JP2002228665A - プリオン病感染因子のスクリーニング方法 - Google Patents

プリオン病感染因子のスクリーニング方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液製剤等の医薬品、食品、化粧品等のプリ
オンによる感染の有無を迅速に決定するために、動物モ
デル等によるCJD等のヒトプリオン病感染因子の早期検
出が必要とされている。 【解決手段】 非ヒト動物の濾胞樹状細胞（FDC）にお
ける異常プリオンタンパク質の沈着を指標とすることを
特徴とする、サンプル中のヒトまたはヒト以外のプリオ
ン病感染因子のスクリーニング方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中のヒト
またはヒト以外のプリオン病感染因子のスクリーニング
方法、新規組み換えプリオンタンパク質、該タンパク質
を発現するトランスジェニック動物及びノックイン動物
に関する。
【０００２】
【従来の技術】クロイツヘルト・ヤコブ病（Creutzfeld
t-Jacob病、以下CJDと略す）は、神経難病の一つであ
り、初老期に痴呆をきたす疾患である。発病すると、患
者は約３−５ヶ月後にはいわゆる寝たきりの植物状態と
なりやがて死に至る。CJDに対する有効な治療法はな
く、対症療法のみ行われているのが現状である。
【０００３】CJDは、単なる痴呆をきたす神経変性疾患
という側面だけでなく、ヒトからヒトへ、または動物か
ら動物へ感染することが知られている。ヒトの脳を食べ
ることによって感染したと考えられているkuru病、成長
ホルモン製剤によって感染したCJD、最近問題となって
いる硬膜移植後のCJD等がヒトからヒトへの感染の例で
ある。また、イギリスで問題となっている新変異型CJD
（new variant CJD, nvCJD）は牛海綿状脳症（bovine s
pongiform encephalopathy、BSEと略す。一般的には狂
牛病と呼ばれている）のウシからヒトへの感染と考えら
れている。
【０００４】1982年、CJDの感染因子はタンパク質性の
ものであるという仮説から、プリオンという感染因子が
命名された。1985年には感染因子プリオンを構成するプ
リオンタンパク質の遺伝子がクローニングされた。この
結果、プリオンタンパク質は正常な動物の脳でも発現し
ており、発病した患者においては、正常型プリオンタン
パク質とは明確に区別可能な異常型プリオンタンパク質
が沈着していることが明らかになった。現在、ヒトにお
けるプリオンの異常に起因するいわゆるプリオン病とし
て、上記kuru病、CJDの他、Gerstmann-Straussler症候
群（GSSと略す）、致死性家族性不眠症（Fatal familia
l insomnia；FFIと略す）が知られている。
【０００５】ヒトの場合、プリオンタンパク質は253個
のアミノ酸から構成されており（配列番号２）、Ｎ末端
の22アミノ酸からなるシグナル配列、Ｃ末端の23アミノ
酸が除去された後、糖脂質GPI（Glycosyl-phosphatidyl
-inositol）を介して細胞膜表面上に結合しているタン
パク質である（配列番号３）。
【０００６】一方、1989年にプリオンタンパク質遺伝子
の変異が発見され、家族性であるGSSや家族性のCJDがプ
リオンタンパク質のアミノ酸１個の変異のみで発病する
ことが見出され、プリオンタンパク質がCJDにおいて重
要な役割を持っていることが明らかとなった。
【０００７】また、上記nvCJDは、若年（10代から30
代）で発病し、他のCJDで知られている中枢神経系にお
ける異常型プリオンタンパク質の沈着だけでなく、他の
CJDでは認められなかったリンパ装置の濾胞樹状細胞（F
ollicular Dendritic Cell:FDC）への沈着も認められる
ことが報告された（Hill A.F.ら、Lancet 1997, 349:99
-100）。nvCJDは、キャリアー患者の存在がどの程度で
あるかが不明であり、イギリスにおいては血液製剤をイ
ギリスの自国の血液で供給することを禁止する程の深刻
な問題となっている。
【０００８】その理由の一つとして、同一種におけるプ
リオンの伝播（感染）は容易であり、感染率が高く、ま
た潜伏期間も短いのに対し、一つの種から別の種への移
行には長期の潜伏期間が必要であり、感染率も非常に低
いという事実が挙げられる。この種間障壁のために、動
物モデル等を用いてCJD等のヒトプリオン病の感染因子
の存在を検出することは非常に困難なものであった。
【０００９】例えば、上記nvCJDについて、ヒト型トラ
ンスジェニックマウスへの感染実験が試みられている
（Hill, A.F.ら、Nature 1997 Oct 2;389(6650):448-5
0）が、発症までに長い潜伏期間（228日以上）を要し、
成功率も高いものではなかった（５６匹中２５匹のみ成
功）。最近、ウシ型のトランスジェニックマウスを用
い、約250日の潜伏期間で感染したことが報告されてい
る（Scott M.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,
96:15137-42）。
【００１０】また、試料中のプリオンの検出方法とし
て、トランスジェニック動物を用いた系が報告されてい
る（特表平11-510496号）が、マウスを用いた例では50
日前後でのスクレイピーの発症が報告されているが、ヒ
トのプリオン病に関しては発症までに200日近くを要し
ている。
【００１１】一方、本発明者等は、オートクレーブ法と
いう新しい免疫染色法を用いてCJD患者及びCJD感染マウ
スの中枢神経のシナプスに異常プリオンタンパク質が沈
着することを証明した（Kitamoto, T.ら、Am. J. Patho
l. 140:1285-1294 (1992);Muramoto, T.ら、Am. J. Pat
hol. 140:1411-1420 (1992)）。また、中枢神経系以外
の細胞、FDCでも異常プリオンタンパク質が沈着するこ
とも発見した（Kitamoto, T.ら、J. Virol. 65:6292-62
95 (1991)）。FDCへの異常プリオンタンパク質の沈着
は、マウスの発病よりずっと以前の段階から検出でき、
発病前診断が可能である（Muramoto, T.ら、Am. J. Pat
hol. 140:1411-1420 (1992); Muramoto,T.ら、Am. J. P
athol. 143:1470-1479 (1993)）。
【００１２】通常、感染因子（マウスプリオン）のマウ
スへの頭蓋内投与では、マウスは120-140日で発病する
が、FDCへの異常プリオンタンパク質の沈着を指標とす
ると、投与30日後には感染因子を投与されたマウスの全
てで検出が可能であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、血液製
剤等の医薬品のプリオンによる感染の有無を迅速に決定
するために、動物モデル等によるCJD等のヒトプリオン
病感染因子の早期検出が必要とされている。
【００１４】また、FDCへの異常プリオンタンパク質の
沈着はマウスの系でのみ証明されており、従来ヒトのCJ
Dでは検出できなかった。また、野生型マウスにおいて
は、ヒト及びマウス間の種差が存在するために、ヒトCJ
Dからの初代の感染実験ではFDCへの異常プリオンタンパ
ク質の沈着が認められないことが知られている（Muramo
to, T.ら、J. Virol. 67:6808-6810 (1993)）。従っ
て、ヒトのプリオンタンパク質の異常を直接検出する方
法が必要とされていた。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記実情
に鑑み鋭意検討した結果、ヒト及びマウスのプリオンタ
ンパク質由来の新規組み換えプリオンタンパク質を作製
し、これを導入したトランスジェニック動物及びノック
イン動物を作製した。その結果、これまでにない短期間
でサンプル中のヒトプリオン病感染因子を検出できる、
非常に有効なスクリーニング方法を開発することに成功
した。
【００１６】 すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２６）を提供す
る。（１） 非ヒト動物の濾胞樹状細胞（FDC）におけ
る異常プリオンタンパク質の沈着を指標とすることを特
徴とする、サンプル中のヒトまたはヒト以外のプリオン
病感染因子のスクリーニング方法。 （２） 該非ヒト動物がヒト化プリオンタンパク質遺伝
子を発現するトランスジェニック動物であることを特徴
とする、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
【００１７】（３） 該非ヒト動物がヒト化プリオンタ
ンパク質遺伝子を発現するノックイン動物であることを
特徴とする、上記（１）に記載のスクリーニング方法。 （４） サンプルを該非ヒト動物に腹腔内、脳内、血管
内、または経口投与することを特徴とする、上記（１）
から（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。 （５） FDCにおける異常プリオンタンパク質の沈着
を、組織学的検出法、電気泳動法、及び／または結合ア
ッセイによって検出することを特徴とする、上記（１）
から（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１８】（６） FDCにおける異常プリオンタンパ
ク質の沈着を、サンプル投与後１４日〜７００日で検出
することを特徴とする、上記（１）から（５）のいずれ
かに記載のスクリーニング方法。 （７） ヒト化プリオンタンパク質が、非ヒト動物プリ
オンタンパク質遺伝子のエクソン３の一部をヒトプリオ
ンタンパク質のエクソン３の一部と置換したものであ
る、上記（１）から（６）のいずれかに記載のスクリー
ニング方法。
【００１９】（８） ヒト化プリオンタンパク質が、ヒ
トプリオンタンパク質におけるヒト特異的アミノ酸残基
のうちＣ末端側の６残基が上記スクリーニングに使用す
る非ヒト動物プリオンタンパク質の対応するアミノ酸残
基と置換したものである、上記（１）から（６）のいず
れかに記載のスクリーニング方法。 （９） ヒト化プリオンタンパク質が、配列番号６また
は７に示すアミノ酸配列を含むものである、上記（１）
から（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法。 （１０） 非ヒト動物プリオンタンパク質遺伝子のエク
ソン３の一部をヒトプリオンタンパク質遺伝子のエクソ
ン３の一部と置換した組み換え遺伝子によってコードさ
れることを特徴とする、組み換えヒト化プリオンタンパ
ク質。
【００２０】（１１） ヒトプリオンタンパク質におけ
るヒト特異的アミノ酸残基のうちＣ末端側の６残基が非
ヒト動物プリオンタンパク質の対応するアミノ酸と置換
したものである、組み換えヒト化プリオンタンパク質。 （１２） 配列番号６または７に示すアミノ酸配列を含
む、組み換えヒト化プリオンタンパク質。 （１３） 上記（１０）から（１２）のいずれかに記載
のタンパク質をコードする遺伝子またはその断片。
【００２１】（１４） 下記の（ａ）〜（ｃ）のヌクレ
オチド配列を含む遺伝子またはその断片。 （ａ）配列番号４に示すヌクレオチド配列、（ｂ）配列
番号４に示すヌクレオチド配列と縮重関係にあるヌクレ
オチド配列、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチ
ド配列であって、上記（１０）に記載のタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列。
【００２２】（１５） 上記（１３）または（１４）に
記載の遺伝子またはその断片を含有するベクター。 （１６） 上記（１３）または（１４）に記載の遺伝子
またはその断片が導入されたトランスジェニック動物。 （１７） 上記（１３）または（１４）に記載の遺伝子
またはその断片が導入されたノックイン動物。 （１８） FDCにおいてヒト化プリオンタンパク質を発
現することを特徴とするトランスジェニック動物。 （１９） FDCにおいてヒト化プリオンタンパク質を発
現することを特徴とするノックイン動物。
【００２３】（２０） 脳及び／又はFDCにおいて上記
（１０）から（１２）のいずれかに記載のタンパク質を
発現してなるトランスジェニック動物。 （２１） 脳及び／又はFDCにおいて上記（１０）から
（１２）のいずれかに記載のタンパク質を発現してなる
ノックイン動物。 （２２） 上記（１０）から（１２）のいずれかに記載
のタンパク質を発現するトランスジェニック動物の作出
方法。 （２３） 上記（１０）から（１２）のいずれかに記載
のタンパク質を発現するノックイン動物の作出方法。
【００２４】（２４） 以下の（ａ）〜（ｆ）の工程： （ａ）非ヒトプリオンタンパク質遺伝子またはその断片
を含むベクターを構築し、（ｂ）上記非ヒトプリオンタ
ンパク質遺伝子のエクソン３の一部をヒトプリオンタン
パク質のエクソン３の一部と置換し、（ｃ）3'非翻訳領
域にloxpで囲まれた抗生物質耐性遺伝子を挿入し、
（ｄ）得られた改変ベクターを該非ヒトのES細胞に導入
し、（ｅ）相同組み換えの認められたクローンからキメ
ラ動物を作成し、（ｆ）Ｆ１動物の受精卵にCre酵素発
現プラスミドを導入して抗生物質耐性遺伝子を削除す
る、ことを含む、上記（２３）に記載のノックイン動物
の作出方法。
【００２５】（２５） 上記（１８）若しくは（２０）
に記載のトランスジェニック動物、または上記（１９）
若しくは（２１）に記載のノックイン動物を使用するこ
とを特徴とする、ヒトまたはヒト以外のプリオン病の予
防及び／または治療のための薬剤のスクリーニング方
法。 （２６） 上記（１８）若しくは（２０）に記載のトラ
ンスジェニック動物、または上記（１９）若しくは（２
１）に記載のノックイン動物を使用することを特徴とす
る、血液製剤等ヒトまたはヒト以外の動物の臓器に由来
するあらゆる医薬品、食品、化粧品等の安全性試験を行
うための方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について更に詳細に
説明する。本明細書において、「非ヒト動物」とは、マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブ
タ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、鳥類及び
魚類をいう。本発明において、非ヒト動物は特に限定さ
れるものではないが、飼育及び操作上の点から特に好ま
しくはマウスである。
【００２７】本明細書において、「異常プリオンタンパ
ク質」とは、正常型プリオンタンパク質の立体構造が変
化し、界面活性剤で不溶性となり、タンパク分解酵素で
部分的に消化されなくなったプリオンタンパク質をい
う。ヒトならびに動物のプリオン病では、正常プリオン
タンパク質の他に必ずこの異常プリオンタンパク質が存
在し、その存在の証明は、タンパク分解酵素処理後のウ
エスタンブロット法や、タンパク質抽出後の電子顕微鏡
を用いた異常プリオンタンパク質から構成されるアミロ
イド繊維の検出、そして本発明者等が開発したオートク
レーブ法を利用した免疫染色法（Shin, R. W.ら、Lab.
Invest. 64:693-702 (1991); Kitamoto, T.ら、J. Viro
l. 65:6292-6295 (1991); Kitamoto, T.ら、Am. J. Pat
hol. 140:1285-1294 (1992)）による検出などによって
確かめられる。
【００２８】また、本明細書において、「感染因子」と
は、ヒトまたは本発明のトランスジェニック動物または
ノックイン動物に投与した場合にプリオン病を発症させ
る能力を有する因子をいい、具体的には、ヒト由来また
はヒト以外の動物由来の異常プリオンタンパク質もしく
はその断片、またはこれらを含有するものをいう。感染
因子を含有するサンプルとしては、例えばヒトまたはヒ
ト以外の動物由来の血液製剤等の医薬品、食品、化粧品
等が挙げられる。
【００２９】更に、本明細書において、「ヒト化プリオ
ンタンパク質」とは、発現させる宿主となる非ヒト動物
が本来発現するプリオンタンパク質の一部がヒトプリオ
ンタンパク質の配列と置き換わっているものをいい、例
えば、非ヒト動物プリオンタンパク質遺伝子のコーディ
ング領域の一部をヒトプリオンタンパク質遺伝子の対応
領域と置換した組み換え遺伝子によってコードされる組
み換えヒト化プリオンタンパク質、ヒトプリオンタンパ
ク質におけるヒト特異的アミノ酸残基のうちの一部の残
基が非ヒト動物プリオンタンパク質の対応するアミノ酸
残基と置換した組み換えヒト化プリオンタンパク質等が
挙げられる。
【００３０】本発明において好適に用いられるヒト化プ
リオンタンパク質として、特に非ヒト動物プリオンタン
パク質遺伝子のエクソン３の一部をヒトプリオンタンパ
ク質遺伝子のエクソン３の一部と置換した組み換え遺伝
子によってコードされる組み換えヒト化プリオンタンパ
ク質が挙げられる。この組み換えヒト化プリオンタンパ
ク質は、マウス等の非ヒト動物のプリオンタンパク質遺
伝子のエクソン３の一部を組み換えによってヒトプリオ
ンタンパク質遺伝子のエクソン３の一部と置換すること
により得られる遺伝子を、例えばベクターに組み込んで
宿主に導入し、発現させることによって得ることができ
る。ここで、「エクソン３の一部」とは、エクソン３の
プリオンタンパク質翻訳領域に存在するSmaI部位からBs
tEII部位までの領域を必須に含む配列のことをいう。
尚、プリオンタンパク質遺伝子において、タンパク翻訳
領域はエクソン３のみに存在する。
【００３１】このような遺伝子組み換え等の、本明細書
に記載の遺伝子工学的手法は、当分野において通常用い
られるものであり、当業者であれば、本明細書の記載に
基づいて適宜行うことができる。
【００３２】本発明に係るヒト化プリオンタンパク質
は、具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｆ）の工程： （ａ）非ヒトプリオンタンパク質遺伝子またはその断片
を含むベクターを構築し、（ｂ）上記非ヒトプリオンタ
ンパク質遺伝子のエクソン３の一部をヒトプリオンタン
パク質のエクソン３の一部と置換し、（ｃ）3'非翻訳領
域にloxpで囲まれた抗生物質耐性遺伝子を挿入し、
（ｄ）得られた改変ベクターを該非ヒトのES細胞に導入
し、（ｅ）相同組み換えの認められたクローンからキメ
ラ動物を作成し、（ｆ）Ｆ１動物の受精卵にCre酵素発
現プラスミドを導入して抗生物質耐性遺伝子を削除す
る、ことによって得られるノックイン動物により、上記
ヒト化タンパク質が発現する。
【００３３】また、ヒト化プリオンタンパク質は、ヒト
プリオンタンパク質において、ヒト特異的であることが
知られているアミノ酸残基のうち、例えばＣ末端側の６
残基が非ヒト動物プリオンタンパク質の対応するアミノ
酸残基と置換したものとして、部位特異的突然変異誘
発、または化学的合成等の当業者に公知の手法により得
ることができる。
【００３４】ヒトプリオンタンパク質遺伝子の塩基配列
は配列番号１に示す塩基配列として、そのアミノ酸配列
は、配列番号２に示す全アミノ酸配列として知られてい
るが、Ｎ末端の22アミノ酸からなるシグナル配列、Ｃ末
端の23アミノ酸が除去された配列番号３のアミノ酸配列
にプロセシングされて成熟タンパク質となる。この配列
番号３において、33、34、50、58、75、87、90、116、1
21、123、133、144、146、193、197、198、205、206、
及び208番目の残基がヒト特異的であるとされている（K
retzschmar, H.A.ら、DNA 1986, 5:315-24）。本発明者
等は、これらヒト特異的アミノ酸の非ヒト動物の対応ア
ミノ酸との置換について種々検討した結果、本発明に係
るスクリーニング方法の使用において、特にＣ末端側の
６残基が非ヒト動物プリオンタンパク質の対応するアミ
ノ酸残基と置換したものが好適であることを見出した。
この配列の一例を配列番号６または７に示す。配列番号
６は、コドン１２９がメチオニンであり、配列番号７
は、コドン１２９がバリンである。この多型は正常なヒ
トプリオンタンパク質でも見られるものであり、ヒトの
各種プリオン病で見られる異常プリオンタンパク質にお
いても存在する。
【００３５】本発明はまた、本発明に係る上記ヒト化プ
リオンタンパク質をコードする遺伝子またはその断片、
及び該遺伝子またはその断片を含有するベクターを提供
する。
【００３６】本発明に係るヒト化プリオンタンパク質を
コードする遺伝子は、上記配列番号６または７に示すア
ミノ酸配列を含む組み換えヒト化プリオンタンパク質を
コードするものであるが、他の態様として、例えば配列
番号４に示すヌクレオチド配列を含む遺伝子、及び配列
番号４に示すヌクレオチド配列と縮重関係にあるヌクレ
オチド配列を含む遺伝子、及びこれらの配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド
配列を含む遺伝子を挙げることができる。ここで、スト
リンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッ
ドが形成される条件をいう。例えば、相補性が高いヌク
レオチド配列、すなわち90％以上、好ましくは95％以上
の相補性を有するヌクレオチド配列同士はハイブリダイ
ズし、それより相補性が低いヌクレオチド配列同士はハ
イブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的に
は、ナトリウム濃度が15〜300mM、好ましくは15〜75mM
であり、温度が50〜60℃、好ましくは55〜60℃での条件
をいう。遺伝子としては、DNA及びRNAのいずれでも良
く、また合成によって得られるものであっても良い。ま
た、「断片」とは、プリオンタンパク質遺伝子の一部で
あって、好ましくは配列番号２におけるコドン85からコ
ドン230までをコードするヌクレオチド配列を含むが、
この配列の欠損型であっても良く、最短300ヌクレオチ
ド程度の長さのものをいう。
【００３７】該遺伝子またはその断片を含有するベクタ
ーとしては、該遺伝子が導入される宿主動物細胞中で発
現し得るものであればいずれでも良く、当分野において
使用されるものであれば特に限定されるものではない
が、例えばアクチンプロモーターを利用したどの細胞で
も発現が認められるベクター等が挙げられる。また、該
遺伝子の発現を調節し得るプロモーター、エンハンサ
ー、その他の調節遺伝子等を適宜組み込むことができ
る。本発明において好適に使用できるプロモーターとし
ては、例えばFDCにおける発現を促進するようなプロモ
ーター、例えばCD21(Cr2)遺伝子のプロモーター等が挙
げられ、文献として例えばZabel, M.D.ら、J. Immunol.
2000 Oct. 15;165(8):4437-45を参照すれば良い。
【００３８】一方、従来、プリオンタンパク質遺伝子を
導入したトランスジェニックマウスの作製は既に報告さ
れている（Telling G.C.ら、Cell 1995, Oct. 6:83(1)
79-90）。一つは、図１Cに示すように、完全なヒト型の
プリオンタンパク質の遺伝子を導入したものであり、CJ
D発病までの潜伏期間は約250日であった。もう一つは、
図１Aに示すように、KpnIサイトからBstEIIサイトまで
がヒトプリオンタンパク質由来の配列であり、Ｎ末端及
びＣ末端がマウスプリオンタンパク質由来の配列となっ
ているタンパク質の遺伝子を導入し、潜伏期間が約200
日となったものである。これに対して本発明のトランス
ジェニックマウスは、図１Bに示すように、Ｎ末端からB
stEIIサイトまでがヒトプリオンタンパク質由来の配列
であり、Ｃ末端がマウスプリオンタンパク質由来の配列
となっているタンパク質の遺伝子を導入したものであ
る。
【００３９】本発明者等は、図１Bに模式的に示すタン
パク質をコードする遺伝子（配列番号６または７）を導
入したトランスジェニックマウスを作製し、ホモの場合
で発病までの潜伏期間が平均147日のものを得ることが
できた。従って、本発明は、配列番号６または７に示す
組み換えヒト化プリオンタンパク質を発現するトランス
ジェニック動物を提供する。本発明において、トランス
ジェニック動物は、ホモであってもヘテロであっても良
いが、好ましくはホモ型である。
【００４０】しかしながら、トランスジェニック動物
は、遺伝子がどの染色体上のどの位置に導入されている
か不明であり、また、上記のような短い潜伏期間を示す
ものを得るためには、プリオンタンパク質遺伝子のノッ
クアウト動物と交配しなければならない。本発明者等
は、以前にマウス遺伝子をヒト型に置き換える、ES細胞
を使った遺伝子置換法を確立している（Kitamoto, T.
ら、Biochem. Biophys. Res.Commun. 222:742-747 (199
6)）。この方法を改良し、天然のマウス遺伝子の一部を
上記配列番号１に示す配列を有するヒト遺伝子と置換し
たノックインマウスを作製した。このノックインマウス
は、潜伏期間が平均151日であった。
【００４１】すなわち、本発明は、配列番号６、７ある
いは１０に示す組み換えヒト化プリオンタンパク質を発
現するノックイン動物を提供する。本発明において、ノ
ックイン動物は、ホモであってもヘテロであっても良い
が、好ましくはホモ型である。組み換えヒト化プリオン
タンパク質の発現は全身で見られるが、特に脳及び／又
は脾臓において検出することができる。
【００４２】ES細胞を用いた遺伝子置換法の利点は、上
記のようにトランスジェニック動物で問題となった、マ
ウス内因性プリオンタンパク質を排除するためにノック
アウト動物と交配しなくても良いという点である。ま
た、遺伝子発現の分布・発現量も正常の動物と同様であ
り、全く自然な発現が得られるという利点も有する。
【００４３】ヒト化プリオンタンパク質を導入したモデ
ル動物では、ヒトまたはヒト以外の動物由来の感染因子
を投与すると異常プリオンタンパク質の沈着がFDCで検
出できることが予想される。従って、ヒト型のトランス
ジェニック動物は、FDCでの異常プリオンタンパク質の
沈着を指標とした、感染因子の迅速なスクリーニング方
法に使用することができる。
【００４４】上記予想に基づき、本発明者等が得られた
トランスジェニックマウス及びノックインマウスの発病
後にFDCを調べたところ、トランスジェニックマウスで
は異常プリオンタンパク質はほとんど検出されなかった
が、ノックインマウスでは脾臓、リンパ節、腸管のリン
パ装置（パイエル氏板）のFDCにヒト型の異常プリオン
タンパク質の沈着を認めた（図２Ａ）。
【００４５】従来、FDCへの異常プリオンタンパク質の
沈着が、感染実験の際に投与した材料に含まれている異
常プリオンタンパク質が集められているのか、またはFD
Cで正常プリオンタンパク質から異常プリオンタンパク
質への変換が生じているのかを決定することはできなか
った。本発明に係る配列番号６または７に示す組み換え
プリオンタンパク質は、上記のようにＣ末端がマウス型
であるため、本発明者等は次に、ヒト型プリオンタンパ
ク質のＣ末端に対する抗体を作製した。この抗体でFDC
を調べたところ、FDCを染めることはできなかった（図
２Ｂ）。このことから、FDCに沈着した異常プリオンタ
ンパク質は、感染因子中に含まれていたヒト型の異常プ
リオンタンパク質が単に集められているのではないこと
が示された。
【００４６】本発明者等は更に、免疫染色で確認した脾
臓への異常プリオンタンパク質の沈着を、ウエスタンブ
ロット法においても検討し、ノックインマウスの脾臓に
おいて異常プリオンタンパク質の存在を確認した（図
３）。更に、直接感染実験において、脾臓において感染
性が存在することも証明された（表２、接種実験３）。
【００４７】本発明者等が作製したノックインマウス
は、発病までに平均151日の潜伏期間を有していたが、F
DCへの異常プリオンタンパク質の沈着が検出できるまで
の最短期間を検討した。その結果、本発明のノックイン
マウスを使用したアッセイ系においては、１４日という
非常に短期間で検出が可能であることが明らかになった
（表６）。
【００４８】一方、完全なヒトプリオンタンパク質（配
列番号１０、８アミノ酸の欠損）を発現するKi-HuMで
は、全例発病したものの非常に長い潜伏期間643日を要
した。腹腔内接種75日後の脾臓のFDCにおける免疫組織
染色も80％（5頭中4頭）の検出率にとどまったが、Ki-C
hMと同様にFDCへの異常プリオンタンパク質の沈着を確
認した（表７）。すなわち、FDCにプリオンタンパク質
が有効に発現するノックイン法を使えば、脳でプリオン
タンパク質の異常化の起こりにくい完全ヒト型の動物で
も、FDCではある程度有効に異常化が見とめられること
が明らかになった。これらのことから、FDCにプリオン
タンパク質が有効に発現する本発明者等の請求する方法
によるノックイン動物を用いれば、特定の領域を置換し
たプリオンタンパク質遺伝子のみならず、ウシ等のヒト
以外の動物のプリオンタンパク質を発現するノックイン
動物において、FDCにおけるウシ等のヒト以外の動物の
異常プリオンタンパク質の沈着も検出可能である。
【００４９】本発明のノックイン動物は、上記のように
従来にないプリオン高感受性動物であることが明らかと
なった。従って本発明はまた、本発明のノックイン動物
を使用して、そのFDCへの異常プリオンタンパク質の沈
着を指標とし、サンプル中のヒトまたはヒト以外の動物
のプリオン病発症の有無を検出するバイオアッセイを提
供する。このアッセイは、サンプル中のプリオン病感染
因子のスクリーニング方法として利用することができ
る。
【００５０】サンプルとしては、例えば血液、血液製剤
等、ヒトまたはヒト以外の動物の臓器に由来するあらゆ
る医薬品、食品、化粧品等が挙げられる。サンプルを非
ヒト動物、好ましくはヒト化プリオンタンパク質を発現
するトランスジェニック動物、特に好ましくは本発明の
ノックイン動物に感染させる。サンプルの投与は、腹腔
内、脳内、若しくは血管内投与、または経口投与のいず
れでも良いが、腹腔内投与の場合には、後に記載するよ
うに、相対的に多量のサンプルを投与することができ、
好ましい。具体的には、血液・臓器等、またはそれに由
来する製剤を含む溶液をノックイン動物の腹腔内へ、例
えば２ｍｌ程度投与し、感染させる。
【００５１】感染後、FDCへの異常プリオンタンパク質
の沈着を検出することによって、サンプルによるプリオ
ン病発症の有無を決定することができる。検出方法とし
ては、FDCへの異常プリオンタンパク質の沈着を検出し
得るものであればいずれでも良いが、例えば脾臓、リン
パ節、腸管のリンパ装置であるパイエル氏板のFDCへの
異常プリオンタンパク質の沈着を、電子顕微鏡等によっ
て観察する組織学的検出法、電気泳動法、及び／または
異常プリオンタンパク質に対する抗体を放射性または非
放射性標識し、結合アッセイを行う方法、例えばin sit
uハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット法、ELI
ZA法等が挙げられる。検出は、感染後経時的に行っても
良いが、予め感染因子存在時のFDCへの異常プリオンタ
ンパク質の沈着までの期間を対照サンプルによって決定
し、サンプル感染からその期間、例えば75日経過後にFD
Cへの異常プリオンタンパク質の沈着の有無を検出する
方法であっても良い。検出時期は特に限定するものでは
なく、投与から１４日〜７００日の間であればいずれで
も良い。FDCにおける異常プリオンタンパク質の沈着を
指標とすることで、従来と比較して非常に短期間で感染
因子の存在を決定することができる。
【００５２】ヒトのプリオン病、とりわけCJDにおいて
は、マウスモデルのようにFDCに異常プリオンタンパク
質の見られる症例はこれまで全く報告されていなかっ
た。このことは、CJDがほとんど孤発例によるもので、
外からの感染によらないという事実と一致する。しか
し、1996年にイギリスで起こったnvCJDは牛海綿状脳症
由来の感染因子が関係していると考えられ、感染性プリ
オン病に位置付けられている。従って、感染因子の検出
は非常に重要となっている。
【００５３】本発明はまた、感染因子を腹腔内、脳内、
血管内、または経口投与することによるスクリーニング
方法を提供する。従来、感染実験は、主として脳内投与
により行われていた。感染因子を含むサンプルを脳内に
投与する場合には、投与量が制限されるという制約があ
る。マウスの脳内には最大限20μlしか投与できない
が、腹腔内であれば２ｍｌのサンプルでも投与可能であ
り、しかも複数回の投与も可能である。
【００５４】感染因子の濃度が低いと考えられている血
液を含む一般臓器のバイオアッセイでは、この100倍に
及ぶ量的な差は大きくその検出感度に影響する。例えば
CJD感染マウスの場合、脳内投与による感染実験では、
脳ではLD50が１０-8／ｇであり、血液は１０-3／ｇ以下
である。これは、脳内投与として20μlを使用した結果
であるが、腹腔内投与では100倍量のサンプルを投与す
ることが可能となり、これによって１０-3／ｇの臓器
（血液）の感染実験を１０-5／ｇに相当する高い感染性
臓器（脾臓等）と同じレベルにすることができる。従っ
て、腹腔内投与は、サンプル中の感染因子のスクリーニ
ング方法において、今後非常に期待される投与方法であ
る。
【００５５】これまで、ヒトのトランスジェニックマウ
スモデルでは、感染因子の腹腔内投与での発病は報告さ
れていない。本発明者等のトランスジェニックマウスの
データから、FDCに異常プリオンタンパク質が沈着しな
いと、腹腔内投与等の末梢からの発病は困難であること
が示唆された。また、頭蓋内投与では発病するが、腹腔
内投与では発病しないSCIDマウス（Ｔ細胞及びＢ細胞が
欠損）では、FDCへの異常プリオンタンパク質の沈着は
認められない。このことは、FDCへの異常プリオンタン
パク質の沈着が生じないと脳へ異常プリオンタンパク質
が伝播されないことを示す。
【００５６】本発明のノックインマウスは、感染因子投
与によって初めてヒト型異常プリオンタンパク質が沈着
したものであり、これを用いて腹腔内投与を行った。投
与後平均283日において、１１匹全ての発病が確認され
た。すなわち、本発明において、末梢からのヒトプリオ
ン感染が初めて成功したのである（表５）。
【００５７】更に、本発明は、本発明のトランスジェニ
ック動物、または本発明のノックイン動物を使用するこ
とを特徴とする、ヒトまたはヒト以外のプリオン病の予
防及び／または治療のための薬剤のスクリーニング方法
を提供する。
【００５８】上記のように、本発明のトランスジェニッ
ク動物またはノックイン動物を用いて、短期間かつ高感
度でFDCにおける異常プリオンタンパク質の沈着を検出
することができる。この手法を用い、異常プリオンタン
パク質のFDCへの沈着、またはFDCから脳への移行をブロ
ックし得る薬剤を、感染因子投与の前後、あるいは感染
因子と同時に被検動物に投与することによって、スクリ
ーニングすることができ、それによって現在非常に大き
な問題となっており、有効な薬剤が報告されていないヒ
トまたはヒト以外のプリオン病の予防及び／または治療
のための薬剤を開発することができる。
【００５９】
【実施例】［実施例１］ ノックインベクターの作製 組み換えヒトプリオンタンパク質を調製するために、遺
伝子置換ベクターとして、マウスのプリオンタンパク質
遺伝子（配列番号８、配列番号９はアミノ酸配列）のエ
クソン３の翻訳領域の40番目のアミノ酸であるグリシン
（118番目のヌクレオチド）から187番目のアミノ酸であ
るスレオニン（561番目のヌクレオチド）までをヒトの
プリオンタンパク質遺伝子と置換したエクソン３を中心
とした約10Kbpのコンストラクトを選択した。ノックイ
ンベクターは、20Kbpに及ぶ長いイントロンをもつこと
を特徴とするマウスプリオンタンパク質遺伝子のイント
ロン２のBamHI部位からエクソン３のSmaI部位までの3.5
Kbpを利用し、エクソン３のSmaI部位からBstEII部位ま
でをヒトプリオンタンパク質遺伝子に置換し、エクソン
３の3'側非翻訳領域であるApaI部位にloxpで囲まれたPG
K-neo遺伝子を挿入した（図４）。ApaIからEcoRVまでの
４Kbpに及ぶ３’領域はマウスの遺伝子を用いた。
【００６０】ネガティブ選択として、ジフテリア毒素で
あるDTA遺伝子を3'側に挿入し、NotIでプラスミドを線
状化した後、エレクトロポレーションでES細胞に導入し
た。ES細胞は、G418選択（ネオマイシン選択）の後、12
0クローンを選び、サザンブロットで解析した。解析し
た120クローン中４クローンで相同組み換えを確認し
た。これは、以前本発明者等がloxP-neo-gpt-loxPを用
いて行った実験で、陽性率が288クローン中１クローン
であったのに比較して、効率が良いものであった。
【００６１】得られたノックインベクターで更に相同組
み換えの効率を検討したところ、陽性率は１クローン／
60クローン、６クローン／180クローン、５クローン／1
75クローン、２クローン／98クローンと、効率良く陽性
クローンが得られることが確認された。
【００６２】［実施例２］ ノックインマウスの作製 マウスへの遺伝子導入は、エレクトロポレーション法で
ES細胞に導入し、G418耐性のクローンをサザンブロット
法によって解析した。相同組み換えの認められた陽性ク
ローン（ES細胞）を桑実胚に導入してキメラマウスを作
製し、キメラマウスの交配によってF1マウスを作製した
（germ-line化）。陽性F1マウスの交配によって得られ
た受精卵にCre酵素を発現するプラスミドを導入し、不
要になったneo遺伝子を削除し、ヒト型への置換を終了
した。
【００６３】得られたヘテロ接合体のヒト型ノックイン
マウス（Ki-ChM）同士を交配してホモ接合体マウスを作
製した。得られたノックインマウスは、配列番号６に示
す組み換えプリオンタンパク質を発現した（Ki-ChM）。
同様にして、完全なヒトプリオンタンパク質（配列番号
１０、通常５回ある８アミノ酸の繰り返し配列が４回と
なっている）を発現するノックインマウスも対照として
作製した（Ki-Hu）。
【００６４】［実施例３］ トランスジェニックマウス
の作製 マウスのプリオンタンパク質遺伝子を、２種類のマウ
ス、129SVマウス及びI/Lnマウスからクローニングし
た。129SVマウスのイントロン２は20Kbp以上と長いもの
であるので、イントロン２が短いI/Lnマウスの遺伝子も
利用した。129SV由来の５’側の５Kbp、I/Lnマウス由来
のエクソン１及び２を含む12KbpのBamHI断片、及び129S
V由来のエクソン３領域７Kbpを連結した（図５）。エク
ソン３は実施例２のノックインマウスと同様にSmaIから
BstEII部位までをヒトのプリオンタンパク質に置き換え
ている。このようにして作製したトランスジェニックベ
クターをプラスミドから切り出し、BDF1マウスの受精卵
に直接導入した。導入に成功したF0マウスを交配し、F1
マウスを作製した。このF1マウスで発現量を解析後、ノ
ックアウトマウスと２回交配し、マウスのプリオンタン
パク質を発現しない、組み換えプリオンタンパク質（配
列番号６または７）のみを発現するマウスを作製した
（Tg-ChM及びTg-ChV）。
【００６５】［実施例４］ ノックインマウス及びトラ
ンスジェニックマウスへの脳内投与による感染の確立 ヒト孤発性CJD患者の凍結脳から、リン酸緩衝液（PBS）
を用いて10％の濃度になるようにガラスホモゲナイザー
で脳乳剤を作成し、麻酔下で実施例２で得られたノック
インマウス（Ki-ChM, Ki-HuM）と実施例３で得られたト
ランスジェニックマウス3系統（Tg-ChM#30, Tg-ChV#12,
Tg-ChV#21）の右脳半球に27ゲージ針のシリンジを用い
て２０マイクロリットルずつ脳内接種を行った。接種後
の観察記録で自発運動の減少、歩行失調、異常歩行、挙
尾反応などの神経症状が現れ、進行し、削痩、衰弱がみ
られた個体は安楽死の後、剖検した。神経症状が現れて
安楽死までの期間は平均21日程度を要した。潜伏期間は
接種日を０日とし安楽死までの期間とした。剖検時に緩
衝ホルマリン固定以外に、主要臓器の一部は摂氏マイナ
ス７０度に凍結保存した。
【００６６】また、すべてのマウスは、プリオン専用の
病理標本作製室にてパラフィン包埋、薄切後、HE染色な
らびに本発明者の考案したオートクレーブ法による免疫
組織染色により、病変と異常プリオンタンパク質沈着に
よる組織診断を行い、プリオン病の有無を確認した。
【００６７】その結果、ノックインマウスのうち、コド
ン129がメチオニンホモ型であるヒト孤発例CJD(129M/M)
-H3を接種されたマウスでは、組み換えヒトプリオンタ
ンパク質を発現するKi-ChMマウスの潜伏期間は151± 6.
7日であった。同じ材料接種のトランスジェニックマウ
ス３系統（Tg-ChM#30, Tg-ChV#12, Tg-ChV#21）はそれ
ぞれ、156±14.2日、175±15.3日、192± 4.0日を示し
た（表１）。全ヒトプリオンタンパク質を発現するKi-H
uMマウスの潜伏期間が643±42.9日であるのに対して、
著しく潜伏期間が短縮された。一方、導入遺伝子をもた
ないWild（野生型）マウスにおいては、発病したのは14
例中わずか5例36％の発病率であり、その潜伏期間も759
±69.8日間であった。
【００６８】また、コドン129がバリンとメチオニンの
ヘテロ型のヒト孤発例CJD(129V/M) -Suを接種されたノ
ックインマウスでは潜伏期間141± 5.3日であり、同じ
くヘテロ型の孤発例CJD(129V/M)-Phを接種されたトラン
スジェニックマウス３系統（Tg-ChM#30, Tg-ChV#12, Tg
-ChV#21）ではそれぞれ、154±20.8日、171± 9.2日、1
88± 1.4日の潜伏期間であった（表１）。
【００６９】
【表１】
【００７０】これらのことから、実施例２及び３で得ら
れた本発明のノックインマウス及びトランスジェニック
マウスはヒトプリオンに対して非常に高い感受性を要
し、これまでの野生型マウスでは長い期間を要し、不確
定であったヒトプリオンの感染性の証明が短期間で確実
に実施できることが明らかとなった。特に、ノックイン
マウスではヒトプリオンタンパク質遺伝子の多型である
129番目のコドンがメチオニンあるいはバリンヘテロ型
どちらのヒトプリオンに対しても150日前後と、今まで
に見られない短い潜伏期間で感染が成立した。これは、
ヒトのプリオンタンパク質遺伝子多型に対応できること
を示す結果である。同時にこれらの感染潜伏期間はマウ
ス順化株プリオンのマウスからマウスの感染潜伏期間に
匹敵し、プリオン感染に存在する‘種の壁’を越えたと
考えられる。さらに、全ヒト型のノックインマウスKi-H
uMの長い潜伏期間に対して、ノックインマウスKi-ChMが
著しい潜伏期間の短縮を示したことは、導入されたベク
ターとそれにより発現した組み換えヒトプリオンタンパ
ク質が、このマウスの感受性を支配していることが明ら
かである。
【００７１】［実施例５］ FDCにおける異常プリオン
タンパク質の組織学的検出 実施例２及び３で得られたノックインマウス及びトラン
スジェニックマウスの発病後にFDCを調べたところ、ト
ランスジェニックマウスでは異常プリオンタンパク質は
検出されなかったが、ノックインマウスでは脾臓、リン
パ節、腸管のリンパ装置（パイエル氏板）のFDCにヒト
型の異常プリオンタンパク質の沈着を認めた（図２
Ａ）。
【００７２】［実施例６］ ウエスタンブロット法によ
る異常プリオンタンパク質の検出 本発明者等は更に、免疫染色で確認した脾臓への異常プ
リオンタンパク質の沈着を、ウエスタンブロット法にお
いても検討し、ノックインマウスの脾臓において異常プ
リオンタンパク質の存在を確認した。実施例２で得られ
たノックインマウスを用い、感染させた脾臓、非感染
（対照）の脾臓、及び感染させた脳のウエスタンブロッ
トを分析した。
【００７３】プロテイナーゼＫ処理後にウエスタンブロ
ットにかけた場合、異常プリオンタンパク質からは３本
のバンドが形成されることが知られている。図３に示す
ように、感染させた脾臓及び脳由来のサンプルでは、下
から糖鎖のつかないもの、１ヶ所糖鎖がついたもの、２
ヶ所糖鎖がついたものの３本のバンドが認められ、異常
プリオンタンパク質が存在することが明らかであった
が、非感染サンプルでは、相当するバンドは認められな
かった。また、脳と比較して、脾臓での異常プリオンタ
ンパク質の量は少ないことも示された。
【００７４】［実施例７］ ヒト型プリオンタンパク質
Ｃ末端に対する抗体によるFDCの免疫染色実験 ヒト型プリオンタンパク質のＣ末端に対するモノクロー
ナル抗体を作製した。この抗体は、ヒトプリオンタンパ
ク質（配列番号２）のコドン２１５、２１９、２２０を
認識する抗体であり、マウスプリオンタンパク質のそれ
に相当するコドンのアミノ酸配列とは反応しない。実施
例２で得られたノックインマウス（Ki-ChM）はこのコド
ン２１５、２１９、２２０がヒト型ではなく、マウス型
に置換しているため、このモノクローナル抗体では反応
せず、完全ヒト型プリオンタンパク質とのみ反応する。
このノックインマウスを、完全ヒト型の異常プリオンタ
ンパク質をもつ孤発例のCJDの脳乳剤で感染させた。FDC
が単に接種した完全ヒト型の異常プリオンタンパク質を
集積したのであれば、この抗体で染色されるはずである
が、実験ではノックインマウスの異常プリオンタンパク
質を全く染めなかった。つまり、単に接種した完全ヒト
型のプリオンタンパク質が集まったのではなく、ノック
インマウス自身のＣ末がマウス型となったヒト型プリオ
ンタンパク質が異常になったものがFDCで沈着していた
のである。
【００７５】［実施例８］ トランスジェニックマウス
とノックインマウスの比較 実施例５でトランスジェニックマウスではFDCへの異常
プリオンタンパク質の沈着が検出できず、ノックインマ
ウスで検出できた理由を検討するために、脾臓での組み
換えプリオンタンパク質の発現をウエスタンブロットで
測定した。
【００７６】ノックインマウス（Ki-ChM）の脾臓、及び
脳においてノックインマウスと比較して組み換えプリオ
ンタンパク質を２倍量発現しているトランスジェニック
マウス（Tg-ChV#12）の脾臓での正常型プリオンタンパ
ク質の発現量をウエスタンブロットで検討した。結果を
図６に示す。図６において、ａ−ｄはノックインマウ
ス、ｅはトランスジェニックマウスである。ｄ及びｅは
同じ組織重量の脾臓の分画を電気泳動したもので、ｄに
対してｃはその50％、ｂは25％、ａは12.5％の組織重量
の分画を電気泳動している。ｅの免疫反応の強度はｂに
ほぼ相当すると考えられ、トランスジェニックマウスで
はノックインマウスの約２５％程度しか発現していない
ことが明らかとなった。
【００７７】この結果から、トランスジェニックマウス
における発現分布は野生型マウスの発現分布と異なるこ
とが明らかとなり、トランスジェニックマウスでは、脾
臓（FDC）での組み換えプリオンタンパク質の発現が見
られないのではなく、発現量が極めて少ないことから、
トランスジェニックマウスでの脾臓のFDC陰性結果につ
ながったものと考えられる。従って、適当な検出方法を
用いることにより、本発明のトランスジェニック動物を
用いてもFDCでの異常プリオンタンパク質の沈着を検出
できることが示された。
【００７８】［実施例９］ ヒトプリオン感染後発病マ
ウスの感染性の確認 直接感染実験において、マウスの脳、脾臓に証明された
異常プリオンタンパク質の感染性について証明した。孤
発性CJD症例の10％脳乳剤を実施例２で得られたノック
インマウス（Ki-ChM）に脳内接種し、発病したノックイ
ンマウス（Ki-ChM）の脳、脾臓をリン酸緩衝液（PBS）
を用いて10％の濃度になるようにガラスホモゲナイザー
で脳乳剤作成し、麻酔下でノックインマウス（Ki-ChM）
の右脳半球に27ゲージ針のシリンジを用いて２０マイク
ロリットルずつ脳内接種を行った。本明細書中に記載の
実施例すべてのマウス接種実験で行われている定法通
り、接種後の観察記録で自発運動の減少、歩行失調、異
常歩行、挙尾反応などの神経症状が現れ、進行し、削
痩、衰弱がみられた個体は安楽死の後、剖検、診断し
た。
【００７９】その結果、発病マウス脳乳剤を接種したマ
ウスでは６頭中６頭（100％）が発病し、潜伏期間は123
±10.0日であった。一方、発病マウス脾臓乳剤を接種し
たマウスでも、５頭中５頭（100％）が発病し、潜伏期
間は156±7.9日でであった。この結果から明らかなごと
く、ヒト脳乳剤を接種後発病したノックインマウス（Ki
-ChM）の脳、脾臓（FDC）には、異常タンパク質の沈着
のみならず、感染力もあることが証明された（表２）。
【００８０】
【表２】
【００８１】［実施例１０］ FDCにおけるCJD患者の異
常プリオン検出実験 CJD患者の凍結脳をリン酸緩衝液（PBS）を用いて10％の
濃度になるようにガラスホモゲナイザーで脳乳剤作成
し、ノックインマウス（Ki-ChM）腹腔内に26ゲージ針の
シリンジを用いて50マイクロリットルずつ接種を行っ
た。接種後75日に安楽死を施し、剖検した。剖検時に緩
衝ホルマリン固定を行った。主要臓器の一部は摂氏マイ
ナス７０度に凍結保存した。また、すべてのマウスは、
プリオン専用の病理標本作製室にてパラフィン包埋、薄
切後、HE染色ならびに発明者の考案したオートクレーブ
法による免疫組織染色により、FDCにおける異常プリオ
ンタンパク質沈着を検査した。
【００８２】その結果、コドン129がメチオニンホモ型
のヒト孤発例CJD(129M/M)-H3、バリンとメチオニンのヘ
テロ型ヒト孤発例CJD(129V/M)−Su、ヒト硬膜移植例CJD
-TMD-Du/cのいずれの症例のヒトプリオン接種において
も、全てのKi-ChMマウスでFDCにおける異常プリオンタ
ンパク質が検出され、検出率100％であった（表３）。
【００８３】
【表３】
【００８４】［実施例１１］ 硬膜移植例CJDの感染 硬膜移植後CJDを発症し確定診断された患者の凍結脳（C
JD-TMD-Du/c）をリン酸緩衝液（PBS）を用いて10％の濃
度になるようにガラスホモゲナイザーで脳乳剤作成し、
ノックインマウス（Ki-ChM）の腹腔内に26ゲージ針のシ
リンジを用いて50マイクロリットルずつ接種を行った。
接種後75日に安楽死を施し、剖検した。剖検時に緩衝ホ
ルマリン固定を行った。主要臓器の一部は摂氏マイナス
７０度に凍結保存した。また、すべてのマウスは、プリ
オン専用の病理標本作製室にてパラフィン包埋、薄切
後、HE染色ならびに発明者の考案したオートクレーブ法
による免疫組織染色により、FDCにおける異常プリオン
タンパク質沈着を検査した。その結果、５頭接種した全
Ki-ChMマウスの脾臓FDCに異常プリオンタンパク質が検
出された（表３）。
【００８５】［実施例１２］ 英国nvCJD患者由来の異
常プリオン検出 英国で牛のBSE由来ではないかと推定されている変異型C
JD（以下、nvCJDと略す）患者の凍結脳をリン酸緩衝液
（PBS）を用いて10％の濃度になるようにガラスホモゲ
ナイザーで脳乳剤を作成し、プリオン以外の感染性因子
を除去するために摂氏60度30分間を保持した後、接種ま
での間、摂氏マイナス70度に凍結保存した。接種に際し
て、解凍し、ノックインマウス（Ki-ChM）腹腔内に26ゲ
ージ針のシリンジを用いて50マイクロリットルずつ接種
を行った。接種後75日に安楽死を施し、剖検した。剖検
時に緩衝ホルマリン固定を行った。主要臓器の一部は摂
氏マイナス７０度に凍結保存した。また、すべてのマウ
スは、プリオン専用の病理標本作製室にてパラフィン包
埋、薄切後、HE染色ならびに発明者の考案したオートク
レーブ法による免疫組織染色により、FDCにおける異常
プリオンタンパク質沈着を検査した。
【００８６】その結果、３例のnvCJD患者脳、nv-96/0
2、nv-96/07、nv-96/45について、それぞれ５頭中５
頭、４頭中４頭、４頭中４頭と、100％の検出率で異常
プリオンタンパク質が検出された。本発明のノックイン
マウス（Ki-ChM）のFDCを用いた新しいバイオアッセイ
法は英国のnvCJD患者由来プリオンの診断にも有用であ
った（表４）。
【００８７】
【表４】
【００８８】［実施例１３］ アッセイ系の検討１（脳
内投与及び腹腔内投与） ヒトCJD患者の凍結脳をリン酸緩衝液（PBS）を用いて10
％の濃度になるようにガラスホモゲナイザーで脳乳剤を
作成し、プリオン以外の感染性因子を除去するために摂
氏60度30分間を保持した後、接種までの間、摂氏マイナ
ス70度に凍結保存した。接種時に解凍し、麻酔下で実施
例２で得られたノックインマウス（Ki-ChM）の右脳半球
に27ゲージ針のシリンジを用いて２０マイクロリットル
ずつ脳内接種を行った。接種後の観察記録で自発運動の
減少、歩行失調、異常歩行、挙尾反応などの神経症状が
現れ、進行し、削痩、衰弱がみられた個体は安楽死の
後、剖検した。神経症状が現れて安楽死までの期間は平
均21日程度を要した。潜伏期間は接種日を０日とし安楽
死までの期間とした。剖検時に緩衝ホルマリン固定以外
に、主要臓器の一部は摂氏マイナス７０度に凍結保存し
た。また、すべてのマウスは、プリオン専用の病理標本
作製室にてパラフィン包埋、薄切後、HE染色ならびに発
明者の考案したオートクレーブ法による免疫組織染色に
より、病変と異常プリオンタンパク質沈着による組織診
断を行い、プリオン病の有無を確認した。
【００８９】
【表５】
【００９０】その結果、ノックインマウスのうち、コド
ン129がメチオニンホモ型であるヒト孤発例CJD(129M/M)
-H3を接種されたマウスでは、潜伏期間は151± 6.7日で
あり、腹腔内接種では潜伏期間は延長したが、283± 9.
2日で11頭全てが発病した。また、コドン129がバリンと
メチオニンのヘテロ型のヒト孤発例CJD(129V/M) -Suを
接種されたノックインマウスでは潜伏期間141± 5.3日
であった。ヘテロ型でコドン232のメチオニンがアルギ
ニンに変換した遺伝子変異をもつヒト脳乳剤では潜伏期
間はやや延長し、177±4.9日を呈したが、全例発病し
た。硬膜移植後のCJDヒト10％脳乳剤TMD-Du/Cも167±2
4.7日の潜伏期間で発病した。
【００９１】これらのことから、本発明のノックインマ
ウス、Ki-ChMは種々のタイプのヒトプリオンに対して高
い感受性を有することが明らかになった。また、接種ル
ートも脳内のみならず、腹腔内接種でも感受性を有する
ことから、様々の末梢からの感染に関してもヒトプリオ
ンの感受性を有することが予測できる。
【００９２】［実施例１４］ アッセイ系の検討２−経
時的観察 孤発例CJDヒト凍結脳をリン酸緩衝液（PBS）を用いて10
％の濃度になるようにガラスホモゲナイザーで脳乳剤を
作成し、プリオン以外の感染性因子を除去するために摂
氏60度30分間を保持した後、接種までの間、摂氏マイナ
ス70度に凍結保存した。接種時に解凍し、実施例２で得
られたノックインマウス（Ki-ChM）の腹腔内に26ゲージ
針のシリンジを用いて50マイクロリットルずつ接種を行
った。接種後14日、31日、44日、60日、75日、150日に
安楽死させた。剖検時に緩衝ホルマリン固定以外に、主
要臓器の一部は摂氏マイナス７０度に凍結保存した。ま
た、すべてのマウスは、プリオン専用の病理標本作製室
にてパラフィン包埋、薄切後、HE染色ならびに本発明者
の考案したオートクレーブ法による免疫組織染色によ
り、病変と異常プリオンタンパク質の検出を行った。
【００９３】その結果、免疫組織染色で接種後14日のノ
ックインマウス（Ki-ChM）４頭中２頭（50％）のFDCに
異常プリオンタンパク質の沈着が認められた。以降、31
日から150日まで、全ての接種マウスのFDCに異常プリオ
ンタンパク質が陽性であった。しかしながら、標的臓器
である中枢神経系においては14日から150日に至るまで
異常プリオンタンパク質の検出、その他の病理組織学的
変化は認められなかった。
【００９４】本発明のノックインマウス（Ki-ChM）を用
いたFDCによるバイオアッセイ法では14日という非常に
短い期間で、異常プリオンタンパク質が検出でき、これ
は持続して検出できることが明らかである（表６）。
【００９５】
【表６】
【００９６】［実施例１５］ アッセイ系の検討３−濃
度の検討 実施例１４により、孤発性CJDヒト10％脳乳剤を使い、
最短14日で本発明のノックインマウス（Ki-ChM）のFDC
で異常プリオンタンパク質の沈着が検出できることを明
らかにしたが、次に、接種材料の希釈によりどのくらい
の濃度まで検出できるかを検討した。
【００９７】上述の孤発性CJDヒト10％（10倍希釈）凍
結脳乳剤を解凍し、同じPBSにて1％（100倍希釈）、0.1
％（1,000倍希釈）、0.01％（10,000倍希釈）液を調整
し、実施例２で得られたノックインマウス（Ki-ChM）の
腹腔内に26ゲージ針のシリンジを用いて50マイクロリッ
トルずつ接種を行った。接種後75日に安楽死させ、緩衝
ホルマリン液に固定した。標本はプリオン専用の病理標
本作製室にてパラフィン包埋、薄切後、本発明者の考案
したオートクレーブ法による免疫組織染色により、異常
プリオンタンパク質の検出を行った。
【００９８】その結果、0.0１％（10,000倍希釈）でも8
0％以上の個体でFDCに異常プリオンタンパク質が検出さ
れた。このことから、本発明のノックインマウス（Ki-C
hM）のFDCを用いることによって、10,000倍以上の希釈
を行っても孤発性CJDヒト脳の感染性を検出することが
可能であることが示された。
【００９９】［実施例１６］ ノックインマウスKi-ChM
とKi-HuMの感受性の比較 実施例２で作製した２系統のノックインマウスKi-ChMと
Ki-HuMを用いて脳内接種と腹腔内接種による感受性の比
較試験を行った。すなわち、孤発性CJD症例CJD(129M/M)
-H3の10％脳乳剤を実施例２で得られたノックインマウ
スKi-ChMとKi-HuMの右脳半球に27ゲージ針のシリンジを
用いて２０マイクロリットルずつ脳内接種を行った。ま
た、腹腔内には26ゲージのシリンジを用いて50マイクロ
リットルずつ接種した。
【０１００】脳内接種では、本明細書中に記載の実施例
すべてのマウス接種実験で行われている定法通り、接種
後の観察記録で自発運動の減少、歩行失調、異常歩行、
挙尾反応などの神経症状が現れ、進行し、削痩、衰弱が
みられた個体は安楽死の後、剖検、診断した。潜伏期間
は接種日を０日とし安楽死までの期間とした。剖検時に
緩衝ホルマリン固定以外に、主要臓器の一部は摂氏マイ
ナス７０度に凍結保存した。
【０１０１】腹腔内接種では接種後75日に安楽死を施
し、剖検した。剖検時に緩衝ホルマリン固定を行った。
主要臓器の一部は摂氏マイナス７０度に凍結保存した。
また、すべてのマウスは、プリオン専用の病理標本作製
室にてパラフィン包埋、薄切後、HE染色ならびに発明者
の考案したオートクレーブ法による免疫組織染色によ
り、FDCにおける異常プリオンタンパク質の沈着を検査
した。
【０１０２】その結果、ヘテロ接合体のヒト型ノックイ
ンマウスKi-ChMは151±6.7日の潜伏期間で全例発症し
た。一方、完全なヒトプリオンタンパク質（配列番号１
０、通常５回ある８アミノ酸の繰り返し配列が４回とな
っている）を発現するノックインマウスKi-HuMでは、全
例発症したものの非常に長い潜伏期間643±42.9日を要
した。腹腔内接種75日後の脾臓のFDCにおける免疫組織
染色ではKi-ChMは100％（５頭中5頭）に異常プリオンタ
ンパク質を検出できたが、Ki-HuMでは80％（5頭中4頭）
の検出率にとどまった（表７）。
【０１０３】
【表７】
【０１０４】脳内接種の潜伏期間と75日後のFDCにおけ
る異常プリオンタンパク質検出率をあわせて考えると、
ノックインマウスではコンストラクトの如何に関わらず
FDCにおける異常プリオンタンパク質沈着が必ず起こる
ことが明らかとなった。つまり、FDCにプリオンタンパ
ク質が有効に発現するノックイン法を使えば、脳でプリ
オンタンパク質の異常化の起こりにくい完全ヒト型の動
物でも、FDCではある程度有効に異常化が見とめられる
ことが明らかになったわけである。また同時に、潜伏期
間の長い系統、すなわち脳での異常化が起こりにくい完
全ヒト型の動物でのFDCの陽性率が100％とならないこと
は、FDCにおける異常プリオンタンパク質の沈着も、マ
ウスのヒトプリオンに対する感受性を反映しており、完
全ヒト型のプリオンタンパク質の異常化の起こりにくさ
の反映でもある。
【０１０５】
【発明の効果】上記の如く、本発明により、ヒトのプリ
オンタンパク質に対して従来になく非常に高い感受性を
有する動物モデルを作製することができた。また、この
動物モデルの使用により、ヒトに対するプリオン病の安
全性試験において使用できる新規なスクリーニング方法
を提供することができた。
【０１０６】本発明によって得られたノックイン動物
は、nvCJDの異常プリオンタンパク質のアッセイ系とし
ても非常に優れたものである。特に、腹腔内投与におい
ては、脳内投与と比較して感染因子の接種量を100倍に
上げることができ、感染力が低いと考えられる血液でも
大量に投与することによって、その感染力を調べること
ができる。従って本発明のノックイン動物は、ヒトまた
はヒト以外の動物由来の血液または臓器から作られる製
剤の最終的な安全性試験に必須のものとなることが期待
される。
【０１０７】nvCJDは、ウシ・プリオンタンパク質を経
口接種することによってまず扁桃、及び消化器官のリン
パ装置のFDCに異常プリオンタンパク質が沈着し、このF
DCから脳へ異常プリオンタンパク質が運ばれると考えら
れている。本発明で得られたノックイン動物は、このnv
CJDと同様に末梢の経路からFDCに異常プリオンタンパク
質の沈着を起こし、脳へ異常プリオンタンパク質が運ば
れて発病することがヒトプリオン感染で証明できたもの
である。従ってこのモデルは、単に迅速なバイオアッセ
イの確立だけでなく、将来的にはFDCから脳への異常プ
リオンタンパク質の移行をブロックする薬剤の開発のス
クリーニング系としても役立つものと考えられる。
【０１０８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> President of Tohoku University <120> Method of Screening for Infection Factor of Prion Disease <130> P00-0219 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(762) <400> 1 atg gcg aac ctt ggc tgc tgg atg ctg gtt ctc ttt gtg gcc aca tgg 48 Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 1 5 10 15 agt gac ctg ggc ctc tgc aag aag cgc ccg aag cct gga gga tgg aac 96 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 act ggg ggc agc cga tac ccg ggg cag ggc agc cct gga ggc aac cgc 144 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 tac cca cct cag ggc ggt ggt ggc tgg ggg cag cct cat ggt ggt ggc 192 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 tgg ggg cag cct cat ggt ggt ggc tgg ggg cag ccc cat ggt ggt ggc 240 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 tgg gga cag cct cat ggt ggt ggc tgg ggt caa gga ggt ggc acc cac 288 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 agt cag tgg aac aag ccg agt aag cca aaa acc aac atg aag cac atg 336 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 gct ggt gct gca gca gct ggg gca gtg gtg ggg ggc ctt ggc ggc tac 384 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 atg ctg gga agt gcc atg agc agg ccc atc ata cat ttc ggc agt gac 432 Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg cac cgt tac ccc aac caa 480 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 gtg tac tac agg ccc atg gat gag tac agc aac cag aac aac ttt gtg 528 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 cac gac tgc gtc aat atc aca atc aag cag cac acg gtc acc aca acc 576 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 acc aag ggg gag aac ttc acc gag acc gac gtt aag atg atg gag cgc 624 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 gtg gtt gag cag atg tgt atc acc cag tac gag agg gaa tct cag gcc 672 Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala 210 215 220 tat tac cag aga gga tcg agc atg gtc ctc ttc tcc tct cca cct gtg 720 Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 225 230 235 240 atc ctc ctg atc tct ttc ctc atc ttc ctg ata gtg gga tga 762 Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 1 5 10 15 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala 210 215 220 Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 3 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 35 40 45 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro 65 70 75 80 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met 100 105 110 Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 115 120 125 Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Met 130 135 140 Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile 145 150 155 160 Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 165 170 175 Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys 180 185 190 Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser 195 200 205 <210> 4 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Chimera-type prion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <400> 4 atg gcg aac ctt ggc tac tgg ctg ctg gcc ctc ttt gtg act atg tgg 48 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 act gat gtc ggc ctc tgc aaa aag cgg cca aag cct gga ggg tgg aac 96 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 acc ggt gga agc cgg tat ccc ggg cag ggc agc cct gga ggc aac cgc 144 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 tac cca cct cag ggc ggt ggt ggc tgg ggg cag cct cat ggt ggt ggc 192 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 tgg ggg cag cct cat ggt ggt ggc tgg ggg cag ccc cat ggt ggt ggc 240 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 tgg gga cag cct cat ggt ggt ggc tgg ggt caa gga ggt ggc acc cac 288 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 agt cag tgg aac aag ccg agt aag cca aaa acc aac atg aag cac atg 336 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 gct ggt gct gca gca gct ggg gca gtg gtg ggg ggc ctt ggc ggc tac 384 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 rtg ctg gga agt gcc atg agc agg ccc atc ata cat ttc ggc agt gac 432 Xaa Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg cac cgt tac ccc aac caa 480 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 gtg tac tac agg ccc atg gat gag tac agc aac cag aac aac ttt gtg 528 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 cac gac tgc gtc aat atc aca atc aag cag cac acg gtc acc acc acc 576 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 acc aag ggg gag aac ttc acc gag acc gat gtg aag atg atg gag cgc 624 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 gtg gtg gag cag atg tgc gtc acc cag tac cag aag gag tcc cag gcc 672 Val Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala 210 215 220 tat tac gac ggg aga aga tcc agc agc acc gtg ctt ttc tcc tcc cct 720 Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro 225 230 235 240 cct gtc atc ctc ctc atc tcc ttc ctc atc ttc ctg atc gtg gga tga 768 Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 <210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Chimera-type prion protein <220> <221> VARIANT <222> 129 <223> Xaa=Met or Val <400> 5 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Xaa Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 Val Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala 210 215 220 Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro 225 230 235 240 Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 <210> 6 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ChM-type prion protein <400> 6 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 35 40 45 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro 65 70 75 80 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met 100 105 110 Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 115 120 125 Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Met 130 135 140 Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile 145 150 155 160 Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 165 170 175 Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys 180 185 190 Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg 195 200 205 Ser <210> 7 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ChV type prion protein <400> 7 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 35 40 45 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro 65 70 75 80 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Val Leu Gly Ser Ala Met 100 105 110 Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 115 120 125 Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Met 130 135 140 Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile 145 150 155 160 Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 165 170 175 Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys 180 185 190 Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg 195 200 205 Ser <210> 8 <211> 765 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(765) <400> 8 atg gcg aac ctt ggc tac tgg ctg ctg gcc ctc ttt gtg act atg tgg 48 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 act gat gtc ggc ctc tgc aaa aag cgg cca aag cct gga ggg tgg aac 96 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 acc ggt gga agc cgg tat ccc ggg cag gga agc cct gga ggc aac cgt 144 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 tac cca cct cag ggt ggc acc tgg ggg cag ccc cac ggt ggt ggc tgg 192 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp 50 55 60 gga caa ccc cat ggg ggc agc tgg gga caa cct cat ggt ggt agt tgg 240 Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp 65 70 75 80 ggt cag ccc cat ggc ggt gga tgg ggc caa gga ggg ggt acc cat aat 288 Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn 85 90 95 cag tgg aac aag ccc agc aaa cca aaa acc aac ctc aag cat gtg gca 336 Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala 100 105 110 ggg gct gcg gca gct ggg gca gta gtg ggg ggc ctt ggt ggc tac atg 384 Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met 115 120 125 ctg ggg agc gcc gtg agc agg ccc atg atc cat ttt ggc aac gac tgg 432 Leu Gly Ser Ala Val Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp 130 135 140 gag gac cgc tac tac cgt gaa aac atg tac cgc tac cct aac caa gtg 480 Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val 145 150 155 160 tac tac agg cca gtg gat cag tac agc aac cag aac aac ttc gtg cac 528 Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His 165 170 175 gac tgc gtc aat atc acc atc aag cag cac acg gtc acc acc acc acc 576 Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr 180 185 190 aag ggg gag aac ttc acc gag acc gat gtg aag atg atg gag cgc gtg 624 Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val 195 200 205 gtg gag cag atg tgc gtc acc cag tac cag aag gag tcc cag gcc tat 672 Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr 210 215 220 tac gac ggg aga aga tcc agc agc acc gtg ctt ttc tcc tcc cct cct 720 Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro 225 230 235 240 gtc atc ctc ctc atc tcc ttc ctc atc ttc ctg atc gtg gga tga 765 Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 <210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp 50 55 60 Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp 65 70 75 80 Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn 85 90 95 Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala 100 105 110 Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Val Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp 130 135 140 Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val 145 150 155 160 Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His 165 170 175 Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val 195 200 205 Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro 225 230 235 240 Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 10 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 35 40 45 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly 50 55 60 Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys 65 70 75 80 His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly 85 90 95 Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly 100 105 110 Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro 115 120 125 Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn 130 135 140 Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr 145 150 155 160 Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met 165 170 175 Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser 180 185 190 Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser 195 200
【０１０９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４：キメラ型プリオン遺伝子 配列番号５：キメラ型プリオンタンパク質 配列番号６：ChM-型プリオンタンパク質 配列番号７：ChV-型プリオンタンパク質
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組み換えプリオンタンパク質の構造を
示す模式図である。
【図２】（Ａ）FDCへの異常プリオンタンパク質の沈着
を示す。 （Ｂ）ヒト型プリオンタンパク質のＣ末端を認識する抗
体による免疫染色を示す。
【図３】異常プリオンタンパク質による脾臓及び脳の感
染をウエスタンブロットにより示す。
【図４】本発明のノックイン動物作製に用いられるベク
ター（ノックインベクター）及び相同組み換え、Cre-誘
導型組み換えによるヒト化の一例を示す。
【図５】本発明に用いたトランスジェニックベクターの
構造を示す。
【図６】ノックインマウス及びトランスジェニックマウ
スの脾臓における組み換えプリオンタンパク質の発現を
ウエスタンブロットにより示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｚ 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 毛利 資郎 福岡県福岡市東区馬出３−１−１ 九州大 学医学部内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB05 4B024 AA13 BA80 CA04 EA04 GA14 GA18 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ13 QQ79 QR48 QR72 QR80 QS12 QS36 QS38 QX01 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA25 CA24 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA52 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非ヒト動物の濾胞樹状細胞（FDC）にお
    ける異常プリオンタンパク質の沈着を指標とすることを
    特徴とする、サンプル中のヒトまたはヒト以外のプリオ
    ン病感染因子のスクリーニング方法。
  2. 【請求項２】 該非ヒト動物がヒト化プリオンタンパク
    質遺伝子を発現するトランスジェニック動物であること
    を特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 【請求項３】 該非ヒト動物がヒト化プリオンタンパク
    質遺伝子を発現するノックイン動物であることを特徴と
    する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  4. 【請求項４】 サンプルを該非ヒト動物に腹腔内、脳
    内、血管内、または経口投与することを特徴とする、請
    求項１から３のいずれか１項に記載のスクリーニング方
    法。
  5. 【請求項５】 FDCにおける異常プリオンタンパク質の
    沈着を、組織学的検出法、電気泳動法、及び／または結
    合アッセイによって検出することを特徴とする、請求項
    １から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  6. 【請求項６】 FDCにおける異常プリオンタンパク質の
    沈着を、サンプル投与後１４日〜７００日で検出するこ
    とを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載
    のスクリーニング方法。
  7. 【請求項７】 ヒト化プリオンタンパク質が、非ヒト動
    物プリオンタンパク質遺伝子のエクソン３の一部をヒト
    プリオンタンパク質のエクソン３の一部と置換したもの
    である、請求項１から６のいずれか１項に記載のスクリ
    ーニング方法。
  8. 【請求項８】 ヒト化プリオンタンパク質が、ヒトプリ
    オンタンパク質におけるヒト特異的アミノ酸残基のうち
    Ｃ末端側の６残基が上記スクリーニングに使用する非ヒ
    ト動物プリオンタンパク質の対応するアミノ酸残基と置
    換したものである、請求項１から６のいずれか１項に記
    載のスクリーニング方法。
  9. 【請求項９】 ヒト化プリオンタンパク質が、配列番号
    ６または７に示すアミノ酸配列を含むものである、請求
    項１から６のいずれか１項に記載のスクリーニング方
    法。
  10. 【請求項１０】 非ヒト動物プリオンタンパク質遺伝子
    のエクソン３の一部をヒトプリオンタンパク質遺伝子の
    エクソン３の一部と置換した組み換え遺伝子によってコ
    ードされることを特徴とする、組み換えヒト化プリオン
    タンパク質。
  11. 【請求項１１】 ヒトプリオンタンパク質におけるヒト
    特異的アミノ酸残基のうちＣ末端側の６残基が非ヒト動
    物プリオンタンパク質の対応するアミノ酸と置換したも
    のである、組み換えヒト化プリオンタンパク質。
  12. 【請求項１２】 配列番号６または７に示すアミノ酸配
    列を含む、組み換えヒト化プリオンタンパク質。
  13. 【請求項１３】 請求項１０から１２のいずれか１項に
    記載のタンパク質をコードする遺伝子またはその断片。
  14. 【請求項１４】 下記の（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド
    配列を含む遺伝子またはその断片。 （ａ）配列番号４に示すヌクレオチド配列、（ｂ）配列
    番号４に示すヌクレオチド配列と縮重関係にあるヌクレ
    オチド配列、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列にストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチ
    ド配列であって、請求項１０に記載のタンパク質をコー
    ドするヌクレオチド配列。
  15. 【請求項１５】 請求項１３または１４に記載の遺伝子
    またはその断片を含有するベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項１３または１４に記載の遺伝子
    またはその断片が導入されたトランスジェニック動物。
  17. 【請求項１７】 請求項１３または１４に記載の遺伝子
    またはその断片が導入されたノックイン動物。
  18. 【請求項１８】 FDCにおいてヒト化プリオンタンパク
    質を発現することを特徴とするトランスジェニック動
    物。
  19. 【請求項１９】 FDCにおいてヒト化プリオンタンパク
    質を発現することを特徴とするノックイン動物。
  20. 【請求項２０】 脳及び／又はFDCにおいて請求項１０
    から１２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現して
    なるトランスジェニック動物。
  21. 【請求項２１】 脳及び／又はFDCにおいて請求項１０
    から１２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現して
    なるノックイン動物。
  22. 【請求項２２】 請求項１０から１２のいずれか１項に
    記載のタンパク質を発現するトランスジェニック動物の
    作出方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１０から１２のいずれか１項に
    記載のタンパク質を発現するノックイン動物の作出方
    法。
  24. 【請求項２４】 以下の（ａ）〜（ｆ）の工程： （ａ）非ヒトプリオンタンパク質遺伝子またはその断片
    を含むベクターを構築し、（ｂ）上記非ヒトプリオンタ
    ンパク質遺伝子のエクソン３の一部をヒトプリオンタン
    パク質のエクソン３の一部と置換し、（ｃ）3'非翻訳領
    域にloxpで囲まれた抗生物質耐性遺伝子を挿入し、
    （ｄ）得られた改変ベクターを該非ヒトのES細胞に導入
    し、（ｅ）相同組み換えの認められたクローンからキメ
    ラ動物を作成し、（ｆ）Ｆ１動物の受精卵にCre酵素発
    現プラスミドを導入して抗生物質耐性遺伝子を削除す
    る、ことを含む、請求項２３に記載のノックイン動物の
    作出方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１８若しくは２０に記載のトラ
    ンスジェニック動物、または請求項１９若しくは２１に
    記載のノックイン動物を使用することを特徴とする、ヒ
    トまたはヒト以外のプリオン病の予防及び／または治療
    のための薬剤のスクリーニング方法。
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