JP2002014104A - Ｇｖｈｄの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＧＶＨＤの早期検出に的確で有用な判断指標を
提示し、当該指標に基づくＧＶＨＤの検出方法、薬物治
療におけるＧＶＨＤの進展もしくは予防効果のモニタリ
ング方法、並びに、これらの方法を効果的に実施するた
めのキットを提供すること。 【解決手段】ヒトから採集された試料中のＵＴＩの量を
測定することを特徴とするＧＶＨＤの検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＧＶＨＤ（移植片
対宿主疾患）の検出方法、並びに当該検出に用いられる
測定キットに関する。詳細には、ＧＶＨＤの患者から採
取される試料中のＵＴＩ（尿中トリプシンインヒビタ
ー）を測定することを特徴とするＧＶＨＤの検出方法、
並びに当該検出のためのキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＵＴＩは、ヒト由来の分子量約６７００
０の酸性糖蛋白質であり、トリプシン、α−キモトリプ
シン、ヒアルロニダーゼ、顆粒球エラスターゼ、プラス
ミン等の多種の酵素に対する阻害作用やライソゾーム膜
安定化作用を有しこれらの作用に基づき、臨床的には急
性循環不全症ならびに急性膵炎の治療薬として用いられ
ている。

【０００３】ＵＴＩの生物化学的性状は古くから知られ
ており、ファールバングらの総説においてＵＴＩ活性が
上昇する疾患として感染症、腎疾患以外に、心筋梗塞、
外科手術、白血病、悪性腫瘍が記載され、また正常妊娠
後期等においても、尿中***量が増加することが知られ
ている（Faarvang，H. J. ら Scand. J. Clin. Lab.Inv
est. 17(supp. 83)、１〜７８頁、１９６５年；桑島
ら、炎症、９巻、３号、１７５〜１８２頁、１９８９
年）。しかしながら、これまでＧＶＨＤと生体中のＵＴ
Ｉの濃度との関わりについては報告がなく、その病態と
尿中***量との関係についても知られてはいなかった。

【０００４】ＧＶＨＤは、免疫担当細胞であるリンパ球
が、移植片を拒絶し得ないような宿主に移植され生着
し、宿主の組織抗原に対して移植免疫反応を起こす結
果、ひきおこされる症状である。組織適合性の一致しな
い他人からの骨髄移植や輸血あるいは、臓器移植を受け
るときにしばしば発症する。

【０００５】骨髄移植とは、レシピエント（受容者）の
血液系を破壊した上で、健常なドナー（提供者）から骨
髄、即ち血液系の基となる細胞集団（例えば幹細胞）を
移植することによって、レシピエントの内々でドナー由
来の血液系を再構成しようとする治療法である。レシピ
エントの血液系の破壊には、既に冒されている悪性疾患
を排除することおよび／またはレシピエントの免疫系を
抑制することを目的として放射線療法あるいは骨髄破壊
性高用量化学療法等が行われる。骨髄移植は、移植片で
ある骨髄細胞には造血幹細胞だけでなく免疫担当細胞も
含まれているので、移植片拒絶（graft rejection)を免
れてもＧＶＨＤが生じうる点で、他の臓器移植（腎、
肝、心など）とは異なっている（原田実根ら、「新しい
造血肝細胞移植」１〜７頁、１９９８年、第２刷、南江
堂）。

【０００６】免疫不全の患者が検疫担当細胞の多い器官
の移植を受けると、ＧＶＨＤが発現する危険性は高い。
従って、免疫系を再形成する目的で骨髄移植が行なわれ
る一時免疫不全の乳児および小児には重大な課題であ
り、また悪性疾患の治療のために骨髄移植を受ける患者
にとっても重大な課題である。なお、白血病の治療に対
する骨髄移植後の再発に対してドナーリンパ球輸注療法
（ＤＬＴ）が行われるが、その最大の副作用がＧＶＨＤ
であることも知られている（原田実根ら、「新しい造血
肝細胞移植」１７７〜１８２頁、前出）。また、臍帯血
幹細胞移植においても臍帯血バンクを介した非血縁者間
臍帯血幹細胞移植が行われつつあり、II度以上の急性Ｇ
ＶＨＤの合併率は３０〜５０％と報告されている（別冊
・医学のあゆみ、「血液疾患」、Ｖｅｒ．２４３６〜４
３９頁、１９９８年）。

【０００７】ＧＶＨＤには、急性（骨髄移植後数週間以
内）もしくは慢性（移植後数ヶ月から数年続く）の両兆
候が現れうる。適当な総説としては、大野竜三ら「白血
病治療マニュアル」１７７〜１８４頁、１９９８年、第
４刷、南紅堂が参照されよう。急性ＧＶＨＤの主な標的
臓器あるいは組織は皮膚、腸管、肝臓であり、症状とし
ては、斑丘疹、紅斑性発疹、下痢および肝炎として現
れ、また免疫再形成が、長時間の過酷な免疫抑制により
損なわれる。それぞれの臓器ごとに臨床的な重症度(sta
ge) が決められ、臓器毎の重症度の組み合わせによって
全身の重症度(grade) が決められている（Thomas ED ら
ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２９２巻：８３２−８４３頁及び８
９５−９０２頁，１９７５年）。

【０００８】急性ＧＶＨＤの診断については、臨床的症
状から以下の様に行われる。まず、皮膚については、手
掌や足底に紅斑が出現し、重症化するに従い、四肢、顔
面、体幹へと広がり、斑状丘疹から紅皮症へと進展し、
最終的には水泡を形成し落屑にいたることもある。鑑別
すべき皮膚症状として、ＨＨＶ−６による皮疹、薬疹、
Stevens-Johnson 症候群などがあり、確定診断は皮膚生
検によっている。消化管症状としての下痢は、皮疹に数
日遅れて出現する。１日の下痢量や血便、閉塞性イレウ
スなどの所見による判断がある。鑑別すべき消化管症状
としては、前処置などの薬剤の副作用としての粘膜障
害、サイトメガロウイルスによる腸炎、細菌性腸炎など
があり、直腸生検が確定診断となる。

【０００９】肝障害の特徴は、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬ
Ｔ（ＧＰＴ）、ＬＤＨなどの逸脱酵素の増加に比して、
ＡＬＰ、γ−ＧＴＰなどの胆道系酵素や直接ビリルビン
の増加が著しく、血清総ビリルビンのレベルによりstag
e が区別される。鑑別すべき肝合併症としては、肝中心
静脈閉塞（ＶＯＤ）、ウイルス性肝炎、シクロスポリン
等による薬剤性肝障害などがある。確定診断は肝生検に
より、経皮的肝生検に代わって経静脈的肝生検が推奨さ
れているが、我が国においてはまだ一般化していない。
また、重症急性ＧＶＨＤの際には、皮疹に数日先だって
４０度前後の高熱が出現することが多い。感染症との区
別として、ステロイド投与に著名な反応が認められると
きには、急性ＧＶＨＤによる発熱の可能性が高い。その
他急性膵炎、急性細気管支炎、食道炎、胃炎なども報告
されている。

【００１０】しかしながら、ＧＶＨＤの検査所見に関し
ては、例えばＩｇＥ、インターフェロンやＴＮＦが増加
することが知られてはいるが、ＩｇＥは増加しない例も
あり、インターフェロンやＴＮＦではルーチンで測定す
ることは困難でいずれも（早期）診断に役立てられるこ
とは少なく、現在までのところ急性ＧＶＨＤに特有の検
査所見はないとされている。

【００１１】ＧＶＨＤの予防は薬剤によるものと、骨髄
中からＴ細胞を除去する方法とがある。薬剤による予防
としては、例えば、移植後からメトトレキセートの静注
または経口での投与、移植前日から移植後におけるシク
ロスポリンやタクロリムス（ＦＫ５０６）の点滴静注、
或いは、前処置もしくは移植後の抗リンパ球細胞グロブ
リン（ＡＬＧ）や抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の投
与などが挙げられる。Ｔ細胞除去法としては、Ｔ細胞特
異的モノクロナール抗体を利用した除去や造血幹細胞の
表面マーカーであるＣＤ３４抗原に対するモノクロナー
ル抗体を用いて幹細胞を選択的に分離する方法等が挙げ
られる。しかし、適切なＧＶＨＤ予防を行っても、重症
ＧＶＨＤはある頻度で発症する。急性ＧＶＨＤの治療
は、患者ごとのリスクによって開始時期も治療内容も異
なってくる。

【００１２】軽症例ではプレドニン（１〜２mg/kg ）に
よる治療を開始し、解熱、下痢量の減少が観られれば経
過を観察し、漸減中止する。ＧＶＨＤの重症例では、強
力な免疫抑制療法を行わない限り救命は不可能である。
例えばシクロスポリンによる予防を行っていた症例で
は、ＦＫ５０６に変更し、メチルプレドニゾロンの大量
療法やＡＬＧ或いはＡＴＧの投与を行うことが勧められ
るが、治療開始時期が多少でも遅れると救命は望み得な
い。急性ＧＶＨＤが重症化すれば、体液・蛋白の喪失、
組織への体液貯留、臓器不全などの病態が進行し、やが
て間質性肺炎などの感染症を合併して致死的経過をたど
ることになる。上記のＧＶＨＤ治療が奏功するまでの期
間の全身管理の良否も最終的な結果に影響する。

【００１３】他方、慢性ＧＶＨＤは、移植後１００日以
降に出現する自己免疫様病変と免疫不全を特徴とする病
態である。慢性ＧＶＨＤの進展形式は、１）急性ＧＶＨ
Ｄからの移行（progressive type）、２）急性ＧＶＨＤ
が一旦消失した後の発症（quiescent type）、３）慢性
ＧＶＨＤが初発するもの（de novo type）の３種類があ
り、急性ＧＶＨＤからの移行は最も多く６０％程度にも
上る。慢性ＧＶＨＤの治療には、薬物としてはシクロス
ポリンＡ、ＦＫ５０６、プレドニゾロン、アザチオプリ
ン、サリドマイド等があるが、有効性のみならず副作用
の観点においても現状では満足の行くものはない。先述
のように、急性ＧＶＨＤの存在が一番大きな慢性ＧＶＨ
Ｄの発症要因であり、急性ＧＶＨＤをいかに抑制するか
によって慢性ＧＶＨＤの予防と治療を考えるべきとされ
ている。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＧＶＨ
Ｄの診断を早期に的確に行うことは、ＧＶＨＤの発症リ
スクを背負う患者とりわけ骨髄移植患者にとって、ＧＶ
ＨＤの予防や治療すなわち患者の救命や予後の管理に重
要である。しかし、未だ適当な検査所見が確立されてお
らず、既存の診断方法にはそれぞれ鑑別されるべき諸症
状が存在し、確定判断においても、患者に苦痛を与える
生検や薬物の反応を観察することが必要である。

【００１５】従って、本発明の目的は、ＧＶＨＤの検出
に的確で有用な判断指標を提示し、当該指標に基づくＧ
ＶＨＤの検出方法、薬物治療におけるＧＶＨＤの進展も
しくは予防効果のモニタリング方法、並びに、これらの
方法を効果的に実施するためのキットを提供することで
ある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく鋭意検討した結果、骨髄移植患者のＧＶＨ
Ｄの重症化、患者の血液中もしくは尿中のＵＴＩ濃度の
推移において、ＧＶＨＤの重症化とＵＴＩ量の増加とに
著明な相関を見出した。とりわけ急性ＧＶＨＤの重症化
と尿中へのＵＴＩ***量の増加とに強い相関を見出し
た。このことから本発明者らはＧＶＨＤの早期検出に的
確で有用な指標として、尿中のＵＴＩの***量を選択し
急性ＧＶＨＤの早期検出方法の提供、並びに当該検出の
ためのキットを提供することに成功し、本発明を完成す
るに至った。

【００１７】本発明の第一の態様は、ヒトから採取され
た試料中のＵＴＩを測定することを特徴とするＧＶＨＤ
の検出方法である。好ましくは、ＧＶＨＤが発症する恐
れのある状態の患者から採取された試料中のＵＴＩ量を
測定することを特徴とする急性ＧＶＨＤの検出方法であ
る。

【００１８】本発明の第二の態様は、骨髄移植患者にお
けるＧＶＨＤの検出を目的とする第一の態様記載の検出
方法である。

【００１９】本発明の第三の態様は、試料として血液も
しくは尿を用いることを特徴とする第一ないし第二の態
様記載の診断方法である。

【００２０】本発明の第四の態様は、少なくとも前処置
前、移植日、および移植後白血球回復期の３点で、試料
中のＵＴＩの存在を測定する工程を含んでなる、本発明
の第一ないし第三の態様に記載の検出方法である。

【００２１】好ましくは、前処置前、移植日、および移
植後白血球回復期の３点で測定した試料中のＵＴＩ量
が、下記関係式（１）； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） を満たし、より好ましくは、 ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞１／３ （２） であることを、ＧＶＨＤ発症の判断の指標とする検出方
法である。なお、上記関係式（１）、（２）において、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
定値 である。ＵＴＩ量の測定値は後述するクレアチニン補正
値を用いるのが好ましい。

【００２２】試料は、例えば、患者から採取された尿も
しくは血液であって、採取された新鮮な試料を用いるこ
とができるが、−８０℃程度に冷凍保存された試料を適
宜解凍して測定しても良い。また、尿に適当な保存剤も
しくは安定化剤（例えばホルマリン、トルエン、フェノ
ール、アジ化ナトリウム、或いは適当なプロテアーゼイ
ンヒビター（例えばベンザミン、トラネキサム酸等）
等）を添加して室温、好ましくは冷暗所にて保存した後
測定に供しても良い。

【００２３】なお、移植後白血球回復期のＵＴＩ測定の
ため、移植日以後毎日測定することも可能であるが、所
定の間隔で測定することが好ましい。具体的には、１日
〜１０日の任意の間隔で測定が可能であり、例えば２日
毎、３日毎、５日毎、７日毎、１０日毎の間隔が挙げら
れる。試料の採取は、尿の場合、例えば採尿時刻を１日
の午前もしくは午後の何れかに設定するか、更に好まし
くは、採尿時刻を特定時刻±１時間以内に設定し、同じ
採尿時刻に採取された尿を用いる。採尿は、患者の自力
による排尿を採取するか、経尿道的に膀胱から直接採取
されたものであってもよい。

【００２４】より早期の検出のためには、なるべく測定
間隔を短くし、上記関係式を満たした時点でＧＶＨＤへ
の移行を疑う。測定間隔は、また、患者のＵＴＩ測定値
の変化の個人差や容態等により、適宜変更される。以上
の第一〜第四の態様において、より好ましい態様は、試
料として尿を用いる当該ＧＶＨＤの検出方法である。

【００２５】本発明の第五の態様は、ＵＴＩの定量を行
なって急性ＧＶＨＤを診断するために用いられるＵＴＩ
測定キットである。

【００２６】本発明の第六の態様は、免疫反応により試
験試料中のＵＴＩを測定する手段を有する急性ＧＶＨＤ
測定キットである。

【００２７】本発明の第七の態様は、第五もしくは第六
の態様記載のＧＶＨＤ測定キットによる急性ＧＶＨＤの
モニター下に使用されることを特徴とする急性ＧＶＨＤ
の予防および／または治療剤である。第七の態様におい
て使用される薬物としては、メトトレキセート、シクロ
ホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロス
ポリン、タクロリムス水和物、塩酸グスペリムス等の免
疫抑制剤の他、プレドニンやメチルプレドニゾロン等の
ステロイド剤、ＡＬＧ、ＡＴＧ等が例示される。

【００２８】

【発明の実施の形態】次に本発明の実施の形態について
説明する。本発明は、ＧＶＨＤが発生する恐れのある状
態のヒト、例えば造血幹細胞移植とりわけ骨髄移植を受
けた患者から得られる試料中のＵＴＩを測定することを
特徴とするＧＶＨＤの発症の検出方法、並びに当該ＧＶ
ＨＤ検出のための測定キットである。ＧＶＨＤが発生す
る恐れのある状態にあるヒトとは、例えば造血幹細胞移
植、ドナーリンパ球輸注療法（ＤＬＴ）、輸血、臓器移
植を受けた患者が挙げられる。

【００２９】本発明にいう「ＧＶＨＤ」は、免疫担当細
胞であるリンパ球が、移植片を拒絶し得ないような宿主
に移植され生着し、宿主の組織抗原に対して移植免疫反
応を起こす結果ひきおこされる急性もしくは慢性の疾病
をいう。本発明の検出方法により、早期に検出しうるＧ
ＶＨＤとして好適なものとしては、造血幹細胞移植とり
わけ骨髄移植或いは（非縁者間）臍帯血幹細胞移植に起
因するＧＶＨＤ、ドナーリンパ球輸注療法（ＤＬＴ）に
おけるＧＶＨＤ、輸血に起因するＧＶＨＤ、あるいは、
臓器移植に起因するＧＶＨＤがあげられ、より好ましく
は急性ＧＶＨＤであり、更に好ましくは骨髄移植に起因
する急性ＧＶＨＤが挙げられる。

【００３０】ここで、「骨髄移植」とは、レシピエント
（受容者）の血液系を破壊した上で、健常なドナー（提
供者）から骨髄、即ち血液系の基となる細胞集団（例え
ば幹細胞）を移植することによって、レシピエントの内
々でドナー由来の血液系を再構成しようとする治療法で
ある。レシピエントの血液系の破壊には、既に冒されて
いる悪性疾患を排除することおよび／またはレシピエン
トの免疫系を抑制することを目的として放射線療法ある
いは骨髄破壊性高用量化学療法等が行われる。

【００３１】「前処置」とは、例えば白血病の治療にお
ける骨髄移植に先立って、レシピエントの体内に残存す
る白血病細胞の根絶と移植骨髄生着のための免疫抑制を
目的として行われる、全身放射線照射および／または大
量の抗がん剤例えばシクロスポリン、シタラビン、ブス
ルファン、メルファラン或いはエトポシド等の単独もし
くは併用投与等の処置である。通常移植手術のおよそ１
週間前ごろから移植当日にかけて前処置が行われる。

【００３２】従って、本発明において「前処置前」と
は、その前処置の以前の期間を意味するが、通常、前処
置の前２週間から前処置に入るまでの時期をいう。「移
植日」とは、レシピエントに対して、骨髄等の移植の施
術日もしくはその一両日である。

【００３３】「移植後白血球回復期」とは、前処置によ
り激減したレシピエントの白血球数が、骨髄等の移植に
よりおよそ１０００／ｍｍ³ 以上に回復した時期をい
い、通常、骨髄等の移植の施術日から２〜３週間後であ
るが、患者の回復状況により１週間程度前後しうる。

【００３４】特に、本発明の第四の態様では、少なくと
も前処置前、移動日、および移植後白血球回復期の３点
での試料中のＵＴＩ量を測定し、その測定値より、ＧＶ
ＨＤ発症を予想する判断指標とする。さらに好ましく
は、それぞれの測定値を（ａ）、（ｂ）、（ｃ）とした
場合に、試料中のＵＴＩ量が、下記関係式（１）； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） であることを、ＧＶＨＤ発症を予想する判断指標とす
る。さらに、尿中のＵＴＩ量が、 ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞１／３ （２） である場合は、その後、施術日から約３〜４週間後に重
症の急性ＧＶＨＤ、例えば腸管、皮膚等において III度
以上の急性ＧＶＨＤを発生する可能性が極めて大きいと
判断される。

【００３５】本発明に使用されうるＵＴＩの測定手法お
よび測定キットとしては、ＵＴＩ量または濃度を測定で
きる試薬またはキットであれば特に限定されないが、例
えば、トリプシン活性の阻害作用を測定する酵素学的測
定法、ＵＴＩと抗ＵＴＩ抗体との反応に基づく様々な免
疫学的測定方法およびかかる測定原理に基づくＵＴＩ測
定キットが挙げられる。

【００３６】酵素学的測定方法は、自動分析機の使用に
より迅速に測定できるが、トリプシン活性の阻害量をみ
るため、特異性の面でやや劣る。改善された技術とし
て、試料中のα１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）を
不活性化させる前処理を行なう技術、例えばＷＯ９９／
４９０７６号公報に開示された測定方法が利用され得
る。他方、免疫学的測定方法は、抗原抗体反応に基づく
ためＵＴＩのみを正確に測定できる特徴を持つ。具体的
には、定量的検出方法として、ラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、及
び、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）等が知られ
ており、定性的検出方法としては、赤血球凝集法、ラテ
ックス凝集反応比濁法（ＬＡＩＡ）、時間分解蛍光免疫
測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーア
ッセイ（ＩＣＡ）または電気化学的特異結合分析法（Ｍ
ＥＤＩＡ）（特開平５−２６４５５２号公報参照）等が
挙げられる。なお、ＬＡＩＡにおける凝集促進剤として
ポリエチレングリコールを添加する改良技術として特開
平１１−６４３３４号公報に開示された技術も利用され
得る。

【００３７】免疫学的測定方法に使用される抗ＵＴＩ抗
体は、ＵＴＩに対して特異的に反応し抗原抗体反応を生
じ、各測定法に必要な性質を有していれば良い。例えば
ＬＡＩＡにおいては凝集反応を有するものであれば特に
制限されず、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体
若しくはポリクロナール抗体を含む抗血清等の何れでも
良い。抗体の種類も制限されず、各種免疫グロブリン例
えばＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＤが使用で
きる。抗原の種類も制限されず、ラット、ウサギ、ヤギ
等由来の抗体が使用できる。これらの抗体は、免疫原と
してＵＴＩを使用すること以外は、通常行われる抗体作
成方法により得られる（例えば、日本泌尿器学会７４
巻、９号（１９８３年）に記載の方法）。反応液中の抗
ＵＴＩ抗体の濃度は、測定感度と測定上限に影響するの
で、適量を実験によって求めることが望ましく、その
際、抗ＵＴＩ抗体の力価や精製の程度を考慮して適量を
求めることができる。

【００３８】これらの測定法に供される本発明の「キッ
ト」としては、酵素学的測定法用のキットとして、例え
ば、 トリプシン溶液＋基質溶液＋トリプシン以外のプロテ
アーゼ溶液から構成される測定キット、 トリプシン溶液＋基質溶液＋酸化剤溶液から構成され
る測定キット、 或いは、またはに更に緩衝液を加えた測定キット があり、例えばＷＯ９９／４９０７６明細書記載の測定
キットＡおよびキットＢが参照される。これらのキット
には必要に応じＵＴＩ標準品や希釈溶媒が添付される。

【００３９】免疫学的測定方法のキットとしては、例え
ば抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ法を用いた該手段の
試薬としては、酵素標識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体、酵素基質及び発色剤が挙げられる。ここに記
載される酵素は例えばペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙
げられる。すなわち、酵素標識抗ＵＴＩ抗体がＨＲＰ標
識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体が非標識抗Ｕ
ＴＩ抗体、酵素基質が過酸化水素水及び発色剤がテトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢ）発色剤となる。これら４試
薬により臓器移植後の臓器移植患者（レシピエント）の
ＵＴＩ量を測定する手段の一例は構成される。該試薬を
含めたキットとしては、該試薬が含まれれば、特に免疫
反応または発色反応の検出を阻害するものを含まなけれ
ば、他に何が含まれていてもよい。例えば結合反応の場
であるプレート等含むことが好ましく、さらにプレート
が、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体がプレートに結合された抗
ウリナスタチン抗体結合プレートであればさらに好まし
い。また、必要に応じてプレートシール、抗体希釈液、
検体希釈液、洗浄液、発色停止剤または標準ＵＴＩ液等
を含むことが好ましい。さらに測定するための機器とし
て、ピペット類、恒温層、試験管類、吸光度測定計等を
含んでいてもよい。

【００４０】この試薬またはキットによる試料中のＵＴ
Ｉ量の測定方法は、以下の通りである。まず非酵素標識
抗ＵＴＩ抗体を固定したプレートに尿及び酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体を添加し、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体と資料中の
ＵＴＩさらに酵素標識抗ＵＴＩ抗体を結合させる。プレ
ートを洗浄して結合物を残渣と分離し、酵素基質と発色
剤を添加して発色の吸光度を測定する。同時に行った標
準ＵＴＩの測定値または予め求められている検量線よ
り、試料中のＵＴＩ濃度を求める。さらに尿中のＵＴＩ
量のクレアチニン補正値を求める場合は、公知の方法で
尿中クレアチニン量を測定し、下記式により換算量を求
める。 式 尿中ＵＴＩ量のクレアチニン補正値（Ｕ／ｍｇ・Ｃｒ
ｅ）＝尿中ＵＴＩ濃度（Ｕ／ｍｌ）×尿中クレアチニン
濃度（ｍｇ／ｍｌ）

【００４１】また別の例として、抗体を用いた該手段の
試薬としては、酵素標識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体及び酵素基質が組み込まれたＭＥＤＩＡ法を利
用する試薬が挙げられる。ここに記載される酵素をＨＲ
Ｐとした場合の各具体例はサンドイッチＥＩＡ法におけ
る説明と同様である。これら３試薬により臓器移植後の
臓器移植患者（レシピエント）の尿中ＵＴＩ量を測定す
る手段の一例は構成される。該試薬を含めたキットとし
ては、該試薬が含まれれば、特に免疫反応または電気化
学反応の検出を阻害するものを含まなければ、他に何が
含まれていてもよい。例えば、反応の場（マトリクス）
及び電極等を含む反応装置（特開平５−２６４５５２号
公報参照）を含むことが好ましい。また、必要に応じて
抗体希釈液、検体希釈液、電子メディエーターまたは標
準ＵＴＩ液等を含んでいてもよい。さらに測定するため
の付属品として、ピペット類、試験管類、電流測定計等
を含んでいてもよい。このＭＥＤＩＡ法による測定のた
めの試薬またはキットによる尿中ＵＴＩ量の測定方法
は、以下の通りである。反応装置に尿及び酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体を添加し、またはマトリクスに予め酵素標識抗
ＵＴＩ抗体が含浸されている場合は反応装置に尿を添加
し、生じた電流の変化を測定する。同時に行った標準Ｕ
ＴＩの測定値または予め求められている検量線より、尿
中のＵＴＩ濃度を求める。尿中のＵＴＩのクレアチニン
補正値を求める場合は、上記に記載の方法で求める。

【００４２】当該キットの具体例は、 １）定量的測定キットとして、 ＵＴＩ−ＲＩＡキット：放射ラベルＵＴＩ（例えば
¹²⁵ I −ＵＴＩ）＋固相化した抗ＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標
準品から構成されるキット、或いは、固相化した抗ＵＴ
Ｉ抗体の代わりに抗ＵＴＩ抗体＋第二抗体を加えたキッ
トがあり、例えばＢｒｉｔｔ−Ｍａｒｉｅら（Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ、Ｖｏｌ．
３７０、ｐｐ１１５７−１１６１、Ｎｏｖ．（１９８
９））が参照される。 ＵＴＩ−ＥＩＡキット：抗ＵＴＩ抗体＋酵素（例えば
ペルオキシダーゼ）標識抗体＋基質溶液から構成される
キットがあり、具体的には、Ｅｔｓｕｏら（Ｃｌｉｎｉ
ｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ．１６７、ｐｐ．１５５−
１６４（１９８７））、或いは、後述する本発明の実施
例４が参照される。また、固相化抗体＋酵素標識抗体の
組み合わせとしては、ポリクロナール抗体同士の他、モ
ノクロナールとポリクロナールの組み合わせ、モノクロ
ナール同士の組み合わせの何れも利用可能である。これ
らのキットには適宜、ＵＴＩ標準品、試料希釈液、反応
停止液等の付属品が添付されうる。 ＵＴＩ−蛍光免疫測定キット：の酵素標識抗体の代
わりに、蛍光標識した抗体を用いて構成されるキットで
ある。 ＵＴＩ−化学発光キット：の酵素標識抗体の代わり
に、化学発光物質で標識した抗体を用いて構成されるキ
ットである。

【００４３】２）定性的検出方法 ＵＴＩ−赤血球凝集法キット：赤血球に固相化した抗
ヒトＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標準品を構成とするキットであ
る。 ＵＴＩ−ＬＡＩＡキット：ラテックスに固相化抗ヒト
ＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標準品を構成とするキット、例えば
後述の測定方法の実施例１−ｂが挙げられる。

【００４４】本発明の「ＵＴＩ測定キットによるＧＶＨ
Ｄのモニター下に使用されることを特徴とするＧＶＨＤ
の予防および／または治療剤」とは、現在もしくは将来
上市され若しくは開発が指向される全ての薬剤が該当す
るが、好ましくは、本発明の診断方法で患者の症状をモ
ニターしつつ投薬されることにより、そのＧＶＨＤの予
防もしくは治療効果がより優れて発揮される薬剤であ
る。具体的には、メトトレキセート、シクロスポリン、
タクロリムス、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロ
ン、アザチオプリン、ミゾリビン、ＡＬＧ、ＡＴＧ等こ
れらの塩、これらの水和物ないし塩の水和物等が挙げら
れる。これらは単独もしくは適宜併用されてもよい。併
用する場合は、メトトレキセートとシクロスポリン、も
しくは、メトトレキセートとタクロリムス水和物との併
用が好ましく、あるいは、メトトレキセートとシクロス
ポリンとｍ−ＰＳＬの３剤併用、もしくは、メトトレキ
セートとタクロリムス水和物とｍ−ＰＬＳとの３剤併用
も好ましい。投与法としては、好ましくは経口投与もし
くは静脈内投与である。必要に応じ血中濃度をモニター
しながらの点滴静注が好ましい。

【００４５】本発明のＧＶＨＤの早期検出方法は、上記
構成をとることにより、ＧＶＨＤ、特に急性ＧＶＨＤの
発症を、早期に的確に検出することが可能である。とり
わけ骨髄移植患者におけるＧＶＨＤの早期検出に有用で
ある。本発明においては、試料としては好ましくは採取
された血液あるいは尿が使用される。とりわけ尿の使用
は、採取に特別な器具や技術を必要とせず安全かつ簡便
であり、患者への負担や検査担当者の安全確保等の観点
からも望ましい。このため、臨床検査、診断分野におい
て最も有用性の高い検出方法である。使用済み器具や試
料の廃棄についても問題が無い。少なくとも前処置前、
移植日、および移植後白血球回復期の３点で、試料中の
ＵＴＩ量を測定し、その測定値をＧＶＨＤの発症の判断
指標とし、特に、試料中のＵＴＩ量が上記関係式（１）
を満たすことをＧＶＨＤの発症の判断指標とする本発明
の検出方法では、より的確にＧＶＨＤの発症を検出する
ことが可能である。また、本発明の検出方法により、Ｇ
ＶＨＤの進展をモニターしつつ患者に対し薬物による的
確な予防および／または治療が可能となる。本発明のＧ
ＶＨＤを早期検出するための測定キットは、上記構成を
採ることにより、ＧＶＨＤ発症の可能性を早期に、的確
かつ簡便に検出することができる。従って、本発明の検
出方法および測定キットは、ＧＶＨＤの診断に、好適に
用いられる。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、さらに具体
的に説明する。 ＜ＧＶＨＤの検出＞ （実施例１） （対象と方法）骨髄移植症例７例について、ＥＩＡ法
（後述するキットの実施例４参照）を用いて、（ａ）前
処置前（移植２〜３週間前）、（ｂ）移植日、（ｃ）移
植後白血球回復期（移植後２〜３週間後）の３点で尿中
のＵＴＩ濃度を測定した。なお、患者にはＧＶＨＤの予
防のため通常量のサイクロスポリンＡとメトトレキセー
トを投与した。

【００４７】（判定方法）ＧＶＨＤ発症の傾向の有無
を、次の式で現される数値（Ｒ）により判定した。 Ｒ＝｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ 式中、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
定値 Ｒ＞１／３のとき陽性（＋：重症ＧＶＨＤ発症の恐れあ
り）、１／３≧Ｒ＞０のとき擬陽性（±：ＧＶＨＤの傾
向あり）とし、Ｒ≦０のときは陰性（−：重症ＧＶＨＤ
発症の恐れ無し）とした。

【００４８】（結果）ＵＴＩ濃度は、全症例で移植日に
上昇した。白血球回復期において、２症例（Ａ氏、Ｂ
氏）はＵＴＩ値がさらに上昇し、他の５症例は低下した
（Ｃ氏〜Ｇ氏）。各測定値ならびに判定結果を下記第１
表に示す。また、本測定における尿中のＵＴＩ量の変化
を図１のグラフに示す。図１のグラフの縦軸は、尿中の
ＵＴＩの濃度（同時に測定したクレアチン濃度により補
正）を、横軸は、測定点（前処置前、移植日、移植後白
血球回復期）を表わす。

【００４９】 （（ａ）〜（ｃ）の測定値の単位：ｍｇ／Ｌ）

【００５０】本発明の検出方法により、７名中２名がＧ
ＶＨＤ陽性と判定された。なお、ＧＶＨＤ陽性と判定さ
れた２名（Ａ氏およびＢ氏）中、Ａ氏は移植後２１日目
に、腸管および皮膚において III度の急性ＧＶＨＤを引
き起こした。Ｂ氏は移植後３４日目に、腸管において I
II度の急性ＧＶＨＤを引き起こした。それぞれの患者に
対してシクロスポリンＡを概ね倍量とプレドニゾロンを
投薬して管理を継続したところ予後は良好に回復しＧＶ
ＨＤは寛解するに至った。また、ＧＶＨＤ陽性と判定さ
れなかった患者はそのまま移植骨髄が生着を続け、病態
として特に問題はなかった。

【００５１】＜ＵＴＩ量の測定方法および測定キット＞ 実施例２：ラテックス凝集免疫比濁法 ２−ａ）測定方法 比濁計ＬＡ−２０００（Analytical instruments Co.,
LTD,東京）を使用し、ラテックス凝集免疫比濁法を用い
てＵＴＩ量を自動測定する。測定原理は、ポリスチレン
ラテックスビーズ（栄研化学、直径０．１μｍ）にウサ
ギ抗ヒトＵＴＩ抗体をコーティングし、ＵＴＩを３７℃
で反応させ、結果生じるラテックス凝集体の濁度を測定
波長５８５ｎｍで測定する。標準物質は持田製薬（株）
製のＵＴＩを用い、反応時間は反応開始後１００秒と５
００秒の間の４００秒における濁度差から抗原量（ＵＴ
Ｉ）を求める。なお、ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体は、ウリ
ナスタチンをフロイントアジュバント（Difco ，ＵＳ
Ａ）と混合して油中水型エマルジョンをつくりこれをウ
サギに免疫して抗血清を得る。

【００５２】２−ｂ）測定キット <1> ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体をコーティングしたポリス
チレンラテックスビーズ <2> 標準物質 その他：必要に応じ、比濁計（例：ＬＡ−２０００）

【００５３】実施例３：酵素法 ３−ａ）測定方法 Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロア
ニリドを基質とし、ウシ膵トリプシン（シグマ社）によ
る分解を阻止しうる尿中ＵＴＩ値をＵＴＩ等量として、
ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ（ロッシュ社）を用いて自動測定
する。

【００５４】３−ｂ）測定キット <1> 基質（Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリド) <2> ウシ膵トリプシン（シグマ社) <3> ＵＴＩ標準品

【００５５】実施例４：サンドイッチ法 ４−Ａ．測定方法（ポリクロナール抗体使用） ４−Ａ−１−ａ）尿中のＵＴＩ測定方法 ＵＴＩに対するポリクロナール抗体を用いた１ステップ
サンドイッチＥＩＡ法により試料中のＵＴＩ量を定量す
る。具体的には、ＵＴＩ抗体を固相化したプレート（９
６ウェル：ＮＵＮＣ社製）に、１０００倍希釈した試料
２０μＬを分注し、ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体溶
液（０．２５μｇ／ｍＬ）８０μＬを添加して３７℃で
３０分間反応させる。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む生理食塩水でプレートを洗浄し、基質溶液（テ
トラメチルベンジジン、ＢｉｏＦＸＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社）を加えて反応させ（遮光下、室温１０分）、
０．５Ｍ硫酸１００μＬにて停止した後マイクロプレー
トリーダー（ＴＨＥＲＭＯｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ社）４５０ｎｍ（副波長６３０ｎｍ）の
吸光度を測定する。ＵＴＩ標準品を用いた同様の操作か
ら得られた標準曲線に基づいて試料中のＵＴＩ量を算出
する。

【００５６】４−Ａ−１−ｂ）測定キット構成 <1> ＵＴＩ抗体（ポリクロナール抗体もしくはモノクロ
ナール抗体）を固相化したプレート <2> ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体溶液 <3> 基質溶液 その他付属品として、 <4> プレート洗浄液 <5> 試料希釈液 <6> 反応停止液 <7> マイクロプレートリーダー <8> ＵＴＩ標準品

【００５７】４−Ａ−２−ａ）血中のＵＴＩの測定方法 血液５０μＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに
とり、生理食塩水１５０μＬ、次いで４０％過塩素酸水
溶液５０μＬを添加し、約５秒攪拌する。１５０００ｒ
ｐｍで１０分遠心し、上清１００μＬを分取する。更に
０．８ＭＮａＯＨ１５０μＬ、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）５０μＬを添加混合して３００μＬの１
５倍希釈試料とする。この希釈試料に尿中ＵＴＩキット
希釈液を加え９００倍希釈試料とする。この試料２０μ
Ｌを用いて４−Ａ−１−ａ）のプロトコールに従って血
中のＵＴＩ量を測定する。なお、この前処理方法を使用
して、全血以外の血清、血漿（ＥＤＴＡ、クエン酸、ヘ
パリン採血）中のＵＴＩを測定可能である。

【００５８】４−Ａ−２−ｂ）血中ＵＴＩの測定キット ４−Ａ−１−ｂ）の尿中ＵＴＩ測定キット<1> 〜<8> に
更に以下の構成を付加する。 <9> ４０％過塩素酸水溶液 <10>生理食塩水 <11>０．８ＭＮａＯＨ水溶液 <12>１ＭTris-HCl（ｐＨ８．０） その他：小型遠心機

【００５９】４−Ｂ. 測定法（モノクロナール抗体） ４−Ｂ−ａ） 測定法４−Ａ−１−ａ）もしくは４−Ａ−２−ａ）にお
いてポリクロナール抗体の代わりに後述のＵＴＩモノク
ロナール抗体を使用して、試料（血液）中のＵＴＩ量を
算出する。 ４−Ｂ−ｂ）測定キット ４−Ａ−１−ｂ）もしくは４−Ａ−２−ｂ）の測定キッ
トにおけるポリクロナール抗体に代え後述のＵＴＩモノ
クロナール抗体を用いてキットを構成する。

【００６０】（参考例）実施例４のサンドイッチ法で用
いる各種プレートの調整方法を記す。 ｉ）ＵＴＩ抗体固相化プレート マイクロタイタープレート（Immuno module Maxisorp,
Nalge Nunc International）にポリクロナール抗体溶液
１００μＬを分注し、室温で一晩放置して抗体を固相化
し、洗浄後、 0.1％Tween20 溶液および４％ラクトース
溶液でコーティングを行い、乾燥後、乾燥剤とともにチ
ャック付きラミネート袋に保存したものを使用した。

【００６１】iiａ）ＵＴＩポリクロナール抗体 日本白色家兎に２週間に１回、耳静脈に精製ＵＴＩ溶液
（持田製薬（株）製ＵＴＩ５００μｇ／ｍＬ）を投与し
た。採血した抗血清より、ＵＴＩとの反応性を指標に反
応性の高い抗血清を選択した。抗血清は５０％飽和硫酸
アンモニウムで塩析後、Protein A Sepharose カラム
（アマシャム・ファーマ・バイオテック）にて精製し、
ポリクロナール抗体とした。

【００６２】iiｂ）ＵＴＩモノクロナール抗体 精製ＵＴＩ（１００μｇ）をフロイント完全アジュバン
トと混合し雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５−１０週齢）の腹
腔に投与した。最終投与３日後にマウス脾臓よりリンパ
球を採集し、ポリエチレングリコールを用いてミエロー
マ（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１）と融合した。定法
に従いＨＡＴセレクションを行いハイブリドーマを作成
し、精製ＵＴＩとの結合を指標によりＥＬＩＳＡ法に
て、ヒトＵＴＩと反応するモノクロナール抗体を得た。
得られたハイブリドーマを無血清培地（ＰＦＨＭ−II 、
ＧＩＢＣＯ）で培養し、上清中に産生した抗体をＰｒｏ
ｔｅｉｎ−Ａカラム（アマシャムファルマシアバイオテ
ク）を用いて精製し、モノクロナール抗体とした。

【００６３】iii ）酵素標識ＵＴＩ抗体の作成 中根らの方法（Peroxidase-labeled antibody ：a new
method of conjugation ：２２巻、１０８４−１０９１
頁、１９７４年）に従い、ペルオキシダーゼ（東洋紡社
製）を過ヨウ素酸により活性化し、ＵＴＩポリクロナー
ル抗体と反応させた。反応後、透析を行い、ペルオキシ
ダーゼ標識ＵＴＩ抗体を得た。使用した抗体量を液量で
割ったものを濃度とした。

【００６４】

【発明の効果】本発明のＧＶＨＤの検出方法ならびにキ
ットにより、ＧＶＨＤ発症を早期に的確に検出すること
が可能になる。とりわけ骨髄移植患者におけるＧＶＨＤ
の早期検出に有用である。また、本発明の検出方法によ
り、急性ＧＶＨＤの進展をモニターしつつ患者に対し薬
物による的確な予防および／または治療が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 移植前後の尿中ＵＴＩ量の変化を示すグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 真嗣 大阪府大阪市西区南堀江１−14−28 ヤマ ゴビル７Ｆ (72)発明者 加藤 克明 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA25 CA25 CA26 CB03 DA44 FA26 FA29 FB01 FB03 FB07 FB12 FB13 GC15

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトから採集された試料中のＵＴＩの量を
   測定することを特徴とするＧＶＨＤの検出方法。
2. 【請求項２】骨髄移植におけるＧＶＨＤの検出を目的と
   する請求項１に記載のＧＶＨＤの検出方法。
3. 【請求項３】前記試料として、尿を用いることを特徴と
   する請求項１ないし２記載のＧＶＨＤの検出方法。
4. 【請求項４】少なくとも前処置前、移植日、および移植
   後白血球回復期の３点で、試料中のＵＴＩの存在を測定
   する工程を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載
   のＧＶＨＤの検出方法。
5. 【請求項５】前処置前、移植日、および移植後白血球回
   復期の３点で、試料中のＵＴＩの存在を測定する工程を
   含んでなり、試料中のＵＴＩ量の測定値が、下記関係式
   （１）を満たすことを、ＧＶＨＤの発症の指標として判
   定することを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載
   のＧＶＨＤの検出方法； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） 式中、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
   定値。
6. 【請求項６】ＵＴＩの定量を行なって急性ＧＶＨＤを診
   断するために用いられるＵＴＩ測定キット。
7. 【請求項７】免疫反応により試験試料中のＵＴＩを測定
   する手段を有する急性ＧＶＨＤの測定キット。