JP2002513383A

JP2002513383A - 患者の脳組織でのアスコルビン酸の濃度を増加させる方法

Info

Publication number: JP2002513383A
Application number: JP50737798A
Authority: JP
Inventors: アグス、デビッド・ビー; ベラ、ジュアン・シー; ゴールデ、デビッド・ダブリュ
Original assignee: スローン−ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1997-05-21
Filing date: 1998-05-21
Publication date: 2002-05-08
Also published as: EP0983062A4; US6221904B1; US20010053793A1; WO1998052560A1; US6420420B2; EP0983062A1; CA2290381A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者に、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の脳組織でのアスコルビン酸濃度を増加させる方法を提供する。本発明は、デヒドロアスコルビン酸が、促進的グルコース輸送体を介して組織に入ることも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】患者の脳組織でのアスコルビン酸の濃度を増加させる方法本出願では、1997年12月１日に出願された米国仮出願番号第60/067,185号および1997年５月21日に出願された米国仮出願番号第60/0,47,271号の利益が主張され、それらの内容は参照してここに組み込まれる。本発明は、米国政府の認可番号第RO1 CA30388号および第RO1 HL42107号の下に支援された。したがって、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。本出願を通して、括弧内に種々の資料が参照される。これらの文献の開示は、本発明の属する技術の現状を更に十分に既述するために、その全体が本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。これらの資料についての完全な書誌的引用は、本明細書の末尾、請求の範囲の前に見ることができる。〔発明の背景〕脳組織および神経学上の障害と、酸化的フリーラジカルの発生および存在との間には、多くの関連付がなされている。例えば、１）Ｊｅｎｎｅｒ（２６）は、酸化的侵襲をパーキンソン疾患、アルツハイマー疾患およびハンチントン疾患に結びつけた。２）最近の臨床研究では、抗酸化剤活性を示す薬学上の製剤であるアルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）およびセレジリン（デプレニル）が、中程度に重篤なアルツハイマー疾患の進行を遅滞させることができることが示された(２７)。３）ビタミンＣおよびビタミンＥのような抗酸化剤は、その病原論にフリーラジカル形成が関与し且つ抗酸化剤防御を損傷するような疾患の治療において、重要な役割を示す可能性がある。酸化的損傷を、アルツハイマー疾患のような神経変性プロセスの中心的問題として位置づけた仮説がなされてきた(２８)。フリーラジカルの仮説によれば、アルツハイマー疾患は損傷を受けた罹患脳領域における正常な加齢プロセスを促進し、これは代謝から発生したフリーラジカルによって更に進行的に損傷を引き起こす。アルツハイマー疾患では、大脳皮質は、抗酸化剤の必要性を増し、フリーラジカルに対する感受性が増大し、スーパーオキシドジスムターゼのようなフリーラジカルの防御酵素の濃度は、前頭皮質および海馬で２５−３５％まで減少するように見える。海馬のコリン作動性ニューロンの損失はアルツハイマー疾患の主要な特性であり、これらのニューロンは、ムスカリン性のコリン受容体でのフリーラジカルによる破壊効果をとっくに受けやすいように思える(２９)。４）抗酸化剤はパーキンソン疾患用の薬として試験されてきており(３０)、酸化的脱アミノ化の阻害により抗酸化剤として作用する可能性のあるセレジリンが、その障害の発生を遅延させることが分かった(３１)。５）Ｐｅｙｓｅｒらは、抗酸化剤療法が、ハンチントン疾患の経過の初期における運動性低下の速度を遅延させる可能性があると結論づけた(３５)、６）Ｃｈａｌｌｅｍ（３２）によれば、フリーラジカルおよび酸化的侵襲が、狂牛病の病原論に関連した因子である可能性がある。７）脂質過酸化と呼ばれる低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化的修飾は、アテローム硬化症での初期事象であることが示された。抗酸化剤であるプロブコールは、バルーン冠状血管形成後の再狭窄率を減少させる上で有効である(３６)。酸化ＬＤＬは、細胞毒性および血管機能不全のような脳細胞を含めた細胞での数種の有害な影響を示す。したがって、脳組織でフリーラジカルスカベンジャーまたは抗酸化剤の濃度を増加させることは、神経変性疾患に罹った患者に対して治療上の利益を供することができる。Ｓａｎｏらは(２７)、抗酸化剤であるセレジリンまたはビタミンＥを使用することにより、アルツハイマー疾患に罹った患者での臨床的に重要な機能の破壊を遅延させることができると結論づけた。ビタミンＥは、大量には血液 ‐脳防御壁を通過しないが、それでも測定可能な影響を示すので、それらの結果は特に重要である。抗酸化能を増強することは、多くの疾患を治療する上で有用である。例えば、本発明によって達成される抗酸化能の増加により、発作および神経血管疾患を治療することが可能になる。虚血性発作は、成人の間で死亡または障害を生じる最も、一般的な神経学上の障害である。全ての型の発作は死亡の原因として三番目にランクされ、これを越えるのは心臓疾患および癌のみである。虚血性発作は、全発作のおよそ８５％の割合を占める。医療的または手術的治療で、急性虚血性発作の影響を逆行させるものとして確立されたものはまだないので、発作を呈するヒトの初期の同定および治療では、そのような治療が有効かどうかに注目せざるを得ない。最近、発作のために認可された治療はない。発作から生じる損傷は、血管の閉塞によって引起こされ、それにより脳領域への血液中の酸素の送出を制限する。損傷の多くは、影響を受けた領域の再灌流後、閉塞した血管によって助長される領域での酸素フリーラジカルによる損傷にり引起こされる(３７)。したがって、脳の抗酸化能を増加させることは、発作または他の神経血管疾患における有益の効果を示す可能性がある。したがって、患者にデヒドロアスコルビン酸を与えることによって脳内でのビタミンＣ濃度を増加させると、中枢神経系での抗酸化能を増強できるであろうし、上述のとおり発作および神経血管疾患で治療できる。研究者らは、アテローム硬化症、並びにその心臓発作および発作による致死的効果は、血液中においてコレステロールを運搬する低密度脂質タンパク質（ＬＤＬ）の酸化に関連して発生することを提案してきた。その理論では、身体自身の免疫細胞によって発生されるフリーラジカルが、アテローム硬化症病巣を発生する血管内膜細胞によって取込まれるＬＤＬを酸化させる旨が主張されている。紫外線およびガンマ線照射、タバコの煙および他の環境汚染物も、細胞および生命化合物に酸化的損傷を引起こす。その損傷は、癌および冠動脈心臓疾患（ＣＨＤ）を含めた数種の慢性疾患の発生に至る。ビタミンＥおよびＣ、およびカロチノイドのような抗酸化剤が、損傷および確実な疾患を予防できることがさらに提唱された。多くの疫学的研究および動物研究によって、その理論を支持する証拠が提供された(３３，３４)。最近の研究では、抗酸化剤プロブロールが、バルーン冠状血管形成後の再狭窄率を下げる上で効果的であることが示された(３６)。証拠によれば、神経精神科学的障害であるハンチントン疾患の神経病理学は、グルタミン酸ゲートのイオンチャネルの過剰活性化から生じ、それは酸化的侵襲によってニューロンを死滅させることが示唆される。抗酸化剤療法は、ハンチントン疾患過程の初期において、運動の減少の速度を遅れさせる可能性があることが報告された(３５)。ビタミンＣは、デヒドロアスコルビン酸の形態で促進的グルコース輸送体ＧＬＵＴ１を介してイン・ビトロで細胞に入り、そしてアスコルビン酸として細胞内に保持される(１)。デヒドロアスコルビン酸のＧＬＵＴ１輸送がビタミンＣの組織獲得に関する生理学上の一次機構であるとする仮説を試験するために、我々は、げっ歯類での血液‐脳障壁（ＢＢＢ）を通過するビタミンＣの輸送を調べた。ＧＬＵＴ１は、内皮細胞にあるＢＢＢで発現するものであり、グルコースが脳に入る要因である。血中のビタミンＣの優勢な形態であるアスコルビン酸はＢＢＢを越える能力がないのに対して、デヒドロアスコルビン酸は脳に容易に入り、アスコルビン酸の形態で保持された。デヒドロアスコルビン酸の脳への輸送は、Ｄ −グルコースによって完全に阻害されたが、Ｌ−グルコースによっては阻害されなかった。これらの知見は、ＧＬＵＴ１によるデヒドロアスコルビン酸の輸送を、脳がビタミンＣを要求する機構として規定し、ビタミンＣの酸化を、脳によるビタミンの蓄積で重要の調節段階として指摘する。ビタミンＣの酸化形態であるデヒドロアスコルビン酸は、促進的グルコース輸送体を介して輸送されることが先に分かった。ツメガエル卵細胞でのＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２およびＧＬＵＴ４の発現によって、デヒドロアスコルビン酸がアスコルビン酸に還元された後に細胞内に保持されるデヒドロアスコルビン酸を取込む能力が与えられた(１)。促進的グルコース輸送体が、正常なヒト好中球および骨髄白血病セルラインＨＬ６０によるビタミンＣの輸送および蓄積に関与することも確立された(１−３)。これらの細胞で、デヒドロアスコルビン酸は細胞膜を越えて輸送され、そして双方向性グルコース輸送体を介して輸送できない還元形のアスコルビン酸で蓄積される(１−３)。アスコルビン酸は、小腸、腎臓および副腎髄質クロム親和性細胞に存在すると報告されるＮａ⁺−アスコルベート共輸送体を介して輸送できる(４)。共輸送体は、分子的に特徴づけられておらず、または白血球細胞におけるＮａ⁺−依存性アスコルビン酸取込みは発見されていない(２、３)。ＧＬＵＴ１は、ＢＢＢにおける内皮細胞で発現されるものであり、脳へのグルコース輸送の要因である(５、６)。１８８０年代に、Ｅｈｒｌｉｃｈは、静脈内に注射されたアニリン染料が、脳および脊髄を除き、実験用ウサギの臓器の全てを着色することを見出した(７、８)。この観察で、ＢＢＢは血液および脳の間の内皮防御壁を形成し、栄養素の輸送を調節し、生成物を排出する一次的機能がある毛細管の壁から構成されるという最終的知見に至った(９、１０)。ＧＬＵＴ１、モノカルボン酸輸送体、中性アミノ酸輸送体、アミン輸送体、塩基性アミノ酸輸送体、ヌクレオシド輸送体およびプリン塩基輸送体を含めた数種の栄養素輸送体は、ＢＢＢで同定された(１１)。ここで、ビタミンＣは、酸化形態デヒドロアスコルビン酸でのみＧＬＵＴ１を介してＢＢＢを越え、還元形態のアスコルビン酸で脳に保持されることがげっ歯類で示される。本発明は、抗酸化性のビタミンＣを脳組織に制御して導入することを可能にし、そしてそれは、フリーラジカルおよび酸化的損傷に関連した種々の障害を治療および予防する重要な治療法としての役割を果たすにちがいない。〔発明の概要〕本発明は、患者の脳組織でのアスコルビン酸濃度を増加させる方法を提供する方法であって、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を患者に投与することを具備した方法を提供する。本発明はまた、前記デヒドロアスコルビン酸が、促進的グルコース輸送体を介して組織に入る上述の方法を提供する。本発明はまた、患者の神経変性疾患を治療する方法であって、脳組織の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を患者に投与することを具備した方法を提供する。最後に、本発明は、患者の神経変性疾患を予防する方法であって、脳組織の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を患者に投与することを具備した方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１デヒドロアスコルビン酸はＢＢＢを越えて輸送され、アスコルビン酸として脳に蓄積される。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（６−８週齢）および（Ｂ）フィッシャーＦ３４４ラット（体重７０−８０グラム）に、尾部静脈に５μＣｉ（マウス）または１０μＣｉ（ラット）¹⁴Ｃ−アスコルビン酸(Ｌ−［１−¹⁴Ｃ］アスコルビン酸、比活性、６．６ｍＣｉ／ミリモル、デュポン・エヌイーエヌ (ＤｕｐｏｎｔＮＥＮ))、¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸または³Ｈ−ショ糖（ [フルクトース−１−³Ｈ]−ショ糖、比活性２０．０Ｃｉ／ミリモル、デュポン・エヌイーエヌ）を注射した。各群は、１２匹の動物から構成され、そしてその値は、平均⁺ＳＥＭとして現される。（Ｃ）脳のエタノール可溶性分画のＨＰＬＣ分析および（Ｈ）２０μＣｉ¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸を注射され、そして５分間で屠殺されたマウスの血清(注射材料、点線)。（Ｃ）脳におけるビタミンＣの蓄積は、アスコルビン酸の形態である(〜９０＆；保持時間＝１１８０分、実線)。（Ｈ）血清に存在する放射性活性は、アスコルビン酸の形態である(＞９８％；保持時間＝１１．８０分、実線)。¹⁴Ｃ−アスコルビン酸(●)、¹⁴Ｃ− デヒドロアスコルビン酸（■）または³Ｈ−ショ糖（○）を静脈に注射したマウスの脳での放射性活性の蓄積の（Ｄ）最初の動態および（Ｅ）２時間の動態。¹⁴ Ｃ−アスコルビン酸(●)、¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸（■）または³Ｈ−ショ糖（○）を静脈に注射したマウスの血清での放射性活性の（Ｆ）最初の動態および（Ｇ）２時間の動態。（Ｄ）から（Ｇ）までに設定された各データは、４匹のマウス±ＳＥＭを現す。図２Ｂａｌｂ／ｃマウスのＢＢＢでのＧＬＵＴ１を介したデヒドロアスコルビン酸の輸送の特異性。（Ａ）¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸（■）は、脳に入り、そしてその蓄積は、ＧＬＵＴ１を介して輸送されるＤ−デオキシグルコースの量を増加させることによって遮断された。ＢＢＢを越える³Ｈ−ロイシン（○ ）または¹⁴Ｃ−アスコルビン酸（●）の輸送は、Ｄ−デヒドログルコースに。よって影響されなかった。(Ｂ)ＧＬＵＴ１を介して輸送されないＬ−グルコースは、¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸の輸送に影響を示さなかった。ＢＢＢを越える³ Ｈ−ロイシン（○）または¹⁴Ｃ−アスコルビン酸（●）の輸送は、Ｌ−グルコースによって影響されなかった。全ての実験は、３０秒の時間経過をかけて行われた。各データの組は、４匹のマウスを含み、そしてデータは、平均±ＳＥＭとして現された。マウスは、およそ１２ｍＭの基本線の血清グルコース濃度を示し、それはマウスの平均血漿容積に基づいて全マウスで２．６７ｍｇグルコースに換算される。この実験で投与された外来のグルコースの量は、この数に基づき、そして最大寛容レベルに続く多重線であった。図３ ¹⁴Ｃ標識アスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸、Ｄ−デオキシグルコースおよびショ糖を用いたラットの脳のデジタルオートラジオグラフィー。（Ａ）４０μＣｉの¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸、（Ｂ）４０μＣｉ¹⁴Ｃアスコルビン酸および（Ｃ）４０¹⁴μＣｉのＣ−ショ糖（[グルコース−¹⁴Ｃ(Ｕ)]−ショ糖、比活性、３１０ｍＣｉ／ミリモル、デュポン・エヌイーエヌ）を静脈注射した３分後、フィッシャーＦ３４４ラット（８週齢）に対してデジタルオートラジオグラフィーを行った。脳の領域は、図面で＊で示される。デヒドロアスコルビン酸注射ラットについての脳／バックグランド数の光刺激蛍光（ＰＳＬ）／ｍｍ²比は、８．６±０．３（３区分の平均±ＳＥＭ）であった。アスコルビン酸注射ラットでのＰＳＬ／ｍｍ²比は、１．５±０．１、そしてショ糖注射ラットでは、１．４±０．１であった。〔発明の詳細な説明〕本発明は、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の脳組織でのアスコルビン酸濃度を増加させる方法を提供する。本発明は、デヒドロアスコルビン酸が、促進的グルコース輸送体を介して組織に入る上述の方法も提供する。本発明は、患者に、脳組織の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の脳組織中のアスコルビン酸濃度を増加させる方法をも提供する。本発明の１つの実施形態において、患者はヒトである。別の実施形態で、ヒト患者は、神経変性疾患を示す。このような神経変性疾患としては、限定されないが、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、または他の形態の初老期痴呆が挙げられる。別の実施形態においで、患者は、神経血管疾患を示す。本発明は、発作または神経血管疾患を治療または予防するのに有用である。患者は、神経系発現を伴う遺伝性疾患を担持する可能性がある。１つの実施形態では、遺伝性疾患は、ハンチントン疾患である。別の実施形態では、患者は、精神***病を有する。さらに別の実施形態では、ヒト患者は、行動障害を示す。このような行動障害としては、限定されないが、気分変調、退行期うつ病、優性攻撃性(aggressiveness via dominance)、機能亢進、ディプリベーション症候群、分離不安、間欠性不安、機器社会病質、常同症、恐怖症または社会化障害が挙げられる。当業者によって容易に理解されるように、本発明は、抗酸化剤によって治療し得るヒトおよび動物の疾患の両方に適用できる。本発明は、家畜および獣医学の医薬に使用されることが意図される。本発明において、デヒドロアスコルビン酸は、経口で、静脈で、筋内に、またはデヒドロアスコルビン酸が加水分解されない他の投与経路または環境によって投与することができる。デヒドロアスコルビン酸は、水溶液中で容易に加水分解する。安定化形態でデヒドロアスコルビン酸を投与することが本発明の意図である。デヒドロアスコルビン酸は、低ｐＨ条件下で安定であることが知られている。したがって、デヒドロアスコルビン酸は、低ｐＨで保存し、その後、患者の大静脈に直接的に投与してもよい。あるいは、デヒドロアスコルビン酸は、粉末形態で保存し、患者に投与する前に水に溶かしてもよい。さらに、デヒドロアスコルビン酸は、低ｐＨでリポソームに封入することができる。その後、封入されたデヒドロアスコルビン酸を患者に投与する。好ましい実施形態では、封入デヒドロアスコルビン酸は、経口で投与される。米国特許第４，８２２，８１６号では、アルドノ−ラクトンおよびＬ−トレオン酸、Ｌ−キシロン酸およびＬ−リキソン酸の塩を使用することで、デヒドロアスコルビン酸を安定化させることが記述される。米国特許第４，８２２，８１６号の内容は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。したがって、本方法は、デヒドロアスコルビン酸の安定化のための別の手段を提供する。最後に、適切な量のアスコルビン酸およびアスコルベートオキシダーゼを患者に一緒に投与して、患者の脳組織中のアスコルビン酸濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を生成することができる。アスコルベートオキシダーゼは、Ｌ−アスコルビン酸の酸化を触媒し、そしてそれは、市販で入手できる。米国特許第５，６１２，２０８号では、新たなアスコルベートオキシダーゼおよびそれの遺伝子のことが記述されており、その内容は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。したがって、アスコルベートオキシダーゼは、組換えＤＮＡ技術によって産生できる。本発明を用いて、患者の脳組織に最大量のアスコルビン酸を負荷することができる。デヒドロアスコルビン酸は、種々の塩形態で存在することができる。これらの形態を包含することは、本発明の意図である。これらの塩は、水に溶かすとデヒドロアスニコルビン酸を生成する。本発明は、患者に、脳組織のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の痴呆を治療または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、患者に、脳組織の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の神経変性疾患を治療または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、有効量のデヒドロアスコルビン酸を、神経変性疾患用の治療剤と共に投与する組合せ療法を提供する。投与は、同時にまたは異なる時点で行うことができる。アルツハイマー疾患を治療する場合、治療剤としてはエストロゲン、ビタミンＥ(アルファ−トコフェロール)、タクリン(テトラヒドロアクリジナミン)、セレジリン(デプレニル)、およびアラセプト(ドネペジル)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。パーキンソン疾患については、治療剤としては、抗コリン作用性クラスの薬、クロザピン、カルビドパまたはベンセラジドを伴うレボドパ、セレジリン(デプレニル)、およびドーパミンアゴニストクラスの薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、患者に、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の発作または血管神経疾患または脂質過酸化によって引起こされる可能性がある他の疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明は、患者に、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の発作または血管神経疾患または脂質過酸化によって引起こされる可能性がある他の疾患を治療または予防する方法を提供する。これらの疾患には、発作、アテローム硬化症および神経変性障害が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明は、遺伝性疾患の中枢神経系発現を治療または予防する方法を提供する。疾患の症状は、脳の抗酸化能を増大させることによって改善される。遺伝性疾患のこのような中枢神経系発現の予防は、脳の抗酸化能を高いレベルに維持する場合にさえ予防できる。この遺伝性疾患としては、限定されないが、ハンチントン疾患が挙げられる。本発明は、患者に、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の行動障害を治療または予防する方法を提供する。最終的に、本発明は、患者に、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする、患者の行動障害を治療または予防する方法を提供する。このような行動障害としては、気分変調、退行期うつ病、優性攻撃性、機能亢進、ディプリベーション症候群、分離不安、間欠性不安、機器社会病質、常同症、恐怖症または社会化障害が挙げられるが、これらに限定されない。行動障害を治療または予防する場合、デヒドロアスコルビン酸は、他の薬と組合わせて使用することができる。それらは、同時にまたは異なる時点で投与することができる。別の実施形態では、行動障害は、精神***病である。本発明は、続く実験詳細からよりよく理解される。しかし、当業者は、検討された特定の方法および結果が、以降に続く請求項にさらに十分に記述されるとおり、ただ本発明の例示であることを容易に理解する。〔実験の詳細〕実験方法血液−脳防御壁輸送の研究：アスコルベートオキシダーゼ、１単位／１．０ミリモルＬ−アスコルベート（カボチャ属(Cucurbita)の種から誘導された、シグマ社(Sigma)）と一緒にインキュベートすることによって、全実験で¹⁴Ｃ−アスコルビン酸を発生させた。ビタミンＣ標品に、還元剤としてジチオスレイトール（０．１ミリモル／リットル）を添加した。ＣＯ₂吸入の頚部脱臼により、注射後の様々の時点で動物を屠殺した。その後、脳を切開して取り、そして７０％メタノールで均質化した。サンプルを、記述のとおりシンチレーション分光光度計またはＨＰＬＣについて進行させた(２、３)。添加した１ミリモル／ＬのＥＤＴＡを用いたメタノール分画でＨＰＬＣを行った(２、３)。分析までサンプルを −７０℃で保存した。ＨＰＬＣサンプルを、ワットマンの強力陰イオン交換パーティシル(Part,isil)１０ＳＡＸ（４．６−×２５−ｃｍ）カラム（ワットマン社(Wharman)、オレゴン州ヒルスボロ(Hillsboro,OR)）で分離した。ワットマン −型ＷＣＳ溶媒調整カラムを使用し、そして溶出液を、一列に配列されたダイオードアレイ検出器およびラジオアイソトープ検出器を備えたベックマンシステム金液体クロマトグラフィー（ベックマン・インストルメンツ社(BeckmanInstrume nts)、カリフォルニア州アービン(Irvine,CA)）でモニターした。２６５ｎｍでの吸収によって、そして放射活性によってアスコルビン酸をモニターした。デヒドロアスコルビン酸は、２６５ｎｍでなにも吸収を示さず、そして放射活性によってモニターした。デジタルオートラジオグラフィー：動物を屠殺し、ドライアイス／ヘキサン混今物で冷凍し、そしてその後〜５％カルボキシメチルセルロース（シグマ・アルドリッチ社(Sigma Aldrich)）に包埋させた。動物のブロックを、−２０℃で〜１２時間平衡にさせ、そしで動物を、低温ミクロトーム（ＰＭＶ）で、〜４０− ４５μｍのスライス厚を示す円錐切片に切り分け、そしてテープをデジタルプレートに直接露出させるために持上げた(２３)。露出時間は、およそ７２時間であった。全デジタルプレートを、２５μｍ解像度でフジ・バス５０００デジタルオートラジオグラフィック・システム（フジインク比(Fuji,Inc.)）でスキャンした。ＢＢＢ透過性表面領域生成物の計算：ＢＢＢを越える化合物の量は、以下の方程式によって規定される２つのパラメーターに依存する。：ＰＳ＝（Ｖ_p−Ｖ_o）／ｔ（ここで、ＰＳは、ＢＢＢ透過性−表面領域生成物であり、そしてＡＵＣは、注射後の付与時間（ｔ）での濃度時間−活性曲線での血漿領域である）外部器官技術と称される単一の静脈内注射技術の変法を、麻酔をかけた動物中のＢＢＢＰＳ生成物を定量するのに使用した。不可欠の血漿放射活性に等しかった（アスコルビン酸またはショ糖を、７０％メタノールの存在下で細胞から可溶化された後）血清の分あたりの（ＤＰＭ）／μｌの崩壊として、血漿および脳の放射活性を測定した。ＢＢＢＰＳ生成物は、注射用量含有率／脳組織のグラム数＝ＰＳ×ＡＵＣで計算される。変数が規定される場合、以下のとおりである。その処置の間、ラットに、ケタミン９０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ麻酔の混合物で麻酔をかけた。キンラジンは、麻酔の導入の３０分後に、およそ２８０ｍｇ／ｄｌで測定される血清グルコースで、その動物での高血糖症および低インスリン血症を引起こす(２４、２５)。これは、ラットでの基本線のグルコース濃度よりほとんど３倍高く、そしてＧＬＵＴ１を介して輸送に、したがってＰＳ計算に影響を及ぼす。放射標識試験化合物（³Ｈ−ショ糖、¹⁴Ｃ−アスコルビン酸、¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸）は、３匹のラットの群でカニューレ形成静脈に注射した。ショ糖を、Ｖ₀マーカー（血漿容積マーカー）として使用した。注射後３０秒間(ｔ)、動脈血を、腹大動脈にカニューレ挿入したカテーテルから重力によって収集し、そしてその後、動物を屠殺し、そして脳を採取した。結果および考察マウスおよびラットに、尾部静脈で、¹⁴Ｃ−アスコルビン酸、¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸または³Ｈ−ショ糖を注射した。静脈注射の３分後、それらの動物を屠殺し、脳を採集し、そしてメタノール可溶性分画を、液体シンチレーションによって計数した。およそ４％のデヒドロアスコルビン酸（脳組織のグラム当たりの注射用量（ＩＤ）の含有率として現された）が、３分後、脳で見られた( 図１Ａおよび１Ｂ)。注射されたアスコルビン酸およびショ糖は、３分に、脳の均質化液中に痕跡量の放射活性のみを生じたが、それによりアスコルビン酸はＢＢＢを通過できなかったことが示される。ショ糖は、代謝されたり輸送されたりしないので、それは、血漿容積のマーカーとして使用される(１２)。ショ糖およびアスコルビン酸注射動物の脳に存在する少量の放射活性は、脳血管内に存在する放射活性と一致した、。脳の均質化液のメタノール（７０％）分画の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析では、デヒドロアスコルビン酸注射動物の脳に蓄積されたヒタミンＣの形態が、＞８５％アスコルビン酸であることが示された(図１Ｃ)。この結果は、デヒドロアスコルビン酸は、ＢＢＢを越えて輸送され、そして脳内にアスコルビン酸を保持したことを示した。デヒトロアスコルビン酸注射後、脳の放射活性は、３分で最大４．３％のＩＤ／グラム脳組織に達し、２５分で３．３％に減少し、そして注射の２時間後までそのレベルを維持した(図１Ｄ、１Ｅ)ショ糖およびアスコルビン酸の注射は、注射の１５から３０秒後に、０．４％ＩＤ／グラム脳組織の最大の脳蓄積を生じた (図１Ｄ)。ショ糖注射動物中の脳の放射活性は、１５分後、これらのマウスでの血清放射活性での下降を付随しながら、＜０．１％に減少した(図１Ｅ、１Ｇ)。アスコルビン酸注射マウスでは、注射の２時間後、１．１％ＩＤ／グラムの脳組織まで脳の放射活性での増加があり、その間の時点は、血清での放射活性の量の減少があった(図１Ｅ、１Ｇ)。デヒドロアスコルビン酸注射の１５秒後の血清の放射活性濃度は、８％ＩＤ／グラム血清であった一方で、アスコルビン酸を注射したマウスでの対応の数は、２７％であった。したがって、デヒドロアスコルビン酸は、アスコルビン酸より実質的に早く循環から除かれた(図１Ｆ)。３分の時点で、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸注射動物の血清での放射活性は、等しかった(図１Ｇ)。５分でのデヒドロアスコルビン酸注射動物の血清に残る放射活性は、アスコルビン酸に関連した(図１Ｈ)。注射した¹⁴Ｃ−アスコルビン酸は、最初の３０分間をかけて測定可能な脳への輸送がないことを示したが、ある種の放射活性は、より長い期間で脳に蓄積した。この結果についての少なくとも３つの強力な説明がある。第一は、アスコルビン酸は、間欠期間で代謝され、そして脳での計数量は、アスコルビン酸の輸送された標識代謝性分解産物を現したことである。このような説明は、ＨＰＬＣの結果が、デヒドロアスコルビン酸注射脳での放射活性の主要部を、無傷のアスコルビン酸に付随する放射活性ピークで溶出されることを示したと思えない。第二の可能性は、ＢＢＢまたはコロイド叢での少数のＮａ⁺−アスコルビン酸共輸送体の存在であり、それは、この場合であるとき、アスコルビン酸の蓄積は、時間と線状で生じないが、３０分後にのみ生じたので起こりそうにない(１３)。その解釈は、微細環境でのアスコルビン酸の酸化が、イン・ビボで生じ、それにより、その後ＢＢＢを越えて輸送し、そしてアスコルビン酸として脳に保持されたデヒドロアスコルビン酸の生成を起こすということである。注射したデヒドロアスコルビン酸の血清濃度は、ただ、注射後、最初の数分の間にアスコルビン酸またはショ糖の２０から２５％の血清濃度に達成した。ショ糖は、輸送機構を有せず、したがって、血清からのそのクレアランスは遅かった。アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸についてのクレアランス機構の役割は、デヒドロトアスコルビン酸の場合にはＧＬＵＴであり、アスコルビン酸の場合には潜在的にＮａ⁺−アスコルベート共誘導体である輸送体を介している(４ )。血清からのデヒドロアスコルビン酸の迅速なクレアランスは、輸送体として入手可能な多数のグルコース輸送体に反映しそうである。グルコース輸送体ＧＬＶＴ１は、Ｌ−グルコースではなく、Ｄ−グルコースを選択的に輸送する。デヒドロアスコルビン酸が、ＧＬＵＴを介してＢＢＢを通過することを確認するために、Ｄ−およびＬ−グルコースで阻害実験を行った。２ −デオギシ−Ｄ−グルコース（Ｄ−デオキシグルコース）およびＤ−グルコース（データは示されず）は、用量依存形態で７０％まで脳内のデヒドロアスコルビン酸の取込みを阻害した一方で、Ｌ−グルコースおよびロイシンは、影響を示さなかった(図２Ａ)。ＧＬＵＴによって輸送されないが、主にＬ系輸送体を介して、そしてＡＳＣ系輸送体による微量の伸長までＢＢＢを越えるロイシンの取込み（１４）は、Ｄ−デオキシグルコースのＬ−グルコースの濃度を増加させることによって影響されなかったり(図２Ｂ)、またはアスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸およびロイシンの血清濃度も、Ｄ−デオキシグルコースまたはＬ−グルコースの濃度を増加させることによって影響されなかった(データは示されず)。これらの結果では、Ｄ−デオキシグルコースは、デヒドロアスコルビン酸はグルコース輸送体を介して脳に入るのを阻害するが、ある種の他の輸送体系を影響しないか、または浸透効果によって一般のＢＢＢ透過性を変えることを確証した。外部器官として血清を利用する外部器官アプローチ法を、フィッシャーＦ３４４ラット（１５）中のＢＢＢ透過性−表面領域生成物（ＰＳ）を計算するのに使用した。¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸の計算したＰＳは、１３６±１２（ＳＥＭ）μｌ／分／グラム脳組織であり、¹⁴Ｃ−アスコルビン酸は、−０．４４±０．２４μｌ／分／グラム脳組織であり、そして³Ｈ−Ｄ−デオキシグルコースは、４４±３．２μｌ／分／グラム脳組織であった。アスコルビン酸とデヒドロアスコルビン酸との間のＢＢＢ透過性−表面領域生成物（ＰＳ）での差異は、ビタミンＣの還元状態の間でのＢＢＢ輸送体での際立った差異を例示した。アスコルビン酸の計算されたＰＳは、ショ糖と同様に、３０秒でおよそ０μｌ／分／グラム脳組織であり、それは、輸送体でＢＢＢを越るものはないことを示す。デヒドロアスコルビン酸のＰＳは、２つの化合物の間のＫ_m値での差異に対応するＤ−デヒドログルコースより３倍大きかった。輸送体についてのＤ−デオキシグルコースの見かけのＫ_mは、ＨＬ６０細胞でのデヒドロアスコルビン酸についての見かけのＫ_m０．８５ｍＭに比較して、ＨＬ６０細胞で２．５ｍＭであった(２、３)。 ¹⁴Ｃ−デヒドロアスコルビン酸を注射されたラット、および¹⁴Ｃ−アスコルビン酸を注射されたラットの脳のデジタルオートラジオグラフィーを行って、注射化合物の解剖学上の分布を確認した(図３)。脳での活性蓄積のオートラジオグラフィーの証拠は、デヒドロアスコルビン酸を注射した動物のみに見られた。¹⁴Ｃ −ショ糖を、血管内容積のマーカーとして使用した。この研究の結果は、ビタミンＣの脳への輸送が、デヒドロアスコルビン酸を輸送するＢＢＢでＧＬＵＴによって指示されることを確認した。アスコルビン酸それ自身は、ＢＢＢを越えて輸送できない。したがって、イン・ビボでのグルコース輸送は、ビタミンＣの酸化形態デヒドロアスコルビン酸のみが輸送可能である（１−３）点でイン・ビトロモデルに匹敵するほど機能することが分かった。ＢＢＢを通過した後、デヒドロアスコルビン酸を、アスコルビン酸に還元させ、そしてアスコルビン酸として脳に保持した。この捕獲機構は、血液でより脳内で高濃度のビタミンＣの蓄積を可能にする。全体で、知見は、脳内のビタミンＣの蓄積の調節における重要な段階であるとしてアスコルビン酸の酸化を指摘する。最近推奨されるビタミンの毎日の割当て量は、毎日６０ｍｇであり、そしてヒト有志でおよそ２４μＭの安定状態の血漿濃度を生じる(１６)。アスコルビン酸のみが、血清中に検出され、共に、デヒドロアスコルビン酸は、痕跡量の血清レベルであるかまたは検出できない(１７)。この研究で注射されたビタミンＣは、およそ５００μＭであったが、それはげっ歯類でのビタミンＣの生理学的血清濃度より５倍多い(１８)。この研究では、生理学上のグルコース濃度で、ＧＬＵＴ１を介したデヒドロアスコルビン酸輸送が起こった。正常なげっ歯類でのグルコースの血清濃度は、およそ１０ｍＭであるが、なお、脳へのデヒドロアスコルビン酸輸送があり、それはデヒドロアスコルビン酸およびグルコースの両方が、生理学的条件下でＧＬＵＴの基質である。この結果は、５０ｍＭより多いデオキシグルコース濃度が、ＧＬＵＴ１を介したデヒドロアスコルビン酸の輸送を遮断するのに必要であることが示されるイン・ビトロでのデータと一致する(２、３)。ＪａｍｅｓＬｉｎｄは、１７７２年に壊血病の条約で、壊血病の臨床的説明を詳述した。彼は、以下のとおり壊血病患者の「破壊された遺体」の検死結果の彼の報告を結論づけた。「驚くべきことに、それらの可哀いそうな動物の脳は常に健全でそして無傷である...」(１９)。このように、脳が、ビタミンＣの激減した最後の器官であるように脳内のアスコルビン酸の蓄積および貯蔵のための機構があるように見えた。正常なヒトの脳は、およそ１ｍＭのビタミンＣ濃度を示し、正常な血清濃度の１０倍である(２０)。脳内でのビタミンＣの正確な役割は、不確定であるが、アスコルビン酸は、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼのコファクターであり、したがってカテコールアミンの生合成に関連する可能性がある。ビタミンＣも、膜リン脂質の過酸化を阻害し、そして脳内のフリーラジカルのスカベンジャーとして作用することができる(２１、２２)。この研究の結果は、デヒドロアスコルビン酸の形態でのＧＬＵＴ１を介したビタミンＣ輸送の生理学上の重要さを示し、脳が、ビタミンＣを得、そして保持する機構を規定する。最近のデータは、多量のビタミンＣが、脳に負荷される可能性があることを示す。患煮ラットの頚動脈に、カテーテルでカニューレを挿入し、そして２４ｍｇのデヒドロアスコルビン酸を、その動脈に注射する実験を行った。注射したデヒドロアスコルビン酸に、痕跡量の放射活性（¹⁴Ｃ−標識）デヒドロアスコルビン酸を加えた。デヒドロアスコルビン酸を、４０分間かけて灌流させ、そして脳を収集した。放射活性ビタミンＣの量を、脳で定量し、そして脳に蓄積した注射されたビタミンＣの総量は、このように推定された。実験では、２．６ｍｇのビタミンＣが、４０分の注射期間のあいだじゅう患者ラットの脳に蓄積し、それは注射用量のおよそ１１％であることが示された。これは、患者動物の脳内のビタミンＣの製薬学的濃度に達することが可能であることを示す。正常な成体ラット脳中の総ビタミンＣ濃度がおよそ１５０μｇであることが注目されるべきである。このようにビタミンＣの基本線の正常な濃度より対数倍多いビタミンＣが達成された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１１１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ベラ、ジュアン・シーアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、イースト・シックスティサード・ストリート 504、アパートメント 14シー (72)発明者ゴールデ、デビッド・ダブリュアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、イースト・シックスティフォース・ストリート 402、アパートメント 10エー

Claims

【特許請求の範囲】１．患者の脳組織におけるアスコルビン酸濃度を増加させる方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２．前記デヒドロアスコルビン酸が、促進的グルコース輸送体を介して脳組織に侵入する請求項１に記載の方法。３．患者の脳組織におけるアスコルビン酸濃度を増加させる方法であって、患者に対して、脳組織の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを特徴とする方法。４．前記患者が、ヒトである請求項１に記載の方法。５．前記ヒト患者が、神経変性疾患を有する請求項１に記載の方法。６．前記神経変性疾患が、アルツハイマー疾患またはパーキンソン疾患である請求項５に記載の方法。７．前記ヒト患者が、神経血管疾患を有する請求項１に記載の方法。８．前記ヒト患者が、発作を有する請求項７に記載の方法。９．前記ヒト患者が、低密度脂質タンパク質または脂質過酸化の酸化的修飾に関与する疾患を有する請求項１に記載の方法。１０．前記ヒト患者が、発作、アテローム硬化症または神経変性障害を有する請求項９に記載の方法。１１．前記ヒト患者が、行動障害を有する請求項１に記載の方法。１２．前記行動障害が、気分変調、退行期うつ病、優性攻撃性、機能亢進、ディプリベーション症候群、分離不安、間欠性不安、機器社会病質、常同症、恐怖症または社会化障害である請求項１１に記載の方法。１３．請求項１に記載の方法であって、前記デヒドロアスコルビン酸を、経口に、静脈で、皮下に、または筋内に投与する方法。１４．患者の痴呆を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。１５．患者の痴呆を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。１６．患者の神経変性疾患を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。１７．患者の神経変性疾患を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。１８．前記神経変性疾患が、アルツハイマー疾患またはパーキンソン疾患である請求項１６または１７に記載の方法。１９．患者の発作または神経血管疾患を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２０．患者の発作または神経血管疾患を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２１．患者の低密度脂質タンパク質または脂質過酸化の酸化的修飾に関与する疾患を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２２．患者の行動障害を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中のアスコルビン酸の濃度を増加させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２３．患者の行動障害を治療または予防する方法であって、患者に対して、脳組織中の抗酸化能を増大させるのに有効な量のデヒドロアスコルビン酸を投与することを具備する方法。２４．前記行動障害が、気分変調、退行期うつ病、優性攻撃性、機能亢進、ディプリベーション症候群、分離不安、間欠性不安、機器社会病質、常同症、恐怖症または社会化障害である請求項２２または２３に記載の方法。２５．さらに、有効量の治療剤を投与することを含む、請求項１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２または２３に記載の方法。