JP2000505544A - 肝臓移植レシピエントを含めた個体の肝状態の決定法 - Google Patents
肝臓移植レシピエントを含めた個体の肝状態の決定法Info
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Abstract
(57)【要約】
対象の肝状態を決定する方法は、前記対象からの体液の試料中のパイグルタチオンS−トランスフェラーゼ(πGST)イソ型のレベルを、πGSTイソ型に特異的な免疫検定によって測定し、その測定されたπGSTのレベルを、前記体液中のπGSTの正常範囲と比較し、そして前記正常範囲に相対してπGSTレベルの増加が検出される場合、前記体液中のπGSTのレベルに基づいて対象の肝状態を決定することを含む。一次的移植片拒絶反応は、概して、胆管樹状構造で起こるので、該方法は、肝臓移植の場合に、移植後の極めて初期段階に拒絶反応の起こる可能性を決定することができる特別な用途を有する。
Description
【発明の詳細な説明】
肝臓移植レシピエントを含めた個体の肝状態の決定法技術分野
本発明は、肝臓移植レシピエントを含めた対象の肝状態を決定し、そしてそれ
によって、必要ならば、その肝状態によって適当な療法または矯正作用について
決定する方法に関する。背景技術
様々な種類の肝損傷を区別する能力は、移植患者および胆管系に影響しうる他
の肝疾患に苦しむ個体両方の治療において極めて重要である。
グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)は、主として、等電点によっ
て規定されるアルファ(αGST)、ミュー(μGST)、パイ(πGST)お
よびシータクラス(θGST)イソ型から成るタンパク質の多重遺伝子族を含み
、そして主としてグルタチオンに対する結合により、ある範囲の生体内異物の解
毒化に関与している(Beckett,G.J.およびHayes,J.D.,Advances in Clinical C
hemistry(1993);30,281-380)。概して、それらタンパク質は、2個の25〜2
7kDaサブユニットから成る事実上の二量体であり、そしてホモ二量体または
ヘテロ二量体の形で存在しうる。パイグルタチオンS−トランスフェラーゼ(π
GST)はホモ二量体であり、そして肝臓内の胆管上皮細胞の細胞質中に存在し
ている(Beckett,G.J.およびHayes,J.D.(1993)上記)。αGSTは、肝臓内の肝
細胞中に存在することが知られ、そしてホモ二量体およびヘテロ二量体両方の状
態で存在する(Campbell,J.A.H.ら,Cancer(フィラデルフィア)(1991)67,1608
-1613;Howie,A.F.ら,Clin.Chem.Acta.,(1988)177,65-76)。αおよびπGST
のこの不均一なGST分布は、種々のイソ酵素が種々の肝部分において独特のin
vivo機能を有することを示唆している(Campbell,J.A.H.ら,(1991)上記)。
EP−A0640145号は、肝臓移植レシピエントにおける拒絶反応の初期診断の
助けとなり、しかも血漿または血清トランスアミナーゼが不存在であるかまたは
それが何等かの変化をする前のレシピエントからの血漿または血清αGSTの増
加を測定することを含む方法を開示している。したがって、血漿αGSTレベル
の測定は、移植片拒絶反応についての極端に感度が高いが完全に特異的ではない
マーカーとして作用することによって移植後肝状態の監視を容易にすることが最
終的に示された。
注目に値するのは、πGSTが移植片拒絶反応のマーカーとして可能であると
考えられていなかったことである。おそらくは、この事実は、肝臓の胆管上皮細
胞中に存在する酵素の低レベルによると思われる。しかしながら、αおよびπG
STは、放射性免疫検定によって測定されたように、正常個体および特定の癌(
例えば、胆管癌)に苦しむ人々両方からの胆汁中に存在するといういくつかの証
拠がある(Howie,A.F.ら,Clin.Chem.Acta.,(1989)184,269-278)。更に、幾人
かの著者は、πGSTが悪性組織において特異的に発現されるらしいことから、
血清および血漿πGSTレベルの測定が、悪性腫瘍の診断を容易にしうるという
ことを論及した(Niitsu,Y.ら,Cancer(1989)63,317-323;Howie,A.F.ら,Clin.
Chem.(1990)36(3),453-456,およびHida,T.ら,Cancer(1994)73(5),1377-1382)
。前述の著者らで、πGSTが、移植された肝臓拒絶反応または他の肝臓/胆管
疾患の予想においてある役割を果たしうるということに言及したものはいなかっ
た。
一次的移植片拒絶反応は、概して、肝臓内の胆管樹状構造で起こることが知ら
れているので(Ascher,N.,(1993)“Immunology of liver transplantation”,N
euberger,J.およびAdams,D.(監修)中)、胆汁または血漿πGSTレベルの具体
的な測定が、初期拒絶反応の診断を可能にしうるしまたは移植後肝細胞若しくは
胆管損傷の区別を容易にしうると考えられる。非特異的肝損傷と移植片拒絶反応
とを区別する重要性は、それぞれの状態の処置が全く異なるので、誇張して述べ
ることはできない。更に、間違った処置の開始は、既に重病の個体の健康にとっ
て極めて有害でありうる。例えば、移植片損傷がウイルス感染によって起こる場
合(例えば、C型肝炎再感染またはサイトメガロウイルス(CMV)、過剰の免
疫抑制剤(例えば、シクロスポリンAまたはFK506)は、ウイルス感染と戦
う能力を有意に損なうと考えられるので、抗拒絶反応免疫抑制処置のレベルを
注意深く監視する必要がある。逆に、非特異的移植片損傷から本来の拒絶反応を
認識できないことは、免疫抑制療法の増加を遅らせ、そしてついには、移植片除
去をもたらすことがありうる。
したがって、肝臓の様々な疾患状態または異常状態における個体の肝状態を決
定する方法が必要とされている。発明の開示
本発明は、対象の肝状態を決定する方法であって、前記対象からの体液の試料
中のパイグルタチオンS−トランスフェラーゼ(πGST)イソ型のレベルを、
πGSTイソ型に特異的な免疫検定によって測定し、その測定されたπGSTの
レベルを、前記体液中のπGSTの正常範囲と比較し、そして前記正常範囲に相
対してπGSTレベルの増加が検出される場合、前記体液中のπGSTのレベル
に基づいて対象の肝状態を決定することを含む上記方法を提供する。
特定の肝部位に対して特異的なマーカーに基づいて肝状態を決定するもう一つ
の方法を提供することにより、以下で更に詳細に記載される肝臓の様々な疾患状
態および他の異常状態を有する患者の治療が大いに促進される。
対象は、適当に肝臓移植レシピエントであり、そして肝状態は移植後に決定さ
れる。
本発明は、肝臓移植の場合に特別な用途を有するが、これは、一次的移植片拒
絶反応が、概して、上述のように肝臓内の胆管樹状構造で起こるので、移植後の
極めて初期段階に拒絶反応の起こる可能性を決定することができるためである。
したがって、肝臓移植拒絶反応のもっと初期の検出は、EP−A0640145号で記
載され且つ請求の範囲に記載された方法に相対して、本発明による方法で可能で
ある。
好ましくは、レシピエントはヒトである。
免疫検定は、好ましくは、酵素免疫検定、特に、サンドイッチ酵素免疫検定で
ある。
本発明による方法は、培地の範囲内であるが、特に、胆汁、血漿および血清中
でπGSTを測定するのに用いることができる。
本明細書中で体液とは、例えば、胆汁、血漿、血清および尿などの体液並びに
組織支持培地および灌流液を意味する。本明細書中において体液は、概して、基
質とも称される。
本発明による方法は、胆汁中のπGSTイソ酵素レベルの検出を初めて容易に
する。
体液が胆汁である場合、正常πGSTレベルは15μg/L未満である。
体液が血漿である場合、正常πGSTレベルは100μg/L未満である。
以下で示されるように、その方法を血漿について行う場合、血漿を集め且つ貯
蔵した後、その貯蔵期間中にほとんど溶血を起こさせない条件下において抗凝固
薬の存在下で決定することに注意すべきである。
本発明者は、フルオロオキシレート試験管の使用が、高度の溶血を引き起こし
て赤血球からπGSTを放出させ、これが誤った高レベルのπGSTを与えるこ
とを見出した。他のGSTイソ酵素は、血液中で見出されないかまたは極めて低
レベルで存在する。例えば、μGSTは白血球中に存在する。しかしながら、そ
れが赤血球中に存在するかどうかについては、文献から明らかではない。いずれ
にせよ、μGSTは集団の50%で存在するにすぎない。θGSTは、μGST
の場合と同様の個体間変動を示し、そして血液中に存在する場合、極めて低レベ
ルで存在する。αGSTは、血液中に全く存在しない。
好ましい実施態様では、抗体−抗原反応を最適にする有効量のタンパク質を含
有する希釈剤で試料を希釈する。
本発明者は、その希釈剤が、このような免疫測定法において標準試薬として慣
用的に用いられるトゥイーン20を含む場合、間違ったπGST濃度が検出され
ることを見出した。本発明者は、抗体−抗原反応を最適にする有効量のタンパク
質を用いる場合、実施例6で示される直線的滴定が得られることを見出した。
適当に、タンパク質は、ウシ血清フルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの
血清アルブミンである。
本発明による免疫検定法は、実施例で以下に記載のように、2.5時間以内に
完了することができる。これは、πGSTの定量のための商業的に入手可能な検
定のどれよりもかなり速い。
本発明は、したがって、一つの実施態様において、単クローン性抗πGST
IgGで被覆された微量滴定ウェルまたは他の表面に対する試料、抗体−酵素結
合体および基質の逐次的付加に基づく、2.5時間以内に完了できる免疫検定を
提供する。得られた色の強さは、試料中に存在するπGSTの量に比例し、そし
てその検定範囲は0〜100μg/Lである。検定範囲は、試料希釈度を増加さ
せることによって容易に広げられる。
本発明のもう一つの実施態様により、更に、前記対象での移植片拒絶反応と非
特異的肝細胞損傷との区別を容易にするために、アルファグルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼ(αGST)イソ型のレベルを前記対象からの体液の試料中で測
定する。
本発明はまた、上記で定義の方法を実施するための1種類またはそれ以上の成
分含有する試験キットまたはパックを提供する。図面の簡単な説明
添付図面において、
図1は、実施例1のサンドイッチ酵素免疫検定の略図である;
図2は、実施例1で記載のヒトπGSTについての酵素免疫検定によるπGS
T対数濃度(μg/L)に対する450/630nmでの吸光度のプロットであ
る;
図3は、ヒトμ、αおよびπGSTのSDS−PAGE分析である;
図4は、ヒトπGSTのイムノブロット分析である;
図5は、多数の患者の再灌流後の時間(時)に対する胆汁中のαGSTおよび
πGSTの(ng/ml)のプロットである;
図6は、多数の患者の時間(日)に対するπGSTのプロットである;そして
図7は、一人の患者の移植後の日数に対するAST/ALT(U/L)および
αGSTおよびπGSTの(ng/ml)のプロットである。発明の実施態様
本発明を次の実施例によって更に詳しく説明する。
製造例A ヒトπGSTの精製
πGSTを、アフィニティークロマトグラフィーによってヒト胎盤から精製し
た。精製手順の正確な詳細は次の通りである。
a. ヒト胎盤325gを、均一化緩衝液中において胎盤1部対緩衝液3部の
比率で、Waring(Waringは商標である)ブレンダーを用いて2分間均一化した。
均一化緩衝液は、次の組成を有した。
20mMトリス−HCl
250mMスクロース
5mM EDTA pH7.8
2μg/mlロイペプチン
2μg/mlペプスタチン
b. 胎盤ホモジネートを10000gで60分間遠心分離した。
c. 次に、その上澄みを、200mM NaCl含有20mMトリス−HC
l,pH7.8中で予め平衡されたグルタチオン(GSH)−セファロースアフ
ィニティーカラム上に充填した。平衡緩衝液を再度加えて、非結合タンパク質を
溶離した。最後に、5mM GSH含有50mMトリス−HCl pH9.5を
用いて、結合GSTをアフィニティーカラムから溶離した。
d. 次に、溶離した材料を、0.1M PBSに対して透析した。
製造例B 抗体生産および精製:
精製ヒトπGSTを、下記に与えられた日程にしたがってニュージーランドホ
ワイトウサギに皮下(s.c.)注射し、そして血清の抗πGST反応性について評
価した。IgG[抗ヒトπGST]力価が、半定量的ドットブロット分析によっ
て測定したところ充分になったら、その被験動物から全採血し、そして血清を集
めた。全IgGをウサギ血清からプロテインAアフィニティークロマトグラフィ
ーによって精製し、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に対
する結合に用いた。腹水としての単クローン性IgG[抗ヒトπGST]は、ナ
イメーヘン,オランダの大学病院から入手され、そして使用前に更に精製されな
かった。免疫感作計画(概略): 1日目:ウサギの耳からプレ血清5mlの試験採血を行った。ヒトπGST抗
原0.5ml(100μg)を等容量のフロイント完全アジュバントと混合した
。その抗原およびアジュバントの混合物を均一化して、確実に充分なエマルジョ
ンとした。次に、この混合物を、予め毛を剃り落とされたウサギの背面上の多数
の部位に皮下注射した。
28日目:ウサギの耳から血清5mlの試験採血を行った。抗原0.5ml(
100μg)を等容量のフロイント不完全アジュバントと混合した。その抗原/
アジュバント混合物を均一化して、確実に充分なエマルジョンとした。次に、こ
の混合物を、ウサギの背面上の多数の部位に皮下注射した。
42日目:ウサギの耳から血液10mlの試験採血を行った。
56日目:ウサギに対する2回目のブースター投与を、28日目について記載
のように与えた。
70日目:ウサギの耳から血液10mlの試験採血を行った。力価が充分に高
くなった時点でそのウサギを屠殺し、そして可能な限り多量の血液を集めた。
製造例C イムノブロット法
次の実施例で用いるための多クローン性および単クローン性IgG全部を、ヒ
トαおよびμGSTに対するπGST反応性および可能性のある交差反応性につ
いてそれぞれ、次のイムノブロット組合わせによって検査した。
(a)ウサギIgG[抗ヒトπGST]を用いて、固定されたヒトα、πおよ
びμGSTを含有するニトロセルロース膜をプローブした。
(b)ネズミIgG[抗ヒトπGST]を用いて、固定されたヒトα、πおよ
びμGSTを含有するニトロセルロース膜をプローブした。
イムノブロット検出に用いられた方法は、次の通りであった。
1. ヒトα、πおよびμGST(0.5μg/トラック)を、15%SDS
−PAGE上で電気泳動させ、分子量マーカーも包含された。
2. 電気泳動後、そのポリアクリルアミドゲルを切取り、そして半分をタン
パク質について染色し、その残りをニトロセルロース上への電気泳動転移に用い
た。
3. 電気泳動転移後、そのニトロセルロース膜を、0.05%(w/v)ト
ゥイーン20含有リン酸緩衝溶液(PBST)すなわち遮断用緩衝液中5%(w
/v)Marvel(Marvelは商標である)で1時間遮断した。
4. 次に、次の溶液を調製した。
(i) PBST中1%(w/v)Marvel中のウサギIgG[抗ヒトπGS
T]
(ii) PBST中1%(w/v)Marvel中のネズミIgG[抗ヒトπGS
T]
そして遮断用緩衝液をデカントしたら、これらを膜に対して加えた。
抗体溶液とのインキュベーションを1時間続けた。
5. 次に、ニトロセルロース膜をPBST中で洗浄した(各5分間2回)。
6. 次に、抗ウサギIgG−HRP結合体を製造し(PBST中1%(w/
v)Marvel中で1/1000)、そして上の4(i)に対して加えた。抗ネズミ
IgG−HRP結合体も製造し(1/1000)、そして上の4(ii)に対して
加えた。
7. 抗種結合体との1時間のインキュベーション後、試薬を捨て、そして上
の5の場合と同様に膜を洗浄した。
8. 次に、ジアミノベンジジン基質を製造し、そして膜に対して加えた。
正の反応は、ニトロセルロース膜上の褐色沈降によって示された。
製造例D 抗πGST IgG−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合体合 成:
抗πGST IgG−HRP結合体を、チオエーテル結合法を用いて合成した
。
(Duncan,R.J.S.ら(1983);Anal.Biochem.132,68-73)反応性マレイミド基を、SM
CC(スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン1−カル
ボキシレート)を用いてIgG分子上に導入し、そしてマスキングされたスルフ
ヒドリル基をHRPに対して結合した。反応性スルフヒドリル基を生じる脱マス
キング工程後、マレイミドで活性化されたIgGおよびHRP−SHを一緒に混
合し且つ4.5時間反応させた。チオエーテル共有結合によって形成されて得ら
れたIgG−HRP結合体を50%(v/v)グリセロールに加え、そして
実施例1のEIAで用いるために−20℃で貯蔵した。
実施例1 サンドイッチ酵素免疫検定
ヒトπGSTの定量的検出のための免疫検定の形式は、図1で図示され且つ下
記で記載される慣用的なサンドイッチ形式である。
a. Nunc Maxisorp(Nunc Maxisorpは商標である)微量滴定プレートを、ヤ
ギF(ab)2フラグメント[抗マウスIgG]によって固定されたネズミ単ク
ローン性IgG[抗ヒトπGST](製造例Bで論及された)で被覆した。この
抗体被覆法は、Mab結合部位を位置付けるのに役立ち、そして更に、付着で誘
導される捕捉抗体の変性を最小限にすることによって検定感度を向上させる。
b. 製造例Aで記載のように胎盤から精製されたヒトπGSTを検定標準物
質として用いた。
c. テトラメチルベンジジン基質(TMB)と結合したIgG[抗ヒトπG
ST]−HRP結合体を用いて、捕捉された/固定されたαGSTの検出を促進
した。
d. 酵素反応を、1N H2SO4の添加によって停止させ、そして吸光度を
450nmで基準波長として630nmを用いて測定した。色の強さはπGST
濃度に比例するので、濃度(μg/L)に対するA450/630nmのプロットを作成
した後、未知試料の濃度を決定することができる(図2を参照されたい)。全検
定時間は2.5時間未満であった。
全検定時間は、2時間15分であることが判ったが、検定条件には、試料およ
び結合体それぞれのインキュベーション工程中に微量滴定プレートを一定温度で
振とうすることが含まれた。TMB基質インキュベーションは、一定温度条件の
みを必要とした。
実施例2 πGSR分析用の胎盤の採取
血漿中のπGSTレベルに対する種々の一般的に用いられる抗凝固薬(エチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)、リチウムヘパリン、クエン酸ナトリウムおよび
フルオロオキシレート)および他の血漿採取試験管(血小板阻害剤含有)の作用
を調べた。試料を静脈穿刺によって特定の抗凝固薬が入っている試験管中に集め
た。血漿を遠心分離(6,000g10分間)によって分離し、そして残留する
血小板を追加の遠心分離工程(10,000g10分間)によって除去した。上
澄みを取り出し、そして実施例1で記載のプロトコールを用いて試料を検定した
。
多数の個体から血漿を一連の血漿採取試験管中に集めた。それぞれの試料を上
記のように処理し、そして血漿中へのπGSTの放出を24時間にわたって監視
した。下記の表1は、4種類の異なった血漿採取試験管中に集められ、T0およ
びT24で検定された同じ個体からの血漿中のπGSTレベルを示す。結果は、
上の抗凝固薬のいずれの存在下においても、採取された血漿中のπGST濃度に
は有意の差がないことを示す。未分離の血漿を最大24時間まで貯蔵した場合、
(赤血球または血小板からのπGSTの放出によって引き起こされる)πGST
濃度の有意の増加は見られない。例外はフルオロオキシレート試験管であり、そ
こでは大規模な溶血が起こって、赤血球からπGSTを放出させ、そして表1で
示されるようなタンパク質の誤った高レベルを与えた。
表1 血漿中のπGST分析での血漿採取試験管中の抗凝固薬の影響の比較。 値はμg/Lで与えられる。 表1から、上の抗凝固薬のいずれの存在下においても、採取された血漿中のπ
GST濃度間には有意の差がないことが分かる。
実施例3 免疫検定試薬の純度の評価
図3は、ウサギに免疫感作する前に製造例Aの手順によって得られたヒトπG
STの純度を例示し、そしてほかの場合には低下した検定特異性の原因となりう
る他のヒト由来タンパク質が全く存在しないことを確証する。図3において、
列1=μGST
列2=αGST
列3=πGST
列4=分子量マーカー。
単クローン性抗体反応性のイムノブロット分析は、IgG[抗ヒトπGST]
がヒトπGSTに極めて特異的であったが、ヒトαまたはμGSTとの有意の交
差反応性を全く示さなかったことを示した。結果を図4で示す。
列1=πGST
列2=分子量マーカー。
知見は、表2で示されるように、ヒトπGST特異的酵素免疫検定におけるαお
よびμGST反応性の欠如によって支持された。
表2 ヒトπGSTの検出のための酵素免疫検定における ヒトαGSTおよびμGST反応性の評価。 表2から、この検定においてαGSTにもμGSTにも交差反応性が見られな
いことは明らかである。
このことの意味は、それが、ヒトπGST定量のための酵素免疫検定はヒトπ
GSTの検出に特異的であるということを意味しているので極めて重要である。
したがって、試料中に存在するヒトπGSTはいずれも、交差混入することなく
他のGSTから特異的に検出することができる。
実施例4 胆汁中のπGST定量
具体的な肝臓/胆管損傷を有する患者からの多数の胆汁試料を、ヒトπGST
の検定で調べた。肝細胞癌(HCC)および原発性胆汁性肝硬変(PBC)の患
者は、極めて高レベルのπGSTを有することが判った。胆管石(BDS)の患
者もまた、増加したπGSTレベルを有するが、表3で示されるように、HCC
およびPBCの場合ほど高くないことが判った。
表3 肝細胞癌(HCC)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)および 胆管石(BDS)の患者からの胆汁中のπGST濃度。 これらの試料はいずれも、有意に高いπGSTレベルを示す。
実施例5 πGST定量の臨床的有用性
胆汁および血漿の連続試料を、肝臓移植手術後の患者から採取し、そしてπお
よびαGST両方についてそれぞれ検定した。患者は、平穏無事な回復から急性
拒絶反応およびC型肝炎再感染までの、通常は移植に関係した一定範囲の術後状
態を示した。
胆汁中のπおよびαGST両方の濃度を同時に監視した場合、多数の有意の傾
向が見られた。αGSTは、EP−A0640145号で記載の手順にしたがって測定
された。平穏無事な回復中に、πGSTは、移植後2時間程度に早く検出されう
るが、レベルは低いままであった(すなわち、50μg/L未満)。αGSTレ
ベルは、再灌流損傷のために最初は高かったが、図5で示されたように、2日以
内にベースラインレベルまで戻った。この図は、ヒト肝臓移植中および後のαお
よびπGSTの典型的な経過を示す。πGSTレベルは低いままである。肝臓移
植に関係した合併症も確認されうる。主な危険性の一つは、急性拒絶反応、また
は一層重症のステロイド耐性拒絶反応である。本発明者は、これらの特別な場合
に、図6で示されるように何日間かにわたって持続されたπGSTレベルの有意
の増加があったことを見出した。この図は、ステロイド耐性拒絶反応(SR)お
よび急性拒絶反応(AR)のエピソード中のπGSTレベルを示す。レベルは上
昇し、そして少なくとも20日間にわたって高いままである。αGSTレベルも
また高かったが、それらは5〜8日間以内にベースラインレベルまで戻った。
感染または再感染の可能性は、移植に関係したもう一つ重大な危険性である。
本発明者は、HCV再感染のエピソードにおいて、極めて高レベルのαGSTが
持続した期間にわたって(すなわち、少なくとも25日間)観察されたことを認
めた。しかしながら、πGSTレベルは、図7で示されたように正常に近いまま
であった。これは、前の急性拒絶反応の場合とははっきりと対照をなし、その場
合、逆も真であった。したがって、αおよびπGSTの同時定量により、従来極
めて難しいことが判っていたし、そして移植外科医に治療状のジレンマを与えて
いたことである、急性拒絶反応とHCV再感染とをうまく区別することが可能に
なった。
実施例6 胆汁試料の希釈の直線性
具体的な肝臓/胆管損傷(肝細胞癌および原発性胆汁性肝硬変)を有する患者
から多数の胆汁試料を得、更には、ドナー胆汁および肝臓移植後から試料を得た
。これら試料を、実施例1のプロトコールにしたがってヒトπGSTについて検
定した。
多数の標準的な希釈剤を、胆汁試料の滴定のための試料希釈剤として用いた。
これら希釈剤は、多数の検定システムにおいて日常的に用いられ、トゥイーン2
0が最も一般的に用いられるデタージェントである。本発明者は、しかしながら
、試料希釈剤中のこの特定のデタージェントの存在が、間違った結果を引き起こ
したことを見出した。πGSTの誤って高い濃度は、トゥイーン20含有希釈剤
で希釈された試料中で見られ、表4で示されるような不十分な滴定によって引き
起こされた。トゥイーン20の不存在下で、直線的滴定が見られた。したがって
、
この検定の臨界的因子は、試料希釈剤中のトゥイーン20(標準試薬)の不存在
であり、それが用いられた場合、πGSTの誤って高いレベルが観察されると考
えられる。
表4 トゥイーン20含有および不含希釈剤中のPBC胆汁試料の滴定の比較。 値はμg/Lで与えられる。 直線的滴定は、トゥイーン20不含希釈剤中でのみ観察された。
実施例7 被覆抗体としての多クローン性および単クローン性抗体の比較
多クローン性および単クローン性抗ヒトπGST IgGを、直接的にかまた
はリンカー(ヤギ抗種IgGのF(ab)2フラグメント)によってNunc Maxiso
rpプレート上に固定した。次に、既知の濃度のヒトπGSTの標準を実施例1で
記載のように流し、そして同様の固定IgG濃度での吸光度を比較した。
多クローン性および単クローン性抗体両方を、捕捉抗体として用いるために固
相上に被覆した。多クローン性および単クローン性抗体両方の直接被覆は、標準
曲線に関して極めて低い吸光度読みをもたらした(表5を参照されたい)。固定
がリンカー抗体(ヤギ抗マウス/抗ウサギIgG)によって行われた場合、単ク
ローン性抗体についてO.D.値の有意の増加が得られた。しかしながら、多ク
ローン性抗体ではこのような増加は見られなかった。表5 ヒトπGSTの検出のための被覆法の比較。 固相上への抗体の直接被覆(2μg/mL)は、πGST抗体を一定濃度で含む
リンカー抗体(ヤギ抗種,2μg/mLで)による被覆に匹敵した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 マニング,フィオナ・メアリー
アイルランド国カウンティ・ダブリン,ラ
スク,オーリン・パーク,ザ・クローズ
36
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 対象の肝状態を決定する方法であって、前記対象からの体液の試料中の パイグルタチオンS−トランスフェラーゼ(πGST)イソ型のレベルを、πG STイソ型に特異的な免疫検定によって測定し、その測定されたπGSTのレベ ルを、前記体液中のπGSTの正常範囲と比較し、そして前記正常範囲に相対し てπGSTレベルの増加が検出される場合、前記体液中のπGSTのレベルに基 づいて対象の肝状態を決定することを含む上記方法。 2. 対象が肝臓移植レシピエントであり且つ肝状態を移植後に決定する請求 項1に記載の方法。 3. 対象がヒトである請求項1または2に記載の方法。 4. 免疫検定が酵素免疫検定である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 5. 体液が胆汁であり且つ正常πGSTレベルが15μg/L未満である請 求項1〜4のいずれかに記載の方法。 6. 体液が血漿であり且つ正常πGSTレベルが100μg/L未満である 請求項4に記載の方法。 7. 血漿を集め且つ貯蔵した後、その貯蔵期間中にほとんど溶血を起こさせ ない条件下において抗凝固薬の存在下で決定を行う請求項6に記載の方法。 8. 抗体−抗原反応を最適にする有効量のタンパク質を含有する希釈剤で試 料を希釈する請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 9. タンパク質が血清アルブミンである請求項8に記載の方法。 10.免疫検定全体を2.5時間以内に完了する請求項1〜9のいずれかに記 載の方法。 11.更に、前記対象での移植片拒絶反応と非特異的肝細胞損傷との区別を容 易にするために、アルファグルタチオンS−トランスフェラーゼ(αGST)イ ソ型のレベルを前記対象からの体液の試料中で測定する請求項2〜10のいずれ か1項に記載の方法。 12.請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法を実施するための1種類ま たはそれ以上の成分を含有する試験キットまたはパック。
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