプチド抗原を処理しない。このため、単一の型の外部ペプチドで満た
され得る細胞表面上に、満たされていないＭＨＣクラスＩ分子が存在することに
なる。細胞は、Ｒ−１０倍地で、３７℃、および５％ＣＯ2雰囲気下で増殖した
。約２００万個の細胞が得られ、ＲＰＭＩ倍地で２回洗浄され（遠心分離は１，
５００ｒｐｍで５分間）、ペプチドはＲＰＭＩ中の１０％ＤＭＳＯに、様々な濃
度で加えられた。一般的に、０、１０-4、１０-5および１０-6のインフルエンザ
マトリックス×ペプチド（配列：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）および ｔａｘペプチド
（配列：ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ）の濃度を使用した。細胞は、１時間、３７℃でパ
ルスされ、ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に細胞表面上で結合させた。次に細胞
はＲＰＭＩ倍地で２回洗浄され、過剰のペプチドを除去された。
【０２２２】 ペプチドパルスを受けた細胞は、室温、ＦＩＴＣまたはＲＰＥのいずれかの蛍
光マーカーで標識されたＴＣＲ四量体１〜１０μｇを用いて、ＴＣＲ四量体で染
色された。染色は３０分間続けられ、次に細胞を氷冷ＲＰＭＩで１回洗浄し、続
いてＰＢＳ溶液中の３％ホルムアルデヒドで固定化した。次に固定し、染色した
細胞を、４℃、暗所でＦＡＣＳ分析の前まで最大１週間保存した。
【０２２３】 ＦＡＣＳ分析は、ベクトン−ディッキンソンＦＡＣＳスキャナーを用いてなさ
れ、そのデータを記録し、‘セルクエスト（Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ）’ソフトウェ
アを用いて分析した。図４７は、ｆｌｕマトリックスＴＣＲまたは ｔａｘ Ｔ
ＣＲのいずれかからなるＴＣＲ四量体の、それらの特異的ペプチドに対する特異
的結合を示している。バックグラウンドおよび交差反応性は低かった。興味深い
ことに、ペプチドにパルスをしている間のペプチドのＭＨＣクラスＩに対する変
化する親和性の効果でありうるにもかかわらず、ｔａｘ ＴＣＲ四量体は、ｆｌ
ｕマトリックスＴＣＲ四量体よりそのペプチドへよく結合するように思われる。
【０２２４】 また細胞の他の変化を、ＴＣＲ四量体、ＨＬＡ−Ａ２の正常Ｂ細胞系ヘテロ接
合性である４５細胞を用いて染色した。細胞を調製し、ペプチドを、Ｔ２細胞の
ように正確に、パルスし、標識し、ＦＡＣＳスキャンした。図４８は、ペプチド
をパルスされた４５細胞のＴＣＲ四量体標識の結果を示している。細胞の染色は
、Ｔ２細胞に比べて目立って低く、これはＴ２細胞がホモ接合性であるのに反し
て、４５細胞がヘテロ接合性であることを予想通り示した。この効果に加えて、
Ｔ２細胞の場合において複合体は初めのうちはエンプティーであるのに対して、
４５細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ複合体は初めのうちはペプチドでローディン
グされるために、他のＨＬＡ−Ａ２陽性細胞と比較してＴ２細胞表面上へのペプ
チドローディングのより大きい効果がある。
【０２２５】 実施例２４−ＴＣＲ−被覆ラテックスビーズの調製および染色 抗原のＴＣＲ染色の感受性を改良するために、蛍光マーカーで標識されたＴＣ
Ｒ−被覆ビーズを作成した．蛍光標識された、ニュートラビディン−被覆ビーズ
を、モレキュラー プローブスより購入した。ビオチン化された可溶性ＴＣＲに
よるビーズのコーティングは、４℃でＴＣＲの飽和濃度とともに培養することに
よってなされ、ビーズ上の結合部位の最大数がＴＣＲで占有されていることを確
かめた。次にビーズを、バックグラウンドのレベルを減らすためにブロッキング
剤を含むことを除いてはＴＣＲ四量体で説明されたものと類似した方法で、ペプ
チド−パルスを受けた抗原提示細胞を標識するために用いた。この方法は、パル
スを受けていない細胞および無関係なペプチドでパルスを受けた細胞に関する大
量の染色によって証明されたように、完全に成功したわけではなかった。しかし
ながら、特異的ラベリングの実質的な量もまた、染色のバックグラウンドを越え
て観察された（図４９）。興味深いことに、ＴＣＲ−被覆ビーズと共に ｔａｘ
ペプチドでパルスを受けたＴ２細胞のいくつかのラベリングが観察された。この
ラベリングは、ＴＣＲのより高次の多量体により、低い水準の提示された抗原の
検出および結合が可能になることを示すＴＣＲ四量体を用いて検出が可能となる
ものより、規模の次元では低いペプチド濃度である。
【０２２６】 参考文献
【０２２７】
【化４】
【０２２８】
【化５】
【０２２９】
【化６】
【０２３０】
【化７】
【０２３１】
【化８】
【０２３２】
【化９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、Ｔ細胞受容体−ロイシンジッパー融合タンパク質の模式
図である。それぞれの鎖は、２個の免疫グロブリンスーパーファミリードメイン
、即ち１個の可変ドメイン（Ｖ）、１個の定常ドメイン（Ｃ）からなる。定常ド
メインは、鎖同士のシステイン残基のｎ−末端を即座に切り離し、短いリンカー
を介してｃ−末端で約４０のアミノ酸のｃ−ｊｕｎ（α）およびｃ−ｆｏｓ（β
）からのロイシンジッパーヘテロ二量体モチーフに融合される。α−ｊｕｎおよ
びβ−ｆｏｓはそれぞれ、二個の鎖間ジスルフィド結合、単に非共有的な接触に
よる対からなる。α鎖は、定常ドメインが小さいためβ鎖より短い。
【図２】 図２は、ヘテロ二量体ＪＭ２２ｚｉｐ受容体の、還元／非還元ゲ
ル分析の写真である。精製されたＴＣＲ−ジッパーの同一サンプルが１５％アク
リルアミドＳＤＳゲル上にローディングされ、それぞれは還元条件（レーン２）
および非還元条件（レーン４）である。マーカータンパク質は、レーン１および
３に示される。分子量はキロダルトンで示した。両条件下で、非共有結合的に関
係しているヘテロ二量体は、アルファおよびベータ鎖に切断する。レーン４にお
いて、それぞれの鎖は高い移動度で、単一のバンドとして移動し、一種類の鎖内
のジスルフィド結合が存在することを示している。これは正しいジスルフィド結
合形成と一致している。
【図３】 図３は、ＪＭ２２ｚｉｐ ＴＣＲのＨＬＡ−Ａ２ｆｌｕマトリッ
クス（Ｍ５８−６６）複合体への特異的な結合を示す図である。ＨＬＡ−Ａ２複
合体は、単一ペプチド周辺で再生され、β２−ミクログロブリンでビオチン化さ
れており、３個のストレプトアビジン フローセル上に固定化されている：ＨＬ
Ａ−Ａ２ ＰＯＬの３７７０の共鳴単位（ＲＵ）は、フローセル（ＦＣ）３およ
びＨＬＡ−Ａ２ Ｍ５８−６６ ＦＬＵの二つの異なるレベルを制御している（
ＦＣ１の２９７０ＲＵ、およびＦＣ２の４９６０ＲＵ）。４３μＭの濃度のＪＭ
２２ｚｉｐは、すべての３つのフローセル上に６０秒間連続的に可溶性相中へ注
入された。注入の間、ＨＬＡ−Ａ２ ＦＬＵ−被覆フローセル両方の応答での上
記バックグラウンドの増加は、フローセル１および２それぞれへのＪＭ２２ｚｉ
ｐの特異的結合である約１０００ＲＵおよび７０ＲＵでみられた。
【図４】 図４は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインと融合した
、ＪＭ２２からのＴＣＲα鎖で制限された可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕ マトリ
ックスタンパク質の配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示
している。Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配列の５’
末端にローディングされた変異は小文字で示されており、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕ
ｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図５】 図５は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインと融合した
、ＪＭ２２からのＴＣＲβ鎖で制限された可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕ マトリ
ックスタンパク質のタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（
下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文字
で示されている。セリン残基をシステイン残基に置換したＤＮＡ配列は、太文字
かつ下線で示されている。この変異は、ＴＣＲの折りたたみ効率を高めている。
【図６】 図６は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよびＢｒ
ｉＡの基質として作用するビオチン化標識と融合する、ＪＭ２２からのＴＣＲβ
鎖で制限された可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕ マトリックスのタンパク質配列（
一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ
−ｆｏｓ配列間およびｃ−ｆｏｓおよびビオチン化標識の間のリンカー配列は、
小文字で示されている。セリン残基をシステイン残基に置換したＤＮＡ配列の変
異は、太文字および下線で示されている。この変異は、ＴＣＲの折りたたみ効果
を高めている。
【図７】 図７は、ＴＣＲ−ジッパー−ビオチン化標識融合タンパク質の模
式図を示している。
【図８】 図８は、塩化ナトリウムの勾配で、ＰＯＲＯＳ １０ＨＱカラム
から再生ＴＣＲを溶出した結果を示している。ＴＣＲは、約１００ｍＭ ＮａＣ
ｌで単一のピークとして溶出した。０．１以上のＯＤ（２８０ｎｍ）値を持つタ
ンパク質を含むフラクションは、貯蔵され、ビオチン化のために濃縮された。
【図９】 図９は、スーパーデックス２００ＨＲ １０／３０カラム（ファ
ルマシア）を用いたゲルろ過によってビオチン化ＴＣＲを遊離ビオチンから分離
した結果を示している。ＴＣＲ−ビオチンは、約１５ｍｌで溶出し、６９ｋＤａ
の分子量に相当した（標準タンパク質およびそれらの溶出量：サイログロブリン
（６６９ｋＤａ）１０．１４ｍｌ，アポフェリチン（４４３ｋＤａ）１１．３６
ｍｌ，β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）１２．７２ｍｌ，ＢＳＡ二量体（１３４
ｋＤａ）１３．１２ｍｌ，ＢＳＡ単量体（６７ｋＤａ）１４．９３ｍｌ，オバル
ブミン（４３ｋＤａ）１５．００ｍｌ，キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）
１８．０９ｍｌ，ＲＮアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）１８．９１ｍｌ）。
【図１０】 図１０は、スーパーデックス２００ＨＲ １０／３０カラム（
ファルマシア）を用いたＴＣＲ四量体のゲルろ過の結果を示している。１４．６
１および１２．７４のピークは、エクストラアビジンを安定化するために用いら
れたＢＳＡ（単量体および二量体）に一致する。エクストラアビジン−ＦＩＴＣ
が四量体化に用いられた場合、１１．５９のピークは、イエローＦＩＴＣ（ｙｅ
ｌｌｏｗ ＦＩＴＣ）の存在によって判断されたＴＣＲ四量体を含む。このピー
クは、分子量３４０ｋＤａに相当し、エクストラアビジン−結合ＴＣＲ四量体に
一致する。
【図１１】 図１１は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインと融合
した、クローンＡ６からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限さ
れたＴＣＲα鎖のタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下
部）を示している（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚ
ｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子発現を増強するため
にＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ
配列間のリンカー配列のように、小文字で示されている。
【図１２】 図１２は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９
６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖
のタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示してい
る。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
アラニン残基をシステイン残基に置換したＤＮＡ配列は、太文字かつ下線で示さ
れている。
【図１３】 図１３は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインと融合
した、クローンＭ１０Ｂ７／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可
溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖のタンパク質
の配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲ
およびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図１４】 図１４は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、ｍ１０Ｂ７／Ｄ３（
Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ
−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖のタンパク質配列（一文字コード、上部）および
ＤＮＡ配列（下部）を示している。アラニン残基をシステイン残基で置換したＤ
ＮＡ配列の変異は、太文字および下線で示されている。クローニング目的のため
、かつＸｍａＩ制限部位を除去するためにローディングされた二つのサイレント
変異（Ｐ−Ｇコドン）もまた小文字で示されている。
【図１５】 図１５は、“ＴＣＲ遺伝子のアンカー増幅”のために用いられ
た合成ＤＮＡプライマーを示している。クローニングに用いられたＤＮＡ制限酵
素の認識部位は、下線で示されている。Ａ：ポリ−Ｃ“アンカープライマー”。
Ｂ：ＴＣＲα鎖定常領域特異的プライマー。Ｃ：ＴＣＲβ鎖定常領域特異的プラ
イマー。
【図１６】 図１６は、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コ
イル（“ロイシンジッパー”）領域をコードするＤＮＡフラクションのＰＣＲ増
幅に用いられる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。クローニングに用い
られたＤＮＡ制限酵素の認識部位は、下線で示している。Ａ：ｃ−ｊｕｎ５’プ
ライマー。Ｂ：ｃ−ｊｕｎ３’プライマー。Ｃ：ｃ−ｆｏｓ５’プライマー。Ｄ
：ｃ−ｆｏｓ３’プライマー。
【図１７】 図１７は、ＴＣＲに融合したｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎフラ
グメント（ｐＢＪ１０７およびｐＢＪ１０８に挿入）のぞれぞれのＤＮＡおよび
アミノ酸（一文字コード）配列を示している。Ａ：ＴＣＲα鎖に融合したｃ−ｊ
ｕｎロイシンジッパー。Ｂ：ＴＣＲβ鎖に融合したｃ−ｆｏｓロイシンジッパー
。
【図１８】 図１８は、ＴＣＲβ鎖で対をなさないシステイン残基を変異さ
せるのに用いる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。プライマーは、変異
誘発のための“クイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）TM”法（ストラタ
ジーン）の使用により切れるように設計されている。Ａ：フォワード（センス）
プライマーのシステインからセリンへの変異の、アミノ酸配列と変異を示す。Ｂ
：バックワード（ナンセンス）プライマーのシステインからセリンへの変異。Ｃ
：フォワード（センス）プライマーのシステインからアラニンへの変異の、アミ
ノ酸配列と変異を示す。Ｄ：バックワード（ナンセンス）プライマーのシステイ
ンからアラニンへの変異。
【図１９】 図１９は、ＴＣＲ−ジッパー融合タンパク質の模式的表現であ
る。４つの免疫グロブリンドメインは、ドーム状に示されており、示されている
システイン残基マッチング対間で鎖内のジスルフィド結合を持つ。数は成熟した
Ｔ細胞受容体鎖でのアミノ酸位置を示している；組換え後の鎖長さにおけるわず
かな変動により、鎖長さは異なるＴＣＲ間で多少変化する。リンカー配列におい
てローディングされた残基は、一文字コードで示されている。
【図２０】 図２０は、ＴＣＲαおよびβ鎖のＰＣＲ増幅に用いる合成ＤＮ
Ａプライマーの配列を示す。ＤＮＡ制限酵素の認識部位は下線で示され、それぞ
れのＴＣＲ鎖に対応するアミノ酸配列は、フォワードプライマー配列の上に示さ
れている。ＴＣＲ遺伝子配列およびＴＣＲ遺伝子に相当しない他のＤＮＡ配列に
関連したサイレントＤＮＡ変異は、小文字で示されている。Ａ：ＪＭ２２インフ
ルエンザマトリックスウイルスペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα１０．
２鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｂ：ＪＭ２２インフルエンザ
マトリックスウイルスペプチドＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ１７鎖で限定され
たＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｃ：インフルエンザ核タンパク質ペプチド−
Ｈ２−ＤbのマウスＶα４鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｄ：
インフルエンザ核タンパク質ペプチド−Ｈ２−ＤbのマウスＶβ１１鎖で限定さ
れたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｅ：００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−
ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα２３鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマ
ー。Ｆ：００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ５
．１鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｇ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ
ペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα２．３鎖で限定されたＡ６ ＴＣＲの
５’ＰＣＲプライマー。Ｈ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０
１のヒトＶβ１２．３鎖で限定されたＡ６ ＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｉ
：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα１７．２鎖で
限定されたＢ７ ＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｊ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペ
プチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ１２．３鎖で限定されたＢ７ ＴＣＲの
５’ＰＣＲプライマー。Ｋ：一般的に適用できる、ヒトＣα鎖の３’ＰＣＲプラ
イマー。Ｌ：一般的に適用できる、ヒトＣβ鎖の３’ＰＣＲプライマー。
【図２１】 図２１は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで限定されたＴ
ＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配
列の５’末端にローディングされた変異は、小文字で示されており、ＴＣＲおよ
びｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図２２】 図２２は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで制限されたＴ
ＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文
字で示されている。
【図２３】 図２３は、ｃ−ｊｕｎからの“ロイシンジッパー”ドメインに
融合した、マウスＦ５受容体からの可溶性Ｈ２−Ｄb／インフルエンザウイルス
核タンパク質で制限されたＴＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コー
ド、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発
現を増強するためにＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、小文字
で示されており、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図２４】 図２４は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、マウスＦ５受容体からの可溶性Ｈ２−Ｄb／インフルエンザウイルス核タ
ンパク質によって制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コ
ード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示したものである。ＴＣＲおよびｃ−
ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図２５】 図２５は、ｃ−ｊｕｎからの“ロイシンジッパー”ドメインに
融合した、患者００３からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ Ｇａｇで制限さ
れたＴＣＲα鎖の、予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤ
ＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現を増強するために
ＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、小文字で示されており、Ｔ
ＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図２６】 図２６は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、患者００３からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ Ｇａｇで制限された
ＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配
列（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小
文字で示されている。
【図２７】 図２７は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、クローンＡ６（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，１９９６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１
Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（
一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉで
の遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異
は、小文字で示されており、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同
様である。
【図２８】 図２８は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ
ｅｔ ａｌ，１９９６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で
制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およ
びＤＮＡ配列（下部）を示している（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ
，１９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８１；Ｈｏｗａｒ
ｄ，Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａｌｌ
ａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ，１９９９）。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリン
カー配列は、小文字で示されている。システイン残基をアラニン残基に置換した
ＤＮＡ配列の変異は、太文字および下線にて示されている。
【図２９】 図２９は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、クローンＭ１０Ｂ７／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可
溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖の予想される
タンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している
。ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図３０】 図３０は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＭ１０Ｂ７
／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ
／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コ
ード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ
配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。アラニン残基をシステイン残
基に置換したＤＮＡ配列の変異は、太文字および下線にて示されている。クロー
ニング目的、かつＸｍａＩ制限部位を除去するためにローディングされた二つの
サイレント変異（Ｐ−Ｇコドン）もまた小文字で示されている。
【図３１】 図３１は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ
ｅｔ ａｌ，１９９６）からの変異型可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−
Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部
）およびＤＮＡ配列（下部）を示している（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂ
ｅｌｌ，１９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８１；Ｈｏ
ｗａｒｄ，Ｓｈａｗ，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈ
ａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ，１９９９）。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配
列は、小文字で示されている。システイン残基をアラニン残基に置換したＤＮＡ
配列の変異は、太文字および下線にて示されている。またアスパラギン残基のア
スパラギン酸への置換、可溶性ＴＣＲに影響を与える検知されうる機能を持たな
い定常領域における変異も太文字および下線で示されている。
【図３２】 図３２は、ＴＣＲβ鎖で使用されるｃ−ｆｏｓビオチン化融合
パートナーの予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配
列（下部）を示している。ＤＮＡ制限酵素の認識部位は下線で示され、二つの融
合ドメインの太文字が示されている。リンカー配列は小文字で示されている。
【図３３】 図３３は、ヒトＪＭ２２インフルエンザマトリックスペプチド
−ＨＬＡ−Ａ０２０１のＶβ−ｃ−ｆｏｓロイシンジッパーフラグメントのＰＣ
Ｒ増幅に用いる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。
【図３４】 図３４は、ゲルの写真のセットである。ａ．００３ＨＩＶｇａ
ｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なＴＣＲの変性タンパク質標品を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド
）、レーン２および３：０．５ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導させた後
のバクテリア、レーン４および５：６Ｍグアニジンバッファーに可溶化した精製
封入体。ｂ．インフルエンザマトリックスペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異
的なビオチン−標識されたＴＣＲの変性タンパク質標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析した。レーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２およ
び３：６Ｍグアニジンバッファーに可溶化したα−およびβ鎖の精製封入体。ｃ
．ＨＴＬＶ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なビオチン−標識さ
れたＴＣＲの変性タンパク質標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１お
よび５：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２、３および４：０
．５ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導させた後のバクテリア中のα−、β
−および変異鎖発現、レーン６、７および８：６Ｍグアニジンバッファー中で可
溶化した封入体を精製したα−、β−および変異型β鎖。
【図３５】 図３５は、ＰＯＲＯＳ １０ＨＱ陰イオン交換カラムからのＪ
Ｍ２２ｚヘテロ二量体の溶出を示すクロマトグラフィーである。破線は、塩化ナ
トリウム濃度を示す導電率を表しており、実践は溶出したタンパク質濃度を示す
２８０ｎｍでの光学濃度を表している。ピークのタンパク質を含むフラクション
は、さらなる分析のために貯蔵された。インサートはスーパーデックス２００Ｈ
Ｒカラムからの精製ＪＭ２２ｚの溶出のクロマトグラムを示している。矢印は既
知分子量のタンパク質を用いたカラムの標準メモリを示している。これらのタン
パク質を用いた比較によって、再生ＪＭ２２ｚタンパク質は、約７４ｋＤａの分
子量を持つことがわかり、これはヘテロ二量体タンパク質と一致する。
【図３６】 図３６は、精製ＪＭ２２ｚタンパク質の（クーマシー染色され
た）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。レーン１およ
び３：既知分子量の標準タンパク質（示した通り）、レーン２：サンプルをロー
ディングする前に還元剤（ＤＴＴ）を含むＳＤＳ−サンプルバッファーで処理し
たＪＭ２２ｚタンパク質、レーン４：還元剤を含まないＳＤＳ−サンプルバッフ
ァーで処理したＪＭ２２ｚタンパク質。
【図３７】 ａ．インフルエンザマトリックスペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合
体に特異的な、再生ビオチン−標識されたＴＣＲの精製。ｉ．ＰＯＲＯＳ １０
ＨＱカラムからのタンパク質の溶出のクロマトグラム。ｘ軸は２８０ｎｍでの吸
収を示し、ｙ軸は導電率（タンパク質溶出に用いられる塩化ナトリウム濃度勾配
の目安）を示す。フラクション数は垂直線で示されている。ii．ｉにおけるカラ
ムから溶出したフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は広範囲の分子量マ
ーカー（バイオラッド）であり、およびレーン２〜１３はフラクション６〜１５
のそれぞれ５μｌである。iii．ビオチン−標識されたｆｌｕ−ＴＣＲを含むｉ
の貯蔵フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：広範囲の分子量マーカ
ー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン−標識されたｆｌｕ−ＴＣＲタンパク
質。ｂ．ＨＴＬＶ−ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的な、再生ビオ
チン−標識されたＴＣＲの精製。ｉ．ＰＯＲＯＳ １０ＨＱカラムからのタンパ
ク質の溶出のクロマトグラム。ｘ軸は２８０ｎｍでの吸収を示し、ｙ軸は導電率
（タンパク質溶出に用いられる塩化ナトリウム濃度勾配の目安）を示す。フラク
ション数は垂直線で示されている。フラクション数は垂直線で示されている。ii
．ｉにおけるカラムから溶出したフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は
広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）であり、およびレーン２〜１０はフラ
クション３〜１１のそれぞれ５μｌである。iii．ビオチン−標識されたｔａｘ
−ＴＣＲを含むｉの貯蔵フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：広範
囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン−標識されたｔａｘ
−ＴＣＲタンパク質。レーン３：変異型ビオチン−標識されたｔａｘ−ＴＣＲタ
ンパク質。
【図３８】 図３８は、ＢｒｉＡ酵素でビオチン化した後のビオチン−標識
された可溶性ＴＣＲの、ＰＢＳで平衡化したスーパーデックス２００ＨＲカラム
からの溶出を示すクロマトグラムである。ビオチン化ＴＣＲは、約１５〜１６分
で溶出し、遊離のビオチンは約２１分で溶出する。ビオチン化可溶性ＴＣＲを含
むフラクションは、将来的な使用のために貯蔵される。
【図３９】 図３９は、ゲルの写真のセットであり、ビオチン化ＴＣＲのビ
オチン化を評価する。ａ．再生ＴＣＲおよび封入体標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レ
ーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン化ｆｌ
ｕ−ＴＣＲ、レーン３：ビオチン化ｔａｘ−ＴＣＲ、レーン４：ビオチン化変異
型ｔａｘ−ＴＣＲ、レーン５：ＨＩＶｇａｇ−ＴＣＲ（ビオチン化標識を付され
ていない）；ｂ．広範囲のマーカーがビオチン−標識されていること（バイオラ
ッド）を除けばａ．と同一のゲルのウェスタンブロット。染色は、ビオチン化タ
ンパク質を示すためにアビジン−ＨＲＰ接合体を用い、可視化はＯｐｔｉ−４Ｃ
Ｎ（バイオラッド）を用いた。
【図４０】 図４０は、異なるＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体に結合するＪ
Ｍ２２ｚを説明している。（はめ込み）ＪＭ２２ｚおよびＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ
間の相互作用の特異性は、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの１９００ＲＵで被覆したフロ
ーセル上でＴＣＲを通過することから得られるＳＰＲ応答と、ＨＬＡ−Ａ２−ｐ
ｏｌの４２００ＲＵで被覆した他の二つのフローセル、ＣＤ５の４３００ＲＵで
被覆した他のものの上でＴＣＲを通過することから得られる応答とを比較するこ
とによって説明される。異なるＪＭ２２ｚ濃度のバックグラウンド応答は、ＨＬ
Ａ−Ａ２−ｐｏｌの１７００ＲＵで測定された（ａ）。バックグラウンド値は、
ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの１９００ＲＵで測定された特異的応答から引かれ（ｂ）
、さらに濃度に対してプロットされた（ｃ）。１３μＭのＫｄは、非線形の曲線
のあてはめによって見積もられ、１２μＭのＫｄに従い同じデータのキャッチャ
ードプロットを基礎にして計算された。
【図４１】 図４１は、天然型および変異型可溶性ビオチン化ｔａｘＴＣＲ
のＢｉａｃｏｒｅ２０００TM分析結果を示すグラフである。５μlの、２．２ｍ
ｇ／ｍｌ濃度の天然型 ｔａｘＴＣＲ、次に２．４ｍｇ／ｍｌ濃度の天然型 ｔａ
ｘＴＣＲを、以下のタンパク質を表面に付着させた４つのフローセル上に流した
。Ａ：ｔａｘ−ｐＭＨＣ複合体、Ｂ／Ｃ：ｆｌｕ−ｐＭＨＣ複合体、Ｄ：ＯＸ６
８コントロールタンパク質。天然型および変異型タンパク質の両方は、特異的ｐ
ＭＨＣ複合体に同様に結合した。
【図４２】 図４２は、同じＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ複合体に結合している可
溶性ＴＣＲ上に結合している可溶性ＣＤ８ａａの効果を示している。（Ａ）ＴＣ
Ｒ、または、ＴＣＲおよび１２０μＭ可溶性ＣＤ８は、無関係なタンパク質（Ｃ
Ｄ５）の４１００ＲＵで被覆したコントロールフローセルおよびＨＬＡ−Ａ２−
ｆｌｕの４７００ＲＵで被覆したプローブフローセルへ注入された。バックグラ
ウンドを差し引いた後、ＴＣＲ単独の異なる濃度（白丸）で、または、１２０μ
Ｍの可溶性ＣＤ８との組み合わせ（黒丸）において計算された平衡応答値が示さ
れる。またＣＤ８単独の値（白三角）およびＴＣＲ＋ＣＤ８とＴＣＲとの間の計
算された差（白四角）も示される。（Ｂ）２５℃における、４９μＭＴＣＲ単独
の固定化ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの４７００ＲＵに対する応答の、時間依存性（白
丸）、または、１２０μＭ ＣＤ８との組み合わせ（黒丸）、および５μｌ／分
の流速が示されている（その値は、固定化ＣＤ５の４１００ＲＵで測定されたバ
ックグラウンド寄与率のために測定された）。ＴＣＲのオフ−レイトは同時のＣ
Ｄ８の結合によって影響を受けなかった。
【図４３】 エクストラアビジンを用いたビオチン化ＴＣＲの四量体化。ス
ーパーデックス２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過は、ビオチン化ＴＣＲおよび
エクストラアビジンが結合していずれのタンパク質よりも高い分子量を持つオリ
ゴマーを形成することを示している。ゲルろ過クロマトグラフィー：Ａ．エクス
トラアビジン、Ｂ．ビオチン化ＴＣＲ、Ｃ．ＴＣＲ四量体。
【図４４】 図４４は、ＰＲＥ−改変ストレプトアビジンを用いたビオチン
化ＴＣＲの四量体である。スーパーデックス２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過
は、ビオチン化ＴＣＲおよびストレプトアビジン−ＲＰＥが結合していずれのタ
ンパク質よりも高い分子量を持つオリゴマーを形成することを示している。ゲル
ろ過クロマトグラフィー：Ａ．ストレプトアビジン−ＲＰＥ、Ｂ．ビオチン化Ｔ
ＣＲ、Ｃ．ＴＣＲ−ＲＰＥ四量体。
【図４５】 図４５Ａは、ビオチン化可溶性ｆｌｕ−ＴＣＲのＢｉａｃｏｒ
ｅ分析の結果を示すグラフである。１ｍｇ／ｍｌ濃度のｆｌｕ−ＴＣＲ ５μｌ
を、ストレプトアビジンを介して付着した以下のものとともに３つのフローセル
上に流した。ｉ：非特異的コントロールタンパク質、ii：ｆｌｕマトリックスｐ
ＭＨＣ、iii：ｔａｘ ｐＭＨＣ。図４５Ｂはｆｌｕ−ＴＣＲ四量体のＢｉａｃ
ｏｒｅ分析の結果を示すグラフである。０．００５ｍｇ／ｍｌ濃度の５μｌのｆ
ｌｕ−ＴＣＲ四量体溶液を、ストレプトアビジンを介して付着した以下のものと
ともに３つのフローセル上に流した。ｉ：非特異的コントロールタンパク質、ii
：ｆｌｕマトリックスｐＭＨＣ、iii：ｔａｘｐＭＨＣ。
【図４６】 図４６Ａは、ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲのＢｉａｃｏｒｅ
分析の結果を示すグラフである。１ｍｇ／ｍｌ濃度のｆｌｕ−ＴＣＲ ５μｌを
、ストレプトアビジンを介して付着した以下のものとともに２つのフローセル上
に流した。ｉ：非特異的コントロールタンパク質、ii：ｆｌｕマトリックスｐＭ
ＨＣ、iii：ｔａｘ ｐＭＨＣ。図４５Ｂは、ｔａｘ−ＴＣＲ四量体のＢｉａｃｏ
ｒｅ分析の結果を示すグラフである。０．０５ｍｇ／ｍｌ濃度のｆｌｕ−ＴＣＲ
５μｌを、ストレプトアビジンを介して付着した以下のものとともに３つのフ
ローセル上に流した。ｉ：非特異的コントロールタンパク質、ii：ｆｌｕマトリ
ックスｐＭＨＣ、iii：ｔａｘ ｐＭＨＣ。
【図４７】 Ｔ２細胞のＦＡＣＳ分析は、様々なレベルのペプチドでパルス
を受け、インフルエンザマトリックスペプチドまたはＨＴＬＶｔａｘペプチドの
いずれかに特異的なＴＣＲ四量体で染色した。Ａ．分析のための細胞のゲーティ
ング（ｇａｔｉｎｇ）。Ｂ．“データ．００１”＝０ペプチド；“データ．００
７”＝１０-4Ｍ ｆｌｕペプチド；“データ．００９”＝１０-5Ｍ ｆｌｕペプ
チド；“データ．０１０”＝１０-6Ｍ ｆｌｕペプチド；“データ．００３”＝
１０-4ｔａｘペプチドでパルスを受けたＴ２細胞の染色であり、すべてＲＰＥで
標識された５(ｇ ｆｌｕ−ＴＣＲ四量体で染色されている。Ｃ．“データ．０
０２”＝０ペプチド；“データ．００４”＝１０-4Ｍ ｔａｘペプチド；“デー
タ．００５”＝１０-5Ｍ ｔａｘペプチド；“データ．００６”＝１０-6Ｍ ｔ
ａｘペプチド；“データ．００８”＝１０-4ｆｌｕペプチドでパルスされたＴ２
細胞の染色であり、すべてＲＰＥで標識された５μｇ ｔａｘ−ＴＣＲ四量体で
染色されている。
【図４８】 ４５細胞のＦＡＣＳ分析は、様々なレベルのペプチドでパルス
を受け、インフルエンザマトリックスペプチドまたはＨＴＬＶ ｔａｘペプチド
のいずれかに特異的なＴＣＲ四量体で染色した。Ａ．分析のための細胞のゲーテ
ィング。Ｂ．“データ．００２”＝０ペプチド；“データ．００４”＝１０-4Ｍ
ｆｌｕペプチド；“データ．００６”＝１０-5Ｍ ｆｌｕペプチド；“データ
．０１０”＝１０-4ｔａｘペプチドでパルスされた４５細胞の染色であり、すべ
てＲＰＥで標識された５(ｇ ｆｌｕ−ＴＣＲ四量体で染色されている。Ｃ．“
データ．００３”＝０ペプチド；“データ．０１１”＝１０-4Ｍ ｔａｘペプチ
ド；“データ．０１３”＝１０-5Ｍ ｔａｘペプチド；“データ．０１５”＝１
０-6Ｍ ｔａｘペプチド；“データ．００５”＝１０-4ｆｌｕペプチドでパルス
された４５細胞の染色であり、すべてＲＰＥで標識された５(ｇ ｔａｘ ＴＣ
Ｒ四量体で染色されている。
【図４９】 様々なレベルのペプチドでパルスを受け、赤蛍光標識を用いて
ＴＣＲ−被覆ラテックスビーズ（‘蛍光’−分子プローブ）で染色されたＴ２細
胞のＦＡＣＳ分析である。Ａ．分析のための細胞のゲーティング、Ｂ．分析にた
めの染色された細胞のゲーティング。シフトは、細胞に結合する多くのビーズに
よって生じるサイド−散乱であることに留意すること。Ｃ．“データ．００２”
＝０ペプチド；“データ．００４”＝１０-4Ｍ ｆｌｕペプチド；“データ．０
０６”＝１０-5Ｍ ｆｌｕペプチド；“データ．００７”＝１０-6Ｍ ｆｌｕペ
プチドでパルスを受けたＴ２細胞の染色であり、すべて１０μｌ ｆｌｕ−ＴＣ
Ｒ−被覆ビーズで染色された。Ｄ．“データ．００３”＝ ０ ペプチド； “
データ．００９”＝ １０-4 Ｍ ｔａｘペプチド； “データ．０１０”＝
１０-5 Ｍ ｔａｘペプチド； “データ．０１１”＝ １０-6 Ｍ ｔａｘペ
プチドでパルスを受けたＴ２細胞の染色であり、すべて１０μｌ −ＴＣＲ−被
覆ビーズで染色された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 57Ｃ Ｍｉｌｔｏｎ Ｐａｒｋ，Ｍｉｌｔ ｏｎ，Ｏｘｏｎ，ＯＸ14 ４ＲＸ，Ｇｒｅ ａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ (72)発明者 ボールター，ジョナサン，マイケル イギリス国，オーエックス14 ４アールエ ックス，オキソン，ミルトン，57シー ミ ルトン パーク，アヴィデックス リミテ ッド

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための、合成多価Ｔ細胞
    受容体（ＴＣＲ）複合体であって、前記ＴＣＲ複合体は前記ＭＨＣ−ペプチド複
    合体に特異的な複数のＴ細胞受容体を含んでなることを特徴とするＴＣＲ複合体
    。
  2. 【請求項２】 前記Ｔ細胞受容体は、１つのα鎖と１つのβ鎖とを有するα
    βＴ細胞受容体であることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ複合体。
  3. 【請求項３】 前記α鎖およびβ鎖は、可溶形態のＴ細胞受容体αおよびβ
    鎖であることを特徴とする請求項２に記載のＴＣＲ複合体。
  4. 【請求項４】 前記Ｔ細胞受容体は、２またはそれ以上のＴ細胞受容体の多
    量体の形態であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＣＲ
    複合体。
  5. 【請求項５】 前記多量体は、三量体または四量体であることを特徴とする
    請求項４に記載のＴＣＲ複合体。
  6. 【請求項６】 前記Ｔ細胞受容体は、結合分子を介して互いに会合してなる
    ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  7. 【請求項７】 前記結合分子は、アビジン、ストレプトアビジン、またはエ
    クストラアビジンのような多価付着分子であることを特徴とする請求項６に記載
    のＴＣＲ複合体。
  8. 【請求項８】 前記Ｔ細胞受容体αまたはβ鎖の少なくとも１つが、ビオチ
    ンなどの修飾酵素に対するアミノ酸認識配列を含む融合タンパク質から誘導され
    てなることを特徴とする請求項７に記載のＴＣＲ複合体。
  9. 【請求項９】 前記Ｔ細胞受容体は、ビオチン化されてなることを特徴とす
    る請求項８に記載のＴＣＲ複合体。
  10. 【請求項１０】 非多量体Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて増強された結
    合能力を有する、多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体を含んでなる
    ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  11. 【請求項１１】 非多量体Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて増強された結
    合能力を有する、多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体を含んでなる
    多価ＴＣＲ複合体。
  12. 【請求項１２】 前記Ｔ細胞受容体は、 ｉ）第一の異種のＣ−末端二量体化ペプチドを有する組換えＴ細胞受容体のαま
    たはγ鎖の細胞外ドメイン；および ii）前記第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体
    化ドメインを形成する第二のＣ−末端二量体化ペプチドを有する組換えＴ細胞受
    容体のβまたはδ鎖の細胞外ドメイン、 を含んでなる再生された組換えＴ細胞受容体であることを特徴とする請求項１〜
    １１のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  13. 【請求項１３】 細胞質ドメインに隣接する前記α及びβまたはγ及びδ鎖
    間の、天然のＴ細胞受容体において存在するジスルフィド結合が、前記組換えＴ
    細胞受容体に存在しないことを特徴とする請求項１２に記載のＴＣＲ複合体。
  14. 【請求項１４】 前記ヘテロ二量体化ドメインは、高次コイルドメインであ
    ることを特徴とする請求項１２または１３に記載のＴＣＲ複合体。
  15. 【請求項１５】 前記二量体化ペプチドは、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓ二
    量体化ペプチドであることを特徴とする請求項１４に記載のＴＣＲ複合体。
  16. 【請求項１６】 前記Ｔ細胞受容体鎖および前記へテロ二量体化ペプチド間
    に位置する可変性リンカーを含んでなることを特徴とする請求項１２〜１５のい
    ずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  17. 【請求項１７】 前記Ｔ細胞受容体は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系で発現されてな
    ることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  18. 【請求項１８】 前記Ｔ細胞受容体は、Ｃ末端でビオチン化されてなること
    を特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  19. 【請求項１９】 前記Ｔ細胞受容体は、脂質二重層に会合してなることを特
    徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  20. 【請求項２０】 前記脂質二重層は、小胞を形成してなることを特徴とする
    請求項１９に記載のＴＣＲ複合体。
  21. 【請求項２１】 前記Ｔ細胞受容体は、前記小胞の外側に付着してなること
    を特徴とする請求項２０に記載のＴＣＲ複合体。
  22. 【請求項２２】 前記Ｔ細胞受容体は、前記小胞に由来する（derivatised
    ）脂質成分を介して前記小胞に付着してなることを特徴とする請求項２０または
    ２１に記載のＴＣＲ複合体。
  23. 【請求項２３】 前記Ｔ細胞受容体は、前記脂質二重層に埋没されてなるこ
    とを特徴とする請求項１９または２０に記載のＴＣＲ複合体。
  24. 【請求項２４】 前記Ｔ細胞受容体は、微粒子に付着してなることを特徴と
    する請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  25. 【請求項２５】 識別標識をさらに含んでなることを特徴とする請求項１〜
    ２４のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  26. 【請求項２６】 細胞障害剤または免疫促進剤のような治療剤をさらに含ん
    でなることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体。
  27. 【請求項２７】 インビボで使用される、薬剤的に許容される製剤中に含ま
    れてなることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＴＣＲ複合体
    。
  28. 【請求項２８】 （ｉ） （ａ）複数のＴ細胞受容体を含む合成多価Ｔ細胞
    受容体複合体、および／または、（ｂ）非多量体のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と
    比べて増強された結合能力を有する多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二
    量体を含む、合成多価Ｔ細胞受容体複合体を準備すること（ただし、前記Ｔ細胞
    受容体は前記ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的である）、 （ii） 前記多価ＴＣＲ複合体とＭＨＣ−ペプチド複合体とを接触させること、
    および、 （iii） 前記多価ＴＣＲ複合体のＭＨＣ−ペプチド複合体に対する結合を検出
    すること、 を含むことを特徴とするＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法。
  29. 【請求項２９】 前記多価ＴＣＲ複合体は、識別標識が設けられてなること
    を特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 特異的なペプチド抗原を提示する細胞を検出することを目
    的とする請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記多価ＴＣＲ複合体は、請求項１〜２７のいずれか１項
    に記載の多価ＴＣＲ複合体であることを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか
    １項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 (i) （ａ）複数のＴ細胞受容体を含む合成多価ＴＣＲ複
    合体、および／または、（ｂ）非多量体のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて増
    強された結合能力を有する多量体化された組換えＴ細胞受容体ヘテロ二量体を含
    む合成多価ＴＣＲ複合体を準備することと（ただし、前記Ｔ細胞受容体はＭＨＣ
    −ペプチド複合体に特異的であり、前記多価ＴＣＲ複合体は前記多価ＴＣＲ複合
    体に会合した治療剤を含んでなる）、 (ii) 前記多価ＴＣＲ複合体と潜在的な標的細胞とを、前記Ｔ細胞受容体の前記
    標的細胞への付着を許容する条件下において接触させること、 を含むことを特徴とする標的細胞に治療剤を輸送する方法。
  33. 【請求項３３】 前記多価ＴＣＲ複合体は、請求項１〜２７のいずれか１項
    に記載の多価ＴＣＲ複合体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
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