JP2002512006A - ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である成熟ＦＬＩＮＴ（ｍＦＬＩＮＴ）ポリペプチド、または、ＯＰＧ３の治療上の適用 - Google Patents

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である成熟ＦＬＩＮＴ（ｍＦＬＩＮＴ）ポリペプチド、または、ＯＰＧ３の治療上の適用

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フイ・クワン・ヤク
アレクセイ・カリトネンコフ
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ナ・ソンチン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】成熟ＦＬＩＮＴ蛋白質(ｍＦＬＩＮＴ)は、ＦａｓＬ及びＬＩＧＨＴを結合し、ＦａｓＬ-Ｆａｓ相互作用を阻止する。ｍＦＬＩＮＴは、ＦａｓＬ-Ｆａｓ媒介アポトーシス、及び、前炎症活性を阻止し、そして異常なアポトーシス、及び、炎症に関連した疾患の処置に有用である。 【解決手段】本発明はＦＬＩＮＴ、並びに、成熟ＦＬＩＮＴのアミノ酸、及びヌクレオチド配列を提供する。ＦＬＩＮＴを発現するトランスジェニック動物の製造、及び、その特徴付けを開示する。ｍＦＬＩＮＴを利用した治療用組成物、及び処置方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は以下の米国特許出願についての優先権を主張する：1998年3月30日に
出願された第60/079,856号；1998年5月20日に出願された第60/086,074号；1998
年9月9日に出願された第60/099,643号；1998年12月18日に出願された第60/112,7
03号；1998年12月17日に出願された第60/112,577号；1998年12月18日に出願され
た第60/112,933号；及び、1998年12月22日に出願された第60/113,407号。
【０００２】 発明の背景 ＦａｓＬ(ＣＤ９５Ｌ及びＡＰＯ１Ｌとも呼ばれる)は種々の型の細胞で発現さ
れており、増殖、分化、免疫調節、炎症反応、細胞毒性、及び、アポトーシス等
の生物学的反応を生じさせることができる。興味深いことに、ＴＮＦＲファミリ
ーの受容体ＦＡＳ/ＡＰＯのリガンドであるＦａｓＬ(Sudaら、Cell 75:1169〜78
(1993年))における変異は自己免疫と関連している(Fisherら、Cell 81:935〜46(
1995年))のと同時に、ＦａｓＬの過剰産生は、薬剤誘導性肝炎と係っているかも
しれない。ＦａｓＬは眼、精巣、脳、及び、若干の腫瘍の免疫寛容組織で発現さ
れている。また、腎臓、及び、肺、そしてまた、活性化された胸腺細胞、脾細胞
、及び、Ｔリンパ球でも見出されている。
【０００３】 アポトーシスは発生、及び、恒常性の両方において中心的な役割を果たす。発
生中の胚においては形態形成、またはシナプス形成の間、及び、成体の動物にお
いては組織代謝回転(tissue turnover)、または免疫反応の最後において細胞は
、アポトーシスにより死ぬ。アポトーシスの生理的な役割は非常に重要なので、
この過程の逸脱は有害であり得る。例えば、或る脳内ニューロンの予定外のアポ
トーシスは、アルツハイマー病、及び、パーキンソン病等の疾患の一因となり、
深刻なＤＮＡ損傷を受けた後の、アポトーシスを開始する***細胞の欠損は癌の
一因となる。
【０００４】 細胞の環境からの生存シグナル、及び、細胞の完全さに対する内部センサーに
より、通常、細胞のアポトーシス機構は抑制される。細胞がその周囲との接触を
失ったり、または、修復不能な損傷を受けた場合には、細胞はアポトーシスを開
始する。***サイクルを進めるか、または、減ずる矛盾したシグナルを同時に受
ける細胞もアポトーシスを引き起こす。個々の細胞の自殺を積極的に指示するこ
とを生物体において可能にするまた別の機構を、哺乳動物は発達させてきた。こ
の種の「有益な(instructive)」アポトーシスは、特に免疫系において重要であ
る。独特な「デスリガンド(death ligand)」により開始されるアポトーシスシグ
ナルを伝達する細胞表面受容体であるデス受容体(death receptor)は、有益な役
割のアポトーシスにおいて中心的な役割を果たす。これらの受容体は、リガンド
結合から数秒内でデスカスパーゼを活性化でき、数時間内でアポトーシス性の細
胞死を引き起こす。
【０００５】 デス受容体は、類似のシステインに富む細胞外ドメインによって定義される腫
瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体遺伝子スーパーファミリーに属する。デス受容体は、
「デスドメイン(death domain)」と呼ばれる相同な細胞質配列をさらに含む。デ
スドメインにより、デス受容体を細胞のアポトーシス機構に携わらせるのを一般
的に可能にするが、場合によってはそれらは、アポトーシスと別個の、または、
それを打ち消す機能を媒介する。
【０００６】 Ｆａｓ(ＣＤ９５またはＡｐｏ１とも呼ばれる)は、良く特徴付けられたデス受
容体である。Ｆａｓ及びＦａｓリガンド(ＦａｓＬ)は、アポトーシスにおいて重
要な役割を果たす。ＦａｓＬはホモ三量体分子である。各ＦａｓＬタイマー(tim
er)が、3個のＦａｓ分子を結合すると示唆されている。デスドメインは互いに会
合する性質を有するため、Ｆａｓの結合は受容体のデスドメインの密集につなが
る。その後、ＦＡＤＤ(Ｆａｓ関連デスドメイン(Fas associated death domain)
；Ｍｏｒｔ１とも呼ばれる)と呼ばれるアダプター蛋白質が、自己のデスドメイ
ンを介して密集した受容体デスドメインに結合する。ＦＡＤＤはまた、カスパー
ゼ-８(ＦＬＩＣＥまたはＭＡＣＨとも呼ばれる)の酵素前駆体形体中にタンデム
で繰り返される類似のドメインに結合する「デスエフェクタードメイン(death e
ffector domain)」を含む。ＦＡＤＤの補充により、カスパーゼ-８のオリゴマー
化は、自己切断による活性化を進める。その後、カスパーゼ-８は、カスパーゼ-
９等の下流のエフェクターカスパーゼ-を活性化し、細胞のアポトーシスを行わ
せる(Ashkenazi A.ら、Death Receptors: Signaling and Modulation Science 2 81 ,1305〜1308(1998年8月))。
【０００７】 ＦａｓＬはＴリンパ球でアポトーシスの引き金となるが、また前炎症性(proin
flammatory)でもある。ＦａｓＬは、多形核白血球(ＰＭＮ)とも呼ばれる好中球
の活性を刺激することが示されている(Chen J.ら、Science 282:1714〜17(1998
年))。ＦａｓＬ-Ｆａｓ結合は、末梢リンパ組織内の自己反応性リンパ球のクロ
ーン消失、及び、自己反応性リンパ球集団の排除に関係してきており、従って、
免疫系の恒常性に寄与している。しかしながら、トランスジェニックマウスの筋
管、または脾島でのＦａｓＬの発現は、移殖拒絶を促進する顆粒球反応を誘導す
ることが見つけられた(Allison J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:3943〜47(19
97年4月);Kang S-M.ら、Nature Medicien,第3巻第7号,738〜743(1997年7月))。
【０００８】 ＦａｓＬ-Ｆａｓ受容体結合の効果の少なくとも1つは、恒常性に必要なアポト
ーシスである。しかしながら、リガンド-受容体結合の平衡は、ストレス、疾病
または外傷によりときどき混乱させられる。無秩序なＦａｓＬ-Ｆａｓ結合の負
の効果の1つは、制御の効かなくなった、または、異常なアポトーシスである。
該結合の別の効果は、ＦａｓＬにより活性化された好中球による健全な細胞の破
壊である。
【０００９】 例えば、特定の器官における制御の効かなくなったアポトーシスのより悲惨な
結果の1つは、急性肝不全である。急性肝不全は、アポトーシス経路の過剰な活
性化によって特徴付られ、肝細胞の大量のアポトーシス、及び、出血性の肝臓変
化が起こる。急性肝不全は、肝臓を襲うウイルス感染、肝臓を襲う細菌感染、肝
炎、肝細胞の創傷、及び／または、肝細胞が大量のアポトーシスを受ける他の病
気の結果として起こり得る。結果として急性肝不全を起こす感染の1例は、細菌
により誘導される劇症肝炎である。
【００１０】 発明の概要 本発明は、図１に記載の配列を有する単離された核酸分子、図３に記載の配列
を有する単離された核酸分子、図１に記載の配列を有する単離されたポリペプチ
ド、及び、図３に記載の配列を有する単離されたポリペプチドを包含する。本発
明にはまた、図１に記載の配列を有する導入遺伝子を含むトランスジェニックマ
ウスを含む。
【００１１】 本発明の一態様によると、ｍＦＬＩＮＴが次の症状を処置するために提供され
る：急性肝不全；肝臓の炎症；異常な肝細胞のアポトーシス；敗血症；炎症に関
連した疾患；肝炎；異常なアポトーシスの処置；虚血に関連した創傷または疾患
；凝固性亢進と関連した創傷または疾患であって、活性化プロテインＣ等の血栓
溶解剤または抗血栓剤から選択される群から選択される薬剤と合せた使用を含む
；再灌流に関連した創傷または疾患；異常な心筋虚血症に起因する心筋の損傷；
Ｉ型糖尿病；癌；化学療法、または、治療的な照射による骨髄、腸内皮、口腔内
皮を含む周囲の無害な組織への損傷；治療的な照射、または、化学療法に暴露さ
れた造血前駆細胞の創傷；腸の内皮細胞、造血前駆細胞、及び、末梢血細胞の損
傷を含む、治療的な照射、または、化学療法による細胞の損傷；無形成性貧血；
骨髄異形成症候群；並びに、汎血球減少症状。
【００１２】 本発明の別の態様によると、ｍＦＬＩＮＴは、造血前駆細胞の生長または分化
を促進するため、及び、ＣＤ３４＋細胞の生長または分化を促進するために提供
される。
【００１３】 本発明のさらなる態様には、活性成分としてｍＦＬＩＮＴを有し、次の処置に
適合された製剤が含まれる：急性肝不全；肝臓の炎症；異常な肝細胞のアポトー
シス；敗血症；炎症に関連した疾患；肝炎；異常なアポトーシスの処置；虚血に
関連した創傷または疾患；凝固性亢進と関連した創傷または疾患であって、活性
化プロテインＣ等の血栓溶解剤または抗血栓剤から選択される群から選択される
薬剤と合せた使用を含む；再灌流に関連した創傷または疾患；異常な心筋虚血症
に起因する心筋の損傷；Ｉ型糖尿病；癌；化学療法、または、治療的な照射によ
る骨髄、腸内皮、口腔内皮を含む周囲の無害な組織への損傷；治療的な照射、ま
たは、化学療法に暴露された造血前駆細胞の創傷；腸の内皮細胞、造血前駆細胞
、及び、末梢血細胞の損傷を含む治療的な照射、または、化学療法による細胞の
損傷；無形成性貧血；骨髄異形成症候群；並びに、汎血球減少症状。
【００１４】 本発明のまたさらに別の態様では、活性成分としてｍＦＬＩＮＴを有し、造血
前駆細胞の生長または分化を促進、及び、ＣＤ３４＋細胞の生長または分化を促
進するのに適合された製剤が提供される。
【００１５】 また、本発明の別の態様には、次の症状を処置するのに有用な薬剤の調製にお
けるｍＦＬＩＮＴの使用が含まれる：急性肝不全；肝臓の炎症；異常な肝細胞の
アポトーシス；敗血症；炎症に関連した疾患；肝炎；異常なアポトーシスの処置
；虚血に関連した創傷または疾患；凝固性亢進と関連した創傷または疾患であっ
て、活性化プロテインＣ等の血栓溶解剤または抗血栓剤から選択される群から選
択される薬剤との使用を含む；再灌流に関連した創傷または疾患；異常な心筋虚
血症に起因する心筋の損傷；Ｉ型糖尿病；癌；化学療法、または、治療的な照射
による骨髄、腸内皮、口腔内皮を含む周囲の無害な組織への損傷；治療的な照射
、または、化学療法に暴露された造血前駆細胞の創傷；腸の内皮細胞、造血前駆
細胞、及び、末梢血細胞の損傷を含む、治療的な照射、または、化学療法による
細胞の損傷；無形成性貧血；骨髄異形成症候群；並びに、汎血球減少症状。
【００１６】 さらなる態様によると、本発明には造血前駆細胞の生長または分化を促進、お
よび、ＣＤ３４＋細胞の成長または分化を促進するのに有用な薬剤の調製におけ
るｍＦＬＩＮＴの使用が含まれる。
【００１７】 本発明は、異常な肝細胞のアポトーシスに苦しむ個体を処置する方法であって
、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を包含する。本
発明はまた、炎症に関連した疾患を患う個体を処置する方法であって、治療的な
量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を含む。さらに、本発明は
異常なアポトーシスに苦しむ個体を処置する方法であって、治療的な量のｍＦＬ
ＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を含む。
【００１８】 本発明はさらに、肝臓の多様な疾患を処置するためのｍＦＬＩＮＴの使用を含
む。この点に関し、本発明は急性肝不全を患う個体を処置する方法であって、治
療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を包含する。本発明
はまた、肝臓に炎症を患う個体を処置する方法であって、治療的な量のｍＦＬＩ
ＮＴを該個体に投与することを含む方法を含む。本発明の別の方法は、肝炎を患
う個体を処置するための方法であって、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投
与することを含む方法を含む。
【００１９】 本発明はまた、敗血症を患う個体を処置する方法であって、治療的な量のｍＦ
ＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を包含する。
【００２０】 本発明にはさらに、虚血に関連した創傷または疾患を患う個体を処置する方法
であって、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法が含ま
れる。このような創傷、または、疾患は凝固性亢進と関連してい得る。この点に
関し、本発明はまた、凝固性亢進と関連した疾患を処置する方法であって、治療
的な量のｍＦＬＩＮＴを、血栓溶解剤または抗血栓剤と一緒に投与することを含
む。このような抗血栓剤の1例は、活性化プロテインＣである。
【００２１】 本発明はまた、再灌流に関連した創傷、または、疾患を患う個体を処置する方
法であって、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を含
む。
【００２２】 本発明はさらに、異常な心筋虚血症を患う個体における心筋の損傷を予防する
方法であって、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法を
包含する。
【００２３】 本発明にさらに含まれるのは、Ｉ型糖尿病を患う個体を処置する方法であって
、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法である。ここで
本発明に包含される別の方法は、癌を患う個体を処置する方法であって、治療的
な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法である。
【００２４】 本発明にはさらに、化学療法剤または治療的な照射により処置された個体にお
いて、該薬剤または該照射により誘導された周囲の無害な組織への損傷を処置す
る方法であって、治療的な量のｍＦＬＩＮＴを該個体に投与することを含む方法
を含む。このような組織には、骨髄、及び、口腔の内皮を含む腸の内皮が含まれ
る。
【００２５】 本発明は、治療的な照射、または、化学療法に曝された造血前駆細胞を処置す
る方法であって、該細胞にｍＦＬＩＮＴを投与することを含む方法を包含する。
このような方法は治療的な照射、または、化学療法の有害な影響からの造血前駆
細胞の回復を促進する。本発明はまた、造血前駆細胞の生長または分化を促進す
る方法であって、該細胞にｍＦＬＩＮＴを投与することを含む方法を含む。本発
明はさらに、ＣＤ３４＋細胞の生長または分化を促進する方法であって、該細胞
にｍＦＬＩＮＴを投与することを含む方法を含む。
【００２６】 本発明はまた、癌を処置する方法を包含し、該方法はイン・ヴィトロで骨髄細
胞をｍＦＬＩＮＴで処置し、患者が治療的な照射、または、化学療法の処置を受
けた後、該細胞を該患者に投与することを含む。骨髄細胞は自己由来、即ち、処
置される患者由来、または異種由来、即ち、患者以外の個体由来であり得る。
【００２７】 本発明はまた、治療的な照射または化学療法を受ける患者における細胞損傷を
処置する方法であって、該照射または化学療法と共に治療的に有効な量のｍＦＬ
ＩＮＴを該患者に投与する方法を包含する。細胞損傷は、腸の内皮細胞、造血前
駆細胞、または、末梢血細胞へのものであり得る。
【００２８】 本発明はまた、無形成性貧血、骨髄異形成症候群、または、汎血球減少症状を
処置する方法であって、無形成性貧血を患う患者に治療的に有効な量のｍＦＬＩ
ＮＴを投与することを含む方法を意図している。
【００２９】 図面の簡単な説明 図１はヒトＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に示す。 図２はヒトＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に示す。 図３はヒトｍＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に示す。 図４はヒトｍＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に示す。 図５は、異なる回数のＬＰＳ投与後の動物敗血症モデルにおける、ｍＦＬＩＮ
Ｔの他の薬剤と組合わせた能力を示す。 図６の左図は、動物敗血症モデルにおいて、ｍＦＬＩＮＴを抗-ＴＮＦと比較
する実験を示す。右図は、同じモデルにおいて、より低用量のｍＦＬＩＮＴを抗
-ＴＮＦに対して比較する。 図７は、動物敗血症モデルにおいて、ｍＦＬＩＮＴ、及び、抗-ＴＮＦの静脈
内、及び、腹腔内運搬を比較する実験を示す。 図８は、ｍＦＬＩＮＴを用いた処置による、Ｂ１６メラノーマ腫瘍の体積の減
少を示す。 図９は、照射に続く骨髄幹細胞のｍＦＬＩＮＴによる回復を示す。 図１０は、５-フルオロウラシルを用いた処置に続く、骨髄前駆細胞のｍＦＬ
ＩＮＴにより促進された回復を示す。
【００３０】 発明の詳細な説明 Ｆａｓリガンドを結合する化合物を同定する方法を用いて、出願人らは、ヒト
ＦＬＩＮＴポリペプチドが、ＦａｓＬ-Ｆａｓ受容体相互作用を崩壊させる能力
を有することを発見した。出願人らは、ＴＮＦＲ蛋白質とその対応するリガンド
の相互作用が疾病を引き起こすか、または、悪化させる場合に、そのような相互
作用を調節する方法、及び、疾病を予防、若しくは、処置する方法を発見した。
【００３１】 上述のように、ＦａｓＬ-Ｆａｓ受容体結合の下流の効果の一つがアポトーシ
スであることは、よく立証されている。この経路の異常な活性を実証する条件下
では、多様な疾患の病状の一因である制御の効かなくなったアポトーシスが起こ
る。ＦａｓＬ-Ｆａｓ受容体結合の、さらに別の下流の効果は、好中球の活性化
であり、ＦａｓＬにより活性化された好中球により細胞が破壊される。
【００３２】 最近、腹膜滲出液細胞(ＰＥＣ)において、好中球の浸潤の原因となるＩＬ-１
βのプロセシング、及び、放出をＦａｓＬが誘導することが発見された。特に、
Miwa K.ら(Nature Medicine,4(11):1287〜1292(1998年11月))は、ＩＬ-１αβノ
ックアウトマウスでは抑制されているのに対し、Ｆａｓリガンドを発現する腫瘍
細胞の野生型のマウスへの接種により、大量の好中球浸潤が誘導されることを見
つけた。これは、ＦａｓＬが炎症性の役割を有することを示す。これはまた、或
る条件下においてはアポトーシス自体が炎症を誘導し得ることを示唆する。さら
に、ある種の炎症因子が、Ｆａｓ媒介アポトーシス経路を誘導できることが知ら
れている。従って、ＦａｓＬがその病理学的効果を発揮するのに、2つのおそら
く異なるが、関連する経路を介して作用することはありそうなことである。
【００３３】 発明者らは、ＦＬＩＮＴポリペプチドが、Ｆａｓ受容体自身より大きくないと
しても、少なくとも同じ親和性でＦａｓＬに結合することを発見した。ＦａｓＬ
を結合する結果、ＦＬＩＮＴポリペプチドは、ＦａｓＬのＦａｓ受容体への結合
を妨害することができ、下流の事象を妨げる。以下の実施例に示す種々のイン・
ヴィトロ、及び、動物モデルを用い、出願人らは、Ｆａｓ媒介される有害な効果
を阻害するＦＬＩＮＴポリペプチドの能力を証明した。これらのデータからＦＬ
ＩＮＴが、ＦａｓＬ活性のアポトーシス性、及び、前炎症性の両方に作用し得る
ことが明らかであり、以下に論ずる幾つかの疾病、および、創傷状態におけるそ
の使用が示唆される。
【００３４】 以下に示すデータは、ｍＦＬＩＮＴがＦａｓＬアポトーシス誘導活性、及び、
前炎症活性の両方を阻害することを示す。ＦａｓＬをアンタゴナイズすることに
より、ｍＦＬＩＮＴポリペプチドはＦａｓＬにより活性化された好中球、及び、
ＦａｓＬ-Ｆａｓ相互作用により直接媒介されたアポトーシス性の損傷の両方に
より引き起こされた健全な細胞の破壊を調整できる。よって、ｍＦＬＩＮＴを用
いた本処置方法は、ＦａｓＬの直接的なアポトーシス効果に伴う疾患、及び／ま
たは、ＦａｓＬの前炎症性効果により媒介される損傷の処置、並びに、予防にお
いて、これらが別個の生理的な経路であるかどうかにかかわらず有用である。
【００３５】 従って、一般に特徴付られるように、本発明は、「異常なアポトーシス」、特
にＦａｓリガンド(ＦａｓＬ)、及び、Ｆａｓ受容体(Ｆａｓ)結合(ＦａｓＬ-Ｆａ
ｓ結合とも呼ばれる)により誘導されるアポトーシスにより引き起こされるか、
若しくは、悪化される症状を予防するか、または、処置する方法に関連する。本
発明はまた、前炎症性反応、より詳しくはＦａｓＬにより誘導された好中球の活
性化により引き起こされた前炎症性反応により引き起こされた症状を予防、また
は、処置する方法に関する。
【００３６】 本明細書を通して、標題は構成的な便宜を目的として用いられているだけであ
り、それにより明細書中に記載の主題を限定的に解釈するべきではない。
【００３７】 Ｉ．定義 以下の定義が本発明において採用される。
【００３８】 本明細書中の「ＦＬＩＮＴ」という用語は、いずれかの全長ＦＬＩＮＴポリペ
プチドを指す。このような全長ポリペプチドには、ＦＬＩＮＴポリペプチドの第
1〜29番目のアミノ酸であるリーダー配列が含まれる。ＦＬＩＮＴの例には、ヒ
トＦＬＩＮＴである図１、及び、ヒトＦＬＩＮＴバリアントである図２に記載さ
れるアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。
【００３９】 本明細書中の「ｍＦＬＩＮＴ」という用語は、成熟ＦＬＩＮＴ、即ち、リーダ
ー(シグナルとしても知られる)ペプチドを有さないＦＬＩＮＴを指す。ｍＦＬＩ
ＮＴの例には、リーダーペプチドを欠く図１の蛋白質である図３に記載のアミノ
酸配列を有する蛋白質、及び、第1〜29番目のアミノ酸を欠く図２の蛋白質であ
る図４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。よって、「ｍＦＬＩＮ
Ｔ遺伝子」は、ｍＦＬＩＮＴポリペプチドをコードする核酸である。図３及び４
に記載の核酸は、本発明のｍＦＬＩＮＴ遺伝子の例である。
【００４０】 ＦａｓＬ、若しくは、Ｆａｓの発現または相互作用、及び、それにより生じる
いずれかのアポトーシスに関しての本明細書中の「不適当」、及び、「異常な」
という用語は、通常の発現、相互作用、または、アポトーシスのレベルからのど
のような逸脱も含むと解釈されるべきである。このような逸脱には、時間的、量
的、及び、質的な異常が含まれる。ＦａｓＬまたはＦａｓの「発現」は、転写、
翻訳、及び、それに関する事象だけでなく、運搬、及び、細胞表面での有効性／
利用しやすさ等の、活性ＦａｓＬまたはＦａｓの有効性を増大させるどのような
過程をも指す。
【００４１】 また、本明細書中の「異常なアポトーシス」という用語は、過剰、及び／また
は、不適当なアポトーシスを指す。典型的な異常なアポトーシスは、物理的、化
学的、または、生物的な障害を受けた細胞、及び、組織において観察される。こ
のような障害には、これらに限定されるわけではないが、物理的創傷、ウイルス
感染、細菌感染、虚血、照射、化学療法等が含まれる。
【００４２】 「融合蛋白質」という用語は、天然では見受けられない雑種蛋白質であって、
2種、若しくは、それ以上の異なる蛋白質、または、その断片が1つのポリペプチ
ド鎖に共有結合された転写融合体、または、酵素融合体を含む。
【００４３】 「宿主細胞」は、いずれかの真核細胞、または、原核細胞であって、例えば形
質転換、若しくは、トランスフェクション等によって該宿主細胞に導入されたベ
クター中に含まれるクローン化遺伝子を増殖、及び／または、発現するのに適し
た細胞を指す。
【００４４】 「単離された核酸化合物」は、どのように構築、または、合成されていようと
も、天然の配置とは位置的に異なるいずれかのＲＮＡ、または、ＤＮＡ配列を指
す。
【００４５】 「プラスミド」という用語は、染色体外の遺伝的因子を指す。本明細書中に開
示されるプラスミドは市販されているか、制限無く公的に入手可能であるか、ま
たは、公開された方法に従って容易に入手可能なプラスミドから構築され得る。
【００４６】 「プライマー」とは、例えば核酸化合物の酵素的、または、合成による延長の
開始基質として働く核酸断片である。
【００４７】 「プロモーター」という用語は、例えばＤＮＡからＲＮＡへの転写を指示する
核酸配列を指す。誘導プロモーターとは、例えば炭素源、熱、または、金属イオ
ン等の環境シグナルによって制御できるものである。構成プロモーターは、一般
に一定のレベルで働き、制御できない。
【００４８】 本明細書中の「組換えＤＮＡクローニングベクター」は、1若しくはそれ以上
の追加のＤＮＡ部分を組み込み得る、または、組み込んだＤＮＡ分子を含む、こ
れらに限定されるわけではないが、プラスミドまたはファージを含むいずれかの
自律複製するものを指す。
【００４９】 本明細書中の「組換えＤＮＡ発現ベクター」または「発現ベクター」は、例え
ばプラスミドまたはファージである、いずれかの組換えＤＮＡクローニングベク
ターであって、プロモーター及び他の制御因子が存在し、それによりポリペプチ
ドをコードしていてもよい挿入ＤＮＡの転写を可能としたものを指す。
【００５０】 「選択的結合」という用語は、ＦＬＩＮＴポリペプチドのＦａｓＬは結合する
が、ＴＮＦαは結合しない能力を指す。
【００５１】 ペプチドまたは蛋白質に関して用いられる「実質的に純粋な」とは、該ペプチ
ドまたは蛋白質が、他の蛋白質分子を含む他の細胞性、及び、非細胞性分子から
単離されていることを意味する。実質的に純粋な調整物は、少なくとも約85％純
粋、好ましくは少なくとも約95％純粋であろう。本明細書中の「実質的に純粋な
」蛋白質は、例えば、ＩＭＡＣ蛋白質精製方法を含む当業者に周知の多様な技術
により調製され得る。
【００５２】 本明細書中の「ベクター」という用語は、宿主細胞中へ細胞外、または、細胞
内ＤＮＡを導入するのに使用される核酸化合物を指す。ベクターには、1または
それ以上の蛋白質分子をコードし得るヌクレオチド配列が含まれる。天然のまま
の、または、組換え工学技術を受けたプラスミド、コスミド、ウイルス、及び、
バクテリオファージが一般に使用されるベクターの例である。
【００５３】 本明細書中に開示、及び、記載される種々の制限酵素は市販されており、反応
条件、コファクター、及び、活性のその他の必要条件を含む該酵素の使用方法は
当業者に周知である。特定の酵素の反応条件は、製造者の指示に従って行った。
【００５４】 II．ＦＬＩＮＴのＦａｓＬ、及び、ＬＩＧＨＴへの結合 ＦＬＩＮＴは、新しく同定されたＴＮＦＲスーパーファミリーの一員である。
この受容体のファミリーは、これらに限定されるわけではないが、細胞増殖、細
胞分化、免疫制御、炎症反応、細胞毒性、及び、アポトーシスを含むＴＮＦリガ
ンドの多様な生物学的効果を媒介する。
【００５５】 本発明のＦＬＩＮＴポリペプチドは、細胞外ドメインを含む可溶性の受容体で
ある。ＦＬＩＮＴポリペプチドはどのような膜貫通ドメインも含まず、そのため
可溶性である。ＦＬＩＮＴはまた、ＯＰＧ３(オステオプロテグリン(osteoprote
grin)３)、または、ＴＮＦＲｓｏｌと呼ばれてきた。ＦＬＩＮＴは、米国特許出
願第６０/０３５,４９６号を優先権の基礎とするＷＯ９８/３０６９４号に論じ
られるＴＮＦＲ６α、及び、ＴＮＦＲ６β、並びに、ＥＰ０８６１８５０Ａ１号
に論じられるＴＲ４と密接に関連していると考えられている。
【００５６】 以下に示すデータは、イン・ヴィトロで、ｍＦＬＩＮＴがＦａｓＬ、及び、Ｌ
ＩＧＨＴに結合することを示す。示されるように、ＦａｓＬは炎症反応、及び、
アポトーシスの誘導を引き起こすことの両方に関連する。ＬＩＧＨＴの生物学的
な活性には、これらに限定されるわけではないが、細胞増殖が含まれる。ＬＩＧ
ＨＴは、活性化Ｔ細胞により産生される29ｋＤａのII型膜貫通ＴＮＦスーパーフ
ァミリーの一員となる蛋白質である(Mauri D.M.、Immunity,8:21(1998年))。Ｆ
ａｓＬと同様に、証拠によりＬＩＧＨＴは好中球浸潤、及び、アポトーシスと関
連付られる(Zhaiら、J.Clin.Investig. 102:1142〜51(1998年))。従って、ｍＦ
ＬＩＮＴにより媒介されるＬＩＧＨＴ活性の阻害は、以下に記載されるｍＦＬＩ
ＮＴにより媒介されるＦａｓＬの阻害と実質的に同じ程度に、特に免疫調節、及
び、癌治療において治療的に有用であると期待される。
【００５７】 III．ＦＬＩＮＴ−治療的適用 発明者らは、ｍＦＬＩＮＴがイン・ヴィトロで、ジャーカット細胞のＦａｓＬ
誘導アポトーシスを阻害することを発見した。抗-ＣＤ３抗体がこれらの細胞を
活性化し、これらの細胞にＦａｓＬを発現させ、アポトーシスを行わせるように
する。ｍＦＬＩＮＴはまた、イン・ヴィトロで、ジャーカット細胞の抗-ＣＤ３誘
導アポトーシスを、用量依存的に阻害するのに有効であった。
【００５８】 ｍＦＬＩＮＴは、ＦａｓＬのＦａｓとの不適当、若しくは、異常な相互作用を
妨げるので、本発明はこの相互作用と関連した疾患の処置、及び／または、予防
に適用可能である。例えば、ＦａｓＬ及び／若しくはＦａｓの発現、または、有
効性の増加によって、この不適当な相互作用は起こり得る。ＦａｓＬ-Ｆａｓ相
互作用がアポトーシスを誘導することが知られているので、本発明の方法はさら
に、不適当、または、異常なアポトーシスにより特徴付られる疾患に広く適用さ
れる。
【００５９】 別の態様において本発明は、ＦａｓＬ-媒介アポトーシス、及び／若しくは、
前炎症反応、特にＦａｓＬにより誘導される好中球の活性化により引き起こされ
る前炎症反応を含む、ＦａｓＬ-Ｆａｓ結合により引き起こされるか、または、
悪化される症状を予防、または、処置する方法に関する。
【００６０】 例えば、ｍＦＬＩＮＴはダウン症を処置するのに用いられ得る。ダウン症には
神経細胞の増幅されたアポトーシスが係っているかもしれない。この点で、Seid
iら(Neuroscience Lett.,260:9(1999年))は、Ｆａｓ関連アポトーシスがダウン
症の神経変性の重要な特色であるかも知れないことを示唆する、ダウン症の成人
患者の側頭葉、及び、小脳における上昇したレベルのＦａｓ蛋白質の存在を報告
している。よって、ダウン症患者のｍＦＬＩＮＴによる処置が有効かも知れない
ことが期待される。特に、本発明者らは、ｍＦＬＩＮＴがＦａｓＬを結合し、Ｆ
ａｓ-ＦａｓＬ結合を妨げ、そして、アポトーシスを阻害することを示した。同
様に、アポトーシスはアルツハイマー病、及び、他の神経変性疾病と結び付けら
れてきた。ダウン症、アルツハイマー病、及び、他の神経変性疾患と関連した増
幅されたアポトーシスを、ｍＦＬＩＮＴの投与が減少させることが期待される。
【００６１】 発明者らは、種々の疾病、及び、創傷状態を示す多様なモデル系においてｍＦ
ＬＩＮＴを試験した。いくつかの疾患の例には、これらに限定されるわけではな
いが、抗体依存性細胞毒性、ヒト免疫不全ウイルスによる感染、溶血性***症
候群、アレルギー、及び、気管支肺異形成症が含まれる。従って、以下の項目で
は対応するモデル系における疾病、及び、創傷状態について検討する。
【００６２】 本発明はまた、ＦＬＩＮＴ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の製造を
包含する。特に、発明者らは、測定可能な量のｍＦＬＩＮＴを産生するトランス
ジェニックマウスを作った。これらのような動物は、以下に詳述する、内毒素誘
導ショック、大脳虚血、心臓再灌流障害、並びに、治療的な照射、及び、化学療
法等の癌治療により誘導された損傷等の多様な疾患におけるｍＦＬＩＮＴの効果
を評価するのに有用である。
【００６３】 Ａ．肝臓損傷、及び、炎症のｍＦＬＩＮＴによる処置 ＦａｓＬは、これらに限定されるわけではないが、肝炎により肝臓で引き起こ
された障害を含む急性肝不全に関連付けられてきた。急性肝炎のマウスモデルで
は、抗-ＦａｓＬ抗体のマウスへの投与は、肝細胞のアポトーシスにより誘発さ
れる肝不全を引き起こし、動物は数時間内に死んだ(Kondoら、Nature Medicine 3 (4):409〜413(1997年)、及び、Galleら、J.Exp.Med.,182:1223〜1230(1995年11
月)参照）。
【００６４】 Tsujiら(Infect.Immun.,65:1892〜1898(1998年))は、細菌誘導劇症肝炎のモデ
ル系について記述する。以下に詳述するように、この系により肝臓、及び、その
他の組織における多様な疾患について予言できる。Tsujiらの方法では、マウス
にプロピオニバクテリウム アクネス(Propionibacterium acnes)が注射され、続
いてリポ多糖(ＬＰＳ)が注射された。普通のマウスでは、最初の注射により肝臓
で肉芽腫の形成が引き起こされ、第2の注射により大量のアポトーシスが誘導さ
れ、その結果、肝臓障害が起こる。Tsujiらは、ＴＮＦＲｐ５５を肉芽腫形成に
、そして、ＴＮＦＲｐ５５、及び、Ｆａｓをアポトーシスに関連付けるためにこ
の方法を用いた。
【００６５】 Tsujiらの動物モデルの改変バージョンを用いて、発明者らはｍＦＬＩＮＴの
投与が、実験動物の生存率を劇的に改善することを発見した。示したように、本
発明により処置、及び／または、予防し得る疾患の多くは、ＦａｓＬ-Ｆａｓに
関連した原因を共有する。従って、標的となる疾病は一般に、Ｆａｓを不適当に
(例えば、時間的、質的、若しくは量的に)発現するか、または、Ｆａｓを発現す
る際に不適当にＦａｓＬと接触するようになった組織のどちらかを含む。これら
の疾病の多くは、不適当なＦａｓの上向き調節に続く、アポトーシスのＦａｓＬ
媒介誘導という一般的な病理学モデルに従う。Ｆａｓ(または、ＦａｓＬ)の不適
当な発現は、例えば、或る炎症関連サイトカインが発現を誘導しているかも知れ
ない炎症傷害により誘導されているかも知れない。
【００６６】 例えば、一次単核細胞浸潤により、不適当なＦａｓ及び／またはＦａｓＬの発
現を起こし得る、多数のサイトカインの分泌が起こることが知られている。例え
ばＩＬ-１α、ＩＬ-１β、及びＴＮＦ-αが、Ｆａｓ発現を誘導し得ることが知
られている。このＦａｓの増加された発現が、実際、襲われた組織をナチュラル
キラー細胞、及び、細胞毒性Ｔ細胞等のＦａｓＬを持つエフェクター細胞に対し
感受性にするのかも知れない。ＦａｓＬを持つエフェクターの、Ｆａｓを持つ標
的との接触により、後者のアポトーシスが誘発される。別の言い方をすると、こ
の肝臓創傷モデルは、(ａ)炎症性傷害、並びに／または、(ｂ)ＦａｓＬ-Ｆａｓ
媒介アポトーシス、及び／若しくは、壊死により特徴付けられる或る種の疾病の
イン・ビボ代用物である。
【００６７】 このモデルと一致するのは、例えば自己骨髄移殖で非常に一般的である、対宿
主性移殖片病(ＧＶＨＤ)の病理学である。ＧＶＨＤは、少なくとも一部はＦａｓ
Ｌ媒介アポトーシスにより、宿主組織を破壊する宿主反応性Ｔ細胞の存在により
起こる。ＧＶＨＤは輸入(afferent)、及び、輸出(efferent)と呼ばれる、典型的
には2つの期間に分けられる。輸入は宿主抗原の認識、及び、ドナーＴ細胞の増
殖によって特徴付けられる。輸出では皮膚、肝臓、及び、胃腸管等の組織が炎症
を起こし、そして単核細胞浸潤、及び、組織変化傷害により特徴付けられる。実
際に、ＦａｓＬ欠損マウスを用いた実験により、ＧＶＨＤでＦａｓＬが肝臓、皮
膚、及び、リンパ器官の障害に重要な役割を果たすことが示される。よって、Ｇ
ＶＤＨは炎症傷害、及び、Ｆａｓにより媒介されるアポトーシスの枠組に従う。
【００６８】 橋本甲状腺炎(ＨＴ)もこの枠組に適合する。ＨＴは、甲状腺濾胞細胞に対する
自己免疫反応の結果起こる。通常の甲状腺細胞はＦａｓＬを産生し、ごくわずか
なレベルでＦａｓを発現する。しかしながら、ＨＴでは、生じた炎症により、活
性化マクロファージでのＩＬ-１βの分泌が起こり、それによりその後、Ｆａｓ
を産生するよう甲状腺細胞が誘導される。これにより致命的なＦａｓＬ-Ｆａｓ
オートクリンループ(autocrine loop)が作動し、アポトーシスに到る。
【００６９】 同様に、アテローム性動脈硬化障害に関連した酸化された低密度リポ蛋白質(
ＯｘＬＤＬ)は、慢性的な炎症反応を促進する。血管内皮は通常、ＦａｓＬ及び
Ｆａｓの両方を発現するが、ＯｘＬＤＬの欠損障害ではアポトーシスを起こさな
い。しかしながら、ＯｘＬＤＬによる処置により、ＦａｓＬ発現は増加され、内
皮細胞はアポトーシスを起こす。
【００７０】 慢性腎不全は、腎管内皮細胞におけるＦａｓ発現を誘導することが示されたＩ
Ｌ-１α、及び、ＴＮＦ-αの分泌と関連する。この疾患は、ＦａｓＬ-Ｆａｓの
アポトーシス経路を介した管の内皮細胞の減少によって特徴付けられる。さらに
、細管細胞でのＦａｓ発現の同じサイトカイニン媒介誘導は、急性腎不全の内毒
素ショック(敗血症)モデルでも観察される。
【００７１】 急性肝不全は、肝臓を襲うウイルス感染、肝臓を襲う細菌感染、肝炎、肝細胞
創傷、及び／または、肝細胞が大量のアポトーシスを起こす他の症状で見つけら
れ得る。例えば、Galleら(J.Exp.Med,182:1223〜1230(1995年11月))は、Ｆａｓ
Ｌ-Ｆａｓ媒介細胞死が、ヒトにおける肝不全で役割を果たすことを発見した。G
alleらは、ＦａｓＬ-Ｆａｓ媒介アポトーシスが、老化した肝細胞を排除するた
めの機構であることを知った。例えば、脂肪親和性化合物(例えば、フェノバル
ビトール)による処置の休止後の肝臓退縮の間、及び、ウイルス感染の間の肝臓
再生で発見された。実験を通して彼等は、ウイルス性肝炎の間、活性化Ｔ細胞が
肝細胞を攻撃することを見つけた。Ｆａｓは、構成的に管細胞で発現されている
。即ち、活性化により、ＦａｓＬがＴ細胞で発現されていた。肝臓からＨＢＶを
除くために、活性化Ｔ細胞がＢ型肝炎(ＨＢＶ)抗原-発現肝細胞を殺すのかも知
れないと考えられている。
【００７２】 Tsujiらの改変モデルを用いた発明者らの成功はさらに、ｍＦＬＩＮＴが敗血
症を処置、及び、予防するのに有効であることを示す。敗血症は、血中、または
組織中の1若しくはそれ以上の病原性生物、または、その毒素の存在によって特
徴付けられる。さらに、敗血症は、サイトカインネットワーク、白血球、並びに
、補体、及び、凝固／繊維素溶解系を含む多数の宿主防護機構の活性化と関連し
、及び、それらにより媒介される、感染に対する全身性の炎症反応により特徴付
けられる(Mestersら、Blood,88:881(1996年)参照)。
【００７３】 内毒素が組織壊死因子(ＴＮＦ)を誘導し、それが炎症反応、及び、ＦａｓＬを
誘導することにより肝不全、及び、死を促進することが知られている。しかしな
がら、敗血症の処置においてＴＮＦ-αに対する抗体を使用する試みは、一様に
失敗した。これはおそらく、ＴＮＦ-αが敗血症の病理への効果とは別に、それ
が通常の免疫機能のより包括的なメディエーターであることに起因し得る。さら
に、以下の実施例において示すように、ＴＮＦの阻害剤は障害後の敗血症ではわ
ずかな有用性しか示さないが、予防においてはより有用である。
【００７４】 実施例に示されるデータは、ｍＦＬＩＮＴがＴＮＦ阻害剤よりも、動物敗血症
モデルにおいて生存を促進するのに有効であることを確認する。実際、これらの
データは、ＴＮＦ阻害剤が予防実験(即ち、ＬＰＳ／ガラクトサミン投与前)に使
用された場合にのみ効果を示すのに対し、ｍＦＬＩＮＴが処置後のレジメにおい
ても用いられることを示す。患者は内毒素への曝露後、事実上、常に診察に来る
であろうから、これは臨床的に意味のあることである。別の言い方をすると、こ
れらのデータはｍＦＬＩＮＴが、ＴＮＦ阻害剤とは非常に対照的に、予防的、及
び、改善レジメの両方において有用であることを示す。最低でも、これらのデー
タはｍＦＬＩＮＴが、抗-ＴＮＦよりも疾病の進行において遅い時間に投与され
得ることを示し、従って、臨床においてＴＮＦ阻害剤で見られた問題が避けられ
ることが期待される。
【００７５】 さらに、これらのデータは、ｍＦＬＩＮＴが少なくとも2つのレベルで治療的
に効果を有することを示す。内毒素は炎症反応、及び、ＦａｓＬの両方を直接誘
導するＴＮＦを誘導することが知られている。前述のTsujiらのデータは、これ
らが2つの別個の経路であり、その両方が肝不全、及び、死の一因となっている
ことを示す。特に、彼等のＦａｓ欠損マウスを用いたデータは、彼等のモデルに
おける損傷の実質的な量がＦａｓと無関係な、ＴＮＦ依存的な経路により行われ
たことを強く示す。しかしながら、以下に示すデータは、Ｆａｓ依存経路の阻害
剤であるｍＦＬＩＮＴが、Ｆａｓ依存性であろうとなかろうと、モデル中の全て の 損傷を抑制できることを明らかにする。従って、それらが異なる経路であろう
とも、ｍＦＬＩＮＴは炎症反応、及び、ＦａｓＬの誘導の両方により媒介される
損傷を抑制できる。
【００７６】 さらに、ｍＦＬＩＮＴが、敗血症を処置するのに有用な他の薬剤と組み合わせ
て有利に使用され得ることも意図される。例えば、米国特許第5,009,889号は、
活性化プロテインＣ(ａＰＣ)が、ヒヒ敗血症モデルを処置するのに有効であるこ
とを示す。このようなモデルを例えば、ｍＦＬＩＮＴ及びａＰＣを用いた適当な
組合わせ処置法を調べるのに使用し得る。ａＰＣは、敗血症／敗血症ショックの
初期症状である敗血症に伴う散在性の血管内凝固、及び、微小血管内のフィブリ
ンの広範にわたる蓄積を予防し得る。
【００７７】 従って、ｍＦＬＩＮＴ処置された動物で観察される生存率の改善に基づき、発
明者らは、次の疾病の1またはそれ以上がｍＦＬＩＮＴで処置され得ると考える
：急性呼吸障害症候群(ＡＲＤＳ)；甲状腺腫；肝細胞創傷(ウイルス、細菌、癌
、外傷)；単球増加症；粘液嚢胞(粘膜の炎症)；膵炎；歯周病／歯肉炎；腎不全
；付随器官不全(satellite organ failure)；全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)
；手術；血管溢泌(vascular bleeds)；血管漏出症候群(vascular leak sundrome
)；全器官移植;複合的器官不全(ＭＯＤＳ)；冠動脈バイパス移殖；同種移殖片拒
絶；移殖拒絶；感染(例えば、微生物、肺炎、組織壊死感染、ウイルス)；慢性関
節リウマチにおける骨消失；橋本甲状腺炎；Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、Ｂ型肝
炎ウイルス(ＨＢＶ)、エボラウイルス(溶血熱)、及び、エプスタイン-バーウイ
ルス(ＥＢＶ)を含むウイルス；皮膚炎；乾癬；炎症性腸疾病；潰瘍性大腸炎；ク
ローン病；アテローム性動脈効果症；並びに、敗血症。
【００７８】 特に、本発明は、炎症と関連する疾患を処置する方法を意図する。当業者であ
れば、これらの疾患には、これらに限定されるわけではないが、ＧＶＨＤ、橋本
甲状腺炎、ＡＲＤＳ、肝細胞創傷(ウイルス、細菌、癌、外傷)、粘液嚢胞(粘膜
の炎症)、膵炎、歯周病／歯肉炎、腎不全、リポ蛋白質器官不全、全身性炎症反
応症候群(ＳＩＲＳ)、全器官移植、複合的器官不全(ＭＯＤＳ)、冠動脈バイパス
移殖、同種移殖片拒絶、移殖拒絶、感染(例えば、微生物、肺炎、組織壊死感染
、ウイルス)、慢性関節リウマチ、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、Ｂ型肝炎ウイル
ス(ＨＢＶ)、エボラウイルス(溶血熱)、及び、エプスタイン-バーウイルス(ＥＢ
Ｖ)を含むウイルス感染、皮膚炎、炎症性腸疾病、アテローム性動脈効果症、並
びに、敗血症が含まれることを認識するであろう。
【００７９】 Ｂ．ｍＦＬＩＮＴによる虚血、及び、再灌流の処置 虚血は、多様な毒性の代謝物の蓄積に繋がる、組織への血流の減少によって特
徴付けられる。これらの代謝物は壊死、及び／または、アポトーシスによる細胞
死の一因となる。おそらく驚くべきことに、組織が再灌流されるとアポトーシス
性のダメージが増加する。これはおそらく、虚血により誘導された代謝物の血清
成分との反応によるフリーラジカル、及び、その他の毒素の生成のためである。
いずれにしても、研究によりアポトーシス性のダメージが、少なくとも一部がＦ
ａｓ媒介経路により起こることが示された。以下に示す実験では、おそらくＦａ
ｓＬを阻害することにより、ｍＦＬＩＮＴは虚血／再灌流創傷を妨げるのに用い
得ることが示された。
【００８０】 脳卒中、及び、脳外傷等の大脳虚血に関連した疾患の処置、または、予防にお
けるｍＦＬＩＮＴ組成物の有用性は、以下に示すデータにより確認した。全卒中
(global stroke)の生きたアレチネズミモデルを用いたモデルを示す。大脳虚血
は、総頸動脈の一時的な閉塞により誘導され、続いてｍＦＬＩＮＴ、または、コ
ントロールとしての賦形剤により処置した。データは、ｍＦＬＩＮＴ処置された
アレチネズミが、賦形剤処置されたコントロールグループよりも、明らかにより
多くの生きたニューロンを保持したことを示す。
【００８１】 これらのデータは、機能するＦａｓ受容体を欠くマウスにおける大脳虚血傷害
後の大脳組織の梗塞部の割合を比較し、通常のコントロールと比べて明らかに少
ないダメージが見られたという研究結果と一致する(Rosenbaumら、Annals of Ne urology ,44(3),441(1998年))。よって、ｍＦＬＩＮＴが、大脳虚血症状を患った
患者におけるＦａｓ受容体の通常のシグナル過程を妨げ、それにより脳組織を悪
化から保護することが期待される。
【００８２】 さらに、Ｆａｓ媒介アポトーシスは、心筋梗塞モデルにおける虚血再灌流障害
に結び付けられてきた(Kajsturaら、Laboratory Investigation 74:86〜107(199
6年))。従って、前述のアレチネズミモデルはおそらく、全身性の虚血再灌流障
害を予測できる。発明者らは、これを確認するために、心筋細胞を用いたイン・
ヴィトロ分析を行った。詳しくは、虚血心臓組織で見られる低酸素条件を模倣し
て、心筋細胞を低酸素条件で8時間培養した後、通常のＯ2下で16時間培養した。
実験結果は、心筋細胞のｍＦＬＩＮＴによる処置が、低酸素により誘導されるア
ポトーシスに対して細胞を保護することを示した。特に、10μｇ／ｍｌのｍＦＬ
ＩＮＴによる処置は、低酸素誘導アポトーシスを90％阻害した。心筋細胞のＦａ
ｓＬ誘導アポトーシスもまた、ｍＦＬＩＮＴによる処置により阻害された。
【００８３】 前述の観察、及び、データより、発明者らは次の疾病の1またはそれ以上が、
ｍＦＬＩＮＴにより処置され得ると考える：発作；脊髄虚血；痙攣／子癇前症；
再灌流障害；心筋梗塞、その急性、半急性、及び、慢性後遺症、並びに、これに
限られるわけではないが鬱血性心不全を含む関連する臨床症候群。従って、ＦＬ
ＩＮＴは、心筋の保護の促進、及び、代償不全心筋肥大の予防に有用である。
【００８４】 再灌流障害は、複数の組織中に存在し得、そして腸、火傷、心臓バイパス機構
障害、肝臓(外傷誘導)、溶血熱(エボラ)、幼児毒性(高Ｏ2濃度の高酸素保育器)
、四肢破砕肺傷害(limb crush lung injury)／ＡＲＤＳ、器官移植、複数の外傷
(例えば、自動車事故による)、血管ベッド(vascular bed)の保護、敗血症、及び
他の疾病で通常示される血管器官不全を含む多様な傷害の結果である。これらの
観察はさらに、ｍＦＬＩＮＴが急性心筋梗塞に続く心筋細胞のアポトーシスの予
防／減衰、並びに、一般に低酸素による心臓、及び、他の組織への損傷を予防す
るのに有用であることを示す。
【００８５】 採収の準備における器官保護の場合には、ｍＦＬＩＮＴは、代わって、ドナー
から一旦、取り除かれた器官における虚血再灌流障害に伴うアポトーシスを防ぐ
のに予防的に有用である。典型的な方法には、ドナーを有効量のｍＦＬＩＮＴで
器官採収に先立って前処置することを含む。代わりに、または、連続して、採収
された器官をｍＦＬＩＮＴを含む溶液で潅流、または、溶液に漬けてもよい。こ
の方法は、例えば腎臓、心臓、肺、または、他の器官、及び、組織で用い得る。
【００８６】 他の例では、ｍＦＬＩＮＴは血栓形成、または、凝固性亢進に伴う虚血再灌流
障害を処置するのに有用である。従って、ｍＦＬＩＮＴを血栓溶解剤(例えば、
ウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ)、及び／または、活性化プロテインＣ(ａ
ＰＣ)等の抗血栓剤と組合わせて投与し得る。米国特許第5,350,578号には、ａＰ
Ｃの抗血栓剤活性が記載される。そこで開示されるヒヒ動物モデルは、意図され
た組合わせ治療の有用な用量レジメを突きとめるのに用いられ得る。この点で、
次の疾患が、ａＰＣの添加有り、または、無しでｍＦＬＩＮＴにより処置され得
ることが期待される：増大された凝固障害により特徴付けられる痙攣、及び、子
癇前症；ＨＥＬＬＰ(血小板減少、溶血、及び、肝臓機能の妨害が合併された子
癇前症)；ＨＩＴＳ(ヘパリン誘導血小板減少)；播種性血管凝固(ＤＩＡ)；火傷
；並びに、手術による血小板減少の合併症。
【００８７】 上述のように、研究により、アポトーシス障害の大部分が、再灌流により誘導
されることが示される。この障害は、抗酸化剤によりこの障害が減らされるので
、少なくとも部分的には酸化損傷のためであるようである。同様に、おそらく劣
化を招くのと似た型の障害から保護するように働く、抗酸化剤であるビタミンＥ
を、肉の保存剤として用い得ることが見つけられた。屠殺数日前に、ブタにビタ
ミンＥを投与することが、豚肉の貯蔵寿命を延ばすことが示された。よって、ｍ
ＦＬＩＮＴが、同じように組織、及び、器官を保存するのに有用であろうと考え
られた。これは、特にヒトに消費される器官、及び、肉の貯蔵寿命を延ばすのに
有用であろう。
【００８８】 Ｃ．ｍＦＬＩＮＴによる造血疾患の処置 本出願において議論されるように、ｍＦＬＩＮＴは、Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作
用を阻害し、それによりアポトーシスを予防する。以下に議論するように、Ｆａ
ｓ／ＦａｓＬ相互作用は、造血過程に係っている。従って、本発明は骨髄移殖、
化学療法、放射線治療、無形成性貧血、及び、骨髄異形成症候群、汎血球減少症
状を含む多様な処置、並びに、疾患からの血液の回復を促進するためのｍＦＬＩ
ＮＴをベースとした治療を意図する。本発明はまた、ｍＦＬＩＮＴをベースとし
た、単独、または、他の血液生長因子と組合わせた骨髄細胞系統の拡張を必要と
するいずれかの臨床症状の処置を包含する。このような生長因子には、これらに
限定されるわけではないが、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、ＦＬＴ-３リガンド、
トロンボポエチン(ＴＰＯ)、幹細胞因子(ＳＣＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-
ＣＳＦ)、及び、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)が含ま
れる。
【００８９】 自己、及び、異種骨髄移殖が一般に、新生疾病の多数を処置するのに用いられ
る。自己移殖では、処置される患者から骨髄細胞を取出し、イン・ヴィトロで培
養する。化学療法、及び／または、放射線治療に続いて、細胞を患者に再導入す
る。異種移殖では、別の個体により骨髄細胞が提供される。このような疾病を処
置するのに用いられる化学療法、または、放射線治療により骨髄部分、及び、腸
の内皮への損傷による劇的な骨髄抑制が起こり、患者は免疫抑制され微生物に侵
入されやすくなる。サイトカインの使用と関連した毒性が典型的には存在し、そ
して、サイトカインが典型的には全ての系統の回復を増幅するわけではないが、
造血サイトカインによる移殖骨髄細胞の処置によって、血液の骨髄、及び、血球
系統の回復が促進される(Moore,M.A.S.,Blood 78:1(1991年)；Metcalf,D.,Scien ce 254:529(1991年))。
【００９０】 放射、または、化学療法が骨髄細胞、及び、腸の内皮細胞のアポトーシスを誘
導することが示された。Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路は、感受性の細胞においてアポト
ーシスを誘導することが知られている。総説については、Nihoら、Current Opin ion in Hematology ,5:163(1998年)参照。ＦａｓはＣＤ３４＋前駆細胞上で発現
されており、これらの細胞はＦａｓ刺激によるアポトーシス効果に対して感受性
である(Nagafujiら、Blood,86:883〜889(1995年)；Satoら、Br.J.Haematol.,97:
356(1997年)；Yamaneら、Eur.J.Haematol.,58:289(1997年))。さらに、サイトカ
インによる造血前駆細胞のイン・ヴィトロでの拡張(expansion)は、機能的なＦａ
ｓ発現を上向き調節し、最近では、Ｆａｓがイン・ビボの造血恒常性で負の調節
因子としての役割を果たしているのかもしれないと考えられている(Takenakaら
、Blood,88:2871(1996年)；Stahnkeら、Exp.Hematol.,26:844(1998年))。
【００９１】 １．ｍＦＬＩＮＴ、並びに、放射、及び、化学療法 発明者らは、ｍＦＬＩＮＴが照射を受けた骨髄幹細胞の回復を促進することを
示した。特にマウスを照射し、骨髄細胞を取り出し、サイトカインＩＬ-６、及
び、ＣＳＦと共にイン・ヴィトロで培養した。培養培地へのｍＦＬＩＮＴの添加
により、骨髄前駆細胞、即ち赤血球細胞、顆粒球-マクロファージ細胞、及び、
赤血球単球巨核球細胞の前駆細胞の回復が劇的に増加した。発明者らはまた、ｍ
ＦＬＩＮＴが、５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)で処置したマウスから採収された
骨髄細胞の生存を促進することを示した。抗-ＦａｓＬ抗体もまた、５-ＦＵ処置
マウスから取られた細胞の生存を増加させる。
【００９２】 従って、本発明は、ｍＦＬＩＮＴの照射防護、及び／または、化学防護剤とし
ての使用を包含する。ｍＦＬＩＮＴは、自己または異種移殖に先立って骨髄前駆
細胞のイン・ヴィトロでの拡張、及び、成熟を増幅するのに有用である。ｍＦＬ
ＩＮＴはまた、患者を放射、または、化学療法により処置した後に、前駆細胞の
拡張、または、成熟を促進させるのに有用である。この点で、患者が癌治療(化
学療法、及び、放射線治療)処置されていた場合に、ｍＦＬＩＮＴの該患者への
投与は前駆細胞の拡張、及び、成熟を促進することが期待される。ｍＦＬＩＮＴ
はまた、癌治療、及び、癌治療中の前駆細胞の周期を阻害する骨髄阻害剤により
処置された患者における前駆細胞の拡張、及び、成熟を促進すると期待される。
【００９３】 上述のように、サイトカインは、癌治療を受ける患者の赤血球、並びに、骨髄
細胞のイン・ヴィトロ、及び、イン・ビボで拡張を増幅するのに用いられる。本発
明者らは、ｍＦＬＩＮＴがサイトカインで処置された細胞の拡張を促進すること
を示した。よって、本発明は、ｍＦＬＩＮＴを、1またはそれ以上のサイトカイ
ンと組合わせて、イン・ヴィトロ、及び、イン・ビボで骨髄前駆細胞を拡張するの
に使用することを包含する。顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-Ｃ
ＳＦ)は、化学療法、及び、放射線治療によって起こる骨髄抑制からの回復を促
進するのに用いられている。よって、本発明は、ｍＦＬＩＮＴ、及び、ＧＭ-Ｃ
ＳＦの骨髄抑制からの回復を促進するための組合わせた使用も包含する。
【００９４】 発明者らはさらに、抗-ＦａｓＬ抗体がまた、５-ＦＵで処置された骨髄細胞の
回復を促進することを示した。よって、本発明は化学療法、または、放射線治療
に続いて骨髄細胞の回復の促進における抗-ＦａｓＬの使用を包含する。このよ
うな抗体は、イン・ヴィトロで、異種移殖または自己移殖のために骨髄細胞を拡
張するのに用いられ得る。化学療法、放射線治療、及び／または、骨髄抑制剤の
投与により起こる骨髄抑制からの回復を促進するのに抗ＦａｓＬ抗体もまた、イ
ン・ビボで投与され得る。
【００９５】 患者をｍＦＬＩＮＴで処置する場合には、全身投与が適当である。本明細書中
で用いられるように、ｍＦＬＩＮＴの化学療法、または、照射と「一緒の」投与
には、以下の方法に従ったｍＦＬＩＮＴの投与が包含される：(1)ｍＦＬＩＮＴ
による前処置に続く、照射、または、化学療法；(2)ｍＦＬＩＮＴ、及び、化学
療法、または、放射線治療の同時の投与；(3)先に化学療法、または、照射、続
いてｍＦＬＩＮＴの投与；(4)ｍＦＬＩＮＴの前処置、続いて化学療法、または
、放射線治療、続いてｍＦＬＩＮＴの投与。本発明は、1またはそれ以上の前述
の処置方法におけるｍＦＬＩＮＴの使用を包含する。
【００９６】 ２．末梢における血球減少の処置 本発明はまた、無形成性貧血、及び、骨髄異形成症候群等の造血疾患と関連し
た、末梢における血球減少の処置を意図する。Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシ
スは、リンパ球生成を抑制することが示されてきた(Yasutomoら、J.Immunol.,15 7 :1981(1996年))。Ｆａｓの増加された発現が、無形成性貧血の患者の前駆細胞
で観察されている(Young,N.S.,Eur.J.Hematol.,60(増刊):55(1996年))。Ｆａｓ
の増加された発現はさらに、骨髄異形成症候群を患う患者の前駆細胞でも観察さ
れてきた。
【００９７】 さらに、Mariaらは、Ｆａｓが迅速に初期赤芽細胞で上向き調節され、末端成
熟により高いレベルで発現されることを報告した(Blood 93:796(1999年))。Mari
aらはまた、未成熟の血液細胞がＥＰＯ依存性で、機能性のＦａｓ分子を発現す
ることを報告した。ＦａｓＬを産生する成熟赤芽細胞の存在下では、高レベルの
ＥＰＯに曝されない限り、未成熟細胞はアポトーシスを起こす。Mariaらは、Ｆ
ａｓ／ＦａｓＬ系が、ＥＰＯと一緒に赤血球生成恒常性に寄与することを示唆し
た。
【００９８】 特定の仮説に固執するわけではないが、造血の減少、及び、その結果の血球減
少は、アポトーシスの直接の結果であり得、Ｆａｓ及びＦａｓリガンドの上向き
調節によりまた媒介されているかも知れない。明細書の別の個所に記載されるよ
うに、ｍＦＬＩＮＴはＦａｓ／ＦａｓＬ結合を阻害して、アポトーシスを阻害し
、そして、ｍＦＬＩＮＴはまた造血前駆細胞の生長、及び、成熟を増幅する。従
って、ｍＦＬＩＮＴの使用は、造血疾患によるアポトーシスを抑制し、これらの
疾患と関連した1またはそれ以上の症状を改善へと導くことが期待される。さら
に、未成熟造血細胞はＦａｓＬ誘導アポトーシスに感受性であり、そして、個体
は分化された造血細胞が欠損しているので、このような個体へのｍＦＬＩＮＴの
投与は、未成熟造血細胞のＦａｓＬ誘導アポトーシスを阻害することにより、こ
れらの成熟欠陥を改善することが期待される。
【００９９】 造血疾患を患う個体の治療は、罹病した個体へのｍＦＬＩＮＴの直接の投与に
よって、または、その後罹病した個体に移殖される骨髄細胞を処置するための、
ｍＦＬＩＮＴのイン・ヴィトロでの使用により行われ得る。
【０１００】 ｍＦＬＩＮＴによる治療は、ＥＰＯ、並びに、造血前駆細胞の生長、及び／ま
たは、成熟を促進する他の化合物の投与により増加され得る。サイトカインは、
造血前駆細胞の生長を刺激することが知られている。よって、本発明には、ｍＦ
ＬＩＮＴ、並びに、血小板減少、及び、骨髄異形成症候群等の疾病を患う個体の
前駆細胞の生長、及び、分化を促進する1またはそれ以上のサイトカインとを組
合わせた使用が包含される。
【０１０１】 ３．遺伝子治療 ＦＬＩＮＴはまた、遺伝子治療と組合わせて使用し得る。造血前駆細胞が個人
に移植される場合、それらは適当な導入遺伝子によってトランスフェクトされ、
そしてまた、場合により1またはそれ以上のサイトカインと組合わせて、ｍＦＬ
ＩＮＴで処置される。細胞の培養に続いて、それらは個体に移殖される。このよ
うな遺伝子治療は、所望の性質を血液細胞に与えるのに有用であろう。
【０１０２】 Ｄ．無害な周囲組織のｍＦＬＩＮＴによる保護 癌を処置するのに用いられる化学療法、及び、治療的な照射等の多くの細胞に
損傷を与える治療が、所謂「無害な周囲」組織の傷害、及び、アポトーシスを引
き起こすことが良く知られている。本明細書中の「無害な周囲」組織は、薬理学
的、放射線、または、装置による治療によって傷つけられた非病理組織である。
これらの組織には、これらに限定されるわけではないが、胃部の内皮(口腔、食
道、胃、及び、腸を覆う内皮が含まれる)、肺内皮、血液細胞(リンパ球、単球、
Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞、好中球、好酸球、マスト細胞、血小
板)、腎臓内皮、及び、毛包が含まれる。これらの組織の多くが、それらの構成
細胞の迅速な生長、及び／または、代謝回転によって特徴付けられる。
【０１０３】 「細胞傷害性」治療には、これらに限定されるわけではないが、化学療法(例
えば、シスプラチン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、カンプトセシン、並
びに、フルオロウラシル、及び、他のヌクレオシドアナログ)、治療的な照射、
レーザー療法、及び、吸入毒素(ブレオマイシン等)の投与が含まれる。冠動脈か
らの妨害物の物理的な除去等の装置による治療と関連した、物理的操作もまた、
無害な周囲組織に障害を引き起こし得る。これらの細胞障害性治療は罹病した組
織を壊し、殺すので有用であるが、上述のように、これらは「無害な周囲の」組
織に障害を与え、アポトーシスを誘導するという望ましくない副作用を有する。
【０１０４】 本明細書中の別の個所において検討するように、ｍＦＬＩＮＴは、Ｆａｓ／Ｆ
ａｓＬ相互作用を阻害する。また、ｍＦＬＩＮＴがイン・ヴィトロでＦａｓＬ誘
導アポトーシスを阻害し、治療的な照射、及び、化学療法に続いてｍＦＬＩＮＴ
が骨髄細胞の生存を改善することが本明細書中で示された。従って、細胞障害性
治療により引き起こされた無害な、周囲の組織への障害を改善することが本発明
の目的である。
【０１０５】 照射、及び、化学療法等の癌治療は、腸の内皮細胞におけるアポトーシスを誘
導することが示された。多くの化学療法剤が、アポトーシスを誘導することによ
り機能することが知られている(例えば、Micheauら、J.Natl.Can.Inst. 89:783(
1997年)参照)。照射、及び、化学療法により誘導された骨髄抑制と組み合わさっ
た、このアポトーシスは、広範な日和見感染を許す。現在のところ、化学療法、
及び、治療的な照射に伴う腸機能の破壊を処理する効果的な治療は存在しない。
上述のように、サイトカインによる治療は骨髄抑制の回復を促進することが示さ
れてきたが、サイトカインは望ましくない毒性を生じ得る。
【０１０６】 よって、ｍＦＬＩＮＴが、照射、及び／または、化学療法によって誘導された
腸の内皮への障害を改善することが期待される。特定の仮説に縛られるわけでは
ないが、ｍＦＬＩＮＴがこの障害を、腸の内皮細胞のアポトーシス、及び／また
は、炎症を阻害することにより改善することが期待される。
【０１０７】 Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用は、慢性胃炎に関係してきた。Ｆａｓ、及び、Ｆａ
ｓＬの発現が、慢性胃炎を患う個体の胃部内皮細胞で増加していることが示され
てきた(Rudiら、J.Clin.Invest. 102:1506(1998年)参照)。Rudiはまた、ヘリコ
バクター感染した胃部の内皮細胞が増加したレベルのＦａｓＬ(ＣＤ９５リガン
ド)、及び、Ｆａｓ(ＣＤ９５受容体)を有し、ＦａｓＬを抗-ＡＰＯ-１抗体で阻
害することによりヘリコバクター誘導アポトーシスが減少することを報告した。
従って、ｍＦＬＩＮＴが、(i)ヘリコバクターによって誘導される胃炎、並びに
上述のように、(ii)化学療法、及び、照射等の細胞障害性治療を阻害するのに有
用であることが期待される。
【０１０８】 さらに、高用量の化学療法(ＨＤ-ＣＴ)を受けている患者は、胃部上皮のアポ
トーシス、及び、炎症によって特徴付けられる重篤な粘膜炎の危険がある。Wyme
ngaら(Br.J.Cancer 76:1062(1997年))は、ＨＤ-ＣＴにより処置された乳癌患者
の口腔の粘膜炎について研究した。口部洗浄により出てくる生きた上皮細胞の割
合は、ＨＤ-ＣＴにより処置された患者で増加し、上口部の粘膜層での落屑が示
された。さらに、ＨＤ-ＣＴ患者の口粘膜では、未成熟細胞の割合がより高かっ
た。
【０１０９】 その他の無害な周囲の組織もまた、ｍＦＬＩＮＴ治療により利益を受けるかも
知れない。例えば、Ｆａｓ／ＦａｓＬ誘導アポトーシスは、肺上皮におけるブレ
オマイシン誘導アポトーシスと係ってきた(Hagimotoら、Am.J.Respir.Cell.Mol. Biol. 16:91(1997年))。その研究では、ブレオマイシンで処置された肺胞上皮細
胞中で、Ｆａｓ ｍＲＮＡが上向き調節され、そして浸潤リンパ球中でＦａｓＬ
ｍＲＮＡが上向き調節されていることが示された。よって、出願人らは、ｍＦＬ
ＩＮＴ治療が、細胞障害性治療によって誘導された、上皮等の肺組織における障
害を改善し得ることを期待する。
【０１１０】 Ｅ．癌のｍＦＬＩＮＴによる処置 本発明者らは、マウスにメラノ−マ細胞を注射した場合に生じる腫瘍の体積の
減少を、マウスへのｍＦＬＩＮＴの投与が引き起こすことを発見した。このｍＦ
ＬＩＮＴの効果は、ｍＦＬＩＮＴ／ＦａｓＬ結合、及び、その結果としてのＦａ
ｓＬ媒介Ｔ細胞アポトーシスの阻害により媒介されているかも知れず、それによ
って腫瘍の破壊を容易にするＴ細胞媒介免疫応答が起こる。この点については、
ＦａｓＬはメラノーマ、ヒト結腸直腸癌、肝細胞癌、星状細胞種、及び、肺癌で
発現されていることが知られている(O'Connellら、Immunology Today挿入記事*
；Chappellら、Cancer Immunol.Immunother. 47:65(1998年))。さらに、大腸癌
セルラインがＦａｓＬを発現し、イン・ヴィトロでＦａｓＬ媒介アポトーシスを
誘導することによりＴ細胞を殺せることが報告された(O'Connell)。よって、本
明細書で観察されるメラノーマ腫瘍は、Ｆａｓを発現する浸潤Ｔ細胞のＦａｓＬ
により媒介される死を引き起こす、ＦａｓＬを発現するかも知れない。しかしな
がら、本発明で示された腫瘍の減少には、その他の機構も原因であるかも知れな
い。
【０１１１】 本発明者らにより、腫瘍体積のｍＦＬＩＮＴ媒介減少について達成された成功
に基づき、他の型の癌もまたｍＦＬＩＮＴにより成功裏に処置され得ることが期
待される。これらの癌には、これらに限定されるわけではないが、星状細胞腫、
大腸癌、食道癌、肺癌、メラノーマ、及び、肝細胞癌が含まれる。他のｍＦＬＩ
ＮＴにより処置され得る癌には、膀胱癌、及び、卵巣癌が含まれる。
【０１１２】 Ｆ．自己免疫疾患のｍＦＬＩＮＴによる処置 Ｉ型(インシュリン依存性)、及び、II型(非インシュリン依存性)の両方の糖尿
病は、高血糖によって特徴付けられる。本明細書中の、当分野において周知の「
高血糖」という用語は、健康なヒトにおいて見られる血中グルコースレベルより
も高いレベルによって特徴付けられる症状を表す。健康なヒトの絶食血中グルコ
ースレベルは、110ｍｇ／ｄＬより少ない(真性糖尿病の診断、及び、分類につい
ての専門家会合、Diabetes Care,21(増刊1号),S5〜S19(1992年))。
【０１１３】 Ｉ型インシュリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)は、ＦａｓＬ-Ｆａｓ経路を介した
脾臓(インシュリン産生)β細胞の破壊を含む慢性自己免疫疾患である。この破壊
経路が、炎症過程により活性化されることは有り得ることである。通常のβ細胞
はＦａｓを発現しないが、傷害を受けている間にはこれらの細胞でＦａｓが発現
される。従って、これらのＦａｓ+細胞のＦａｓＬ-Ｆａｓ相互作用を介した局所
的な破壊に、リンパ球関連ＦａｓＬが関連していることはあり得ることである。
ｍＦＬＩＮＴがこの経路を中和するのに有用なのと同じ程度に、これは、ＩＤＤ
Ｍの予防、または、処置で有用である。
【０１１４】 多発性硬化症(ＭＳ)は、変性炎症性脱髄性疾病である。Ｆａｓは、急性、及び
、慢性ＭＳの両方の傷害縁の周りに位置する乏突起膠細胞、及び、近接の白質で
見つけられたが、通常の組織では少ししか見えないか、または、全く見られない
。異常なＦａｓの発現が、炎症過程で放出されるサイトカインにより誘導される
のかも知れない。さらに、ＦａｓＬ発現細胞は、Ｆａｓ発現アポトーシス性乏突
起膠細胞と同じ場所に位置付けられ、この経路がこの疾患の病理に関与している
ことが示唆された。別の自己免疫疾患である狼瘡もまた、ｍＦＬＩＮＴにより処
置され得る。
【０１１５】 Ｇ．骨粗鬆症のｍＦＬＩＮＴによる処置 以下の実施例中に示されるデータは、ｍＦＬＩＮＴが骨粗鬆症等の骨損失の疾
患を予防、または、処置するのに有用であることを示した。これらのデータは、
ＴＮＦＲスーパーファミリーの天然に生じる分泌された一員が、骨の再吸収の調
節の役割を有すると報告されたデータと一致する。Simonetら、Cell 89:309(199
7年)(オステオプロテグリン(ＯＰＧ)と呼ばれる)、Tsudaら、Biochem. and Biop hys.Res.Commun. 234:137(1997年)(破骨細胞生成阻害因子(ＯＣＩＦ)と呼ばれる
)は、骨再吸収する破骨細胞の分化の阻害剤として実質的に機能する。一貫して
、研究によりＦａｓは骨芽細胞アポトーシスと直接結び付けられた(Jilkaら、J. Bone&Mineral Res. 13:793〜802(1998年)；Kawakamiら、J.Bone＆Mineral Res. 12 :1637〜46(1997年))。
【０１１６】 IV．ｍＦＬＩＮＴの治療製剤 ｍＦＬＩＮＴポリペプチド組成物は、各患者の臨床症状(特にｍＦＬＩＮＴポ
リペプチド単独の処置による副作用)、ｍＦＬＩＮＴポリペプチド組成物の運搬
部位、投与方法、投与スケジュール、及び、従事者に公知のその他の要因を考慮
した、良い治療実務と矛盾がない方法により製剤、及び、投薬される。
【０１１７】 有効量のポリペプチドにより、例えばＦａｓＬ、または、ＬＩＧＨＴである選
択されたＴＮＦＲファミリーリガンドの生物活性の統計的に有意な調節が行われ
ることとなる。ＦａｓＬの生物活性には、これに限定されるわけではないが、ア
ポトーシスが含まれる。ＬＩＧＨＴの生物活性には、これに限定されるわけでは
ないが、細胞増殖が含まれる。ＬＩＧＨＴは、活性化Ｔ細胞により産生される29
ｋｄのII型膜貫通ＴＮＦスーパーファミリーの一員の蛋白質である(Mauri d.M., Immunity ,8:21〜30(1998年1月))。
【０１１８】 さらに、有効な量はまた、処置される疾病、創傷、または疾患の有害な症状、
または、徴候の予防、または、改善により決定され得る。従って、本発明の目的
におけるｍＦＬＩＮＴポリペプチドの「治療的に有効な量」は、そのような考察
により決定される。ｍＦＬＩＮＴが免疫モジュレーターであり、そのような物質
で共通に観察されるのはベル型用量応答曲線であることに注目すべきである。そ
のような現象は当分野において周知であり、これを考慮して、それに合うように
ｍＦＬＩＮＴの治療的に有効な量を調節することは、臨床医の技術範囲内のこと
である。
【０１１９】 一般的な計画として、非経口的に各用量が投与されるｍＦＬＩＮＴの医薬的に
有効な量は、患者の体重に対して約1μｇ／ｋｇ／日〜10ｍｇ／ｋｇ／日の範囲
内であり、より詳しくは、2〜8ｍｇ／ｋｇ、好ましくは2〜4ｍｇ／ｋｇ、最も好
ましくは2.2ｍｇ／ｋｇ〜3.3ｍｇ／ｋｇ、そして、最終的に2.5ｍｇ／ｋｇであ
ろう。しかしながら、上述のように、これは治療上の裁量による。好ましくは、
この用量は少なくとも0.01ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１２０】 連続的に与えられる場合、ｍＦＬＩＮＴポリペプチドは、典型的には約0.1μ
ｇ／ｋｇ／時間〜約50μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、1日に1〜4回の注射によ
り、または、例えばミニポンプを用いた連続的な皮下注入のどちらかにより投与
される。静脈内バック溶液(intravenous bag solution)もまた用い得る。変化が
観察されるのに必要とされる処置の長さ、及び、処置に続いて反応が起こるまで
の間隔は、所望の効果に依存して異なる。
【０１２１】 本発明のｍＦＬＩＮＴを含む医薬組成物は、これらに限定されるわけではない
が、経口、直腸、頭蓋内、非経口、槽内、膣内、腹膜内、局所、経皮的(粉末、
軟膏、滴剤、若しくは経皮パッチにより)、口内、または、経口、若しくは、経
鼻スプレーを含む多様な方法を用いて投与され得る。「医薬的に許容され得る担
体」により、非毒性の固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材
料、または、いずれかの型の製剤助剤が意図される。本明細書中の「非経口」と
いう用語は、これらに限定されるわけではないが、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸
骨内、皮下、及び、関節内注射、並びに、注入を含む投与方法を表す。ｍＦＬＩ
ＮＴを含むインプラントもまた用い得る。
【０１２２】 ｍＦＬＩＮＴポリペプチドはまた、徐放性の系によっても適当に投与される。
徐放性組成物の適当な例には、例えば、フィルム、または、マイクロカプセル等
の形作られた物品の形体の半透性のポリマーマトリックスが含まれる。徐放性材
料には、ポリアクチド(polyactide)(米国特許第3,773,919号、ＥＰ第58,481号)
、Ｌ-グルタミン酸、及び、γ-エチル-Ｌ-グルタミン酸の共重合体(Sidman,U.ら
、Biopolymers 22:547〜556(1983年))、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレー
ト)(R.Langerら、J.Biomed.Mater.Res. 15:167〜277(1981年)；R.Langer,Chem.T ech. 12:98〜105(1982年))、エチレンビニルアセテート(R.Langerら、同上)、ま
たは、ポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸(ＥＰ第133,988号)が含まれる。徐放性
ｍＦＬＩＮＴポリペプチド組成物にはさらに、リポソームに取り込まれたｍＦＬ
ＩＮＴポリペプチドも含まれる。ｍＦＬＩＮＴポリペプチドを含むリポソームは
、本質的に公知の方法により調製される(ＤＥ第3,218,121号；Epsteinら、Proc. Natl.Acad.Sci.(USA) 82:3688〜3692(1985年)；Hwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.( USA) 77:4030〜4034(1980年)；ＥＰ第52,322号；ＥＰ第36,676号；ＥＰ第88,046
号；ＥＤＰ第143,949号；ＥＰ第142,641号；日本特願昭58-118008号；米国特許
第4,485,045号、及び、第4,544,545号；並びに、ＥＰ第102,324号）。通常、リ
ポソームは小型(約200〜800オングストローム)の単層状の型であり、コレステロ
ール当り約30ｍｏｌよりも大きい脂質含量であり、選択された割合は、最適なＴ
ＮＦＲポリペプチド治療に適合されている。
【０１２３】 非経口投与のための一態様では、ｍＦＬＩＮＴポリペプチドは一般に、それを
所望の程度の純度で、単位用量の注射可能な形体(溶液、懸濁液、または、乳剤)
中に、医薬的に許容され得る担体、即ち、用いられる用量、及び、濃度で受容者
に非毒性で、製剤中の他の成分と融和性であるものと混合することにより製剤さ
れる。例えば、製剤は好ましくは酸化剤、及び、ポリペプチドに有害であること
が知られる他の化合物を含まない。
【０１２４】 一般に、ｍＦＬＩＮＴポリペプチドを、液体担体、または、細かく分離した固
体担体、または、その両方と均一、及び、完全に接触することにより製剤を調製
する。その後、必要であれば、製品を所望の製剤に形作る。好ましくは担体は、
非経口担体であり、より好ましくは受容者の血液と等張の溶液である。このよう
な担体ビヒクルの例には、水、塩水、リンガー溶液、及び、ブドウ糖溶液が含ま
れる。固定油、及び、オレイン酸エチル等の非水性ビヒクルもまた、本発明で、
リポソームと同じように有用である。
【０１２５】 担体は好ましくは、等張性、及び、化学的安定性を増す物資等の添加剤を少量
含む。このような材料は、用いられる用量、及び、濃度で受容者に非毒性であり
、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及び、他の有機酸、若しくは、それらの
塩等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；例えば、ポリアルギニン若しくは
トリペプチド等の低分子量(約10残基より少ない)ポリペプチド；血清アルブミン
、ゼラチン、若しくは、免疫グロブリン等の蛋白質；ポリビニルピロリドン等の
親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、若しくは、アルギ
ニン等のアミノ酸；単糖、二糖、及び、セルロース若しくはその誘導体、グルコ
ース、マンノース、若しくは、デキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等の
キレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム
等の対イオン；並びに／または、ポリソルベート、ポリオキサマー(polyoxamer)
、若しくはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２６】 ｍＦＬＩＮＴは典型的にはこのようなビヒクル中に、約0.1ｍｇ／ｍｌ〜100ｍ
ｇ／ｍｌ、好ましくは1〜10ｍｇ／ｍｌの濃度で、約3〜8のｐＨで製剤される。
前述の或る特定の賦形剤、担体、または、安定剤の使用によりｍＦＬＩＮＴポリ
ペプチド塩が形成されることが理解される。
【０１２７】 治療的投与に用いられるＦＬＩＮＴポリペプチドは無菌でなければならない。
無菌性は、無菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)による濾過により容易に行われ
得る。治療的なｍＦＬＩＮＴポリペプチド組成物は一般に、例えば、皮下注射針
により貫通し得る蓋を有する静脈注射用の溶液バック、または、バイアルである
無菌の出入口を有する容器に入れられる。
【０１２８】 ＦＬＩＮＴポリペプチドは通常、例えば、密閉されたアンプル、または、バイ
アルである一用量、または、複数用量の容器に、水溶液、または、再構成される
凍結乾燥製剤として貯蔵される。凍結乾燥製剤の例として、10ｍｌのバイアルが
5ｍｌの無菌濾過された1％(重量／容量)ｍＦＬＩＮＴポリペプチド水溶液で満た
され、得られた混合物は凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥されたｍＦＬＩ
ＮＴポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成することにより調製される。
【０１２９】 本発明はさらに、1またはそれ以上の本発明の医薬組成物の成分で満たされた1
またはそれ以上の容器を含む医薬的なパック、または、キットを提供する。この
ような容器は、医薬または生物学的製品の製造、使用、または、販売を規制する
政府機関により指示される形体での、機関によるヒトへの投与のための製造、使
用、または販売の認可を表す通告を伴い得る。さらに、本発明のポリペプチドは
、他の治療的な化合物と一緒に用いられ得る。
【０１３０】 Ｖ．ポリペプチド製造方法 本発明の一態様は、ｍＦＬＩＮＴ遺伝子でコードされる実質的に精製されたポ
リペプチド、または、ｍＦＬＩＮＴ遺伝子に関する。
【０１３１】 当業者であれば、本発明のポリペプチドが、固相ペプチド合成、または、組換
え方法を含む当分野において周知の化学的方法等の多数の異なる方法によって合
成され得ることを理解する。どちらの方法も米国特許第4,617,149号に記載され
る。
【０１３２】 ポリペプチドの固相化学合成の原理は周知であり、当分野の一般文献で見つけ
られ得る。例えば、H.Dugas及びC.Penneyの「BIOORGANIC CHEMISTRY」(Springer Verlag,New York(1981年))第54〜92頁参照。例えば、ペプチドはApplied Biosy
stemsにより提供されるApplied Biosystems 430Aペプチドシンセサイザー(Appli
ed Biosystems,Foster City,CA)、及び、合成サイクルを用いた固相法により合
成され得る。
【０１３３】 本発明のポリペプチドはまた、クローン化されたＦＬＩＮＴ遺伝子を用いた組
換えＤＮＡ法によっても製造され得る。高収量が望まれる場合、組換え法が好ま
れる。クローン化された遺伝子の発現は、当業者に周知の多様な適当な宿主細胞
で行われ得る。この目的のため、当業者に周知のいずれかの適当な手段により、
ＦＬＩＮＴ遺伝子は宿主細胞中に導入される。クローン化遺伝子の染色体への導
入は本発明の範囲内に含まれるが、適当な染色体外に維持される発現ベクター中
に遺伝子が、ＦＬＩＮＴ遺伝子のコード領域が構成、または、誘導プロモーター
に調節可能に結合されるよう、クローン化されることが好ましい。
【０１３４】 ＦＬＩＮＴポリペプチドの組換え産生の基本的な工程は： ａ)ＦＬＩＮＴをコードする天然、合成、または、半合成ＤＮＡを構築し、 ｂ)該ＤＮＡを、ＦＬＩＮＴポリペプチドを単独、または、融合ポリペプチド
のどちらかとして発現するのに適した方法で発現ベクター中に組み込み、 ｃ)該ベクターを適当な真核、または、原核宿主細胞中に形質転換、または、
他の方法で導入して、組換え宿主細胞を形成し、 ｄ)該組換え宿主細胞を、ＦＬＩＮＴポリペプチドを発現するように培養し、
そして、 ｅ)ＦＬＩＮＴポリペプチドを当業者に周知のいずれかの手段により回収し、
そして、実質的に精製する ことである。
【０１３５】 １．原核及び新核宿主細胞中での組換え ＦＬＩＮＴポリペプチドの発現 組換えＦＬＩＮＴポリペプチドの産生に、原核細胞が用いられ得る。例えば、
大腸菌Ｋ１２株２９４(ATCC No.31446)が、外来ポリペプチドの原核細胞での発
現に特に有用である。大腸菌の他の株、枯草菌等のバチルス、サルモネラ・ティ
フィムリウム(Salmonella typhimurium)、または、セラチア・マルセサンス(Serr atia marcescans )等の腸内細菌、種々のシュードモナス属、及び、ストレプトマ
イセス等の他の細菌もまた、本発明の組換えポリペプチドのクローニング、及び
、発現の宿主細胞として用いられ得る。
【０１３６】 原核細胞で遺伝子を発現させるのに適当なプロモーター配列には、β-ラクタ
マーゼ(例えば、レプリコン、及び、β-ラクタマーゼ遺伝子を含む、ベクターｐ
ＧＸ２９０７(ATCC 39344))、ラクトース系(Changら、Nature(London),275:615(
1978年)；Goeddelら、Nature(London),281:544(1979年))、アルカリホスファタ
ーゼ、及び、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーターの制御下でｔｒｐＥ融合ポリ
ペプチドとしてオープンリーディングフレームの発現を容易にするように設計さ
れたｔｒｐプロモーター系(ベクターｐＡＴＨ１(ATCC 37695))が含まれる。ｔａ
ｃプロモーター(ｐＤＲ５４０(ATCC-37282)から単離可能)等のハイブリッドプロ
モーターもまた適当である。一般にそのヌクレオチド配列の知られる他の細菌プ
ロモーターも、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに、必要とされるいず
れかの制限部位を提供するリンカー、または、アダプターを用いて結合され得る
。細菌系において用い得るプロモーターはさらに、所望のポリペプチドをコード
するＤＮＡに制御可能に連結されたシャイン-ダルガーノ配列を含み得る。これ
らの例は限定ではなく、単なる例示である。
【０１３７】 本発明のポリペプチドは、直接発現、または、酵素的若しくは化学的切断によ
り除き得る他のポリペプチドペプチド、若しくは、ペプチドとの翻訳融合体とし
て所望のポリペプチドを含む融合ポリペプチドとして合成し得る。組換え系中で
の或る種のペプチドの産生において、融合ポリペプチドとしての発現が寿命を延
長するか、所望のペプチドの収量を増加するか、または、ポリペプチドを精製す
るための適切な手段を提供することがしばしば観察される。これは特に、哺乳動
物ポリペプチドを原核細胞宿主中で発現する場合に関連する。ペプチド鎖の特定
の部位でポリペプチドを切断する(例えば、エンテロキナーゼ、及び、トロンビ
ン)、または、アミノ末端、若しくは、カルボキシ末端からペプチドを消化する(
例えば、ジアミノペプチダーゼ)多様なペプチダーゼが公知である。さらに、特
定の化学物質(例えば、臭化シアン)は、特定の部位でポリペプチド鎖を切断する
であろう。当業者は部位特異的内部切断部位を導入するためのアミノ酸配列(及
び、組換え手段が採用される場合には合成、または、半合成コード配列)の必要
な修正を理解する。例えば、「PROTEIN PURIFICATION: FROM MOLECULAR MECHANI
SMS TO LARGE SCALE PROCESSES」(American Chemical Society, Washington,D.C
.(1990年))中のP.Carter「Site Specific Proteolysis of Fusion Polypeptides
」第13章参照。
【０１３８】 原核細胞に加えて、カエル卵母細胞等の種々の両生類発現系、及び、哺乳動物
細胞系を用い得る。特定の宿主細胞の選択は、ある程度、用いられる特定の発現
ベクターに依存する。本発明で用いるのに適する例示的な哺乳動物宿主細胞は、
例えば、ＨｅｐＧ-２(ATCC HB 8065)、ＣＶ-１(ATCC CCL 70)、ＬＣ-ＭＫ2(ATCC
CCL 7.1)、３Ｔ３(ATCC CCL 92)、ＣＨＯ-Ｋ１(ATCC CCL 61)、ＨｅＬａ(ATCC
CCL 2)、ＲＰＭＩ８２２６(ATCC CCL 155)、Ｈ４IIＥＣ３(ATCC CCL 1600)、Ｃ
１２７Ｉ(ATCC CCL 1616)、ＨＳ-Ｓｕｌｔａｎ(ATCC CCL 1484)、及び、ＢＨＫ-
２１(ATCC CCL 10)である。
【０１３９】 哺乳動物宿主細胞を形質転換するのに広く多様なベクターが適当である。例え
ば、ｐＳＶ２型ベクターは、転写、及び、ポリアデニル化に必要とされるサルウ
イルス４０(ＳＶ４０)ゲノムの部分を含む。挿入された遺伝子の転写をＳＶ４０
プロモーターが行う、ｐＳＶ２-ｇｐｔ、ｐＳＶ２-ｎｅｏ、ｐＳＶ２-ｄｈｆｒ
、ｐＳＶ２-ｈｙｇ、及び、ｐＳＶ２-β-グロビン等のプラスミドｐＳＶ２型の
多数のベクターが構築された。これらのベクターは、American Type Culture Co
llection(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852)、または、N
ational Center for Agricultural Utilization Research(1815 North Universi
ty Street,Peoria,Illinois 61604-39999)等より広く入手可能である。
【０１４０】 哺乳動物細胞中での発現に適するプロモーターには、ＳＶ４０後期プロモータ
ー、例えば、エストロゲン誘導性鶏卵白アルブミン遺伝子、インターフェロン遺
伝子、グルココルチコイド誘導性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子等の
真核細胞遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、並びに
、極初期、及び、後期アデノウイルス遺伝子のプロモーターが含まれる。
【０１４１】 プラスミドｐＲＳＶｃａｔ(ATCC 37152)は、鶏、及び、他の宿主細胞に感染す
ることの知られているウイルスであるラウス肉腫ウイルスの、末端反復配列の部
分を含む。この末端反復配列は、本発明のベクターにおいて用いるのに適当なプ
ロモーターを含む(H.Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),79,6777(1982年))。
プラスミドｐＭＳＶｉ(NRRL B-15929)は、マウス、及び、他の宿主細胞に感染す
ることの知られているウイルスであるマウス肉腫ウイルスの、末端反復配列の部
分を含む。マウスメタロチオネインプロモーターもまた、真核宿主細胞の使用に
ついてよく特徴付られており、本発明の使用に適する。このプロモーターは、本
発明の他のプラスミドの構築の出発材料となり得るプラスミドｐｄＢＰＶ-ＭＭ
Ｔｎｅｏ(ATCC 37224)中に存在する。
【０１４２】 哺乳動物細胞のこのベクターによるトランスフェクションは、これらに限定さ
れるわけではないが、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈、エレクトポ
レーション等を含む多数の周知の方法により行われ得る。例えは、Maniatisら(
上述)参照。
【０１４３】 いくつかのウイルスもまた、適当なベクターとなる。例としては、米国特許第
4,775,624号に記載されるように、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワク
シニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及び、ラウス肉腫ウイ
ルスが含まれる。該特許は、本明細書の一部を構成する。例えば、組換え蛋白質
を産生するためにバキュロウイルスｐＦａｓｔＢａｃ-１(GIBCO/BRL)を、ＳＦ９
等の適当な宿主細胞を感染するのに使用し得る。
【０１４４】 酵母、及び、他の菌類等の真核細胞微生物もまた、適当な宿主細胞である。酵
母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が好ましい真核細胞
微生物である。クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、及び
、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の他の酵母も適当である。サッカロマ
イセスでの発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７(ATCC-40053)を用い得る
(例えば、L.Stinchcombら、Nature,282,39(1979年)；J.Kingsmanら、Gene,7,141
(1979年)；S.Tschemperら、Gene,10,157(1980年)参照)。プラスミドＹＲｐ７は
、ｔｒｐ１栄養要求性突然変異体中で用いるための選択マーカーとなるＴＲＰ１
遺伝子を含む。
【０１４５】 組換え産生されたＦＬＩＮＴポリペプチドの精製 クローン化されたＦＬＩＮＴ遺伝子を運ぶ発現ベクターが、標準的な方法を用
いて適当な宿主細胞中に形質転換、または、トランスフェクトされる。ベクター
を含む細胞を、組換えＦＬＩＮＴポリペプチドの発現に適した条件下で増殖させ
る。例えば、導入遺伝子が誘導プロモーターの制御下に置かれた場合、適当な生
育条件には、適切な誘導物質が含まれるであろう。組換え産生されたポリペプチ
ドは、形質転換された細胞の細胞抽出物から、いずれかの適当な手段により精製
され得る。
【０１４６】 好ましいポリペプチド精製の工程では、ＦＬＩＮＴポリペプチドのアミノ末端
に幾つかのヒスチジン残基を結合するために、ＦＬＩＮＴ遺伝子は５'末端で改
変される。この「ヒスチジンタグ」により、米国特許第4,569,794号に記載の「
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー」(ＩＭＡＣ)と呼ばれる、
１段階ポリペプチド精製方法が可能になる。該特許文献は、本明細書の一部を構
成する。ＩＭＡＣ方法により、上述のように、改変された組換えポリペプチドを
発現する細胞からの粗抽出物から出発する、実質的に純粋な組換えＦＬＩＮＴポ
リペプチドの迅速な単離が可能になる。
【０１４７】 本発明の他の態様には、図１、２、３、４をコードする単離された核酸が含ま
れる。これらの核酸のいずれをも、化学的な合成方法により製造し得る。核酸の
合成は当分野において周知である(例えば、E.L.Brown、R.Belagaje、M.J.Ryan、
及び、H.G.Khorana、Methods in Enzymology,68:109〜151(1979年)参照)。ＦＬ
ＩＮＴ、または、ｍＦＬＩＮＴ遺伝子に対応するＤＮＡ配列の断片は、Applied
Biosystems Inc.(850 Lincoln Center Drive,Foster City,CA 94404)のモデル３
８０Ａ、または、３８０ＢのＤＮＡ合成機等の慣用のＤＮＡ合成装置を用いて、
ホスホロアミダイト化学により製造し得、その後、断片を全遺伝子を再構築する
ように連結させる。代わりに、ホスホトリエステル化学を、本発明において用い
られる核酸を合成するのに用い得る(例えば、Gait,M.J.編「OLIGONUCLEOTIDE SY
NTHESIS, A PRACTICAL APPROACH」(1984年)参照)。
【０１４８】 代わりの方法、即ちＰＣＲでは、例えば、図１を含む本明細書中に開示され、
記載されるＤＮＡ配列は、多数の出発材料から製造され得る。例えば、ＦＬＩＮ
Ｔ遺伝子を発現する組織由来のｃＤＮＡ調製物(例えば、ｃＤＮＡライブラリー)
から始め、図１、または、その中のサブ領域に相補的な適当なオリゴヌクレオチ
ドプライマーが、米国特許第4,889,818号に記載されるように調製される。ＰＣ
Ｒのための、その他の適当な方法がMichael A.Innisら編の「PCR PROTOCOLS: A
GUIDE TO METHOD AND APPLICATIONS」(Academic Press,Inc.(1990年))に開示さ
れる。
【０１４９】 本発明のリボ核酸は、上述のポリヌクレオチド合成方法により、または、例え
ば、ＦＬＩＮＴ ＤＮＡ鋳型を転写するためのＲＮＡポリメラーゼを用いて、酵
素的に合成され得る。本発明のリボ核酸を調製するための最も好ましい系では、
バクテリオファージＴ７、または、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラ
ーゼを用いる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、非常に特異的であり、転写され
るべき鋳型の５'末端に、バクテリオファージ特異的な配列の挿入を必要とする(
上述のManiatisら、参照)。この発明はまた、図1〜4と相補的な核酸、ＲＮＡ、
または、ＤＮＡを提供する。
【０１５０】 ２．ベクター 本発明の別の態様は、本発明の核酸を含む組換えＤＮＡクローニングベクター
、及び、発現ベクターに関する。
【０１５１】 当業者は、最も適当なクローニングベクター、または、発現ベクターの選択が
制限酵素部位の有効性、ベクターがトランスフェクト、若しくは、形質転換され
る宿主細胞の型、トランスフェクション、若しくは、形質転換の目的(例えば、
染色体外因子としての安定な形質転換、または、宿主染色体への挿入)、容易に
分析、若しくは、選択し得るマーカーの存在、または、不在(例えば、1つの型、
及び、別の型の抗生物質耐性、並びに、代謝マーカー)、並びに、宿主細胞中に
必要とされる遺伝子のコピー数等を含む多数の要因に依存することを理解する。
【０１５２】 本発明の核酸を運ぶのに適当なベクターには、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイル
ス、溶菌バクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、安定なバクテリオフ
ァージ、プラスミド、ウイロイド等が含まれる。最も好ましいベクターは、プラ
スミドである。
【０１５３】 発現ベクターを調製する場合、例えば、構成または誘導プロモーターを使用す
べきか等、考慮すべき多くの変数が存在することを当業者は理解する。実験者は
また、製造される核酸、または、ポリペプチドの量が、部分的に、発現系の選択
を指図することを理解する。プロモーター配列に関しては、調節可能に連結され
た遺伝子の高レベルで、制御可能な発現を可能にするので、誘導プロモーターが
好ましい。当業者は、例えば、炭素源、金属イオン、及び、熱である多様な誘導
物質に応答する、多数の適当なプロモーターを認識するであろう。発現ベクター
に関して、その他関連して決定されなければならないことには、組換えポリペプ
チドの局在を指示する配列を含むべきかどうかが含まれる。例えば、遺伝子のコ
ード領域に先立つシグナルペプチドをコードする配列は、得られるポリペプチド
の細胞外の運搬を指示するのに有用である。
【０１５４】 本発明はまた、図1〜4を含むポリペプチドを発現できる組換え宿主細胞を構築
する方法を提供する。この方法は、図1〜4のいずれかに記載された単離されたＤ
ＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクターを宿主細胞中に形質転換、または、他の方
法により導入する方法を含む。
【０１５５】 好ましい宿主細胞は、外来の遺伝子、または、ポリペプチドの高レベルの発現
に順応され得、該ポリペプチドを膜構造中に導入するであろう、いずれかの真核
細胞である。発現のためのベクターは、図1〜4の配列のいずれかを含むものであ
る。形質転換された宿主細胞は、当業者に周知の条件下で、ＦＬＩＮＴまたはｍ
ＦＬＩＮＴが発現され、それにより組換えＦＬＩＮＴ、または、ｍＦＬＩＮＴポ
リペプチドが組換え宿主細胞中で産生されるように培養される。
【０１５６】 以下の実施例は、より完全に本発明について説明する。当業者であれば、記載
の特定の試薬、設備、及び、手法が単なる例示であって、どのような意味でも本
発明を限定する目的ではないことを理解する。
【０１５７】 実施例１ ｍＲＮＡからのＦＬＩＮＴ遺伝子のＲＴ-ＰＣＲ増幅 慣用の方法を用い、ＦＬＩＮＴ遺伝子を逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によ
り単離する。例えば肺であるＦＬＩＮＴ遺伝子を発現する組織からの総ＲＮＡを
標準的な手法により調製する。一本鎖ＦＬＩＮＴ ｃＤＮＡ合成は、図1〜4のい
ずれかの適当な領域に対して特異的なプライマーと共に、市販のキット(Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ(登録商標)Ｓｙｓｔｅｍ;Life Technologies)を用いて、ＰＣ
Ｒにより達成される。
【０１５８】 増幅は、一本鎖ｃＤＮＡ(真空下で乾燥)に次のものを添加することにより行わ
れる：8μｌの10×合成緩衝液(200ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ,ｐＨ8.4；500ｍＭ Ｋ
Ｃｌ,25ｍＭ ＭｇＣｌ2,1ｕｇ／ｕｌ ＢＳＡ)；68μｌ蒸留水；各プライマーの1
0ｍＭ溶液を1μｌ；及び、1μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(2〜5Ｕ／μｌ)。
ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性するために、反応物を94℃で5分間加熱す
る。その後、いずれかの適当な温度循環装置を用いて、15〜30サイクルのＰＣＲ
増幅を行う。増幅したサンプルを、適当な大きさの断片についてアガロースゲル
電気泳動により分析し得る。
【０１５９】 実施例２ 宿主細胞中でＦＬＩＮＴを発現するためのベクターの製造 大腸菌等の多様な原核宿主細胞中でＦＬＩＮＴ、または、その断片を発現する
のに適した発現ベクターは容易に作られる。ベクターは、複製起点(Ｏｒｉ)、形
質転換方法後にベクターを取り込んだ細胞を選択するのに有用なアンピシリン耐
性遺伝子(Ａｍｐ)、並びに、ＦＬＩＮＴコード領域に対して作動可能に連結され
たＴ７プロモーター、及び、Ｔ７ターミネーターを含む。プラスミドｐＥＴ１１
Ａ(Novogen,Madison WIより入手)は適当な親プラスミドである。ｐＥＴ１１Ａは
エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ、及び、ＢａｍＨＩを用いた切断により線状化され
る。線状化されたｐＥＴ１１Ａは、ＮｄｅＩ、及び、ＢａｍＨＩ粘着末端を有し
、図1〜4に開示されるＦＬＩＮＴ遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片に連結さ
れる。
【０１６０】 この構築物で用いられるＦＬＩＮＴ遺伝子は、コードされるポリペプチド産物
の精製を単純化するために５'末端(コードされたポリペプチドのアミノ末端)を
少し改変し得る。この目的のため、8個のヒスチジン残基をコードするオリゴヌ
クレオチドがＡＴＧ開始コドンの後ろに挿入される。コードされるポリペプチド
のアミノ末端へのヒスチジン残基の配置は、ＩＭＡＣ1段階ポリペプチド精製方
法を可能にするのに役立つ。
【０１６１】 実施例３ ＦＬＩＮＴポリペプチドの組換え発現、及び、精製 ＦＬＩＮＴ、または、その断片をコードし、作動可能に発現プロモーターに連
結されたオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を運ぶ発現ベクターを大腸菌Ｂ
Ｌ２１(ＤＥ３)(ｈｓｄＳ ｇａｌ λｃＩｔｓ８５７ ｉｎｄ１Ｓａｍ７ｎｉｎ５ ｌａｃ ＵＶ５-Ｔ７遺伝子１)中に標準的な方法により形質転換する。アンピシリ
ンへの耐性について選択された形質転換体を、無作為に選択し、迅速プラスミド
調製物を用いたアガロースゲル電気泳動により、ベクターの存在について試験す
る。ベクターを含有するコロニーをＬブロス上で生育し、ベクターに運ばれるＯ
ＲＦにコードされるポリペプチド産物を、実質的に米国特許第4,569,794号に記
載されるように、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡ
Ｃ)により精製する。
【０１６２】 簡潔には、ＩＭＡＣカラムは次のように調製される。保存剤を除くために金属
を欠くキレート樹脂(例えば、セファロース６Ｂ ＩＤＡ,Pharmacia)を蒸留水で
洗浄し、50ｍＭの塩化金属、または、硫酸金属水溶液を、樹脂の間隙の約75％が
色のついた金属イオンで飽和されるまで添加することにより、適当な金属イオン
(例えば、Ｎｉ(II)、Ｃｏ(II)、または、Ｃｕ(II))をしみ込ませる。それにより
カラムは、組換えポリペプチド産物を含む粗細胞抽出物を受ける準備ができる。
【０１６３】 未結合のポリペプチド、及び、他の材料をいずれかの適当な緩衝液(ｐＨ7.5)
でカラムを洗浄することにより除去した後、結合されたポリペプチドをｐＨ4.3
で、適当な緩衝液により、または、好ましくはｐＨ7.5で、イミジゾール(imidiz
ole)含有緩衝液で溶出する。
【０１６４】 実施例４ ＦＬＩＮＴｍＲＮＡの組織分布 ＦＬＩＮＴｍＲＮＡの多様なヒト組織における存在をノーザンブロット分析に
より分析した。異なる組織、または、培養細胞の総ＲＮＡを標準塩化グアニジン
／フェノール抽出方法により単離し、そしてポリ-Ａ+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)-セ
ルロース タイプ７(Pharmacia)を用いて単離した。ＲＮＡ試料の電気泳動をホル
ムアミド中で行い、続いてＺｅｔａ-Ｐｒｏｂｅ(登録商標)ナイロン膜(Bio-Rad,
Hercules,Calif.)に毛管移行した。図１が、ＭｕｌｔｉＰｒｉｍｅ(登録商標)ラ
ンダムプライミングキット(Amersham,Arlington Heights,Ill.)を用いてプロー
ブを製造するための鋳型であった。ラベル化反応の効率は、鋳型1μｇ当りおよ
そ4×1010ｃｐｍの結合であった。ハイブリダイゼーション緩衝液は、0.5Ｍリン
酸ナトリウム、7％ＳＤＳ(重量／容量)、1％ＢＳＡ(重量／容量)、及び、1ｍＭ
ＥＤＴＡを含んでいた。プレハイブリダイゼーションをハイブリダイゼーション
緩衝液中、65℃で2時間行い、32Ｐ標識プローブを添加し、インキュベーション
を一晩続けた。膜を緩衝液Ａ(40ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ7.2、5％ＳＤＳ(重
量／容量)、0.5％ＢＳＡ(重量／容量)、及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で1時間
、その後、緩衝液Ｂ(40ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ7.2、1％ＳＤＳ(重量／容量
)、及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で20分間洗浄した。膜を風乾し、−80℃でＫ
ｏｄａｋ Ｘ-ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに補力スクリーンと共に曝露した。
【０１６５】 結果により、胃、脊髄、リンパ節、気管、脾臓、結腸、及び、肺を含む多数の
組織にＦＬＩＮＴ ｍＲＮＡが存在することが示された。
【０１６６】 実施例５ ポリペプチドに対する抗体の産生 実質的に純粋なポリペプチド、または、その断片をトランスフェクト、若しく
は、形質転換した細胞から、当分野において周知のいずれかの方法、または、本
明細書中に特に開示された方法により単離する。最終調製物中のポリペプチド濃
度は、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルターによる濾過により、約1〜5ｕｇ／ｍｌの
レベルとなるように調整される。モノクローナル、または、ポリクローナル抗体
は以下のように調製され得る。
【０１６７】 モノクローナル抗体はマウスハイブリドーマから、Kohler及びMilstein(Natur e ,256,495(1975年))の方法により、または、その改変された方法により調製され
得る。簡潔にいうと、マウスを数マイクログラムのポリペプチド、若しくはその
断片、または、その融合ペプチドにより数週間にわたって、繰り返し接種する。
その後、マウスを殺し、そして脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞を、ポ
リエチレングリコールを手段としてマウスミエローマ細胞と融合する。融合され
た細胞で抗体を産生するものを、例えば、E.Engvall(Meth.Enzymol.,70,419(198
0年))に記載されるように、ＥＬＩＳＡ等のいずれかの適当な免疫分析により同
定する。
【０１６８】 ポリクローナル抗血清は、本明細書中に開示されるポリペプチド、その断片、
または、その融合ポリペプチドで適当な動物を免疫化することを含む、例えば、
J.Vaitukaitisら(Clin.Endocrinol.Metab. 33,988(1971年))に記載される周知の
方法によって調製され得る。少用量(例えば、ナノグラム量)の抗原を複数の皮内
部位に投与することが、最も信頼できる方法であるようだ。
【０１６９】 実施例６ 哺乳動物ＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇ発現ベクターの構築 ＦＬＩＮＴ発現の確認 (抗体の使用無しで) を容易にするために、「内部リボ
ソーム導入部位」／増幅グリーン蛍光ポリペプチド(ＩＲＥＳ／ｅＧＦＰ)ＰＣＲ
断片の哺乳動物発現ベクターｐＧＴＤ(Gerlitz,B.ら、Biochemical Journal 295 :131)への導入により、ビシストロン性発現ベクター(ｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴＦ)を
構築した。この新しいｐＩＧ１と呼ばれるベクターは、次の配列標認点を含む：
Ｅ１ａ-応答ＧＢＭＴプロモーター(D.T.Bergら、BioTechniques 14:972(1993年)
；D.T.Bergら、Nucleic Acids Resarch 20:5485(1992年))；唯一のＢｃｌＩｃＤ
ＮＡクローニング部位；エンセファロマイカーディティス(Encephalonyocarditi s )ウイルス(ＥＭＣＶ)由来のＩＲＥＳ配列；ｅＧＦＰ(Clontech)コード配列(Cor
mackら、Gene 173:33(1996年))；ＳＶ４０の小型「ｔ」抗原接合部位／ポリアデ
ニル化配列；ＳＶ４０初期プロモーター、及び、複製起点；マウスジヒドロ葉酸
レダクターゼ(ｄｈｆｒ)コード配列；並びに、ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性マ
ーカー／複製起点。得られた蛋白質は、Ｃ末端にＦｌａｇ配列が結合されていた
：[ＦＬＩＮＴ]-ＤＹＫＤＤＤＤＫ。
【０１７０】 ヒトＦＬＩＮＴ配列に基づき、次のプライマーを合成した：５'-ＴＡＧＧＧＣ ＴＧＡＴＣＡ ＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＧＧＧＧ-３'；及び、５'-ＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡ[ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴ
Ｃ]ＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＣ-３'。後者のリバースプライマー
は、Ｆｌａｇエピトープ配列(位置24〜47、括弧内)(Micele,R.M.ら、J.Immunol. Methods 167:279(1994年))を含む。その後、これらのプライマーを、ＦＬＩＮＴ
ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するのに用いた。得られた1.3ＫｂのＰＣＲ産物をその後
、ＢｃｌＩで消化し(プライマー内に制限部位が組み込まれた、上記下線)、プラ
スミドｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴＦを製造するために、ｐＩＧ１の唯一のＢｃｌＩ部
位に連結した。ヒトＦＬＩＮＴ ｃＤＮＡの配向、及び、ヌクレオチド配列を挿
入物の制限消化、及び、二重鎖配列決定により確認した。
【０１７１】 実施例７ 哺乳動物ＦＬＩＮＴ-非Ｆｌａｇ発現ベクターの構築 非Ｆｌａｇ発現ベクター(ｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴ)を作成するために、Ｑｕｉｃ
ｋ Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて、ｐＩＧ１-ＦＬＩＮ
ＴＦ構築物から8アミノ酸ＦＬＡＧエピトープをコードする24塩基対のＤＮＡ配
列を欠失させた。ＦＬＡＧ配列に隣接する19塩基対配列と相同な35塩基対のプラ
イマー、及び、その相補鎖を合成し、プラスミドｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴＦを鋳型
とするＰＣＲ増幅に用いた。親由来ＤＮＡを除くためにＰＣＲ反応混合物をＤｐ ｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＰＣＲ産物をＥｐｉｃｕｒｅａｎ ＸＬ
Ｉ-ｂｌｕｅ大腸菌細胞に形質転換した。16個のアンピシリン耐性形質転換体を
取り、プラスミドＤＮＡを制限消化により分析した。16個のうち10個が、24塩基
配列の欠失に対応する結果を与えた。24塩基配列の正確な欠失は、ｐＩＧ１-Ｆ
ＬＩＮＴのＤＮＡ配列決定により確認した。このプラスミド中のＦＬＩＮＴのヌ
クレオチド配列は図１に示す。
【０１７２】 実施例８ ＡＶ１２ ＲＧＴ１８トランスフェクタントからの 高産生ＦＬＩＮＴクローンの単離 ＦＬＩＮＴ遺伝子を運ぶ組換えプラスミド(ｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴ)は、メトト
レキサートに対する耐性をコードする。さらに、構築物は蛍光ポリペプチドＧＦ
Ｐをコードする遺伝子を、同じ転写物上のＦＬＩＮＴ遺伝子の３'に隣接して含
む。高レベルのＧＦＰの発現は、高レベルのＦＬＩＮＴ-ＧＦＰ ｍＲＮＡの発現
を必要とするので、高い蛍光を有するクローンは、高レベルでＦＬＩＮＴを生産
するより大きな可能性を有するであろう。ＡＶ１２ ＲＧＴ１８細胞をトランス
フェクトするのに、ｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴ、及び、ｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴＦを用い
た。250ｎＭのメトトレキサートに耐性な細胞を選択し、プールした。耐性なク
ローンのプールを蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)に付し、全体の上位5％内の
蛍光値を有する細胞をプールに、細胞1個毎に分類した。高い蛍光のプールを、3
連続分類サイクルに付した。2回目、及び、3回目のサイクルからのプール、及び
、個々のクローンを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりＦＬＩＮＴ産生について分析した
。クマシー染色から、最も高レベルのＦＬＩＮＴを発現すると判断されたプール
、または、クローンを増殖、及び、ＦＬＩＮＴの精製に利用した。このプラスミ
ドを用いて産生されたｍＦＬＩＮＴと呼ばれる成熟ＦＬＩＮＴ蛋白質のアミノ酸
配列を図３に示す。
【０１７３】 実施例９ ｍＦＬＩＮＴポリペプチドの大規模精製 まず安定クローンである安定なｐＩＧ１-ＦＬＩＮＴ-含有ＡＶ１２ ＲＧＴ１
８細胞を数個の10リットルスピナー中で生育することにより、ｍＦＬＩＮＴの大
規模産生を行った。コンフルーエンシーに達した後、最大量のＦＬＩＮＴを培地
中に分泌するように細胞をさらに2〜3日培養した。ｍＦＬＩＮＴを含む培地を0.
1％ＣＨＡＰＳに調整し、Ａｍｉｃｏｎ ＰｒｏＦｌｕｘ Ｍ１２接線濾過系(tang
ential filtration system)中で350ｍｌに濃縮した。濃縮した培地を19,000ｒｐ
ｍ(43,000×ｇ)で15分間遠心し、ＳＰ-５ＰＷ ＴＳＫ-ＧＥＬカラム(21.5ｍｍ×
15ｃｍ；TosoHaas)に流速8ｍｌ／分で通した。吸光度(280ｎｍ)がベースライン
に戻るまで、カラムを緩衝液Ａ(20ｍＭ ＭＯＰＳ,0.1％ＣＨＡＰＳ,ｐＨ6.5)で
洗浄し、結合したポリペプチドを0.1Ｍ〜0.3Ｍ ＮａＣｌ(緩衝液Ａ中)の85分に
わたって展開される直線的な濃度勾配により溶出した。ｍＦＬＩＮＴを含む画分
をプールし、緩衝液Ｂ(50ｍＭ Ｔｒｉｓ,0.1％ＣＨＡＰＳ,0.3Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ
7.0)で平衡化した(7.5ｍｍ×7.5ｃｍ)ヘパリン-５ＰＷ ＴＳＫ-ＧＥＬカラムに
かけた。0.3Ｍ〜1.0Ｍ ＮａＣｌ(緩衝液Ｂ中)の60分にわたって展開される直線
的な濃度勾配により、結合されたポリペプチドを溶出した。ｍＦＬＩＮＴを含む
画分をプールし、0.1％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏで平衡化した1ｃｍ×15ｃｍのＶｙｄａｃ
Ｃ４カラムにかけた。0〜100％ＣＨ3ＣＮ／0.1％ＴＦＡの直線勾配で、結合され
たｍＦＬＩＮＴを溶出した。ｍＦＬＩＮＴを含む画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析
し、95％よりも純粋であることを見つけ、8ｍＭ ＮａＰＯ4、0.5Ｍ ＮａＣｌ、1
0％グリセロール、ｐＨ7.4で透析した。ｍＦＬＩＮＴのＮ末端配列を精製したポ
リペプチドで確認した。質量分光分析、及び、エンドグリコシダーゼ-Ｆ消化に
より、ｍＦＬＩＮＴがグリコシル化されていることが示される。
【０１７４】 実施例１０ Ａ．ＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇ、及び、ＦＬＩＮＴ発現ベクターの構築 研究のための十分な組換え蛋白質を製造するため、バキュロウイルス感染した
細胞中でＦｌａｇを付加した、及び、天然の型のヒトＦＬＩＮＴを発現させた。
ヒトＦＬＩＮＴ ｃＤＮＡは、発現のため次のように処理した。ＦＬＩＮＴのＦ
ＬＡＧが付加された型をコードするｃＤＮＡを含むｐＩＧ３(ｐＩＧ１の誘導体
；Gerlitz,B.及びGrinnell,B.W.、未発表データ)発現ベクターをＸｂａＩで切断
し、平滑末端とするために充填した。その後、ベクターをＳａｌＩで切断した。
得られた、コード領域を含む918塩基対の断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化
し、末端を平滑化した後、ＳａｌＩで消化したバキュロウイルスベクターｐＦａ
ｓｔＢａｃ-１(GIBCO／BRL)中に連結し、プラスミドｐＢａｃＯＰＧ３Ｆｌａｇ
を生成した。この構築物は全長分子(シグナルペプチドを構成する、29個のＮＨ2 -末端アミノ酸を含む)、及び、蛋白質のＣＯＯＨ-末端のＦＬＡＧタグを発現す
るように設計された。発現は、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターの制
御下にあった。
【０１７５】 蛋白質の天然型を発現するベクターの構築のため、ｐＣＤＮＡ３.１(＋／−)(
Invitrogenより入手)中にサブクローニングした蛋白質の全長をコードする920塩
基対のＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII ｃＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ、及び、ＨｉｎｄIII
で切断した。断片をゲル精製し、ＸｂａＩ、及び、ＨｉｎｄIIIで消化されたバ
キュロウイルスベクターｐＦａｓｔＢａｃ-１(GIBCO／BRL)中に連結し、プラス
ミドｐＢａｃＯＰＧ３を生成した。
【０１７６】 Ｂ．バキュロウイルスの産出、及び、蛋白質の産生 ｐＢａｃＯＰＧ３Ｆｌａｇ、及び、ｐＢａｃＯＰＧ３の2つのベクターを別々
に、2つの組換えバキュロウイルス(ｖＢａｃＯＰＧ３Ｆｌａｇ、及び、ｖＢａｃ
ＯＰＧ３)を産出するために、販売者(GIBCO／BRL)が記述するように用いた。各
ウイルスを別々に、蛋白質産生のためＳＦ-９細胞を感染するのに用いた。組換
え蛋白質を、感染されたＳＦ-９細胞から回収された上清中でウエスタンブロッ
ト、及び、クマシー染色分析により測定した。
【０１７７】 実施例１１ Ｆａｓリガンド結合実験 ｍＦＬＩＮＴのＦａｓＬとの相互作用の検出 市販のＴＲＡＩＬ、及び、ＦａｓＬである公知のＴＮＦリガンドのｍＦＬＩＮ
Ｔとの相互作用を調べるために、ドットブロット実験を行った。
【０１７８】 ＴＲＡＩＬ(RnD Systems)、及び、ＦａｓＬ(Kamiya Biomedical Company)をニ
トロセルロース紙にスポットし、精製したｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇと一緒にイン
キュベートした。ｍＦＬＩＮＴを洗い去り、結合したｍＦＬＩＮＴを抗Ｆｌａｇ
抗体を用いて検出した。ＯＰＧ２Ｆｃ、及び、ｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇの両方が
過剰発現し、上記実施例に従って精製した。続いて、濾紙をＰＢＳ中の5％脱脂
乳を用いて室温で、30分間ブロックした。その後、ニトロセルロース紙をＦａｓ
Ｌ-Ｍｙｃを含む細胞溶解物と混合し、さらに、室温で1時間、回転装置上でイン
キュベートした。抗-ｍｙｃ抗体、及び、抗-マウスＩｇＧ-ＨＲＰと一緒に、2回
目、及び、3回目のインキュベーションを各々1時間、及び、30分間行った。ｍｙ
ｃエピトープを含むポリペプチドをＸ線フィルム上の化学蛍光により検出し、ｍ
ＦＬＩＮＴが、ＦａｓＬに特異的に結合したことが示された。ＴＮＦα、ＴＮＦ
β、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、または、ＴＲＡＮＣＥについては、はっきりと感
知できる結合は検出されなかった。
【０１７９】 イン・ヴィトロでのＦａｓ-Ｆａｓリガンド相互作用のために、まず基礎実験を
行った。他に指示がない場合、全ての洗浄工程はＴＢＳＴ(SIGMAからのＴｗｅｅ
ｎ２０を加えたトリス緩衝液塩水)を用いて3〜6回行われた。
【０１８０】 ＥＬＩＳＡプレート上に、ｍｒｅｃＦａｓ(100ｎｇ)を吸着させた。その後、
プレートを0.1％ゼラチンを加えたＴＢＳＴでブロックした。それから、1マイク
ログラム／ｍｌのＭ２ Ａｂｓ(KodakのScientific Imaging System部門より入手
した抗ｆｌａｇ抗体)を含む0.1％溶液を加えたＴＢＳＴに、ｈＦａｓリガンド(
Ｆｌａｇタグ化)を最大濃度300ｎｇ、最小1ｎｇの異なる濃度で添加した。プレ
ートを6回洗浄した後、抗-マウス-Ａｂｓ-ＨＲＰ(3000希釈,Bio-Rad)をウェルに
添加した。3回洗浄した後、基質としてＡＢＴＳを用いた視覚化酵素反応を行っ
た。他に指定されない限り、Molecular Devices Corp.(Menlo Park,California)
により商品化されるＥＬＩＳＡ読み取り機を使用した。
【０１８１】 以下のデータが集められた：
【０１８２】 ＦＬＩＮＴ-ＦａｓＬ結合が確認でき、即時生体分子相互作用分析を用いて結
合の特異性(例えば、動力学、特異性、親和性、協同性、関連結合パターン、濃
度)が決定され得る。この技術は、即時に生体分子の相互作用をいずれかの反応
体を標識化することなく試験する能力を有する。特に、それは光学現象表面プラ
ズモン共鳴を利用し、検出は生特異的界面における巨大分子の質量濃度の変化に
依存する。動力学的情報が容易に得られるように、相互作用を即時で追跡する。
多くの場合、成分を予め精製することなく研究を行うことができる。
【０１８３】 測定は、ＢｉａＣｏｒｅ２０００機器を用いて達成される。チップ、固定化及
び保守キット、並びに、緩衝液を伴う機器は、Biacore AB,Rapsgatan 7,S-754 5
0 Uppsala,Swedenから得られる。ＦａｓＬはKamiya Biomedical Company(910 In
dustry Drive,Seattle,WA 98188)から、グアニジンイソチオシアネート溶液はGi
bcoBRLから得られ、そしてｍＦＬＩＮＴは実施例８及び９のように調製される。
【０１８４】 ｍＦＬＩＮＴを含む溶液をのせた、固定化したＦａｓＬを用いた実験。この実
験では、ＦａｓＬ-ＦＬＩＮＴ相互作用のＫDは1.13×10-7であり、その値は1.62
×10-7であったＦａｓＬを結合したＦａｓよりも低い。これは、ＦａｓＬが三量
体であり、ここではＦａｓＬ単量体が結合されたという事実により説明される。
さらなる実験では、三量体の形成を許す、ＦａｓＬと溶液中で結合したＦＬＩＮ
Ｔを用いた。これらの実験においてのＦＬＩＮＴ-ＦａｓＬについて得られたＫD は、2桁良かった(即ち、ＫDは2桁低かった)。この観察は、ＦＬＩＮＴがＦａｓ
と、ＦａｓＬ結合について効果的に競合するであろうことを示し、これは同様に
、以下に詳述される実験で観察された治療的な利点を説明する。
【０１８５】 ＦＬＩＮＴはＦａｓ-Ｆａｓリガンド相互作用を阻害する 上述のように、ｍｒｅｃＦａｓ(100ｎｇ)をＥＬＩＳＡプレート上に吸着させ
た。再びプレートをＴＢＳＴ、及び、0.1％ゼラチンでブロックした。その後、1
マイクログラム／ｍｌのＭ２Ａｂｓを含む0.1％溶液を加えたＴＢＳＴ中の、異
なるｍＦＬＩＮＴ濃度(最大濃度300ｎｇから1ｎｇまで)の存在下で、ｈＦＡＳリ
ガンド(Ｆｌａｇタグ化、各点で30ｎｇ)を各ウェルに添加した。前述のように、
プレートの洗浄後、抗-マウス-Ａｂｓ-ＨＲＰ(3000希釈,Bio-Rad)をウェルに添
加した。洗浄後、基質としてＡＢＳＴを用いた視覚化酵素反応を行った。データ
を次の表に示す。
【０１８６】 Ｆａｓリガンドは異なる親和性でＦａｓ、及び、ｍＦＬＩＮＴと結合する ＦＬＩＮＴ、及び、Ｆａｓ(各100ｎｇ)をＥＬＩＳＡプレート上に吸着させた
。1マイクログラム／ｍｌのＭ２Ａｂｓを含む0.1％溶液を加えたＴＢＳＴ中に、
最大濃度300ｎｇから1ｎｇまでの濃度で、ｈＦＡＳリガンド(Ｆｌａｇタグ化)を
添加した。プレートの洗浄後、抗-マウス-Ａｂｓ-ＨＲＰ(1：3000希釈,Bio-Rad)
をウェルに添加した。洗浄後、基質としてＡＢＴＳを用いた視覚化酵素反応を行
った。以下の表にそのデータを示す。
【０１８７】 実施例１２ ｍＦＬＩＮＴの抗-ＣＤ３誘導ジャーカットアポトーシスに対する効果の測定 非組織処理した24ウェルプレート(Decton Dickinson,Mansfield,MA)を、ＰＢ
Ｓ中の1ｕｇ／ｍｌの抗-ＣＤ３(Farmingen)0.5ｍｌで、37℃で90分間コートした
。プレートを1度、ＰＢＳで洗浄した。1ｍｌの1×106細胞／ｍｌを各ウェルに以
下の処置と一緒に、または、無しで入れた：10μＭ ＤＥＶＤ-ｃｍｋ、1ｕｇ Ｏ
ＰＧ２-Ｆｃ、1または2ｕｇのｍＦＬＩＮＴ、及び、1ｕｇの抗-ＦａｓＬ Ａｂ。
ｍＦＬＩＮＴは実施例８、及び、９に従って作成した。
【０１８８】 細胞を一晩、37℃で培養し、その後、アネキシンＶ、及び、ＰＩ染色で染色し
た。アポトーシスは、フローサイトメーター(ＦＡＣＳ)により分析した。細胞の
アポトーシスは、アネキシンＶによる陽性染色により示された。
【０１８９】 実施例１３ 組換えＦａｓＬ誘導ジャーカット細胞アポトーシス に対するｍＦＬＩＮＴの効果の測定 1×106細胞／ｍｌを1ミリリットルを、24ウェル組織培養プレートの各ウェル
に添加し、次の試薬で処置した：可溶性ＦａｓＬ(200ｎｇ)、ＦａｓＬ及び1ｕｇ
ｍＦＬＩＮＴ、ＦａｓＬ及び1ｕｇ ＯＰＧ２-Ｆｃ、Ｔｒａｉｌ(200ｎｇ)、Ｔ
ｒａｉｌ及び1ｕｇ ｍＦＬＩＮＴ。細胞を一晩、37℃で培養した後、アネキシン
Ｖ及びＰＩで染色した。細胞のアポトーシスは、フローサイトメーター(ＦＡＣ
Ｓ)により分析した。ｍＦＬＩＮＴは実施例８、及び、９に従って作成した。
【０１９０】 実施例１４ 抗-ＣＤ３誘導ジャーカット細胞アポトーシスに対する ｍＦＬＩＮＴの用量依存的な効果の測定 各ウェルに異なる量のｍＦＬＩＮＴが添加されるという点以外は、実施例１３
に記載のプレートコート、及び、細胞処置と同じ工程を行った。ｍＦＬＩＮＴは
実施例８、及び、９に従って作成した。以下の表は添加された量を示す：
【０１９１】 実施例１５ マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞(ＬＴＴ細胞)を用いたヒトｍＦＬＩＮＴ のマウスＦａｓｌ媒介アポトーシスに対する効果の測定(アネキシンＶ分析) ＦＬＩＮＴは実施例８、及び、９に従って作成した。ＬＴＴ、２、１４、１１
細胞(ＬＴＴ細胞)(Glasebrook、Eur.J.Immunol. 17:1561〜65(1987年)参照)をこ
のアネキシンＶ分析で用いた。1日目に、96ウェルプレートを抗-ＣＤ３(２Ｃ１
１)の連続希釈液でコートした。2日目に、各ウェル当り50μｌ中の100,000個の
ＬＴＴ細胞を、コントロールに対しては50μｌの培地の添加と共に、そして： 第１群．可溶性Ｆａｓ(ｓＦａｓ)(ＦａｓＦｃ、マウス)を最終濃度1μｇ／ ｍｌで、 第２群．ｍＦＬＩＮＴ(ヒト)を最終濃度1ｕｇ／ｍｌで、 第３群．抗-ＦａｓＬ(マウス)を最終濃度1ｕｇ／ｍｌで、 を含む50μｌの培地と添加した。その後、これらを一晩、37℃で、5％のＣＯ2中
で培養した。
【０１９２】 翌日(3日目)、細胞を各ウェルから回収し、洗浄し、フローサイトメトリー分
析に従い、アネキシンＶ及びＰＩで標識化した。
【０１９３】 実施例１６ マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞(ＬＴＴ細胞)を用いたマウスＦａｓｌ媒介 アポトーシスに対するヒトｍＦＬＩＮＴの効果の測定(細胞毒性分析) 1日目と2日目とは、実施例１６と同じ工程を行った。3日目に、20ｕｌのＭＴ
Ｓ溶液(Promega)を細胞に添加し、その後、37℃で2時間培養した。プレート読み
取り機を用い、波長490ｎｍにおける吸光度を集めた。
【０１９４】 実施例１７ ＬＩＧＨＴ結合実験 ＬＩＧＨＴ、及び、ｍＦＬＩＮＴの間のドットブロット結合を確認するため、
２９３細胞をＬＩＧＨＴ発現構築物で、一晩一時的にトランスフェクトした。翌
日、細胞を分離し、氷上でｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇと一緒にインキュベートした
。Ｆｌａｇエピトープを次に、蛍光色素と複合体化した抗-Ｆｌａｇで検出し、
ｍＦＬＩＮＴと特異的結合した群をフローサイトメーターで検出した。コントロ
ールとして、ベクターでトランスフェクトした細胞を用いた。結合が特異的であ
ることを確認するため、10倍量の非標識化ｍＦＬＩＮＴとの競合分析を行った。
【０１９５】 より具体的には、上述のように細胞の6ウェルディッシュをトランスフェクト
した。ベクター、及び、ｍ-ＬＩＧＨＴ発現細胞の両方を与えた。Ｐ１００ピペ
ッターで勢い良くピペッティングすることにより、細胞をプレートから剥がした
。その後、0.1％のＰＢＳ／ＢＳＡ中で、細胞を以下ａ〜ｄに示す組合わせの1つ
に暴露した。 ａ．20ｎＭのＧＳＴ／ｆｌａｇ、ｍＦＬＩＮＴ／ｆｌａｇ、または、ＨＶＥ
Ｍ； ｂ．20ｎＭのＦＬＩＮＴ／ｆｌａｇ＋200ｎＭのＧＳＴ／ｆｌａｇ、ｍＦＬ
ＩＮＴ、または、ＨＶＥＭ； ｃ．20ｎＭのＦＬＩＮＴ／ｆｌａｇ＋ＨＶＥＭ＋200ｎＭの抗-ヒトＦＡＳリ
ガンド； ｄ．1μｇ／ｍｌの抗-ヒトＦＡＳリガンド-ビオチン
【０１９６】 細胞を氷上で30分間インキュベートし、0.1％のＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した。
その後、細胞を1μｇ／ｍｌの抗-ヒトＩｇＧ-ビオチン(ＨＶＥＭの検出のため)
、または、2μｇ／ｍｌのＭ２-ビオチン(ｆｌａｇ複合体の検出のため)のどちら
かに暴露した。細胞を氷上で30分間インキュベートし、0.1％のＰＢＳ／ＢＳＡ
で洗浄した。その後、細胞を1:1000希釈で、ストレプトアビジン Ａｌｅｘａ４
８８(SIGMA)に曝露した。再び、細胞を氷上で30分間インキュベートし、0.1％の
ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した。結合を測定するため、細胞をＦＡＣＳＯＲＴフロー
サイトメーター(Decton Dickinson)を用いて分析した。
【０１９７】 フローサイトメーターを用いた細胞表面結合分析により、ＬＩＧＨＴ発現細胞
がｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇで染色されたものが用いられた場合にのみ、ピークが
移動することが確認された(データ示さず)。ｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇで染色した
場合に、コントロール細胞では移動は見られなかった。細胞を非タグ化ｍＦＬＩ
ＮＴの10倍の過剰量とプレインキュベーションして、ｍＦＬＩＮＴ-Ｆｌａｇの
全結合部位を予め塞いでしまった場合には、移動したピークは完全にベースライ
ンピークに戻った。
【０１９８】 実施例１８ 肝傷害の処置のためのｍＦＬＩＮＴのイン・ビボ試験 マウスを使用し、Tsuji H.ら(Infection and Immunity,65(5):1892〜1898(199
7年))に記載の方法を改変して用いて肝傷害のモデル誘導した。ｍＦＬＩＮＴは
、実施例８及び９に従って作成した。
【０１９９】 具体的には、本発明のポリペプチドの急性炎症、及び、アポトーシスに対する
活性を、以下の方法を用いて決定した。簡単に言うと、各実験グループについて
ＢＡＬＡ／ｃマウス(Harlan)に、100μｌのＰＢＳ(GIBCO-BRL)中の6ｍｇのＤ(＋
)ガラクトサミン(Sigma,39F-0539)、及び、100μｌのＰＢＳ中の3μｇの大腸菌
０２６:Ｂ６のリポ多糖Ｂ(ＬＰＳ)(Difco,3920-25-2)を静脈注射(尾部側静脈)し
た。ガラクトサミンの静脈への投与5分後に、ＬＰＳを静脈注射により投与した
。ＬＰＳで刺激した後、0、2、4、6時間目に各々、動物にｍＦＬＩＮＴ(200μｇ
)、ハムスターＩｇＧ(500μｇ、Cappel,30926)、マウスＴＮＦ、ＴＮ３-１９.１
２に対するｍＡｂ(500μｇ、Sheehan K.C.F.ら(J.Immunol.,142:3884(1989年)))
、及び、抗-マウスＦａｓリガンド(500μｇ、PharMingen,MO24301)を腹膜内注射
した。マウスの生存率をＬＰＳ注射の24時間、及び、48時間後に測定した。
【０２００】 200μｇのｍＦＬＩＮＴポリペプチド(ＦＬＩＮＴ)の腹膜内注射後に、3μｇの
ＬＰＳで刺激したマウスでは、動物生存率で明確な効果があった。ｍＦＬＩＮＴ
が刺激の2時間後に投与された場合、動物のうち100％が生存し；刺激の4時間後
では、動物のうち73％が生存し；刺激の6時間後では、動物のうち60％が生存し
た。対照的に、刺激の4時間後における抗-ＴＮＦαの投与では、10％の動物しか
保護されなかった。
【０２０１】 図５では、ＬＰＳ／ＧａｌＮで刺激前、及び、刺激後に200μｇのｍＦＬＩＮ
Ｔ、または、他の分子を静脈内に投与する効果を比較する。ＬＰＳ／ＧａｌＮの
2時間前に投与された場合、抗-ＴＮＦ、及び、ｍＦＬＩＮＴ処置の両方が、マウ
スの100％の生存につながった。抗-ＦａｓＬで処置されたマウスの80％が生き残
り、そして、ＩｇＧで処置されたマウスの約30％が生き残った。
【０２０２】 対照的に、ＬＰＳ／ＧａｌＮの4時間後に抗-ＴＮＦが投与された場合、48時間
後には、10％より少ない動物が生き残った。驚くべきことに、ＬＰＳ／ＧａｌＮ
処置の4時間後にｍＦＬＩＮＴで処置された場合、80％の動物が生き残った。Ｌ
ＰＳ／ＧａｌＮ処置の4時間後における抗-ＦａｓＬの投与もまた、80％の生存に
つながった。ＩｇＧは実質的に生存に関し何の効果も有さず、約2％の動物が生
き残っただけである。よって、ｍＦＬＩＮＴは疾病の後期における処置で有効で
ある。
【０２０３】 図６では、ＬＰＳ及びＧａｌＮによる刺激の2時間前に、400ｕｇのｍＦＬＩＮ
Ｔをマウスに腹膜内投与した場合、ＬＰＳ／ＧａｌＮ投与の48時間後に、100％
の動物が生きていた。ＬＰＳ／ＧａｌＮ刺激の2時間前に、400ｕｇの抗-ＴＮＦ
を腹膜内に与えた場合、48時間後には約95％の動物が生き残った。対照的に、ｍ
ＦＬＩＮＴで処置されたなかった動物の20％しか、48時間後まで生き残らなかっ
た。ＬＰＳ／ＧａｌＮの2時間前のＩｇＧの投与は、生存率を30％の上昇させた
に過ぎない。
【０２０４】 図６は、ｍＦＬＩＮＴの用量を50ｕｇに減らしても、防護効果があることを示
す。ＬＰＳ／ＧａｌＮ投与の48時間後、未処置の動物の0％の生存に対し、48時
間後まで約70％の動物が生き残った。
【０２０５】 図７は、100ｕｇのｍＦＬＩＮＴの生存に対する効果が、腹膜内、または、静
脈内に与えられようと、ＬＰＳ／ＧａｌＮ投与の12時間前、または、2時間前に
与えられようと同じであることを示す。ＬＰＳ／ＧａｌＮ投与の4時間後にｍＦ
ＬＩＮＴが与えられた場合、静脈内投与では100％の生存となり、腹膜内投与は8
0％の生存となった。この図はまた、ＬＰＳ／ＧａｌＮ投与4時間後の、静脈内に
与えられた用量／反応の関係を示し、50ｕｇで80％が生存し、10ｕｇで40％が生
存し、5ｕｇで20％が生存し、そして、1ｕｇではたったの2％しか生存しなかっ
た。
【０２０６】 実施例１９ この実施例は、発作、脳外傷、及び、他の類似の疾患に臨床的に関連する大脳
虚血の処置における、ｍＦＬＩＮＴの有用性を示す。
【０２０７】 成体雄アレチネズミ(体重70〜80ｇ、Charles River Laboratories,Wilmington
,MA)を、40ｍｇ／ｋｇのフェノバルビタールナトリウム(ネンブタール)の腹膜内
注射により、そして、麻酔の外科用水準を維持するのに必要な場合には、さらに
10ｍｇ／ｋｇの腹膜内注射で麻酔した。体温を37℃に保つため、動物をサーモス
タットで調節された電気毛布に載せた。頚部の腹側表面をさらして毛を剃り、2
％のヨウ素溶液で皮膚を拭いた。
【０２０８】 手術前の準備後、中線切開を行い皮膚を開いた。総頸動脈(ＣＣＡ)をクランプ
するために曝し、分離するために胸骨舌骨筋を裂いた。滅菌した動脈瘤バサミ(0
.15ｍｍの刃、締め力〜10ｇｍ)をＣＣＡの左右両方の滅菌クリップアプライヤー
により5分間固定した。その後、クランプを除き、動脈の開存性を視覚的に確認
した。頸の傷は、外科的縫合により閉じた。
【０２０９】 大脳虚血処置にすぐ続いて、そして、アレチネズミがまだ意識不明の間に、頭
の背側を剃り、2％のヨウ素溶液で皮膚を拭いた。外科的麻酔下、アレチネズミ
の頭を定位機器(ＳＡ)によって安定な位置に固定し、頭蓋を曝すために中線切開
を行った。ＳＡのバーニヤスケールによって示される、ブレグマから横へ1ｍｍ
、後方へ1ｍｍの位置の頭骨を直径0.5ｍｍのドリル刃を備えた歯科用ドリルを薄
くした。薄くした領域を、27ゲージの短い太針を備えたマイクロ注射器で刺し、
リン酸緩衝液塩水(ＰＢＳ)中の5ｕｌ(0.63ｍｇ／ｍｌ)ｍＦＬＩＮＴのボーラス
注射のために3ｍｍの深さに挿入した。ｍＦＬＩＮＴは実施例８、及び９に従っ
て作成した。
【０２１０】 ボーラス注射後、貯蔵器がアレチネズミの肩の皮膚の下に置かれたＡｌｚｅｔ
浸透ポンプ(Alza Corp.,Palo Alto,CA)に連結された脳点滴アセンブリーの点滴
カニューレ(長さ3ｍｍ)に、注射針を交換した。点滴カニューレを、歯科用セメ
ントを用いて頭蓋表面に固定した。傷を外科的縫合により閉じた。ｍＦＬＩＮＴ
溶液(0.63ｍｇ／ｍｌ)、または、ＰＢＳを含むＡｌｚｅｔ浸透ポンプは、1ｕｌ
／時間の速度で3日間、連続的に輸送した。アレチネズミは5日間生存させた(手
術の日を0日目とした)。
【０２１１】 生存5日目に、アレチネズミをＣＯ2チャンバーで殺した。心臓を通した3分間
の塩水、及び、2分間のホルムアルデヒドによる灌流を行うために開胸した。当
分野で一般に適合された標準的な方法に従って、組織学的処理のために脳を取り
出した。ブレグマのおよそ1.7ｍｍ後方から頭頂部分を得た。クレシルバイオレ
ット(cresyl violet)で染色した後、この部分を顕微鏡により倍率40×で、両半
球の背側ＣＡ１領域(長さ0.5ｍｍ)に沿った無傷の海馬神経細胞の数の細胞数を
定量化するために観察した。データはｔ検定、及び、ウィルコキソン順位試験に
よって分析した。
【０２１２】 その結果、ｍＦＬＩＮＴがビヒクルと比べて、神経細胞の生存に明らかな効果
を有し(ｔ検定でｐ＝0.0039；ウィルコキソン順位数でｐ＝0.0037)、普通のコン
トロールと区別ができなかった。
【０２１３】 実施例２０ 処置グループ： 動物数 コントロール １０ ＦＬＩＮＴ(50μｇ／注射)静脈内、 １０ 4〜13日 ＯＰＧ２(50μｇ／注射)静脈内、 １０ 4〜13日 総数： ３０匹のマウス
【０２１４】 実験のため、ドナーの腫瘍の汁から、Ｂ１６メラノーマ細胞の単一の細胞懸濁
液を調製した。0日目に、Taconic Farmsからの雄Ｃ５７Ｂ１マウスの後脚に、腫
瘍細胞(2×106)を皮下移植した。4日目に処置を始めた。ｍＦＬＩＮＴ、または
、ＯＰＧ２を、4〜13日目に日に1回、総数10回の尾部静脈への静脈注射により投
与した。ｍＦＬＩＮＴは実施例８、または、９に従って作成した。実験の概観は
上に示される。
【０２１５】 腫瘍の反応は、4、8、11、17、21、25、30及び34日目に腫瘍の2つの寸法のカ
リパス測定によって決められた腫瘍容量測定によりモニターした。腫瘍容量は、
半楕円として計算した。動物を、上述のスケジュールと同じに体重を計った。
【０２１６】 コントロールの腫瘍は、17.4±0.3日目に500ｍｍ3、21.1±0.3日目に1000ｍｍ 3 の容量に達した。ｍＦＬＩＮＴで処置された動物の腫瘍は、19.3±0.3日目には
500ｍｍ3、23.0±0.4日目には1000ｍｍ3の量に達した。ＯＰＧ２で処置された動
物の腫瘍は、18.5±0.4日目に500ｍｍ3、22.2±0.4日目に1000ｍｍ3の量に達し
た。よって、ｍＦＬＩＮＴにより生じた腫瘍生長の遅延は1.8日であり、ＯＰＧ
２により生じた腫瘍生長の遅延は1.1日であった。これらのデータは、図８に図
示される。図８に示すように、ｍＦＬＩＮＴ処置マウスにおける20日後の腫瘍容
量はおよそ730ｍｍ3であったが、コントロールのマウスにおける腫瘍容量はおよ
そ1000ｍｍ3であった。動物の体重減によって示されるようなｍＦＬＩＮＴ、ま
たは、ＯＰＧ２投与による毒性の示唆は無かった。
【０２１７】 実施例２１ 6週齢の30匹のＮＯＤマウスを、Jackson研究所(Bar Harbor,Maine)より購入す
る。マウスは3匹ずつ檻に入れ、自由に餌(Ｐｕｒｉｎａ５００１)、及び、水を
取れるようにする。1週間の順化後、マウスの尾を切って出血させ、血中グルコ
ース、及び、血清インシュリンを測定する。血中グルコースは麻酔無しの尾の切
断により、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＧ血中グルコース分析機(Medisense Inc.,Bedfor
d,MA)を用いて測定する。血清インシュリンは、ＲＩＡキット(Linco Inc.,St.Lo
uis,MO.)により測定する。その後、マウスを任意に3つのグループ、即ち、コン
トロール、ｍＦＬＩＮＴ注射、及び、ＯＰＧ２注射グループに分ける。マウスの
グループへの割り当てに続き、週に1回、体重、及び血中グルコースを測定する
。明白な糖尿病の徴候(血中グルコース＞200ｍｇ％；〜14週齢)の発症から始め
て、マウスにＰＢＳに希釈したｍＦＬＩＮＴ(50μｇ／日)、または、ＯＰＧ２(5
0μｇ／日)を日に1回、腹膜内へ注射する。コントロールのマウスに、当量のＰ
ＢＳを注射する。注射の2週間後、マウスを吸入麻酔(二酸化炭素)により麻酔し
、グルコース、及び、インシュリンの測定のために血液を、心臓穿刺により取っ
た。さらに、膵臓をAnimal Studies Support Teamが回収し、続いてβ細胞の完
全さ(hematoxolin及びエオシン)についての組織化学分析、及び、インシュリン
についての免疫組織化学染色(George Sanduskys研究所)のため、亜鉛-ホルマリ
ン中で24時間固定する。ｍＦＬＩＮＴは実施例８、及び９に従って作成される。
【０２１８】 実施例２２ この実施例は、虚血再灌流障害を模倣するイン・ヴィトロモデルにおけるアポ
トーシスを、ｍＦＬＩＮＴが阻害することを示す。これらのデータは、ｍＦＬＩ
ＮＴが、このような障害を予防、及び、処置するのに有用であることを示す。
【０２１９】 心室心筋細胞を1〜3日齢の新生児ラットの心臓からトリプシン消化により単離
し、非心筋細胞はプレプレーティングにより除いた。一次培養物を無血清培地中
で、特別に被覆した96ウェルプレートにプレートした。
【０２２０】 低酸素症は、グルコース無し、及び、酸素を無し(5％ＣＯ2、及び、95％Ｎ2)
で、8時間培地をインキュベートすることにより誘導した。再灌流は、グルコー
ス含有培地中で、通常の酸素条件下で16時間インキュベートすることにより模倣
した。このインキュベーションの終わりに、心筋細胞のアポトーシスを細胞質ヌ
クレオソーム関連ＤＮＡ ＥＬＩＳＡ法により測定した。被検試料をｍＦＬＩＮ
Ｔ(2μｇ／ｍｌ、または、5μｇ／ｍｌ)と、そして、コントロール試料を市販の
カスパーゼ阻害剤であるＺ-ＹＶＡＤ-ｆｍｋ(50μＭ)とインキュベートした。2
連実験により、低酸素症／再灌流誘導アポトーシスの実質的に完全な阻害が示さ
れた。ｍＦＬＩＮＴは実施例８、及び、９に従って作成した。
【０２２１】 これらのデータを確認し、観察された阻害がＦａｓにより媒介されたものであ
ったかを確認するために、心筋細胞のアポトーシスを可溶性ＦａｓＬと一緒にイ
ンキュベートすることにより誘導し、上述のようにアポトーシスを測定した。こ
れらの実験で、アポトーシスは抗-Ｆａｓ中和抗体(1μｇ／ｍｌ)、または、ｍＦ
ＬＩＮＴ(10μｇ／ｍｌ)のどちらかにより阻害された。これらの実験により、ｍ
ＦＬＩＮＴがアポトーシスを阻害し、少なくとも部分的には、ＦａｓＬ-Ｆａｓ
アポトーシス経路を阻害することにより、阻害することが示された。
【０２２２】 実施例２３ マウス破骨細胞分化分析 Takahashiら(Endocrinology 123:2600(1988年))の共培養方法を、Galvinら(En docrinology ,137:2457(1996年))に記載されるように改変し、種々の薬剤の破骨
細胞分化への影響を研究するのに用いた。ｍＦＬＩＮＴは、実施例８、及び、９
に従って作成した。
【０２２３】 雄のＢａｌｂ／Ｃマウス(4〜8週齢)をＣＯ2で安楽死させ、大腿骨を取り、大
腿骨から骨髄を生育培地で洗い出した。骨髄細胞を500×ｇでの6分間の遠心によ
り沈澱させ、生育培地(5％の加熱不活性化胎児ウシ血清、及び、1％の抗生物質
抗糸状菌溶液を加えたＲＰＭＩ １６４０)中に再懸濁した。骨髄集団(5×104細
胞／ｃｍ2)を、骨髄細胞の添加2時間前にＢＡＬＣ細胞(新生児マウスの頭蓋冠由
来の安定なセルライン)がプレートされた組織培養皿に植え付けた。細胞を7日間
、加湿した培養器中、37℃で5％のＣＯ2と一緒に、3日目と5日目に培地を交換し
て培養した。培養物を0、3、及び、5日目に、10-8Ｍ １,２５-(ＯＨ)2Ｄ3有りで
、または、無しで処置した。さらに、細胞をｍＦＬＩＮＴ遺伝子(図１)でトラン
スフェクトした細胞の調節培地から精製した分泌ｍＦＬＩＮＴ蛋白質有りで、ま
たは、無しで処置した。7日間の培養に続いて、24ウェルのクラスター皿中の細
胞をホルマリン(3.7％で10分間)で固定した後、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(
ＴＲＡＰ)で、Graves,L及びJilka RL(J.Cell Physiology 145:102(1990年))によ
り記載される方法の改変を用いて染色した。破骨細胞(3またはそれ以上の核を含
むＴＲＡＰ-陽性細胞)の数を定量した。以下の表に結果を報告する。 表 ａ―各値は、6個のウェルの平均誤差、及び、標準誤差を表す *コントロールグループと比べたｐ＜0.05
【０２２４】 実施例２４ ブタ破骨細胞分化分析 新生児ブタ(1〜5日齢)をＣＯ2で安楽死させ、外肢を70％エタノールで洗浄し
て、柔組織を除き、上腕骨、橈骨、尺骨、大腿骨、脛骨、及び、腓骨を摘出した
。長い骨を氷冷のカルシウム、及び、マグネシウムを含まないハンク平衡塩溶液
(ＣＭＦ-ＨＢＳＳ、Gibco BRL)中に入れ、柔組織を全て除いた。骨を縦方向に裂
き、骨内膜表面を骨髄、及び、梁骨の両方を取るために解体した。梁骨小片、及
び、骨髄細胞の懸濁液を激しく振ることにより攪拌し、200ｍｍの篩にかけた後
、100ｍｍの篩にかけた。細胞を4℃、500×ｇで、10分間遠心し、沈澱をＣＭＦ-
ＨＢＳＳ中に再懸濁した後、Ｆｉｃｏｌｌ-Ｐａｑｕｅ勾配(Pharmacia,Piscataw
ay,NJ)で分離した。勾配からの単核細胞画分を2回、ＣＭＦ-ＨＢＳＳ中で洗浄し
、35ｍｍ篩にかけた。細胞をａ-ＭＥＭ(ｐＨ7.2、8.3ｍＭ ＮａＨＣＯ3(Gibco B
RL,Grand Island,NY)を含むように改変)、10％の加熱不活性化ウシ胎児血清(Ｆ
ＢＳ,Hyclone,Logan,UT)、及び、2％の抗生物質／抗真菌性溶液(Gibco BRL,Gran
d Island,NY)からなる生長培地に懸濁し、1×106細胞／ｃｍ2の密度で組織培養
皿に植えた。典型的な骨髄細胞収量は1〜2×109細胞／動物の間であり、動物の
大きさにより異なった。細胞を37℃で、5％のＣＯ2と共に、加湿した培養器中で
培養した。24〜48時間後、非付着細胞を取り、10-8Ｍ １,２５-(ＯＨ)2Ｄ3(Biom
ol,Plymouth Meeting,PA)、及び、ｍＦＬＩＮＴ蛋白質(実施例８、及び、９のよ
うに得た)を含むか、または、含まない生育培地中に、7.5×105細胞／ｃｍ2の密
度で24ウェルのクラスター皿に植えた。48〜72時間毎に培地を１,２５-(ＯＨ)2
Ｄ3、及び、ｍＦＬＩＮＴを含むか、または、含まない生育培地で培地交換して
、最大10日間細胞を培養した。5日間の培養に続いて、細胞をホルマリン(3.7％
で10分間)で固定した後、実施例６のように、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(Ｔ
ＲＡＰ)で染色した。破骨細胞(3またはそれ以上の核を含むＴＲＡＰ陽性細胞)の
数を定量した。以下の表に結果を報告する。 表 ａ―各値は、6個のウェルの平均誤差、及び、標準誤差を表す *コントロールグループに比べたｐ＜0.05
【０２２５】 実施例２５ ｍＦＬＩＮによるイン・ヴィトロ処置 ＦＬＩＮＴを実施例８及び９に従って作成し、以下の実験において用いた。
【０２２６】 Ａ―照射マウスからの骨髄細胞 この実験は、ｍＦＬＩＮＴが、血中サイトカインによりイン・ヴィトロ拡張を
行わせることにより、照射からマウス造血前駆細胞の回復を促進できるか測定す
るために設計された。マウスに3ｍｇの５-フルオロ-ウラシルを腹膜内注射し、4
日後に大腿骨を取り、骨髄(ＢＭ)細胞を単離するために洗い流した。24ウェルト
レイの各ウェルに、1×106ＢＭ細胞を3連で、Iscoves改変ダルベッコ培地(ＩＭ
ＤＭ)＋10％ＦＢＳ中に植え付け、3日間、ｍＦＬＩＮＴ(1ｕｇ／ｍｌ)の存在下
、または、不在下でサイトカイン幹細胞因子(ＳＣＦ)、及び、ＩＬ-６で刺激し
た。3日間のイン・ヴィトロ拡張期間後、5×103細胞を3連でＣＦＵ分析のために
取出して培養した。
【０２２７】 ｍＦＬＩＮＴと共に培養した骨髄細胞は、ｍＦＬＩＮＴで処置されなかった細
胞と比較して明らかに増加した数のＣＦＵを有した。図９は、ＣＦＵコロニー／
3×106刺激ＢＭ細胞を示す。これらの結果は、ｍＦＬＩＮＴが前駆細胞をアポト
ーシスから保護し、そして、コロニーを形成することができる存続可能な細胞の
数を増加させることを示した。図は、以下のコロニー形成単位についての結果を
示す―赤血球細胞(ＣＦＵ-Ｅ)(コントロール―15,000コロニー；ｍＦＬＩＮＴ処
置―33,000コロニー)(ｐ＜0.003)―顆粒球マクロファージ細胞(ＣＦＵ-ＧＭ)(コ
ントロール―8,000；ｍＦＬＩＮＴ処置―15,000)(ｐ＜0.039)；そして始原顆粒
球赤血球単球巨核球細胞(ＣＦＵ-ＧＥＭＭ)(コントロール―750；ｍＦＬＩＮＴ
処置―3,000)(ｐ＜0.007)。ｐ値は、スチューデントのＴ検定により計算される
ように、有意な相違を示す。
【０２２８】 Ｂ―化学療法剤で処置されたマウスからの骨髄細胞 この実験は、ｍＦＬＩＮＴ、または、抗-ＦａｓＬ抗体が、化学療法剤に曝露
されたマウス造血前駆細胞の回復を、イン・ヴィトロでの造血サイトカインによ
る拡張後、促進し得ることを示すために設計された。５-ＦＵ処置したマウスか
らの2×106骨髄細胞を、24ウェルトレイの各ウェルのＩＭＤＭ培地＋10％ＦＢＳ
中に3連で植付け、3日間、ＳＣＦ及びＩＬ-６、並びに、以下の化合物の1つで刺
激した： １)ｍＦＬＩＮＴ(1ｕｇ／ｍｌ) ２)抗-ＦａｓＬ(1ｕｇ／ｍｌ) ３)ＦａｓＬ(0.15ｕｇ／ｍｌ) ４)コントロール―添加なし
【０２２９】 イン・ヴィトロでのサイトカインによる3日間の拡張期間に続いて、生存能力の
ある細胞を数え、ＣＦＵ分析を行うのに用いた。もしｍＦＬＩＮＴ、または、抗
-ＦａｓＬ抗体が前駆細胞をアポトーシスから保護するのであれば、これらのグ
ループでＣＦＵ分析についてより大きなコロニー数が期待される。図１０に結果
が示され、骨髄細胞数(×1000)が示される。値は、コントロール細胞：3,300；
ＦａｓＬ処置細胞：3,000；抗-ＦａｓＬ処置細胞：4,200；ｍＦＬＩＮＴ処置細
胞：4,900。
【０２３０】 Ｃ―ＣＤ３４＋細胞 この実験は、ｍＦＬＩＮＴ、または、抗-ＦａｓＬ抗体が精製ヒトＣＤ３４＋
前駆細胞で、前駆細胞の回復を促進できるかを決めるために設計された。精製さ
れたヒトＣＤ３４＋細胞(1×106／ｍｌ)を、ｍＦＬＩＮＴ、若しくは、抗-Ｆａ
ｓＬ抗体有り、または、無しで100Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ-６、及び、100ｎｇ／ｍ
ｌのヒトＳＣＦで3日間、イン・ヴィトロで前駆細胞を拡張するために刺激した。
拡張、及び、処置に続いて細胞を数え、ＣＦＵ分析を行う。
【０２３１】 実施例２６ トランスジェニックＦＬＩＮＴマウス Ａ―トランスジェニックマウスの調製 この実施例は、ＦＬＩＮＴを発現するトランスジェニックマウスの構築を示す
。これらの動物は明らかなレベルでＦＬＩＮＴを発現し、今までのところ、有害
な作用は示さず、ＦＬＩＮＴが好ましい毒性プロフィールを有することが示され
た。これらの動物はまた、上述の症状のために有用な処置プロトコルをさらに決
めるのに有用である。
【０２３２】 導入遺伝子の構築。 ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)プライマーを合成し、上述のプラスミドｐＩＧ
１-ＦＬＩＮＴＦから、融合されたＦＬＩＮＴ-ＦＬＡＧ ＤＮＡ配列を増幅する
のに用いた。５'プライマー、５'-ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧ
ＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴ-３'、ＢｇｌII制限部位、及び、３'プラ
イマー、５'-ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴ
ＣＧＴＣＣＴＴ-３'は、ＳｐｅＩ制限酵素部位を含んでいた。これらは全ＦＬＩ
ＮＴ、及び、ＦＬＡＧコード領域を増幅するのに用いられた。増幅された1.1ｋ
ｂの断片をプラスミドｐＭＴｍｃｓ２のマルチクローニングサイトに連結し、プ
ラスミドｐＭＴｍｃｓ２-ＦＬＩＮＴ(6.7ｋｂ)を生じさせた(Foxら、Eur.J.Phar macol. 308:195(1996年)参照)。
【０２３３】 ＦＬＩＮＴ遺伝子断片を、ｐＭＴｍｃｓ２-ＦＬＩＮＴからＢｇｌII、及び、
ＳｐｅＩ消化により切り出し、ゲル精製した。その後、この断片をクレノー酵素
により平滑化し、J.David Gladstone大学のJohn Taylorにより提供されたプラス
ミドｐＬＩＶ.７のクレノーで平滑化したＭｌｕＩ部位に連結した(Fanら、Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91:8724(1994年)参照)。得られたプラスミドｐＬＩＶ７-Ｆ
ＬＩＮＴはまた、ａｐｏＥ遺伝子プロモーター／５'フランキング領域、及び、
「肝臓制御領域」(ＨＣＲ)と呼ばれる肝臓の増幅配列を含む。胎児へのマイクロ
インジェクションのため、ＡｐｏＥ遺伝子プロモーター-ＦＬＩＮＴ／ＦＬＡＧ-
ＨＣＲ融合遺伝子を包含する7.0ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＬＩＶ-ＦＬ
ＩＮＴから、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩの消化により切り出し、ゲル電気泳動、及び
、ガラスビーズ抽出により精製した。
【０２３４】 トランスジェニック動物の開発 トランスジェニックマウスを、例えば、Hogan,B.ら(「MANIPULATING THE MOUS
E EMBRYO: A LABORATORY MANUAL」Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring
Harbor,NY)1986年)に記載され、Fox及びSolter(Molec.Cell.Biol. 8:5470(1988
年))により改変された確立された技術を用いて作った。簡単にいうと、ＡｐｏＥ
遺伝子プロモーター-ＦＬＩＮＴ-ＨＣＲ融合遺伝子を包含する7.0ｋｂのＤＮＡ
断片を、ＦＶＢ／Ｎ株の新しく受精させた1細胞段階の胚(接合子)の雄の前核中
にマイクロインジェクションした。胚をイン・ヴィトロで、2細胞段階に生長する
ように一晩培養した。その後、2細胞胚を偽妊娠させたＣＤ-１株マウスの卵管に
移植し、分娩日まで到るようにさせた。新生マウス中の導入遺伝子の存在につい
て試験するために、各動物からつま先の小さい部分を取り、核酸を放出させるた
めにプロテイナーゼＫで消化した。つま先抽出物の試料を続いて、導入遺伝子を
含むマウスを同定するために、ヒトＦＬＩＮＴ特異的プライマーを用いたＰＣＲ
分析に付した。5匹の先駆トランスジェニックマウスが、ＦＬＩＮＴ導入遺伝子
を含むと同定され、６４９４、７２６２，７３５３、７６５３、及び、７６５９
と命名した。これらの先駆体各々を、安定なトランスジェニックの系統を作るた
めに繁殖させた。
【０２３５】 ６４９４系統を導入遺伝子発現、及び、病理について詳細に特徴付けた。広範
な組織発現が６４９４系統で、ノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ(TaqMan)、ウェ
スタンブロット、及び、免疫組織化学分析により検出され、肝臓、及び、腎臓で
最も高かった。高レベルのＦＬＩＮＴ蛋白質が、ＥＬＩＳＡ分析により６４９４
系統のマウスの循環器系で検出された；先駆体レベル＝４９０ｎｇ／ｍｌ；後代
レベルは285〜1360ｎｇ／ｍｌ(ｎ＝6)の範囲にわたった。内因性のＦＬＩＮＴは
これらの分析では検出されなかった。６４９４後代の5〜8週齢のものでは、明ら
かな組織病理学的な発見は無かった。予備的血液化学分析では、トリグリセリド
レベルが、６４９４マウスで上昇してい得ることが示された。動物には、目立っ
た異常は無かった。
【０２３６】 Ｂ―照射からのマウスの防護 この実験は、トランスジェニックＦＬＩＮＴマウスが放射線の不利な効果から
防護されているかどうかを評価するために設計された。18匹のトランスジェニッ
ク、及び、18匹の非トランスジェニックマウスを致死的に、850ｃＧｙで照射す
る。各グループの18匹中の8匹に、骨髄移殖をしない。これらの8匹のマウスのう
ち、5匹を放射物により誘導される死のコントロールとして使用し、3匹を照射3
日後における腸粘膜、及び、骨髄区画の組織分析に用いた。
【０２３７】 残りの10匹のマウスに、3×104骨髄細胞を普通の非トランスジェニックドナー
から移殖する。照射により肝臓は傷害を受けないので、ＦＬＩＮＴトランスジェ
ニックマウスは、依然としてＦＬＩＮＴ蛋白質を全身で産生できるはずである。
この骨髄細胞投与は、典型的には明細書中に記載されるように照射された野生型
動物の30日目における約50％の生存につながる。移殖後7、15、21、及び、30日
目において50〜100μｌの血液を尾からの出血により得、末梢血の回復をモニタ
ーするために血液学分析を行う(ｎ＝各グループ当り10匹のマウス；総数20匹)。
血液学分析には、白血球細胞数(ＷＢＣ)、赤血球数(ＲＢＣ)、ヘマトクリット、
並びに、血中のリンパ球、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、及び、単球数
を測定するための血液塗抹顕微鏡法を含むであろう。マウスの生存、及び、末梢
血細胞の回復を測定する。
【０２３８】 ＦＬＩＮＴが、拡張する前駆細胞のアポトーシスを阻害し、及び／または、放
射物により誘導された障害からの腸内上皮の回復を促進するので、2つのグルー
プの間で、生存、消化管上皮、及び、骨髄の組織、並びに、末梢血の回復につい
て相違があることが期待される。
【０２３９】 Ｃ―化学療法からのマウスの保護 この実験は、ＦＬＩＮＴ、及び、ＧＭ-ＣＳＦ投与を組合わせることによる、
半致死的照射、及び、化学療法により誘導された骨髄抑制による前駆細胞の回復
に対する効果を決定するために設計された。特に、この実験では、化学療法、及
び、半致死的照射の組合わせからの白血球細胞の回復が、トランスジェニックマ
ウスで改善されているかを試験する。このような化学療法のレジメの1例は、カ
ルボプラチンによる処置である。
【０２４０】 15匹のトランスジェニック、及び、15匹のコントロールマウスへのカルボプラ
チン(1.2ｍｇ／マウス)の単一の腹膜内注射に続いて、500ｃＧＹの照射を行う。
このレジメにより、長時間の血小板減少、及び、重篤な貧血を伴う重篤な骨髄抑
制が誘導される(Leonardら、Blood,83:1499(1994年))。照射24時間後から始めて
、12日間にわたって毎日、ＷＢＣ数を回復するために10μｇ／ｋｇ体重の組換え
マウスｒｍＧＭ-ＣＳＦを腹膜内注射する(Mayerら、J.Inf.Disease 163:584(199
1年)；Gamba-Vitaloら、Blood Cells 17:193(1991年))。7日毎に、30日目まで血
液を尾からの出血により集め、完全な血液学的分析を行う。血液分析には、白血
球数(ＷＢＣ)、赤血球数(ＲＢＣ)、ヘマトクリット、並びに、血中のリンパ球、
好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、及び、単球数を測定するための血液塗抹
顕微鏡法が含まれるであろう。12日目、及び、20日目に、各グループから3匹の
マウスを殺す。これらのマウスから、脾臓細胞充実性、及び、骨髄細胞充実性を
分析する。また、骨髄細胞をプールし、前駆細胞含量を試験するためにＣＦＵ分
析を行うのに用いる。
【０２４１】 Ｄ―前駆細胞の末梢移動に対するＦＬＩＮＴの効果 この実験は、前駆細胞の末梢移動を試験する試験のために設計された。前駆細
胞の末梢移動を試験するためＦＬＩＮＴトランスジェニック、及び、コントロー
ルマウスを3ｍｇの５-ＦＵを腹膜内に処置し、そして、4日後に、骨髄細胞から
単離されたＣＦＵ分析を行うか、または、3日間にわたって毎日100ｎｇのＧＭ-
ＣＳＦを腹膜内投与し、続いて骨髄細胞充実性、及び、前駆細胞含量をＣＦＵ分
析により決定する。移殖の方法は、上述の実施例Ｂに記載される。遺伝子治療へ
の適用は、上述ように、レトロウイルスによる形質転換のためのイン・ビボ、ま
たは、イン・ヴィトロでのサイトカインによる刺激に続いて前駆細胞の回復を促
進することであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 ヒトＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に
示す。
【図１ｂ】 図１ａの続き。
【図２ａ】 ヒトＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に
示す。
【図２ｂ】 図２ｂの続き。
【図３】 ヒトｍＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒に
示す。
【図４ａ】 ヒトｍＦＬＩＮＴのアミノ酸、及び、ヌクレオチド配列を一緒
に示す。
【図４ｂ】 図４ａの続き。
【図５】 異なる回数のＬＰＳ投与後の動物敗血症モデルにおける、ｍＦ
ＬＩＮＴの他の薬剤と組合わせた能力を示す。
【図６】 左図は、動物敗血症モデルにおいて、ｍＦＬＩＮＴを抗-ＴＮＦ
と比較する実験を示す。右図は、同じモデルにおいて、より低用量のｍＦＬＩＮ
Ｔを抗-ＴＮＦに対して比較する。
【図７】 動物敗血症モデルにおいて、ｍＦＬＩＮＴ、及び、抗-ＴＮＦの
静脈内、及び、腹腔内運搬を比較する実験を示す。
【図８】 ｍＦＬＩＮＴを用いた処置による、Ｂ１６メラノーマ腫瘍の体積
の減少を示す。
【図９】 照射に続く骨髄幹細胞のｍＦＬＩＮＴによる回復を示す。
【図１０】 ５-フルオロウラシルを用いた処置に続く、骨髄前駆細胞のｍ
ＦＬＩＮＴにより促進された回復を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 9/10 7/02 35/00 9/10 43/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/705 (Ｃ１２Ｐ 21/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/12 (31)優先権主張番号 ６０／０９９，６４３ (32)優先日 平成10年９月９日(1998．9．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１２，５７７ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１２，７０３ (32)優先日 平成10年12月18日(1998．12．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１２，９３３ (32)優先日 平成10年12月18日(1998．12．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１３，４０７ (32)優先日 平成10年12月22日(1998．12．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｄ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンドリュー・ローレンス・グレースブル ック アメリカ合衆国46077インディアナ州ザイ オンズビル、バレー・メドウ・ドライブ 11410番 (72)発明者 ケネス・エリオット・グールド アメリカ合衆国46077インディアナ州ザイ オンズビル、モーニングサイド・ドライブ 620番 (72)発明者 ジョン・エドワード・ヘイル アメリカ合衆国46038インディアナ州フィ ッシャーズ、フォレスト・ドライブ7644番 (72)発明者 ジョゼフ・ジョーグ・ヒューアー アメリカ合衆国46237インディアナ州イン ディアナポリス、ミルブルック・サークル 6838番 (72)発明者 フイ・クワン・ヤク アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ブランズウィック・コート121番 (72)発明者 アレクセイ・カリトネンコフ アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、アベネル・コート9672番 (72)発明者 ジャック・ミズライ スイス、ツェーハー4070バーゼル、エフ・ ホフマン−ラロシェ・リミテッド内 (72)発明者 ナ・ソンチン アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、インディペンデンス・ウェイ10756 番 (72)発明者 ティモシー・ウェイン・ノブリット アメリカ合衆国46203インディアナ州イン ディアナポリス、マンカー2650番 (72)発明者 チャールズ・アーサー・レイディー アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ローリング・スプリングス・ドライ ブ11903番 (72)発明者 ソン・ホヨン アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、タンマー・ドライブ10211番 (72)発明者 ワン・ジャン アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ウエストン・ドライブ10905番 (72)発明者 ウー・シーイン アメリカ合衆国46254インディアナ州イン ディアナポリス、ナンバー531、ウェイク フィールド・ロード6463番 (72)発明者 スティーブン・ハロルド・ザッカーマン アメリカ合衆国46250インディアナ州イン ディアナポリス、ウォワシー・ドライブ 7710番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 FA10 GA11 HA01 4B064 AG02 CA02 CA19 CC24 DA05 4C084 AA02 AA06 AA07 BA23 ZA361 ZA371 ZA542 ZA751 ZA891 ZA892 ZB111 ZB261 ZC351 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA22 EA23 EA28 FA74

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 急性肝不全の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  2. 【請求項２】 肝臓の炎症の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  3. 【請求項３】 異常肝細胞アポトーシスの処置で使用するためのｍＦＬＩＮ
    Ｔ。
  4. 【請求項４】 敗血症の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  5. 【請求項５】 炎症に関連する疾患の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  6. 【請求項６】 肝炎の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  7. 【請求項７】 異常なアポトーシスの処置で使用するためｍＦＬＩＮＴ。
  8. 【請求項８】 虚血と関連した創傷、または、疾患の処置で使用するための
    ｍＦＬＩＮＴ。
  9. 【請求項９】 該創傷、または、疾患が凝固性亢進と関連した、請求項８に
    記載のｍＦＬＩＮＴ。
  10. 【請求項１０】 血栓溶解剤、または、抗血栓剤から選択される群より選ば
    れる薬剤をさらに含む、請求項８に記載のｍＦＬＩＮＴ。
  11. 【請求項１１】 抗血栓剤が活性化プロテインＣである、請求項１０に記載
    のｍＦＬＩＮＴ。
  12. 【請求項１２】 再灌流関連障害、または、疾患の処置で使用するためのｍ
    ＦＬＩＮＴ。
  13. 【請求項１３】 異常心筋虚血症に起因する心筋細胞への損傷の保護に使用
    するためのｍＦＬＩＮＴ。
  14. 【請求項１４】 Ｉ型糖尿病の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  15. 【請求項１５】 癌の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  16. 【請求項１６】 化学療法剤、または、治療的な照射により誘導された周囲
    の無害な組織への損傷の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  17. 【請求項１７】 該組織が骨髄である、請求項１６に記載のｍＦＬＩＮＴ。
  18. 【請求項１８】 該組織が腸内上皮である、請求項１６に記載のｍＦＬＩＮ
    Ｔ。
  19. 【請求項１９】 上皮が口腔内のものである、請求項１８に記載のｍＦＬＩ
    ＮＴ。
  20. 【請求項２０】 治療的な照射、または、化学治療に曝露された造血前駆細
    胞の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  21. 【請求項２１】 造血前駆細胞の生長、または、分化の促進で使用するため
    のｍＦＬＩＮＴ。
  22. 【請求項２２】 ＣＤ３４＋細胞の生長、または、分化の促進で使用するた
    めのｍＦＬＩＮＴ。
  23. 【請求項２３】 治療的な照射、または、化学療法からの細胞損傷の処置で
    使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  24. 【請求項２４】 該細胞が腸の上皮細胞、造血前駆細胞、または、末梢血細
    胞である、請求項２３に記載のｍＦＬＩＮＴ。
  25. 【請求項２５】 無形成性貧血の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  26. 【請求項２６】 骨髄異形成症候群の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  27. 【請求項２７】 汎血球減少症状の処置で使用するためのｍＦＬＩＮＴ。
  28. 【請求項２８】 図１に記載の配列を有する単離された核酸分子。
  29. 【請求項２９】 図３に記載の配列を有する単離された核酸分子。
  30. 【請求項３０】 図１に記載の配列を有する単離されたポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 図３に記載の配列を有する単離されたポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 図１に記載の配列を有する導入遺伝子を含むマウス。
  33. 【請求項３３】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、急性肝不全の処置に
    適合された製剤。
  34. 【請求項３４】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、肝臓の炎症の処置に
    適合された製剤。
  35. 【請求項３５】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、異常な肝細胞アポト
    ーシスの処置に適合された製剤。
  36. 【請求項３６】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、敗血症の処置に適合
    された製剤。
  37. 【請求項３７】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、炎症に関連する疾患
    の処置に適合された製剤。
  38. 【請求項３８】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、肝炎の処置に適合さ
    れた製剤。
  39. 【請求項３９】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、異常なアポトーシス
    の処置に適合された製剤。
  40. 【請求項４０】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、虚欠に関連した創傷
    、または、疾患の処置に適合された製剤。
  41. 【請求項４１】 創傷、または、疾患が、凝固性亢進に関連する、請求項４
    ０に記載の製剤。
  42. 【請求項４２】 血栓溶解剤、または、抗血栓剤から選択される群から選択
    される薬剤をさらに含む、請求項４０に記載の製剤。
  43. 【請求項４３】 該抗血栓剤が活性化プロテインＣである、請求項４２に記
    載の製剤。
  44. 【請求項４４】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、再灌流関連創傷、ま
    たは、疾患の処置に適合された製剤。
  45. 【請求項４５】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、異常な心筋虚血症を
    患った個体における心筋細胞の損傷を保護するのに適合された製剤。
  46. 【請求項４６】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、Ｉ型糖尿病の処置に
    適合された製剤。
  47. 【請求項４７】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、癌の処置に適合され
    た製剤。
  48. 【請求項４８】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、化学療法、または治
    療的な照射によって誘導された、周囲の無害な組織の損傷の処置に適合された製
    剤。
  49. 【請求項４９】 該組織が骨髄である、請求項４８に記載の製剤。
  50. 【請求項５０】 該組織が腸内上皮である、請求項４８に記載の製剤。
  51. 【請求項５１】 該上皮が口腔中のものである、請求項５０に記載の製剤。
  52. 【請求項５２】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、治療的な照射、また
    は、化学療法に暴露された造血前駆細胞の処置に適合された製剤。
  53. 【請求項５３】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、造血前駆細胞の生長
    、または、分化を促進するのに適合された製剤。
  54. 【請求項５４】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、ＣＤ３４＋細胞の生
    長、または、分化を促進するのに適合された製剤。
  55. 【請求項５５】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、治療的な照射、また
    は、化学療法による細胞損傷の処置に適合された製剤。
  56. 【請求項５６】 該細胞が、腸内上皮細胞、造血前駆細胞、または、末梢血
    細胞である、請求項５５に記載の製剤。
  57. 【請求項５７】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、無形成性貧血の処置
    に適合された製剤。
  58. 【請求項５８】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、骨髄異形成症候群の
    処置に適合された製剤。
  59. 【請求項５９】 活性成分としてｍＦＬＩＮＴを含む、汎血球減少症状の処
    置に適合された製剤。
  60. 【請求項６０】 急性肝不全の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮ
    Ｔの使用。
  61. 【請求項６１】 肝臓の炎症の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮ
    Ｔの使用。
  62. 【請求項６２】 異常な肝細胞アポトーシスの処置に有用な薬剤の調製にお
    けるｍＦＬＩＮＴの使用。
  63. 【請求項６３】 敗血症の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの
    使用。
  64. 【請求項６４】 炎症に関連した疾患の処置に有用な薬剤の調製におけるｍ
    ＦＬＩＮＴの使用。
  65. 【請求項６５】 肝炎の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使
    用。
  66. 【請求項６６】 異常なアポトーシスの処置に有用な薬剤の調製におけるｍ
    ＦＬＩＮＴの使用。
  67. 【請求項６７】 虚血に関連した創傷、または、疾患の処置に有用な薬剤の
    調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  68. 【請求項６８】 該創傷、または、疾患が凝固性亢進と関連する、請求項６
    ７に記載の使用。
  69. 【請求項６９】 製剤が、血栓溶解剤、または、抗血栓剤から選択される群
    から選択される剤をさらに含む、請求項６７に記載の使用。
  70. 【請求項７０】 該抗血栓剤が活性化プロテインＣである、請求項６９に記
    載の使用。
  71. 【請求項７１】 再灌流関連創傷、または、疾患の処置に有用な薬剤の調製
    におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  72. 【請求項７２】 異常な心筋虚血症に起因する心筋細胞の損傷を防護するの
    に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  73. 【請求項７３】 Ｉ型糖尿病の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮ
    Ｔの使用。
  74. 【請求項７４】 癌の処置に有用な薬剤の調製における、ｍＦＬＩＮＴの使
    用。
  75. 【請求項７５】 化学療法剤、または、治療的な照射により誘導される周囲
    の無害な組織への損傷の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  76. 【請求項７６】 該組織が骨髄である、請求項７５に記載のｍＦＬＩＮＴ。
  77. 【請求項７７】 該組織が腸内上皮である、請求項７５に記載のｍＦＬＩＮ
    Ｔ。
  78. 【請求項７８】 上皮が口腔内のものである、請求項７７に記載のｍＦＬＩ
    ＮＴ。
  79. 【請求項７９】 治療的な照射、または、化学療法に曝露された造血前駆細
    胞の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  80. 【請求項８０】 造血前駆細胞の生長、または、分化を誘導するのに有用な
    薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  81. 【請求項８１】 ＣＤ３４＋細胞の生長、または、分化を誘導するのに有用
    な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  82. 【請求項８２】 治療的な照射、または、化学療法による細胞損傷の処置に
    有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩＮＴの使用。
  83. 【請求項８３】 該細胞が腸の内皮細胞、造血前駆細胞、または、末梢血細
    胞である、請求項８２に記載の使用。
  84. 【請求項８４】 無形成性貧血の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬＩ
    ＮＴの使用。
  85. 【請求項８５】 骨髄異形成症候群の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦ
    ＬＩＮＴの使用。
  86. 【請求項８６】 汎血球減少症状の処置に有用な薬剤の調製におけるｍＦＬ
    ＩＮＴの使用。
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