JP3750819B2 - C−kit受容体に対するリガンド及びその使用法 - Google Patents
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Description
ここに記載の発明は、アメリカ合衆国国立健康協会およびアメリカ癌協会から、夫々R01-CA 32926およびACS MV246D号の授与番号で付与された援助の下に行われた。従って、アメリカ合衆国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
〔発明の背景〕
この出願の全体を通して、括弧内のアラビア数字によって種々の刊行物が引用される。これら刊行物の完全な目録が、請求の範囲の直前の明細書末尾に列記されている。これら刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、その全体が、参照としてこの出願に組み込まれる。
c-kitプロトオンコジーン(癌原遺伝子)は、未同定リガンドのためのトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体をコードし、またコロニー刺激因子-1(CSF-1)/血小板由来増殖因子(PDGF)/kit受容体サブファミリーの一員である(7,41,57,23)。最近になって、c-kitはマウスのホワイト-スポッティング(W)遺伝子座の対立遺伝子であることが示された(9,17,35)。W遺伝子座での突然変異は、発生の際および成人生命体中において、生殖細胞、色素細胞および造血系の異なった細胞集団の増殖および/または移行および分化に影響を及ぼす(47,51)。造血機能に対する影響は、幹細胞に対すると同様、赤血球細胞系統および肥満細胞系統に対するものであり、重篤なW対立遺伝子の殆どのホモ接合体にとって致命的な大赤血球性貧血(46)と、結合組織および粘膜肥満細胞の完全な欠如(72)とをもたらす。W突然変異は細胞自立的な影響を与え(28,46)、この性質に対応して、c-kitRNA転写物がW突然変異の標的において発現することが示された(35)。高レベルのc-kitRNA転写物は、一次骨髄由来の肥満細胞および肥満細胞系で見られた。幾らか低いレベルの転写物が、メラニン細胞および赤血球細胞系において見られた。
c-kitに対するリガンドを同定することは、該リガンドが、c-kitを発現し且つin vivoでW突然変異により影響される異なった細胞型に対して多面発現的な影響を有し得るので、極めて重要かつ興味深いものである。c-kitリガンドを産生し得る細胞型に関する重要な洞察は、c-kit/Wの機能に関する知識から導かれ得る。W/W Vマウスの結合組織および胃腸管粘膜の両者における肥満細胞の欠如によって、肥満細胞の発生におけるc-kitの機能が示された。骨髄由来の肥満細胞(BMMC)はインターロイキン3(IL-3)依存性であり、胃腸管粘膜に見られる肥満細胞(MMC)に類似している(92,93)。腹腔由来の結合組織肥満細胞(CTMC)は、in vitroにおいて、増殖のためにIL-3およびIL-4の両者を必要とする(79,75)。インターロイキンIL-3およびIL-4は、活性化されたT細胞および活性化された肥満細胞によって産生される、特性のよく知られた造血性増殖因子(hematopoietic growth factors)である(92,94,95,96,97)。また、繊維芽細胞によって産生される、追加の肥満細胞増殖因子の存在が予言されている(47)。IL-3の不存在下において、腹腔由来のBMMCおよびCTMCは、3T3繊維芽細胞との共培養(co-culture)によって維持され得る(98)。しかし、W/W Vマウス並びに多くの他のW対立遺伝子に関してホモ接合であるマウス由来のBMMCは、IL-3の不存在下での繊維芽細胞との共培養系では増殖することができない(99,100,38)。このことは、成熟肥満細胞におけるc-kit受容体の機能を示唆しており、c-kit受容体のリガンドが繊維芽細胞によって産生されることを暗示している。最近、Huffおよび彼の共同研究者等は、NIH 3T3繊維芽細胞から得た濃縮馴らし培地を用いることによって、線虫(Nippostronglyus brasiliensis)に感染したマウスのリンパ節細胞から得た肥満細胞コロニーが刺激されたことを報告した(84)。短期間の肥満細胞増殖試験が開発されたが、これは繊維芽細胞由来の活性(KLと称する)を精製することを意味する。KLは、IL-3の不存在下で正常BMMC′sおよび腹腔肥満細胞の増殖を支持するが、W/W VBMMC′sの増殖を支持しない。加えて、KLは赤血球バースト(BFU−E)の形成に適していることが示された。KLの生物学的性質は、肥満細胞の生物学および赤血球生成の観点に関して、c-kitリガンドに期待される性質に一致している。W突然変異が及ぼす欠陥は細胞自立性である;この性質に一致して、c-kitRNAがW突然変異の細胞標的中で発現することの証拠が存在する(35,39)。幾つかの突然変異対立遺伝子の分子的病変に関する最近の研究成果によって、これらはc-kit受容体の正常な活性または発現を崩壊させる機能喪失性突然変異(loss-of-function mutations)であることが示された(35,100,101)。
マウス染色体10上のスチール遺伝子座(S1)における突然変異は、発現型に関して、W突然変異を有するマウス見られるのと極めて類似した特徴をもたらす。即ち、造血機能、配偶子形成およびメラニン形成に影響を与える(5,47,51)。S1遺伝子座には多くの対立遺伝子が知られている;これらは半優性な突然変異であって、異なった対立遺伝子は、異なった細胞系統に対するその影響および重篤度において異なるっている(47,51)。オリジナルS1対立遺伝子は重篤な突然変異である。SIISIホモ接合は生殖細胞における欠陥であり、コート色素が欠失しており、大赤血球性貧血により周産期に死亡する(5,50)。S1対立遺伝子についてホモ接合であるマウスは、生存可能ではあるが重篤な大赤血球性貧血を有し、コート色素を欠失しており、生殖不能である。SII+およびSld/+ヘテロ接合の両者は、稀釈されたコート色および中程度の大赤血球性貧血を有し、生殖腺の大きさは小さいが妊娠可能である。W突然変異とは対照的に、S1突然変異は細胞自立性ではなく、その突然変異標的の微小環境における欠陥によって惹起されと思われる(28,30,12)。S1突然変異のマウスとW突然変異のマウスとの相似的かつ相補的特性のために、以前は我々も他の研究者も、S1遺伝子産物がc-kit受容体であるとの仮説を立てていた(51,9)。
プロトオンコジーンc-kitは、HZ4-フェリン肉腫ウイルスのオンコジーンであるv-kitの正常細胞性対応物(normal cellular counterpart)である。c-kitはトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体をコードしており、該受容体は血小板由来増殖因子受容体ファミリーの一員であり、且つネズミホワイト-スポッティング遺伝子座の遺伝子産物である(9,17,23,35,41,57)。c-kitのW遺伝子座との同一性が示されたことは、胚形成の際および成体動物において、メラニン形成、配偶子形成および造血機能の種々の観点におけるc-kit受容体系の機能を示唆する(47,51)。これら予期される機能に合致して、c-kit・mRNAはW突然変異の細胞標的内において発現される(3,24,25,35,39)。
肥満細胞におけるc-kit/Wの公知の機能に基づいて、最近、c-kit受容体のリガンドであるKLが同定され、特性が調べられた。造血機能におけるc-kit受容体の予期された機能に合致して、KLは骨髄由来細胞および結合組織肥満細胞の増殖を刺激する。また、赤血球形成において、KLはエリスロポエチンと共働して、赤血球バーストの形成を促進する(7-14日BFU-E)。更に、KLに関するin vitroでの最近の実験によって、これをエリスロポエチン、GM-CSF、GCSFおよびIL-7の夫々と組み合わせて用いると、赤血球前駆体、骨髄細胞前駆体およびリンパ球前駆体の増殖および分化を増大させることが示された。これは、幾つかの造血細胞系統の前駆体において、c-kit受容体系が或る役割を有することを示唆している(27,37)。
マウス染色体10上のスチール遺伝子座における突然変異は、W突然変異をもったマウスに見られる発現型に極めて類似した発現型の特徴をもたらす。即ち、この突然変異は造血機能、配偶子形成およびメラニン形成に対して影響を及ぼす(5,47,51)。最近、幾つかの重篤なS1対立遺伝子にKL配列の欠如が見出された観察に基づいて、c-kit受容体のリガンドであるKLは、ネズミスチール遺伝子座に関する対立遺伝子であることが示された。KLとc-kitとの間にリガンドと受容体との関係が存在することに合致して、S1突然変異はW突然変異と同じ細胞標的に影響を与える。しかし、W突然変異とは対照的に、S1突然変異は細胞自立的ではなく、またc-kit受容体の微小環境に影響を与える(12,28,30)。スチール遺伝子座における突然変異は半優性な突然変異であり、異なった対立遺伝子は、その異なった細胞系統に対する影響および重篤度において変化する(47,51)。オリジナルS1対立遺伝子は、重篤なS1突然変異の一例である。S1/S1ホモ接合は生殖細胞に乏しく、コート色素が欠失しており、大赤血球性貧血によって周産期に死亡する(5,50)。S1d対立遺伝子に関してホモ接合であるマウスは、生存可能ではあるが重篤な大赤血球性貧血を有し、コート色素を欠失しており、かつ妊娠不能である(6)。S1/+およびS1d/+のヘテロ接合は、稀釈されたコート色および温和な大赤血球性貧血を有する一方、生殖腺の大きさは小さいが妊娠可能である。KL・cDNAをプローブに用いたS1d/+DNAのサザンブロット分析によってEcoR1多形が示され、これによって該突然変異はKL遺伝子の欠失、その点突然変異(point mutation)またはそのDNA再配列の結果であることが示唆された(11)。
〔発明の概要〕
本発明によれば、出願人によって精製され又は出願人の組換法によって製造されたc-kitリガンド(KL)と、他の増血性因子および薬剤的に許容可能なキャリアとを含有する薬剤組成物が提供され、並びに本発明の薬剤組成物を患者に投与することを具備した患者の治療方法が提供される。本発明は、c-kitリガンド(KL)および精製されたc-kitリガンド(KL)ポリペプチド、またはその可溶性フラグメントと、他の増血性因子とを用いた複合療法を提供する。本発明はまた、単独または複合療法において、KLをex vivoで使用するための方法および組成物を提供する。突然変異されたKL拮抗剤もまた開示される。このような拮抗剤はまた、小分子であり得る。治療剤としての、KLに対するアンチセンス核酸もまた開示される。最後に、生殖細胞、肥満細胞およびメラニン形成細胞におけるKLの役割の利点を用いた組成物および方法が開示される。
本発明は、c-kitリガンド(KL)および精製されたc-kitリガンド(KL)ポリペプチドに対応したアミノ酸配列をコードする拡散分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
図 1:繊維芽細胞馴らし培地およびIL-3に対する、+/+又はW/WVBMMCの増殖応答:
+/+又はW/WV骨髄由来の肥満細胞が、1%3CM、10%FCM(20×濃度)を含有する培地または培地のみで培養された。培養24-30時間で3H-チミジンの取り込みを測定した。
図 2:KL精製のクロマトグラフィープロファイル:
A.ACA 54ウルトラゲル上でのゲル濾過クロマトグラフィー。280nmの吸光度が破線で示され、バイオ活性が実線で示されている。タンパクサイズマーカの溶出位置がKDで示されている。
B.DEAE-5PWカラム上での陰イオン交換FPLC。点線はNaCl勾配を示している。
C.セミ分取型C18カラム上での分離。1-プロパノール勾配が点線で示されている。
D.C18分析カラム上での分離。
図 3:KLの電気泳動分析。個々の画分からの得た物質をSDS/PAGE(12%)で分離し、銀で染色した。KLの位置(28-30KD)が矢印で示されている。対応する画分のKL活性が下に示されている。
A.酢酸アンモニウム緩衝液及び1-プロパノールでC18分析カラムから溶出された0.5ml画分の分析。
B.2-メルカプトエタノール不存在の水性.1%TFAを用いて、C18分析カラムから溶出された0.5ml画分の分析。
図 4:KLに応答した、W *突然変異肥満細胞の増殖:
肥満細胞は、W/+とW/+との交配こよる個体の胎児肝臓、または野生型、W VおよびW 41ヘテロ接合およびホモ接合の骨髄から誘導された。増殖試験におけるKL濃度を増大させることによって、突然変異肥満細胞の増殖特性が測定された。ホモ接合突然変異肥満細胞は実線で、ヘテロ接合突然変異肥満細胞は破線で、野生型肥満細胞は点線で示されており、Wを除いて正常な胎児は+/+またはW/+の何れかであり得る。
図 5:BMMCおよび腹腔肥満細胞(CTMC/PMC)における、c-kitの発現および増殖因子応答性の比較。
A.硫酸ベルベリンを用いた、精製PMCおよびBMMCにおけるヘパリンプロテオグリカンの蛍光染色。
B.c-kit抗体を用いFACSによる、PMCおよびBMMDにおけるc-kitの細胞表面発現の測定。抗c-kit血清は実線で示され、非免疫コントロール血清は点線で示されている。
C.KLに対するPMCの増殖能力の測定。5000個の細胞が、1000 U/mlのKLを含むか又は含まない0.5mlの10%Wehi-3CM若しくは0.5 mlのRPMI-Cの中に撒かれ、2週間後に生存細胞が測定された。
図 6:KLのバースト促進活性の測定:
骨髄および脾臓細胞がエリスロポエチン(2U/ml)の存在下で撒種され、示された濃度で純粋なKLが添加された。培養第7日に、BFU-Eが測定された。このデータは、夫々がKLの濃度当たり2回反復された二つの別の実験の平均を表わしている。
図 7:W/W胎児肝臓からのKL依存性BFU-E形成の測定:
W/+動物の交配による胎児が、懐胎16.5日に採取された。四体の胎児のうちの一つはW/Wホモ接合であった。肝臓細胞は、対照培地、IL-3(50 U/ml)またはKL(2.5 mg/ml)の何れかの存在下に、105細胞/mlで撒かれた。全ての培養物はエリスロポエチン(2U/ml)を含んでいる。データはBFU-Eの数/肝臓で表わされ、何れも2回反復された撒種の平均である。+/+またはW/+胎児についてのこのデータは、肝臓が正常な3体の胎児からの平均である。
図 8:KLのK-末端アミノ酸配列およびPCRによる対応核酸配列の推定:
上行;KLのN末端アミノ酸配列(残基10-36)。
中間行;101 bpのPCR生成物をM13中にクローニングし、続いて配列決定することによって得られた、三つのcDNAのヌクレオチド配列。
下行;第一鎖cDNA合成およびPCRに用いられる、縮重センスプライマー及びアンチセンスプライマー(degenerate sense and antisense primers)の配列。このアミノ酸配列は配列認識番号2として同定された。
図 9:PCRで生成されたオリゴヌクレヲチドプローブ(単離されたc-kitリガンドポリペプチドに対応する)を用いたノーザンブロット分析:
6.5 kbのmRNAが、ラベルされたプローブで単離された。
図10:KLのN末端アミノ酸10-36に対応したcDNAの、RT-PCRによる誘導:
BALB/c 3%3細胞からの1μgのポリ(A)+RNAが、cDNA合成の鋳型として用いられ、また引き続き行われた二つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて用いたPCR増幅における鋳型として用いられた。101 bpのPCR生成物のアガロース中での電気泳動分析が示されている。
図11:1.4k b KL・cDNAクローンのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列:
長いオープン・リーディング・フレームの予想アミノ酸配列が、1文字表記アミノ酸コードを用いてヌクレオチド配列の上に示されている。右側の数字は、メチオニン(ヌクレオチド16-18)の番号を1としたときのアミノ酸の番号である。可能なN末端シグナル配列(SP)およびトランスメンブランドメイン(TMS)は前記配列の上にダッシュ線で示され、細胞外のシステイン残基は丸で囲んである。予想されるタンパク構造が下方に示されている。N-結合されたグリコシル化部位、およびN末端ペプチド配列(Pep.Seq)の位置が示されている。この核酸配列はまた、配列認識番号1と称される。
図12:ノーザンブロット分析による、BALB/c 3T3細胞RNAにおけるKL特異性RNA転写物の同定:
BALB/c 3T3細胞からのポリ(A)+RNA(4μg)が電気泳動的に分離され、ニトロセルロースに移され、32Pラベルされた1.4 kbのKL・cDNAとハイブリダイズされた。18S及び28SのリボゾームRNAsの移動が示されている。
図13:KLのSDS-PAGE分析:
A.KLの銀染色
B.125I-KLのオートラジオグラフ
図14:肥満細胞およびc-kitを発現するψ2細胞に対する125I-KLの結合:
A.pLJ・c-kit発現ベクターを含み、高c-kitタンパクを高レベルで発現するNIHψ2/c-kit細胞。
B.+/+若しくはW/WV生体マウスの骨髄の肥満細胞、またはW/Wもしくは出産期を合致させたた正常な対照(W/+または+/+)の胎児肝臓細胞。
図15:125I-KLと肥満細胞上のc-kit受容体との架橋および共沈殿。
A.正常ウサギ血清(NRS)または二つの抗c-kitウサギ抗血清(α-c-kit)との、KLの共沈殿。
B.ジスクシイミジル基質を用いた、c-kitに対するKLの架橋。SDS-page分析は、12%または7.5%ポリアクリルアミドゲル上で行われた。架橋された種は、ラベルされた「KL+cK」である。
図16:S1/+およびSIISIマウス由来のTagl-消化されたDNAのRFLP分析。C3HeB/Fej a/a CaJ S1 Hmマウス由来のS1対立遺伝子が、C57B L/6J S1 Hmマウスに導入され、C57BL/6Jバックグラウンドに導入された。また、C57BL/6J S1C3H×S1C3Hクロスの子孫を評価した。
A.1.4 KB KL・cDNAプローブの、二つの非貧血マウス(SII+レーン)及び二つの貧血マウス(SIISIレーン)由来のDNAに対するハイブリダイゼーション。SIISIマウス由来のDNAに対するハイブリダイゼーションは検出されなかった。
B.TIS/Dra/SaI、即ちS1に緊密にリンクしたプローブ(後記の詳細な説明を参照のこと)に対するハイブリダイゼーション。このプローブは、SIc3H1S1c3Hホモ接合体における4kB C3HeB/FeJ誘導対立遺伝子、及び2 kb C57BL/6J対立遺伝子を同定する。
図17:KL-1、KL-2及びKL-S1dcDNAのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列:
Balb3T3細胞プラスミドcDNAライブラリーから得られたKL・cDNAのヌクレオチド配列が示されている。異なった組織からのRT-PCT生成物およびS1d/全RNA、KL-1、KL-2およびKL-S1dがサブクローニングされ、配列分析が行われた。白い三角は、KL-2中にスプライスされるエキソンの5′及び3′境界を示している;黒い三角は、S1dcDNA中の欠失エンドポイントを示している。S1dcDNAの67ヌクレオチド挿入配列が、KL・cDNA配列の上に示されている。矢印は、KL-1の細胞外領域における推定タンパク分解性開裂部位を示している。シグナルペプチド(SP)及びトランスメンブランセグメント(TMS)は、上に引いた線で示されている。
図18:パネルAおよびB:正常組織およびS1d突然変異繊維芽細胞から得たKL・cDNAの、RT-PCRクローニングによる同定:
全RNAを、C57BI6/Jマウスの異なった組織およびS1d/+繊維芽細胞から得た。正常組織およびBalb 3T3細胞から得たRNA(10μg)とのRT-PCR反応は、プライマー#1および#2を用いて行われた。また、+/+及びS1d/+繊維芽細胞から得たRNAとの反応は、プライマーの組み合わせ、即ち#1+#2、#1+#3、および#1+#4を用いて行われた。その反応生成物は、0.25μg/mlの臭化エチジウムの存在下に、1%NuSieveアガロース中での電気泳動によって分析された。φX174 Hae III-DNAマーカーが示されている。
図19:異なったKLタンパク生成物のトポロジー:
影を付した領域はN末端のシグナルペプチドであり、黒く塗り潰したブロックはトランスメンブランドメインであり、YはN結合したグリコシル化部位である。点線は選択的にスプライスされたエキソン境界を示しており、また対応するアミノ酸番号が示されている。KL-S1dのC末端における影線を付した領域は、KLによってコードされないアミノ酸を示す。KL-Sは、KLのタンパク分解による開裂またはC末端削除変異により生成したKLの可溶形を示す。
図20:RNaseタンパク試験による、異なった組織でのKL-1およびKL-2転写物の同定:
32Pによってラベルされたアンチセンス・リボプローブ(625nt.)が、組織および繊維芽細胞から得た20μgの全細胞RNAとハイブリダイズされた(但し、肺および心臓については10μgを用いた)。RNase消化の際、反応混合物は4%ポリアクリルアミド/尿素ゲル中での電気泳動によって分析された。KL-1およびKL-2について、夫々575 nts.及び449 nts.の保護されたフラグメントが得られた。オートラジオグラフの露出は48時間または72時間であった(但し、3T3繊維芽細胞RNAについては6時間)。
図21:パネルA−C。COS細胞中におけるKL-1およびKL-2タンパク生成物の生合成的特徴:
DEAEデキストラン法を用いて、COS-1細胞が5μgのKL-1およびKL-2発現プラスミドで形質転換された。72時間後に、細胞は35S-Metで30分間ラベルされ、次いで完全培地で追跡された。上清および細胞溶解物は抗KLウサギ血清で免疫沈殿された。免疫沈殿物はSDS−PAGE(12%)によって分析された。分子量マーカーの移動はキロダルトン(kD)で示されている。
図22:パネルA−C。KL-1およびKL-2タンパク生成物のPMA誘導開裂:
COS-1細胞が、5μgのKL-1およびKL-2発現プラスミドで形質転換された。72時間後、細胞は35S-Metで30分間ラベルされ、次いでa)血清を含まない培地、b)ホルボールエステル(phorbol ester)PMA(1μM)を含む培地、c)カルシウムイオノホアであるA23187(1μM)を含む培地で追跡された。上清および細胞溶解物は抗KLウサギ血清で免疫沈殿された。免疫沈殿物はSDS−PAGE(12%)によって分析された。分子量マーカーの移動はキロダルトン(kD)で示されている。
図23:パネルAおよびB。COS細胞中におけるKL-S1dおよびKL-Sタンパク生成物の生合成的特徴。
図24:COS細胞上清中における生物学的活性の測定:
KL-1、KL-2、KL-S1dおよびKL-Sの発現プラスミドで形質転換されたCOS細胞からの上清が、肥満細胞増殖試験における活性について試験された。上清の稀釈系列がBMMCsと共にインキュベートされ、培養24-30時間の3H-チミジンの取込みが測定された。
図25:HPP−CFU試験におけるヒト(rh)IL−1β(100 U/mL)、rmKL(10-100ng/mL)、並びにrhM−CSF,rhG−CSFおよびrmIL−3(全て1,000 U/mL)の間の相乗作用:
5−FU後4日のネズミ骨髄が、サイトカイン類を含む2mLの0.5%アガロース下地層の上に2.5×104個の骨髄細胞を含む1mLの0.36%アガロースを重層した、60mmのペトリ皿内で培養された。酸素の減少した条件下で12日間培養した後、直径が0.5mmよりも大きいコロニーから培養物を評価した。
図26:5−FU後24時間のネズミ骨髄の7日間の懸濁培養における、GM−CSF−反応性CFU−GMの増大倍数を示す、二次CFU−GMまたはデルタ試験:
骨髄細胞(2/5×105/mL)が、指定したサイトカインの組合わせ及びGM−CSF−刺激コロニー試験において再クローン化された回収細胞と共に、7日間培養された。増大倍数は、MG−CSFを用いた一次クローン原性試験で測定されたCFU−GMのインプット数に対する、二次クローン原性試験で回収されたCFU−GM数の比率である。rmKLは20 ng/mLで、rhIL−6は50 ng/mLで、rhIL−1βは100 U/mLで、rhGM−CSFまたはrhIL−3は1,000 U/mLで用いられた。
図27:IL-1+IL-3+KLの存在下の懸濁液中において、5−FU後24時間の骨髄を7日間の培養した際の造血機能の増幅:
細胞(顆粒球およびリンパ球を差し引いて104個であり、また一次クローン原性試験ではIL-1+IL-3+KLに対して反応性である2.5%のHPP−CFUを含む)は懸濁液中でインキュベートされた。また、全細胞、並びにIL-1+IL-3+KLに対して反応性のHPP−CFR又はrmGM−CSFに対して反応性のCFU−GMが、二次クローン原性試験において7日後に測定された。その計算は、インプットHPP−CFUに対するアウトプット細胞の比率に基づいている。
図28:正常ネズミ骨髄からのコロニー増殖に対する、IL-6、IL-1およびKLの単独または組合わせによる効果:
対照培養物は、何等の成長因子も存在しない条件下で増殖された。IL-6、IL-1およびKLの7つの組合わせが、単独またはCSF類(G−CSF,M−CSF,GM−CSF)およびIL-3との組合わせて試験された。データは、三回の培養における平均値+ESとして示されている。
図29:5−FUパージされた骨髄由来のHPP−SFCの刺激における、IL-6、IL-1およびCSF類の間の相乗作用。
骨髄は、5−FUを投与した1−7日後に回収され(上から下)、G−CSF,M−CSF,並びにIL-3±IL-6、IL-1またはIL-6+IL-1の存在下で増殖された。データは、(d1・5-FU〜d7・5-FU)骨髄細胞1×105〜1×104個当りの全CFU−C(HPP-CFC+LPP-CFC)として示されている。このデータは、三回の培養における平均値+ESとして示されている。
図30:KLは、他のサイトカイン類との組合わせにより、相乗作用的にHPP−CFCを刺激する。
図28に示したサイトカイン類の40の組合わせが、5−FU注入後に回収されたBMからのCFU−C(HPP-CFC+LPP-CFC)を刺激する能力について試験された。コロニー数は、1×105個のd1 5-FU BM細胞または1×104個のd7 5-FU BM細胞の3回の培養の平均値+SEを表している。
図31:Δ培養における全細胞数の増大には、複数の成長因子による複合刺激が必要とされる。
増殖7日後のΔ培養物中に存在する非粘着性細胞の数が、材料および方法の章で記載したようにして測定された。ダッシュ線は、培養物の接種に用いられた2.5×105個のd1 5-FU BM細胞を表している。回収された細胞の形態学は本文中で議論されている。データは、2〜15回の実験の平均値+SEとして示されている。
図32:IL-6、IL-1及びKLは、単独でも組合わせた場合でも、Δ培養の際のLPP−CFCの増大において、CSF類との相乗作用的である。
G−CSF,M−CSF,GM−CSF,IL-3またはIL-1+IL-3の存在下で増殖したLPP−CFCについては、材料および方法の章に記載したようにして計算した。Δ値は、3回の一次および二次コロニー計数の平均値から計算された。結果は、2回または3回の実験でプールされた6〜11のΔ値の平均値±SEとして提示されている。なお、LPP−CFCΔ値は対数スケールである。
図33:IL-6、IL-1及びKLは、単独でも組合わせた場合でも、Δ培養の際のLPP−CFCの増大において、CSF類と共に作用する。
全てのHPP−CFCは、IL-1+IL-3の存在下で増殖された。Δ値は、3回の一次および二次コロニー計数の平均値から計算された。結果は、2〜11の実験の平均値±SEとして提示されている。なお、HPP−CFCΔ値は対数スケールである。
図34:IL-1+KLに反応する親細胞は、Δ培養において増大しなかった。
Δ試験における一次および二次HPP−CFCの刺激効果について、IL-1+IL-3がIL-1+KLと比較された。Δ値は、3回のCFU−C試験の平均値から計算された。示された結果は、1回の実験からの結果を表している。なお、Δ値は対数スケールである。
図35:CFU−Sの数は、Δ培養において増大する。
5−FU投与後のin vitroΔ試験またはin vivo試験において生じる、HPP−CFC,LPP−CFCおよびCFU−Sの増大に関するΔ値が比較された。5−FU投与の8日後に観察された大腿当たりの親細胞の数を、5−FU治療の1日後に観察された数で除することによって、親細胞のin vitro増大に関するΔ値が測定された。データは、1〜3回の実験の平均+SEを表している。
〔発明の詳細な説明〕
結合実験および交差結合実験に基づいて、今や、c-kit受容体に対するKLの関係が決定され、KLはc-kitのリガンドであることが示された。KLのN末端タンパク配列を用いて、KL特異性のcDNAクローンが誘導された。これらcDNAクローンを用いて、KL遺伝子のS1遺伝子座に対する関係が研究され、KLはS1遺伝子座によってコードされることが示された。
最近、BALB/c 3T3繊維芽細胞の馴らし培地から造血性増殖因子KLが精製されたが、これはc-kitリガンドに予想される生物学的性質を有していた(37)。IL-3の不存在下において、KLは正常マウス由来のBMMCの増殖を刺激する能力を有するが、W突然変異マウス由来のBMMCの増殖は刺激しないので、KLの精製はこれに基づいて行われた。この精製された因子は、IL-3の不存在下でBMMCおよびCTMCの増殖を刺激し、従って成熟肥満細胞において重要な役割を果たすように思える。造血機能におけるc-kitの予期される機能に関しいえば、KLは、エリスロポエチンと共働して赤血球バースト(7-14日 BFU-E)の形成を容易にすることが示された。BALB/c 3T3細胞の馴らし培地から単離されたKLの可溶性形態は、30 kDの分子量および3.8のpIを有している。また、ゲル濾過の際のKLの特徴は生理的条件下で非共有結合的に結合した2量体の形成を示すにもかかわらず、KLはジスルヒド結合した2量体ではない。
cDNAsの核酸配列から推定されるKLの予想アミノ酸配列は、KLが分泌されるタンパクとしてではなく、トランスメンブランタンパクとして合成されることを示している。次いで、膜結合形のKLのタンパク分解的開裂によって、可溶形のKLが生じる。c-kitの最も近い関連体であるCSF-1受容体のリガンドは、KLのトポロジー的特徴を共有しており、タンパク分解的に開裂して可溶性成長因子を生成することが示されている(44,45)。更に、推定されるKLの構造的特徴に関する最近の分析によって、アミノ酸の相同性、二次構造およびエキソン配列に基づいて、KLとCSF-1との関連性が示された。このことは、これら二つの因子の間の進化的関連性を示しており、従ってこの二つの受容体系がお互いから進化したものであるとの見解を強化するものである(4)。
或いは、最近になって、二つの異なった形のKLタンパク、即ちKL-1およびKL-2をコードするスプライスされたKL・mRNAが報告されている(15)。KLにコードされたタンパク生成物は、KL・cDNAをトランスフェクトしたCOS細胞中において同定され、特徴付けられており、フラナガン等(Flanagan et al.)の発見が幾つかの方法で発展されている。上記のように、KLは、タンパク分解的に開裂されて可溶性のKLを生じるトランスメンブランタンパクとして合成される。KL、KL-2の選択的にスプライスされた転写物(予想されるタンパク分解的開裂部位を欠いている)のタンパク生成物は、KL-1のそれとは異なった代謝回転特性を呈することが示された。加えて、KL-1およびKL-2の両者のタンパク分解的開裂は、PMAおよびカルシウムイオノホアA23187のような薬剤によって調節され得る。広範囲の異なったマウス組織において、相対的に異なった量のKL-1およびKL-2が測定されている。このことは、KL-1およびKL-2の発現が組織特異的な仕方で制御されることを示している。
また、S1 d対立遺伝子の遺伝子産物も定義されている(15)。S1 dは、タンパクのトランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含んだKL内の欠失に起因しており、生物学的に活性な分泌された突然変異KLタンパクをもたらす。c-kitの増殖機能および移行機能における可溶形KLおよび細胞結合形KLの夫々の役割は、これら結果の観点において議論される。
本発明は、c-kitに対するリガンドに対応した精製された哺乳動物タンパクであって、二つのポリペプチドのホモ二量体を含み、夫々のポリペプチドが約30 kDの分子量および約3.8の等電点を有する精製された哺乳動物タンパクを提供する。ここで用いるられる「c-kitリガンド」の語は、幹細胞因子、肥満細胞因子およびスチール因子とも定義されている、ポリペプチドまたはタンパクを意味する。ここで用いられるc-kitリガンドタンパク及びc-kitリガンドポリペプチドには、天然に存在する形および組換え形の両方が含まれる。組換え形とは、天然に存在するc-kitとの充分な同一性を有し、同様の生物学的活性を有する、天然には存在しない形のタンパクおよびポリペプチドである。このようなポリペプチドの例には、KL-1.4およびS-KLと称されるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなタンパクおよびポリペプチドには、その誘導体および類縁体が含まれる。本発明の一態様おいて、前記精製された哺乳動物タンパクはネズミタンパクである。本発明の他の態様において、前記精製された哺乳動物タンパクはヒトタンパクである。
また、本発明によれば、c-kitリガンドに対応する精製された哺乳動物タンパクであって、グリコシル化された精製タンパクが提供される。しかし、本発明には非グリコシル化形の前記タンパクも包含される。本発明にはまた、c-kitリガンドに対応した天然に存在する精製された哺乳動物タンパクと同等のグリコシル化を含んだ、精製された哺乳動物タンパクも包含される。このタンパクは、当業者に公知の方法によって、上記二つのホモ二量体ポリペプチドの間にシスチン架橋を導入することにより製造される。
また本発明によれば、c-kitリガンドに対応する上記精製された哺乳動物タンパクの有効量と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物が提供される。
更に、哺乳動物の白血球減少症を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と有効量の造血性因子とを含有し、該造血性因子が哺乳動物の白血球減少症の治療に効果的なG−CSF、GM−CSFおよびIL-3からなる群から選択される薬剤組成物が提供される。
本発明によればまた、哺乳動物の貧血を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物の貧血の治療に効果的な有効量のEPO(エリスロポエチン)またはIL-3とを含有する薬剤組成物が提供される。貧血には、ダイアモンドブラックファン貧血(Diamond Black fan anemia)および再生不良性貧血が含まれるが、これらに限定されるものではない。しかしながら、ブラックファン貧血および再生不良性貧血の治療のためには、有効量の上記組成物および貧血の治療に効果的な有効量のG−CSFおよびGM−CSFを含有する薬剤組成物が好ましい。更に、本発明によれば、哺乳動物に上記組成物を投与することによって、哺乳動物の貧血を治療する方法が提供される。また、哺乳動物における移植の際の骨髄を増強するために有効な薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物における移植の際の骨髄のエングラフメント(engraphment)を高めるのに効果的な有効量のIL-1またはIL-6と含有する薬剤組成物が提供される。本発明によれば、放射線、化学物質または化学療法剤により誘導された骨髄形成不全症または骨髄抑制(myelosuppression)の治療において骨髄修復を高めるための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物における骨髄修復を高めるのに効果的な有効量のIL-1とを含有する薬剤組成物が提供される。また、本発明によって、患者の後天的免疫不全症候群(AIDS)を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、患者のAIDSの治療に効果的な有効量のAZTまたはG−CSFとを含有する薬剤組成物が提供される。
本発明によれば、神経損傷を治療するための組成物であって、哺乳動物における神経損傷を治療するために効果的な、有効量の上記薬剤組成物を含有する組成物が提供される。
また、肺発達不全の症状を呈する乳幼児を治療するための組成物であって、肺発達不全の症状を呈する乳幼児の治療に効果的な有効量の精製された前記哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する組成物が提供される。
更に、対象における脱毛を防止するための組成物であって、対象の脱毛を防止するために効果的な、c-kitリガンドに対応する有効量の精製された哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する組成物が提供される。また、本発明によれば、対象の毛髪における色素喪失を阻害するための薬剤組成物であって、対象の毛髪における色素喪失を阻害するのに効果的な、c-kitリガンドに対応する有効量の精製された哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物が提供される。
また、上記に列挙した疾患を治療する方法であって、これら疾患を治療するのに有効な量で、上記有効な組成物を投与することによる方法が提供される。
ここで用いられる「対象」の語は、例えば哺乳動物、動物、ヒト、マウスまたはラットを意味するが、これらに限定されるものではない。「哺乳動物」とは、例えばマウス(ネズミ)またはヒトを意味するが、これらに限定されるものではない。
本発明は、c-kitリガンド(KL)に対応したアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。このような核酸の例には、KL 1.4、KL-1、KL-2またはS−KLと称される核酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明にはまた、これらアミノ酸配列をコードする核酸分子とは異なるが、発現型における同じ効果を生じる核酸分子をも包含する。これら異なった分子ではあるが、表現型的には等価な核酸分子を「等価な核酸分子」という。そして、本発明はまた、上記の核酸分子と比較した場合に、生成されるポリペプチドの表現型を変化させないような非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子をも包含する。本発明は更に、本発明の核酸分子に対してハイブリダイズする核酸分子をも包含する。ここで用いられる「核酸」の語には、一本鎖および二本鎖のDNAおよびcDNAと同様、RNAも包含される。加えて、ここで用いられる「ポリペプチド」の語には、天然に存在するその対立遺伝子的変種、並びに人間が作った組換え型が包含される。
本発明の目的において、c-kitリガンド(KL)は、ヒトc-kitリガンドまたはネズミc-kitリガンド(KL)である。
また、本発明によれば、c-kitリガンド(KL)に対応したアミノ酸配列をコードする核酸分子を具備するベクターが提供されれる。このベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはコスミドベクターが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
本発明はまた、RNA転写プロモータ並びに他の調節配列に対して機能し得るようにリンクされた、本発明の単離された核酸分子を提供する。ここで用いられる「機能し得るようにリンクされた」とは、該プロモータが、RNAの転写を指示するように核酸分子から離れて位置付けられることを意味する。このようなプロモータの例としては、SP6、T4およびT7がある。プロモータおよびクローニング部位の両者を含み、該クローニング部位に挿入されたDNA片が該プロモータに対して機能し得るようにリンクされるようなベクターが、当該技術分野において知られている。好ましいこれらベクターは、in vitroにおいてRNA転写ができるものである。このようなベクターの例は、pGEM系列[Promega Biotec,Madison,WI]である。
更に、本発明によれば、c-kitリガンド(KL)ポリペプチドの製造のための宿主ベクター系であって、適切な宿主内に上記ベクターの一つを具備する宿主ベクター系が提供される。本発明の目的にとって好ましい宿主には真核細胞(例えば哺乳動物細胞)、又はバキュロウイルス(baculovirus)発現のための昆虫細胞が含まれるが、これにら限定されるものではない。適切な宿主にはまた、E.coliのようなバクテリア細胞または酵母細胞が含まれる。
E.coli内で発現されたとき蛋白を回収するように、E.coli細胞内に請求の範囲に記載の核酸をトランスフェクトして、c-kitリガンド蛋白を発現させる。このE.coliは、異なった二つの培地(LBまたはTB)内での1リットル培養で増殖され、ペレット化される。夫々のバクテリアペレットは、20mlの破壊用緩衝液(下記参照)中で、20,000 lb/in2のフレンチプレッシャ細胞破壊装置に二回通すことによってホモジェナイズされた。高速回転(120k rpm×20分)の後、上清が第二チューブ内に移された。c-kit蛋白またはポリペプチドは特定の画分内に位置する。これは6Mグアニジニウム-HClまたは8M尿素を用いて可溶化され、続いて透析または稀釈され得る。
破壊用緩衝液
50 mMヘペス、pH8.0
20%グリセロール
150 mM NaCl
1 mM MgSo4
2 mM DTT
5 mM EGTA
20μg/ml DNAseI
更に、精製された可溶性c-kitリガンド(KL)ポリペプチド、並びに該精製された可溶性c-kitリガンド(KL)ポリペプチドのフラグメントが本発明によって提供される。
本発明の一態様において、c-kitリガンドポリペプチドはアミノ酸1〜約164に対応する。本発明の他の態様において、c-kitリガンドポリペプチドはアミノ酸1〜約148、或いは次の融合ポリペプチドに対応する。この融合ポリペプチドは、アミノ酸約165からアミノ酸約202若しくは205に融合されたアミノ酸1〜約148に対応するもの、またアミノ酸177からアミノ酸約202若しくは205に融合されたアミノ酸1〜約164に対応するものである。
本発明の他の態様において、c-kitリガンドポリペプチドは、生物学的に活性な結合部位に連結された、アミノ酸1〜約164に対応するポリペプチドを含み得る。このような生物学的に活性な結合部位には、基質細胞、細胞外マトリックス、ヘパリン結合ドメイン、ヘモネクチン(hemonectin)結合部位または細胞付着活性を結合するための付着部位に対応したアミノ酸が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。例えば、1986年3月25日、1986年9月30日および1988年12月20日に夫々発行された、米国特許第4,578,079号、同第4,614,517号および同第4,792,525号を参照されたい。
本発明の一態様において、可溶性c-kitリガンド(KL)は画像化剤に結合される。画像化剤は当業者に公知であり、放射性アイソトープ、色素、或いはパーオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような酵素であり得るが、これらに限定されるものではない。適切な放射性アイソトープには125I、32Pおよび35Sが含まれるが、これらに限定されるものではない。
これらの結合された複合体ポリペプチドは、in vitroまたはin vivoにおいて、c-kit受容体タンパクを発現する細胞の存在を検出するのに有用である。この検出がin vitroで行われるとき、試験すべき細胞または組織のサンプルは、前記複合体ポリペプチドが細胞または組織の表面に存在するc-kit受容体と結合するような適切な条件下で、複合体ポリペプチドと接触され;次いで未結合の複合体ポリペプチドを除去して、結合された複合体ポリペプチドの存在が検出され;これによってc-kitタンパクを発現する細胞または組織が検出される。
或いは、前記複合体ポリペプチドは、例えば静脈内投与によって患者に投与され得る。充分な量の前記複合体ポリペプチドが投与されなければならないが、一般的に、このような量は患者の大きさ、体重および他の特徴に応じて変化する。当業者は、このような量を容易に決定することができる。
投与に続いて、細胞または組織の表面に存在するc-kit受容体に結合した前記複合体ポリペプチドは、細胞内の画像化によって検出される。
本発明の方法において、この細胞内画像化は多くの画像化法の何れかであってよく、放射性アイソトープにより放出される放射線を検出して可視化することが含まれ得る。例えば、アイソトープがヨウ素の放射性アイソトープ(例えば125I)であるならば、ガンマ線カメラを用いて放射性ヨウ素から放出されるガンマ線を検出することにより、放射線の検出および可視化を行うことができる。
加えて、可溶性のc-kitリガンド(KL)ポリペプチドフラグメントは、毒素、化学療法剤または放射性アイソトープのような治療剤と結合され得る。従って、患者に対してその有効量を投与すれば、この複合体分子は、c-kit受容体を発現する細胞に対して前記治療剤を送給する組織特異性のデリバリーシステムとして作用する。
また、c-kitリガンド(KL)ポリペプチドを製造するための方法であって、c-kitリガンド(KL)ポリペプチドを産生させる適切な条件下で、上記の宿主ベクター系を増殖させることと、得られたc-kitリガンド(KL)ポリペプチドを回収することとを具備した方法も提供される。
本発明はまた、この方法によって製造された、c-kitリガンド(KL)ポリペプチドを提供する。
本発明は更に、c−kitリガンド拮抗剤を提供する。これらはc−kit受容体に関するスクリーニングによって見出される小分子の拮抗剤であり得る。或いは、これらはリボース又は他の糖骨格に基づくアンチセンス核酸、DNA、RNAであって、糖間のチオホスフェート結合、メチルホスフェート結合、メチルホスホネート結合を伴ったものであり得る。これらのアンチセンス分子は、in vivoにおけるc−kitリガンドの翻訳を阻害するであろう。
また、可溶性の突然変異型c-kitリガンド(KL)拮抗剤ポリペプチドであって、この突然変異型ポリペプチドはc-kit受容体に結合する能力を保持する一方、該受容体に対する機能的リガンドの結合により媒介される生物学的応答が破壊されるような、突然変異型c-kitリガンド(KL)拮抗剤が提供される。従って、これら突然変異型c-kitリガンド(KL)ポリペプチドは、c-kit受容体への正常な機能性リガンドの結合をブロックすることによって、c-kit受容体のリガンドにより媒介される生物学的機能に対する拮抗剤として作用する。このKL拮抗剤は、ランダムな突然変異生成によって調製され得る。二量体化することができない突然変異型KL分子または修飾KL分子は、効果的な拮抗剤であり得る。KLはM−CSFとかなりの相同性を有しており、二量体化にとって重要と思われる幾つかのαヘリックスを含んでいる(102)。これらヘリックス領域における部位指向性の突然変異によって、この二量体化の能力は阻害され得る。或いは、突然変異型KLは正常な機能性KLとのヘテロ二量体を形成し得るであろうが、このヘテロ二量体はc−kit受容体を活性化することはできないであろう。c−kit受容体自体は、活性なキナーゼになるために二量体化することを必要とされるので、c−kit受容体に結合して該受容体の二量体化を阻害する可溶性の突然変異型KLは、効果的な拮抗剤であろう。
更に、出願人によって精製され、または出願人の組換え法によって製造されたc-kitリガンド(KL)と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有した薬剤組成物が提供される。このc-kitリガンドは、本発明の単離された可溶性c-kitリガンド、そのフラグメント、または上記の可溶性の突然変異型c-kitリガンド(KL)ポリペプチドを含み得る。ここで用いる「薬剤的に許容され得るキャリア」には、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水もしくは水/油エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のような、標準的薬剤担体の何れもが包含される。これら薬剤的キャリアには、吸入されるエアロゾル形態が含まれる。
上記のKL拮抗剤は、喘息、アレルギー、アナフラキシー、アレルギー性喘息、リウマチ性関節炎を含む関節炎、乳頭状結膜炎、白血病、メラノーマ、皮膚性アレルギー反応、硬皮症を含む種々の疾患の治療に用いることができる。
本発明は更に、上記のc-kitリガンドタンパク、可溶性c-kitリガンド(KL)ポリペプチド又はそのフラグメントと特異的に複合体を形成できる物質を提供する。本発明はまた、c-kitリガンド(KL)受容体タンパクと特異的に複合体を形成できる物質を提供する。本発明の一態様において、この物質はモノクローナル抗体、例えばヒトモノクローナル抗体である。
本発明によれば、c-kit細胞活性に関連した生物学的機能を修飾する方法が提供される。この方法は、その機能が修飾されるべき細胞のサンプルを、該細胞の生物学的機能を修飾するのに効果的な、有効量の上記薬剤組成物と接触させることを具備する。この方法によって修飾され得る生物学的活性には、細胞-細胞相互作用、c-kitを発現する細胞の繁殖、およびin vitroでの受精が含まれるが、これに限定されるものではない。この方法は、in vitro又はin vivoにおいて行われ得る。この方法がin vivoで行われるとき、c-kit機能に関連した生物学的機能を修飾するのに効果的な、有効量の上記薬剤組成物が患者に投与される。
本発明の更なる側面は、ex-vivo法と、ex-vivoでの使用に適したキャリア中にKLを含有する組成物である。これらの側面には、次の二つが含まれる。
1.遺伝子の増血性前駆細胞へのトランスフェクションを向上させる方法であって、まず初期増血性細胞をKLおよび増血性因子を含有する組成物と接触させ、次いで工程(a)の培養細胞に遺伝子をトランスフェクトすることによる方法。
2.遺伝子を哺乳動物に導入する方法であって、a)初期増血性前駆細胞をKLを含有する組成物に接触させることと、b)遺伝子を(a)の細胞にトランスフェクトさせることと、c)哺乳動物に(b)のトランスフェクトされた細胞を投与することとを具備する方法。これらの方法において、遺伝子はアンチセンスRNAまたはDNAであり得る。
KLおよび有効量の一つまたは複数の増血性成長因子を含有する組成物は、ex-vivoで末梢血液レベルを増大させるために使用することができる。増血性成長因子IL-1、IL-3、IL-6、G−CSF、GM−CSFまたはこれらの組み合わせは、特に適している(図26参照)。末梢血液の増大のための方法もまた提供される。血小板レベルまたは他の細胞タイプをブーストするためのKLを含有する組成物および方法が提供される。
本発明は更に、細胞をKLと接触させることによって、c−kit細胞活性に関連した生物学的機能を修飾する方法が提供される。この細胞は、c−kitを発現し、または増血性細胞であり、或いはin vitro受精に含まれるものであり得る。
本発明はまた、患者における肥満細胞の増殖を刺激する方法であって、患者に対して、患者の肥満細胞の増殖を刺激するのに有効な量で、上記の薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。この投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、肥満細胞の増殖が刺激されるような投与量で行われる。患者内における該組成物の量が肥満細胞の増殖を刺激するのに効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われればよい。
患者における肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導する方法であって、肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導するのに有効な量で、上記の薬剤組成物を患者に投与することを具備した方法もまた、本発明によって提供される。この投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、肥満細胞または赤血球前駆体の分化が誘導されるような投与量で行われる。患者内の該組成物の量が肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導するのに効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
本発明は更に、c−kitリガンドを単独または組み合わせて使用する時に、前駆体細胞のレベルをブーストまたは刺激する方法を提供する。特に効果的な組み合わせは、G−CSF、GM−CSF、IL-1、IL-3、IL-6、IL-7およびMIP1αとの組み合わせである。KLに対してIL-1、IL-3およびIL-6を加える組合わせが最大限に効果的である。しかし、IL-1、IL-3、IL-6及びGM−CSFは単独でも中程度に効果的である。特に、5−フルオロウラシル(5−FU)で処理された骨の、高増殖能コロニー形成試験(HPP−CFU)の成長に示されている通りである。このような組合せは、in vivo、in vitro及びex-vivoで使用することができる。
本発明はまた、患者における骨髄移植または白血病の治療を容易にする方法であって、患者に対し、骨髄移植を容易にし又は白血病を治療するのに効果的な量で、有効量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、骨髄移植が容易になるような投与量または白血病が治療されるような投与量で行われる。患者内の該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。この方法は特に、急性骨髄性白血病の治療および慢性骨髄性白血病の改善に有用である。このc−kitリガンドは、白血球細胞の増殖速度を増大することによって、化学療法に対して感受性にさせる。
本発明はまた、患者のメラノーマを治療する方法であって、患者に対して、メラノーマを治療するために効果的な、有効量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、メラノーマが治療されるような投与量で行われる。患者内における該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
可溶性のc-kitリガンド(KL)ポリペプチドもまた、そのc-kitに結合する能力を維持しつつ、c-kitの生物学的活性が破壊されるように、突然変異され得る。従って、本発明は患者のアレルギーを治療する方法であって、患者に対し、アレルギーを治療するのに効果的な量で、上記の可溶性突然変異c-kitリガンドの有効量および薬剤的に許容され得る担体を投与することを具備した方法を提供する。このような組成物は、当該突然変異型c−kitリガンド拮抗剤の水溶液を噴霧して吸入させるような、エアロゾール形態として投薬され得る。上記のKL拮抗剤はまた、同じくエアロゾールの形態で、アレルギーに対しても有効であり得る。
c−kitリガンドの局所的薬剤組成物は、関節炎、リューマチ性関節炎、硬皮症、急性皮膚アレルギー反応について使用する効果的な薬物であろう。このc−kitリガンド拮抗剤はまた、アレルギー性結膜炎、ポスト・アレルギー性組織損傷に対して効果的であり、或いはアナフラキシーショックに対する予防剤として効果的であり得る。肥満細胞はヒスタミン反応を媒介するから、c−kitリガンドに対して相補的なc−kit拮抗剤またはアンチセンス分子は、アレルギー及び胃酸分泌を含むヒスタミン媒介反応をブロックするために有効であろう。
メラニン細胞の増殖はKLに著しく依存するから、c−kit拮抗剤はメラノーマの治療剤として効果的であろう。同様の仕方で、KL拮抗剤は白血病の治療に使用され得るであろう。
当業者には周知のように、アレルギーの治療に有効な上記組成物の量は、治療されるべき夫々の患者および治療されるアレルギーに応じて変化する。患者内における該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
更に、本発明はc-kit(KL)ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法であって、正常骨髄肥満細胞の増殖が誘導されるような適切な条件下において、正常骨髄肥満細胞をc-kitリガンド(KL)ポリペプチドのサンプルと共にインキュベートすることと;二重突然変異型骨髄肥満細胞を、適切な条件下でc-kitリガンド(KL)ポリペプチドのサンプルと共にインキュベートすることと;その生成物の夫々を3H-チミジンと共にインキュベートすることと;正常骨髄肥満細胞および二重突然変異型骨髄肥満細胞のDNA中に取り込まれたチミジンの量を測定することと;正常骨髄肥満細胞中へのチミジンの取り込み量を、二重突然変異型骨髄肥満細胞中へのチミジンの取り込み量と比較することにより、c-kitリガンド(KL)ポリペプチドの生物学的活性を測定することとを具備した方法を提供する。
この出願を通して、DNA分子中の特定のヌクレオチドに関する参照は、DNAのコーディング鎖に存在するヌクレオチドに対するものである。この明細書の全体を通して、特定のヌクレオチドを示すために、以下の標準的な略号が用いられる。
C−シトシン A−アデノシン
T−チミジン G−グアノシン
U−ウラシル
実験1:c−kitリガンドの精製
<実験材料>
マウスおよび胎児の同定
WBB6+/+およびW/W v、C57B16W v/+およびWBW/+マウスは、ジャクソン研究所(バーハーバー、ME)から入手した。ヘテロ接合体W 41/+マウスは、ジャクソン研究所のJ.ベーカー博士の好意により提供され、兄弟姉妹交配により出願人のコロニーで維持された。肝臓が、妊娠14〜15日目に、W/+動物を交配することにより誘導された胎児から取り出された。W/W胎児は、同腹子のうちで、他のW/+および+/+胎児に比較して、青白い色と小さい肝臓の大きさによって同定された。それらの同定は、各々の胎児から誘導された肥満細胞におけるc−kitタンパクの分析によって確認された(38)。
肥満細胞の培養、腹腔内肥満細胞の調製およびフローサイトメトリー(流動細胞計測法)
肥満細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)、WEHI−3B細胞の馴らし培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および2−メルカプト−エタノールを補充したRPMI−1640培地(RPMI−完全培地(C))中において、成熟マウスの骨髄および胎齢14〜15日の胎児肝臓細胞から増殖された(60)。非付着性細胞を集め、1週間毎に培地を変え、7×105細胞/mlより少ない細胞密度で維持した。培養液の肥満細胞含量を、1%トルイジンブルー含有メタノールでサイトスピン試料(cytospin preparation)を染色することにより、1週間毎に測定した。4週間後に、培養液は通常95%以上の肥満細胞を含んでおり、これが増殖測定に使われた。腹腔内肥満細胞は、C57B1/6マウスから、7〜10mlのRPMI−Cで腹腔を灌流することによって得られた。肥満細胞は、以前報告されたのと本質的に同様にして(61)、22%メトリザミド(Metrizamide;ニコム(Nycomed)、オスロ、ノルウエー)を含有し、Ca++およびMg++を含まないPBSを用いた密度勾配遠心分離によって精製された。肥満細胞を1%トルイジンブルー含有メタノールで5分間染色し、H2Oで5分間洗浄し、標準手順により硫酸ベルベリンで染色した(62)。肥満細胞は、以前報告されたようにして、c-kitの細胞外決定基を認識するc−kit特異性ウサギ抗血清で標識され、FACSCAN(ベクトン・ディッキンソン社)で分析された(38)。
肥満細胞増殖測定
肥満細胞をRPMIで3回洗浄してIL−3を除去し、これを試験試料の2倍連続希釈系列を含む96穴プレートにおいて、0.2mlのRPMI−C中で5×104c/mlの濃度に培養した。プレートを37℃で24時間インキュベートし、1穴当たり2.5μCの3H−TdRを添加し、更に6時間インキュベーションを継続した。細胞をガラス繊維フィルターで集め、DNAへのチミジンの取り込みを測定した。
繊維芽細胞馴らし培地の調製
Balb/3T3細胞(1)を、10%ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したローラーボトル内のダルベッコ変法MEM(DME)中において、集密状態にまで増殖させた。培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した。CSを含まないDMEを加え、3日後に馴らし培地を回収した。細胞に対して血清を含む培地を1から2日間与え、次いで洗浄して血清を除去し、血清の入っていない培地を与え、そして3日後に第二の馴らし培地を回収した。馴らし培地(CM)は、細胞を除くために15分間2500rpmで遠心され、0.45uフィルターを通して濾過され、4℃で凍結された。次いで、馴らし培地はペリコン限外濾過装置、続いてアミコン撹拌セル(両方ともカットオフ値が10,000kDの膜を有している)を用いることにより、100〜200倍に濃縮された。
カラムクロマトグラフィー
ブルーアガロースカラムクロマトグラフィー(BRL社、ガイテルスブルグ(Gaithersburg)、MD)が、PBSで平衡化したベッド用量100mlのカラムを使って行われた。濃縮FCMの50−80mlを該カラムにかけ、1時間平衡化した後に活性物質を含む流出物を集め、透析チューブ内においてPEG 8000で15〜20mlに濃縮した。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、PBSで平衡化したACA54ウルトラゲル(LKB社、ロックランド、MD)のカラム(2.6×90cm)で行なわれ、分子量マーカーで検量された;使用された分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン(Mr 68,000)、キモトリプシノーゲン(Mr 25,700)、リボヌクレアーゼA(Mr 14、300)で、これらは全てNJ州ピスカタウエー(Piscataway)のファルマシア社から入手したものである。ブルーアガロースカラムからの濃縮液をゲル濾過カラムに載せ、流速を37.5ml/時間に調節し、そして7.5ml画分を集めた。
陰イオン交換および逆層HPLC(RP−HPLC)
高性能液体クロマトグラフィーは、ウォータースHPLCシステム(W600Eパワーラインコントロラー、490Eプログラム可能な多波長検出器、および810ベースラインワークステイション;ウォータース社、ベッドフォード、MA)を用いて行われた。ゲル濾過からの活性画分を0.05Mトリス−塩酸(pH7.8)で透析し、0.05Mトリス−塩酸(pH7.8)で平衡化されたプロテイン−パックDEAE−5PW・HPLCカラム(7.5 mm×7.5 cm、ウォータース社)にかけた。結合したタンパクは、0〜0.05Mトリス−塩酸(pH7.8)の直線的な濃度勾配で溶出された。結合したタンパクは、.02Mトリス−塩酸(pH7.8)中における0〜0.4M塩化ナトリウムの直線的な濃度勾配で溶出された。流速は1ml/分とし、2mlの画分を回収した。
RP−HPLCは、ヴィダック(Vydac)社の半分取用および分析用のサイズC18カラムを用いて行った。両カラムに対して、バッファーAは100 mM酢酸アンモニウム(pH6.0)であり、バッファーBは1−プロパノールであった。陰イオン交換からの生物活性のある画分を集め、半調整C18カラムにかけた。結合したタンパクは、最初10分間は0%〜23%の1−プロパノール、次の70分間は23〜33%の1−プロパノールを用いた急激な濃度勾配で溶出された。流速は2ml/分に調節され、2ml画分が回収された。生物活性のある画分をプールし、バッファーAで1:1に希釈し、そして分析用C18逆層カラムにかけた。タンパクは、10分間は0%〜26%の1−プロパノールを用いた急激な濃度勾配で溶出され、次いで26%〜33%の1−プロパノールを用いた穏やかな濃度勾配で70分間溶出された。流速は1ml/分とし、1ml画分が回収された。分析用のC4逆層カラムによる分離は、水溶性0.1%TFA中の0〜80%のアセトニトリルを用いた直線的な濃度勾配で行われた。
等電点電気泳動(IEF)
部分的に精製した1mlのKLに、20%(V/V)グリセロールおよびpH3.5〜10の2%(V/V)アンフォライン(LKB社、ガイテルベルグ(Gaithersberg、)MD)を添加した。2%アンフォライン(ampholine;pH3.5〜10)を含有する5〜60%のグリセロール密度勾配を、IEFカラム(LKB8100)に負荷した。試料を勾配の等密度領域にかけ、続いてIEF(2000V、24h、4℃)を行った。5ml画分を集め、そして各々の画分でpHを測定した。これら画分をRPMI−Cで透析し、生物活性を試験した。
赤血球前駆細胞の測定
成熟骨髄細胞、脾臓細胞および胎齢14日の胎児肝臓細胞を、1.2の%メチルセルロース、30%のFCS、100uMの2−メルカプトエタノール、ヒト組換えエリトロポエチン(2単位/ml、アムジェン社、サウサンドオークス、CA)を含有するイスコヴ変法ダルベッコ培地(イスコヴ、1978;ノッカおよびペルス、1987)に、各々105、106及び107細胞/mlで播いた。培養は37℃で7日間インキュベートされ、ヘモグロビンを含有するコロニー及びバーストが倒立顕微鏡下で記録された。最適な増殖を行なうために、0.1mMヘミン(コダック)を骨髄細胞の培養液中に添加した。精製したKL、IL−3またはWEHI−3CMの何れか(10%、vol/vol)、或いは組換えマウスIL−3(50u/ml、ゲンザイム(Genzyme)、ケンブリッジ)を指示された箇所に添加した。
<実験方法>
短期間の肥満細胞の増殖測定は繊維芽細胞由来の活性を検出する
正常の肥満細胞の増殖を促進するが、W/W V肥満細胞の増殖は促進しない繊維芽細胞由来成長因子活性の同定および測定を行うために、BMMCをIL−3を含まない培地で洗浄し、20倍濃縮した繊維芽細胞ならし培地(FCM)あるいはWEHI−3・CM(IL−3)を含む培地で培養した。24時間培養した後、3H−チミジンの取り込みを決定した。正常+/+マウスおよび突然変異W/W Vマウスに由来するBMMCは、IL−3に対する反応が類似していた(図1);対照的に、20倍濃縮した繊維芽細胞馴らし培地は+/+肥満細胞の増殖を促進したが、W/W V肥満細胞ではほとんど増殖は促進されなかった。濃縮したFCMはまた、他のIL−3依存細胞の増殖を刺激する能力についても試験された。骨髄性の32D細胞は、c−kit遺伝子産物を欠落していることが知られている(35)。32D細胞について、WEHI−3・CMでは正常な増殖が観察されたが、FCMでの増殖は観察されなかった(結果は示していない)。これらの結果と、WおよびW v対立遺伝子の両方でc−kitの欠乏が知られているということを併せて考慮すると、FCM活性は肥満細胞(BMMC)中の機能的なc−kitタンパクの発現に依存しており、従ってc−kit受容体のリガンドかもしれないということが示唆された。さらに、FCM活性はIL−3とは性質が異なる。従って、正常肥満細胞およびW突然変異肥満細胞は、繊維芽細胞馴らし培地からの得た推定c−kitリガンド(KL)の精製のための、単純で特異的な測定系を提供する。
肥満細胞刺激活性KLの精製
KLを精製するために、Balb/3T3繊維芽細胞の無血清馴らし培地51を、限外濾過で50倍に濃縮した。濃縮液をPBSで平衡化したブルーアガロースカラムに通し、肥満細胞刺激活性を含む素通り画分を集め、ポリエチレングリコールで濃縮した。正常肥満細胞を使った生物活性の測定に加えて、精製されたピーク画分は、ほとんど活性が観察されないW/W v肥満細胞でも試験された。ブルーアガロースカラムからの物質は、ACA・54カラムを用いたゲル濾過によって分画された(図2A)。生物学的活性は、夫々55〜70kDおよび30kDに対する大ピークおよび小ピークとして溶出した。主要なピークの画分を回収し、透析し、NaCl濃度勾配を有するDEAE−5PWカラム上でのFPLCクロマトグラフィーで分画した(図2B)。活性は、0.11MのCaClでFPLCカラムから溶出した。ピーク画分を集め、半分取用C18カラムを用いて、酢酸アンモニウム/n−プロパノール濃度勾配でHPLCクロマトグラフィーを行った(図2C)。半調製用C18カラムから30%n−プロパノールで溶出された活性物質をバッファーAで1:1に希釈し、分析用C18カラムを使って再びクロマトグラフィーを行った(図2D)。活性な単一ピークが30%n−プロパノールで再び溶出され、これは溶出プロファイルにおける吸光度(280nm)の主要ピークに対応した。同様の結果が、溶媒としてH2Oおよび.1%TFAを含むアセトニトリルを用いたC4カラムによっても得られた(図3B)。両方の溶媒系による分離からの得られた活性分画のSDS−PAGEおよび銀染色によって、28〜30kDの分子量に対応した移動度をもつ1本の主要なバンドが示された。このバンドの存在と量は、生物学的な活性のピークと良く相関していた(図3)。還元条件下および非還元下において、このバンドの移動度に有意な違いはなかった。これは、KLがジスルフィドで結合された二量体ではないことを示している(図3C)。3本の分離した物質が、還元条件下および非還元条件下のSDS−PAGEで観察された。これは、精製された物質の大きさが不均一であることを示している。280 nmでの吸光度によって見積もられたタンパクの総量は、参照標準のBSAと比較した銀染色で検出された量と相関していた。表1に示すように、Balb/3T3細胞の馴らし培地から得たKLの精製は3000倍以上であり、最初の全活性の47%の回収率であった。出願人の試験容量0.2mlにおける+/+肥満細胞の最高増殖量の1/2を、50単位の活性と定義する。これは約0.5ngのタンパクに対応する。部分的に精製した物質(イオン交換の後)の等電点電気泳動は、3.7−3.9のpH領域に活性の主要なピークを示した。これは、KLの等電点が3.7〜3.9であることを示している。
異なるc−kit/W突然変異をもった肥満細胞のKLに対する増殖反応
精製されたKLが、野生型動物、並びにW、W vおよびW 41対立遺伝子のホモ接合体およびヘテロ接合体に由来する肥満細胞の増殖を刺激するその能力について試験された。本来のW対立遺伝子は非機能的なc−kit受容体で特徴付けられ、W対立遺伝子がホモ接合体の動物は周産期に死亡して重篤な貧血を示し、またW/W胎児から得られた肥満細胞はBalb/3T3繊維芽細胞と共培養したときに増殖しない(63、38)。W vとW 41の対立遺伝子はともに、部分的に欠損したc−kit受容体で特徴付けられ、ホモ接合体突然変異動物は生存できる(64、65、38)。ホモ接合体W v動物は重篤な大赤血球貧血を有しており、それらの肥満細胞は共培養測定において僅かな反応を示す。また、より重篤でないW 41対立遺伝子のホモ接合体は中程度の貧血を有し、それらの肥満細胞は共培養測定において中程度の反応を示す。ホモ接合変異体およびヘテロ接合変異体、並びに+/+肥満細胞は、先に記述したように、W vおよびとW 41対立遺伝子については骨髄から、またW対立遺伝子については胎齢14日の胎児肝臓から誘導された。胎児肝臓由来のW/W肥満細胞はKLに反応して増殖することはなかったが、ヘテロ接合体(W/+)および正常(+/+)な肥満細胞は、両者共にKLに対する同様の増殖反応を示した(図4)。W v/W vマウスから得た骨髄由来肥満細胞は、KLに対する反応が著しく欠損していたが、1000U/mlにおいて或る程度の増殖、すなわち+/+値の10%の増殖が観察された(図4)。ヘテロ接合体W/+肥満細胞とは対照的に、W v/+肥満細胞は、この変異の優性遺伝の特徴と一致して中程度の反応(40%)を示した。W 41/W 41およびW 41/+肥満細胞もまた、WおよびW v対立遺伝子を有する肥満(細胞)よりは少ない程度であるけれども、KLで増殖する能力を欠損しており、この事実は当該突然変異のin vivo表現型と一致している(図4)。これらの結果は、W、W vおよびW 41の対立遺伝子を持つ肥満(細胞)のKLに対する反応性と、これらの突然変異の重篤度およびin vivoでの特徴との間の相関性を示している。対照的に、WEHI−3CM(IL−3)に対する突然変異肥満細胞の増殖反応は、異なるW突然変異によって影響されなかった。
KLは腹腔内肥満細胞の増殖を刺激する
腹膜腔内肥満細胞(PMC)は既によく特徴付けられており、BMMCとは対照的に、結合組織型肥満細胞の代表である(66)。PMCはIL−3単独に対する反応においては増殖しないが、それらの成熟した表現型と生存率はNIH−3T3繊維芽細胞と共培養することにより維持することが出来る(67)。従って、KLがPMCの増殖を刺激するかどうかを決定することは興味深い。最初に、c−kitがPMCで発現されるかどうか決定するための実験を行った。腹腔肥満細胞をメトリザミド(metrizamide)密度勾配遠心法により精製し、細胞表面でのc−kit発現を抗c−kit血清あるいは正常ウサギ血清を用いた免疫螢光法により分析した。PMCプレパレーションは、トルイジンブルーと硫酸ベルベリンによる染色に基づけば、90−98%の純度であった。硫酸ベルベリンは結合組織の肥満細胞の顆粒中のヘパリン・プロテオグリカンを染色し、更にこの色素はDANを染色することも知られている(図5)(62)。BMMCと粘膜肥満細胞は、ヘパリンプロテオグリカンよりもコンドロイチン硫酸di−B/Eプロテオグリカンを優位に含んでおり(67)、従って硫酸ベルベリンはBMMCの顆粒を染色しない(図5A)。フローサイトメトリーによるc−kit発現の分析によって、実質的にすべてのPMCが、BMMCで観察されたc−kit発現と同程度でc−kitを発現することが示された(図5B)。次に、KLがPMCの生育に影響を与えるか否か、あるいは増殖を刺激するか否かを決定するための実験を行った(図5C)。PMCを培地単独の中で培養し、あるいはBMMCに対する最適濃度のWEHI−3CMを添加した培地中で培養すると、WEHI−3CM中では僅かな細胞が長期間生存したけれども、3−4日間以内でPMCの生存率を失う結果となった。KLの存在下でPMCを培養する生存が持続され、2週間後の細胞数は5000から60,000へ増加した。BMMCの数の同様な増加は、KLに対する反応性においても観察された。PMCのWEHI−3CMに対する増殖反応の欠如とは対称的に、BMMCは、予期されたようにWEHI−3CMで増殖された。培養して1週間後および2週間後に、細胞をトルイジンブルーと硫酸ベルベリンで染色した。硫酸ベルベリン染色は単離された直後のPMCと比較したとき幾らか減少していたけれども、両色素により100%の細胞が染色され、PMCの成熟した表現型は培養中にも維持されていた。
KLは赤血球バーストの形成(BFU−E)を刺激する
W突然変異の重要な側面は、赤血球細胞系統への影響である。in vivoでのこの欠損の結果は、最も重篤な対立遺伝子のホモ接合体にとっては致死的な、大赤血球貧血である(47,65)。W/W Vマウスの骨髄における赤血球前駆細胞集団の分析は、BFU−EおよびCFU−Eの僅かな減少を示す(68、69)。W/W胎児の肝臓では、BFU−Eの数は影響を受けないが、CFU−Eの数の大きな減少が観察される。これは、赤血球成熟の個別の段階でのc−kitの役割が、CFU−Eの段階よりもかなり前であることを示唆している(35)。造血機能におけるKLの役割を評価するために、またc−kit受容体への関係をより明らかにするために、BFU−E形成に対するKLの影響を測定した。骨髄、脾臓および胎児肝臓の細胞を、標準培地の条件下で、KL、エリトロポエチンおよびWEHI−3CMの存在および非存在下において撒いた。次いで、培養7日目にBFU−Eの数を数えた。エリトロポエチンの非存在下では、WEHI−3CMあるいはKLでの赤血球の増殖は観察されなかった。エリトロポエチンの存在下において、脾臓細胞からのBFU−Eは、KLにより濃度依存的に刺激された。即ち、エリトロポエチン単独での12BFU−E/106細胞から、2.5ngのKL/mlによる最高刺激での50BFU−E/106細胞へと刺激された(図6)。BFU−Eの数に対する効果に加えて、バーストの平均の大きさがKLによって劇的に増大した。KL+エリトロポエチンを加えた脾臓細胞を使って得られたBFU−Eの数は、WEHI−3CM+エリトロポエチンを加えて観察された数と同様であった。これとは対照的に、KL+エリトロポエチンは骨髄細胞からのBFU−Eの増大を刺激しなかったが、WEHI−3CM+エリトロポエチンは、105骨髄細胞から18のBFU−E形成を引き起こした。胎齢14日の胎児肝臓細胞に対するKLの影響も実験したが、脾臓細胞と同様の結果が観察された。胎児肝臓細胞からのBFU−Eの有意な数が、エリトロポエチン単独で観察された;しかし、2.5ng/mlのKLによって、6±2から20±5へ増加した。WEHI−3CM+エリトロポエチンの存在下では、18±3のBFU−Eが胎児肝臓細胞で観察された。
赤血球系列におけるKLのc−kitに対する関係を更に評価するために、KLが、W/Wマウスの胎児肝臓細胞からの赤血球バースト形成を促進するか否かを評価した。W/Wと、W/+またが+/+肝臓細胞を、交配したW/+マウスの胎齢16.5日の胎児から調製した。有核細胞の全数は、健康な胎児と比較して、W/W突然変異の肝臓では8倍減少していた。W/Wと、W/+または+/+の胎児肝臓からのBFU−Eの数は、IL−3+エリトロポエチンで生育した培養において同様であり、エリトロポエチン単独で生育した培養におけるBFU−Eの低い水準についても同様であった(図7)。W/W胎児肝臓細胞に対して、KLはエリトロポエチン単独で観察された水準以上にはBFU−Eを刺激しなかった。ところが、W/+または+/+肝臓細胞からのKL依存性BFU−Eの数は、エリトロポエチン+IL−3で得られたものと同様であった。この結果は、KLに対する赤血球前駆細胞の反応性がc−kit機能に依存しているということを示唆している。
精製KLの結合実験
精製したKLを、クロラミンT法を用いて、125Iで高比活性(例えば2.8×105cpm/ng)にラベルした。このラベルしたKLを用いて、肥満細胞へのKLの特異的結合を検出した。しかし、W/W肥満細胞については結合は観察されず、同腹子の肥満細胞へは良好な結合を示した。肥満細胞に結合した後、KLはc−kitに対する抗血清で共沈殿された。加えて、W突然変異肥満細胞へのKLの結合は、細胞表面でのc−kit発現(V、37(+)対W(-)と関係している。
c−kitリガンドのペプチド配列の決定
c−kit受容体タンパクを記述したようにして単離し、該タンパクの配列を、当業者に周知の方法で決定した。
該タンパクの、N−末端からの一文字記号によるアミノ酸配列は下記の通りである:
但し:
K=リジン;E=グルタミン酸;I=イソロイシン;X=不明;G=グリシン;N=アスパラギン;P=プロリン;V=バリン;T=スレオニン;D=アスパラギン酸;L=ロイシン;A=アラニン;Y=チロシン;M=メチオニン;である。
<実験の考察>
W遺伝子座とc−kitプロトオンコジーンとが対立遺伝子であるとの発見は、発生過程および成熟動物でのc−kitの機能について重要な情報を明らかにした。c−kit受容体の機能に関する知見によって、今度はc−kit受容体のリガンドを産生する組織および細胞のタイプについての重要な糸口が提供された。c−kitリガンドを同定する試みにおいて、Balb/3T3繊維芽細胞(c−kitリガンドを産生すると推定される一つの細胞タイプ)の馴らし培地から、KLと命名された成長因子が精製された。この成長因子は、肥満細胞の生物学および造血機能に関して、c−kitリガンドに期待される生物学的性質を有している。KLは、30kDの分子量と3.8の等電点を有する。KLは、この特性をもったCSF−1,PDGF−AおよびPDGF−Bとは対照的に、ジスルフィドで結合された二量体ではない(70,71)。けれども、PBS中でのゲル濾過の際におけるKLの挙動は、55−70kDの大きさを示している。このことは、生理的条件下での、非共有結合で結合した二量体の存在と一致する。KLは、BMMC及び精製した腹腔肥満細胞(CTMC)の増殖を刺激する能力を有するが、W突然変異マウスからのBMMCsに対する増殖刺激能力はもたないことに基づけば、肥満細胞に対する影響において、IL−3およびIL−4のような他の造血性成長因子とは異なっている。Balb/3T3繊維芽細胞は、造血性成長因子G−CSF、GM−CSF、CSF−1、LIFおよびIL−6の供給源である;しかし、これらは何れもKLの生物活性を持っていない(35,71)。さらに、KLのタンパク配列の決定からの予備的な結果は、KLが既知のタンパク配列とは異なることを示している。
W突然変異マウスには肥満細胞が存在しないので、in vivoでの肥満細胞の増殖、分化および/または生存におけるc−kitおよびそのリガンドの特異的な役割が推論されている(72、73)。肥満細胞の分化において、c−kit機能が必要とされる正確な1または2以上の段階は知られていない。IL−3によって骨髄、胎児肝臓または脾臓からin votroで誘導された肥満細胞は、最終的に分化した肥満細胞であるMMCおよびCTMCの両方のタイプの前駆細胞を意味するのではあるが、粘膜の肥満細胞(MMC)に似ている(66)。IL−3依存性肥満細胞は、正常およびW突然変異マウス両方の骨髄あるいは胎児肝臓から同等の効率で発生され得るから、c−kitは明らかに、造血性前駆細胞からのBMMCの発生には必要とされない(60)。BMMCおよびCTMC/PMCにおけるc−kit発現と、これに対応したBMMCおよび成熟CTMC/PMCのKLに対する反応性の証明は、肥満細胞の分化における多数の段階でのc−kitの役割を示唆している。繊維芽細胞に加えて、IL−3とIL−4との組み合わせ、IL−3とPMAとの組み合わせ、またはIgE受容体の架橋によって、in vitroでのCTMCの増殖が刺激され得ることが示されている(74,75,76,77,78)。アレルギーおよび炎症応答の媒介物であるこれら生体反応修飾物質とは対称的に、FCSの存在下において、KLは単独でCTMC増殖を刺激する能力を有する。従ってKLは、その産生や標的細胞に対する作用のためのこれら免疫応答とは独立した、肥満細胞の増殖および分化活性を有しているかもしれない。
W突然変異が及ぼす造血機能の欠損は、赤血球細胞の成熟におけるc−kitの必須な役割を示している(80,68,69)。同腹子と比較した、W/W胎児の肝臓における赤血球前駆細胞の分析によって、c−kit機能が存在しない状態では、成熟は正常にBFU−E段階へ到達するが、CFU−E段階への進行は抑制されることが示唆された(35)。in vitroにおいて、この欠損は、エリトロポエチンと共働してW/W vおよび+/+骨髄からのBFU−Eの成熟を容易にするのに充分なIL−3を、培養系へ添加することにより克服され得る(78)。in vivoにおいて、このプロセスでのIL−3の役割は知られておらず、従って、c−kitは赤血球分化のこの段階を通る進行において重要な機能を果たし得る。エリトロポエチンと共同して、脾臓および胎児肝臓細胞からの赤血球バーストの形成を刺激するKLの能力は、赤血球分化のこの段階で機能するc−kitと一致する。さらに、W/WのBFU−Eを刺激するKLの能力は、KLに媒介されるBFU−E形成にc−kit機能が必要とされることを示唆している。このことは、KLに媒介される肥満細胞の増殖にc−kit機能が必要性とされること似ている。Balb/3T3の、胎児肝臓細胞からのBFU−Eの分化に対するバースト促進効果は既に報告されている(79)。KLは、Balb/3T3細胞のバースト促進活性の原因であるらしい。この研究の興味ある発見は、KLが、骨髄細胞からの7日目のBFU−Eを刺激することができないことである。この結果は、胎児肝臓、成人脾臓および成人骨髄中におけるBFU−Eが、成長要求物において異なることを示唆している。最近の実験は、培養液中でより遅い時期に(14−20日)出現する骨髄細胞中での初期の赤血球多機能性前駆細胞が、KLによって刺激されるかもしれないことを示している。BFU−E形成におけるKLの直接的な影響を示すために、また補助細胞あるいは他の内在成長因子の関わり合いを除外するために、精製した前駆細胞集団による実験を行う必要がある。
造血機能および肥満細胞発生の欠損に加えて、W突然変異は造血系の幹細胞コンパートメント(compartment)に影響を及ぼすと思われる。影響される集団には、様々な細胞系統に対する長期間のリポピュレイション能力を持つ細胞と同様、致死的な放射線を受けたマウスの脾臓中の骨髄コロニーを産生する脾臓コロニー形成単位(CFU−S)が含まれ得る(81,46,47,81,82)。いまや、c−kit/W遺伝子産物が幹細胞コンパートメント(compartment)で機能する段階を同定するために、KLが、可能であれば他の造血性成長因子と組み合わせて、自己複製あるいは造血系幹細胞集団の分化能力における影響を有しているか否かを決定するのは興味深いことであろう。
マウスのスチール遺伝子座(Sl)における変異は、W変異を持つマウスの表現系に類似して、造血系、メラニン形成および配偶子形成における多形質な表現系を産生する(47,51)。しかし、W突然変異とは対照的に、Sl突然変異は突然変異の細胞内標的の微小環境に影響を与えるが、細胞自律的ではない(46)。WおよびSl変異の相似的および相補的な影響によって、c−kit受容体のリガンドまたは遺伝子産物をコードするSl遺伝子は、産物および/またはリガンドの機能と密接に連結していることが示唆されている(9)。この推測に合致して、Sl/Sl d胚繊維芽細胞またはSl/Sl d繊維芽細胞の馴らし培地は、夫々、BMMCおよび肥満細胞前駆細胞の増殖を援助できないし、多分機能的なKLを産生しないであろう(16,84)。もし、KLがc−kit受容体のリガンドであるとすれば、分子的な分析によって、Sl遺伝子座の遺伝子産物に関するKLの特性を決定することが可能とされるであろう;さらに、Sl変異をもったマウスへのKLの投与によって、少なくともこの突然変異の幾つかの症候が治癒に導かれることが予期されるであろう。
1.4kbのcDNAクローンが、既述した方法を使ってヒト繊維芽細胞またはヒト胎盤ライブラリーをスクリーニングするために用いられた。ヒトc−kitリガンドをコードする遺伝子の単離において、遺伝子は既述の方法を使って特徴づけられるであろう。
実験2:核酸配列の単離
<実験の方法>
マウスおよび組織培養
WBB6+/+、C57BL/6J、C57BL/67WV/+、WB6W/+、C3HeB/FeJ a/a CaJS1 Hm、およびM.スプレータス(M.spretus)マウスは、ジャクソン・ラボラトリー(バー・ハーバー、ME)から得られた。種間の交配のために、雌C57B1/6Jと雄M.スプレータス・マウスとを交配させた;この交配の子孫は、以下に述べるようにC57B1/6JまたはM.スプレータス対立遺伝子の遺伝を刻み込まれる。(C57BL/6J×M.スプレータス)F1雌オフスプリング(offspring)は、C57B1/6J雄と戻し交配された。
肥満細胞は、+/+、Wv/WvおよびW/+成体マウスの骨髄および胎齢14−15日のW/W胎児の胎児肝臓から、10%胎児細胞血清(FCS)、WEHI−3B細胞の馴らし培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸および2−メルカプトエタノール(RPMI−含有)を添加したRPMI1640培地中で増殖された(36、60)。BALB/c 3T3細胞(1)は、ポール・オッドーネル(Paul O′Donnell)(スローン・ケッタリング・インスティテュート(Sloan-Kettering Institute)ニューヨーク、ニューヨーク)から入手され、10%ウシ血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法MEM中で増殖された。
KLの精製とアミノ酸配列決定
他で記載されているように、肥満細胞増殖試験(37)を使って、BALB/c 3T3細胞の馴らし培地からKLを精製した。次いで、ペリコン限外濾過装置およびこれに続いてアミコン撹拌セルを用い、馴らし培地を100−200倍に濃縮した。次に、濃縮液はブルーアガロース(ベテスダ・リザーチ・ラボラトリー、ガイテルスブルグ、MD;BethesdaResearch Laboratories,Gaithersburg, MD)上でのクロマトグラフにかけられ、活性物質を含む流出物がポリエチレングリコール8000の透析膜で濃縮され、ACA54ウルトラゲル(LKB社、ロックランド、MD)カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって分画された。生物活性は、55〜70kdおよび0kdに夫々対応する大ピークおよび小ピークとして溶出された。大ピークの画分を集めて透析し、DEAE−5PWカラム上でのFPLCによって、NaCl濃度勾配で分画した。活性は、0.11M NaClでHPLCカラムから溶出された。ピーク分画が回収され、半分取型C18カラムと酢酸アンモニウム−n−プロパノールの濃度勾配でHPLCにかけられた。30%n−プロパノールで半分取型C18カラムから溶出した活性物質は、1:1に希釈され、分析用C18カラムを使って再びクロマトグラフにかけられた。再び、30%n−プロパノールで単一のピークが溶出され、それは溶出プロファイルで吸光度(280nm)の大ピークに相当した。同様の結果が、溶媒としてH2Oと0.1%TFAを含むアセトニトリルでのC4カラムを用いることにより得られた。N−末端アミノ酸配列を、PTHアミノ酸分析計を接続したアプライド・バイオシステム477Aを用いて決定した(Hewick et al.,1961)。
ヨード化
KLは、スタンレーとギルバートの方法を改良したクロラミンT法(1981)を用いてヨード化された。概略を述べると、標識化反応においては、全量25μlの0.25Mリン酸バッファー(pH6.5)中に、200 ngのKL、2nmolのクロラミンT、10%ジメチルスルフォン酸、および0.02%ポリエチレングリコール8000が含有せしめられた。反応は4℃で2分間行い、2nmolのシステインおよび4μMのKIを添加することにより停止された。次に、KLはPD10カラム(ファルマシア)を用いたゲル濾過により、遊離のNaIから分離された。ヨード化されたKLは、4℃で2週間保存された。
結合測定
結合バッファーはRPMI1640培地、5%BSA(シグマ社)、20mMのHEPES(pH7.5)およびNaN3を含有していた。非付着性細胞についての結合実験は、96穴組織培養皿を用いて、100μl量のウエル当り2×105細胞で行なった。Ψ2細胞での結合実験は300μl両の24穴皿で行なった。細胞は、詰抗体または標識したKLを添加する15分前に、結合バッファーで平衡化された。非特異的な結合を決定するために、125I−KLを添加する30前に、標識していないKLまたは抗c−kitウサギ血清を10倍量過剰に添加した。細胞は125I−KLと共に90分間インキュベートされ、非付着性細胞が150μlのFCSによりペレット化された。細胞ペレットは凍結され、計数された。
免疫沈降と架橋結合
BMMCを125I−KLと共に標準結合条件下でインキュベートし、4℃において、FCS中で洗浄し次いでPBS中で洗浄した。以前報告されたようにして(35)、細胞は1%トライトンX−100、20mMトリス(pH7.4)、150mM塩化ナトリウム、150mMのEDTA、10%グリセロール、並びにプロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルフォニル(1mM)およびロイペプシン(20g/ml)によって溶解された。溶解物はc−kit特異的な血清を用いて免疫沈降された。このc−kitは、正常ウサギ血清を用いて、またはv−kitチロシンキナーゼドメイン(23)のフラグメント若しくは組換えワクシニアウイルス(36)のcDNAから発現されたマウスc−kitでウサギを免疫化することにより生成されたものである。共沈殿実験のために、免疫沈降物は洗浄液A(0.1%トライトンX−100、20mMトリス[pH7.4]、150mM塩化ナトリウム、10%グリセロール)で3回洗浄され、SDSサンプルバッファーで可溶化され、そしてSDS−PAGEおよびオートラヂオグラフィーで分析された。架橋実験のために、細胞は4℃で30分間、PBS中のジスクシニミジル基質(0.25mg/ml)と共にインキュベートされ、PBS洗浄され、そして前述のようにして溶解された。沈殿に続く洗浄条件は次の通りである:洗浄液Bで1回(50mMトリス、500mM塩化ナトリウム、5mMのEDTA、0.2%トライトンX-100)、洗浄液Cで3回(50mMトリス、150mM塩化ナトリウム、0.1%トライトンX-100、0.1%−SDS、5mMのEDTA)そして洗浄液Dで1回(50mMトリス、0.1%トライトンX-100)。
cDNA合成、PCR増幅(RT−PCR)、および配列決定
RT−PCR増幅は、本質的には先に公表されているのと同様にして行なった(53)。cDNA合成のために、25μlの0.05Mトリス−HCl(pH8.3)、0.075M塩化カリウム、3mM塩化マグネシウム、10mMジチオトレイトール、200MのdNTPsおよび25UのRNAsin(プロメガ社)中で集密培養されたBALB/c3T3細胞に由来する1μgのポリ(A)-が、50 pmolアンチセンスプライマーおよび50Uのモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素と共に、40℃で30分間インキュベートされた。更に、50Uの逆転写酵素が添加され、保温は更に30分間続けられた。cDNAは、50mM塩化カリウム、10mMトリス−HCl(pH8.3)、1.5mM塩化マグネシウム、0.01%(W/V)ゼラチン、および200μMのdNTPsを含む25μlに、50pmolのセンスプライマー及び2.5UのTaq・DNAポリメラーゼを添加し、反応液を50μlに増量して、温度自動制御サイクラー(パーキン−エルマー・シータース社)で25−30サイクル増幅することにより増幅された。増幅されたフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製され、適切な制限酵素で切断され、配列分析を行なうためにM13mp18およびM13mp19中にサブクローン化された(49)。
cDNAの単離と配列
この実験では、クロンテック社(Clonetech)から得たマウス3T3繊維芽細胞ラムダg11・cDNAライブラリーが使用された。スクリーニングは、宿主バクテリアとして大腸菌Y1090を用いて2回行われた(48);5′末端をラベルしたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、63℃において6倍SSC(6×SSC)で行ない、フィルターの最後の洗浄は2倍SSC、0.2%SDSを用いて63℃で行なった。組換えファージはEcoRIで切断され、配列決定のために、挿入物はM13中にサブクローン化された。これらcDNAのヌクレオチド配列は、両方の鎖および重なり部分について、ザンガー等のジデオキシチェインターミネーター法(49)により、合成オリゴデオキシヌクレオチド(17量体)をプライマーに用いて決定した。
DNAおよびRNA分析
ゲノムDNAはテイルフラグメントから調製され、制限酵素で切断され、電気泳動で分画され、ナイロン膜に転写された。ハイブリッド形成のために、1.4kbのKL・cDNAおよびTIS・Dra/SaI(トランスジェニック系列TG.EB(85)の導入遺伝子挿入部位から得たプローブ)をプローブに用いた。BALB/c3T3細胞をグアニジンイソチオシアネートでホモジェナイズし、RNAをチーウイン(Chirgwin)らの方法(10)に沿って単離さした。全細胞のRNA(10g)およびポリ(A)+RNAは、1%アガロース/ホルムアルデヒドゲルで分画され、ナイロン膜に転写された。プレハイブリダイゼイション及びハイブリダイゼイションは、先に公表されているようにして行なった(86,35)。[32P]リン酸で標識した1.4kbのKL・cDNAを、ハイブリダイゼイションのプローブとして使った。
c−kitおよびc−kitリガンドモノクローナル抗体の調製
ヒト・モノクローナル抗体を単離するために、8週齢のBalb/cマウスの腹膜組織内に、容量比1:1で完全フロイントアジュバント中に含まれる本発明の精製ヒト可溶性c−kitリガンド(KL)ペプチド、またはその可溶性フラグメント50μg(上記の通り調製したもの)を注入した。次いで、マウスは1か月の間隔をあけて、不完全フロイントアジュバントと混合した可溶性リガンドポリペプチド又は可溶性リガンドポリペプチドフラグメントで追加免疫され、尾静脈から脱血された。融合させる4日、3日および2日前に、生理食塩水中のポリペプチドあるいはフラグメント50μgを静脈内に投与することにより、マウスを追加免疫した。次に、本発明の属する技術において公知の方法に従って、脾臓細胞が非分泌性の骨髄腫細胞と融合された。2週間後、既述したようにして、ハイブリドーマ上清はc−kit受容体タンパクに対する結合活性についてスクリーニングされた。次いで陽性クローンが単離され、増殖された。
別法として、c−kit受容体に対するモノクローナル抗体を産生するために、マウスに対してc−kit受容体タンパクの注射および追加免疫を行うこと除いて、上記の方法が実施された。
或いは、ネズミモノクローナル抗体を単離するためには、スプラーグードーリー(Sprague-Dawley)ラットまたはルイスラットに対してネズミ由来ポリペプチドを注射し、得られた脾細胞がラット・ミエローマ(y3−Ag1.2.3)細胞と融合される。
<実験結果>
造血細胞増殖因子KLをコードするネズミcDNAの単離および定性
既述のアニオン交換クロマトグラフおよび逆相HPLCを含む一連のクロマトグラフ工程によって、BALB/C 3T3細胞の馴らし培地からKLタンパクを精製した(37)。先に述べたように、KLのN末端の40個のアミノ酸配列は下記のように決定された:
ハイブリッド形成のための非縮重相同性プローブを誘導するために、図8に示すように、アミノ酸10−16(センスプライマー)およびアミノ酸31−36(アンチセンスプライマー)に対応する、5′末端にエンドヌクレアーゼ認識配列を付与した完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ポリメラーゼチェインリアクションの逆転写酵素改変法(RT−PCR)を用いることにより、KLのアミノ酸10−36を特定するKL・mRNAの配列に対応するcDNAを得た。BALB/C 3T3細胞由来のポリ(A)+RNAを、縮合オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、cDNA合成およびPCR増幅のテンプレートとして使用した。
増幅されたDNA断片をM13にサブクローン化し、3つの挿入物の配列を決定した。プライマー間の配列はユニークであり、且つ正しいアミノ酸配列を特定することが分かった(図8参照)。PCR増幅物のユニークな配列に対応するオリゴヌクレオチド(49ヌクレオチド)は、次に、λgt11のネズミ繊維芽細胞ライブラリーのスクリーングに使用された。3′側半分においてオープンリーデイングフレームが特定されている1.4kbのクローンが得られた。このオーブンリーディングフレームは、クローンの3′末端にまで広がっており、270のアミノ酸をコードする(図11参照)。KLアミノ酸配列の最初の25アミノ酸は、シグナル配列の特徴を有している。そのシグナル配列の後には、精製されたタンパクに由来するN末端ペプチド(アミノ酸26-65)が続いている。陽性に電荷したアミノ酸がカルボキシル末端に続いている21アミノ酸の疎水性配列(残基217-237)は、トランスメンブラン部位の特徴を有している。シグナルペプチドとトランスメンブレンドメインの間の配列には、4つの潜在的なN-リンクされたグリコシル化部位と、4つの不規則に離間されたシステインが存在する。33アミノ酸のC末端部分が、トランスメンブレンドメイン部位に続いているが、終止シグナル(クローン末端)には達していない。従って、KLアミノ酸配列はトランスメンブレンタンパクの特徴、つまりN末端シグナルペプチド、細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよびC末端細胞内セグメントの特徴を有している。
BALB/C 3T3細胞胞においてKLに特異的なRNA転写物を同定するために、RNAブロット分析を行なった(図12参照)。1.4kbのKL・cDNAをプローブに用いることによって、ポリ(A)+RNAを含むブロット上に、6.5kbの主要転写物および4.6kbと3.5kbの2つの短い転写物を同定した。N末端タンパク配列由来の末端ラベルされたオリゴヌクレオチドを用いることによって、同一の転写物が検出された。この結果は、KLが、BALB/C 3T3細胞で多量に発現する大きなmRNAによってコードされていることを示している。
可溶化型KLはc−kit受容体のリガンドである
繊維芽細胞由来の造血細胞増殖因子KLは、一次骨髄肥満細胞および腹腔肥満細胞の増殖を促進し、また赤血球バースト促進活性を示すことが既に示されている。KLタンパクがc−kit受容体のリガンドであるか否かを確認するために、まず、高レベルのc−kitタンパクを発現する細胞:即ちc−kit・cDNAを発現する肥満細胞(BMMC)およびNIHψ2細胞と、KLとの特異的結合を示すことが考えられた。改変クロラミンT法を用いることにより、KLを125Iで高比活性にラベルした(88)。ラベルした物質のSDS−PAGEによる分析では、28-30kd(図13参照)の単一バンドが表われ、また肥満細胞増殖分析によって、ラベルした物質が生物学的活性を保持していることが示された。
125I-KLの濃度をあげ、c−kit・cDNAを発現するNIHψ2細胞、NIHψ2対象細胞、正常なBMMC、並びにW/W,W/+およびWv/WvBMMCに対するKLの結合を4℃において測定した。図14に示した結果によって、ラベルされたKLが、NIHψ2c−kit細胞、並びに+/+,W/+およびWv/Wv肥満細胞には結合するが、NIHψ2c−kit対照細胞およびW/W肥満細胞には結合しないことが示される。Wv突然変異は、c−kitのキナーゼドメインにおけるミスセンス突然変異の結果であって、in-vitroにおけるキナーゼ活性を阻害するが、細胞表面のc−kitタンパクの発現には影響を与えない(36)。これとは対照的に、Wは、c−kitタンパクのトランスメンンブランドメインが除去されるようなスプライス欠陥に起因した欠失によって生じるものであり、従って細胞表面にはc−kitタンパクが発現されない(36)。更に、125I-KLの結合は、非ラベル化KLおよび2種類の抗c−kit抗血清を用いて完了させることができた。これらの結果から、その細胞表面にc−kitを発現する細胞は、125IでラベルされたKLと結合することが示された。
KLがc−kit受容体のリガンドであることについて、より直接的な証拠を得るために、受容体/リガンドの複合体がc−kit抗血清による免疫沈殿によって精製されるか否かを確認した。この実験では、KL−c−kit複合体が安定で、且つc−kit受容体の可溶化に用いる洗浄剤によって影響を受けない事が必要である。受容体−リガンド複合体のこのような性質の先行例は、密接に関連したマクロファージコロニー刺激ファクター(CSF−1)受容体およびPDGF受容体のシステムから導かれる(89)。125I-KLは、4℃でインキュベーションすることによって、BMMC上の受容体と結合する。遊離の125I−KLを洗浄除去する際に、トリトンX-100溶菌手法を使用することによって細胞を溶解させ、またプロテインA/セファロースに結合した抗v−kitおよび抗c−kitウサギ血清を用いて沈殿させた。SDS−PAGEによる免疫複合体の分析(図15A)に示されるように、125I−KLは、抗kit血清とのインキュベーションによって得られた免疫沈殿中には保持されるが、非免疫コントロールの場合には保持されない。これによって、完全な125I-KLが、抗kit血清との免疫複合体を含むサンプルから回収されることが実証された。
c-kit-KL受容体−リガンドの複合体を更に特徴づけるために、KLがc-kitに架橋結合され得るか否かを確認した。BMMCを125I−KLと共にインキュベートし、洗浄し、架橋結合したジサクシンイミジイル基質で処理した。次に、細胞溶解物を抗-v-kit抗血清と共に免疫沈殿させ、SDS−PAGEで分析した。オートラジオグラフで次の三つの種が示された。一つは約30kdの種であり、c−kitに架橋結合しないことによって共沈殿したKLを示す。一つは180-190 kdの種で、共有結合したc−kitKLの単量体-単量体複合体に対応する。残りの一つは、分離ゲルとスタッキングゲルの間の境界にある高分子構造物である(図15B)。細胞溶解物を事前の免疫沈殿なしにSDS−PAGEで直接分離したところ、同様の大きさの分子構造物が観察された。非免疫血清で沈殿を行なった後では、125Iラベルされた分子は観察されなかった。高分子構造物の形成は、肥満細胞とKLとのインキュベーションに依存しており、架橋結合したKL自身とのインキュベーションでは観察されなかった。これらの結果を一緒に考慮すると、KLはc−kit受容体に特異的に結合し、KLがc−kitのリガンドである証拠が提供される。
S1遺伝子座に対するKLのマッピング
S1遺伝子座にKLがコードされているか否かを試験するために、組換え分析を用いて、S1と緊密にリンクしている遺伝子座についてKLのマッピング位置を決定した。この遺伝子座は、トランスジェニック系のTG.EBにおける導入遺伝子(トランスジーン)の挿入部位である(85)。この挿入部位からクローニングされた遺伝子配列は、S1から0.8±0.8cMの地図上にある事が確認された。従って、これはS1に対して最至近距離にある公知のマーカーを示している。
トランスジーン挿入部位に関してKLをマップするために、c57BL/6Jマウスと、Mus spretus種のマウスとの交配を利用する種間マッピング分析を採用した。この方法は、実験室での異種近親交配系の間よりも異種間において、クローニングされたDNAに制限断片長の多型(RFLPs)が頻繁に見られるとの所見を利用してる(90)。1.4kbのKL・cDNAプローブと、TIS Dra/SaIプローブ(トランスジーンの挿入部位からのプローブ)との結合(linkage)は、これら夫々のc57BL/6JまたはMus spretus 対立遺伝子の遺伝的一致点を数えることによって評価した。これらは、Traql制限酵素消化分解によって明らかになったRFLPsを分析することによって、容易に区別され得る。この結合分析の結果を表2に示す。53の子孫のうち、ただ一つの組換え体のみが得られた。これは組換率1.9±1.9%と一致する。この値は導入遺伝子の挿入部位とS1との間で測定された遺伝距離に極めて近いから、この結果は、KLがS1遺伝子座にマップされているという見解と一致する。
KLによって同定された遺伝子座については、オリジナルS1突然変異を有するマウスでもテストされた(50)。この目的のために、近親交配系でのトランスジーン挿入部位遺伝子座が多型であるいう所見を、胎児発達期のS1における遺伝子タイプを確認するために有利に利用した。交配によって、C3HeB/FeJに保持されたS1突然変異を有するC57BL/6Jマウスを産生させ、S1対立遺伝子を有するF1世代を同種交配させた(C57BL/6J S13CH/+S1C3H/+)。この交配より得られるホモ接合体の子孫SIISIは貧血性であり、トランスジーン挿入部位におけるC3HeB/FeJ由来のRFLPについてホモ接合である(図16参照)。非貧血性のマウスは、ヘテロ接合であるS1I+または野生型かの何れかであり、C3HeB/FeJおよびC57BL/6J由来の多型についてヘテロ接合であるか、またはC57BL/6J多型についてホモ接合である。SII+およびSIISIマウス由来のゲノムDNAを、1.4kbのKL・cDNAを使用して分析したところ、ホモ接合体であるSIISI・DNAとのハイブリダイゼーションは見られなかった(図16参照)。従って、S1突然変異において、KLタンパクをコードする遺伝子座が欠損していることは明らかである。この知見は更に、KLがS1遺伝子の産生物であるという見解を支持する。
<実験考察>
c−kit-プロトオンコジーンとネズミW遺伝子座とが対立遺伝子の関係にあるとの発見によって、発育期の動物および成体動物におけるc−kit受容体の多面的作用が明らかになった。更に、この発見によって、哺乳類におけるトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体の最初の遺伝子システムが提供された。S1遺伝子座およびc−kit/W遺伝子座における突然変異は、同じ細胞標的に影響を及ぼす。これらの突然変異が相補的であり、特性が類似しているため、c−kit受容体のリガンドがS1遺伝子座によってコードされることが示唆された。
ここでで報告された実験は、S1遺伝子がc−kit受容体のリガンドをコードしていることを実証するものである。この結論の論拠は次の通りである。KLと称するc−kit受容体作用の知見に基づき、c−kit受容体の予想リガンド(KLと命名)が同定され、精製された(37)。また、機能的c−kit受容体を発現する細胞にKLが結合し、またKLとc−kitタンパクが安定な複合体を形成することを証拠にして、c−kit受容体にKLが特異的に結合することも実証された。KLに特異的なcDNAクローンが誘導され、またKLがマウスの染色体10上のS1遺伝子座にマップされていることが示された。さらに、KL配列がS1マウスのゲノム上で欠損していることも実証された。これらの結果を総合すると、KLはS1遺伝子座でコードされること、およびKLがc−kit受容体のリガンドであることが示唆される。これにより、S1欠陥のための分子レベルでの根拠が提供される。
KL・cDNAクローンのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列によって、KLは一体的なトランスメンンブレンタンパクとして合成されることが示唆される。従って、KLの主要な転写物の構造的特徴は、CSF−1の構造的特徴と類似する。CSF−1はトランスメンブラン分子として合成され、タンパク加水分解によってプロセッシングされて、分泌される可溶性生成物を形成し得る(91,44)。おそらくはCSFと同様に、KLもまた、プロセッシングされて可溶性タンパクを形成し得る細胞表面分子として合成されるのであろう。従って、BALB/C 3T3細胞の馴らし培地から精製されるタンパクは、細胞膜型からタンパク加水分解によって分泌された可溶性型KLであろう。KLタンパクの翻訳後のプロセッシングおよび発現は未だ明らかになっていないが、細胞表面付着型のKLが、c−kit/W受容体システムの増殖機能および移行機能を指示する細胞-細胞間相互作用を媒介するのであろう。KLの細胞膜付着型の所見と一致して、可溶性c−kit受容体とアルカリフォスファターゼの融合タンパクは、BALB/C 3T3細胞の細胞表面に結合するが、S1I/S1マウスに由来する繊維芽細胞には結合しないことが示されている(14)。
c−kit受容体のリガンドの同定における最も重要な側面は、リガンドの同定が、c−kitの多面的機能の研究を容易にするという事実にある。造血システムにおいて、c−kit/W突然変異は赤血球および肥満細胞系に影響を与え、また幹細胞区画に対する影響も推測されている。c−kit/KLは赤血球の成熟に重要な役割を果たしており、これは突然変異動物の貧血で最も良く観察される。更に、W/WおよびSIISId動物由来の胎児肝臓においては、BFU−Eの数が正常なままであるのに対し、CFU−Eの数は抑制される。このことは、c−kit/KLが、分化のBFU−E段階からCFU−E段階への進行を促進することを示唆している(90,35)。この点に関して、KLは骨髄におけるBFU−E(7日目)、並びに培養中に後で現われる初期赤血球多能性前駆細胞の増殖および分化(14−20日目)を刺激することが示されている(37)。
WおよびS1に突然変異をもつマウスには肥満細胞が存在しないため、in vivoでの肥満細胞の増殖、分化および/または生存ににおいて、c−kit/KLが重要な役割を持つことが推論されている(72,73)。肥満細胞の分化において、c−kit/KLが必要とされる段階は正確には分かっていない。BMMCは正常およびW突然変異体マウスから同等の効率で派生し得るので,骨髄細胞および胎児肝臓からのBMMCのin vitroでの派生には、c−kit/KLの作用は必要とされない(60)。KLに応答してBMMCおよび結合組織タイプの肥満細胞が増殖するという出願人の論証は、アレルギー反応および炎症反応を媒介すると考えられているIL−3およびIL−4に依存しない肥満細胞の増殖および分化の様々な段階における、c−kit/KLの役割を示すものである(66)。幹細胞区画において、この影響を受ける集団には多分、致命的な放射能照射を受けたマウスの膵臓に骨髄コロニーを作る膵臓コロニー形成ユニット(CFU−S)、並びに様々な細胞系で長期にわたって再集団化可能な細胞が含まれる(80,81,82,83)。いまや、幹細胞においてc−kit/KLがどの段階で働くかを同定するために、in vitroにおける造血幹細胞集団の自己再生または分化の潜在能力に対するKLの影響を、できれば他の造血細胞増殖因子と組み合わせて決定することが興味の対象である。c−kitの他の作用は、細胞周期性をもたない細胞から細胞周期性を持つ細胞への移行を促進することであろう(31)。SIISIdおよびW/wvマウスの放射線感受性の増加は、幹細胞ダイナミクスにおけるこのような役割を示唆する;更に、関連するPDGF受容体は細胞周期(過程)へのエントリーを促進することが知られている。
配偶子形成において、WおよびS1突然変異体は始原生殖細胞の増殖および生存に影響を与え、またその初期分化期における始原細胞卵黄嚢内臓胚から生殖器***への移行に影響する。出生後の配偶子形成においては、c−kit発現が未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞、精原細胞AおよびB、並びに間隙組織にも検出された(39)。メラニン形成において、c−kit/KLはおそらくは初期発生過程ならび成熟メラニン細胞において、メラニン芽細胞の増殖および神経堤から神経末梢へのメラニン芽細胞の移行に作用すると思われる。KLが入手可能になったことによって、これらの細胞システムにおけるc−kit受容体の作用のin vitro研究が促進されるであろう。
c−kit発現細胞の作用する微細環境がS1突然変異体マウスには欠けており、この微小環境はc−kitリガンドが生産される部位と推定される。突然変異の偶発的な性格のために、in vivoでKLを産生する細胞タイプはわかっていない。しかしながら、WおよびS1突然変異体の遺伝的欠損を再産生するin vitroシステムにおいて、この疑問に関心が当てられてきている。長期の骨髄細胞培養システムにおいて、SIISId付着細胞には遺伝的欠損があるが、非付着造血細胞には遺伝的欠損はない。また、肥満細胞−繊維芽細胞共培養システムにおいて、SIISId繊維芽細胞には遺伝的欠損があるが、肥満細胞では欠損がない(12,16)。これらのin vitroシステムでの結果は、造血間質細胞、胚細胞、結合組織繊維芽細胞がKLを産生することを示唆する。胚細胞起源のBALB/C 3T3細胞系は、KLをかなりのレベルで発現し、KL精製のための細胞源とされた。KLを発現する細胞タイプの知見は、c−kit発現が文書報告されている部位(消化管、神経システム、胎盤および脳顔面頭葢構造)において、c−kitが作用しているか否かを評価するのに役立ち得る(35,39)。S1、Wの表現型がこれらの細胞システムに関連しているか否かは分かっていない。
マウス染色体10上に、KL遺伝子(即ちS1遺伝子座)とトランスジーン挿入遺伝子座Tg・EBとの間の密接なリンクがあることを立証するために、同一種間の戻し交配を使用した。同様のアプローチが、S1近傍にあるTg・EB遺伝子座のマップを作るために以前から使用されてきた。しかしながら、KLコード配列がもとのS1対立遺伝子で欠損しているという知見は、S1遺伝子座とKL遺伝子とが同一であることを支持している。現時点では、S1対立遺伝子の欠損の大きさは分かっていない。それが近隣遺伝子に影響を与えるか否かを確認することが重要であろう。
S1対立遺伝子にKLコード配列が欠損していることは、この対立遺伝子がKLゼロ突然変異(null mutation)であることを示している。S1対立遺伝子がホモ接合のとき、大半のマウスが大赤血球貧血により周産期に死亡し、希に生き残ったマウスもコート色素を欠き、生殖細胞を欠く(5)。この表現型は、KLとc−kitのリガンド-受容体の関係に合致して、重篤なc−kit/Wの機能喪失突然変異の表現系と非常に相似する。SIISIとW/Wホモ接合とでは異なるが、例えば胚細胞の分化においS1はより顕著な影響を与え、造血機能においてS1はより重篤な貧血を惹起する。しかし、これらの相違は異種株という背景から来るものなのか、あるいはS1欠損が近傍の遺伝子に影響を与えた結果なのかは分からない(5)。
オリジナルなW突然変異は、c−kitゼロ突然変異の例である(36)。正常対立遺伝子とのヘテロ接合子のとき、WI+マウスは典型的な腹側スポットを有するが、コート色素の稀薄化はなく、また造血細胞および配偶子形成に対する影響もない。WI+マウスにおける弱いヘテロ接合の表現型は、S1I+マウスのヘテロ接合の表現型とは対照的であり、中程度の大赤血球貧血および腹側スポットに加えて、稀薄化したコート色素および小さい生殖腺を有する。このように、50%のKL遺伝子量は制限的であり、またc−kit受容体の正常な作用には不十分であるが、殆どの場合において、50%のc−kit受容体量では制限的であるようにはみえない。
造血機能、配偶子形成機能およびメラニン形成機能において、c−kit受容体システムは、成熟の進んだ細胞タイプと同様、未成熟の前駆細胞集団中でも作用する。重篤なS1およびW突然変異は、これらの細胞系の発生を阻害する。従って、より成熟した細胞集団におけるc−kit受容体の作用は明らかではない。c−kit/KLの作用の一部のみが損なわれているS1およびW突然変異は、しばしば成熟がより進んだ細胞集団において影響を表わす。多くの弱いS1対立遺伝子が知られている。例えば、配偶子形成形成およびメラニン形成におけるそれらの表現型は、c−kit受容体システムの多面的作用を解明する上で重要であろう。
実験3;KL−1およびKL−2
<実験材料>
マウスおよび組織培養
WBB6+/+、C57BL/6J及び129/Sv−Sld/+マウスをジャクソン・ラボラトリー(Bar Harbor、ME)から入手した。129/Sv−Sld/+雄および雌マウスを交配し、胎齢14日の胎児を得た。これらをTodaroおよびGreenの方法(54)に従う胚繊維芽細胞の誘導のために用いた。10%牛胎児血清(FCS)、WEHI−3B細胞からの馴し培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび2−メルカプトエタノールを補充したRPMI-1640培地(RPMI−完全(C))(36)中で、+/+成体マウスの骨髄から肥満細胞を成長させた。10%牛血清(CS)、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベルコ改変MEM(DME)中で、Balb/3T3細胞(1)を成長させた。Dr. Jerrard Hurwitz(SKI)からCOS−1細胞(18)を入手し、これを10%牛胎児血清、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したDME中で成長させた。
抗KL抗体の生成
Balb3T3細胞の馴し培地から、肥満細胞増殖反応測定法(37)を用いて、マウスKLが精製された。抗KL抗体を得るために、1匹のウサギを、完全フロインドアジュバント中に含有させた1μgのKLを皮下注射して免疫感作させた。3週間後、このウサギに対して、不完全フロインドアジュバント中に含ませた1μgのKLを皮下注射して追加免疫を行なった。1週間後に血清を採取し、その後は2週間の間隔で血清を採取した。この目的に用いられた125I−標識KLは、先に述べたスタンレイおよびギルバートのクロラミンT法の改良法によってヨウ素標識された。
cDNAライブラリー・スクリーニング
Balb/c3T3繊維芽細胞の全RNAから、オリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーによってポリ(A)RNAが調製された。次に、インビトロゲン社(Invitrogen Inc.)によって、カスタムメイドのcDNAが調製された。基本的に、二本鎖cDNAはオリゴdTおよびランダムプライミングによって合成された。非パリンドローム性のBstXIリンカーを鈍端cDNAに連結し、BstXIで消化した後、cDNAは発現プラスミドpcDNAI(インビトロゲン)中にサブクローニングされた。次いで、エレクトロポレーション法によって、ライゲーション反応混合物を用いてE.coli MC1061/P3を形質転換し、プラスミド・ライブラリーを生成させた。当初、このライブラリーは約107独立コロニーの大きさであった。このプラスミド・ライブラリーをスクリーニングするために、前述の末端標識オリゴヌクレオチド・プローブが用いられた(38)。ハイブリダイゼーションは、6倍SSC(6X SSC)中において63℃で行われ、フィルターの最終洗浄は63℃において2X SSCおよび0.2%SDSで行われた。組み換えプラスミドの挿入物は、HindIIIおよびXbaIでの消化により解放され、次いで配列分析のためにファージM13mp18中にサブクローニングされた。
PCR増幅(RT−PCR)および配列決定
組織および細胞ラインからの全RNAを、Chirgwinのグアニジウム・イソチオシアナート/CsCl遠心分離法により作成した(10)。このRT−PCR増幅は基本的に前述のようにして行われた(38).以下のプライマーがRT−PCRのために用いられた。
プライマー#1:
プライマー#2:
プライマー#3:
プライマー#4:
cDNAを合成するために、0.05mMのトリス−HCl(pH:8.3)、0.75MのKCl、3mMのMgCl2、10mMのDTT、200μMのdNTP′s及び25UのRNAsin(BRL社)を含む50μlの溶液中に、細胞ラインまたは組織から得た全RNA10μgを溶解し、これをアンチセンスプライマー50pモルおよび400Uのモロネイマウス白血病ウイルス・逆転写酵素(BRL)と共に37℃で1時間インキュベートした。このcDNAを、1/10容量の3M・NaOAc(pH:7.0)および2.5容量部無水エタノールを加えることにより析出させ、50μlのddH2O中に再懸濁させた。PCRは、10mMのトリス−HCl(pH:8.3)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、0.01%(w/v)のゼラチン、200μMのdNTP′s、夫々500pモルのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに2.5UのTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer-Cetus)を含む100μlの溶液中において30サイクル行われた。センスプライマー及びアンチセンスプライマー内に、HindIII部位およびXbaI部位を夫々配置した。増幅されたDNAフラグメントをアガロース・ゲル電気泳動法で精製し、適当な制限酵素で消化し、配列分析のためにM13mp18及びM13mp19中にサブクローニングした(49)。KL−1、KL−2、KL−S及びKL−SldのPCR産物を、HindIIIおよびXbaIで消化し、次いで発現プラスミドpCDM8またはpcDNAI(インビトロゲン社)中にサブクローニングした。アルカリ溶解法(48)でミニプレプ(miniprep)プラスミドDNAを調製し、続いてフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール析出を行った。COS−1細胞の形質転換に用いられるマキシプレプ(maxiprep)プラスミドDNAは、「Qiagen」クロマトグラフィーカラム法によって調製した。
RNAse保護試験
KL−1含有pcDNAIプラスミドをSpeIで線形化することにより、RNAse保護検定のためのリボプローブを作製した。次いで、プロメガジェミニ・キット(Promega Gemini kit)に従って、SP6ポリメラーゼを用いてこのアンチセンスリボプローブを合成した。高い比活性でラベリングされたリボプローブを、45℃で1晩、80%ホルムアミドの存在下において、10μgまたは20μgの全RNAに対してハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション混合物をRNAse・AおよびT1(Boehringer-Mannheim)で消化し、プロテイナーゼK(48)で処理し、この保護された標識化RNAフラグメントを4%尿素/ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。RNAse保護試験のオートラジオグラムをデンシトメトリーにより分析し、そのフィルムの一部をより良好な解像のためホスホ画像分析機(モレキュラー・ダイナミックス社)により再構築した。
COS−1細胞における「KL」cDNAsの一過性発現
「KL」cDNAsの一過性発現のために、多少の改良を伴って先に説明したDEAE−デキストラン法(20)を用いて、COS−1細胞にトランスフェクトした。簡単に述べると、使用1日前にCOS1細胞をサブ集密状態にまで増殖させ、次いでトリプシン処理した後、150 mm径のペトリ皿上に、ペトリ皿1個当たり6×106細胞の密度で再接種した。24時間後に細胞は70%集密状態に達し、この細胞に対して、10%DEAE−デキストラン(シグマ社)の存在下で6〜12時間に亘って、5μgのプラスミドDNAをトランスフェクトした。プラスミドDNAを含む培地を除去し、10%DMSO/PBS++を用いて正確に1分間、細胞に対して化学的なショックを与えた。細胞をPBS++で洗浄することにより、残留DMSOを除去した。トランスフェクトされたCOS−1細胞を、10%ウシ胎児血清、100mg/mlのL−グルタミンおよび抗生物質を加えたDME中で増殖させた。
「KL」タンパクのパルス追跡および免疫沈降分析
トランスフェクト(形質導入)されたCOS−1細胞について、形質導入の72時間後にパルス追跡実験が行なわれた。細胞は、10%の透析ウシ胎児血清を含むメチオニン非含有DMEと共に30分間インキュベートされ、0.5mCi/mLの割合で35S−メチオニン(NEN社)でラベリングされた。このラベリング期間の終点において、ラベリング培地を過剰のメチオニンを含む正規の培地で置換した。KLの蛋白分解開裂に対するフォルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)およびA23187の効果を判定するために、ラベリング培地を正規の培地に置換えた後、ラベリング期間の終点において、形質導入された細胞に対して1μMのPMA、または1μMのA23187を添加した。免疫沈降分析のために、指定された時間において、細胞および上清液を別々に回収した。前述のようにして(35)、1%トリトン-100、20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、20mMのEDTA、10%グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤塩化フェニルメチルスルホニル(1mM)およびロイペプチン(20μg/ml)中で、細胞溶解産物を調製した。KLタンパク産物の免疫沈降分析のために、抗マウスKLウサギ抗血清を用いた。抗KL血清をプロテインAセファロース(Pharmacia)に結合させ、洗浄液A(0.1%トリトンX-100、20mMのトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、10%グリセロール)で3回洗浄した。抗KL血清/プロテインAセファロースの複合体は、4℃で少なくとも2時間、上清液および細胞溶解産物と共にインキュベートされた。この免疫沈殿物を、洗浄液B(50mMのトリス、500mMのNaCl、5mMのEDTA、0.2%トリトンX-100)で1回洗浄し、洗浄液C(50mMトリス、500mMのNaCl、5mMのEDTA、0.1%トリトンX-100、0.1%SDS)で3回洗浄し、さらに洗浄液D(10mMトリス、0.1%トリトンX-100)で1回洗浄した。ゲル分析のために、5分間沸騰させることによって免疫沈殿物をSDSサンプル緩衝液中に溶解させ、SDS−PAGE(12%)およびオートラジオグラフィで分析した。
可溶性KLの生物学的活性の判定
10%牛胎児血清、WEHI−3B細胞からの馴し培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび2-メルカプトエタノールで補ったRPMI-1640培地(RPMI−完全)(36)中において、成体WBB6+/+マウスの骨髄から肥満細胞を増殖させた。非付着細胞を遠心分離により回収し、1週毎に再培養(refed)して、7×105細胞/ml以下の細胞密度に保った。培養物の肥満細胞含量は、サイトスピン試料(cytospin preparation)をメタノール中の1%トルイジンで染色することにより、1週毎に測定された。4週間後の培養物は通常95%以上の肥満細胞を含有しており、これを増殖反応測定のために用いた。形質導入されたCOS−1細胞からの上清液を、形質導入の48ないし72時間後に集めた。この上清液中の可溶性KLの生物学的活性を、IL−3の非存在下で、COS−1細胞上清液の異なる希釈液を用いてBMMCを培養することにより測定した。このBMMCを完全RPMIで3回洗浄し、0.2%IL−3中で増殖させた。次の日に細胞を回収し、完全RPMI(マイナスIL−3)中に懸濁させて、96ウェルのプレートの100μl/ウェル中に104個のBMMCを播種した。同量の希釈上清液を各ウェルに加え、37℃で24時インキュベートした。次いで、[3H]−チミジン2.5μCi/ウェルを加え、さらに6時間インキュベーションを続けた。細胞はガラスファイバーフィルター(GF/C・ワットマン社)上に回収され、チミジンの取込みをシンチレーション・カウンター内で測定した。試験は3回行って、その平均値を示した。測定値の標準編差は一般に平均値の10%を越えることはなかった。
<実験結果>
KLの選択的にスプライスされた転写物は、切除短縮されたトランスメンブラン型のKLタンパクをコードする
ここでは、マウス3T3繊維芽細胞ライブラリーから分離され、且つKLのコーディング配列(267アミノ酸)の殆どを含んだcDNAクローンが記載される。6.5kbのKL・mRNAに対応する完全なcDNA配列を得るために、Balb/c3T3繊維芽細胞に由来するポリA+RNAを用いて、プラスミドcDNAライブラリーを構築した。この目的に用いられたプラスミドベクターpcDNAIは、cDNA挿入物がCMVプロモータから発現される哺乳動物発現ベクターであり、またCOS細胞(インビトロゲン)における一過性発現のためSV40複製起源が含まれている。このライブラリーは、ここに記載したN末端およびC末端のKLコーディング配列に対応したオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされた。その結果、完全なKLコーディング配列、並びに5′および3′未翻訳配列を含むcDNAクローンが得られた。このクローン(図17)のヌクレオチド配列は、一つの塩基変化を除いて先に公表された配列(2,38)と一致している。この塩基変化は、664位にいてセリン206がアラニンに置換されたものである。
アンダーソン等によるマウスKL・cDNAクローンの分析によれば、48ヌクレオチドのインフレーム欠失を伴うスプライスされたcDNAが示されており、これはKL発現細胞中における選択的にスプライスされたKL・RNA転写物の存在を示唆している(2)。組織および細胞ラインから得たRNA中における選択的にスプライスされたKL・RNA転写物を同定するために、RT−PCR法を用いた。使用したプライマーは、KL・cDNAの5′および3′非翻訳領域に対応しており、ユニークな制限部位を含むように修飾された。図18に示したRT−PCT反応の電気泳動分析は、Balb/c3T3細胞および脳からのサンプル中に約870bpの単一の分画を示しているのに対して、脾臓、こう丸および肺からのサンプル中には大きさが約870bpおよび750bpの2つの分画が見られる。更に分析するために、この2つのPCR反応生成物を哺乳動物発現ベクターpCDM8中にサブクローニングした。DNA配列分析によって、最初に、大きいPCR生産物が公知のKL・cDNA配列(KL−1と呼ぶ)に対応することが示された。しかし、より小さいPCR生産物では、KLコーディング配列の84ヌクレオチドの切片が失なわれており、インフレーム欠失が生じていた。欠失の終点はラットおよびヒトKL遺伝子におけるエキソン境界に対応しており、これらの境界はマウス遺伝子中にも保存されていると思われる(27)。従って、より小さいPCR生産物は、選択的にスプライスされたKL・RNA転写物(KL−2と称する)に対応するものと思われる。KL−2におけるエキソンの欠乏は、トランスメンブラン・ドメインに先行する。即ち、それは4つのN−結合グリコシル化位置の1つを含んでおり、またKLの公知の可溶型におけるC末端(Ala-166及びAla-167)を含む(58)。従って、KL−2は、KL−1の切除短縮形バージョンをコードすると予測される。なお、このKL−1の切除形バージョンは、トランスメンブランタンパクとして合成されると思われる(図17、19)。
KL−2は組織特異的に発現される
選択的にスプライスされた転写物であるKL−2は、脾臓、こう丸および肺のRNA中に検出されたが、繊維芽細胞および脳のRNA中には検出されなかった。このことは、KL−2の発現が組織特異的な仕方で制御され得ることを示唆している。この問題についてより詳しく言及するため、RNA中のKL−1およびKL−2・RNA転写物の定常状態レベルを、RNAse保護試験を用いて、種々の組織から判定した。SP6・RNAポリメラーゼを用いて625ヌクレオチドのRNAハイブリダイゼイションプローブを作るために、KL−1・cDNAを含むpcDNAIプラスミドをSpeIで線状化した。このプローブは、40日齢マウスのBalb/c3T3繊維芽細胞、脳、脾臓およびこう丸、並びに成熟マウスの脳、骨髄、小脳、心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓、胎盤(14日p.c.)からの全RNA20μgとハイブリダイズした。次いで、サンプルをRNSseで消化し、反応生成物を4%尿素/ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分析した。これらの実験において、KL−1・mRNAは575塩基の単一分画を保護したのに対し、KL−2・mRNAは449および42ヌクレオチドの分画を保護した。図20に示すように、Balb/c3T3繊維芽細胞においてはKL−1が主な転写物であり、KL−2は殆ど検出できなかった。脳および胸線においてはKL−1が主な転写物であるが、脾臓、こう丸、胎盤、心臓および小脳においてはKL−1およびKL−2の双方の転写物が種々の割合で見られた。組織におけるKL−2に対するKL−1の割合がデンシトメトリーによって判定され、脳では26:1、骨髄では3:1、脾臓では1.5:1、こう丸(40日p.n.)では1:2.6であった。これらの結果は、KL−1およびKL−2の発現が組織特異的に調節されることを示している。
COS細胞におけるKLタンパクの生合成的特徴
KLはBalb/c3T3細胞の馴らし培地から精製され、これは可溶性タンパクであるにも拘らず、KL−1およびKL−2について予測されたアミノ酸配列は、これらタンパクが膜に結合していることを示唆している。KL−1およびKL−2タンパク物質に対するKL−Sの関係を研究するために、これらの生合成的特徴を決定した。RT−PCRによって調製されたKL−1およびKL−2のcDNAsを、COS−1細胞内における一過性発現のために、発現ベクターであるpcDNAIまたはpCDM8のHindIIIおよびXbaI部位にサブクローニングした。KL−1およびKL−2タンパク物質の一過性発現を容易にするために、COS−1細胞に、上述のようにDEAE-デキストラン/DMSOプロトコールを用いて、KL−1およびKL−2プラスミドを形質導入した。COS−1細胞におけるKLタンパク合成は、形質移入の72ないし96時間後に最大であることが示された。KL−1およびKL−2タンパク物質の生合成的特徴を判定するために、パルス追跡実験を行った。トランスフェクションの72時間後に、培養物を35S−メチオニン(0.5mCi/ml)で30分間ラベリングし、ついで通常の培地で追跡した。細胞分解物および上清液を指定された時間に回収し、精製マウスKLでウサギを免疫して作製した抗KL抗血清との免疫沈降のための処理を行い、SDS−PAGE(12%)で分析した。ラベリング期間の終了時に、KL−1プラスミドで形質移入された細胞内に、24、35、40および45kDのKL特異的タンパク生産物が見出だされた(図21)。これらのタンパクは、おそらく第1次翻訳生産物と、グリコシル化によって徐々に変性処理されたKLタンパク生産物であると思われる。次第に時間を長くして追跡することによって、45kD形は成熟KLタンパクであり、また該タンパクがKLの細胞膜形をであることが明らかになった。30分後から、28kDのKLタンパク生産物が上清液において見られ、時間が経つにつれて量も増加した。38kDおよび24kDの2つの少量生産物も、時間が経つにつれて見出された。これらの結果は、KL−1が最初に膜結合タンパクとして合成され、ついで多分タンパク分解開裂を介して培地中に解放されるという考えと一致する。
KL−2プラスミドで形質移入されたCOS−1細胞のパルス追跡実験を図20に示す。KL−2タンパク生産物は効率的にプロセッシングされて、32kDおよび28kDの生産物を生成したが、これにはKL−2の予測細胞膜形が含まれると思われる。このKL−2の細胞膜形は5時間以上の半減期を有し、対応するKL−1タンパクより安定している。3時間後、細胞上清液に約20kDのKL−2の可溶形が見られた。上清液におけるこのKL−2の可溶形の出現および蓄積は、KL−2の可溶形の出現と比較して遅い。これは、KL−2タンパク生産物の非効率的なタンパク分解プロセスに合致するものである。KL−2においては、選択的スプライシングの結果、可溶形KLの公知のC末端を含む配列、即ちKL−1の予想開裂部位が欠如していた。従って、KL−2のタンパク分解開裂には、KL−1およびKL−2の双方においてN末端またはC末端に存在する、欠失エキソンによりコードされる配列の第2開裂部位が含まれるものと思われる。上清液に見られる38kDのKL−1タンパク生産物は、トランスメンブラン・ドメイン近くの開裂部位を含む開裂生産物を表していると思われる(図19)。
COS細胞におけるKL−1およびKL−2のタンパク分解プロセスは、PMAおよびカルシウムイオノファA23187により調節される
プロテインキナーゼC誘導物質PMAは、CSF−1受容体、c−kit受容体およびTGF−αの例に示されるように、細胞膜タンパクのタンパク分解開裂を促進して、これらのタンパクの細胞外領域の可溶形を生成させることが知られている(13,4)。COS−1細胞内のKL−1およびKL−2の生合成的特徴に対する、PMA処理の効果が測定された。図22Bに示すパルス追跡実験は、KL−1およびKL−2の双方の急速な開裂が、PMAによって同様の速度論で誘導されることと、解放されたKL−1およびKL−2タンパク生産物が当該誘導物質の非存在下で得られるものと区別できないことを示している。これらの結果は、KL−1およびKL−2の双方のタンパク分解開裂の機構が、PMAによって同様に活性化されることを示している。他方において、この結果は、KL−1およびKL−2の夫々に対して特異的な異なった2つのプロテアーゼがPMAにより活性化されること、或いは非常に高いレベルで活性化される1つのプロテアーゼが存在し、これがKL−1およびKL−2の双方を異なった速度で開裂することを意味しているかも知れない。ラットKLの公知のC末端アミノ酸配列に基づくKL−1の主な開裂部位は、アミノ酸PPVA ASSL(186-193)を含み、エラスターゼ様酵素が関与していると思われる。上記の議論に基づくと、KL−2における認識配列は、上記の議論に基づけば、欠失されたエキソンのC末端に存在するものと思われ、アミノ酸RKAAKA(202-34)を含み、KL−1プロテアーゼと同様の特異生をもった酵素(或いはトリプシン様プロテアーゼであり得る)の関与が考えられる。KL開裂に対するカルシウムイオノファ(A23187)の効果が判定された。KL−1およびKL−2の双方の開裂がこの試薬によって促進され、プロテインキナーゼCの活性が関与しないメカニズムがKL−1およびKL−2の双方のタンパク分解開裂を媒介し得ることが示された(図22)。
解放されたKLタンパク生産物の生物学的活性
解放されたKLタンパク生産物の生物学的活性をテストするために、形質導入されたCOS−1細胞の上清液をトランスフェクションの72時間後に回収し、肥満細胞増殖測試験におけるその活性を測定した。骨髄由来の肥満細胞(BMMC)を、異なる希釈度の上記上清液と共に24時間インキュベートし、前述のようにして3H−チミジンの取込みを測定した(図23)。その結果、KL−1形質導入細胞からの上清液は、KL−2形質導入細胞からの上清よりも3倍〜5倍の高い活性が認められ、これはKL−1およびKL−2からの可溶性KLの解放が異なることと一致している。重要なことは、KL−1形質導入細胞およびKL−2形質導入細胞の解放されたタンパクが両者共に、肥満細胞増殖測定法において同様の比活性(specific activities)を示しているように観測されたことである。
トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを含むC末端KLをコードする配列の欠失から得られるスチールディッキー対立遺伝子
Sld対立遺伝子についてホモ接合のマウスは、コート色素を欠いているが、Sl対立遺伝子についてホモ接合のマウスとは対照的に成育可能であり、また生殖不能で大赤血球性貧血を有している。従って、これらのマウスにおけるc−kit受容体システムは、いくらかの残留活性を示すと思われる。Sld突然変異は3つの細胞系統に同じように影響し、突然変異がKLの本質的特性に影響を与えることを示唆している。Sldの分子レベルでの根拠を調査するために、PCRクローニング技術を用いて、先ずKLコード配列がこの対立遺伝子において最初に特徴づけられた。標準的手法によって、Sld/+胎児から第1次胎児繊維芽細胞が誘導された。次いで、Sld/+胎児繊維芽細胞から得たRNAおよび異なるプライマーを用いて、SldKLコード化区域を増幅した。その際、Sldが欠失突然変異である可能性に注意を払った。Sld/+全RNAおよびプライマー1,2を用いたRT−PCR増幅によって、1つのDNAフラグメントが生成された。このDNAフラグメントは、+/+繊維芽細胞RNAから得れらる生産物と同等の可動性(mobility)で移動した。また、その配列判定によって、このDNAフラグメントは公知のKL配列と区別し得ないことが示された。従って、この分画は正常な対立遺伝子を表していると推定される。プライマー1及び3、またはプライマー1及び4を用いたときは、より早い移動性をもったDNAフラグメントが同様に増幅された(図18)。プライマー1+3、およびプライマー1+4を用いて得られた850bpおよび1070bpのDNAフラグメントの双方をpCDM8中にサブクローニングし、ついで配列決定を行った。KL−SldcDNAでは、野生型配列のヌクレオチド切片660〜902が欠失され、代わりに67bpの配列が挿入されていることが見出された(図17)。この欠失および挿入によって、終止コドンにおいて5′欠失終点からの3つのアミノ酸をもたらした。KL−SldcDNAの予想アミノ酸配列は、公知のKL配列におけるアミノ酸1-205と、更に3つのアミノ酸からなるものであった(図17および19)。このKL−Sldのアミノ酸配列は、4つの全てのN−結合グリコキシル化部位と、KLの可溶性型に含まれる全ての配列を含んでいるが、野生型KL−1のトランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインは欠失されている。結論として、KL−Sldタンパク生産物は分泌されたタンパクであり、これは生物学的活性を示す。
KL−Sl d およびKL−Sタンパク生産物の生合成的特徴および生物学的活性
KL−Sldタンパク生産物との比較のため、KL−1の切除短縮形バージョン(KL−Sと命名)を作製した。ここにおいて、終止コードンがアミノ酸位置191(可溶性KLタンパクの推定C末端)に挿入された。COS−1細胞に対してKL−SldおよびKL−Sプラスミドをトランスフェクトし、パルス追跡実験を行なって、2つのタンパク生産物の生合成的特性の判定を行った。KL−Sldタンパク生産物は急速にプロセッシングされ(グリコキシル化によると思われる)、次いで培地中に分泌された。ここでは、追跡時間の30分後に早くも主たる30kD種が見出され、時間の経過に伴って増大した(図24)。KL−Sタンパク生産物の生合成的特性は、KL−Sldのものと非常に類似していた(図24)。ここでも、時間の経過とともに分泌物質の量の増大が培地中に検出され、逆に細胞に結合したKL−Sタンパク生産物は時間とともに減少した。
分泌されたKL−SldおよびKL−Sタンパク生産物の生物学的活性を検査するために、肥満細胞増殖試験を実施した。形質導入されたCOS−1細胞からの培地を、トランスフェクションの72時間後に集め、ついで希釈度の異なるこの上清液を用いて、IL−3の不存在下でのBMMCに与えられる増殖能力を評価した。双方のサンプルは何れもかなりの生物学的活性を含んでおり、その活性はKL−1を幾分越えるものあった(図23)。これらの結果を総合すると、KL−Sldタンパク生産物は分泌されるものであり、また生物学的活性を有するものであることを、確信的に実証している。
<実験の考察>
c−kitとマウスW座との間に対立遺伝子の関係があることの実証は、発生中、および成熟動物におけるc−kit受容体の多面作用を明らかにし、そのリガンドであるKLの同定を容易にした。更に、KLとマウススチール座との間の対立遺伝子関係に関する最近の発見は、W突然変異とSl突然変異との間の関係についての分子的認識を提供した。このことは、これら突然変異の相似的かつ相補的な表現型に基づいて、マウス遺伝学者によって予期されていたものである。この予期されたKLのトランスメンブラン構造は、KLの膜結合形および可溶形の双方が、c−kit機能において有用な役割を果たしていることを暗示するものである。本出願では、この推測に関する実験的証拠が提供されている。
第一に、KLの可溶形は、トランスメンブラン形の前駆体、即ちKL−1からの効果的なタンパク分解開裂により発生することを示している。第二に、KL−1およびKL−2の選択的にスプライスされたバージョン(スプライシングにより主なタンパク開裂部位が除去されたもの)も、効率的には多少劣るが、KLの可溶な生物学的活性形を同様に生成することが示されている。第三に、COS−1細胞におけるKL−1およびKL−2の開裂は、調節することが可能なプロセスである。第四に、KL−1およびKL−2は組織特異的方法で発現される。更に、生存可能なSld突然変異は、KLコード配列のC末端(トランスメンブラン領域を含む)を含む欠失の結果であり、この欠失はKLの生物学的に活性な分泌形を生じることが示された。Sld対立遺伝子を持つマウスの表現形は、c−kit機能における分泌形および細胞膜結合形の双方のKLについて、その役割に関する考えをさらに支持するものである。
c−kitとCSF−1Rとの進化論的に密接な関係のため、構造およびトポロジーの双方の点に関し、対応する成長因子(KLおよびCSF−1)の間の関係を予測することは妥当なものと言える。CSF−1・mRNAsの選択的にスプライスされた形は、トランスメンブラン領域のN末端配列、タンパクのリガンド部分とトランスメンブラン領域との間に位置する298アミノ酸のスペーサセグメントにおいて異なるタンパク生産物をコードすることが知られている(43)。更に、選択的にスプライスされたCSF−1・RNA転写物は3′非翻訳領域において異なる(21)。幾つかの組織におけるKL・RNA転写物の分析によって、選択的にスプライスされたKL・RNAが同定された。この場合にも、CSF−1における場合と同様に、推測されたリガンド部分とトランスメンブラン領域との間のスペーサが欠失されている。興味深いことに、この選択的にスプライスされたRNA生成物の発現は、組織特異的な仕方で制御される。KLおよびCSF−1のリガンド部分についての最近の比較分析では、限定的なアミノ酸ホモロジー、対応するエキソンの比較、並びに「エキソンにコードされた第2次構造」の適合性に基づいて、2つのタンパクの間の構造的類似性が指摘されている(4)。更に、4α−ヘリカル領域と、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残渣の重複は、KLおよびCSF−1のリガンド領域についての関連した3次構造を示唆している。また2つのタンパクのN末端シグナルペプチド、トランスメンブラン領域および細胞内領域に見られる類似性は、これらの領域が2つのタンパクにおいて重要な関連作用を果たすことを示唆している。これらの結果は、KLとCSF−1との間の進化的関連および構造的類似性の考えを強くしている。
KLの特異な特徴は、トランスメンブラン・タンパクとしての予測された三部構成構造である。KL、KL−1およびKL−2の形は、何れもトランスメンブランタンパクとして合成され、これらはタンパク分解開裂によりプロセッシングされ、可溶性で且つ生物学的活性形のKLを放出する。しかし、COS細胞システムで判定されるように、これら2つの形のプロセッシング工程は異なる速度論に従う。KL−1タンパクの分解開裂は非常に効率的であり、対照的にKL−2タンパクはより安定で、分解開裂に対し抵抗を示す。欠失エキソンによりコードされる配列、即ちアミノ酸174-201には、可溶性KLタンパクのC末端およびタンパク分解開裂部位が含まれる(27)。従って、可溶KL−2タンパクを発生するためには、おそらく第2の又は別のタンパク分解開裂部位が用いられ、この開裂には他のプロテアーゼが関与するかも知れない。COS−1細胞において、プロテインキナーゼC活性化剤PMAおよびカルシウムイオノファA23187によってKL−1およびKL−2のタンパク分解開裂が誘導されることは、異なる細胞型においては、このプロセスが別の調節を受け得ることを示唆している。興味深いことに、可溶性のKL−2タンパクは正常の生物学的活性を示し、これは欠失されたエキソンにコードされる配列は当該活性に関しては必須ではないことを示している。
一方において、膜結合バージョンであるKL−1およびKL−2は、細胞/細胞接触による信号を媒介するように機能し、或いは細胞接着分子として機能得る(19、26)。他方、KLの可溶形は拡散性ファクターであり、これは比較的短い距離あるいは長い距離に亘って目標細胞およびその受容体に到達する。しかし、KLの可溶形は又、FGF、LIFまたはint−1と類似した仕方で細胞外マトリクスにも結合し、または該マトリックス中に隠退され得るので、短い距離において膜結合形と同様に機能する(8、33、42)。細胞膜結合形であれば、KLは受容体を有する目標細胞との相互反応のための、高濃度の局在化信号を提供ないし維持することができる。これに対して、KLの可溶形はより低い可変濃度で信号を与え得る。c−kitは種々の細胞システムにおいて、細胞増殖、細胞移動、細胞生存、後有糸***機能を容易にすると思われる。CSF−1受容体系との類似性によれば、細胞生存機能および細胞移動は、細胞増殖機能よりも、該因子のより低い濃度を要求すると思われる(55)。KLの細胞膜結合形および可溶形は、c−kit機能の異なる側面において作用し得る。CSF−1受容体およびc−kitの両者は、夫々の細胞外領域のプロテインキナーゼCに媒介された分解的解放によって、下方調節され得る(13)。このプロセスの機能的意義は分かっていない、これら受容体から放出された細胞外領域は、CSF−1およびKLを中和してこれらの信号を調節するとの仮設が提出されている。何等かの方法で、KLのタンパク分解開裂はc−kit機能の下方調節をもたらし、従って、このれらのプロセスは相補的または類似的とみなす事ができる。要約すると、種々の細胞膜結合KL分子の合成、並びにKLの可溶形を生じさせるこれらのタンパク分解開裂は、発生中および成熟動物における種々の細胞形において、c−kit機能を制御ないし調節する手段を与える。
発生期および成熟動物における可溶形KLの役割を評価する独特の機会が、Sld突然変異の分子ベースでの特徴付けによって提供された。Sld対立遺伝子はKLタンパクの分泌バージョンをコードするが、トランスメンブラン領域およびKLのC末端を含む欠失の結果、膜結合形をコードしない。従って、Sld/SldおよびSl/Sldマウスの生物学的特徴は、KLの可溶形および膜結合形の役割についての手掛かりを与えるであろう。Sl対立遺伝子はKLゼロ突然変異であるから、Sl/Sldマウスは、Sldタンパクのみ生産する(11、38)。これらのマウスは生存可能であり、重篤な大赤血球貧血、組織肥満細胞の欠乏、コート色素の欠如および妊娠不能により特徴づけられる。これらの突然変位株表現型の殆どの特徴は、W/W vマウスに類似している(47、51)。しかし、幾つかの著しい相違が存在する。Sl/Sldマウスの貧血は、W/W vマウスよりも、血中酸素減少に対してより敏感なように見える(46、47)。W/W vマウスにおける配偶子形成に関しては、原始生殖細胞は増殖せず、またその移動も遅い(32)。Sl/Sld胎児においては、W/W v胎児に類似する原始生殖細胞は増殖しないが、残りの細胞は正しく移動し、発生の適当な時間に生殖腺***に到達するように見える(29、51)。これらの実験から、SldKLタンパク生産物は細胞移動を維持することができるが細胞増殖はできず、従ってKLの細胞膜形はc−kitの増殖応答に対し重要な役割を果たすであろうとの仮設を立てることができる。更に、Sl/Sld繊維芽細胞は、IL−3の非存在下での骨髄肥満細胞の増殖および繊維を支持せず、これは正常な胎児繊維芽細胞がこのような特性を有することと対照的である(16)。Sl/Sld繊維芽細胞が実際にSldタンパク生産物を合成するとすれば、Sl/Sld繊維芽細胞が肥満細胞の増殖を支持できないことは、一方では、これら細胞が放出する可溶性のKL−Sldタンパクの量が増殖の促進に十分ではないことを意味する。他方、これらの結果は、このプロセスにおける細胞膜結合形KLの重要な役割が存在することを示唆している。
IL-1、IL-3、G−CSF、GM−CSFとKLとの組合せ
我々は正常ネズミ骨髄の培養において、ネズミKL(組換えネズミc−kit・リガンド)を用いた。KL単独の場合は骨髄コロニーの刺激は殆ど観測されなかったが、KLとG−CSF、GM−CSF、およびIL-3とを組合せた場合には、コロニー数およびサイズの両方で実質的な増加が見られた。しかしながら、KLとM−CSFとの組合せでは、このような増加は見られなかった(103)。5-FU処置後24時間の骨髄を用いたHPP−CFCアッセイでは、サイトカイン類の組合せでコロニー刺激の増加が見られた。HPP−CFCの刺激において、KLにG−CSF、GM−CSF、IL-3、IL-7またはIL-6の何れかを加えることは有効であり、3種または4種の因子を組合せることは更に有効であった。IL-1、IL-6およびKLと組み合わせたCSF類またはIL-3は最も有効であった。図25は、5-FU処置後4日のネズミ骨髄の培養において、サイトカイン類の組合せによって刺激されたHPP−CFCを示す。2種のサイトカインの組合せ(IL-1に対してGM−CSFまたはIL-3の何れかを加えた組み合わせ)は、KLとIL-1の組み合わせ又はKLとIL-3の組み合わせと同様に、多数のHPP−CFCを刺激した。しかし、IL-1とKLとの組み合わせに対して、更にG−CSFもしくはIL-3の何れかを加えた3種の因子の組合せが最も有効であった。
初期増血細胞のデルタCFUアッセイまたは二次CFUアッセイ:ネズミ研究。デルタアッセイは、拘束された前駆体(committed progenitors)に乏しく且つ初期期幹細胞に富む骨髄を、幹細胞の生存、漸増(recruitment)、分化および膨脹(expansion)を促進させる種々のサイトカイン類の存在下で、短期(7日間)の懸濁培養を行うことを包含しており、前駆体細胞は第2クローン原性アッセイにおいて測定される。5-FU耐性の幹細胞は、単一のCSF刺激剤を用いた通常のCFU−GMアッセイの他に、複数のサイトカイン刺激剤を用いた一次HPP−CFCアッセイにおいて検定される。懸濁培養の後、二次HPP−CFCおよびCFU−GMアッセイが行なわれる。3つのパラメータを型通りに測定する。その第1は、一次培養において単一のCSF種(例えば、G−CSF)に応答する全CFU−GM(インプット)を、二次培養において同じCSF種に応答する二次CFU−GMの全数で割った値によって決定される、系列限定前駆体の増幅である。第2は、二次アッセイにおけるCFU−GM前駆体の全数で割ったHPP−CFCインプットの比である。CFU−GMは、早期前駆体(即ちHPP−CFC)に由来すると考えられているので、この比は幹細胞の前駆体細胞への分化の指標を与えてくれる。最後に、二次HPP−CFCの全数で割ったHPP−CFCインプットの比を決定する。このパラメータは、特に一次培養および二次培養におけるHPP−CFC刺激剤がIL-1、IL-3およびKLの組合せである場合には、幹細胞自己再生(self-renewal)の最良の尺度である。
KLが入手可能になる前の初期の研究においては、単一のCSF種に応答するCFC−GM、並びにHPP−CFC-1および-2の数の様々な程度の膨脹が、IL-1をM−CSFと組み合わせた場合(20ないし30倍増加)、IL-1をG−CSFと組み合わせた場合(50ないし100倍増加)およびIL-1をIL-3と組合せた場合(200倍増加)に見られ、またGM−CSFも限られた程度ではあるが前駆体細胞数の膨脹を示したが、M−CSFおよびG−CSFではそのような膨脹は見られなかった。IL-6は、M−CSF、GM−CSFまたはG−CSFとの相乗作用においてはIL-1よりも有効性に劣っていたが、IL-3との相乗作用においては同等の有効性を有していた。IL-1+IL-6は、3種のCSF類およびIL-3との間に、相加的もしくは超相加的(supradditive)な相互作用を示した。KL(ここに記述された通りに調製され、或いは、1992年1月9日に発行されてImmunex Corporationに譲渡された“肥満細胞成長因子”と題するPCT国際出願WO 92/00376号、又は1992年4月24日に発行されAmgen Incに譲渡された“幹細胞因子”と題する欧州特許出願423 980に記載されている通りに調製されたもの)が懸濁培養相に存在する場合には、前駆体細胞生成のわずかな増幅のみが生じたが(図26)、GM−CSF、IL-3またはIL-1と組合わされた場合には200〜800倍の増幅が起こった。IL-1およびKLに対して、GM−CSFもしくはIL-3の何れかを組合せることは、前駆体の増幅により有効であった。また、IL-1+KL+IL-6に対してIL-3もしくはGM−CSFの何れかを組み合わせた4因子の組合せによって、前駆体細胞は2,500倍にまで増加した。前駆体細胞生成は、CFU−GMアウトプットに基づいて計算された。HPP−CFCインプットは、3因子の組合せ(IL-1+KL+IL-3もしくはCSF類)によって6,000〜10,000の比がもたらされ、(IL-6を含む)4因子の組合せによって8,000〜15,000の比がもたらされることを示した。自己再生の尺度としての、HPP−CFCインプットの比として表わされる二次HPP−CFC-1の産生は、KLに対してIL-1、IL-3もしくはCFS類を組み合わせた2因子の組合せによって50〜700の値に達し、またIL-1+KLに対してIL-6、IL-3もしくはCSF類を組み合わせた3因子の組合せでは700〜1,300の値に達した。
IL-1+IL-3+KLの組合せに晒された、富化HPP−CFCの7日間培養において産生した全分化細胞に基づいて、図27は劇的な増殖が得られたことを示す。これには、二次HPP−CFC-1産生によって測定された自己再生成分、低増殖能力CFU−GMによって測定された前駆体細胞産生物、および形態学的に同定可能な分化骨髄細胞が含まれる。単一の前駆体からこれらの細胞を産生するのに要する細胞数倍加時間は、公知の哺乳動物細胞増殖速度の限界に達している。この増殖が、HPP−CFCより早期のより希な細胞によって維持されているならば、必要とされる個体数倍加時間はより短くなるであろう。この短期培養におけるHPP−CFCの増幅は、長期の再構築細胞(reconsutituting cells)の比較し得る膨脹には反映されないようであり、また大部分のHPP−CFC、より短い個体数倍加時間が必要となるであろう。HPP−CFCの増幅は長期再構築細胞の比較し得る膨脹には反映されないようであり、産生したHPP−CFCの大部分はむしろ幹細胞階層内のより後の段階を表わすようである。また、D12のCFU−Sアッセイは、IL-1をIL-3もしくはKLと組合わせて用いた7日間の懸濁培養後の数において、絶対的な増加をも示した。他の研究者は、同様の懸濁培養において、CFU−GEMMの前駆体(恐らく、長期再構築幹細胞)もまた、IL-1+IL-3の存在下では増幅するが、IL-6とIL-3もしくはGM−CSFとの組合せでは増幅しないことを示している。
早期増血細胞のデルタアッセイまたは二次CFUアッセイ:ヒト研究。ヒトにおいて、骨髄の4-HC処置は、イン・ビトロ・コロニー形成によってGM−CDFに直接応答できる前駆体の大部分を枯渇させるが、コロニー形成が可能な幹細胞を保持し、かつ骨髄移植の流れの中で造血系再構築が可能な幹細胞を保持することが示されている。基本的な移植研究において、CD34+選別もまた長期再構築可能な骨髄細胞を増加させた。4-HC処置と免疫細胞付着によるCD34+細胞の選別とを組み合わせた後、G−CSFもしくはGM−CSFに応答した初期コロニー形成は非常に低かった。しかしながら、7日間の懸濁培養の後にGM−CSFで二次再クローニングを行なうことによって、処置骨髄細胞を懸濁液中で7日間IL-1およびIL-3の組合せにさらすと、最大数の二次CFU−GMが一貫して産生されることが示された。IL-3およびIL-6は、IL-3単独よりも有効性が劣ることはなかったが、他のサイトカインの組合せは有効性がかなり劣っていた。このアッセイにおける二次コロニー形成は、IL-1とKLとの組合わせ、KLとIL-3との組合せで最大限に促進され、3種のサイトカイン全ての組合せは前駆体細胞産生の増幅において最も有効であった。
c−kit・リガンド(KL)とIL-1βとの間、およびIL-6と他の造血性因子との間の相互作用
5-FUを用いたBMのイン・ビトロ・パージングは、静止状態の造血前駆体細胞を殖やすための簡単な技術である。一回投与量の5-FUは、24時間以内に、早期出現CFU−Sおよびより成熟したCFU−C個体群の数を99%を越える率で減少させる一方、BMのより始原的な前駆体を増加させる。後期出現CFU−Sもまた、5-FUでのBMパージングに対して感受性であり、このことは更に、これら細胞が長期BM再構築に応答し得る幹細胞と同じでないことを示唆している。これとは反対に、BM再構築幹細胞は、5-FUの細胞毒性効果に対して耐性であることが示されている(105)。ブラッドレー及びホジソン(Bradley and Hodgson)は、5-FUでパージしたBMを用いて、寒天培養において高度に細胞性の巨大コロニーを形成し得る前駆体細胞分画(compartment)、即ちHPP−CFCを同定した。
我々は、始原ネズミ前駆体細胞分画に対する、IL-1、IL-6およびKLの相互作用を調べた(104)。我々は、クローン原性培養を用いて、これらの因子の相互間またはCSF類との組合せにおける相乗効果および相加効果の証拠を提示する。我々の結果は、IL-1、IL-6およびKLが、初期造血の刺激において独特の作用をすることを示唆する。クローン原性培養でのこの発見が、以前に記載されている短期液体培養アッセイ、Δ−アッセイを用いて更に実証されている。我々は、IL-1、IL-6およびKLの能力を示し、初期および後期の造血前駆体分画の膨脹を規定する。
<材料および方法>
マウス: 雄および雌(C57BL/6 X DBA/2)F1(B6D2F1)マウスを、Jackson laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。該マウスは、層流状態下で飼育され、また酸処理および/またはオートクレーブ処理された飲料水が与えられた。歩哨マウスはコロニーと共に檻に収容され、特異的病原についての観察がなされた。使用されたマウスは全て、少なくとも週齢8週間のものであった。
骨髄調製物および組織培養条件: 正常マウス(NBM)または5−FU処理されたマウスのBMは、一回の実験につき少なくとも3匹マウスの大腿骨および時には脛骨より得た。マウスは、150mg/kg、150〜250μlの容量で、5−FUの静脈内注射によるで処理を受けた。BMは、培養前に遠心分離によって二回洗浄された。特に注記しない限り、BMの全ての取扱い及び培養は、20%FCS(HyClone Laboratories Inc., Logan UT)及び0.05%mg/mlのゲンタマイシン(Gibco)を補充したIMDM(Gibco,Grand Island, NY)を含む培養培地中で行われた。BM細胞はクールター計測器モデルZBI(coulter Electronics, Hialeah, FL)を使用して数えられた。プラスチック容器は全て組織培養グレードのものであった。
サイトカインおよび抗体: 精製されたrhIL−1β、sp act=1.32×107U/mg(Syntex Laboratories, Inc.,: Palo Alto, CA)を、100U/mlで使用した。部分的に精製されたrhIL−6および精製されたrhIL−6は、Steven Gillis(Immunex Corporation, Seattle, WA)の好意によって提供された。この部分的に精製されたIL−6は3000 CESSU/ml、精製されたIL−6は50ng/mlで使用した。精製KLは、ここに記載のように調整されたか、或いは上記で記載したようにして調整された。精製rhG−CSF(Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA)は、1000U/ml(sp act=1×108U/ml)で使用した。精製rhM−CSFは、1000U/ml(Immunex)で使用した。rmIL−3を含む馴し培地は一時的にトランスフェクトされたCOS細胞から調整され、他の成長因子と同様に、最大のCFU−C刺激をもたらす濃度で使用された。ラット抗マウスIL−6モノクローナル抗体はGenzyme(Cambridge,MA)から購入した。
CFU−C分析: LPP−CFC分析は、サイトカイン類および0.36%アガロース(SeaPlaque; FMC, Rockland, ME)を含む培地中に懸濁された、1mlの5×104NBMを含んだ35mmペトリ皿中で行なわれた。このような培養物を、37℃で十分に加湿された5%CO2雰囲気中で7日間インキュベートした。HPP−CFC分析は、前述したような二重層アガロース系を使用して行われた。培養培地、サイトカイン類および0.5%のアガロースからなる2mlの下層を含む60mmペトリ皿に、1日から8日前に5−FU処置したBM(d1−d8・5−FU・BM)1mlを重層し、これを1×103〜1×105細胞/培地の範囲の細胞濃度におけるHPP−CFCについて分析した。二重層培養物を、十分に加湿した5%CO2雰囲気中および7%O2の雰囲気中において、37℃で12日間生育させた。ペトリ皿は、少なくとも50細胞を含む低増殖性コロニー(LPP−CFC)と、少なくとも直径0.5mmの高細胞性高増殖性コロニー(HPP−CFC)について評価された。全てのCFU−Cは、3回の培養から計数された。
CFU−S分析: マウスは、約90Gy/分の照射速度において、137Csγ−線源からの1250Gyで照射された。この1250Gyは3時間の間隔を明けて二回に別けて照射され、最初は800Gyが照射され、次いで450Gyの照射が行われた。最終照射の2−3時間後に、BM細胞が静脈内注射された。BM移植の12日後に、Bouin′s溶液中に固定された脾臓について、遅れて出現するCFU−Sが計数された。
デルタ(Δ)分析: 懸濁培養は、前述したように行なわれた。2.5×105の[d1・5−FU・BM細胞]/mlからなる4つΔ培養物1mlを、24ウエルクラスタープレート中で作成し、これを十分に加湿された5%CO2雰囲気中において、37℃で7日間、成長因子の存在下でインキュベートした。一週間たった培養物から、激しいピペット操作を行った後、非付着性細胞を採収した。四つのΔ培養物から再懸濁されたBM細胞を貯蔵し、その1mlは、培養の細胞性(culture cellularity)を決定するために使用された。残りの3mlの細胞は、遠心分離によって洗浄した(5mlの下層のFCSを通して)。洗浄された細胞は、第二次のLPP−CFC,HPP−CFCおよびCFU−Sについて分析された。G−CSF、GM−CSFおよびIL−3に反応する二次LPP−CFC測定は、7日目のCFU−C培養物中で行われた。IL−1およびIL−3に反応する二次HPP−CFCおよび二次LPP−CFCは、12日後に、HPP−CFCの増殖について記載した条件下で計数された。二次CFC−Cの測定のために、Δ培養物からの細胞が20-2000倍に希釈された。一週間増殖させた後のΔ培養物中に存在するCFU−Sの数を、2-200倍に希釈された洗浄細胞をマウスに移植することによって測定した。
Δ培養後における、BM前駆細胞ポピュレーションの倍増値をΔ値とした。懸濁培養と平行して、出発物である[d1・5−FU・BM]ポピュレーション中に存在する一次のLPP−CFC、HPP−CFCおよびCFU−Sの数が測定された。Δ値は、二次のLPP−CFC、HPP−CFCおよびCFU−Sの全アウトプットを、一次のLPP−CFC、HPP−CFCおよびCFU−Sのインプットで割ることによって決定された。
付着性細胞除去後のΔ分析: 25cm2の組織培養フラスコ中において、2.5×105[dl・5−FU・BM]細胞/mlのΔ培養物12.5mlが作成した。培養開始前に、BMを37℃で4時間、培地中で1回インキュベートすることによって、付着性細胞ポピュレーションを枯渇せしめた。非付着性細胞を25cm2の第二フラスコに移して、両方の細胞ポピュレーションをΔ培養のための上記条件下で維持した。
サイトカイン活性分析: 25cm2の組織培養フラスコ内で生育された培養物のΔ培養上澄液を、遠心分離によって採収した。dl・5−FU・BM、付着性細胞を除いたBMおよびBM付着性細胞を用いて樹立された培養物から、上澄液が採収された。IL−6活性は、以前に記載したネズミハイブリドーマB9細胞増殖分析を用いて測定された。サイトカイン活性も又、成長因子依存性造血細胞系NFS−60を使用して測定された。成長因子活性に反応したNFS−60細胞の増殖は、前述したように測定された。
統計: 有意率は、二方向対スチューデントt検定(two-way paired Student′s t-test)を用いて決定された。
<結果>
NBMに対するIL−1、IL−6およびKLの活性
NBMからのコロニー形成に対する、G−CSF、M−CSF、GM−CSFおよびIL−3と、IL−1、IL−6およびKLとの組み合わせによる影響を図1に示す。IL−1、IL−6、KLおよびIL−1プラスIL−6に反応したコロニー形成は最小であった。IL−1の刺激をM−CSF、GM−CSFまたはIL−4と組合わせた場合には、CSF′s単独で観察されるよりもコロニー形成が増大し、最も顕著には、反復研究で一貫してみられたIL−1およびM−CSF刺激の相加的効果(additive efects)よりも大きかったことである。CSFを含有培養物にIL−6を追加すると、コロニー形成は相加的に増大した。IL−1プラスIL−6の組合せは、この組合わせ単独または更にCSF′sを組み合わせた場合にも、相加的増殖より大きくコロニーを増殖させるような顕著な効果は得られなかった。IL−1、IL−6、G−CSF、GM−CSF、またはIL−3を含んた培養にKLを添加すると、相乗的にCFU−Cを刺激した。KLは、M−CSFとは相乗的に作用しなかった。IL−1プラスKLで刺激された培養物、またはIL−6プラスKLで刺激された培養物に対するCSFの添加は、コロニーの相加的増殖またはそれ以下のコロニー増殖がみられた。
IL−1,IL−6およびKLの、5−FU・BMに対する活性
マウスに対する1回の5−FU投与から1〜7日後の、HPP−CFCおよびLPP−CFCの回復を図2および3に示す。LPP−CFC同様に幾つかのHPP−CFCが一貫して検出されたが、IL−1および/またはIL−6刺激に反応して、コロニーは少ししか成長しなかった。系列に限定された(lineage restricted)CSF′s(G−CSFおよびM−CSF)は、HPP−CFCを刺激する能力が小さいが、GM−CSFおよびIL−3は、HPP−CFCおよびLPP−CFCの両方を刺激することが出来た。HPP−CFCを最高に刺激するには、成長因子を組み合わせることが必要であった。
kitリガンドは、検出可能なコロニー刺激活性を殆どもたず、1×104個のd7・5−FU・BM細胞から、平均1.3のHPP−CFCおよび2.7のLPP−CFCのコロニーが刺激されるに過ぎない(図30)。本研究の殆どにわたって使用されたKLの濃度は、20ng/mlであった。この濃度のKLは、IL−1およびIL−6の存在下において、高増殖性のコロニー形成を促進する。1ng/mlのKLでは平均6.7コロニーが観察されたが、10-100ng/mlのKLでのコロニー数は、2.5×104個のd4・5−FU・BM細胞当たりで、120-147 HPP−CFCの範囲のプラトー値に達した(データ表示せず)。G−CSF含有培地にKLを添加すると、d1およびd7の5−FU・BMポピュレーションは両者共、LPP−CFCの数を増加させたのみならず、d1・5−FU・BM・におけるHPP−CFCの数を増加させた、HPP−CFC刺激に対するKLとG−CSFとの間の相乗効果は、d4・5−FU・BMの培養において顕著であった(データ表示せず)。KLプラスM−CSFの組み合わせは、超相加的なコロニー形成を生じなかった。しかしながら、GM−CSFおよびIL−3の存在下におけるHPP−CFCの刺激において、KLは強い相乗効果を示した。IL−3プラスKLは、d1及びd7の5−FU・BMポピュレーションの両者において、IL−1プラスIL−3よりも、大コロニーを形成するための刺激剤としてはより効果的であった。IL−3含有培地にKLを添加すると、d1及びd7の5−FU・BMにおいて、夫々、HPP−CFCの数は6倍から35倍に増加した。
IL−1,IL−6またはKLは、応用可能なCSF活性を持たないけれども、IL−1,IL−6、またはIL−1プラスIL−6を含有する培養物に対してKLを添加すると、HPP−CFCの成長促進において、これら因子間に劇的な相乗効果が生じた(図30)。IL−6またはIL−1に対するKLの組合せは、夫々、1×105個のd1・5−FU・BM細胞の平均4.0および13.7の高増殖性コロニーを刺激した。更に、3つのサイトカイン類の全てに反応して、1×105個の細胞当たりで、平均42.0のHPP−CFCが刺激された。これらの結果は、HPP−CFCのサブポピュレーションが存在し、このサブポピュレーションは大コロニー形成のためにIL−1、IL−6プラスKLの刺激を必要とすることを明瞭に示している。これら成長因子の組み合わせに対するd7・5−FU・BMの反応は、d1・5−FU・BMのこれら成長因子の組み合わせに対する反応と類似していた。しかし、d7・5−FU・BMにおいて、IL−1、IL−6プラスKLによって刺激されるHPP−CFC割合は、この3つの因子の組み合わせに対して更にGM−CSFを添加することによって刺激され得るHPP−CFCの最大数の1/10よりも少なかった。d1・5−FU・BM細胞ポピュレーションにおいて、この相違は余り劇的ではなく、4つのサイトカインの組合わせによって刺激されたHPP−CFCの最大数が、IL−1、IL−6プラスKLの3つの因子の組合わせによって刺激される数の二倍より僅かに多い程度にすぎなかった。
KLおよびCSF′sの組み合わせを含む培養物に対してIL−6を添加しても、IL−6、KLおよびCSFの内の二つの因子の組み合わせによる相加的効果と考えられるコロニー数を上回るほどには、大コロニーの形成を増大しなかった(図30)。例えば、IL−6,KLプラスGM−CSFの組み合は、1×105個のd1・5−FU・BM細胞当たり、約30の高増殖性コロニーを生じさせた。これら30のHPP−CFCのバルクは、IL−6に刺激された培養と、KLプラスGM−CSFに刺激された培養とで観察されたコロニー(夫々、4及び20のHPP−CFC)を合わせたものと考えられる。このことは、IL−6、KLプラスCSFを組合わせても、更なる追加のHPP−CFCを活性化して増殖させることはないということを示唆している。
IL−6についての上記結果とは対照的に、KLおよびCSFを含む培養に対してIL−1を添加すると、相乗効果を示した(図30)。この相乗効果は、IL−1、KLプラスG−CSFの組合わせの中で生育された、d7・5−FU・BMの培養において最も顕著であった。これら3つのサイトカインるの内の何れの二つの因子の組み合わせても、刺激されたHPP−CFCは5以下であった。しかるに、IL−1、KLプラスG−CSFの組合わせでは、1×104個のBM細胞当たりについて、平均100 HPP−CFCが生じた。顕著ではないが、d7・5−FU・BMの刺激において、IL−1、KLプラスGM−CSF(またはIL−1)間に相乗効果が見られた。また、これらの超相加的効果は、IL−1,KLプラスG−CSF(またはM−CSF)を組み合わせたd1・5−FU・BM細胞ポピュレーションにおいても明らかであった。しかし、IL−1,KLプラスGM−CSF(またはIL−3)の組み合わせによって刺激されたd1・5−FU・BM中に存在する多数のHPP−CFCは、異なったHPP−CFCの細胞ポピュレーションに対してこれら成長因子が付加的に影響した結果であるかもしれない。
上記に述べたように、4つの成長因子の組合せによって多数のHPP−CFCが刺激されたが、IL−1,IL−6、KLプラスGM−CSF(またはIL−3)での刺激が最適であった(図30)。IL−1,IL−、KLプラスGM−CSFの組み合わせは、3%を越えるd7・5−FU・BM細胞を刺激して、高増殖性コロニーを形成することができた。IL−1,IL−6、KLプラスM−CSFのサイトカイン混合物でのみ、HPP−CFCの増大が観察された。これは、もっと少数のサイトカインの組み合わせでは観察されない追加の大コロニー増殖の促進において、4つの全ての成長因子が相乗効果を奏したことによると思われる。IL−1+KL+G−CSF(又はGM−CSF若しくはIL−3)のサイトカイン類の組合わせに対してIL−6を添加しても、超相加的なコロニーの形成は生じなかった。IL−1、IL−6、KLおよびG−CSF(又はGM−CSF若しくはIL−3)の組合わせによって刺激される高増殖性コロニーの数は、殆どの場合に、IL−1、KLおよびG−CSF(又はGM−CSF若しくはIL−3)の組み合わせによって刺激されるHPP−CFCの数に比較して有意に大きくはなかった。
Δ培養物における5−FU・BMの膨脹
Δ培養において7日間増殖させた後に回収された非付着性細胞の数は、5−FU・BMのクローン培養物において種々のサイトカインの組み合わせについて見られる反応パターンを反映していた(図31)。サイトカインの刺激を受けないd1・5−FU・BMの対照培養は、単球/マクロファージの生存細胞ポピュレーションが優勢になるに従い、培養の細胞性において平均39%低下した。IL−1、KL−6またはKLの単独添加によっても、細胞の回収は、インプットのレベルを越えて増加しなかった。GM−CSFおよびIL−3に対する反応において若干増加したことを除けば、多数のサイトカインよって刺激された培養においてのみ、その細胞数は増加した。最大の増殖は、IL−1、KLプラスGM−CSF(またはIL−3)の組合わせによって刺激された培養において得られ、これらの培養に更にIL−6を加えても、細胞回収に著しい増加はなかった。未成熟ミエロイド細胞の出現は、Δ培養で観察された増殖と相関しいた。一つの実験において、IL−3で刺激された培養物中には、約50%の成熟分化した好中球およびマクロファージと、25%のメタ骨髄球と、20%の骨髄球と、3%の芽細胞を含まれていた。芽細胞のパーセンテージは、IL−3を含有する培養物に対して、夫々IL−1(22%)、IL−6(18%)、KL(24%)、IL−1プラスIL−6(12%)、IL−1プラスKL(51%)、IL−6プラスKL(43%)、およびIL−1,IL−6プラスKL(46%)を添加することにより増加する。全芽細胞の最大数は6.1×105個であり、IL−1、KL、およびIL−3によって刺激された培養物から回収された。その数は、最初のd1・5−FU・BM細胞ポピュレーションを200倍上回るオーダーを示した。
サイトカインを添加せずに生育させた対照Δ培養物では、LPP−CFCの前駆細胞ポピュレーションはインプット値を越えて増加されなかった(図32)。コロニー刺激因子G−CSF、M−CSF、GM−CSF、IL−3の添加により増殖がおこった(平均Δ値は、夫々3.4、2.4、23および140)。IL−1単独で、LPP−CFCは60倍を越えて刺激された。IL−1およびCSF′sの刺激を組合わせると、LPP−CFCの相乗的増大がもたらされた。例えば、IL−1プラスIL−3の平均Δ値は520であったのに対して、推定される相加的Δ値は140(IL−3)+63(IL−1)=203である。IL−6での刺激は、小さいが有意なLPP−CFCの増大をもたらした(Δ値=3.4;p<0.01)。IL−6プラスG−CSFおよびIL−6プラスIL−3の組み合わせにおいて、相加的効果よりも大きい効果が得られた。KLは、Δ培養物からのLPP−CFCの回収を顕著には増加させなかった(p=0.08)。しかし、すべての場合において、KLとCSF′sの組合せによる刺激の効果は、相加的効果よりも大きかった。KLプラスIL−3の組合せは、IL−1プラスIL−3と同様、LPP−CFCの増大において効果的であった(夫々の平均Δ値=485および520;p=0.21)。CFC類と組み合わせたIL−1プラスIL−6で刺激すると、Δ培養は全てのの場合において、IL−1またはIL−6によって刺激された培養よりも高いΔ値を示した。IL−1,IL−6プラスCSFの全ての組合せにおいて、LPP−CFCの増大は相加的であったが、IL−1、IL−6プラスM−CSFで刺激された培養は例外であった(Δ値=300;比較として、IL−1プラスM−CSFのΔ値=140、IL−6プラスM−CSFのΔ値=2.8)。IL−6プラスKLは、LPP−CFCの増大の刺激において相乗的に作用し、LPP−CFCの増大を200倍にした。しかしながら、CSFを含有する培養物へこれら二つのサイトカイン類を添加しても、前駆細胞の相加的な増大しかもたらされなかった。IL−1およびKLは、一緒にすると相乗的に刺激し、1000倍を越えるLPP−CFCの増大をもたらした。IL−1プラスKLを含有する培養物に対して、G−CSF、GM−CSFまたはIL−3を添加すると、LPP−CFCの拡大は更に増加した(夫々の平均Δ値=1100、1200および1400)。IL−1,IL−6,KLプラスCSF′sの組合せによって、最大のLPP−CFCの拡大が達成された。IL−1、IL−6、KLプラスIL−3によって刺激されたΔ培養においては、1800倍を越えるLPP−CFCの増大が示された。IL−IプラスKLを含有する培養物にIL−6を添加すると、Δ値は増加するが、観察される前駆細胞の増殖を有意に増やすことはなかった(p>0.05)。
Δ培養物におけるHPP−CFCの増大
異なるサイトカイン類の組合による、HPP−CFCの増大を刺激する能力をテストした(図33)。LPP−CFCの増殖の場合のように、IL−1,KLプラスCSFの組合せで刺激されたΔ培養物中において、HPP−CFCの最高の増大がみられた。CFC類単独による刺激は、HPP−CFCの中程度の増加を刺激されたのみであった。IL−6は、HPP−CFCを刺激して増加させた。更に、IL−6プラスIL−3の組み合わせによる刺激は、IL−3単独よりもHPP−CFC増大により効果があった。IL−6とは対照的に、IL−1は4つの全てのCSF′sとの組み合わせにおいて相乗効果を示した。KLもまた、4つの全部のCSF′sとの組み合わせにおいて、相加的増殖よりも大きなHPP−CFCの増殖を促した。CSF′sの有無に関係なく、IL−1プラスIL−6の組合せは、IL−1またはIL−6何れか単独の場合よりも、HPP−CFCの増殖により効果があった。IL−1プラスIL−6を用いて相乗効果が得られた端的な例は、M−CSFを組み合わせた場合であった(平均Δ値は、IL−6プラスM−CSFでは1.0;IL−1プラスM−CSFでは13.2;IL−1プラスIL−6プラスM−CSFでは65.7)。KLを含有するΔ培養物に対してIL−lまたはIL−6を添加すると、これら組合わせを単独で用いた場合でも、更にCSF′sと組み合わせた場合でも、相加的な増加よりも大きいHPP−CFCの増大をもたらした。KL含有培養物に対して、CSF′sをIL−2またはIL−6と共に添加しても、夫々の場合にはΔ値を増大させるにも拘らず、HPP−CFCの増大に顕著な増加はなかった。IL−1、IL−6プラスKLで刺激された培養において、最大のHPP−CFCの増大が得られ(Δ値は705)。
Δ培養物中に産生された二次HPP−CFCは、IL−1プラスIL−3で刺激されたクローン原性試験において、常法的により分析された(図33)。IL−1プラスGM−CSF、またはIL−1プラスM−CSF等のようなサイトカイン類の他の組合せについて、二次HPP−CFCを刺激する能力があるかをテストした。IL−1プラスM−CSF(またはGM−CSF)の存在下で成長された二次HPP−CFCのカウントは、HPP−CFC数に比較して、これらサイトカイン類の組合せによって刺激された二次LPP−CFCが大量に存在することによって妨害された。二次HPP−CFCの刺激剤として、IL−1およびKLの有効性もテストされた(図34)。テストされたサイトカイン類の何れの組合せとも違って、IL−1プラスKLの組合わせに反応する前駆細胞は、IL−1プラスIL−3に反応性のHPP−CFCおよびLPP−CFCの増大を刺激するΔ培養においては、劇的には増大しなかった。
Δ培養物中でのCFU−Sの増大
Δ培養の後に出現するBM細胞ポピュレーションを更に特徴づけるため、Δ培養においけるサイトカイン刺激に応答したCFU−Sの増大を調べた(図35)。IL−1、IL−3、IL−1プラスIL−3、またはIL−1プラスKLの存在下で生育された培養物は、図32および33に提示した結果と一致して、HPP−CFCおよびLPP−CFCの増加を示した。これらの培養はまた、HPP−CFCの増加よりも高いCFU−Sの増加を示した。IL−1プラスIL−3、およびIL−1プラスKLは、遅れて出現するCFU−Sの数の100倍を越える増加を刺激した。これらの結果は、5−FU処理からの回復期にあるマウスで起こることが知られている、HPP−CFCおよびCFU−Sの増大に匹敵する。in vivo増大(Δin vivo)は、d8・5−FU・BMにおける全大腿骨のHPP−CFC、LPP−CFCおよびCFU−Sを、d1・5−FU・BMの大腿骨につき観測される全コロニーで割ることによって測定された。前駆細胞のin vivo増大は、in vitroΔ培養で観察された増大と同様であったが、LPP−CFCのin vivoの増加はin vitroで観測されたものより低かった。
<考察>
これらの研究は、IL−1、IL−6およびKLが、始原造血細胞の調節因子としての役割を有することを実証している。これらのサイトカイン類は、単独の場合には、我々のクローン培養試験においてマウス造血前駆細胞の増殖を刺激する能力に限界がある(図29−30)。しかしながら、コロニー成長の刺激において、IL−1、IL−6およびKLの間の相乗効果が実証された。IL−1、IL−6およびKLに対してコロニー刺激因子を組合せた系統だった分析によって、我々は、5−FUでパージされたBM中に存在するHPP−CFCおよびLPP−CFCの細胞ポピュレーションを区別することができた。始原造血細胞によるコロニー形成を調節するというIL−1、IL−6および/またはKLの能力は、d1・5−FU・BMの短期液体培養を用いた実験によっても裏付けられた。サイトカイン刺激剤に反応する前駆細胞ポピュレーションの束密度(flux)を測定できるΔ試験によって、LPP−CFCおよびHPP−CFCの最高増大は、初期造血性前駆細胞に対するIL−1、IL−6、KLおよびCSF′sの相乗的相互作用に依存することが実証された(図32−35)。
初期造血作用における調節因子としてのIL−1の重要性は、IL−1が、膀胱癌細胞系5637の馴し培地中に存在する相乗作用をもった活性物質(ヘマトポエチン1)として同定されたときから知られていた。以前に報告された結果と一致して、我々は、IL−1が、HPP−CFCの促進に際してG−CSF、M−CSF、GM−CSF、IL−1またはKLと相乗作用を示すことを示した(図29および30)。始原造血細胞の増殖を促進するIL−1の能力は、Δ試験でも観察された(図31−33)。G−CSF、M−CSF、GM−CSF、IL−3又はKLと組合わせた場合のIL−1の相乗作用活性は、液体培養において全細胞数、骨芽細胞数、LPP−CFC数およびHPP−CFC数の増大を促進する能力があることから明らである。幾つかの研究によって、IL−1プラスIL−3、G−CSF、M−CSF、GM−CSFのサイトカイン類の組合せが示唆されている。Δ培養において、IL−1プラスIL−3の刺激は、LPP−CFCおよびHPP−CFCを、夫々520倍および83倍にまで増大させることができた。この前駆細胞ポピュレーションの増殖は、IL−1プラスG−CSF、M−CSFまたはGM−CSFによって刺激された増大よりも大きかった。しかしながら、d1・5−FU・BMの増大においては、IL−1プラスIL−3よりも、IL−1およびKL間に見られる相乗作用の方がより有効な刺激であった。
IL−1プラスKLで刺激されたΔ培養は、LPP−CFCの数を1000倍を上回って増加させ、またHPP−CFCの数を280倍に増加させた。
IL−6の造血活性は、IL−1の造血活性と異なることが分った。IL−6プラスIL−3またはKLの組合せは、d1〜d7の5−FU・BMからのHPP−CFCの刺激において相乗効果がある事がわかった(図30)。IL−6およびKLもまた、NBMからのCFU−Cの刺激において相乗作用を有していた(図28)。このΔ試験で、LPP−CFCおよびHPP−CFCの増大において、IL−6とIL−3またはKLの何れかとの間の相乗作用が実証された(図5および図6)。HPP−CFCの増大においては、IL−6プラスIL−3の組み合わせは、IL−1プラスIL−3の組み合わせほどには効果的でなかった(夫々のΔ値=40および83)。IL−1、IL−6およびM−CSFの3因子の組合せは、d1〜d7の5−FU・BMからのHPP−CFCの刺激において相乗効果がみられた。更に、Δ試験によって、IL−1、IL−6プラスM−CSFに応答したLPP−CFCおよびHPP−CFC細胞ポピュレーションの増大において、相乗作用がある事が実証された。IL−1、IL−6プラスKLのサイトカインの組合せは、d1およびd7の5−FU・BMからのHPP−CFCの成長促進において、相乗的に作用した。IL−1、IL−6プラスKLをΔ培養に添加した場合にも、最も大きいHPP−CFC増大が観察された(Δ値=705)。IL−1、IL−6、KLおよびCSF′sの間のこれら相乗的相互作用のパターンは、多分化能を有する造血前駆細胞の調節にIL−1、IL−6、およびKLがユニークな役割を果たすことを示している。
本研究に見られた初期造血前駆細胞に対するKLの刺激効果は、KL遺伝子のクローニングに役立つ幹細胞増殖活性と一致している。IL−1、IL−6、G−CSF、GM−CSFまたはIL−1に対するNBM前駆細胞の応答反応において、KLとの組合せによる相乗作用が示された(図28)。以前報告したように、KLは、M−CSFに応答したNBMからのコロニーの形成を高めはしなかった。同様の反応パターンが、5−FU・BMを用いて観察された。即ち、KLはIL−1、IL−6、G−CSF、GM−CSF、またはIL−3と相乗的に作用する、M−CSFとは相乗作用しない(図30)。IL−1プラスKLについて観察されるHPP−CFC刺激の劇的な相乗効果は、CSF′sの添加によって更に増大され得るかもしれない。最も顕著な相乗作用は、d1およびd7の5−FU・BMを培養した際に、IL−1,KL,およびG−CSFの間に見られる相乗作用であった。IL−1,IL−6,KLプラスCSFの4つのサイトカイン類の組合せによって、最適な造血性反応が観測された。このIL−1、IL−6、KLプラスM−CSFの組合せのみが唯一、HPP−CFCの相乗的4因子増殖刺激であった。IL−1、IL−6、KLプラスGM−CSFまたはIL−3の組合せは、殆どのHPP−CFCを刺激し、Δ培養中においてで最大の細胞増殖をさせ、Δ培養中でLPP−CFCの最大の増大をさせた(図31−33)。これらの結果は、初期造血細胞の増殖の調整におけるKLの重要性を実証している。
HPP−CFCは、その成長因子要求性および/または物理的分離技術に基づいて区別される階層性(hierarchy)を示す。初期造血細胞の二つの区分(HPP−CFC−1、HPP−CFC−2)の同定は、ミトコンドリア染色剤ローダミン123の保持に基づく前駆細胞の分離に関係している。ローダミン123に鈍感な細胞は、その細胞増殖にIL−1,IL−3およびM−CSFの相乗的相互作用を必要とする、より始原的なHPP−CFC−1区分の細胞を示すのに対して、HPP−CFC−2区分の細胞はIL−1による刺激を必要としない。IL−1プラスCSFで刺激される前駆細胞のより始原的な性質は、Δ試験の際にのLPP−CFCおよびHPP−CFCの増大において、IL−1およびCSF′sが示す相乗的相互作用と一致する(図32、33)。更に、始原的造血細胞の調節は、成長因子IL−6およびKLによっても支配される。IL−6およびKLが、Δ培養においてHPP−CFCを増殖させ得ることは、HPP−CFC−1と考えられる前駆細胞の刺激において、これらが果たす役割を示唆するものである。これらのデータは、静止幹細胞(ここでは5−FUパージされたBMで代替している)が、その増殖のために多数の成長因子による刺激を必要とするという主張を裏づけている。これら前駆細胞のHpp−CFC−1からHPP−CFC−1への成熟は、複数のサイトカインに刺激された増殖の要求性における制限に従う。IL−1,IL−6,KLプラスGM−CSFの刺激に反応して、3%を越えるd7・5−FU・BM細胞がHPP−CFCを形成することができ(図30)、この発生率はBM中に存在する分化全能性幹細胞の頻度予想より遥かに高い知見は、HPP−CFCの階層性の概念と一致している。
Δ培養におけるHPP−CFCの増加は、多分化が可能な造血前駆細胞の増殖を示唆している。しかしながら、これらΔ培養後のHPP−CFCが、HPP−CFCの階層性において占める位置は不明である。Δ培養において観察された遅れて出現するCFU−Sの増加は、多分化可能な造血前駆細胞の数が、Δ試験の条件下において増加すると言う主張を支持するものである(図35)。精製ローダミン123に対して敏感または鈍感な前駆細胞の、IL−1プラスIL−3,またはKLプラスIL−1,またはIL−3に刺激され懸濁培養に応答して、CFU−Sは100倍を越えて増加した。我々の結果はまた、d2・5−FU・BMの液培養がIL−6プラスIL−3あるいはKLに刺激されると、CFU−Sが低下するという報告に反するが、遺伝子治療のプロトコールには有利となろう。我々の結果は、サイトカインIL−1プラスIL−3またはKLによる前駆細胞の増殖が、骨髄細胞の移植プロトコールに有益であり得ることを示唆している。IL−1プラスKLに対して反応するHPP−CFCは、Δ培養において、IL−1、IL−3,IL−6およびKLの成長因子を組み合わせることによって最低限の増殖を示した(図34)。IL−1プラスKLが、5−FU・BMからのHPP−CFCの成長を促進し、またΔ試験において前駆細胞の大増殖を刺激できることは、IL−1プラスKLが、貯蔵されている前駆細胞または始原的多分化可能な前駆細胞に対して作用できることを示唆している。IL−1プラスKLに反応するHPP−CFCの増殖が制限されることは、IL−1、IL−3、IL−6およびKLの成長因子が、Δ試験にいて初期造血前駆細胞および幹細胞の自己再生を刺激する能力が限定されていることを示唆している。
IL−1およびKLに誘導された増殖およびTGFβおよびMIP1αの影響
TGFβ及びMIP1αマクロファージ炎症性蛋白1αは、前駆細胞を阻止することが以前に報告されている。この二つの因子は承認された幹細胞試験で直接比較されてはいないが、この報告は、これらサイトカイン類の何れかが、造血幹細胞増殖のネガテイブレギュレータとして作用するのではないかということを示唆している。ネズミHPPコロニー分析では、後発の前駆細胞を5−フルオロウラシルで枯渇させ、高増殖可能性を持つコロニーのみをサイズ(>0.5mm)で評価してスコアすることによって、幹細胞の特徴が評価される。IL−1およびKLは初期の造血前駆細胞を優先的に刺激する。従って、我々はIL−1およびKLによって誘導されるHPP増殖について、TGFβおよびMIP1αの影響を評価することを選択した。下記の表においては、二つの別々の実験(各々同一実験を3回行った)からの結果が、成長因子の組合せによって誘導されるHPPコロニーの数で表わされ、GM−CSF(GM)単独で誘導される数と対比して示される。
これらの結果は、TGFβは、IL−1および/またはKLがGM−CSFと共に促進するHPPコロニーの相乗的増殖を損なうのに対して、にMIP1αは係る効果をもたない事を示している。更に、TGFβは、IL−1プラスKLによって誘導されるHPPコロニーを排除したのに対して、MIP1αは、これらの条件下において、HPPコロニー形成を実際に促進した。我々は、MIP1αではなくTGFβこそが、ここで評価された造血前駆細胞ポピュレーションのネガテイブ調節因子として作用すると結論する。このことは、化学療法保護プロトコールの設計において重要な示唆を有している。
IL−3,EPOまたはGM−CSFと組合たKLについての、ヒトにおける研究
全員がプレドニゾン耐性であるか、或いは高い投与を必要とするダイアモンド・ブラックファン貧血の11人の患者は、rhEpoおよびrhIL−3刺激について、低い平均BFU−E頻度を有していた。プレドニゾン感受性である一人の患者を除いて、これらの値は、4人の正常成人骨髄から得られる95%の信頼限界を下回った。組換ネズミのcKitリガンド(rmKL)を追加するか、またはrhIL−3に代替すると、全員が、BFU−Eのサイズおよびヘモグロビン化(hemoglobinization)において著しい増加を示した。更に、rhEPO、rhIL−3およびrmKLを組合せると、11人の患者の内8人の平均BFU−E頻度が少なくとも2倍になった(範囲:2から16倍)。RhIL−3で誘導される骨髄系コロニーもまた、11人の患者の内の5人において、<95%の信頼限界にまで低下した。KLの添加は、6人の患者において、平均の骨髄系コロニーの頻度を2倍以上に高めた。
rhEpoプラスrhIL−3および/またはrmKLによって刺激されたBFU−Eは、様々な度合いの骨髄不全をともなった6人のファンコニー貧血患者では検出不可能であった。また、骨髄コロニーは4症例において検出不可能であり、2症例においては、rhIL−3またはrhGM−CSFの何れかの刺激で有意に減少した。rmKLまたはrhIL−3の添加は、後者の場合、平均頻度を増加させた。RhIL−3プラスrmKLは、DCを有する第三の患者において骨髄コロニーを誘導した。より重篤な形成不全の一人の患者は、rhIL−3またはrhGM−CSFを単独で、またはrmKLと組み合わせた場合にも、赤血球または骨髄のコロニーは形成されなかった。二番目の患者は、rhEpoおよびrhIL−3を用いたときに、低い平均BFU−E頻度であった(正常対照の13%)。後者の患者からのBFU−Eのサイズ、ヘモグロビン化および数は、添加したrmKLと共に増加した。RhIL−3またはrhGM−CSFに刺激された骨髄コロニーは僅かに減少し、KLは平均コロニー頻度を適度に増加させた。
ヒト樹状突起前駆細胞および樹状突起細胞の発生における、c−KITリガンド(KL)、GM−CSFおよび腫瘍壊死因子αの間の相互作用
樹状突起細胞は、in vivo,及びin vitroにおいて、主要な抗原特異的T細胞応答を誘導するための最も有力な抗原提示細胞である。in vitroで発生する樹状突起細胞は、HIVおよび腫瘍に対するワクチン治療の流れにおいて、追加免疫のための抗原パルスの後に使用され得る。我々は、ヒト骨髄、末梢血液および臍帯血液(cord blood)のCD34+細胞ポピュレーションから、ヒト樹状突起細胞を発生させるためのin vitro系を開発した。ここで、懸濁培養中での樹状突起の分化およびクローン試験には、GM−CSFおよびTNFαの存在が必要であり、またc−KITリガンドは、樹状突起細胞/樹状突起細胞コロニーの数を相乗的に増加させる。表3aは、樹状突起細胞コロニーの発生のためには、クローン試験において、ヒト成人骨髄CD34+細胞と共に、GM−CSFおよびTNFαと相乗作用するKLが絶対的に必要である事を示している。血液CD34+細胞ポピュレーションにおいて、GM−CSFプラスTNFαは単独でも樹状突起細胞コロニー形成を誘導するが、ココロニー形成の頻度はKLの添加によって増加する(表1b)。種々のサイトカイン類を比較すると、樹状突起コロニー細胞の発生はKL、GM−CSFおよびTNFαの組合せによって最大限に刺激されることがわかる(表1c)。懸濁培養系において、IL−1プラスKLプラスIL−3は、前駆樹状突起細胞を14日間で100倍を超えて増殖させた。また、GM−CSFプラスKLプラスTNFの添加では、これらの細胞は、同種異系の混合白血球反応、およびCD3・Tリンパ球有糸***誘発の流れにおいて抗原提示が可能な樹状突起細胞に分化した。KLは、始原骨髄前駆細胞/幹細胞について、樹状突起前駆細胞および樹状突起細胞を発生させるためのユニークな増幅刺激剤を提供した。
配列表
(1)一般的情報
(i)出願人:Besmer, Peter
Nocka, Karl
Buck, Jochen
Moore, Malcolm A.S.
(ii)発明の名称:c−KIT受容体に対するリガンド及びその使用法
(iii)配列の数:11
(iv)通信宛先:
(A)名宛人:John P. White-クーパー & ダンハム
(B)通り:ロックフェラープラザ30
(C)市:ニューヨーク
(D)州:ニューヨーク
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:10112
(v)コンピュータ読取り可能な形態:
(A)媒体タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM・PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:PatentIn リリース#1.24
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:1993年4月16日
(C)分類:
(viii)アトニー/エージェント情報
(A)氏名:White,John P.
(B)登録番号:28,678
(C)参照/ドケット番号:37454dpc
(ix)電信情報:
(A)電話:(212)977−9550
(B)テレファックス:(212)644−0525
(C)テレックス:422523 COOP UI
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(ii)分子の型:タンパク
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Claims (30)
- 前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるための組成物であって、c-kitリガンド(KL)、TNFα、および造血性因子を含有し、これら各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がGM−CSF、G−CSF、M−CSF、IL−3およびpIXYからなる群から選択される組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がGM−CSFである組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がG−SCFである組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がM−CSFである組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がIL−3である組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、前記造血性因子がpIXYである組成物。
- 前駆体細胞をex-vivoで樹状突起細胞へと増殖および分化させる方法であって、前駆体細胞を、c-kitリガンド(KL)、TNFαおよび造血性因子を含有する組成物で処置することを具備し、前記組成物の各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がGM−CSF、G−CSF、M−CSF、IL−3およびpIXYからなる群から選択される方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がGM−CSFである方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がG−CSFである方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がM−CSFである方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がIL−3である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記造血性因子がpIXYである方法。
- 抹消血球レベルを増大させるための組成物であって、c-kitリガンド(KL)、TNFα、および造血性因子を含有し、これら各成分の量は、当該組成物が抹消血球レベルを増大させるために有効な量である組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がGM−CSF、G−CSF、M−CSF、IL−3、pIXYおよびIL−1からなる群から選択される組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がGM−CSFである組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がG−CSFである組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がM−CSFである組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がIL−3である組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がpIXYである組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記造血性因子がIL−1である組成物。
- 抹消血球レベルをex-vivoで増大させる方法であって、前駆体細胞を、c-kitリガンド(KL)、TNFαおよび造血性因子を含有する組成物で処置することを具備し、前記組成物の各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がGM−CSF、G−CSF、M−CSF、IL−3、pIXYおよびIL−1からなる群から選択される方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がGM−CSFである方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がG−CSFである方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がM−CSFである方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がIL−3である方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がpIXYである方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記造血性因子がIL−1である方法。
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