PL205979B1

PL205979B1 - Sposób immunologicznego pomiaru zawartości ludzkiej medullazyny i sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego

Info

Publication number: PL205979B1
Application number: PL345608A
Authority: PL
Inventors: Hideaki Suzuki; Kiyoshi Takahashi; Hisashi Katsuragi; Yosuke Aoki
Original assignee: Dainichiseika Color Chem
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2010-06-30
Also published as: EP1122543A1; CA2327414A1; DE60043146D1; AU7218000A; NO328316B1; US7081348B2; ATE445840T1; EP1122543B1; RU2210074C2; AU784387B2; ES2334972T3; CA2327414C; US6767709B1; CN1237346C; NO20010175D0; PL345608A1; NO20010175L; CN1307237A; US20050019957A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób immunologicznego pomiaru zawartości ludzkiej medullazyny i sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego.

Medullazyna, będąca rodzajem proteazy serynowej, występuje, między innymi, w granulocytach i jak się powszechnie uważ a, odgrywa istotną rolę w mechanizmie obronnym, w tym również w stanach zapalnych, w szczególności przewlekłych. Ilość medullazyny w granulocytach rośnie w zaawansowanych stanach wielu przewlekłych chorób zapalnych i normalizuje się w stanie remisji. Jednakże zaobserwowano, że u pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane ilość medullazyny wyraźnie rośnie na kilka dni przed zaawansowaniem się stanu i normalizuje się przed remisją. Stwardnienie rozsiane charakteryzuje się miejscowymi zmianami demielinizacyjnymi istoty białej w ośrodkowym układzie nerwowym oraz glejozą. Jest to poważna przewlekła choroba zapalna, która postępuje z powtarzającymi się remisjami i zaostrzeniami i w wielu wypadkach powoduje śmierć w ciągu 10-15 lat.

Przyczyna stwardnienia rozsianego nie została jeszcze wyraźnie określona, ale uważa się, że choroba ta jest rodzajem choroby autoimmunizacyjnej, w której własne przeciwciała atakują tkankę nerwową po pobudzeniu układu odpornościowego przez wirusa albo bakterie.

Diagnoza jej jest dość trudna i obecnie przeprowadza się ją przez obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) itp. Jednakże, sposób taki jak MRI wymaga wyposażenia na dużą skalę i wysokich umieję tnoś ci umoż liwiających badanie oraz jest drogi. Ponadto, sposób badania szpiku jest związany z zadawaniem bólu pacjentowi. W świetle powyższych okoliczności, opracowano prosty sposób diagnostyczny służący rozpoznaniu choroby, stopnia zaawansowania choroby oraz ocenie następstw. W wyniku, przetestowania sposobów pomiaru meduliazyny w granulocytach krwi opracowano sposób immunologicznego pomiaru, dzięki któremu można ją łatwo zmierzyć i na podstawie zawartości meduliazyny we krwi diagnozować stwardnienie rozsiane.

Jednak zaobserwowano, że gdy immunologiczny pomiar ludzkiej meduliazyny we krwi przeprowadza się po rozcieńczeniu próbki krwi ośrodkiem wodnym, bez przeprowadzenia obróbki w celu całkowitego uwolnienia z granulocytów zawartej w nich meduliazyny, powtarzalność zmierzonych wartości nie jest zadowalająca, co prowadzi do zmienności mierzonych wartości. Tak więc, pożądane jest opracowanie sposobu immunologicznego pomiaru ilości ludzkiej meduliazyny we krwi z dobrą powtarzalnością.

Ocena, czy stwardnienie rozsiane można diagnozować na podstawie ilości meduliazyny we krwi, wymaga zbadania znacznej ilości danych klinicznych. Jednak, do tej pory nie istniały takie dane i ponadto trudno było postawić dokładną diagnozę z powodu trudności w uzyskaniu dokładnych wartości zawartości meduliazyny w granulocytach we krwi z powodu znacznej zmienności zmierzonych wartości. Tak więc, rozpoznanie stwardnienia rozsianego na podstawie ilości meduliazyny we krwi było trudne.

Twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili szeroko zakrojone badania w celu rozwiązania wyżej opisanego problemu. W wyniku tych badań stwierdzono, że ludzką medullazynę we krwi można dokładnie zmierzyć z dobrą powtarzalnością pomiarem immunologicznym przy użyciu przeciwciał przeciwko ludzkiej medullazynie. Ludzką medullazynę uzyskuje się po całkowitym rozerwaniu leukocytów przez traktowanie próbki krwi roztworem wodnym zawierającym surfaktant albo roztworem wodnym o określonym ciśnieniu osmotycznym innym niż ciśnienie osmotyczne ludzkiej krwi.

Ponadto, wraz z opracowaniem niniejszego sposobu dokładnego pomiaru ludzkiej meduliazyny z dobrą powtarzalnością, twórcy niniejszego wynalazku zauważyli, ż e wielkość i zmiany w zmierzonej zawartości ludzkiej meduliazyny w próbce krwi są ściśle powiązane z początkiem stwardnienia rozsianego i jego nasileniem.

Wynalazek niniejszy dotyczy sposobu immunologicznego pomiaru zawartości ludzkiej meduliazyny we krwi, obejmującego następujące etapy (a) i (b):

(a) rozrywanie leukocytów w próbce krwi przez doprowadzenie jej do kontaktu z następującymi wodnymi roztworami (i) lub (ii) lub mieszaniną wodnych roztworów (i) i (ii), przy czym roztwór (i) jest roztworem wodnym, który zawiera 0,05% molowych lub więcej lub 0,005% molowych lub mniej substancji rozpuszczonej, o ciśnieniu osmotycznym 250 mmol/l-H₂O lub mniejszym lub roztworem wodnym o ciśnieniu osmotycznym 310 mmol/LH₂O lub większym; roztwór (ii) jest roztworem wodnym zawierającym surfaktant; i

PL 205 979 B1

b) immunologiczne określenie zawartości ludzkiej medullazyny w próbce krwi metodą obejmującą doprowadzenie do kontaktu próbki krwi zawierającej ludzką medullazynę uwolnioną z leukocytów, które uległy rozerwaniu w etapie (a), z przeciwciałem przeciwko medullazynie unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku w obecności znakowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie z wytworzeniem kompleksu kanapkowego i wychwycenie ludzkiej medullazyny w znakowanym kompleksie immunologicznym przez reakcję antygen-przeciwciało, a następnie określenie ilościowo aktywności znakowanego materiału w tym kompleksie.

Korzystnie w sposobie według wynalazku roztwór wodny (i) jest roztworem buforu i/lub wodą destylowaną która może zawierać organiczny rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie, lub roztwór (i) stanowi roztwór wodny zawierający rozpuszczalne w wodzie substancje wybrane z grupy obejmującej sole kwasów nieorganicznych, sole kwasów organicznych, cukry, alkohole cukrowe, aminokwasy i substancje białkowe.

Korzystnie w sposobie roztwór wodny (i) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

Korzystnie w sposobie roztwór wodny (ii) stanowi roztwór wodny surfaktanta, korzystnie roztwór wodny surfaktantów przynajmniej jednego typu wybranych z grupy obejmującej sole wyższych kwasów tłuszczowych, alkiloarylosulfoniany, alkilosulfoniany, sole estrów, sole alkilopirydyniowe, sole alkilotrimetyloamoniowe, etery polioksyetylenowoalkilofenylowe, etery polioksyetylenowoalkilowe, estry polioksyetylenosorbitanu i kwasów tłuszczowych oraz alkilobetainy.

Korzystnie roztwór wodny (ii) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

Korzystnie w etapie (a) stosuje się mieszaninę wodnego roztworu (i) oraz (ii). Korzystnie też w etapie (a) stosuje się roztwór wodny (i).

W zakres wynalazku wchodzi również sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego obejmujący następujące etapy (a) i (b):

a) etap rozrywania leukocytów w próbce krwi przez doprowadzenie do kontaktu próbki krwi z nastę pują cymi wodnymi roztworami (i) lub (ii) lub wodn ą mieszaniną (i) i (ii), przy czym roztwór (i) jest roztworem wodnym, który zawiera 0,05% molowych lub więcej lub 0,005% molowych lub mniej substancji rozpuszczonej o ciśnieniu osmotycznym 250 mmol/LH-O lub mniejszym lub wodnym roztworem o ciśnieniu osmotycznym 310 mmoi/l-^O lub większym; roztwór (ii) jest roztworem wodnym zawierającym surfaktant; i

b) etap immunologicznego określenia ilości ludzkiej medullazyny uwolnionej do próbki krwi z leukocytów, które uległy rozerwaniu w etapie (a), przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie unieruchomionego na nierozpuszczalnym nośniku w obecności znakowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie i wytworzenie kompleksu kanapkowego i wychwycenie ludzkiej medullazyny w znakowanym kompleksie immunologicznym przez reakcję antygen-przeciwciało, a następnie określenie ilości aktywności znakowanego materiału w tym kompleksie.

Korzystnie w sposobie diagnozowania roztwór wodny (i) jest roztworem buforu i/lub wodą destylowaną, która może zawierać organiczny rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie.

Korzystnie roztwór wodny (i) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

Korzystnie w sposobie diagnozowania roztwór wodny (ii) stanowi roztwór wodny surfaktanta.

Korzystnie etap (b) sposobu obejmuje kanapkowanie ludzkiej medullazyny w próbce krwi między przeciwciałem przeciwko medullazynie unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku i znakowanym przeciwciałem przeciwko ludzkiej medullazynie w celu wytworzenia kompleksu w reakcji antygen-przeciwciało i określenie ilości znacznika w tym kompleksie.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest krzywą kalibracyjną do pomiaru ludzkiej medullazyny, przygotowaną przez wykreślenie absorbancji zmierzonej immunologicznym testem enzymatycznym, opisanym w Przykładzie 2, jako funkcji stężenia antygenu.

Figura 2 stanowi krzywą kalibracyjną do pomiaru ludzkiej medullazyny, wytworzoną przez wykreślenie absorbancji zmierzonej immunologicznym testem enzymatycznym, opisanym w Przykładzie 3, jako funkcji stężenia antygenu.

PL 205 979 B1

Na Fig. 3 pokazano wartości ludzkiej medullazyny w próbkach krwi ^g/10⁸ granulocytów) wykreślone osobno dla osobników zdrowych, pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane i pacjentów cierpiących na niezapalne choroby układu nerwowego.

Na Fig. 4 pokazano wartości ludzkiej medullazyny ^g/10⁸ granulocytów) w próbkach krwi wykreślone osobno dla mężczyzn i kobiet cierpiących na stwardnienie rozsiane.

Na Fig. 5 pokazano wartości ludzkiej medullazyny ^g/10⁸ granulocytów) w próbkach krwi wykreślone osobno dla pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane w różnym wieku. Poniżej wynalazek zostanie opisany szczegółowo.

W etapie b) sposobu immunologicznego pomiaru zawartości ludzkiej medullazyny we krwi według wynalazku dokonuje się wychwytu ludzkiej medullazyny na znakowanym kompleksie immunologicznym przez doprowadzenie do kontaktu ludzkiej medullazyny uwolnionej z leukocytów rozerwanych w etapie a) z przeciwciałem przeciwko ludzkiej medullazynie, unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku, w obecności znakowanego przeciwciała przeciwko ludzkiej medullazynie z wytworzeniem kompleksu kanapkowego przez reakcje antygen-przeciwciało.

Podobnie w sposobie diagnozowania według wynalazku w etapie b) dokonuje się wychwytu ludzkiej medullazyny na znakowanym kompleksie immunologicznym przez doprowadzenie do kontaktu ludzkiej medullazyny uwolnionej z leukocytów rozerwanych w etapie a) z przeciwciałem przeciwko ludzkiej medullazynie, unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku, w obecności znakowanego przeciwciała przeciwko ludzkiej medullazynie z wytworzeniem kompleksu kanapkowego przez reakcje antygen-przeciwciało.

Większość ludzkiej medullazyny w próbce krwi mierzonej w niniejszym wynalazku występuje w granulocytach, które są jednym ze składników leukocytów występujących we krwi, zaś całkowite rozerwanie granulocytów z uwolnieniem całej medullazyny na zewnątrz błony komórkowej przed pomiarem jest zasadniczym wymogiem uzyskania dokładnych pomiarów. Zatem, jeżeli ten warunek nie jest w pełni spełniony, występują znaczne zmienności w pomiarach i można jedynie otrzymać dane o słabej powtarzalności.

Metody mechaniczne, metody wykorzystujące fale ultradźwiękowe i metody obejmujące naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie uważa się za sposoby mogące zapewnić całkowite rozerwanie leukocytów w próbce krwi. Jednak, twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili w wyniku szeroko zakrojonych badań, że poniższy sposób jest szczególnie skuteczny jako praktyczna metoda dająca pomiary o wysokiej dokładności, który można przeprowadzić ze względną łatwością w porównaniu z opisanymi wyżej sposobami.

W sposobie tym stosuje się

- po pierwsze, traktowanie próbki krwi roztworem wodnym o ciśnieniu osmotycznym innym niż ciśnienie osmotyczne krwi; a

- po drugie, traktowanie próbki krwi roztworem wodnym zawierającym surfaktant który jest środkiem farmaceutycznym, który może rozkładać błonę komórkową granulocytów w łagodnych warunkach.

Ciśnienie osmotyczne ludzkiej krwi jest w zakresie od 280 do 290 mmoi/l-^O, stąd trudno jest, przykładowo, całkowicie zniszczyć granulocyty we krwi stosując roztwór wodny o ciśnieniu osmotycznym od 250 do 310 mmol/LH₂O.

Zatem, całkowite rozerwanie granulocytów ludzkiej krwi można osiągnąć przez rozcieńczenie krwi roztworem wodnym o ciśnieniu osmotycznym mniejszym niż 250 mmol/LH₂O albo większym niż 310 mmol/L^O.

Roztwory wodne tego rodzaju, które można zastosować, obejmują czystą wodę, która może zawierać rozpuszczalne w wodzie rozpuszczalniki organiczne, oraz wodne roztwory i roztwory buforów, które są roztworami wodnymi o niezwykle wysokich stężeniach albo niezwykle niskich stężeniach substancji rozpuszczonej zawierające substancje rozpuszczalne w wodzie, takie jak sole kwasów nieorganicznych, sole kwasów organicznych, cukry, alkohole cukrów, aminokwasy i białka, oraz których ciśnienie osmotyczne może całkowicie rozerwać granulocyty. Konkretnie, chlorek sodu, fosforan sodu, itp. są korzystnymi solami kwasów nieorganicznych, zaś octan sodu, cytrynian sodu itp. są korzystnymi solami kwasów organicznych. Ponadto, glukoza i sorbitol itp. są korzystnymi cukrami i alkoholami cukrów. Roztwory wodne o niezwykle wysokich stężeniach wyżej opisanych substancji rozpuszczonych zawierają 0,05% molowych albo więcej, korzystnie 0,1% molowych tych substancji albo więcej, podczas gdy wodne roztwory o nadzwyczaj niskim stężeniu powyżej opisanej substancji rozpuszczonych zawierają 0,005% molowych lub mniej, korzystnie 0,001% molowych lub mniej tych

PL 205 979 B1 substancji. Ilość zastosowanego roztworu wodnego wynosi 50 do 100000 razy więcej niż objętość próbki krwi objętościowo, korzystnie 100 do 10000 razy, jeszcze korzystniej 500 do 2000 razy.

Surfaktanty powierzchniowe, takie jak sole wyższych kwasów tłuszczowych, alkiloarylosulfoniany, alkilosulfoniany i estry alkilosulfonowe, surfaktanty anionowe, takie jak sole alkilopirydyniowe, sole alkilotrimetyloamoniowe oraz aminy alkilopolioksyetylenowe; surfaktanty niejonowe, takie jak etery polioksyetylenowo-alkilofenylowe, etery polioksyetylenowo-alkilowe i estry polioksyetylenosorbitanu i kwasów tłuszczowych; surfaktanty amfoteryczne, takie jak alkilobetainy, naturalne surfaktanty, takie jak saponina, lecytyna i kwas cholowy. Te surfaktanty można stosować w postaci roztworu wodnego o stężeniu od 0,0001 do 10% wagowych, korzystnie 0,001 do 5% wagowych, zaś szczególnie korzystnie od 0,005 do 1% wagowego. Roztwór wodny może być, na przykład, wodą albo mieszanym środkiem obejmującym wodę i rozpuszczalnik organiczny rozpuszczalny w wodzie. Ilość zastosowanego roztworu wodnego jest 50 do 100000 razy, korzystnie 100 do 10000 razy, zaś jeszcze korzystniej jest 500 do 2000 razy większa niż objętość próbki krwi.

Sposób immunologiczny mierzenia ludzkiej medullazyny przeprowadza się na rozcieńczonej próbce krwi otrzymanej przez traktowanie próbki krwi opisanym roztworem wodnym (i) albo roztworem wodnym (ii), w której granulocyty są całkowicie rozerwane. Sposób obejmuje etap reakcji immunologicznej, w której mierzoną próbkę kontaktuje się z przeciwciałem przeciwko ludzkiej medullazynie w obecnoś ci znakowanego antygenu albo przeciwciał a w celu wychwycenia ludzkiej medullazyny jako znakowanego kompleksu immunologicznego przez reakcję typu antygen-przeciwciało; oraz etap wykrywania, w którym wytworzone kompleksy immunologiczne mierzy się stosując substancję znacznikową obecną w cząsteczce. Do reakcji antygen-przeciwciało na etapie reakcji immunologicznej można zastosować dowolny sposób.

Nieograniczające przykłady możliwych do zastosowania sposobów obejmują:

1) sposób kanapkowy według wynalazku, w którym znakowane przeciwciało reaguje z antygenem w próbce krwi, w taki sposób, że mierzy się go po wychwyceniu przeciwciałem unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku;

2) sposób oparty na dwóch przeciwciałach, w którym przeciwciało pochodzące od zwierzęcia różni się od przeciwciała unieruchomionego na nierozpuszczalnym nośniku stosowanym w sposobie kanapkowym, oraz w którym drugie przeciwciało znakowane w odniesieniu do tego przeciwciała dalej poddaje się reakcji z wytworzeniem kompleksu kanapkowego;

3) sposób kompetycyjny, w którym mierzony antygen próbki krwi poddaje się reakcji z przeciwciałem unieruchomionym na nierozpuszczalnym noś niku w obecności antygenu znakowanego peroksydazą;

4) sposób aglutynacyjno-precypitacyjny, w którym próbkę krwi zawierającą mierzony antygen traktuje się znakowanym przeciwciałem, które reaguje swoiście z nim, dając aglutynację-precypitację, a następnie wykrywa się znakowaną substancję w kompleksach immunologicznych oddzielanych przez wirowanie; i

5) sposób oparty na biotynie-awidynie, w którym znakowaną awidynę poddaje się reakcji z przeciwciałem znakowanym biotyną.

Gdy stosuje się nierozpuszczalny nośnik w sposobach według wynalazku immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny, przykłady takich nierozpuszczalnych nośników obejmują związki polimeryczne, takie jak polistyren, polietylen, polipropylen, poliester, poliakrylonitryl, żywice fluorowe, usieciowany dekstran oraz polisacharydy, jak również szkło, metale, cząstki magnetyczne i ich kombinacje. Nierozpuszczalny nośnik można, na przykład, zastosować w różnych postaciach, takich jak półki kolumny, kulki, włókna, pręty, krążki, naczynia, komórki, mikropłytki i probówki. W celu unieruchomienia antygenów albo przeciwciał na tych nierozpuszczalnych nośnikach można zastosować dowolną metodę. Na przykład, można zastosować metody fizycznej adsorpcji, metody wiązania kowalencyjnego i wiązania jonowego.

W sposobie według wynalazku immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny można zastosować dowolną klasę przeciwciał, ale korzystna jest klasa IgG. Korzystne są przeciwciała monoklonalne. Można je zastosować, na przykład, w postaci kompletnego przeciwciała albo jego fragmentów, takich jak F(ab)2 albo Fab. Przeciwciała można otrzymać z dowolnego źródła, ale korzystne jest zastosowanie przeciwciał mysich, szczurzych, króliczych, bydlęcych, owczych, kurzych itp.

Następnie, korzystne jest zastosowanie enzymów, substancji fluorescencyjnych, substancji luminescencyjnych i radioaktywnych, itp. jako substancji znacznikowych do mierzenia na etapie pomiaru znakowanych kompleksów immunologicznych ludzkiej medullazyny wychwyconej w ten sposób.

PL 205 979 B1

Nieograniczające przykłady obejmują enzymy, takie jak peroksydaza, fosfataza alkaliczna i β-D-galaktozydaza; substancje fluorescencyjne, takie jak izocyjanian fluoresceiny i fikobiliproteiny; substancje luminescencyjne, takie jak luminole, dioksetany i sole akrydynowe; oraz substancje radioaktywne, takie jak ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In i ^99mTc. Gdy jako materiał znacznikowy stosuje się enzym, dla pomiaru jego aktywności stosuje się substrat, oraz jeżeli to konieczne, czynnik barwny, fluorescencyjny albo luminescencyjny. Jeżeli jako enzym stosuje się peroksydazę Jako substrat stosuje się nadtlenek wodoru itp., jako czynnik barwny stosuje się sól amoniową kwasu 2,2'-azynodi[3-etylobenzotiazolinosulfonowego] (ABTS), kwas 5-aminosalicylowy, o-fenyleno-diaminę, 4-aminoantypirynę, 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę itp., jako czynnik fluorescencyjny stosuje się kwas 4-hydroksyfenylooctowy, kwas 3-(4-hydroksyfenylo)propionowy itp., oraz luminole, kompleksy transportu ładunku lucygeniny jako czynniki luminescencyjne (na przykład, publikacja międzynarodowa Nr WO 00/09626). Ponadto, jeżeli jako enzym stosuje się fosfatazę alkaliczną, jako substrat można zastosować 4-nitrofenylofosforan, 4-metyloumbelliferylofosforan, fosforan kortyzolu-21 itp., jeżeli jako enzym stosuje się β-D-galaktozydazę, jako substrat można zastosować 2-nitrofenylo-e-D-galaktozydazę, 4-metyloumbelliferylo-(e-D-galaktozydazę, 3-(2'-spiroadamantano)-4-metoksy-4-(3-e-D-galaktozylofenylo)-1,2-dioksetan (AMPGD).

Korzystnym przeciwciałem monoklonalnym, które można zastosować w sposobie immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny według wynalazku jest materiał izolowany jako składnik przeciwciała z surowicy odpornościowej przeciwko ludzkiej medullazynie, otrzymanej przez immunizowanie zwierzęcia według konwencjonalnych metod z użyciem ludzkiej medullazyny jako antygenu. Na przykład, korzystnie stosuje się kozie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie i królicze przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie. Przeciwciała monoklonalne, które można zastosować w sposobie według wynalazku oraz sposoby ich wytwarzania zostały opisane szczegółowo w japońskim zgłoszeniu patentowym nr 151085/1999.

Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie, które można zastosować w sposobie immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny według wynalazku wytwarza się przez hodowanie hybrydoma w pożywce hodowlanej, uzyskanych przez fuzję komórkową między komórkami szpiczaka i komórkami wytwarzającymi przeciwciała uzyskanymi od zwierzęcia immunizowanego ludzką medullazyną ekstrahowaną z granulocytów wyodrębnionych z krwi osobnika zdrowego i izoluje się przeciwciało monoklonalne z hodowli albo podaje się zwierzęciu hybrydoma dootrzewnowo, namnaża hybrydoma w wysięku otrzewnowym i pozyskuje przeciwciała monoklonalne z wysięku.

Hybrydoma wytwarzające przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie można wytwarzać metodą fuzji komórkowej. Oznacza to, że hybrydoma wytwarzające żądane przeciwciało monoklonalne można uzyskać przez pozyskanie komórek wytwarzających przeciwciała od zwierzęcia immunizowanego ludzką medullazyną, poddanie fuzji komórek wytwarzających przeciwciała z komórkami szpiczaka, selektywne namnażanie uzyskanych hybrydoma, badanie przesiewowe hybrydoma wytwarzających przeciwciała i klonowanie wyselekcjonowanych hybrydoma.

Przykłady komórek wytwarzających przeciwciała obejmują komórki śledziony, komórki węzłów chłonnych oraz limfocyty B itp., które otrzymuje się od zwierzęcia immunizowanego ludzką medullazyną albo komórkami albo kompozycją zawierającą ludzką medullazynę. Przykłady immunizowanych zwierząt obejmują myszy, szczury, króliki, kozy, owce i konie. Immunizację można przeprowadzić przez, na przykład, podanie zwierzęciu podskórnie, domięśniowo albo dootrzewnowo ludzkiej medullazyny, w dawce około 1 μg do 1 mg 1 albo 2-krotnie w miesiącu przez okres od 1 do 6 miesięcy. Zbieranie komórek wytwarzających przeciwciała przeprowadza się 2 do 4 dni po ostatniej immunizacji.

Komórki szpiczaka mogą pochodzić od myszy, szczura, itp. Korzystne jest, aby komórki wytwarzające przeciwciała i komórki szpiczaka pochodziły od tego samego rodzaju zwierzęcia.

Można zastosować dowolny sposób fuzji komórkowej; co do tego nie istnieją żadne ograniczenia. Na przykład, można to przeprowadzić przez zmieszanie komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka w pożywce, takiej jak np. pożywka Eaglea w modyfikacji Dulbecco (DMEM) w obecności przyspieszacza fuzji, takiego jak glikol polietylenowy.

Po przeprowadzeniu fuzji komórkowej, hybrydoma można selekcjonować przez odpowiednie rozcieńczanie komórek DMEM itp., odwirowanie, zawieszanie osadu w pożywce selektywnej, takiej jak pożywka HAT i hodowanie ich. Hybrydoma wytwarzające przeciwciała bada się przesiewowo w enzymatycznym teście immunologicznym z użyciem supernatantu hodowlanego, zaś wyselekcjonowane hybrydoma klonuje się metodą rozcieńczeń granicznych w celu uzyskania hybrydoma wytwarzającej przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie.

PL 205 979 B1

Przeciwciało monoklonalne można wytworzyć przez hodowanie tak otrzymanej hybrydoma wytwarzającej przeciwciało, w odpowiedniej pożywce hodowlanej albo w organizmie zwierzęcia, i pozyskiwanie przeciwciała monoklonalnego z hodowli. W celu wytworzenia dużych ilości przeciwciała monoklonalnego, korzystny jest sposób, w którym hybrydoma podaje się dootrzewnowo zwierzęciu tego samego gatunku co dawca komórek szpiczaka, przeciwciało monoklonalne gromadzi się w wysięku, po czym przeciwciało izoluje się z wysięku otrzewnowego.

Wydzielenie przeciwciała monoklonalnego z hodowli albo wysięków można przeprowadzić chromatograficznie na kolumnie z wymiennikiem anionowym albo białkiem A, G itp., albo przez frakcjonowanie siarczanem amonu, co normalnie stosuje się przy oczyszczaniu IgG.

Otrzymane w ten sposób przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie występują w czterech rodzajach, oznaczonych 3F03, 3G03, 2E04 i 1G12, zgodnie z rodzajem hybrydoma zastosowanej do ich wytwarzania. Klasa immunoglobuliny każdego z przeciwciał monoklonalnych jest IgG, podklasy IgGl, zaś każde z tych przeciwciał reaguje z ludzką medullazyną która stanowi ich zgodny antygen. Tak więc, opisane wyżej przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie są przydatne w sposobach według wynalazku immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny.

Następnie, sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego według wynalazku pozwala zdiagnozować początek i/lub nasilenie się stanu stwardnienia rozsianego na podstawie wielkości albo zmian w wartości zmierzonej zawartości ludzkiej medullazyny w próbce krwi uzyskanej wyżej opisanym sposobem immunologicznego pomiaru ludzkiej medullazyny. Konkretnie, można zastosować sposób, w którym ilość ludzkiej medullazyny w 108 granulocytów oblicza się ze zmierzonego stężenia ludzkiej medullazyny w próbce krwi i zmierzonej liczby granulocytów w tej samej próbce krwi, zaś początek stwardnienia rozsianego ocenia się przez porównanie tej wartości z wartością odcinającą (średnia wartość dla zdrowego osobnika ± 2SD (odchylenia standardowe)), albo zmiany nasilenia się choroby w czasie ocenia się przez porównanie zmian wartości zmierzonej w czasie.

Spośród 112 pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane, których zdiagnozowano tym sposobem, 85 było pozytywnych pod względem wartości medullazyny nie niższej niż wartość odcinająca, dając duży odsetek dodatni rzędu 75,8%. W przeciwieństwie, spośród 80 pacjentów cierpiących na różne niezapalne choroby dotyczące układu nerwowego liczba pozytywnych pod względem wartości medullazyny nie mniejsza niż wartość odcinająca wynosiła 13 pacjentów, dając niski dodatni procent rzędu 16,3%. Tak więc zaobserwowano, że sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego na podstawie wartości ludzkiej medullazyny we krwi jest sposobem diagnostycznym o niezwykle wysokiej pewności. Dalej, odsetek osobników normalnych (innymi słowy, ludzi zdrowych) dających pozytywną wartość medullazyny wynosił 0% (Patrz, Tabla 5 i Fig. 3). Stwierdzono również, że poziom wartości medullazyny dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym nie różni się między kobietami i mężczyznami (patrz, Fig. 4) i nie różni się w zależności od wieku (patrz, Fig. 5).

Przykłady

Poniżej, wynalazek zostanie opisany szczegółowo w odniesieniu do Przykładów oraz Przykładów Odniesienia. Wynalazek nie jest w żaden sposób ograniczany przez Przykłady. Procenty pokazane w przykładach są procentami wagowymi.

Przykład odniesienia 1

Wytwarzanie oczyszczonej ludzkiej medullazyny

400 ml krwi od normalnych osobników i 6% roztwór dekstranu (ciężar cząsteczkowy 200000 -300000) w soli fizjologicznej zmieszano w stosunku krew roztwór wodny dekstranu 2:1, zaś powstałą mieszaninę delikatnie mieszano szklaną pałeczką, po czym pozostawiono w 4-8°C przez około 1 godzinę. Strącone czerwone krwinki usunięto, zaś uzyskany supernatant odwirowano przy 15000 obrotów na minutę, po czym pobrano osad w celu uzyskania leukocytów. Do otrzymanych leukocytów, dodano bufor ekstrakcyjny zawierający 1 mM sól disodową kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mM kwas p-chlorortęciobenzoesowy (PCMB) w buforze 1 M fosforanu potasu (PKB) pH 7,0 i powstałą mieszaninę inkubowano mieszając w 37°C przez 20 minut. Powstałą mieszaninę poddano działaniu ultradźwięków przez 15 sekund w celu całkowitego rozerwania komórek i inkubowano w 37°C przez 20 minut, a następnie odwirowano w 4°C przy 12000 obrotów na minutę przez 10 minut. Supernatant pobrano i dializowano wobec wody destylowanej. Pozostały osad poddano powyższym czynnościom kilkakrotnie w celu przeprowadzenia ekstrakcji. Otrzymany płyn ekstrakcyjny nałożono na kolumnę z żelem CM-Sepharose, zrównoważoną 50 mM PKB (pH 6,0) i płukano kolumnę tym samym buforem. Adsorbowane substancje eluowano 1 M PKB (pH 6,0), a eluowany roztwór dializowano

PL 205 979 B1 wobec wody destylowanej przez noc w celu usunięcia soli, a następnie pozostałość zatężono stosując błonę kolodionową w celu otrzymania 1,5 mg oczyszczonej ludzkiej medullazyny.

Przykład odniesienia 2

Wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie

1) Wytwarzanie hybrydoma przez fuzję komórkową między komórkami wytwarzającymi przeciwciało i komórkami szpiczaka

Ludzką medullazynę ekstrahowaną i oczyszczaną z ludzkich granulocytów w Przykładzie Odniesienia 1 emulgowano w kompletnym adiuwancie Freunda i powstałą emulsję wstrzykiwano podskórnie 7-tygodniowym myszom Balb/c w dawce 50 μg/mysz. Po 4 tygodniach, myszy poddano dodatkowej immunizacji tym samym sposobem co w pierwszej immunizacji. Siedem dni po dodatkowej immunizacji potwierdzono wzrost poziomu przeciwciał we krwi. Po dalszych 7 dniach, podano antygen dootrzewnowo w dawce 50 μg/mysz jako immunizację końcową. Z drugiej strony, pasażowano komórki mysiego szpiczaka P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) w pożywce Eaglea w modyfikacji Dulbecco (DMEM) z dodatkiem 20% cielęcej surowicy płodowej. Trzy dni po końcowej immunizacji, splenocyty pobrano od myszy i poddano fuzji z komórkami P3U1 stosując glikol polietylenowy 4000, zaś powstałe fuzje umieszczono w mikropłytce 96-studzienkowej. Po przeprowadzeniu fuzji komórkowej, pożywkę zmieniono na DMEM z dodatkiem 100 μM hipoksantyny, 0,4 μM aminopteryny i 16 μM tymidyny (pożywka HAT) i przez kolejne 2-3 tygodnie otrzymano przez hodowlę selektywną hybrydoma między komórkami szpiczaka i splenocytami.

2) Badanie przesiewowe hybrydoma wytwarzających przeciwciało przeciwko ludzkiej medullazynie

Miana przeciwciał w płynach hodowlanych hybrydoma określano testem ELISA (test immunoenzymatyczny) w celu badania przesiewowego. Mianowicie, ludzką medullazynę adsorbowano na studzienkach mikropłytki do ELISA, po czym studzienki blokowano 2% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 mM buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4). Pięćdziesiąt ul płynu hodowlanego hybrydoma dodawano do każdej studzienki i pozostawiano na 1 godzinę. Po usunięciu hodowli hybrydoma, studzienki przepłukano. Do każdej studzienki dodawano po 100 μl roztworu 2 μg/ml roztworu znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała przeciwko mysim IgG-Fc w PBS, powstałą mieszaninę pozostawiano w 37°C przez godzinę. Po usunięciu roztworu znakowanego enzymem przeciwciała i przepłukaniu studzienek, dodawano po 200 μl roztworu 0,1 M buforu fosforanowo-cytrynianowego (pH 4,6) zawierającego 0,05% ABTS i 0,0034% nadtlenek wodoru, w celu uzyskania reakcji barwnej tym samym selekcjonując hybrydoma wytwarzające przeciwciała przeciwko ludzkiej medullazynie.

3) Klonowanie komórek wytwarzających przeciwciało i izolowanie przeciwciał monoklonalnych

Każdą z hodowli hybrydoma wytwarzających przeciwciało przeciwko ludzkiej medullazynie poddano klonowaniu metodą rozcieńczeń granicznych otrzymując w końcu 4 rodzaje hybrydoma. Hybrydoma podawano osobno dootrzewnowo myszom Balb/c, które uprzednio dostały dootrzewnowo pristane, po czym hodowano hybrydoma w wysięku otrzewnowym, uzyskując wysięk zawierający przeciwciało monoklonalne. Następnie, do otrzymanego wysięku dodano 50% nasycony siarczan amonu w celu wytrącenia przeciwciał. Precypitat oddzielono, rozpuszczono w PBS. Powstały roztwór dializowano wobec 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,8) zawierającego 3 M NaCl. Następnie, wprowadzono go na kolumnę Białko-A/Sepharose CL4B (dostępnej handlowo z Pharmacia). Adsorbowane przeciwciało eluowano roztworem buforowym 0,1 M glicyny-HCl (pH 5,0), a eluowany roztwór zobojętniano, po czym oczyszczano z niego przeciwciało uzyskując 4 rodzaje przeciwciała monoklonalnego: 3F03, 3G03, 2E04 i 1G12.

4) Właściwości przeciwciał monoklonalnych

Western blotting

Antygen odpowiadający przeciwciałom monoklonalnym unieruchomiono metodą Western blotting.

Po pierwsze, medullazynę z ludzkich granulocytów poddano elektroforezie SDS w żelu poliakrylamidowym. Białko przeniesiono z płyty żelowej na arkusz nitrocelulozy na 2 godziny przy nachyleniu napięcia 7V/cm, stosując roztwór zawierający 25 mM.

Tris(hydroksymetylo)aminometan, 192 mM glicyny i 20% metanolu dodano do buforowego roztworu elektrolitów. Następnie, każdą ścieżkę arkusza nitrocelulozy pocięto i jeden z arkuszy poddano znakowaniu na białko przy użyciu Amideblack, zaś inny arkusz poddano testowi immunoenzymatycznemu w następujący sposób. Mianowicie, po zablokowaniu arkusza 2% BSA/PBS, dodano mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie jako przeciwciało pierwotne, a następnie znakowane peroksydazą specyficzne przeciwciało kozie przeciwko mysim IgG-Fc jako przeciwciało

PL 205 979 B1 wtórne i pozostawiono do przereagowania. Po opłukaniu arkusza, dodano roztwór substratu zawierający 0,04% 3,3'-diaminobenzydyny i 0,0034% nadtlenek wodoru w PBS w celu wytworzenia barwy. Dzięki niej potwierdzono, że wszystkie cztery mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie rozpoznawały medullazynę pochodzącą z ludzkich granulocytów.

Test zahamowania

Ludzką medullazynę unieruchomioną w studzienkach mikropłytki do ELISA poddano reakcji z pierwszym biotynowanym przeciwciałem w obecności nieznakowanego drugiego przeciwciała, po czym poddano reakcji awidyny sprzęgniętej z peroksydazą, a następnie dodano substrat w celu wywołania reakcji barwnej w ten sposób przeprowadzając test zahamowania. W żadnej z kombinacji przeciwciał monoklonalnych ilość reagującego przeciwciała biotynylowanego nie zmieniała się. Zatem potwierdzono, że każde z 4 przeciwciał monoklonalnych rozpoznaje epitopy (miejsce antygenowe), które różnią się od siebie.

P r z y k ł a d 1

Tworzenie krzywej kalibracyjnej do pomiaru ludzkiej medullazyny

1) Wytwarzanie perełek z unieruchomionym na nich przeciwciałem monoklonalnym

Po przepłukaniu perełek polistyrenowych (6 mm średnicy), perełki zanurzono na jeden dzień i noc w 4°C w PBS (pH 7,4) zawierającym 10 μg/ml mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04). Następnie, przepłukano je PBS i poddano blokowaniu przez pozostawienie ich w 1% wodnym roztworze BSA w temperaturze 4°C przez dzień i noc, otrzymując perełki z unieruchomionym na nich przeciwciałem monoklonalnym.

2) Wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego znakowanego peroksydazą

Do 1,0 mg/ml roztworu mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) w PBS, dodano 0,1 ml 10 mg/ml roztworu estru N-sukcynimidowego kwasu N-(m-maleimidobenzoesowego) (MBS) w dimetyloformamidzie i pozostawiono mieszaninę do przereagowania w temperaturze 25°C przez 30 minut. Następnie, mieszaninę tę poddano chromatografii na kolumnie Sephadex G-25 i przeprowadzono chromatografię żelowo-permeacyjną stosując 0,1 M bufor fosforanowy (pH 6,0) w celu oddzielenia przeciwciała monoklonalnego ze związanym maleimidem od nieprzereagowanego MBS.

W międzyczasie, roztwór etanolowy o stężeniu 10 mg/ml 3-(2-pirydylotio)propionianu N-sukcynimidylu (SPDP) dodano do roztworu PBS zawierającego 1,0 mg/ml peroksydazy chrzanowej i poddano reakcji w 25°C przez 30 minut. Następnie, roztwór mieszaniny reakcyjnej nałożono na kolumnę Sephadex G-25 i poddano chromatografii żelowo-permeacyjnej 10 mM buforem octanowym (pH 4,5). Zebrano frakcje zawierające HRP związaną z pirydylodisulfidem i zatężono około 10-krotnie na lodzie stosując woreczek koloidionowy. Następnie dodano 1 ml 0,1 M buforu octanowego w fizjologicznym roztworze soli (pH 4,5), zawierającego 0,1 M ditiotreitol, a następnie mieszano przez 30 minut w temperaturze 25°C w celu zredukowania grup pirydylodisulfidowych wprowadzonych do cząsteczki HRP. Tę mieszaninę reakcyjną poddano chromatografii żelowo-permeacyjnej na kolumnie Sephadex G-25 i uzyskano frakcje zawierające tiolowaną HRP.

Następnie, przeciwciało monoklonalne związane z maleimidem i tiolowaną HRP zmieszano i mieszaninę zatężano do stężenia białka równego 4 mg/ml w worku koloidionowym, chłodząc lodem. Powstały roztwór pozostawiono w 4°C na dzień, po czym poddano go chromatografii żelowopermeacyjnej na kolumnie Ultrogel AcA44 (SEPRACOR) uzyskując przeciwciało monoklonalne znakowane peroksydazą.

3) Immunoenzymatyczny test kanapkowy na ludzką medullazynę

Pojedynczą perełkę, na której unieruchomiono przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03), 50 ul roztworu oczyszczonej ludzkiej medullazyny (standardowy materiał referencyjny) w PBS zawierającym 2% BSA, w stężeniu 0, 1, 10, 100 albo 200 ng/ml oraz 350 μl PRS z 2% BSA zmieszano i inkubowano w 37°C przez 30 minut.

Następnie, po usunięciu roztworu z probówki przez aspirację, perełkę płukano fizjologicznym roztworem soli i wypełniono probówkę 400 μl roztworu PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) znakowane-HRP w stężeniu 0,2 μg/ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Roztwór z probówki usunięto przez aspirację, a następnie płukano roztworem fizjologicznym soli. Do każdej z probówek dodano 400 μl buforu 0,1 M kwasu fosforowego (pH 4,6) zawierającego 0,0034% nadtlenku wodoru i 0,05% ABTS, i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Do probówek dodano po 1 ml 0,1 N roztworu wodnego

PL 205 979 B1 kwasu szczawiowego, przerywając w ten sposób reakcje enzymatyczną. Następnie mierzono absorbancję przy długości fali 420 nm stosując spektrofotometr. Wykreślając zmierzoną absorbancję wobec stężenia standardowego materiału referencyjnego, uzyskano krzywą kalibracyjną pokazaną na Fig. 1.

P r z y k ł a d 2

Pomiar medullazyny w próbkach klinicznych testem immunoenzymatycznym

Próbki zamrożonej krwi, pobranej od normalnych osobników (osób zdrowych) oraz od pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane rozmrożono w temperaturze pokojowej i 10 μl każdej z próbek dodano do 2 ml wody destylowanej (ciśnienie osmotyczne = 0 mmol/LH-O) i mieszano stosując wytrząsarkę Voltex do otrzymania roztworów próbek. Następnie, do probówek testowych dodano po 10 pl mieszaniny i rozcieńczono przez dodanie 390 μl PBS (pH 7,4) zawierającego 2% BSA. Następnie, do każdej z probówek dodano perełkę z unieruchomionym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po usunięciu roztworu z probówek przez aspirację, przepłukano je solą fizjologiczną. Następnie, do probówek dodano po 400 μl roztworu PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego mysie znakowaneHRP przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) w stężeniu 0,2 μg/ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie przepłukano, reakcję enzymatyczną i przerwanie reakcji przeprowadzono w sposób opisany wyżej dla krzywej wzorcowej. Następnie zmierzono absorbancję przy długości fali 420 nm stosując spektrofotometr i określono stężenie ludzkiej medullazyny na podstawie krzywej kalibracyjnej. Pomiar od momentu rozcieńczenia próbki przeprowadzono 5-krotnie dla każdej z próbek w celu zbadania powtarzalności pomiaru. W wyniku stwierdzono, że stężenia ludzkiej medullazyny zmierzone w próbkach krwi wykazują niezwykle dużą powtarzalność, jak widać z Tabeli 1.

T a b e l a 1 - Zmierzone wartości ludzkiej medullazyny we krwi

Liczba Pomiarów	Zmierzona wartość (pg/ml)
Osobnik zdrowy	Pacjent
1	8,2	37,2
2	8,0	35,9
3	8,2	35,5
4	7,9	36,4
5	8,2	35,8
Średnia	8,1	36,2
Współczynnik zmienności (%)	1,7	1,8

Przykład porównawczy 1

Pomiar medullazyny w próbkach klinicznych testem immunoenzymatycznym

Próbki krwi, które pobrano od osobników zdrowych oraz pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane i zamrożono w celu przechowywania, rozmrożono w temperaturze pokojowej. 10 μl każdej z próbek dodano do 2 ml roztworu PBS (pH 7,4) (ciśnienie osmotyczne = 290 mmol/LH₂O) i mieszano równomiernie uzyskując roztwory próbek. Do probówek testowych dodano po 10 μl mieszaniny i rozcieńczono przez dodanie 390 μl PBS (pH 7,4) zawierającego 2% BSA. Następnie, do każdej z probówek dodano perełki z unieruchomionym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po usunięciu roztworu z probówek przez aspirację, przepłukano je solą fizjologiczną. Następnie, probówki napełniono 400 μl PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego znakowane-HRP mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) w stężeniu 0,2 μg/ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie przepłukano, reakcję enzymatyczną i przerwanie reakcji przeprowadzono w sposób opisany wyżej dla krzywej wzorcowej. Stopień absorbancji przy długości fali 420 nm zmierzono stosując spektrofotometr i określono stężenie ludzkiej medullazyny na podstawie krzywej kalibracyjnej. Pomiar od momentu rozcieńczenia próbki przeprowadzono 5-krotnie dla każdej z próbek w celu zbadania powtarzalności pomiaru. W wyniku stwierdzono, że stężenia ludzkiej medullazyny zmierzone w próbkach krwi wykazują niezwykle dużą powtarzalność, jak widać z Tabeli 2.

PL 205 979 B1

T a b e l a 2 - Zmierzone wartości ludzkiej medullazyny we krwi

Liczba Pomiarów	Zmierzona wartość (pg/ml)
Osobnik zdrowy	Pacjent
1	7,8	28,8
2	6,6	25,2
3	7,1	27,0
4	5,9	21,6
5	6,9	26,3
Średnia	6,9	25,8
Współczynnik zmienności (%)	10,1	10,4

P r z y k ł a d 3

Pomiar medullazyny w próbkach klinicznych testem immunoenzymatycznym

Próbki zamrożonej krwi, pobranej od normalnych osobników (osób zdrowych) oraz od pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane rozmrożono w temperaturze pokojowej. 10 μl każdej z próbek dodano do 2 ml wody destylowanej zawierającej 0,01% bromku dodecylotrimetyloamoniowego i mieszano stosując wytrząsarkę Voltex do otrzymania roztworów próbek. 10 μl mieszaniny dodano do probówek testowych i rozcieńczono przez dodanie 40 μl roztworu PBS (pH 7,4) zawierającego 2% BSA. Następnie, do każdej z probówek dodano perełkę z unieruchomionym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03) i do każdej probówki dodano po 350 μl roztworu PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego znakowane HRP przeciwciało mysie przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) w stężeniu 0,2 μg/ml i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie przepłukano, reakcję enzymatyczną i zatrzymanie reakcji przeprowadzono dokładnie tak samo jak przy przygotowaniu krzywej kalibracyjnej opisanym wcześniej. Absorbancję przy długości fali 420 nm zmierzono stosując spektrofotometr i określono stężenie ludzkiej medullazyny na podstawie krzywej kalibracyjnej. Pomiar od momentu rozcieńczenia próbki przeprowadzono 5-krotnie dla każdej z próbek w celu zbadania powtarzalności pomiaru. W wyniku stwierdzono, że stężenia ludzkiej medullazyny zmierzone w próbkach krwi wykazują niezwykle dużą powtarzalność, jak widać z Tabeli 3.

T a b e l a 3 - Zmierzone wartości ludzkiej medullazyny we krwi

Liczba Pomiarów	Zmierzona wartość (pg/ml)
Osobnik zdrowy	Pacjent
1	8,3	39,6
2	8,1	38,8
3	8,3	39,2
4	8,4	40,1
5	7,9	39,5
Średnia	8,2	39,4
Współczynnik zmienności (%)	2,4	1,2

Przykład porównawczy 2

Pomiar medullazyny w próbkach klinicznych testem immunoenzymatycznym

Próbki krwi, które pobrano od osobników zdrowych oraz pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane i zamrożono w celu przechowywania, rozmrożono w temperaturze pokojowej. Do 2 ml roztworu PBS (pH 7,4) dodano 10 μl każdej z próbek i mieszano równomiernie do otrzymania roztworu próbki. Do probówek testowych dodano po 10 μl mieszaniny i rozcieńczono przez dodanie 40 μl PBS (pH 7,4) zawierającego 2% BSA. Następnie, do każdej z probówek dodano perełkę z unieruchomionym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03) i 350 μl roztworu PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego mysie znakowane HRP przeciwciało monoklonalne (2E04) w stężeniu 0,2 μg/ml i inkubowano w temperaturze pokojowej 37°C przez 30 minut. Następnie

PL 205 979 B1 przepłukano, reakcję enzymatyczną i przerwanie reakcji przeprowadzono w dokładnie taki sam sposób jak opisany wyżej dla krzywej wzorcowej. Absorbancję przy długości fali 420 nm zmierzono stosując spektrofotometr i określono stężenie ludzkiej medullazyny na podstawie krzywej kalibracyjnej. Pomiar od momentu rozcieńczenia próbki przeprowadzono 5-krotnie dla każdej z próbek w celu zbadania powtarzalności pomiaru. W wyniku stwierdzono, że stężenia ludzkiej medullazyny zmierzone w próbkach krwi wykazują niezwykle dużą powtarzalność, jak widać z Tabeli 4.

T a b e l a 4 - Zmierzone wartości ludzkiej medullazyny we krwi

Liczba Pomiarów	Zmierzona wartość (pg/ml)
Osobnik zdrowy	Pacjent
1	7,4	25,8
2	6,8	30,4
3	6,2	32,7
4	7,6	23,9
5	5,9	29,1
Średnia	6,8	28,4
Współczynnik zmienności	10,9	12,5

P r z y k ł a d 4

Obliczanie wartości ludzkiej medullazyny w próbce krwi i diagnoza choroby

Próbki krwi, które pobrano, odpowiednio, od osobnika zdrowego, pacjenta cierpiącego na stwardnienie rozsiane i pacjenta cierpiącego na niezapalną chorobę układu nerwowego i zamrożono w celu przechowywania, rozmroż ono w temperaturze pokojowej. Do 2 ml wody destylowanej (ciś nienie osmotyczne = 0 mmol/LH₂O) dodano 10 μΐ każdej z próbek i mieszano odpowiednio stosując mieszalnik Voltex uzyskując roztwór próbki. Do probówek testowych dodano po 10 μl mieszaniny i odpowiednio mieszano stosując wytrząsarkę Voltex w celu otrzymania roztworów próbek. Do probówek testowych dodano 10 μl roztworu próbki i rozcieńczono przez dodanie 390 μl roztworu PBS (pH 7,4) zawierającego 2% BSA. Następnie, do każdej z probówek dodano perełkę z unieruchomionym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej medullazynie (3F03) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po usunięciu roztworu z probówek przez aspirację, przepłukano je solą fizjologiczną. Następnie, do probówek dodano po 400 μl roztworu PBS zawierającego 2% BSA i zawierającego znakowane HRP mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej medullazynie (2E04) w stężeniu 0,2 μg/ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 30minut. Następnie przepłukano, reakcję enzymatyczną i przerwanie reakcji przeprowadzono w sposób opisany wyżej dla krzywej wzorcowej. Absorbancję przy długości fali 420 nm zmierzono stosując spektrofotometr i określono stężenie ludzkiej medullazyny na podstawie krzywej kalibracyjnej.

Wartości ludzkiej medullazyny (pg/108 granulocytów) pokazujące ilość medullazyny w 10⁸ granulocytów obliczono na podstawie stężenia ludzkiej medullazyny i liczby granulocytów zmierzonej w każdej z próbek krwi, i pokazano na Fig. 3.

Na Fig. 3 pokazano porównanie odpowiednich wartości medullazyny dla zdrowych osobników, pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i pacjentów cierpiących na niezapalną chorobę układu nerwowego. Poniższe wyniki uzyskano z figury.

• pacjenci ze stwardnieniem rozsianym 355+117 (n=112) • pacjenci z niezapalną chorobą układu nerwowego 233±66 (n=80) • osobnicy zdrowi 213±34 (n=25)

Wyniki te porównano z wartością odcinającą (281 μg/10⁸ granulocytów) i zaklasyfikowano jako pozytywne albo negatywne. Liczby każdej z klasyfikacji i odsetek pozytywnych pokazano w Tabeli 5.

PL 205 979 B1

T a b e l a 5 - Wartości ludzkiej medullazyny w klinicznych próbkach krwi

Próbka	Liczba pozytywnych	Liczba negatywnych	Odsetek pozytywnych
pacjenci ze stwardnieniem rozsianym	85	27	75,8
pacjenci z nie zapalną chorobą nerwową	13	67	16,3
osobnicy zdrowi	0	25	0

Na podstawie powyższych wyników zaobserwowano, że diagnoza stwardnienia rozsianego oparta na wartości medullazyny we krwi jest metodą diagnostyczną o wysokiej pewności. Ponadto, poniższe wyniki uzyskano po sklasyfikowaniu poziomów wartości medullazyny dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym pod względem płci (patrz, Fig. 4) i pod względem wieku (patrz, Fig. 5).

Płeć • pacjenci ze stwardnieniem rozsianym kobiety 351±107 (n=78) mężczyźni 367+143 (n=34) • osobnicy zdrowi 214+34 (n=24) • wartość odcinająca 281 ^g/10⁸ granulocytów)

Wiek pacjenci ze stwardnieniem rozsianym

10-19

20-29

30-39

40-49 i więcej osobnicy zdrowi wartość odcinająca

421+154 (n=9)

329+94 (n=26)

357+104 (n=30)

330+157 (n=17)

375+125 (n=21)

213+34 (n=25)

281 ^g/108 granulocytów)

Wyniki te pokazują że nie istnieje różnica pomiędzy płciami i nie obserwuje się różnic w zależno ś ci od wieku.

Przy pomocy wynalazku jak opisany wyżej, można immunologicznie zmierzyć zawartość ludzkiej medullazyny w próbce krwi w sposób dokładny i z dobrą powtarzalnością. Ponadto, przy pomocy pomiaru zawartości ludzkiej medullazyny we krwi można postawić diagnozę początku albo nasilenia, albo stanu przewlekłej choroby zapalnej, szczególnie stwardnienia rozsianego.

Claims

1. Sposób immunologicznego pomiaru zawartości ludzkiej medullazyny we krwi, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy (a) i (b):

(a) rozrywanie leukocytów w próbce krwi przez doprowadzenie jej do kontaktu z następującymi wodnymi roztworami (i) lub (ii) lub mieszaniną wodnych roztworów (i) i (ii), przy czym roztwór (i) jest roztworem wodnym, który zawiera 0,05% molowych lub więcej lub 0,005% molowych lub mniej substancji rozpuszczonej, o ciśnieniu osmotycznym 250 mmol/LH₂O lub mniejszym lub roztworem wodnym o ciśnieniu osmotycznym 310 mmol/LH₂O lub większym;

roztwór (ii) jest roztworem wodnym zawierającym surfaktant; i

b) immunologiczne określenie ilości ludzkiej medullazyny w próbce krwi metodą obejmującą doprowadzenie do kontaktu próbki krwi zawierającej ludzką medullazynę uwolnioną z leukocytów, które uległy rozerwaniu w etapie (a), z przeciwciałem przeciwko medullazynie unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku w obecności znakowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej medullazynie z wytworzeniem kompleksu kanapkowego i wychwycenie ludzkiej medullazyny w znakowanym kompleksie immunologicznym przez reakcję antygen-przeciwciało, a następnie określenie ilościowo aktywności znakowanego materiału w tym kompleksie.

PL 205 979 B1

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny (i) jest roztworem buforu i/lub wodą destylowaną, która może zawierać organiczny rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór (i) stanowi roztwór wodny zawierający rozpuszczalne w wodzie substancje wybrane z grupy obejmującej sole kwasów nieorganicznych, sole kwasów organicznych, cukry, alkohole cukrowe, aminokwasy i substancje białkowe.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, roztwór wodny (i) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny (ii) stanowi roztwór wodny surfaktanta.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że roztwór wodny (ii) stanowi roztwór surfaktantów przynajmniej jednego typu wybranych z grupy obejmującej sole wyższych kwasów tłuszczowych, alkiloarylosulfoniany, alkilosulfoniany, sole estrów alkilosiarczanowych, sole alkilopirydyniowe, sole alkilotrimetyloamoniowe, etery polioksyetylenowo-alkilofenylowe, etery polioksyetylenowo-alkilowe, estry polioksyetylenosorbitanu i kwasów tłuszczowych oraz alkilobetainy.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny (ii) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) stosuje się mieszaninę wodnego roztworu (i) oraz (ii).

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) stosuje się roztwór wodny (i).

10. Sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy (a) i (b):

a) etap rozrywania leukocytów w próbce krwi przez doprowadzenie do kontaktu próbki krwi z następującymi wodnymi roztworami (i) lub (ii) lub mieszaniną (i) i (ii), przy czym roztwór (i) jest roztworem wodnym, który zawiera 0,05% molowych lub więcej lub 0,005% molowych lub mniej substancji rozpuszczonej o ciśnieniu osmotycznym 250 mmol/l-H₂O lub mniejszym lub wodnym roztworem o ciśnieniu osmotycznym 310 mmol/LH₂O lub większym;

roztwór (ii) jest roztworem wodnym zawierającym surfaktant; i

11. Sposób diagnozowania według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny (i) jest roztworem buforu i/lub wodą destylowaną, która może zawierać organiczny rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie.

12. Sposób diagnozowania według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny (i) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

13. Sposób diagnozowania według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny (ii) stanowi roztwór wodny surfaktanta.

14. Sposób diagnozowania według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny (ii) stosuje się w ilości objętościowo od 50 do 100000 razy większej niż próbka krwi.

15. Sposób diagnozowania według zastrz. 10, znamienny tym, że etap (b) obejmuje kanapkowanie ludzkiej medullazyny w próbce krwi między przeciwciałem przeciwko medullazynie unieruchomionym na nierozpuszczalnym nośniku i znakowanym przeciwciałem przeciwko ludzkiej medullazynie w celu wytworzenia kompleksu w reakcji antygen-przeciwciało i określenie ilości znacznika w tym kompleksie.