KR20030079974A - 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법 - Google Patents

프리온병 감염인자의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030079974A
KR20030079974A KR10-2003-7010113A KR20037010113A KR20030079974A KR 20030079974 A KR20030079974 A KR 20030079974A KR 20037010113 A KR20037010113 A KR 20037010113A KR 20030079974 A KR20030079974 A KR 20030079974A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
human
prion protein
animal
prion
gene
Prior art date
Application number
KR10-2003-7010113A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100544933B1 (ko
Inventor
키타모토데쯔유키
미요시가즈로우
모리시로우
Original Assignee
일본국 (도호꾸 다이가꾸쵸)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일본국 (도호꾸 다이가꾸쵸) filed Critical 일본국 (도호꾸 다이가꾸쵸)
Publication of KR20030079974A publication Critical patent/KR20030079974A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100544933B1 publication Critical patent/KR100544933B1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

혈액 제제 등의 의약품, 식품, 화장품 등의 프리온에 의한 감염 유무를 신속하게 결정하기 위해 동물 모델 등에 의한 CJD 등의 인간 프리온병 감염인자의 조기검출이 필요하게 되었다. 본 발명은 비인간 동물의 여포수상세포(FDC)에서 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하는 것을 특징으로 한다. 시료 중의 인간 또는 인간 이외의 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

프리온병 감염인자의 스크리닝 방법{Method of Screening Prion Disease Infection Factor}
크로이츠펠트 야코프병(Creutzfeldt-Jacob병, 이하 'CJD'라 한다)은 신경병의 하나로서, 노인초기에 치매를 가져오는 질환이다. 발병하면, 환자는 약 3 내지 5개월 후에 소위 잠만자는 식물상태가 되거나 사망에 이른다. CJD에 대한 유효한 치료법은 없고, 증상에 대한 치료만 이루어지고 있는 것이 현실이다.
CJD는 단순히 치매를 가져오는 신경변성 질환이라는 측면 뿐만 아니라 인간에서 인간으로, 또한 동물에서 동물로 감염된다는 것이 알려져 있다. 인간의 뇌를 먹는 것에 의해 감염된다고 알려져 있는 kuru병, 성장 호르몬 제제에 의해 감염되는 CJD, 최근 문제가 되고 있는 경막이식 후 CJD 등이 인간에서 인간으로 감염되는 예이다. 또한, 영국에서 문제가 되고 있는 신변이형 CJD(new variant CJD, nvCJD)는 우해선상 뇌증(bovine spongiform encephalopathy, 이하, 'BSE'라 한다. 일반적으로 '광우병'이라 한다)이 소에서 인간으로 감염된다고 알려져 있다.
1982년, CJD의 감염인자가 단백질성이라는 가설로 인해 프리온이라고 하는 감염인자로 명명되었다. 1985년에는 감염인자 프리온을 구성하는 프리온 단백질의 유전자가 클로닝되었다. 그 결과, 프리온 단백질은 정상적인 동물의 뇌에서도 발현하고, 발병한 환자에서는 정상형 프리온 단백질과 명확하게 구별가능한 이상형 프리온 단백질이 침착한다는 것이 밝혀졌다. 현재, 인간에 있어서 프리온의 이상에 기인하는 소위 프리온병으로서, 상기 kuru병, CJD 외에, Gerstmann-Straussler 증후군(이하, 'GSS'라 한다), 치사성 가족성 불면증(fatal familial insomnia; 이하, 'FFI'라 한다)이 알려져 있다.
인간의 경우, 프리온 단백질은 253개의 아미노산으로 구성되어 있고(서열번호 2), N말단의 22 아미노산으로 이루어진 시그널 서열, C 말단의 23 아미노산이 제거된 후, 당지질 GPI(glycosyl-phosphatidyl-inositol)을 통하여 세포막 표면상에 결합하는 단백질이다(서열번호 3).
한편, 1989년에 프리온 단백질 유전자의 변이가 발견되었고, 가족성인 GSS나 가족성의 CJD가 프리온 단백질의 아미노산 1개의 변이만으로 발병한다는 것이 알려졌으며, 프리온 단백질이 CJD에서 중요한 역할을 하는 것이 밝혀지게 되었다.
또한, 상기 nvCJD는 청년층(10대에서 30대)에서 발병하고, 다른 CJD에서 알려져 있는 중추신경계에서 이상형 프리온 단백질이 침착할 뿐만 아니라, 다른 CJD에서는 확인되지 않는 림파 장치의 여포수상세포(follicular dendritic cell: FDC)에서의 침착도 확인된다는 것이 보고되었다(참조: Hill A.F. et al., Lancet 1997, 349:99-100). nvCJD는 캐리어 환자의 존재가 어느 정도인지가 불명하고, 영국에서는 혈액 제제를 영국 자국의 혈액으로 공급하는 것을 금지할 정도로 심각한 문제가 되고 있다.
그 이유의 하나로서, 동일종에 프리온 전파(감염)가 용이하고, 감염율이 높으며, 또한 잠복기간이 짧은 것에 비해 하나의 종에서 다른 종으로 이행하는 것에는 장기간의 잠복기가 필요하고, 감염율도 매우 낮다는 사실을 예로 들 수 있다. 이러한 종간 장벽 때문에 동물 모델 등을 사용하는 CJD 등의 인간 프리온병의 감염 인자의 존재를 검출하는 것은 매우 곤란하였다.
예컨대, 상기 nvCJD에 대해서, 인간형 유전자도입 마우스의 실험이 시도되었지만(참조: Hill A.F. et al., Nature 1997 Cot 2;389(6650):448-50), 발병까지는 긴 잠복기간(228일 이상)을 필요로 하고, 성공율도 높지 않았다(56마리 중 25마리만 성공). 최근, 소형 유전자도입 마우스를 사용하여 약 250일의 잠복기간으로 감염한 것이 보고되었다(참조: Scott M.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:15137-42).
또한, 시료중의 프리온의 검출방법으로서, 유전자도입 동물을 사용한 예가 보고어(참조: 일본 특개평 제 11-510496호), 마우스를 사용한 예에서는 50일 전후에 스크래피병이 발생한다는 것이 보고되었지만, 인간 프리온병에 대해서는 발병까지 200일 가까이 필요로 하고 있다.
한편, 본 발명자들은 오토클레이브법이라는 신규한 면역염색법을 사용하여CJD 환자 및 CJD 감염 마우스의 중추 신경의 시냅스에 이상 프리온 단백질이 침착하는 것을 증명하였다(Kitamoto, T. et al., Am. J. Pathol., 140:1285- 1294(1992); Muramoto, T. et al., Am. J. Pathol., 140:1411-1420(1992)). 또한, 중추 신경계 이외의 세포, FDC에서도 이상 프리온 단백질이 침착하는 것도 발견하였다(Kitamoto, T. et al., J. Virol., 65:6922-6295(1991)). FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착은 마우스의 발병 보다 훨씬 이전 단계에서 검출할 수 있고, 발병 전에 진단이 가능하다(Muramoto, T. et al., Am. J. Pathol., 140:1411-1420(1992); Muramoto, T. et al., Am. J. Pathol. 143:1470-1479(1993))
통상, 감염인자(마우스 프리온)를 마우스의 두개(cranium)내로 투여하는 경우, 마우스는 120-140일에 발병하지만, FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하는 경우, 투여 30일 후에 감염인자를 투여한 마우스 전부에서 검출이 가능하였다.
상기와 같이, 혈액제제 등의 의약품의 프리온에 의한 감염의 유무를 신속하게 결정하기 위해서, 동물 모델 등에 의한 CJD 등의 인간 프리온병 감염인자의 조기 검출이 필요하게 되었다.
또한, FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착은 마우스계에서만 증명되었고, 종래 인간의 CJD에서는 검출할 수 없었다. 또한, 야생형 마우스에서는 인간 및 마우스 간에 종차가 존재하기 때문에 인간 CJD에서의 초기 감염실험에서는 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착이 확인되지 않는다고 알려져 있다(참조: Muramoto, T. et al., J. Virol. 67:6806-6810(1993)).
따라서, 인간 프리온 단백질의 이상을 직접 검출하는 방법이 필요하게 되었다.
본 발명은 시료 중의 인간 또는 인간 이외의 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법, 신규한 재조합 프리온 단백질, 전기 단백질을 발현하는 유전자도입 동물 및 노크인 동물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 재조합 프리온 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2A는 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 나타낸다.
도 2B는 인간형 프리온 단백질의 C 말단을 인식하는 항체에 의한 면역염색을 나타낸다.
도 3은 이상 프리온 단백질에 의한 비장 및 뇌의 감염을 웨스턴블롯에 의해 나타낸다.
도 4는 본 발명의 노크인 동물 작제에 사용되는 벡터(노크인 단백질) 및 상동 재조합, Cre-유도형 재조합에 의한 인간화의 일례를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 사용한 유전자도입 벡터의 구조를 나타낸다.
도 6은 노크인 마우스 및 유전자도입 마우스의 비장에서 재조합 프리온 단백질의 발현을 웨스턴블롯에 의해 나타낸다.
본 발명자들은 상기 실정에 비추어 예의 검토한 결과, 인간 및 마우스의 프리온 단백질 유래의 신규한 재조합 프리온 단백질을 작제하고, 이것을 도입한 유전자도입 동물 및 노크인 동물을 작제하였다. 그 결과, 지금까지 없었던 시료 중의 인간 또는 인간 이외의 프리온 감염인자를 단기간에 검출할 수 있는, 특히 유효한 스크리닝 방법을 개발하는 것에 성공하였다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (26)을 제공한다.
(1) 비인간(nonhuman) 동물의 여포수상세포(FDC)에서 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 인간 또는 인간 이외의 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법.
(2) 전기 비인간 동물이 인간화 프리온 단백질 유전자를 발현하는 유전자도입 동물인 것을 특징으로 하는 상기(1)에 개시된 스크리닝 방법.
(3) 전기 비인간 동물이 인간화 프리온 단백질 유전자를 발현하는 노크인 동물인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 개시된 스크리닝 방법.
(4) 시료를 전기 비인간 동물의 복강내, 뇌내, 혈관내 또는 경구투여하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(5) FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 조직학적 검출법, 전기영동법 및/또는 결합 어세이(assay)에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(6) FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 시료 투여 후 14일 내지 700일에 검출하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(7) 인간화 프리온 단백질이 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질의 엑손 3의 일부와 치환한 것인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(8) 인간화 프리온 단백질이 인간 프리온 단백질에서 인간 특이적 아미노산 잔기 중 C 말단측의 6잔기가 상기 스크리닝에 사용하는 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산 잔기와 치환한 것인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(9) 인간화 프리온 단백질이 서열번호 6 또는 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 개시된 스크리닝 방법.
(10) 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부와 치환한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 인간화 프리온 단백질.
(11) 인간 프리온 단백질에서 인간 특이적 아미노산 잔기 중 C 말단측의 6 잔기가 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산과 치환한 것인 재조합 인간화 프리온 단백질.
(12) 서열번호 6 또는 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간화프리온 단백질.
(13) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 개시된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그의 단편.
(14) 하기 (a) 내지 (c)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 또는 그의 단편:
(a) 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열과 축합중합 관계에 있는 뉴클레오티드 서열; 및,
(c) (a) 또는 (b)의 서열에서 엄격한(stringent) 조건하에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 있어서, 상기 (10)에 개시된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
(15) 상기 (13) 또는 (14)에 개시된 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터.
(16) 상기 (13) 또는 (14)에 개시된 유전자 또는 그의 단편이 도입된 유전자도입 동물.
(17) 상기 (13) 또는 (14)에 개시된 유전자 또는 그의 단편이 도입된 노크인 동물.
(18) FDC에서 인간화 프리온 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 동물.
(19) FDC에서 인간화 프리온 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 노크인동물.
(20) 뇌 및/또는 FDC에서 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하여 이루어지는 유전자도입 동물.
(21) 뇌 및/또는 FDC에서 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하여 이루어지는 노크인 동물.
(22) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하는 유전자도입 동물의 작제방법.
(23) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하는 노크인 동물의 작제방법.
(24) 하기의 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 상기 (23)에 개시된 노크인 동물의 작제방법:
(a) 비인간 프리온 단백질 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터를 구축하는 단계;
(b) 상기 비인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질의 엑손 3의 일부와 치환하는 단계;
(c) 3'비번역 영역에 loxp로 둘러싸인 항생물질 내성 유전자를 삽입하는 단계;
(d) 수득한 개변 벡터를 전기 비인간 ES 세포에 도입하는 단계;
(e) 상동 재조합이라고 인정된 클로닝에서 키메라 동물을 작성하는 단계; 및,
(f) F1 동물의 수정란에 Cre 효소 발현 플라즈미드를 도입하여 항생물질 내성 유전자를 삭제하는 단계.
(25) 상기 (18) 또는 (20)에 개시된 유전자도입 동물, 또는 상기 (19) 또는 (21)에 개시된 노크인 동물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 또는 인간 이외의 프리온병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 스크리닝 방법.
(26) 상기 (18) 또는 (20)에 개시된 유전자도입 동물 또는 상기 (19) 또는 (21)에 개시된 노크인 동물을 사용하는 것을 특징으로 하는 혈액 제제 등 인간 또는 인간 이외의 동물의 장기에서 유래하는 모든 의약품, 식품, 화장품 등의 안정성 시험을 수행하는 방법.
본 명세서는 본원의 우선권인 일본국 특허출원 제 2001-24279호의 명세서 및/또는 도면에 개시된 내용을 포함한다.
서열표의 설명
서열번호 4는 키메라형 프리온 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 5는 키메라형 프리온 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 ChM-형 프리온 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 ChV-형 프리온 단백질의 아미노산 서열이다.
발명을 실시하기 위한 형태
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서에서,「비인간 동물」은 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 돼지, 소, 양, 고양이, 개 등의 포유동물, 조류 및 어류를 의미한다. 본 명세서에서 비인간 동물은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 사육 및 조작 상의 점에서 특히 바람직한 것은 마우스이다.
본 명세서에서「이상 프리온 단백질」은 정상형 프리온 단백질의 입체구조가 변화하고, 계면활성제로 불활성이 되며, 단백질 분해효소로 부분적으로 소화되어 없어진 프리온 단백질을 의미한다. 인간 및 동물의 프리온병에는 정상 프리온 단백질의 외에 반드시 이상 프리온 단백질이 존재하고, 그 존재의 증명은 단백질 분해 효소 처리 후, 웨스턴블롯법이나, 단백질 추출후 전자 현미경을 사용한 이상 프리온 단백질로 구성된 아밀로이드 섬유의 검출, 그리고, 본 발명자들이 개발한 오토클레이브법을 이용한 면역염색법(참조: Shin, R. W. et al., Lab. Invest., 64:693-702(1991); Kitamoto, T. et al., Am. J. Pathol, 140:1285-1294(1992))에 의한 검출 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 본 명세서에서「감염인자」는 인간 또는 본 발명의 유전자도입 동물 또는 노크인 동물에 투여한 경우에 프리온병을 발병시키는 기능을 갖는 인자를 의미하고, 구체적으로, 인간 유래 또는 인간 이외의 동물 유래의 이상 프리온 단백질 또는 그의 단편 또는 이것을 포함하는 것을 의미한다. 감염인자를 포함하는 시료는 예컨대, 인간 또는 인간 이외의 동물 유래의 혈액제제 등의 의약품, 식품, 화장품 등을 예로 들 수 있다.
또한, 본 명세서에서「인간화 프리온 단백질」은, 발현시킨 숙주가 되는 비인간 동물이 본래 발현하는 프리온 단백질의 일부가 인간 프리온 단백질의 서열과 치환된 것을 의미한다. 예컨대, 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 코딩 영역의 일부를 인간 프리온 단백질 유전자의 대응 영역과 치환한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 재조합 인간화 프리온 단백질, 인간 프리온 단백질에서 인간 특이적 아미노산 잔기 중 일부의 잔기가 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산 잔기와 치환한 재조합 인간화 프리온 단백질 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 인간화 프리온 단백질로서, 특히 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부와 치환한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 재조합 인간화 프리온 단백질을 예로 들 수 있다. 이 재조합 인간화 프리온 단백질은 마우스 등의 비인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 재조합에 의해 인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부와 치환하는 것에 의해 수득할 수 있는 유전자를 예컨대, 벡터에 조합하여 숙주에 도입하고, 발현시키는 것에 의해 수득할 수 있다. 여기서, 「엑손 3의 일부」는 엑손 3의 프리온 단백질 번역 영역에 존재하는 SmaI 부위에서 BstEII부위까지의 영역을 필수적으로 포함하는 서열을 의미하고, 또한, 프리온 단백질 유전자에서 단백질 번역 영역은 엑손 3에만 존재한다.
이와 같은 유전자 재조합 등의 본 명세서에 개시된 유전공학적 방법은 당해 분야에서 통상 사용할 수 있는 것이며, 당업자라면 본 명세서에 개시된 내용을 기초로 용이하게 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 인간화 프리온 단백질은 구체적으로, 하기 (a) 내지 (f)의단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 노크인 동물에 의해 상기 인간화 단백질이 발현한다:
(a) 비인간 프리온 단백질 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터를 구축하는 단계;
(b) 상기 비인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질의 엑손 3의 일부와 치환하는 단계;
(c) 3' 비번역 영역에서 loxp로 둘러싸인 항생물질 내성 유전자를 삽입하는 단계;
(d) 수득한 개변 벡터를 전기 비인간 ES세포에 도입하는 단계;
(e) 상동 재조합으로 인정된 클로닝으로부터 키메라 동물을 작성하는 단계; 및,
(f) F1 동물의 수정란에 Cre 효소 발현 플라즈미드를 도입하여 항생물질 내성 유전자를 삭제하는 단계.
또한, 인간화 프리온 단백질은 인간 프리온 단백질에서, 인간 특이적인 것으로 알려져 있는 아미노산 잔기 중, 예컨대, C 말단의 6 잔기가 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산 잔기와 치환한 것으로서, 부위특이적 돌연변이 유발, 또는 화학적 합성 등의 당업자에 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다.
인간 프리온 단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 개시된 염기서열로서, 그 아미노선 서열은 서열번호 2에 개시된 전체 아미노산 서열로서 알려져 있지만, N 말단의 22 아미노산으로 이루어진 시그널 서열, C 말단의 23 아미노산이 제거된 서열번호 3의 아미노산 서열로 프로세싱(processing)된 성숙 단백질로 이루어진다. 이 서열번호 3에서, 33, 34, 50, 58, 75, 87, 90, 116, 121, 123, 133, 144, 146, 193, 197, 198, 205, 206 및 208번째의 잔기가 인간 특이적이라고 알려져 있다(참조: Kretzschmar, H.A. et al., DNA, 1986, 5:315-24). 본 발명자들은 이러한 인간 특이적 아미노산의 비인간 동물에 대응하는 아미노산과의 치환에 대해 다양하게 검토한 결과, 본 발명에 따른 스크리닝 방법을 사용함으로써 특히 C 말단의 6 잔기가 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산 잔기와 치환한 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 이 서열의 일례를 서열번호 6 또는 7에 개시하였다. 서열번호 6은 코돈 129가 메티오닌이고, 서열번호 7은 코돈 129가 발린이다. 이러한 다형은 정상적인 인간 프리온 단백질에서도 발견할 수 있고, 인간의 각종 프리온병에서 발견되는 이상 프리온 단백질에서도 존재한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 관한 상기 인간화 프리온 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그의 단편 및 전기 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에 관한 인간화 프리온 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 서열번호 6 또는 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간화 프리온 단백질을 코딩하는 것이지만, 다른 태양으로서 예컨대, 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 및 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열과 축합중합 관계인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 및 이러한 서열에서 엄격한 조건 하에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 예로 들 수 있다. 여기서, 엄격한 조건은 소위, 특이적인 하이브리드가 형성되는 조건을 의미한다. 예컨대, 상보성이 높은 뉴클레오티드 서열, 즉 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열들은 하이브리다이즈하고, 그것보다 상보성이 낮은 뉴클레오티드 서열들은 하이브리다이즈하지 않는 조건을 예로들 수 있다. 보다 구체적으로, 나트륨 농도가 15 내지 300mM, 바람직하게는 15 내지 75mM이고, 온도가 50 내지 60℃, 바람직하게는 55 내지 60℃의 조건을 의미한다. 유전자는 DNA 및 RNA 어느 것도 무관하고, 또한 합성에 의해 수득할 수 있는 것이어도 무관하다. 또한,「단편」은 프리온 단백질 유전자의 일부로서, 바람직하게는 서열번호 2에서 코돈 85 내지 코돈 230까지를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이 서열의 결손형이어도 무관하고, 최단 300 뉴클레오티드 정도 길이의 길이의 것을 의미한다.
전기 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터는 전기 유전자가 도입된 숙주 동물 세포에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이어도 무관하고, 당해 분야에서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 액틴프로모터를 이용한 임의의 세포에서도 발현이 인정되는 벡터 등을 예로 들 수 있다. 또한, 전기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터, 인핸서, 그 밖의 조절 유전자 등을 적의 조합할 수 있다. 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 프로모터는 예컨대, FDC에서 발현을 촉진하도록 하는 프로모터, 예컨대 CD21(Cr2) 유전자의 프로모터 등을 예로 들 수 있고, 문헌으로서 예컨대[Zabel. M.D. et al, J. Immunol. 2000 Oct 15;165(8):4437-45]를 참조하면 바람직하다.
한편, 종래 프리온 단백질 유전자를 도입한 유전자도입 마우스의 작제는 개략적으로 보고되어 있다(참조: Telling G.C. et al., Cell 1995, Oct. 6:83(1) 79-90). 하나는 도 1에 개시한 바와 같이, 완전한 인간형 프리온 단백질의 유전자를 도입한 것이고, CJD 발병까지의 잠복기간은 약 250일 이었다. 다른 하나는 도 1A에 나타낸 바와 같이, KpnI 부위에서 BstEII 부위까지가 인간 프리온 단백질 유래의 서열이고, N 말단 및 C 말단이 마우스 프리온 단백질 유래의 서열로 이루어진 단백질의 유전자를 도입하고, 잠복기간이 약 200일 이었다. 이에 비하여, 본 발명의 유전자도입 마우스는 도 1B에 개시한 바와 같이 N 말단에서 BstEII 부위까지 인간 프리온 단백질 유래의 서열이고, C 말단이 마우스 프리온 단백질 유래의 서열로 이루어진 단백질의 유전자를 도입한 것이다.
본 발명자들은 도 1B에 모식적으로 개시한 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 6 또는 7)을 도입한 유전자도입 마우스를 작제하고, 호모의 경우에 발병까지 잠복기간이 평균 147일인 것을 수득할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 6 또는 7에 개시한 재조합 인간화 프리온 단백질을 발현하는 유전자도입 동물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 유전자도입 동물은 호모이어도 헤테로이어도 무관하지만, 바람직하게는 호모형이다.
그러나, 유전자도입 동물은 유전자가 어느 염색체상의 어느 위치에 도입되어 있는지가 불명하고, 또한, 상기와 같이 짧은 잠복기간을 나타내는 것을 수득하기 위해서 프리온 단백질 유전자의 노크아웃트 동물과 교배해야 한다. 본 발명자들은 이전에 마우스 유전자를 인간형으로 치환하고, ES 세포를 사용한 유전자 치환법을 확립하였다(참조: Kitamoto, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:742-747(1996)). 이 방법을 개량하여 천연의 마우스 유전자의 일부를 상기 서열번호 1에 개시한 서열을 갖는 인간 유전자와 치환한 노크인 마우스를 작제하였다. 이 노크인 마우스는 잔복기간이 평균 151일 이었다.
즉, 본 발명은 서열번호 6, 7 또는 10에 개시한 재조합 인간화 프리온 단백질을 발현하는 노크인 동물을 제공한다. 본 발명에서, 노크인 동물은 호모이어도 헤테로이어도 무관하지만, 바람직하게는 호모형이다. 재조합 인간화 프리온 단백질의 발현은 전신에서 발견되지만, 특히 뇌 및/또는 또는 비장(spleen)에서 검출할 수 있다.
ES 세포를 사용한 유전자 치환법의 장점은 상기와 같이 유전자도입 동물에서 문제였던 마우스내인성 프리온 단백질을 배제하기 위해 노크아웃트 동물과 교배하지 않아도 무관하다는 점이다. 또한, 유전자 발현의 분포·발현량도 정상적인 동물과 동일하고, 모두 자연적인 발현을 얻을 수 있다는 장점을 갖는다.
인간화 프리온 단백질을 도입한 모델동물에서는 인간 또는 인간 이외 동물 유래의 감염인자를 투여하면 이상 프리온 단백질의 침착이 FDC에서 검출될 수 있다는 것이 예상된다. 따라서, 인간형 유전자도입 동물은 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 한 감염인자의 신속한 스크리닝 방법에 사용할 수 있다.
상기 예상에 기초하여, 본 발명자들이 수득한 유전자도입 마우스 및 노크인 마우스의 발병 후에 FDC를 조사한 바, 유전자도입 마우스에서는 이상 프리온 단백질은 거의 검출되지 않았지만, 노크인 마우스에서는 비장, 림파절, 장관의 림파장치(파이엘씨판)의 FDC에서 인간형 이상 프리온 단백질의 침착을 확인하였다(참조:도 2A).
종래, FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착이 감염실험시에 투여한 재료에 포함되어 있는 이상 프리온 단백질이 모인 것인지, 또는 FDC에서 정상 프리온 단백질에서 이상 프리온 단백질로의 변환이 생긴 것인지를 결정할 수 없었다. 본 발명에 따른 서열번호 6 또는 7에 개시된 재조합 프리온 단백질은 상기와 같이 C 말단이 마우스형이기 때문에 본 발명자들은 이어서 인간형 프리온 단백질의 C 말단에 대한 항체를 작제하였다. 이 항체에서 FDC를 조사한 바, FDC를 염색한 것은 없었다(참조: 도 2B). 이것으로부터, FDC에 침착한 이상 프리온 단백질은 감염인자에 포함되어 있는 인간형 이상 프리온 단백질이 단순히 모인 것이 아니라는 것을 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 면역염색으로 확인한 비장에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 웨스턴블롯법에서도 검토하고, 노크인 마우스의 비장에서 이상 프리온 단백질의 존재를 확인하였다(참조: 도 3). 또한, 직접 감염실험시에 비장에서 감염성이 존재하는 것도 증명되었다(참조: 표 2, 접종실험 3).
본 발명자들이 작제한 노크인 마우스는 발병까지 평균 151일의 잠복기간을 갖고 있지만, FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착이 검출될 수 있기까지의 최단기간을 검토하였다. 그 결과, 본 발명의 노크인 마우스를 사용한 어세이시스템에서는 14일이라는 매우 단기간으로 검출이 가능하다는 것을 확인하였다(참조: 표 6).
한편, 완전한 인간 프리온 단백질(서열번호 10, 8 아미노산의 결손)을 발현하는 Ki-HuM에서는 모든 예에서 발병하는데 매우 짧은 잠복기간 643일을 필요로 하였다. 복강내 접종 75일 후의 비장의 FDC에서 면역조직 염색도 80%(5두 중 4두)의 검출율에 이르렀지만, Ki-ChM과 동일하게 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 확인하였다(참조: 표 7). 즉, FDC에서 프리온 단백질이 유효하게 발현하는 노크인법을 사용하면, 뇌에서 프리온 단백질의 이상화를 일으키기 어려운 완전 인간형의 동물에서도 FDC에서 어느 정도 유효하게 이상화를 발견할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 것으로부터, FDC에서 프리온 단백질이 유효하게 발현하는 본 발명자들이 청구하는 방법에 의한 노크인 동물을 사용하면, 특정 영역을 치환한 프리온 단백질 유전자 뿐만 아니라, 소 등의 인간 이외의 동물의 프리온 단백질을 발현하는 노크인 동물에서, FDC에서 소 등의 인간 이외의 동물의 이상 프리온 단백질의 침착도 검출할 수 있다.
본 발명의 노크인 동물은 상기와 같이 종래에 없는 프리온 고감수성 동물인 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명은 본 발명의 노크인 동물을 사용하여 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하고, 시료 중의 인간 또는 인간 이외의 동물의 프리온병 발병의 유무를 검출하는 바이오 어세이(bio assay)를 제공한다. 이 어세이는 시료 중의 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법으로 이용할 수 있다.
시료는 예컨대, 혈액, 혈액제제 등, 인간 또는 인간 이외의 동물의 장기에 유래하는 모든 의약품, 식품, 화장품 등을 예로 들 수 있다. 시료를 비인간동물, 바람직하게는 인간화 프리온 단백질을 발현하는 유전자도입 동물, 특히 바람직하게는 본 발명의 노크인 동물에 감염시킨다. 시료의 투여는 복강내, 뇌내 또는 혈관내 투여 또는 경구투여 어느 것이어도 무관하지만, 복강내 투여의 경우에는 하기에 개시하는 바와 같이, 상대적으로 다량의 시료를 투여할 수 있기 때문에 바람직하다. 구체적으로, 혈액·장기 등 또는 그것에 유래하는 제제를 포함하는 용액을 노크인 동물의 복강내에 예컨대, 2ml 정도 투여하여 감염시킨다.
감염 후, FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 검출하는 것에 의해, 시료에 의한 프리온병 발병의 유무를 결정할 수 있다. 검출방법은 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착을 검출할 수 있는 것이면 어느 것이라도 무관하지만, 예컨대, 비장, 림파절, 장관의 림파장치인 파이엘씨판의 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 전자현미경 등에 의해 관찰하는 조직학적 검출법, 전기영동법 및 /또는 이상 프리온 단백질에 대한 항체를 방사성 또는 비방사성 표지하여 결합 어세이를 수행하는 방법, 예컨대, in situ 하이브리다이제이션, 웨스턴블롯법 및 ELIZA법 등을 예로 들 수 있다. 검출은 감염 후 경시적으로 수행해도 무관하지만, 미리 감염인자 존재시에 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착까지의 기간을 대조군 시료에 의해 결정하고, 시료 감염에서 기간, 예컨대 75일 경과후에 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착의 유무를 검출하는 방법이어도 무관하다. 검출시기는 특별히 한정되는 것은 아니고, 투여에서 14일 내지 700일 사이이면 바람직하다. FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하는 것으로 종래와 비교하여 매우 단기간에 감염인자의 존재를 결정할 수 있다.
인간의 프리온병, 특히 CJD에서는 마우스 모델과 같이 FDC에서 이상 프리온 단백질이 발견된다는 것은 지금까지 전혀 보고되지 않았다. 그것은 CJD가 거의 단독으로 발생하는 것이고, 외부에서의 감염에 의한 것이 아니라는 사실과 일치한다. 그러나, 1996년에 영국에서 발생한 nvCJD는 광우병 유래의 감염인자가 관계되어 있다고 알려졌고, 감염성 프리온병으로 평가되었다. 따라서, 감염인자의 검출은 매우 중요하게 되었다.
또한, 본 발명은 감염인자를 복강내, 뇌내, 혈관내 또는 경구투여하는 것에 의한 스크리닝 방법을 제공한다.
종래, 감염실험은 주로 뇌내 투여에 의해 수행되었다. 감염인자를 포함하는 시료를 뇌내에 투여하는 경우에는 투여량이 제한되는 제약이 있다. 마우스의 뇌내에는 최대한 20㎕ 밖에 투여할 수 없지만, 복강내이면 2ml의 시료도 투여할 수 있고, 더구나 복수회의 투여도 가능하다.
감염인자의 농도가 낮다고 인정되는 혈액을 포함하는 일반 장기의 바이오 어세이에서는 이의 100배에 이르는 양적인 차는 검출감도에 크게 영향을 미친다. 예컨대, CJD감염 마우스의 경우, 뇌내 투여에 의한 감염실험에서는 뇌에서 LD 50이 10-8/g이고, 혈액은 10-3/g 이하이다. 이것은 뇌내 투여로서 20㎕를 사용한 결과이지만, 복강내 투여에서는 100배량의 시료를 투여할 수 있고, 이에 따라 10-3/g의 장기(혈액)의 감염실험을 10-5/g에 상당하는 높은 감염성 장기(비장 등)과 동일한 수준으로 할 수 있다. 따라서, 복강내 투여는 시료중의 감염인자의 스크리닝 방법에서 금후 매우 기대되는 투여방법이다.
지금까지, 인간의 유전자도입 마우스 모델에서는 감염인자의 복강내 투여에서의 발병은 보고되지 않았다. 본 발명자들의 유전자도입 마우스의 자료에서 FDC에서 이상 프리온 단백질이 침착하지 않는 것, 복강내 투여 등의 말초에서의 발병은 어렵다는 것이 시사되었다. 또한, 두개(cranium)내 투여에서는 발병하지만, 복강내 투여에서는 발병하지 않는 SCID 마우스(T 세포 및 B 세포가 결손)에서는 FDC에서의 이상 프리온 단백질의 침착은 확인되지 않는다. 이것은 FDC에서 이상 프리온 단백질의 참착이 생기지 않으면 뇌에 이상 프리온 단백질이 전파되지 않는 것을 나타낸다.
본 발명의 노크인 마우스는 감염인자 투여에 의해 처음으로 인간형 이상 프리온 단백질이 침착한 것이고, 이것을 사용하여 복강내 투여를 수행하였다. 투여 후, 평균 283일에 11마리 전부 발병이 확인되었다. 즉, 본 발명에 있어서, 말초에서의 인간 프리온 감염이 처음으로 성공한 것이다(참조: 표 5).
또한, 본 발명은 본 발명의 유전자도입 동물 또는 본 발명의 노크인 동물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 또는 인간 이외의 프리온병 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기와 같이, 본 발명의 유전자도입 동물 또는 노크인 동물을 사용하여 단기간 또한, 고감도로 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 검출할 수 있다. 이 방법을 사용하여, 이상 프리온 단백질의 FDC에서의 침작 또는 FDC에서 뇌로의 이행을 블록킹(blocking)할 수 있는 약제를 감염인자 투여 전후, 또는 감염인자와 동시에 피검동물에 투여하는 것에 의해 스크리닝할 수 있고, 그에 따라 현재 매우 큰 문제가 되고 있지만 유효한 약제가 보고되지 않은 인간 또는 인간 이외의 프리온병의예방 및/또는 치료를 위한 약제를 개발할 수 있다.
각종 동물에서 볼 수 있는 프리온병에서의 어세이에 대해서는, 그 동물의 프리온 단백질 유전자를 조합한 노크인 마우스를 사용하는 것에 의해 어세이할 수 있다.
실시예 1: 노크인 벡터의 작제
재조합 인간 프리온 단백질을 조제하기 위해 유전자 치환벡터로서, 마우스의 프리온 단백질 유전자(서열번호 8, 서열번호 9는 아미노산 서열)의 엑손 3의 번역영역의 40번째의 아미노산인 글리신(118번쩨의 뉴클레오티드)에서 187번째의 아미노산인 트레오닌(561번째의 뉴클레오티드)까지를 인간의 프리온 단백질 유전자와 치환한 엑손 3을 중심으로 한 약 10Kbp의 구조체(construct)를 선택하였다. 노크인 벡터는 20Kbp에 이르는 긴 인트론을 갖는 것을 특징으로 하는 마우스 프리온 단백질 유전자의 인트론 2의 BamHI 부위에서 엑손 3의 SmaI부위 까지의 3.5Kbp를 사용하여, 엑손 3의 SamI 부위에서 BstEII 부위까지를 인간 프리온 단백질 유전자로 치환하고, 엑손 3의 3' 측 비번역 영역인 ApaI 부위에 loxp로 둘러싸인 PGK-neo 유전자를 삽이하였다(참조: 도 4). ApaI에서 EcoRV 까지 4Kbp에 이르는 3' 영역은 마우스의 유전자를 사용하였다.
네거티브 번역으로서, 디프테리아 효소인 DTA 유전자를 3'측에 삽입하고, NotI로 플라즈미드를 선형화한 후, 일렉트로포레이션으로 ES 세포에 도입하였다. ES 세포는 G418 번역(네오마이신 번역) 후, 120 클론을 선택하고, 서던블롯으로 해석하였다. 해석한 120클론 중, 4클론으로 상동 재조합을 확인하였다. 이것은 이전 본 발명자들이 loxP-neo-gpt-loxP를 사용하여 수행한 실험에서, 양성율이 288클론 중 1클론인 것에 비해, 효율이 양호한 것이었다.
수득한 노크인 벡터로 다시 상동 재조합의 효율을 검토하였는 바, 양성율은1클론/60클론, 6클론/180클론, 5클론/175클론, 2클론/98클론으로, 우수한 효율의 양성 클론을 얻을 수 있다.
실시예 2: 노크인 마우스의 작제
마우스로의 유전자 도입은 일렉트로포레이션법으로 ES 세포에 도입하고, G318 내성의 클론을 서던블롯법에 의해 해석하였다. 상동 재조합이 확인된 양성 클론(ES 세포)을 상실배에 도입하여 키메라 마우스를 작제하고, 키메라 마우스의 교배에 의해 F1 마우스를 작제하였다(germ-line화). 양성 F1 마우스의 교배에 의해 수득한 수정란에 Cre 효소를 발현하는 플라즈미드를 도입하고, 불필요하게 된 neo 유전자를 삭제하여 인간형으로의 치환을 종료하였다.
수득한 헤테로 접합체의 인간형 노크인 마우스(Ki-ChM)들을 교배하여 호모 접합체 마우스를 작제하였다. 수득한 노크인 마우스는 서열번호 6에 개시한 재조합 프리온 단백질을 발현하였다(Ki-ChM).
동일하게, 완전한 인간 프리온 단백질(서열번호 10, 통상 5회인 8 아미노산의 반복서열이 4회로 되어 있다)을 발현하는 노크인 마우스도 대조군으로 작제하였다(Ki-Hu).
실시예 3: 유전자도입 마우스의 작제
마우스의 프리온 단백질 유전자를 2종류의 마우스, 129SV 마우스 및 I/Ln 마우스에서 클로닝하였다. 129SV 마우스의 인트론 2는 20Kbp 이상으로 길기 때문에 인트론 2가 짧은 I/Ln 마우스의 유전자도 이용하였다. 129SV 유래의 5'측 5Kbp, I/Ln 마우스 유래의 엑손 1 및 2를 포함하는 12Kbp의 BamHI 단편 및 129SV 유래의 엑손 3 영역 7Kbp를 연결하였다(참조: 도 5). 엑손 3은 실시예 2의 노크인 마우스와 동일하게 SamI에서 BstEII 부위까지를 인간의 프리온 단백질로 치환하고 있다. 이와 같이 하여 작제한 유전자도입 벡터를 플라즈미드에서 절단하여 BDF1 마우스의 수정란에 직접도입하였다. 도입에 성공한 F0 마우스를 교배하고, F1 마우스를 작제하였다. 이 F1 마우스로 발현량을 해석한 후, 노크아웃트 마우스와 2회 교배하고, 마우스의 프리온 단백질을 발현하지 않는 재조합 프리온 단백질(서열번호 6 또는 7)만을 발현하는 마우스를 작제하였다(Tg-ChM 및 Tg-ChV).
실시예 4: 노크인 마우스 및 유전자도입 마우스로의 뇌내 투여에 의한 감염의 확립
인간 독립발생성 CJD 환자의 동결뇌에서 인산 완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제(glass homogenizer)로 뇌유제를 제조하고, 마취하에 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM, Ki-HuM) 및 실시예 3에서 수득한 유전자도입 마우스 3계통(Tg-ChM#30, Tg-ChV#12, Tg-ChV#21)의 우뇌반구에 27게이지침의 주사기(syringe)를 사용하여 20㎕씩 뇌내접종을 수행하였다. 접종 후의 관찰기록에서 자발운동의 감소, 보행실조, 이상보행, 거미반응 등의 정신증상이 나타나고, 진행하여 몸이 마르거나 병약해진 개체는 안락사 후, 부검하였다. 신경증상이 나타나 안락사까지의 기간은 평균 21일 정도를 필요로 하였다. 잠복기간은 접종일을 0일로 하여 안락사까지의 기간으로 하였다. 부검시에 완충포르말린으로 고정한 것 이외에 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다.
또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절제 후 HE 염색 및 본 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 염색에 의해 병변 및 이상 프리온 단백질 침착에 의한 조직 진단을 수행하고, 프리온병의 유무를 확인하였다.
그 결과, 노크인 마우스 중에서 코돈 129가 메티오닌 호모형인 인간 독립발생예 CJD(129M/M)-H3을 접종한 마우스에서는 재조합 인간 프리온 단백질을 발현하는 Ki-ChM 마우스의 잠복기간은151±6.7일이었다. 동일한 재료를 접종한 유전자도입 마우스 3계통(Tg-ChM#30, Tg-ChM#12, Tg-ChM#21)은 각각 156±14.2일, 175±15.3일, 192±4.0일을 나타내었다(참조: 도 1). 전체 인간 프리온 단백질을 발현하는 Ki-HuM 마우스의 잠복기간이 643±42.9일인 것에 비해, 현저하게 잠복기간이 단축되었다. 한편, 도입 유전자를 갖지 않는 야생형 마우스에서 발병한 것은 14열 중에 불과 5열인 36%의 발병율이고, 그 잠복기간도 759±69.8일이었다.
또한, 코돈 129가 발린과 메티오닌의 헤테로형의 인간 독립발생예 CJD(129V/M)-Su를 접종한 노크인 마우스에서는 잠복기간 141±5.3일이고, 동일하게 헤테로형의 독립발생예 CJD(129V/M)-Ph를 접종한 유전자도입 마우스 3계통(Tg-ChM#30, Tg-ChM#12, Tg-ChM#21)에서는 각각 154±20.8일, 171±9.2일, 188±1.4일의 잠복기간이었다(참조: 표 1).
표 1: 인간 프리온의 뇌내 투여에 의한 감염의 성립
마우스 접종재료 잠복기간Days±SD 발병두수/접종두수 감염율(%)
Ki-ChM(노크인마우스) 독립발생예CJD(129M/M)-H3독립발생예CJD(129V/M)-Su 151±6.7141±5.3 7/75/5 100100
Tg-ChM#30(유전자도입) 독립발생예CJD(129M/M)-H3독립발생예CJD(129V/M)-Ph 156±14.2154±20.8 11/115/5 100100
Tg-ChV#12(유전자도입) 독립발생예CJD(129M/M)-H3독립발생예CJD(129V/M)-Ph 175±15.3171±9.2 18/1810/10 100100
Tg-ChV#21(유전자도입) 독립발생예CJD(129M/M)-H3독립발생예CJD(129V/M)-Ph 192±4.0188±1.4 3/32/2 100100
Ki-HuM(노크인마우스) 독립발생예CJD(129M/M)-H3 643±42.9 4/4 100
Wild(야생형마우스) 독립발생예CJD(129M/M)-H3 759±69.8 5/14* 36
10% 인간 뇌유제를 마우스 뇌내에 20㎕ 접종에 의함.
*) 모든 마우스에서 명확한 임상증상이 없었지만, 면역조직 진단에서 양성으로 판정된 개체는 감염성립없이 발병하였다.
이것으로부터, 실시예 2 및 3에서 수득한 본 발명의 노크인 마우스 및 유전자도입 마우스는 인간프리온에 대하여 매우 높은 감수성을 필요로하고, 지금까지의 야생형 마우스에서는 긴 기간을 필요로 하는 불확정한 인간 프리온의 감염성의 증명이 단기간에 확실하게 실시할 수 있는 것이 밝혀졌다. 특히, 노크인 마우스에서는 인간 프리온 단백질 유전자의 다형인 129번째의 코돈이 메티오닌 또는 발린 헤테로형 어느 것의 인간 프리온에 대해서도 150일 전후로 지금까지 볼 수 없는 짧은 잠복기간으로 감염이 성립하였다. 이것은 인간의 프리온 단백질 유전자 다형에 대응할 수 있는 것을 나타내는 결과이다. 동시에 이러한 감염 잠복기간은 마우스 순화주 프리온의 마우스에서 마우스의 감염 잠복기간에 필적하는 프리온 감염에 존재하는 '종의 벽'을 넘는 것이라고 판단된다. 또한, 전체 인간형 노크인 마우스 Ki-HuM의 긴 잠복기간에 대하여, 노크인 마우스 Ki-ChM이 현저하게 잠복기간이 단축된 것은 도입된 벡터와 그것에 의해 발현된 재조합 인간 프리온 단백질이 마우스의 감수성을 지배하고 있는 것을 나타낸다.
실시예 5: FDC에서 이상 프리온 단백질의 조직학적 검출
실시예 2 및 실시예 3에서 수득한 노크인 마우스 및 유전자도입 마우스의 발병후에 FDC를 조사하였는 바, 유전자도입 마우스에서는 이상 프리온단백질은 검출되지 않았지만, 노크인 마우스에서는 비장, 림파절, 장관의 림파장치(파이엘씨판)의 FDC에서 인간형의 이상 프리온 단백질의 참착을 확인하였다(참조: 도 2A)
실시예 6: 웨스턴블롯법에 의한 이상 프리온 단백질의 검출
또한, 본 발명자들은 면역염색에서 확인한 비장에서의 이상 프리온 단백질의참착을 웨스턴블롯법에서도 검출하고, 노크인 마우스의 비장에서 이상 프리온 단백질의 존재를 확인하였다.
실시예 2에서 수득한 노크인 마우스를 사용하여, 감염시킨 비장, 비감염(대조군)의 비장 및 감여시킨 뇌의 웨스턴블롯을 분석하였다.
프로테이나제(proteinase) K 처리후에 웨스턴블롯으로 처리한 경우, 이상 프리온 단백질에서는 3개의 밴드(band)가 형성되는 것이 알려져 있다. 도 3에 개시한 바와 같이, 감염시킨 비장 및 뇌 유래의 시료에서는 하부에 당쇄가 없는 것, 1개소 당쇄가 있는 것, 2개소 당쇄가 있는 것 3개의 밴드가 확인되었고, 이상 프리온 단백질이 존재하는 것이 나타났지만, 비감염 시료에서는 상당하는 밴드가 확인되지 않았다. 또한, 뇌와 비교해서 비장에서의 이상 프리온 단백질의 양이 적은 것도 나타났다.
실시예 7: 인간형 프리온 단백질 C 말단에 대한 항체에 의한 FDC의 면역감염 실험
인간형 프리온 단백질의 C말단에 대한 모노클로날 항체를 작제하였다. 이 항체는 인간 프리온 단백질(서열번호 2)의 코돈 215, 219, 220을 인식하는 항체이고, 마우스 프리온 단백질의 그것에 상당하는 코돈의 아미노산 서열과는 반응하지 않는다. 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM)은 코돈 215, 219, 220이 인간형이 아니고, 마우스형으로 치환하였기 때문에 이 모노클로날 항체에서는 반응하지 않고, 완전 인간형 프리온 단백질과만 반응하였다. 이 노크인 마우스를 완전 인간형의 이상 프리온 단백질을 갖는 독립발생예의 CJD의 뇌유제로 감염시켰다. FDC가 단순히 접종한 완전 인간형의 이상 프리온 단백질을 집적한 것이라면 이 항체로 염색되지만, 실험에서는 노크인 마우스의 이상 프리온 단백질을 모두 염색하지 않았다. 즉, 단순히 접종한 완전 인간형 프리온 단백질이 집적한 것이 아니고, 노크인 마우스 자신의 C말단이 마우스형으로 된 인간형 프리온 단백질이 이상하게 된 것이 FDC에서 침착하고 있는 것이다.
실시예 8: 유전자도입 마우스 및 노크인 마우스의 비교
실시예 5에서 유전자도입 마우스에서는 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착이 검출되지 않지만, 노크인 마우스에서 검출되는 이유를 검토하기 위해, 비장에서의 재조합 프리온 단백질의 발현을 웨스턴블롯으로 측정하였다.
노크인 마우스(Ki-ChM)의 비장 및 뇌에서 노크인 마우스와 비교하여 재조합 프리온 단백질을 2배 발현하고 있는 유전자도입 마우스(Tg-ChV#12)의 비장에서의 정상형 프리온 단백질의 발현량을 웨스턴블롯으로 검토하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서, a 내지 d는 노크인 마우스, e는 유전자도입 마우스이다. d 및 e는 동일한 조직중량의 비장의 분포를 전기영동한 것이고, d에 대하여 c는 그의 50%, b는 25%, a는 12.5%의 조직중량의 분포를 전기영동하고 있다. e의 면역반응의 강도는 b에 거의 상당한다고 판단되고, 유전자도입 마우스에서는 노크인 마우스의 약 25% 정도밖에 발현하지 않는 것을 확인하였다.
이 결과에서, 유전자도입 마우스에서 발현분포는 야생형 마우스의 발현분포와 다르다는 것을 확인하였고, 유전자도입 마우스에서는 비장(FDC)에서 재조합 프리온 단백질의 발현을 발견할 수 없는 것이 아니라, 발현량이 극히 적기 때문에 유전자도입 마우스에서 비장의 FDC 음성결과가 되는 것이라고 판단된다.
따라서, 적당한 검출방법을 사용하는 것에 의해, 본 발명의 유전자도입 동물을 사용해도 FDC에서의 이상 프리온 단백질을 침착을 검출할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
실시예 9: 인간 프리온 감염후 발병 마우스의 감염성의 확인
직접감염 실험에서, 마우스의 뇌, 비장에서 증명된 이상 프리온 단백질의 감염성에 대해서 증명하였다.
독립발생성 CJD열의 10% 뇌유제를 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM)에 뇌내 접종하고, 발병한 노크인 마우스(Ki-ChM)의 뇌, 비장을 인산 완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 마취하에 노크인 마우스(Ki-ChM)의 우뇌반구에 27게이지침의 주사기를 사용하여 20㎕씩 뇌내 접종하였다. 본 명세서에서 개시한 모든 실시예의 마우스 접종실험에서 수행되고 있는 정법에 따라 접종 후의 관찰기록에서 자발운동의 감소, 보행실조, 이상보행, 거미반응 등의 신경증상이 발견되고, 진행하여 몸이 마르거나 병약해진개체는 안락사 후, 부검, 진단하였다.
그 결과, 발병 마우스 뇌유제를 접종한 마우스에서는 6두 중 6두(100%)가 발병하고, 잠복기간은 123±10.0일이었다. 한편, 발병 마우스 비장유제를 접종한 마우스에서도 5두 중 5두(100%)가 발병하고, 잠복기간은 156±7.9일이었다. 이 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 뇌유제를 접종한 후 발병한 노크인 마우스(Ki-ChM)의 뇌, 비장(FDC)에는 이상 단백질의 침착 뿐만 아니라, 감염력도 있는 것이 증명되었다(참조: 표 2).
표 2: 인간 프리온 감염후 발병 마우스의 감염성의 확인
접종재료 접종마우스 잠복기간(days±SD) 발병두수/접종두수
접종실험 1 인간 독립발생예 CJD, 10% 뇌유제 Ki-ChM 151±6.7 7/7
접종실험 2 발병 마우스(접종실험 1)의 10% 뇌유제 Ki-ChM 123±10. 6/6
접종실험 3 발병 마우스(접종실험 1)의 10% 비장유제 Ki-ChM 156±7.9 5/5
실시예 10: FDC에서 CJD 환자의 이상 프리온 검출실험
CJD 환자의 동결뇌를 인산완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 노크인 마우스(Ki-ChM) 복강내에 26게이지침의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다. 접종 후 75일에 안락사시키고 부검하였다. 부검시에 완충 포르말린으로 고정하였다. 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 감염에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질 침착을 검사하였다.
그 결과, 코돈 129가 메티오닌 호모형의 인간 독립발생예 CJD(129M/M)-H3, 발린 및 메티오닌의 헤테로형 독립발생예(129V/M)-Su, 인간 경막이식예 CJD-TMD-Du/c 중 어느 열의 인간 프리온 접종에서도 모든 Ki-ChM 마우스에서 FDC에서 이상 프리온 단백질이 검출되고, 검출율 100%이었다(참조: 표 3).
표 3: FDC에서 CJD 환자의 이상 프리온 검출
접종재료 접종마우스 접종후일수 FDC양성수/검사두수 검출율
독립발생예(129M/M)-H3 인간 10% 뇌유제 Ki-ChM 75 5/5 100%
독립발생예(129V/M)-Su 인간 10% 뇌유제 Ki-ChM 75 5/5 100%
경막이식후CJD-TMD-Du/c 인간 10% 뇌유제 Ki-ChM 75 6/6 100%
10% 인간 뇌유제를 마우스 복강내에 50㎕ 접종에 의함.
실시예 11: 경막이식예 CJD의 감염
경막이식 후 CJD를 발병이 확정진단된 환자의 동결뇌(CJD-TMD-Du/c)를 인산완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 노크인 마우스(Ki-ChM)의 복강내에 26게이지침의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다. 접종 후 75일에 안락사시키고 부검하였다. 부검시에 완충 포르말린으로 고정하였다. 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 감염에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질 침착을 검사하였다.
그 결과, 5두 접종한 전체 Ki-ChM 마우스의 비장 FDC에서 이상 프리온 단백질이 검출되었다(참조: 표 3).
실시예 12: 영국 nvCJD 환자 유래의 이상 프리온 검출
영국에서 소의 BSE에서는 없다고 확정되어 있는 변이형 CJD(이하, 'nvCJD'라 한다) 환자의 동결뇌를 인산완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 프리온 이외의 감염인자를 제거하기 위해 60℃도에서 30분 동안 유지한 후, 접종까지의 사이, -70℃도로 동결보존하였다. 접종에 즈음하여 해동하고, 노크인 마우스(Ki-ChM)의 복강내에 26게이지침의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다. 접종 후 75일에 안락사시키고 부검하였다. 부검시에 완충 포르말린으로 고정하였다. 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 감염에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질 침착을 검사하였다.
그 결과, 3열의 nvCJD 환자뇌, nv-96/02, nv-96/07, nv-96/45에 대해서, 각각 5두 중 5두, 4두 중 4두, 4두 중 4두로 100%의 검출율로 이상 프리온 단백질이 검출되었다.
본 발명의 노크인 마우스(Ki-ChM)의 FDC를 사용한 신규한 바이오 어세이법은 영국의 nvCJD 환자 유래 프리온 진단에도 유용하였다(참조: 표 4).
표 4: 영국 nvCJD 환자의 이상프리온 검출
접종재료 접종마우스 접종후일수 FDC양성수/검사두수 검출율
영국 nvCJD 인간 10% 뇌유제nv-96/02 Ki-ChM 75 5/5 100%
영국 nvCJD 인간 10% 뇌유제nv-96/07 Ki-ChM 75 4/4 100%
영국 nvCJD 인간 10% 뇌유제nv-96/45 Ki-ChM 75 4/4 100%
10% 인간 뇌유제를 마우스 복강내에 50㎕ 접종에 의함.
실시예 13: 어세이시스템의 검토 1(뇌내 투여 및 복강내 투여)
인간 CJD 환자의 동결뇌를 인산완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 프리온 이외의 감염인자를 제거하기 위해 60℃도로 30분 동안 보존한 후, 접종까지의 사이에 -70℃도에서 동결보존하였다. 접종시에 해동하고, 마취하에 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM)의 복강내에 27게이지침의 주사기를 사용하여 20㎕씩 접종하였다. 접종 후의 관찰기록에서 자발운동의 감소, 보행실조, 이상보행, 거미반응 등의 정신증상이 나타나고, 진행하여 몸이 마르거나 병약해진 개체는 안락사 후, 부검하였다. 신경증상이 나타나서 안락사하기 까지의 기간은 평균 21일 정도를 필요로 하였다. 잠복기간은 접종일을 0일로 하여 안락사까지의 기간으로 하였다. 부검시에 완충포르말린으로 고정한 것 이외에 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 본 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 염색에 의해 병변 및 이상 프리온 단백질 침착에 의한 조직 진단을 수행하고, 프리온병의 유무를 확인하였다.
표 5: 어세이시스템의 검토 1(뇌내 및 복강내 접종)
접종재료 접종마우스 접종루트 잠복기간(days±SD) 발병두수/접종두수
독립발생예CJD(129M/M), 인간 10% 뇌유제-H3 Ki-ChM 뇌내 151±6.7 7/7
독립발생예CJD(129M/M), 인간 10% 뇌유제-H3 Ki-ChM 복강내 283±9.2 11/11
독립발생예CJD(129V/M), 인간 10% 뇌유제-Su Ki-ChM 뇌내 141±5.3 5/5
독립발생예CJD(129V/M, M232R)인간 10% 뇌유제 TMD-232 Ki-ChM 뇌내 177±4.9 4/4
경막이식후 CJD, 인간 10% 뇌유제 TMD-Du/C Ki-ChM 뇌내 167±24.7 6/6
그 결과, 노크인 마우스 중에서 코돈 129가 메티오닌 호모형인 인간 독립발생예 CJD(129M/M)-H3을 접종한 마우스에서는 잠복기간은 151±6.7일이고, 복강내접종에서는 잠복기간은 연장되었지만, 283±9.2일로 11두 전부가 발병하였다. 또한, 코돈 129가 발린 및 메티오닌의 헤테로형의 인간 독립발생예 CJD(129V/M)-Su를 접종한 노크인 마우스에서는 잠복기간 141±5.3일이었다. 헤테로형에서 코돈 232의 메티오닌이 아르기닌으로 치환한 유전자 변이를 갖는 인간 뇌유제에서는 잠복기간은 점점 연장하였고, 177±4.9일을 나타내었지만, 모든 예에서 발병하였다. 경막이식후의 CJD 인간 10% 뇌유제 TMD-Du/C도 167±24.7일의 잠복기간에서 발병하였다.
이것으로부터, 본 발명의 노크인 마우스, Ki-ChM은 다양한 형태의 인간 프리온에 대하여 높은 감수성을 갖는 것이 밝혀졌다. 또한, 접종 루트도 뇌내 뿐만 아니라, 복강내 접종에서도 감수성을 갖기 때문에 다양한 말초에서의 감염에 대해서도 인간 프리온의 감수성을 갖는 것을 예측할 수 있다.
실시예 14: 어세이시스템의 검토 2-경시적 관찰
독립발생예 CJD 인간 동결뇌를 인산완충액(PBS)를 사용하여 10%의 농도가 되도록 유리 균질화제로 뇌유제를 제조하고, 프리온 이외의 감염인자를 제거하기 위해 60℃도에서 30분 동안 유지한 후, 접종까지의 사이, -70℃도로 동결보존하였다. 접종시에 해동하고, 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM)의 복강내에 26게이지침의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다. 접종 후 14일, 31일, 44일, 60일, 75일 및 150일에 안락사시켰다. 부검시에 완충 포르말린으로 고정한 것 이외에 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 감염에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질 침착을 검사하였다.
그 결과, 면역조직염색에서 접종 후 14일의 노크인 마우스(Ki-ChM) 4두 중 2두(50%)의 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착이 확인되었다. 이후, 31일에서 150일까지 모든 접종 마우스의 FDC에서 이상 프리온 단백질이 양성이었다. 그러나, 표적장기인 중추신경계에서는 14일에서 150일까지 이를때까지 이상 프리온 단백질의 검출, 기타 병리조직학적 변화는 발견되지 않았다.
본 발명의 노크인 마우스(Ki-ChM)을 사용한 FDC에 의한 바이오 어세이법에서는 14일이라는 매우 짧은 기간에서 이상 프리온 단백질이 검출되었고, 이것은 지속하여 검출할 수 있다는 것이 밝혀졌다(참조: 표 6).
표 6: Ki-ChM 마우스 FDC에서 이상 프리온 단백질의 경시적 검출
투여후의 일수 FDC양성수/검출두수 검출율
14일 2/4 50%
31일 6/6 100%
44일 7/7 100%
60일 6/6 100%
75일 5/5 100%
150일 7/7 100%
실시예15: 어세이시스템의 검토 3-농도의 검토
실시예 14에 의한 독립발생성 CJD 인간 10% 뇌유제를 사용하여 최단 14일에서 본 발명의 노크인 마우스(Ki-ChM)의 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착이 검출되는 것을 발견하였지만, 이어서 접종재료의 희석에 의해 어느 정도의 농도까지 검출할 수 있는 가를 검토하였다.
상기 독립발생성 CJD 인간 10%(10배 희석) 동결 뇌유제를 해동하고, 동일하게 PBS에 1%(100% 희석), 0.1%(1,000배 희석), 0.01%(10,000배 희석)액을 조정하고, 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스(Ki-ChM)의 복강내에 26게이지침의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다. 접종 후 75일에 안락사시키고, 완충 포르말린액으로 고정하였다. 표본은 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 감염에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질을 검출하였다.
그 결과, 0.01%(10,000배 희석)에서도 80%이상의 개체에서 FDC에서 이상 프리온 단백질이 검출되었다.
이것으로부터, 본 발명의 노크인 마우스(Ki-ChM)의 FDC를 사용하는 것에 의해, 10,000배 이상의 희석해도 독립발생성 CJD 인간 뇌의 감염성을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 16: 노크인 마우스 Ki-ChM과 Ki-HuM의 감수성 비교
실시예 2에서 작제한 2계통의 노크인 마우스 Ki-ChM 및 Ki-HuM을 사용하여 뇌내 접종 및 복강내 접종에 의한 감염성을 비교실험하였다. 즉, 독립발생성 CJD증열 CJD(129M/M)-H3의 10% 뇌유제를 실시예 2에서 수득한 노크인 마우스 Ki-ChM 및 Ki-HuM의 우뇌반구에 27게이지침의 주사기를 사용하여 20㎕씩 뇌내접종하였다. 또한, 복강내에는 26게이지의 주사기를 사용하여 50㎕씩 접종하였다.
뇌내접종에서는 본 명세서에 개시한 모든 실시예의 마우스 접종 실험에서 실시한 정법에 따라 접종후의 관찰기록에서 자발운동의 감소, 보행실조, 이상보행, 거미반응 등의 정신증상이 나타나고, 진행하여 몸이 마르거나 병약해진 개체는 안락사 후, 부검, 진단하였다. 잠복기간은 접종일을 0일로 하여 안락사까지의 기간으로 하였다. 부검시에 완충포르말린으로 고정한 것 이외에 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다.
복강내 접종에서는 접종후 75일에 안락사시키고, 부검하였다. 부검시에 완충 포르말린으로 고정하였다. 주요 장기의 일부는 -70℃도로 동결보존하였다. 또한, 모든 마우스는 프리온 전용의 병리표본 작제실에서 파라핀 포매, 박리절단 후 HE 염색 및 본 발명자가 고안한 오토클레이브법에 의한 면역조직 염색에 의해 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 검사하였다.
그 결과, 헤테로 접합체의 인간형 노크인 마우스 Ki-ChM은 151±6.7일의 잔복기간으로 모든 예에서 발병하였다. 한편, 완전한 인간 프리온 단백질(서열번호 10, 통상 5회인 8아미노산의 반복서열이 4회로 되어있다)을 발현하는 노크인 마우스 Ki-HuM에서는 모든 예에서 발병하였지만, 매우 긴 잠복기간 643±42.9일을 필요로 하였다. 복강내 접종 75일 후의 비장의 FDC에서 면역 조직감염에서는 Ki-ChM은 100%(5두 중 5두)에 이상 프리온 단백질을 검출할 수 있었지만, Ki-HuM에서는 80%(5두 중 4두)의 검출율에 이르렀다(참조: 표 7).
표 7: 노크인 마우스 Ki-ChM 및 Ki-HuM의 감수성 비교
접종 루트 마우스 계통 Ki-ChM Ki-HuM
뇌내 접종 잠복기간발병수 151±6.77/7(100%) 643±42.94/4(100%)
복강내 접종 FDC 양성(75일 후) 5/5(100%) 4/5(100%)
모두 독립발생예 CJD(129M/M)-H3, 10% 뇌유제를 접종함.
뇌내 접종의 잠복기간 및 75일 후의 FDC에서 이상 프리온 단백질 검출율을 포함하여 생각하면, 노크인 마우스에서는 구조체(construct)의 여하에 관계없이 FDC에서 이상 프리온 단백질 침착이 반드시 일어난다는 것이 확인되었다. 즉, FDC에서 프리온 단백질이 유효하게 발현하는 노크인법을 사용하면, 뇌에서 프리온 단백질의 이상화가 일어나기 어려운 완전 인간형의 동물에서도 FDC에서 어느 정도 유효하게 이상화가 발견된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 동시에 잠복기간이 긴 계통, 즉 뇌에서의 이상화가 일어나기 어려운 완전 인간형의 동물에서의 FDC에서 양성율이 100%가 되지 않는 것은 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착도 마우스의 인간 프리온에 대한 감수성을 반영하고 있고, 완전 인간형의 프리온 단백질의 이상화가 일어나기 어려움을 나타낸다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 인간의 프리온 단백질에 대하여 종래에 없던 매우 높은 감수성을 갖는 동물 모델을 작제할 수 있다. 또한, 이 동물 모델의 사용에 의해 인간 또는 인간 이외의 동물에 대한 프리온병의 안정성 시험에 사용할 수 있는 신규한 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의해 수득한 노크인 동물은 nvCJD의 이상 프리온 단백질의 어세이시스템으로서도 매우 우수한 것이다. 특히, 복강내 투여에서는 뇌내 투여와 비교하여 감염인자의 접종량을 100배로 높일 수 있고, 감염력이 낮다고 판단되는 혈액에서도 대량으로 투여할 수 있는 것에 의해 그 감염력을 조사할 수 있다.
따라서, 본 발명의 노크인 동물은 인간 또는 인간 이외의 동물 유래의 혈액 또는 장기에서 만들어진 제제의 최종적인 안정성 시험에 필요한 것으로 기대된다.
nvCJD는 소·프리온 단백질을 경구접종하는 것에 의해 우선 편도 및 소화기관의 림파장치의 FDC에서 이상 프리온 단백질이 침착하고, 이 FDC에서 뇌로 이상 프리온 단백질이 운반되는 것으로 판단된다. 본 발명에서 수득된 노크인 동물은 이 nvCJD와 동일하게 말초의 경로에서 FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 일으키고, 뇌에 이상 프리온 단백질이 운반되어 발병하는 것이 인간 프리온 감염에서 증명할 수 있는 것이다. 따라서, 이 모델은 단순히 신속한 바이오 어세이의 확립 뿐만 아니라, 장기적으로는 FDC에서 뇌로의 블로킹하는 프리온 단백질의 이행을 억제하는 약제의 개발의 스크리닝계로서도 역할을 한다고 판단된다.
본 명세서에 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 전부 본 명세서에 개시된 것으로 본다.

Claims (25)

  1. 비인간 동물의 여포수상세포(FDC)에서 이상 프리온 단백질의 침착을 지표로 하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 인간 또는 인간 이외의 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    전기 비인간 동물이 인간화 프리온 단백질 유전자를 발현하는 유전자도입 동물인 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    전기 비인간 동물이 인간화 프리온 단백질 유전자를 발현하는 노크인 동물인 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    시료를 전기 비인간 동물의 복강내, 뇌내, 혈관내 또는 경구투여하는 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 조직학적 검출법, 전기영동법 및/또는 결합 어세이(assay)에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    FDC에서 이상 프리온 단백질의 침착을 시료 투여 후 14일 내지 700일에 검출하는 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 프리온 단백질이 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질의 엑손 3의 일부와 치환한 것인
    스크리닝 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 프리온 단백질이 인간 프리온 단백질에서 인간 특이적 아미노산 잔기 중 C 말단측의 6잔기가 스크리닝에 사용하는 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산 잔기와 치환한 것인
    스크리닝 방법.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 프리온 단백질이 서열번호 6 또는 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는
    스크리닝 방법.
  10. 비인간 동물 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부와 치환한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 인간화 프리온 단백질.
  11. 인간 프리온 단백질에서 인간 특이적 아미노산 잔기 중 C 말단측의 6 잔기가 비인간 동물 프리온 단백질에 대응하는 아미노산과 치환한 것인 재조합 인간화 프리온 단백질.
  12. 서열번호 6 또는 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간화 프리온 단백질.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 개시된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그의 단편.
  14. 하기 (a) 내지 (c)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 또는 그의 단편:
    (a) 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;
    (b) 서열번호 4에 개시된 뉴클레오티드 서열과 축합중합 관계에 있는 뉴클레오티드 서열; 및,
    (c) (a) 또는 (b)의 서열에서 엄격한(stringent) 조건하에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 있어서, 제 10항에 개시된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 개시된 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터.
  16. 제 13항 또는 제 14항에 개시된 유전자 또는 그의 단편이 도입된 유전자도입 동물.
  17. 제 13항 또는 제 14항에 개시된 유전자 또는 그의 단편이 도입된 노크인 동물.
  18. FDC에서 인간화 프리온 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 동물.
  19. FDC에서 인간화 프리온 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 노크인 동물.
  20. 뇌 및/또는 FDC에서 제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하여 이루어지는 유전자도입 동물.
  21. 뇌 및/또는 FDC에서 제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하여 이루어지는 노크인 동물.
  22. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하는 유전자도입 동물의 작제방법.
  23. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 개시된 단백질을 발현하는 노크인 동물의 작제방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    하기의 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    노크인 동물의 작제방법:
    (a) 비인간 프리온 단백질 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터를 구축하는 단계;
    (b) 상기 비인간 프리온 단백질 유전자의 엑손 3의 일부를 인간 프리온 단백질의 엑손 3의 일부와 치환하는 단계;
    (c) 3'비번역 영역에 loxp로 둘러싸인 항생물질 내성 유전자를 삽입하는 단계;
    (d) 수득한 개변 벡터를 전기 비인간 ES 세포에 도입하는 단계;
    (e) 상동 재조합이라고 인정된 클로닝에서 키메라 동물을 제조하는 단계; 및,
    (f) F1 동물의 수정란에 Cre 효소 발현 플라즈미드를 도입하여 항생물질 내성 유전자를 삭제하는 단계.
  25. 제 18항 또는 제 20항에 개시된 유전자도입 동물, 또는 제 19항 또는 제 21항에 개시된 노크인 동물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 또는 인간 이외의 프리온병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 스크리닝 방법.
KR1020037010113A 2001-01-31 2002-01-31 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법 KR100544933B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001024279A JP3421744B2 (ja) 2001-01-31 2001-01-31 プリオン病感染因子のスクリーニング方法
JPJP-P-2001-00024279 2001-01-31
PCT/JP2002/000803 WO2002061418A1 (fr) 2001-01-31 2002-01-31 Procede de criblage de facteur d'infection de maladie a prion

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030079974A true KR20030079974A (ko) 2003-10-10
KR100544933B1 KR100544933B1 (ko) 2006-01-24

Family

ID=18889436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037010113A KR100544933B1 (ko) 2001-01-31 2002-01-31 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7452709B2 (ko)
EP (2) EP1972935A1 (ko)
JP (1) JP3421744B2 (ko)
KR (1) KR100544933B1 (ko)
AU (1) AU2002228403B9 (ko)
CA (1) CA2437016A1 (ko)
NZ (1) NZ527769A (ko)
WO (1) WO2002061418A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ569448A (en) * 2005-12-08 2011-12-22 Univ South Dakota Method of in vitro propagation and detection of infectious prion using follicular dendritic cell cultures co-cultured with B cells
US10266585B2 (en) 2009-08-28 2019-04-23 The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System Methods of treating brain injury
EP2627357B1 (en) * 2010-10-15 2017-05-03 The Board of Regents of The University of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
CN102879577B (zh) * 2012-11-01 2014-04-09 山东龙美生物医学科技有限公司 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5908969A (en) * 1994-05-13 1999-06-01 The Regents Of The University Of California Method of detecting prions in a sample and transgenic animal used for same
AU5287800A (en) * 1999-05-26 2000-12-12 Regents Of The University Of California, The Models of prion disease
JP2001024279A (ja) 1999-07-09 2001-01-26 Matsushita Electric Ind Co Ltd 半導体レーザ素子の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR100544933B1 (ko) 2006-01-24
JP2002228665A (ja) 2002-08-14
AU2002228403B9 (en) 2005-03-10
EP1972935A1 (en) 2008-09-24
AU2002228403B2 (en) 2005-03-03
WO2002061418A1 (fr) 2002-08-08
JP3421744B2 (ja) 2003-06-30
CA2437016A1 (en) 2002-08-08
US20040137421A1 (en) 2004-07-15
EP1394542A1 (en) 2004-03-03
US7452709B2 (en) 2008-11-18
NZ527769A (en) 2005-05-27
EP1394542A4 (en) 2004-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5565186A (en) Method of detecting prions in a sample and transgenic animal used for same
US7416849B2 (en) HBM variants that modulate bone mass and lipid levels
US7632507B2 (en) Synovial cell protein
EP1870472B1 (en) Model animal of Alzheimer's disease and use thereof
PL185549B1 (pl) Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne
JPH11510496A (ja) 試料中のプリオンの検出、ならびにその目的で使用されるプリオン調製物およびトランスジェニック動物
KR100544933B1 (ko) 프리온병 감염인자의 스크리닝 방법
JP4613824B2 (ja) トランスジェニック非ヒト哺乳動物
US9068018B2 (en) Methods of using voltage-gated Hv1 proton channels to detect changes in intracellular pH
JP5954800B2 (ja) 男性不妊症の原因因子検出方法及び男性不妊症モデル動物
WO2006016692A1 (ja) ノックアウト非ヒト動物
JP5605718B2 (ja) アルツハイマー病モデル動物およびその用途
WO2006025421A1 (ja) ***膜タンパク質obfの利用
WO2001024628A1 (fr) Modele animal pour nephrite proliferative a cellules mesangiales
US20030126627A1 (en) Transgenic mouse model of inclusion body myositis
WO2002034041A1 (fr) Animal non humain a proteine-marqueur de la senescence 30 defectueuse, anticorps et son procede de production
CA2332657A1 (en) A method for detecting an aberrant animal-derived prion gene and a prion gene modified mouse which exhibits heart anomalies
Detmer The Role of Mitofusin Proteins in Mitochondrial Fusion and Disease
WO1999050404A2 (en) Transgenic animals with inducible protein expression and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee