JP2002014104A - Method of detecting gvhd - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a determining indicator which is exact and usuful for detection at an early stage of GVHD, provide a detection method for the GVHD, and a monitoring method for development or prevention effect of the GVHD in pharmacotherapy, based on the indicator, and provide a kit for executing the methods effectively. SOLUTION: A quantity of UTI in a sample collected from a human body is measured in this GVHD detecting method.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ＧＶＨＤ（移植片
対宿主疾患）の検出方法、並びに当該検出に用いられる
測定キットに関する。詳細には、ＧＶＨＤの患者から採
取される試料中のＵＴＩ（尿中トリプシンインヒビタ
ー）を測定することを特徴とするＧＶＨＤの検出方法、
並びに当該検出のためのキットに関する。[0001] The present invention relates to a method for detecting GVHD (graft versus host disease) and a measurement kit used for the detection. Specifically, a method for detecting GVHD, comprising measuring UTI (urinary trypsin inhibitor) in a sample collected from a patient with GVHD,
And a kit for the detection.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＵＴＩは、ヒト由来の分子量約６７００
０の酸性糖蛋白質であり、トリプシン、α−キモトリプ
シン、ヒアルロニダーゼ、顆粒球エラスターゼ、プラス
ミン等の多種の酵素に対する阻害作用やライソゾーム膜
安定化作用を有しこれらの作用に基づき、臨床的には急
性循環不全症ならびに急性膵炎の治療薬として用いられ
ている。2. Description of the Related Art UTI has a molecular weight of about 6700 derived from humans.
0 is an acidic glycoprotein that inhibits various enzymes such as trypsin, α-chymotrypsin, hyaluronidase, granulocyte elastase, and plasmin, and has a lysosomal membrane stabilizing effect. It is used as a remedy for insufficiency and acute pancreatitis.

【０００３】ＵＴＩの生物化学的性状は古くから知られ
ており、ファールバングらの総説においてＵＴＩ活性が
上昇する疾患として感染症、腎疾患以外に、心筋梗塞、
外科手術、白血病、悪性腫瘍が記載され、また正常妊娠
後期等においても、尿中***量が増加することが知られ
ている（Faarvang，H. J. ら Scand. J. Clin. Lab.Inv
est. 17(supp. 83)、１〜７８頁、１９６５年；桑島
ら、炎症、９巻、３号、１７５〜１８２頁、１９８９
年）。しかしながら、これまでＧＶＨＤと生体中のＵＴ
Ｉの濃度との関わりについては報告がなく、その病態と
尿中***量との関係についても知られてはいなかった。[0003] The biochemical properties of UTI have been known for a long time, and in the review by Farbang et al.
Surgery, leukemia, and malignant tumors are described, and it is known that urinary excretion increases even in the second half of normal pregnancy (Faarvang, HJ et al. Scand. J. Clin. Lab. Inv.
est. 17 (supp. 83), pp. 1-78, 1965; Kuwashima et al., Inflammation, 9, 3, 175-182, 1989.
Year). However, GVHD and UT in living body
There was no report on the relationship with the concentration of I, and no known relationship between the disease state and urinary excretion.

【０００４】ＧＶＨＤは、免疫担当細胞であるリンパ球
が、移植片を拒絶し得ないような宿主に移植され生着
し、宿主の組織抗原に対して移植免疫反応を起こす結
果、ひきおこされる症状である。組織適合性の一致しな
い他人からの骨髄移植や輸血あるいは、臓器移植を受け
るときにしばしば発症する。[0004] GVHD is a symptom that is caused as a result of lymphocytes, which are immunocompetent cells, being transplanted and engrafted to a host that cannot reject a transplant, and causing a transplant immune reaction against a tissue antigen of the host. It is. It often occurs when receiving bone marrow transplants, blood transfusions, or organ transplants from others with incompatible histocompatibility.

【０００５】骨髄移植とは、レシピエント（受容者）の
血液系を破壊した上で、健常なドナー（提供者）から骨
髄、即ち血液系の基となる細胞集団（例えば幹細胞）を
移植することによって、レシピエントの内々でドナー由
来の血液系を再構成しようとする治療法である。レシピ
エントの血液系の破壊には、既に冒されている悪性疾患
を排除することおよび／またはレシピエントの免疫系を
抑制することを目的として放射線療法あるいは骨髄破壊
性高用量化学療法等が行われる。骨髄移植は、移植片で
ある骨髄細胞には造血幹細胞だけでなく免疫担当細胞も
含まれているので、移植片拒絶（graft rejection)を免
れてもＧＶＨＤが生じうる点で、他の臓器移植（腎、
肝、心など）とは異なっている（原田実根ら、「新しい
造血肝細胞移植」１〜７頁、１９９８年、第２刷、南江
堂）。[0005] Bone marrow transplantation is a process in which the blood system of a recipient (recipient) is destroyed and then transplanted from a healthy donor (donor) into bone marrow, that is, a cell population (eg, stem cells) that forms the blood system. Is a treatment that attempts to reconstitute the blood system from the donor within the recipient. Destruction of the recipient's blood system includes radiation therapy or high-dose myeloablative chemotherapy with the aim of eliminating the malignancy already affected and / or suppressing the immune system of the recipient. . In bone marrow transplantation, bone marrow cells, which are transplants, contain not only hematopoietic stem cells but also immunocompetent cells. Therefore, even if graft rejection is avoided, GVHD can occur. Kidney,
Liver, heart, etc.) (Mine Harada et al., “New hematopoietic hepatocyte transplantation”, pp. 1-7, 1998, 2nd print, Nankodo).

【０００６】免疫不全の患者が検疫担当細胞の多い器官
の移植を受けると、ＧＶＨＤが発現する危険性は高い。
従って、免疫系を再形成する目的で骨髄移植が行なわれ
る一時免疫不全の乳児および小児には重大な課題であ
り、また悪性疾患の治療のために骨髄移植を受ける患者
にとっても重大な課題である。なお、白血病の治療に対
する骨髄移植後の再発に対してドナーリンパ球輸注療法
（ＤＬＴ）が行われるが、その最大の副作用がＧＶＨＤ
であることも知られている（原田実根ら、「新しい造血
肝細胞移植」１７７〜１８２頁、前出）。また、臍帯血
幹細胞移植においても臍帯血バンクを介した非血縁者間
臍帯血幹細胞移植が行われつつあり、II度以上の急性Ｇ
ＶＨＤの合併率は３０〜５０％と報告されている（別冊
・医学のあゆみ、「血液疾患」、Ｖｅｒ．２４３６〜４
３９頁、１９９８年）。[0006] If an immunodeficient patient undergoes transplantation of an organ with a large number of quarantine cells, the risk of developing GVHD is high.
Therefore, it is a significant challenge for infants and children with transient immunodeficiency in which bone marrow transplantation is performed to reform the immune system, and also for patients undergoing bone marrow transplantation to treat malignancies. . In addition, donor lymphocyte infusion therapy (DLT) is performed for recurrence after bone marrow transplantation for the treatment of leukemia, but the greatest side effect is GVHD.
(Mine Harada, et al., “New hematopoietic hepatocyte transplantation”, pp. 177-182, supra). Also, in cord blood stem cell transplantation, cord blood stem cell transplantation between unrelated persons via a cord blood bank is being performed, and acute G or
It has been reported that the merger rate of VHD is 30 to 50% (separate volume, History of Medicine, “Hematology”, Ver.
39, 1998).

【０００７】ＧＶＨＤには、急性（骨髄移植後数週間以
内）もしくは慢性（移植後数ヶ月から数年続く）の両兆
候が現れうる。適当な総説としては、大野竜三ら「白血
病治療マニュアル」１７７〜１８４頁、１９９８年、第
４刷、南紅堂が参照されよう。急性ＧＶＨＤの主な標的
臓器あるいは組織は皮膚、腸管、肝臓であり、症状とし
ては、斑丘疹、紅斑性発疹、下痢および肝炎として現
れ、また免疫再形成が、長時間の過酷な免疫抑制により
損なわれる。それぞれの臓器ごとに臨床的な重症度(sta
ge) が決められ、臓器毎の重症度の組み合わせによって
全身の重症度(grade) が決められている（Thomas ED ら
ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２９２巻：８３２−８４３頁及び８
９５−９０２頁，１９７５年）。[0007] GVHD can present both acute (within a few weeks after bone marrow transplantation) or chronic (within months to years after transplantation) signs. A suitable review may be found in Ryuzou Ohno et al., Leukemia Treatment Manual, pp. 177-184, 1998, 4th print, Nankodo. The main target organs or tissues of acute GVHD are the skin, intestinal tract, and liver, manifested as macula papules, erythematous rash, diarrhea and hepatitis, and immune remodeling is impaired by prolonged severe immunosuppression. It is. Clinical severity (sta
ge) and the severity of the whole body is determined by the combination of the severities of the organs (Thomas ED, et al., NEEnglJ Med 292: 832-843 and 8).
95-902, 1975).

【０００８】急性ＧＶＨＤの診断については、臨床的症
状から以下の様に行われる。まず、皮膚については、手
掌や足底に紅斑が出現し、重症化するに従い、四肢、顔
面、体幹へと広がり、斑状丘疹から紅皮症へと進展し、
最終的には水泡を形成し落屑にいたることもある。鑑別
すべき皮膚症状として、ＨＨＶ−６による皮疹、薬疹、
Stevens-Johnson 症候群などがあり、確定診断は皮膚生
検によっている。消化管症状としての下痢は、皮疹に数
日遅れて出現する。１日の下痢量や血便、閉塞性イレウ
スなどの所見による判断がある。鑑別すべき消化管症状
としては、前処置などの薬剤の副作用としての粘膜障
害、サイトメガロウイルスによる腸炎、細菌性腸炎など
があり、直腸生検が確定診断となる。[0008] Acute GVHD is diagnosed as follows based on clinical symptoms. First, as for the skin, erythema appears on the palms and soles and spreads to the limbs, face, and trunk as it becomes more severe, and progresses from maculopapular to papular dermatosis,
Eventually, blisters form and can lead to desquamation. As skin symptoms to be distinguished, eruption due to HHV-6, drug eruption,
Definitive diagnosis is based on skin biopsy, including Stevens-Johnson syndrome. Diarrhea as a gastrointestinal symptom appears several days after the rash. There are judgments based on daily diarrhea, bloody stool, obstructive ileus, and other findings. Gastrointestinal symptoms to be differentiated include mucosal damage as a side effect of drugs such as pretreatment, enteritis due to cytomegalovirus, bacterial enteritis, and the like, and rectal biopsy is the definitive diagnosis.

【０００９】肝障害の特徴は、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬ
Ｔ（ＧＰＴ）、ＬＤＨなどの逸脱酵素の増加に比して、
ＡＬＰ、γ−ＧＴＰなどの胆道系酵素や直接ビリルビン
の増加が著しく、血清総ビリルビンのレベルによりstag
e が区別される。鑑別すべき肝合併症としては、肝中心
静脈閉塞（ＶＯＤ）、ウイルス性肝炎、シクロスポリン
等による薬剤性肝障害などがある。確定診断は肝生検に
より、経皮的肝生検に代わって経静脈的肝生検が推奨さ
れているが、我が国においてはまだ一般化していない。
また、重症急性ＧＶＨＤの際には、皮疹に数日先だって
４０度前後の高熱が出現することが多い。感染症との区
別として、ステロイド投与に著名な反応が認められると
きには、急性ＧＶＨＤによる発熱の可能性が高い。その
他急性膵炎、急性細気管支炎、食道炎、胃炎なども報告
されている。[0009] Hepatic disorders are characterized by AST (GOT), AL
T (GPT), compared to the increase of deviating enzymes such as LDH,
Biliary enzymes such as ALP and γ-GTP and direct bilirubin increased remarkably.
e is distinguished. Hepatic complications to be differentiated include central hepatic vein occlusion (VOD), viral hepatitis, drug-induced liver injury due to cyclosporine and the like. For definitive diagnosis, liver biopsy recommends transvenous liver biopsy instead of percutaneous liver biopsy, but it has not been generalized in Japan yet.
In addition, during severe acute GVHD, a high fever of about 40 degrees often appears several days before the rash. As distinguished from infections, when a prominent response to steroid administration is observed, there is a high possibility of fever due to acute GVHD. In addition, acute pancreatitis, acute bronchiolitis, esophagitis, gastritis and the like have been reported.

【００１０】しかしながら、ＧＶＨＤの検査所見に関し
ては、例えばＩｇＥ、インターフェロンやＴＮＦが増加
することが知られてはいるが、ＩｇＥは増加しない例も
あり、インターフェロンやＴＮＦではルーチンで測定す
ることは困難でいずれも（早期）診断に役立てられるこ
とは少なく、現在までのところ急性ＧＶＨＤに特有の検
査所見はないとされている。[0010] However, with regard to GVHD test findings, for example, it is known that IgE, interferon and TNF increase, but there are cases where IgE does not increase, and it is difficult to measure routinely with interferon and TNF. None of them are useful for (early) diagnosis, and it is said that there are no laboratory findings specific to acute GVHD to date.

【００１１】ＧＶＨＤの予防は薬剤によるものと、骨髄
中からＴ細胞を除去する方法とがある。薬剤による予防
としては、例えば、移植後からメトトレキセートの静注
または経口での投与、移植前日から移植後におけるシク
ロスポリンやタクロリムス（ＦＫ５０６）の点滴静注、
或いは、前処置もしくは移植後の抗リンパ球細胞グロブ
リン（ＡＬＧ）や抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の投
与などが挙げられる。Ｔ細胞除去法としては、Ｔ細胞特
異的モノクロナール抗体を利用した除去や造血幹細胞の
表面マーカーであるＣＤ３４抗原に対するモノクロナー
ル抗体を用いて幹細胞を選択的に分離する方法等が挙げ
られる。しかし、適切なＧＶＨＤ予防を行っても、重症
ＧＶＨＤはある頻度で発症する。急性ＧＶＨＤの治療
は、患者ごとのリスクによって開始時期も治療内容も異
なってくる。GVHD can be prevented by drugs or by removing T cells from bone marrow. Examples of prophylaxis with drugs include intravenous or oral administration of methotrexate after transplantation, intravenous infusion of cyclosporine and tacrolimus (FK506) from the day before transplantation to post-transplantation,
Alternatively, administration of anti-lymphocyte globulin (ALG) or anti-thymocyte globulin (ATG) after pretreatment or transplantation and the like can be mentioned. Examples of the T cell removal method include a removal method using a T cell-specific monoclonal antibody and a method of selectively separating stem cells using a monoclonal antibody against CD34 antigen, which is a surface marker of hematopoietic stem cells. However, even with proper GVHD prophylaxis, severe GVHD occurs at a certain frequency. When to treat acute GVHD, the timing of initiation and the content of treatment vary depending on the risk of each patient.

【００１２】軽症例ではプレドニン（１〜２mg/kg ）に
よる治療を開始し、解熱、下痢量の減少が観られれば経
過を観察し、漸減中止する。ＧＶＨＤの重症例では、強
力な免疫抑制療法を行わない限り救命は不可能である。
例えばシクロスポリンによる予防を行っていた症例で
は、ＦＫ５０６に変更し、メチルプレドニゾロンの大量
療法やＡＬＧ或いはＡＴＧの投与を行うことが勧められ
るが、治療開始時期が多少でも遅れると救命は望み得な
い。急性ＧＶＨＤが重症化すれば、体液・蛋白の喪失、
組織への体液貯留、臓器不全などの病態が進行し、やが
て間質性肺炎などの感染症を合併して致死的経過をたど
ることになる。上記のＧＶＨＤ治療が奏功するまでの期
間の全身管理の良否も最終的な結果に影響する。In mild cases, treatment with predonin (1-2 mg / kg) is started, and if fever is reduced and the amount of diarrhea is reduced, the progress is monitored and the taper is stopped. In severe cases of GVHD, survival is not possible without strong immunosuppressive therapy.
For example, in the case of prophylaxis with cyclosporine, it is recommended to change to FK506 and administer high-dose methylprednisolone therapy or administration of ALG or ATG, but if the treatment start time is delayed even a little, survival cannot be expected. If acute GVHD becomes severe, loss of body fluids and proteins,
Pathological conditions such as accumulation of body fluid in tissues and organ failure progress, and eventually lead to a fatal progress with infectious diseases such as interstitial pneumonia. The success or failure of the whole-body management until the above-mentioned GVHD treatment is successful also affects the final result.

【００１３】他方、慢性ＧＶＨＤは、移植後１００日以
降に出現する自己免疫様病変と免疫不全を特徴とする病
態である。慢性ＧＶＨＤの進展形式は、１）急性ＧＶＨ
Ｄからの移行（progressive type）、２）急性ＧＶＨＤ
が一旦消失した後の発症（quiescent type）、３）慢性
ＧＶＨＤが初発するもの（de novo type）の３種類があ
り、急性ＧＶＨＤからの移行は最も多く６０％程度にも
上る。慢性ＧＶＨＤの治療には、薬物としてはシクロス
ポリンＡ、ＦＫ５０６、プレドニゾロン、アザチオプリ
ン、サリドマイド等があるが、有効性のみならず副作用
の観点においても現状では満足の行くものはない。先述
のように、急性ＧＶＨＤの存在が一番大きな慢性ＧＶＨ
Ｄの発症要因であり、急性ＧＶＨＤをいかに抑制するか
によって慢性ＧＶＨＤの予防と治療を考えるべきとされ
ている。On the other hand, chronic GVHD is a pathological condition characterized by an autoimmune-like lesion and immunodeficiency appearing 100 days after transplantation. The type of development of chronic GVHD is 1) acute GVH
Transition from D (progressive type), 2) Acute GVHD
Once disappeared (quiescent type), and 3) chronic GVHD first occurred (de novo type), and the transition from acute GVHD was the most frequent, reaching about 60%. Drugs for treatment of chronic GVHD include cyclosporin A, FK506, prednisolone, azathioprine, thalidomide, etc., but none of them are satisfactory at present in terms of not only efficacy but also side effects. As described above, the presence of acute GVHD is the largest chronic GVH
It is a cause of D, and it is said that prevention and treatment of chronic GVHD should be considered depending on how acute GVHD is suppressed.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＧＶＨ
Ｄの診断を早期に的確に行うことは、ＧＶＨＤの発症リ
スクを背負う患者とりわけ骨髄移植患者にとって、ＧＶ
ＨＤの予防や治療すなわち患者の救命や予後の管理に重
要である。しかし、未だ適当な検査所見が確立されてお
らず、既存の診断方法にはそれぞれ鑑別されるべき諸症
状が存在し、確定判断においても、患者に苦痛を与える
生検や薬物の反応を観察することが必要である。As described above, GVH
Early and accurate diagnosis of D is important for patients at risk of developing GVHD, especially for bone marrow transplant patients.
It is important for prevention and treatment of HD, that is, for managing the survival and prognosis of patients. However, appropriate laboratory findings have not yet been established, and there are various symptoms to be distinguished in each of the existing diagnostic methods, and even in definitive judgments, observe the biopsy or drug reaction that causes pain to the patient It is necessary.

【００１５】従って、本発明の目的は、ＧＶＨＤの検出
に的確で有用な判断指標を提示し、当該指標に基づくＧ
ＶＨＤの検出方法、薬物治療におけるＧＶＨＤの進展も
しくは予防効果のモニタリング方法、並びに、これらの
方法を効果的に実施するためのキットを提供することで
ある。Accordingly, it is an object of the present invention to provide an accurate and useful judgment index for detecting GVHD, and to provide a G based on the index.
An object of the present invention is to provide a method for detecting VHD, a method for monitoring the progress or prevention effect of GVHD in drug treatment, and a kit for effectively performing these methods.

【００１６】[0016]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく鋭意検討した結果、骨髄移植患者のＧＶＨ
Ｄの重症化、患者の血液中もしくは尿中のＵＴＩ濃度の
推移において、ＧＶＨＤの重症化とＵＴＩ量の増加とに
著明な相関を見出した。とりわけ急性ＧＶＨＤの重症化
と尿中へのＵＴＩ***量の増加とに強い相関を見出し
た。このことから本発明者らはＧＶＨＤの早期検出に的
確で有用な指標として、尿中のＵＴＩの***量を選択し
急性ＧＶＨＤの早期検出方法の提供、並びに当該検出の
ためのキットを提供することに成功し、本発明を完成す
るに至った。The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that GVH
A severe correlation was found between the severity of GVHD and the increase in the amount of UTI in the severity of D and the change in the UTI concentration in the blood or urine of the patient. In particular, a strong correlation was found between the severity of acute GVHD and an increase in UTI excretion in urine. From the above, the present inventors have selected the amount of UTI excreted in urine as an accurate and useful index for early detection of GVHD, provided a method for early detection of acute GVHD, and provided a kit for the detection. And succeeded in completing the present invention.

【００１７】本発明の第一の態様は、ヒトから採取され
た試料中のＵＴＩを測定することを特徴とするＧＶＨＤ
の検出方法である。好ましくは、ＧＶＨＤが発症する恐
れのある状態の患者から採取された試料中のＵＴＩ量を
測定することを特徴とする急性ＧＶＨＤの検出方法であ
る。According to a first aspect of the present invention, there is provided a GVHD, wherein UTI in a sample collected from a human is measured.
Is a detection method. Preferably, there is provided a method for detecting acute GVHD, which comprises measuring the amount of UTI in a sample collected from a patient in a state where GVHD may occur.

【００１８】本発明の第二の態様は、骨髄移植患者にお
けるＧＶＨＤの検出を目的とする第一の態様記載の検出
方法である。The second aspect of the present invention is the detection method according to the first aspect, which is for detecting GVHD in a bone marrow transplant patient.

【００１９】本発明の第三の態様は、試料として血液も
しくは尿を用いることを特徴とする第一ないし第二の態
様記載の診断方法である。A third aspect of the present invention is the diagnostic method according to the first or second aspect, wherein blood or urine is used as a sample.

【００２０】本発明の第四の態様は、少なくとも前処置
前、移植日、および移植後白血球回復期の３点で、試料
中のＵＴＩの存在を測定する工程を含んでなる、本発明
の第一ないし第三の態様に記載の検出方法である。A fourth aspect of the present invention comprises the step of measuring the presence of UTI in the sample at least at three points before pretreatment, the date of transplantation, and the leukocyte recovery phase after transplantation. A detection method according to the first to third aspects.

【００２１】好ましくは、前処置前、移植日、および移
植後白血球回復期の３点で測定した試料中のＵＴＩ量
が、下記関係式（１）； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） を満たし、より好ましくは、 ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞１／３ （２） であることを、ＧＶＨＤ発症の判断の指標とする検出方
法である。なお、上記関係式（１）、（２）において、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
定値 である。ＵＴＩ量の測定値は後述するクレアチニン補正
値を用いるのが好ましい。Preferably, the amount of UTI in the sample measured at three points before pretreatment, on the day of transplantation, and at the leukocyte recovery period after transplantation is determined by the following relational expression (1): {(c)-(b)} / ｛ (B) − (a)｝> 0 (1), and more preferably, {(c) − (b)} / {(b) − (a)}> １ ／ (2) , A detection method used as an index for determining the onset of GVHD. In the above relational expressions (1) and (2), (a): the measured value of the UTI amount in the sample before the pre-treatment (b): the measured value of the UTI amount in the sample on the day of transplantation (c) : Measured value of the amount of UTI in the sample during the leukocyte recovery period after transplantation. It is preferable to use a creatinine correction value described later as the measured value of the UTI amount.

【００２２】試料は、例えば、患者から採取された尿も
しくは血液であって、採取された新鮮な試料を用いるこ
とができるが、−８０℃程度に冷凍保存された試料を適
宜解凍して測定しても良い。また、尿に適当な保存剤も
しくは安定化剤（例えばホルマリン、トルエン、フェノ
ール、アジ化ナトリウム、或いは適当なプロテアーゼイ
ンヒビター（例えばベンザミン、トラネキサム酸等）
等）を添加して室温、好ましくは冷暗所にて保存した後
測定に供しても良い。The sample is, for example, urine or blood collected from a patient, and a fresh sample collected can be used. The sample stored frozen at about -80 ° C. is appropriately thawed and measured. May be. Also, a suitable preservative or stabilizer for urine (eg, formalin, toluene, phenol, sodium azide, or a suitable protease inhibitor (eg, benzamine, tranexamic acid, etc.))
And the like, and stored at room temperature, preferably in a cool dark place, and then subjected to measurement.

【００２３】なお、移植後白血球回復期のＵＴＩ測定の
ため、移植日以後毎日測定することも可能であるが、所
定の間隔で測定することが好ましい。具体的には、１日
〜１０日の任意の間隔で測定が可能であり、例えば２日
毎、３日毎、５日毎、７日毎、１０日毎の間隔が挙げら
れる。試料の採取は、尿の場合、例えば採尿時刻を１日
の午前もしくは午後の何れかに設定するか、更に好まし
くは、採尿時刻を特定時刻±１時間以内に設定し、同じ
採尿時刻に採取された尿を用いる。採尿は、患者の自力
による排尿を採取するか、経尿道的に膀胱から直接採取
されたものであってもよい。Although it is possible to measure UTI during the leukocyte recovery period after transplantation every day after the date of transplantation, it is preferable to measure at predetermined intervals. Specifically, the measurement can be performed at arbitrary intervals of 1 to 10 days, for example, at intervals of 2 days, 3 days, 5 days, 7 days, and 10 days. In the case of urine, for example, in the case of urine, the urine collection time is set to either morning or afternoon of the day, or more preferably, the urine collection time is set within a specific time ± 1 hour, and the urine is collected at the same urine collection time. Use urine. The urine collection may be from the patient's own urination or transurethral directly from the bladder.

【００２４】より早期の検出のためには、なるべく測定
間隔を短くし、上記関係式を満たした時点でＧＶＨＤへ
の移行を疑う。測定間隔は、また、患者のＵＴＩ測定値
の変化の個人差や容態等により、適宜変更される。以上
の第一〜第四の態様において、より好ましい態様は、試
料として尿を用いる当該ＧＶＨＤの検出方法である。For earlier detection, the measurement interval should be shortened as much as possible, and when the above-mentioned relational expression is satisfied, the shift to GVHD is suspected. Further, the measurement interval is appropriately changed depending on the individual difference and the condition of the change of the UTI measurement value of the patient. In the above first to fourth aspects, a more preferred aspect is a method for detecting GVHD using urine as a sample.

【００２５】本発明の第五の態様は、ＵＴＩの定量を行
なって急性ＧＶＨＤを診断するために用いられるＵＴＩ
測定キットである。The fifth aspect of the present invention relates to a method for diagnosing acute GVHD by quantifying UTI.
It is a measurement kit.

【００２６】本発明の第六の態様は、免疫反応により試
験試料中のＵＴＩを測定する手段を有する急性ＧＶＨＤ
測定キットである。A sixth aspect of the present invention relates to an acute GVHD having a means for measuring UTI in a test sample by an immune reaction.
It is a measurement kit.

【００２７】本発明の第七の態様は、第五もしくは第六
の態様記載のＧＶＨＤ測定キットによる急性ＧＶＨＤの
モニター下に使用されることを特徴とする急性ＧＶＨＤ
の予防および／または治療剤である。第七の態様におい
て使用される薬物としては、メトトレキセート、シクロ
ホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロス
ポリン、タクロリムス水和物、塩酸グスペリムス等の免
疫抑制剤の他、プレドニンやメチルプレドニゾロン等の
ステロイド剤、ＡＬＧ、ＡＴＧ等が例示される。[0027] A seventh aspect of the present invention is an acute GVHD monitor used for monitoring acute GVHD using the GVHD measurement kit according to the fifth or sixth aspect.
Is a prophylactic and / or therapeutic agent. The drugs used in the seventh embodiment include methotrexate, cyclophosphamide, azathioprine, mizoribine, cyclosporine, tacrolimus hydrate, immunosuppressants such as gusperimus hydrochloride, steroids such as prednin and methylprednisolone, ALG , ATG and the like.

【００２８】[0028]

【発明の実施の形態】次に本発明の実施の形態について
説明する。本発明は、ＧＶＨＤが発生する恐れのある状
態のヒト、例えば造血幹細胞移植とりわけ骨髄移植を受
けた患者から得られる試料中のＵＴＩを測定することを
特徴とするＧＶＨＤの発症の検出方法、並びに当該ＧＶ
ＨＤ検出のための測定キットである。ＧＶＨＤが発生す
る恐れのある状態にあるヒトとは、例えば造血幹細胞移
植、ドナーリンパ球輸注療法（ＤＬＴ）、輸血、臓器移
植を受けた患者が挙げられる。Next, an embodiment of the present invention will be described. The present invention relates to a method for detecting the onset of GVHD, which comprises measuring UTI in a sample obtained from a human who is at risk of developing GVHD, for example, a patient who has undergone hematopoietic stem cell transplantation, especially bone marrow transplantation. GV
This is a measurement kit for detecting HD. The human in a state where GVHD is likely to occur includes, for example, patients who have undergone hematopoietic stem cell transplantation, donor lymphocyte infusion therapy (DLT), blood transfusion, or organ transplantation.

【００２９】本発明にいう「ＧＶＨＤ」は、免疫担当細
胞であるリンパ球が、移植片を拒絶し得ないような宿主
に移植され生着し、宿主の組織抗原に対して移植免疫反
応を起こす結果ひきおこされる急性もしくは慢性の疾病
をいう。本発明の検出方法により、早期に検出しうるＧ
ＶＨＤとして好適なものとしては、造血幹細胞移植とり
わけ骨髄移植或いは（非縁者間）臍帯血幹細胞移植に起
因するＧＶＨＤ、ドナーリンパ球輸注療法（ＤＬＴ）に
おけるＧＶＨＤ、輸血に起因するＧＶＨＤ、あるいは、
臓器移植に起因するＧＶＨＤがあげられ、より好ましく
は急性ＧＶＨＤであり、更に好ましくは骨髄移植に起因
する急性ＧＶＨＤが挙げられる。The term "GVHD" as used in the present invention means that lymphocytes, which are immunocompetent cells, are transplanted to a host that cannot reject a transplant and survive, and cause a transplant immune reaction against a host tissue antigen. An acute or chronic disease that results. G that can be detected early by the detection method of the present invention.
Suitable VHDs include GVHD due to hematopoietic stem cell transplantation, especially bone marrow transplantation or (unrelated) cord blood stem cell transplantation, GVHD in donor lymphocyte infusion therapy (DLT), GVHD due to blood transfusion, or
GVHD caused by organ transplantation is exemplified, more preferably acute GVHD, and even more preferably acute GVHD caused by bone marrow transplantation.

【００３０】ここで、「骨髄移植」とは、レシピエント
（受容者）の血液系を破壊した上で、健常なドナー（提
供者）から骨髄、即ち血液系の基となる細胞集団（例え
ば幹細胞）を移植することによって、レシピエントの内
々でドナー由来の血液系を再構成しようとする治療法で
ある。レシピエントの血液系の破壊には、既に冒されて
いる悪性疾患を排除することおよび／またはレシピエン
トの免疫系を抑制することを目的として放射線療法ある
いは骨髄破壊性高用量化学療法等が行われる。Here, the term “bone marrow transplantation” refers to a method in which the blood system of a recipient (recipient) is destroyed, and a healthy donor (donor) is used to obtain bone marrow, that is, a cell population (eg, stem cells) serving as a blood system. ) Is a treatment that seeks to reconstitute the blood system from the donor within the recipient by transplantation. Destruction of the recipient's blood system includes radiation therapy or high-dose myeloablative chemotherapy with the aim of eliminating the malignancy already affected and / or suppressing the immune system of the recipient. .

【００３１】「前処置」とは、例えば白血病の治療にお
ける骨髄移植に先立って、レシピエントの体内に残存す
る白血病細胞の根絶と移植骨髄生着のための免疫抑制を
目的として行われる、全身放射線照射および／または大
量の抗がん剤例えばシクロスポリン、シタラビン、ブス
ルファン、メルファラン或いはエトポシド等の単独もし
くは併用投与等の処置である。通常移植手術のおよそ１
週間前ごろから移植当日にかけて前処置が行われる。"Pretreatment" refers to, for example, prior to bone marrow transplantation in the treatment of leukemia, systemic radiation performed for the purpose of eradication of leukemia cells remaining in the body of the recipient and immunosuppression for transplantation bone marrow survival. Irradiation and / or treatment with a large amount of anticancer agents such as cyclosporine, cytarabine, busulfan, melphalan or etoposide alone or in combination. About 1 for normal transplant surgery
Pretreatment is performed about a week before the day of transplantation.

【００３２】従って、本発明において「前処置前」と
は、その前処置の以前の期間を意味するが、通常、前処
置の前２週間から前処置に入るまでの時期をいう。「移
植日」とは、レシピエントに対して、骨髄等の移植の施
術日もしくはその一両日である。Therefore, in the present invention, "before pretreatment" means a period before the pretreatment, but usually means a period from two weeks before the pretreatment to the start of the pretreatment. The “transplantation day” is a treatment day or one or both days of transplantation of bone marrow or the like to the recipient.

【００３３】「移植後白血球回復期」とは、前処置によ
り激減したレシピエントの白血球数が、骨髄等の移植に
よりおよそ１０００／ｍｍ³ 以上に回復した時期をい
い、通常、骨髄等の移植の施術日から２〜３週間後であ
るが、患者の回復状況により１週間程度前後しうる。The term "white blood cell recovery period after transplantation" refers to a period in which the white blood cell count of the recipient, which has been drastically reduced by the pretreatment, has recovered to about 1000 / mm ³ or more by transplantation of bone marrow or the like. Although it is two to three weeks after the operation day, it may be about one week depending on the recovery status of the patient.

【００３４】特に、本発明の第四の態様では、少なくと
も前処置前、移動日、および移植後白血球回復期の３点
での試料中のＵＴＩ量を測定し、その測定値より、ＧＶ
ＨＤ発症を予想する判断指標とする。さらに好ましく
は、それぞれの測定値を（ａ）、（ｂ）、（ｃ）とした
場合に、試料中のＵＴＩ量が、下記関係式（１）； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） であることを、ＧＶＨＤ発症を予想する判断指標とす
る。さらに、尿中のＵＴＩ量が、 ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞１／３ （２） である場合は、その後、施術日から約３〜４週間後に重
症の急性ＧＶＨＤ、例えば腸管、皮膚等において III度
以上の急性ＧＶＨＤを発生する可能性が極めて大きいと
判断される。In particular, in the fourth embodiment of the present invention, the amount of UTI in a sample is measured at least at three points before pretreatment, on the day of transfer, and during the leukocyte recovery period after transplantation.
It is used as a judgment index for predicting the onset of HD. More preferably, when the measured values are (a), (b), and (c), the UTI amount in the sample is expressed by the following relational expression (1): {(c)-(b)} /｝ (B)-(a)｝> 0 (1) is used as a judgment index for predicting the onset of GVHD. Further, when the UTI amount in the urine is {(c)-(b)} / {(b)-(a)}> 1/3 (2), then, about 3 to 4 weeks from the treatment date Later, it is determined that there is a great possibility that severe acute GVHD, for example, acute GVHD of III degree or higher will occur in the intestinal tract, skin and the like.

【００３５】本発明に使用されうるＵＴＩの測定手法お
よび測定キットとしては、ＵＴＩ量または濃度を測定で
きる試薬またはキットであれば特に限定されないが、例
えば、トリプシン活性の阻害作用を測定する酵素学的測
定法、ＵＴＩと抗ＵＴＩ抗体との反応に基づく様々な免
疫学的測定方法およびかかる測定原理に基づくＵＴＩ測
定キットが挙げられる。The method and kit for measuring UTI that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they are reagents or kits capable of measuring the amount or concentration of UTI. For example, an enzymatic method for measuring the inhibitory effect of trypsin activity is used. Assay methods, various immunological assay methods based on the reaction between UTI and an anti-UTI antibody, and UTI assay kits based on such an assay principle are included.

【００３６】酵素学的測定方法は、自動分析機の使用に
より迅速に測定できるが、トリプシン活性の阻害量をみ
るため、特異性の面でやや劣る。改善された技術とし
て、試料中のα１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）を
不活性化させる前処理を行なう技術、例えばＷＯ９９／
４９０７６号公報に開示された測定方法が利用され得
る。他方、免疫学的測定方法は、抗原抗体反応に基づく
ためＵＴＩのみを正確に測定できる特徴を持つ。具体的
には、定量的検出方法として、ラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、及
び、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）等が知られ
ており、定性的検出方法としては、赤血球凝集法、ラテ
ックス凝集反応比濁法（ＬＡＩＡ）、時間分解蛍光免疫
測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーア
ッセイ（ＩＣＡ）または電気化学的特異結合分析法（Ｍ
ＥＤＩＡ）（特開平５−２６４５５２号公報参照）等が
挙げられる。なお、ＬＡＩＡにおける凝集促進剤として
ポリエチレングリコールを添加する改良技術として特開
平１１−６４３３４号公報に開示された技術も利用され
得る。The enzymatic assay can be carried out quickly by using an automatic analyzer, but is somewhat inferior in specificity because the amount of trypsin activity is inhibited. As an improved technique, a technique of performing a pretreatment for inactivating α1-antitrypsin (α1-AT) in a sample, for example, WO99 /
The measuring method disclosed in JP 49076 can be used. On the other hand, since the immunological measurement method is based on an antigen-antibody reaction, it has a feature that only UTI can be accurately measured. Specifically, radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay, enzyme immunoassay (EIA, ELISA) and the like are known as quantitative detection methods. The methods include hemagglutination, latex agglutination turbidimetry (LAIA), time-resolved fluorescence immunoassay (TR-FIA), immunochromatographic assay (ICA), and electrochemical specific binding analysis (M
(EDIA) (see JP-A-5-264552). The technology disclosed in JP-A-11-64334 may be used as an improved technology for adding polyethylene glycol as an aggregation promoter in LAIA.

【００３７】免疫学的測定方法に使用される抗ＵＴＩ抗
体は、ＵＴＩに対して特異的に反応し抗原抗体反応を生
じ、各測定法に必要な性質を有していれば良い。例えば
ＬＡＩＡにおいては凝集反応を有するものであれば特に
制限されず、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体
若しくはポリクロナール抗体を含む抗血清等の何れでも
良い。抗体の種類も制限されず、各種免疫グロブリン例
えばＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＤが使用で
きる。抗原の種類も制限されず、ラット、ウサギ、ヤギ
等由来の抗体が使用できる。これらの抗体は、免疫原と
してＵＴＩを使用すること以外は、通常行われる抗体作
成方法により得られる（例えば、日本泌尿器学会７４
巻、９号（１９８３年）に記載の方法）。反応液中の抗
ＵＴＩ抗体の濃度は、測定感度と測定上限に影響するの
で、適量を実験によって求めることが望ましく、その
際、抗ＵＴＩ抗体の力価や精製の程度を考慮して適量を
求めることができる。The anti-UTI antibody used in the immunological measurement method may react specifically with UTI to generate an antigen-antibody reaction, and may have properties required for each measurement method. For example, LAIA is not particularly limited as long as it has an agglutination reaction, and may be any of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and an antiserum containing a polyclonal antibody. The type of antibody is not limited, and various immunoglobulins such as IgA, IgE, IgG, IgM, and IgD can be used. The type of antigen is not limited, and antibodies derived from rats, rabbits, goats and the like can be used. These antibodies can be obtained by a commonly used antibody preparation method except that UTI is used as an immunogen (for example, Japanese Urological Society 74).
Vol. 9, No. 9 (1983)). Since the concentration of the anti-UTI antibody in the reaction solution affects the measurement sensitivity and the upper limit of the measurement, it is desirable to determine an appropriate amount by experiment. In this case, an appropriate amount is determined in consideration of the titer of the anti-UTI antibody and the degree of purification. be able to.

【００３８】これらの測定法に供される本発明の「キッ
ト」としては、酵素学的測定法用のキットとして、例え
ば、 トリプシン溶液＋基質溶液＋トリプシン以外のプロテ
アーゼ溶液から構成される測定キット、 トリプシン溶液＋基質溶液＋酸化剤溶液から構成され
る測定キット、 或いは、またはに更に緩衝液を加えた測定キット があり、例えばＷＯ９９／４９０７６明細書記載の測定
キットＡおよびキットＢが参照される。これらのキット
には必要に応じＵＴＩ標準品や希釈溶媒が添付される。The "kit" of the present invention to be used in these measurement methods includes kits for enzymatic measurement methods, for example, a measurement kit comprising a trypsin solution + a substrate solution + a protease solution other than trypsin, There is a measurement kit composed of a trypsin solution + a substrate solution + an oxidizing agent solution, or a measurement kit in which a buffer is further added. For example, measurement kits A and B described in WO99 / 49076 are referred to. These kits include UTI standard products and diluent solvents as necessary.

【００３９】免疫学的測定方法のキットとしては、例え
ば抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ法を用いた該手段の
試薬としては、酵素標識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体、酵素基質及び発色剤が挙げられる。ここに記
載される酵素は例えばペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙
げられる。すなわち、酵素標識抗ＵＴＩ抗体がＨＲＰ標
識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体が非標識抗Ｕ
ＴＩ抗体、酵素基質が過酸化水素水及び発色剤がテトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢ）発色剤となる。これら４試
薬により臓器移植後の臓器移植患者（レシピエント）の
ＵＴＩ量を測定する手段の一例は構成される。該試薬を
含めたキットとしては、該試薬が含まれれば、特に免疫
反応または発色反応の検出を阻害するものを含まなけれ
ば、他に何が含まれていてもよい。例えば結合反応の場
であるプレート等含むことが好ましく、さらにプレート
が、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体がプレートに結合された抗
ウリナスタチン抗体結合プレートであればさらに好まし
い。また、必要に応じてプレートシール、抗体希釈液、
検体希釈液、洗浄液、発色停止剤または標準ＵＴＩ液等
を含むことが好ましい。さらに測定するための機器とし
て、ピペット類、恒温層、試験管類、吸光度測定計等を
含んでいてもよい。As a kit for the immunological assay method, for example, a sandwich EIA method using an antibody may include an enzyme-labeled anti-UTI antibody and a non-enzyme-labeled anti-U
TI antibodies, enzyme substrates and color formers. The enzymes described herein include, for example, peroxidase (HRP). That is, the enzyme-labeled anti-UTI antibody is an HRP-labeled anti-UTI antibody, and the non-enzyme-labeled anti-UTI antibody is a non-labeled anti-UTI antibody.
The TI antibody, the enzyme substrate is a hydrogen peroxide solution, and the coloring agent is a tetramethylbenzidine (TMB) coloring agent. These four reagents constitute an example of a means for measuring the UTI amount of an organ transplant patient (recipient) after the organ transplant. The kit including the reagent may include any other components as long as the reagent is included, as long as the kit does not include a component that inhibits the detection of an immune reaction or a coloring reaction. For example, it is preferable to include a plate or the like that is a site for a binding reaction, and it is more preferable that the plate be an anti-urinastatin antibody-binding plate having a non-enzyme-labeled anti-UTI antibody bound to the plate. Also, if necessary, plate seal, antibody diluent,
It is preferable to include a sample diluent, a washing solution, a color stop agent, a standard UTI solution, and the like. Further, instruments for measurement may include pipettes, thermostats, test tubes, absorbance meters, and the like.

【００４０】この試薬またはキットによる試料中のＵＴ
Ｉ量の測定方法は、以下の通りである。まず非酵素標識
抗ＵＴＩ抗体を固定したプレートに尿及び酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体を添加し、非酵素標識抗ＵＴＩ抗体と資料中の
ＵＴＩさらに酵素標識抗ＵＴＩ抗体を結合させる。プレ
ートを洗浄して結合物を残渣と分離し、酵素基質と発色
剤を添加して発色の吸光度を測定する。同時に行った標
準ＵＴＩの測定値または予め求められている検量線よ
り、試料中のＵＴＩ濃度を求める。さらに尿中のＵＴＩ
量のクレアチニン補正値を求める場合は、公知の方法で
尿中クレアチニン量を測定し、下記式により換算量を求
める。 式 尿中ＵＴＩ量のクレアチニン補正値（Ｕ／ｍｇ・Ｃｒ
ｅ）＝尿中ＵＴＩ濃度（Ｕ／ｍｌ）×尿中クレアチニン
濃度（ｍｇ／ｍｌ）UT in a sample by this reagent or kit
The method for measuring the I amount is as follows. First, urine and enzyme-labeled anti-UTI
The TI antibody is added, and the non-enzyme-labeled anti-UTI antibody is combined with the UTI in the sample and the enzyme-labeled anti-UTI antibody. The plate is washed to separate the conjugate from the residue, and an enzyme substrate and a color former are added, and the absorbance of the color is measured. The UTI concentration in the sample is determined from the measured value of the standard UTI performed at the same time or the calibration curve obtained in advance. UTI in urine
When the creatinine correction value of the amount is determined, the amount of creatinine in urine is measured by a known method, and the converted amount is determined by the following formula. Formula Creatinine correction value of UTI in urine (U / mg · Cr)
e) = UTI concentration in urine (U / ml) x creatinine concentration in urine (mg / ml)

【００４１】また別の例として、抗体を用いた該手段の
試薬としては、酵素標識抗ＵＴＩ抗体、非酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体及び酵素基質が組み込まれたＭＥＤＩＡ法を利
用する試薬が挙げられる。ここに記載される酵素をＨＲ
Ｐとした場合の各具体例はサンドイッチＥＩＡ法におけ
る説明と同様である。これら３試薬により臓器移植後の
臓器移植患者（レシピエント）の尿中ＵＴＩ量を測定す
る手段の一例は構成される。該試薬を含めたキットとし
ては、該試薬が含まれれば、特に免疫反応または電気化
学反応の検出を阻害するものを含まなければ、他に何が
含まれていてもよい。例えば、反応の場（マトリクス）
及び電極等を含む反応装置（特開平５−２６４５５２号
公報参照）を含むことが好ましい。また、必要に応じて
抗体希釈液、検体希釈液、電子メディエーターまたは標
準ＵＴＩ液等を含んでいてもよい。さらに測定するため
の付属品として、ピペット類、試験管類、電流測定計等
を含んでいてもよい。このＭＥＤＩＡ法による測定のた
めの試薬またはキットによる尿中ＵＴＩ量の測定方法
は、以下の通りである。反応装置に尿及び酵素標識抗Ｕ
ＴＩ抗体を添加し、またはマトリクスに予め酵素標識抗
ＵＴＩ抗体が含浸されている場合は反応装置に尿を添加
し、生じた電流の変化を測定する。同時に行った標準Ｕ
ＴＩの測定値または予め求められている検量線より、尿
中のＵＴＩ濃度を求める。尿中のＵＴＩのクレアチニン
補正値を求める場合は、上記に記載の方法で求める。As another example, the reagent for the means using an antibody includes an enzyme-labeled anti-UTI antibody and a non-enzyme-labeled anti-U
A reagent utilizing the MEDIA method in which a TI antibody and an enzyme substrate are incorporated is exemplified. The enzyme described here is HR
Each specific example in the case of P is the same as the description in the sandwich EIA method. These three reagents constitute an example of a means for measuring the amount of UTI in urine of an organ transplant patient (recipient) after organ transplant. The kit including the reagent may include any other components as long as the reagent is included, as long as the kit does not include a component that inhibits detection of an immune reaction or an electrochemical reaction. For example, a reaction field (matrix)
And a reaction device including an electrode and the like (see JP-A-5-264552). Further, if necessary, it may contain an antibody diluent, a sample diluent, an electron mediator, a standard UTI solution, or the like. Further, as accessories for measurement, pipettes, test tubes, an ammeter, and the like may be included. The method of measuring the amount of UTI in urine using the reagent or kit for measurement by the MEDIA method is as follows. Urine and enzyme-labeled anti-U
When a TI antibody is added, or when the matrix is previously impregnated with an enzyme-labeled anti-UTI antibody, urine is added to the reaction device, and the resulting change in current is measured. Standard U performed simultaneously
UTI concentration in urine is determined from the measured value of TI or a previously determined calibration curve. When a creatinine correction value of UTI in urine is determined, it is determined by the method described above.

【００４２】当該キットの具体例は、 １）定量的測定キットとして、 ＵＴＩ−ＲＩＡキット：放射ラベルＵＴＩ（例えば
¹²⁵ I −ＵＴＩ）＋固相化した抗ＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標
準品から構成されるキット、或いは、固相化した抗ＵＴ
Ｉ抗体の代わりに抗ＵＴＩ抗体＋第二抗体を加えたキッ
トがあり、例えばＢｒｉｔｔ−Ｍａｒｉｅら（Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ、Ｖｏｌ．
３７０、ｐｐ１１５７−１１６１、Ｎｏｖ．（１９８
９））が参照される。 ＵＴＩ−ＥＩＡキット：抗ＵＴＩ抗体＋酵素（例えば
ペルオキシダーゼ）標識抗体＋基質溶液から構成される
キットがあり、具体的には、Ｅｔｓｕｏら（Ｃｌｉｎｉ
ｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ．１６７、ｐｐ．１５５−
１６４（１９８７））、或いは、後述する本発明の実施
例４が参照される。また、固相化抗体＋酵素標識抗体の
組み合わせとしては、ポリクロナール抗体同士の他、モ
ノクロナールとポリクロナールの組み合わせ、モノクロ
ナール同士の組み合わせの何れも利用可能である。これ
らのキットには適宜、ＵＴＩ標準品、試料希釈液、反応
停止液等の付属品が添付されうる。 ＵＴＩ−蛍光免疫測定キット：の酵素標識抗体の代
わりに、蛍光標識した抗体を用いて構成されるキットで
ある。 ＵＴＩ−化学発光キット：の酵素標識抗体の代わり
に、化学発光物質で標識した抗体を用いて構成されるキ
ットである。Specific examples of the kit are as follows: 1) As a quantitative measurement kit, a UTI-RIA kit: a radiolabel UTI (for example,
Kit consisting of ¹²⁵ I-UTI) + immobilized anti-UTI antibody + UTI standard, or immobilized anti-UT
There is a kit in which an anti-UTI antibody and a second antibody are added in place of the I antibody. For example, Brit-Marie et al. (Bio
l. Chem. Hopper-Seyler, Vol.
370, pp 1157-1161, Nov. (198
9)) is referred to. UTI-EIA kit: There is a kit comprising an anti-UTI antibody + an enzyme (for example, peroxidase) -labeled antibody + substrate solution. Specifically, Etsuo et al. (Clini)
caChimicaActa. 167, pp. 155-
164 (1987)) or the fourth embodiment of the present invention described later. As the combination of the immobilized antibody and the enzyme-labeled antibody, any of a combination of monoclonal and polyclonal and a combination of monoclonal can be used in addition to the polyclonal antibodies. Appropriate accessories such as a UTI standard, a sample diluent, and a reaction stop solution can be attached to these kits as appropriate. UTI-Fluorescence Immunoassay Kit: A kit comprising a fluorescently labeled antibody in place of the enzyme-labeled antibody. UTI-chemiluminescence kit: This kit is constituted by using an antibody labeled with a chemiluminescent substance instead of the enzyme-labeled antibody.

【００４３】２）定性的検出方法 ＵＴＩ−赤血球凝集法キット：赤血球に固相化した抗
ヒトＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標準品を構成とするキットであ
る。 ＵＴＩ−ＬＡＩＡキット：ラテックスに固相化抗ヒト
ＵＴＩ抗体＋ＵＴＩ標準品を構成とするキット、例えば
後述の測定方法の実施例１−ｂが挙げられる。2) Qualitative detection method UTI-hemagglutination kit: A kit comprising an anti-human UTI antibody immobilized on erythrocytes and a UTI standard. UTI-LAIA kit: a kit comprising an anti-human UTI antibody immobilized on latex and a UTI standard, for example, Example 1-b of the measurement method described below.

【００４４】本発明の「ＵＴＩ測定キットによるＧＶＨ
Ｄのモニター下に使用されることを特徴とするＧＶＨＤ
の予防および／または治療剤」とは、現在もしくは将来
上市され若しくは開発が指向される全ての薬剤が該当す
るが、好ましくは、本発明の診断方法で患者の症状をモ
ニターしつつ投薬されることにより、そのＧＶＨＤの予
防もしくは治療効果がより優れて発揮される薬剤であ
る。具体的には、メトトレキセート、シクロスポリン、
タクロリムス、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロ
ン、アザチオプリン、ミゾリビン、ＡＬＧ、ＡＴＧ等こ
れらの塩、これらの水和物ないし塩の水和物等が挙げら
れる。これらは単独もしくは適宜併用されてもよい。併
用する場合は、メトトレキセートとシクロスポリン、も
しくは、メトトレキセートとタクロリムス水和物との併
用が好ましく、あるいは、メトトレキセートとシクロス
ポリンとｍ−ＰＳＬの３剤併用、もしくは、メトトレキ
セートとタクロリムス水和物とｍ−ＰＬＳとの３剤併用
も好ましい。投与法としては、好ましくは経口投与もし
くは静脈内投与である。必要に応じ血中濃度をモニター
しながらの点滴静注が好ましい。The GVH using the “UTI measurement kit” of the present invention
GVHD used under the monitor of D
The term "preventive and / or therapeutic agent" refers to all drugs currently marketed or to be marketed or to be developed. Preferably, the medicament is administered while monitoring the patient's symptoms by the diagnostic method of the present invention. Is a drug that exerts its GVHD prophylactic or therapeutic effect more excellently. Specifically, methotrexate, cyclosporine,
Examples thereof include tacrolimus, prednisolone, methylprednisolone, azathioprine, mizoribine, ALG, ATG, and the like, salts thereof, and hydrates and hydrates of the salts. These may be used alone or in combination as appropriate. When used in combination, it is preferable to use methotrexate and cyclosporine, or a combination of methotrexate and tacrolimus hydrate, or three drugs of methotrexate and cyclosporine and m-PSL, or methotrexate and tacrolimus hydrate and m-PLS. The combination of the three agents is also preferred. The administration method is preferably oral administration or intravenous administration. Intravenous infusion while monitoring the blood concentration as necessary is preferred.

【００４５】本発明のＧＶＨＤの早期検出方法は、上記
構成をとることにより、ＧＶＨＤ、特に急性ＧＶＨＤの
発症を、早期に的確に検出することが可能である。とり
わけ骨髄移植患者におけるＧＶＨＤの早期検出に有用で
ある。本発明においては、試料としては好ましくは採取
された血液あるいは尿が使用される。とりわけ尿の使用
は、採取に特別な器具や技術を必要とせず安全かつ簡便
であり、患者への負担や検査担当者の安全確保等の観点
からも望ましい。このため、臨床検査、診断分野におい
て最も有用性の高い検出方法である。使用済み器具や試
料の廃棄についても問題が無い。少なくとも前処置前、
移植日、および移植後白血球回復期の３点で、試料中の
ＵＴＩ量を測定し、その測定値をＧＶＨＤの発症の判断
指標とし、特に、試料中のＵＴＩ量が上記関係式（１）
を満たすことをＧＶＨＤの発症の判断指標とする本発明
の検出方法では、より的確にＧＶＨＤの発症を検出する
ことが可能である。また、本発明の検出方法により、Ｇ
ＶＨＤの進展をモニターしつつ患者に対し薬物による的
確な予防および／または治療が可能となる。本発明のＧ
ＶＨＤを早期検出するための測定キットは、上記構成を
採ることにより、ＧＶＨＤ発症の可能性を早期に、的確
かつ簡便に検出することができる。従って、本発明の検
出方法および測定キットは、ＧＶＨＤの診断に、好適に
用いられる。The method for early detection of GVHD of the present invention can accurately detect the onset of GVHD, particularly acute GVHD, early by adopting the above configuration. It is particularly useful for early detection of GVHD in bone marrow transplant patients. In the present invention, preferably, collected blood or urine is used as the sample. In particular, the use of urine is safe and simple without the need for special instruments and techniques for collection, and is also desirable from the viewpoint of burden on patients and ensuring the safety of test personnel. For this reason, it is the most useful detection method in the field of clinical tests and diagnostics. There is no problem with disposal of used instruments and samples. At least before pretreatment,
The UTI amount in the sample was measured at the three points of the transplantation date and the leukocyte recovery period after the transplantation, and the measured value was used as an index for judging the onset of GVHD.
According to the detection method of the present invention, in which the satisfaction of the condition is satisfied, the occurrence of GVHD can be detected more accurately. Further, according to the detection method of the present invention, G
The patient can be properly prevented and / or treated with a drug while monitoring the progress of VHD. G of the present invention
By adopting the above configuration, the measurement kit for early detection of VHD can detect the possibility of the onset of GVHD early, accurately and simply. Therefore, the detection method and measurement kit of the present invention are suitably used for diagnosis of GVHD.

【００４６】[0046]

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、さらに具体
的に説明する。 ＜ＧＶＨＤの検出＞ （実施例１） （対象と方法）骨髄移植症例７例について、ＥＩＡ法
（後述するキットの実施例４参照）を用いて、（ａ）前
処置前（移植２〜３週間前）、（ｂ）移植日、（ｃ）移
植後白血球回復期（移植後２〜３週間後）の３点で尿中
のＵＴＩ濃度を測定した。なお、患者にはＧＶＨＤの予
防のため通常量のサイクロスポリンＡとメトトレキセー
トを投与した。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. <Detection of GVHD> (Example 1) (Subjects and Methods) For the seven cases of bone marrow transplantation, using the EIA method (see Example 4 of the kit described later), (a) Before pretreatment (2 to 3 weeks after transplantation) UTI concentration in urine was measured at three points: before), (b) transplantation date, and (c) leukocyte recovery period after transplantation (2 to 3 weeks after transplantation). In addition, the patient received the usual amount of cyclosporin A and methotrexate for prevention of GVHD.

【００４７】（判定方法）ＧＶＨＤ発症の傾向の有無
を、次の式で現される数値（Ｒ）により判定した。 Ｒ＝｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ 式中、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
定値 Ｒ＞１／３のとき陽性（＋：重症ＧＶＨＤ発症の恐れあ
り）、１／３≧Ｒ＞０のとき擬陽性（±：ＧＶＨＤの傾
向あり）とし、Ｒ≦０のときは陰性（−：重症ＧＶＨＤ
発症の恐れ無し）とした。(Determination Method) The presence or absence of a tendency to develop GVHD was determined by a numerical value (R) expressed by the following equation. R = {(c)-(b)} / {(b)-(a)}> 0, where (a): the measured value of the UTI amount in the sample before the pretreatment (b): at the date of transplantation (C): Measured value of UTI amount in sample in leukocyte recovery period after transplantation Positive when R> １ ／ (+: risk of severe GVHD onset), 1/3 False positive (±: GVHD tended) when ≧ R> 0, negative (−: severe GVHD) when R ≦ 0
No risk of onset).

【００４８】（結果）ＵＴＩ濃度は、全症例で移植日に
上昇した。白血球回復期において、２症例（Ａ氏、Ｂ
氏）はＵＴＩ値がさらに上昇し、他の５症例は低下した
（Ｃ氏〜Ｇ氏）。各測定値ならびに判定結果を下記第１
表に示す。また、本測定における尿中のＵＴＩ量の変化
を図１のグラフに示す。図１のグラフの縦軸は、尿中の
ＵＴＩの濃度（同時に測定したクレアチン濃度により補
正）を、横軸は、測定点（前処置前、移植日、移植後白
血球回復期）を表わす。(Results) The UTI concentration increased in the transplantation day in all cases. In the leukocyte recovery period, two cases (Mr. A, B
Mr.) further increased the UTI value, and decreased in the other 5 cases (Ms. C to G). Each measurement value and judgment result are described in the first section below.
It is shown in the table. Further, the change in the amount of UTI in urine in this measurement is shown in the graph of FIG. The vertical axis of the graph of FIG. 1 represents the concentration of UTI in urine (corrected by the creatine concentration measured at the same time), and the horizontal axis represents measurement points (before pretreatment, transplantation date, leukocyte recovery period after transplantation).

【００４９】 （（ａ）〜（ｃ）の測定値の単位：ｍｇ／Ｌ）[0049] (Unit of measured values of (a) to (c): mg / L)

【００５０】本発明の検出方法により、７名中２名がＧ
ＶＨＤ陽性と判定された。なお、ＧＶＨＤ陽性と判定さ
れた２名（Ａ氏およびＢ氏）中、Ａ氏は移植後２１日目
に、腸管および皮膚において III度の急性ＧＶＨＤを引
き起こした。Ｂ氏は移植後３４日目に、腸管において I
II度の急性ＧＶＨＤを引き起こした。それぞれの患者に
対してシクロスポリンＡを概ね倍量とプレドニゾロンを
投薬して管理を継続したところ予後は良好に回復しＧＶ
ＨＤは寛解するに至った。また、ＧＶＨＤ陽性と判定さ
れなかった患者はそのまま移植骨髄が生着を続け、病態
として特に問題はなかった。According to the detection method of the present invention, two out of seven
It was determined to be VHD positive. In addition, of the two persons (Mr. A and B) determined to be GVHD positive, Mr. A caused acute III-degree GVHD in the intestinal tract and skin on the 21st day after transplantation. On the 34th day after transplantation, Mr. B
Caused a second degree of acute GVHD. The prognosis was well recovered and the GV was improved after administration of each patient with cyclosporine A and double dose of prednisolone.
HD is in remission. In the case of patients who were not determined to be GVHD-positive, the transplanted bone marrow continued to survive, and there was no particular problem as a pathological condition.

【００５１】＜ＵＴＩ量の測定方法および測定キット＞ 実施例２：ラテックス凝集免疫比濁法 ２−ａ）測定方法 比濁計ＬＡ−２０００（Analytical instruments Co.,
LTD,東京）を使用し、ラテックス凝集免疫比濁法を用い
てＵＴＩ量を自動測定する。測定原理は、ポリスチレン
ラテックスビーズ（栄研化学、直径０．１μｍ）にウサ
ギ抗ヒトＵＴＩ抗体をコーティングし、ＵＴＩを３７℃
で反応させ、結果生じるラテックス凝集体の濁度を測定
波長５８５ｎｍで測定する。標準物質は持田製薬（株）
製のＵＴＩを用い、反応時間は反応開始後１００秒と５
００秒の間の４００秒における濁度差から抗原量（ＵＴ
Ｉ）を求める。なお、ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体は、ウリ
ナスタチンをフロイントアジュバント（Difco ，ＵＳ
Ａ）と混合して油中水型エマルジョンをつくりこれをウ
サギに免疫して抗血清を得る。<Method and kit for measuring UTI amount> Example 2: Latex agglutination immunoturbidimetry 2-a) Measurement method Turbidimeter LA-2000 (Analytical instruments Co.,
LTD, Tokyo), and the UTI amount is automatically measured using a latex agglutination immunoturbidimetry. The measurement principle is as follows: polystyrene latex beads (Eiken Chemical Co., 0.1 μm in diameter) are coated with rabbit anti-human UTI antibody,
And the turbidity of the resulting latex aggregate is measured at a measurement wavelength of 585 nm. Reference material is Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
The reaction time was 100 seconds and 5 minutes after the start of the reaction.
From the turbidity difference at 400 seconds between 00 seconds, the amount of antigen (UT
Find I). In addition, rabbit anti-human UTI antibody was prepared by using urinastatin in Freund's adjuvant (Difco, US).
A water-in-oil emulsion is prepared by mixing with A), and this is immunized in a rabbit to obtain an antiserum.

【００５２】２−ｂ）測定キット <1> ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体をコーティングしたポリス
チレンラテックスビーズ <2> 標準物質 その他：必要に応じ、比濁計（例：ＬＡ−２０００）2-b) Measurement kit <1> Polystyrene latex beads coated with rabbit anti-human UTI antibody <2> Standard substance Others: If necessary, nephelometer (eg, LA-2000)

【００５３】実施例３：酵素法 ３−ａ）測定方法 Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロア
ニリドを基質とし、ウシ膵トリプシン（シグマ社）によ
る分解を阻止しうる尿中ＵＴＩ値をＵＴＩ等量として、
ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ（ロッシュ社）を用いて自動測定
する。Example 3: Enzymatic method 3-a) Measurement method UTI value in urine which can prevent degradation by bovine pancreatic trypsin (Sigma) using N-α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide as a substrate Is the UTI equivalent,
Automatic measurement using COBAS FARA (Roche).

【００５４】３−ｂ）測定キット <1> 基質（Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリド) <2> ウシ膵トリプシン（シグマ社) <3> ＵＴＩ標準品3-b) Measurement kit <1> Substrate (N-α-benzoyl-DL-arginine-p
-Nitroanilide) <2> Bovine pancreatic trypsin (Sigma) <3> UTI standard

【００５５】実施例４：サンドイッチ法 ４−Ａ．測定方法（ポリクロナール抗体使用） ４−Ａ−１−ａ）尿中のＵＴＩ測定方法 ＵＴＩに対するポリクロナール抗体を用いた１ステップ
サンドイッチＥＩＡ法により試料中のＵＴＩ量を定量す
る。具体的には、ＵＴＩ抗体を固相化したプレート（９
６ウェル：ＮＵＮＣ社製）に、１０００倍希釈した試料
２０μＬを分注し、ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体溶
液（０．２５μｇ／ｍＬ）８０μＬを添加して３７℃で
３０分間反応させる。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む生理食塩水でプレートを洗浄し、基質溶液（テ
トラメチルベンジジン、ＢｉｏＦＸＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社）を加えて反応させ（遮光下、室温１０分）、
０．５Ｍ硫酸１００μＬにて停止した後マイクロプレー
トリーダー（ＴＨＥＲＭＯｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ社）４５０ｎｍ（副波長６３０ｎｍ）の
吸光度を測定する。ＵＴＩ標準品を用いた同様の操作か
ら得られた標準曲線に基づいて試料中のＵＴＩ量を算出
する。Example 4 Sandwich Method 4-A. Measurement method (using polyclonal antibody) 4-A-1-a) UTI measurement method in urine The amount of UTI in a sample is quantified by a one-step sandwich EIA method using a polyclonal antibody against UTI. Specifically, UTI antibody-immobilized plate (9)
20 μL of a 1000-fold diluted sample is dispensed into 6 wells (manufactured by NUNC), and 80 μL of a peroxidase-labeled UTI antibody solution (0.25 μg / mL) is added, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 0.05% Tween2
The plate is washed with a saline solution containing 0, substrate solution (tetramethylbenzidine, BioFXLaborator).
iss) and allowed to react (under light shielding, at room temperature for 10 minutes),
After stopping with 100 μL of 0.5 M sulfuric acid, a microplate reader (THERMOmax, Molecular)
Devices) absorbance at 450 nm (subwavelength 630 nm). The UTI amount in the sample is calculated based on a standard curve obtained from the same operation using a UTI standard.

【００５６】４−Ａ−１−ｂ）測定キット構成 <1> ＵＴＩ抗体（ポリクロナール抗体もしくはモノクロ
ナール抗体）を固相化したプレート <2> ペルオキシダーゼ標識ＵＴＩ抗体溶液 <3> 基質溶液 その他付属品として、 <4> プレート洗浄液 <5> 試料希釈液 <6> 反応停止液 <7> マイクロプレートリーダー <8> ＵＴＩ標準品4-A-1-b) Composition of assay kit <1> Plate on which UTI antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) is immobilized <2> Peroxidase-labeled UTI antibody solution <3> Substrate solution Other accessories , <4> Plate washing solution <5> Sample diluent <6> Reaction stop solution <7> Microplate reader <8> UTI standard

【００５７】４−Ａ−２−ａ）血中のＵＴＩの測定方法 血液５０μＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに
とり、生理食塩水１５０μＬ、次いで４０％過塩素酸水
溶液５０μＬを添加し、約５秒攪拌する。１５０００ｒ
ｐｍで１０分遠心し、上清１００μＬを分取する。更に
０．８ＭＮａＯＨ１５０μＬ、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）５０μＬを添加混合して３００μＬの１
５倍希釈試料とする。この希釈試料に尿中ＵＴＩキット
希釈液を加え９００倍希釈試料とする。この試料２０μ
Ｌを用いて４−Ａ−１−ａ）のプロトコールに従って血
中のＵＴＩ量を測定する。なお、この前処理方法を使用
して、全血以外の血清、血漿（ＥＤＴＡ、クエン酸、ヘ
パリン採血）中のＵＴＩを測定可能である。4-A-2-a) Method of measuring UTI in blood 50 μL of blood is placed in a 1.5 mL Eppendorf tube, 150 μL of physiological saline and then 50 μL of a 40% aqueous solution of perchloric acid are added, and the mixture is stirred for about 5 seconds. I do. 15000r
Centrifuge at pm for 10 minutes, and collect 100 μL of the supernatant. Further, 150 μL of 0.8 M NaOH, 1 M Tris-HCl
(PH 8.0) 50 μL was added and mixed, and 300 μL of 1 was added.
Use a 5-fold diluted sample. Urine kit diluent in urine is added to this diluted sample to make a 900-fold diluted sample. This sample 20μ
Using L, the UTI level in the blood is measured according to the protocol of 4-A-1-a). In addition, UTI in serum and plasma (EDTA, citrate, heparin blood collection) other than whole blood can be measured using this pretreatment method.

【００５８】４−Ａ−２−ｂ）血中ＵＴＩの測定キット ４−Ａ−１−ｂ）の尿中ＵＴＩ測定キット<1> 〜<8> に
更に以下の構成を付加する。 <9> ４０％過塩素酸水溶液 <10>生理食塩水 <11>０．８ＭＮａＯＨ水溶液 <12>１ＭTris-HCl（ｐＨ８．０） その他：小型遠心機4-A-2-b) Kit for measuring UTI in blood The following components are further added to the kits for measuring UTI in urine <1> to <8> of 4-A-1-b). <9> 40% perchloric acid aqueous solution <10> physiological saline <11> 0.8M NaOH aqueous solution <12> 1M Tris-HCl (pH 8.0) Other: small centrifuge

【００５９】４−Ｂ. 測定法（モノクロナール抗体） ４−Ｂ−ａ） 測定法４−Ａ−１−ａ）もしくは４−Ａ−２−ａ）にお
いてポリクロナール抗体の代わりに後述のＵＴＩモノク
ロナール抗体を使用して、試料（血液）中のＵＴＩ量を
算出する。 ４−Ｂ−ｂ）測定キット ４−Ａ−１−ｂ）もしくは４−Ａ−２−ｂ）の測定キッ
トにおけるポリクロナール抗体に代え後述のＵＴＩモノ
クロナール抗体を用いてキットを構成する。4-B. Assay Method (Monoclonal Antibody) 4-Ba) Instead of the polyclonal antibody in the assay method 4-A-1-a) or 4-A-2-a), a UTI monoclonal antibody described later is used. The amount of UTI in the sample (blood) is calculated using the antibody. 4-B-b) Measurement Kit A kit is constructed using a UTI monoclonal antibody described below instead of the polyclonal antibody in the 4-A-1-b) or 4-A-2-b) measurement kit.

【００６０】（参考例）実施例４のサンドイッチ法で用
いる各種プレートの調整方法を記す。 ｉ）ＵＴＩ抗体固相化プレート マイクロタイタープレート（Immuno module Maxisorp,
Nalge Nunc International）にポリクロナール抗体溶液
１００μＬを分注し、室温で一晩放置して抗体を固相化
し、洗浄後、 0.1％Tween20 溶液および４％ラクトース
溶液でコーティングを行い、乾燥後、乾燥剤とともにチ
ャック付きラミネート袋に保存したものを使用した。Reference Example A method of adjusting various plates used in the sandwich method of Example 4 will be described. i) UTI antibody-immobilized plate Microtiter plate (Immuno module Maxisorp,
100 μL of polyclonal antibody solution was dispensed to Nalge Nunc International), allowed to stand at room temperature overnight to immobilize the antibody, washed, coated with a 0.1% Tween20 solution and a 4% lactose solution, dried, and dried together with a desiccant. The one stored in a laminate bag with a zipper was used.

【００６１】iiａ）ＵＴＩポリクロナール抗体 日本白色家兎に２週間に１回、耳静脈に精製ＵＴＩ溶液
（持田製薬（株）製ＵＴＩ５００μｇ／ｍＬ）を投与し
た。採血した抗血清より、ＵＴＩとの反応性を指標に反
応性の高い抗血清を選択した。抗血清は５０％飽和硫酸
アンモニウムで塩析後、Protein A Sepharose カラム
（アマシャム・ファーマ・バイオテック）にて精製し、
ポリクロナール抗体とした。Iia) UTI polyclonal antibody A Japanese white rabbit was administered with a purified UTI solution (500 μg / mL UTI, manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) via the ear vein once every two weeks. From the collected antisera, an antiserum with high reactivity was selected based on the reactivity with UTI as an index. The antiserum was salted out with 50% saturated ammonium sulfate, and then purified with a Protein A Sepharose column (Amersham Pharma Biotech).
A polyclonal antibody was used.

【００６２】iiｂ）ＵＴＩモノクロナール抗体 精製ＵＴＩ（１００μｇ）をフロイント完全アジュバン
トと混合し雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５−１０週齢）の腹
腔に投与した。最終投与３日後にマウス脾臓よりリンパ
球を採集し、ポリエチレングリコールを用いてミエロー
マ（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１）と融合した。定法
に従いＨＡＴセレクションを行いハイブリドーマを作成
し、精製ＵＴＩとの結合を指標によりＥＬＩＳＡ法に
て、ヒトＵＴＩと反応するモノクロナール抗体を得た。
得られたハイブリドーマを無血清培地（ＰＦＨＭ−II 、
ＧＩＢＣＯ）で培養し、上清中に産生した抗体をＰｒｏ
ｔｅｉｎ−Ａカラム（アマシャムファルマシアバイオテ
ク）を用いて精製し、モノクロナール抗体とした。Iib) UTI monoclonal antibody Purified UTI (100 μg) was mixed with Freund's complete adjuvant and administered to the peritoneal cavity of female BALB / c mice (5-10 weeks old). Three days after the final administration, lymphocytes were collected from the mouse spleen, and fused with myeloma (P3 × 63-Ag.8.8.1) using polyethylene glycol. HAT selection was carried out according to a standard method to prepare a hybridoma, and a monoclonal antibody which reacts with human UTI was obtained by ELISA using binding to purified UTI as an index.
The obtained hybridoma was used in a serum-free medium (PFHM-II,
GIBCO) and the antibody produced in the supernatant was purified by Pro.
Purification was performed using a tein-A column (Amersham Pharmacia Biotech) to obtain a monoclonal antibody.

【００６３】iii ）酵素標識ＵＴＩ抗体の作成 中根らの方法（Peroxidase-labeled antibody ：a new
method of conjugation ：２２巻、１０８４−１０９１
頁、１９７４年）に従い、ペルオキシダーゼ（東洋紡社
製）を過ヨウ素酸により活性化し、ＵＴＩポリクロナー
ル抗体と反応させた。反応後、透析を行い、ペルオキシ
ダーゼ標識ＵＴＩ抗体を得た。使用した抗体量を液量で
割ったものを濃度とした。Iii) Preparation of enzyme-labeled UTI antibody Nakane et al.'S method (Peroxidase-labeled antibody: a new
method of conjugation: 22 volumes, 1084-1091
Page, 1974), peroxidase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was activated with periodate and reacted with UTI polyclonal antibody. After the reaction, dialysis was performed to obtain a peroxidase-labeled UTI antibody. The concentration obtained by dividing the amount of the used antibody by the amount of the solution was used.

【００６４】[0064]

【発明の効果】本発明のＧＶＨＤの検出方法ならびにキ
ットにより、ＧＶＨＤ発症を早期に的確に検出すること
が可能になる。とりわけ骨髄移植患者におけるＧＶＨＤ
の早期検出に有用である。また、本発明の検出方法によ
り、急性ＧＶＨＤの進展をモニターしつつ患者に対し薬
物による的確な予防および／または治療が可能となる。According to the method and kit for detecting GVHD of the present invention, the onset of GVHD can be detected early and accurately. GVHD especially in bone marrow transplant patients
It is useful for early detection of Further, the detection method of the present invention enables accurate prevention and / or treatment of a patient with a drug while monitoring the progress of acute GVHD.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 移植前後の尿中ＵＴＩ量の変化を示すグラフ
である。FIG. 1 is a graph showing changes in the amount of UTI in urine before and after transplantation.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 真嗣 大阪府大阪市西区南堀江１−14−28 ヤマ ゴビル７Ｆ (72)発明者 加藤 克明 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA25 CA25 CA26 CB03 DA44 FA26 FA29 FB01 FB03 FB07 FB12 FB13 GC15  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (72) Inventor Shinji Yamada 1-14-28 Minamihorie, Nishi-ku, Osaka-shi, Osaka Yamago Building 7F (72) Inventor Katsuaki Kato 1-7-7 Yotsuya, Shinjuku-ku, Tokyo Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. F term (reference) 2G045 AA16 AA25 CA25 CA26 CB03 DA44 FA26 FA29 FB01 FB03 FB07 FB12 FB13 GC15

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒトから採集された試料中のＵＴＩの量を
測定することを特徴とするＧＶＨＤの検出方法。1. A method for detecting GVHD, comprising measuring the amount of UTI in a sample collected from a human. 【請求項２】骨髄移植におけるＧＶＨＤの検出を目的と
する請求項１に記載のＧＶＨＤの検出方法。2. The method for detecting GVHD according to claim 1, which is for detecting GVHD in bone marrow transplantation. 【請求項３】前記試料として、尿を用いることを特徴と
する請求項１ないし２記載のＧＶＨＤの検出方法。3. The method for detecting GVHD according to claim 1, wherein urine is used as said sample. 【請求項４】少なくとも前処置前、移植日、および移植
後白血球回復期の３点で、試料中のＵＴＩの存在を測定
する工程を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載
のＧＶＨＤの検出方法。4. The method according to claim 1, further comprising the step of measuring the presence of UTI in the sample at least at three points before the pretreatment, the date of transplantation, and the leukocyte recovery period after transplantation. GVHD detection method. 【請求項５】前処置前、移植日、および移植後白血球回
復期の３点で、試料中のＵＴＩの存在を測定する工程を
含んでなり、試料中のＵＴＩ量の測定値が、下記関係式
（１）を満たすことを、ＧＶＨＤの発症の指標として判
定することを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載
のＧＶＨＤの検出方法； ｛（ｃ）−（ｂ）｝／｛（ｂ）−（ａ）｝＞０ （１） 式中、 （ａ）：前処置前での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｂ）：移植日での試料中のＵＴＩ量の測定値 （ｃ）：移植後白血球回復期での試料中のＵＴＩ量の測
定値。5. The method according to claim 1, further comprising the step of measuring the presence of UTI in the sample at three points before the pretreatment, the transplantation date, and the leukocyte recovery period after the transplantation. The method of detecting a GVHD according to any one of claims 1 to 3, wherein the satisfaction of the expression (1) is determined as an index of the onset of the GVHD; {(c)-(b)} / ｛. (B)-(a)｝> 0 (1) where (a): the measured value of the UTI amount in the sample before the pretreatment (b): the measured value of the UTI amount in the sample on the day of transplantation ( c): Measurement of the amount of UTI in the sample during the leukocyte recovery period after transplantation. 【請求項６】ＵＴＩの定量を行なって急性ＧＶＨＤを診
断するために用いられるＵＴＩ測定キット。6. A UTI measurement kit used for diagnosing acute GVHD by quantifying UTI. 【請求項７】免疫反応により試験試料中のＵＴＩを測定
する手段を有する急性ＧＶＨＤの測定キット。7. A kit for measuring acute GVHD, comprising a means for measuring UTI in a test sample by an immune reaction.