JP2001512307A

JP2001512307A - プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドならびにその作製方法および使用

Info

Publication number: JP2001512307A
Application number: JP53345598A
Authority: JP
Inventors: ドラッカー，ダニエル，ジェイ．
Original assignee: 1149336
Current assignee: 1149336
Priority date: 1997-02-05
Filing date: 1998-02-04
Publication date: 2001-08-21
Also published as: CA2279836A1; WO1998035033A1; EP0981611A1; AU5850798A

Abstract

(57)【要約】エキセンジン４はアメリカドクトカゲ(Gila monster)毒液より最初に単離された生物学的に活性なペプチドである。本発明は、エキセンジンおよび新規ペプチドを含むプロエキセンジンペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに単離された又は組換え体のプロエキセンジンペプチドを包含する。本発明はまた、そのようなペプチドを特異的に認識する抗体をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドならびにその作製方法および使用発明の分野本発明は分子生物学の分野におけるものである。より具体的には、本発明はクローン化された遺伝子、ならび診断、治療および関連用途におけるそれら遺伝子の使用に関する。発明の背景哺乳動物GLP-1に対して52％同一性を示す新規ペプチドのトカゲ毒液からの単離は、エキセンジン(exendin)４と命名されたこのタンパク質の生物学的特性を調べる研究を促した(Eng.ら，（1992）J．Biol．Chem．267，7402-7405)。合成エキセンジン４を用いた実験は、このペプチドが哺乳動物GLP-1と類似の生物学的活性を共有する証拠を提供した。エキセンジン４および末端切断型GLP-1[7-36 ]-アミドは、モルモット腺房細胞調製物におけるcAMPレベルを増大させた(Raufm anら，1992，J．Biol．Chem．267，21432-21437)。そして次に、エキセンジン４はGLP-1受容体に結合し、グルコース依存性インスリン分泌を刺激し、培養された島細胞系においてcAMP蓄積およびインスリン遺伝子発現の両方をin vitroで増大させることが示された(Gokeら，1993，J．Biol．Chem．268，19850-19855)。全長エキセンジン４(1-39)はGLP-1の強力なアゴニストであるが、末端切断型エキセンジン４(9-39)NH₃は、エキセンジン４およびGLP-1両者の競合的アンタゴニストである(Raufman，1996，Regulatory Peptides 61:1-18)。エキセンジンのインスリン向性(insulinotropic)な、GLP-1に類似した特性は、このトカゲ・ペプチドもまた糖尿病患者の治療に有用であるかもしれないことを示唆する。発明の概要爬虫類エキセンジンをコードするポリヌクレオチドが単離され、特徴づけられた。驚くべきことに、単離されたポリヌクレオチドは、エキセンジンのアミノ末端に融合した新規な47アミノ酸ペプチド(47アミノ酸ENTP)をコードするプロエキセンジン（proexendin）多面性(pleiotropic)ペプチドをコードしていた。ENTP の最初の23個のアミノ酸は共通シグナルペプチド配列を形成する。新規ペプチドとエキセンジンの間の融合点には、共通ジペプチジルペプチダーゼ開裂部位が存在する。この部位での開裂は、残基46および47からなる２merおよびエキセンジン４を切断する。さらに、推定されるエキセンジンコード配列のカルボキシル末端に付加的なグリシン残基が見いだされた。この付加的なグリシン残基は、おそらくエキセンジン４の翻訳後プロセシングおよびカルボキシル末端アミド化の間に開裂される。したがって、本発明はプロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドを提供する。１つの実施形態において、本発明はトカゲ・エキセンジン４ペプチドおよび47アミノ酸エキセンジンＮ末端ペプチド(47アミノ酸ENTP)をコードするポリヌクレオチドを提供する。関連する態様において、本発明は47アミノ酸ENTPをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の関連する態様において、本発明は23アミノ酸分泌シグナルペプチドおよび22アミノ酸ENTPをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の態様においては、プロエキセンジンポリヌクレオチドおよびその断片は、構造的に関連したポリヌクレオチドおよび種相同体を同定するための更なる遺伝子クローニングに使用される。本発明の関連する態様においては、プロエキセンジンのアンチセンス版をコードするポリヌクレオチドおよびその断片が得られ、プロエキセンジンの発現を調節するのに用いられる。したがって、本発明はその１態様においてトカゲ・プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードする。本発明の更に別な態様においては、トカゲ・プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。本発明の別な態様においては、プロエキセンジンによってコードされるペプチドは、宿主細胞における組換え産生の産物として提供される。関連する態様においては、プロエキセンジンcDNAを発現する組換え宿主細胞、およびプロエキセンジンによってコードされるペプチドをコードするポリヌクレオチドが選択された宿主細胞において機能する発現制御配列に連結されている発現構築物が提供される。本発明の別な態様においては、実質的に精製された新規なエキセンジンＮ末端プチドおよび実質的に精製されたエキセンジン４(1-40)が提供される。さらに別の態様において、本発明は、例えばプロエキセンジンレベルが変化している状態の診断に用いるための、45アミノ酸ENTP又は22アミノ酸ENTPに対する特異的抗体を提供する。図面の簡単な説明図１は492ポリヌクレオチド配列であり、この配列のヌクレオチド64-465はトカゲ・プロエキセンジン多面性ペプチドをコードしている。図２はトカゲ・プロエキセンジン遺伝子産物の87アミノ酸配列である。破線は新規なENTP配列、およびエキセンジンタンパク質の公表された配列と異なっているプロエキセンジンカルボキシル末端領域を示している。発明の詳細な説明および好ましい実施形態本発明はその１態様においてプロエキセンジンペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドはRNAの形であってもよいし、またはcDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含むDNAの形であってもよい。本発明の１実施形態においては、プロエキセンジン転写産物は図１のポリヌクレオチド配列の核酸64-465によってコードされる。この特定のプロエキセンジンペプチドをコードする核酸は、トカゲ起源のcDNAであって、２個のペプチドをコードする１個の転写産物をコードしている。２個のペプチドとは、図２のアミノ酸48-87として示される40アミノ酸ペプチドである（この点に注意すべきである）エキセンジン４ペプチド；および図２のアミノ酸46および47として示される共通ジペプチジルペプチダーゼ開裂部位を介してエキセンジン４ペプチドのＮ末端に連結している、図２のアミノ酸1-45として示される45アミノ酸ペプチドである。さらに、転写産物のＮ末端に共通シグナルペプチド配列が見いだされ、これは上記２個のコードされるペプチドが細胞から分泌されることを示している。したがって、45アミノ酸ENTPペプチドは、23アミノ酸シグナルペプチド配列および22 アミノ酸ENTPを含むものと思われる。グルカゴンおよびカルシトニン、等のペプチドホルモンをコードする他のポリヌクレオチド配列との類推により、ENTPペプチドはペプチドホルモンとしての生物学的活性を示すことが期待される。本発明は、プロエキセンジンの哺乳動物相同体が存在するという発見にも部分的に基づいている。後述の実施例に示すように、そのような相同体は少なくともマウス心臓、骨格筋および膵臓において発現されている。この情報、ならびに種々の異なる哺乳動物細胞（ヒト、モルモットおよびラットを含む）に対するエキセンジン４の実証された生物学的活性を考慮するならば、プロエキセンジン相同体はあらゆる哺乳動物種において見いだされる可能性がある。本発明のプロエキセンジンヌクレオチド配列は以下のものを含む。すなわち、 (a)図１に示すDNA配列;(b)図２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；(c)高ストリンジェント条件下［例えば、0.5M NaHPO₄，7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)，１mM EDTA中で65℃でフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーション、および0.1xSSC/0.1％ SDS中で68℃で洗浄（Ausubel F.M.ら(編)，1989 ，Current Protocols in Molecular Biology，第１巻，Green Publishing Assoc iates Inc.およびJohn Wiley & Sons，Inc.，New York，p．2.10.3）〕で図１に示すDNA配列の相補体にハイブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列；および(d)中程度にストリンジェントな条件、等の上記よりもストリンジェンシーの低い条件下〔例えば、0.2xSSC/0.1％ SDS中で42℃で洗浄（Ausubelら，1989前掲）〕で図２に示すアミノ酸配列をコードするDNA配列の相補体とハイブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列、である。プロエキセンジンの機能性等価物は、他の種に存在する天然のプロエキセンジン、および天然のものであろうと遺伝子工学的に作製されたものであろうと、プロエキセンジンの機能的活性（すなわち、ペプチドENTPおよびエキセンジンへのプロセシング、エキセンジン受容体への結合、GLP-1のアゴニスト、アデニル酸シクラーゼ産生を刺激、GLP-1のアンタゴニスト）の少なくとも幾つかを保持する突然変異型プロエキセンジンを含む。本発明は配列(a)から(d)の縮重変異型をも包含する。本発明はまた、上のパラグラフに記載のヌクレオチド配列(a)から(d)にハイブリダイズする、そしてそれゆえそれらの相補体である、核酸分子、好ましくはDN A分子を含む。そのハイブリダイゼーション条件は、上に記述したように、高度にストリンジェントであっても、またはそれより低度にストリンジェントであってもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合、高ストリンジェント条件とは、例えば、6xSSC/0.05％ピロリン酸ナトリウム中で37 ℃(14塩基オリゴ)、48℃(17塩基オリゴ)、55℃(20塩基オリゴ)および60℃(23塩基オリゴ)で洗浄することをいう。これらの核酸分子は、例えばプロエキセンジン遺伝子調節に有用なプロエキセンジンアンチセンス分子（および／またはプロエキセンジン遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマー）をコードしてもよいし、または該アンチセンス分子および／またはプライマーとして作用してもよい。プロエキセンジン遺伝子の調節については、そのようなアンチセンスセンス技法を用いて、例えば細胞機能の抑制を調節ことができる。さらに、上記のような配列を、これもまたプロエキセンジン遺伝子調節に有用であるリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として用いることができる。さらに、上記のような核酸分子を、例えば腫瘍細胞の組織型を判定する診断方法の構成要素とすることができる。上述のプロエキセンジンヌクレオチド配列に加えて、当技術分野で周知の分子生物学的技法を用いて過度の実験を行なうことなく、全長プロエキセンジンcDNA または同一種に存在する複数の遺伝子配列および／または他の種に存在するプロエキセンジン遺伝子転写産物の相同体を同定し容易に単離することができる。後述の実施例に示すように、プロエキセンジン転写産物は哺乳動物種および爬虫類動物種の間で保存されている。実際、新規プロエキセンジンの相同体をコードするポリヌクレオチドを、プロエキセンジンを含むことが公知の、または含むと推測されている種々の哺乳動物細胞、好ましくはヒトおよびマウス細胞から単離することができる。特に、唾液腺、骨格筋、心臓および膵臓起源の細胞から単離することができる。１実施形態において、本発明は構造的に関連する核酸を同定するのに有用な道具として、プロエキセンジンポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。例えば、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で核酸ライブラリーをプローブによりつり上げて、プロエキセンジン遺伝子に少なくとも約40％相同な遺伝子を同定することができる。自明なことであるが、特定の種、例えばヒトに由来する相同体を探すのであれば、適切なライブラリーを釣り上げなければならない。トカゲ・エキセンジン遺伝子のエキセンジンをコードする相同体の単離を容易にするためには、相同体は望ましくは核酸レベルでトカゲ・エキセンジン遺伝子に対して80％の配列同一性を有する。より望ましくは、それらは90％同一であり、最も望ましくはトカゲ・プロエキセンジン遺伝子と比較した場合に少なくとも95％の配列同一性を有する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増大させると、単離される相同体のトカゲ・エキセンジン遺伝子との配列同一性が増大することが明らかであろう。例えば、本発明の核酸配列を用いて、高ストリンジェンシー条件下で、トカゲHeloderma horridumの唾液腺由来のcDNA ライブラリーを釣り上げることによってエキセンジン３遺伝子を単離することができる。トカゲ・プロエキセンジン遺伝子のエキセンジンをコードする相同体を単離するためには、膵臓、心臓または骨格筋由来のライブラリーをスクリーニングすることが望ましいが、これは必須ではない。それゆえ、本発明はトカゲ・キセンジンをコードする遺伝子のみでなく、その構造的相同体および特にエキセンジンに類似した特性（例えば、GLP-1受容体に結合する）を有するタンパク質をコードする相同体をも含む。したがって、本発明は爬虫類プロエキセンジン遺伝子であるトカゲ・プロエキセンジン遺伝子およびそれらの哺乳動物相同体を含む、プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドを提供する。関連種における新規プロエキセンジンの相同体の同定は、薬物発見のためのヒトにより密接に関連する動物モデル系を開発するのに有用でありうる。例えば、本明細書に記載のヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プローブとして用いて、関心のある生物に由来するcDNAライブラリーまたはゲノム DNAライブラリーをハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる。さらに、同様の技法によって、ゲノム内の他の遺伝子座に存在する、プロエキセンジン遺伝子産物の１以上の新規ドメインに対して広範囲な相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも同定することが可能である。cDNAライブラリーの場合、そのようなスクリーニング技法は、同一または異なる種において選択的にスプライシングされた転写産物に由来するクローンを同定することが可能である。当業者であれば、プロエキセンジン相同体をコードする核酸分子を同定するのに有用なプローブを作製するために、少なくとも約15ヌクレオチド、好ましくは約17核酸のエキセンジン遺伝子の配列を使用しうることは明白だろう。無論、これらの配列および完全な遺伝子それ自体を使用して、標準的なハイブリダイゼーション技術によりプロエキセンジン関連遺伝子をクローニングすることもできる。例えば、他のエキセンジン（例：他のトカゲ・エキセンジンまたは哺乳類の相同体）をコードするDNAは所定の遺伝子単離法または遺伝子合成法を適用することで取得できる。スクリーニングは、２通りのフィルターを用いて、フィルターハイブリダイゼーションを行うことにより可能である。標識したプローブは図２に示すプロエキセンジンヌクレオチド配列の少なくとも15〜30塩基対を含むことができる。採用されるハイブリダイゼーションの洗浄条件は、cDNAライブラリーが標識配列を誘導した生物の種類と異なる生物に由来する場合は、比較的低いストリンジェンシーとすべきである。爬虫類のプロエキセンジンプローブを用いるマウス・プロエキセンジン相同体のクローニングに関しては、ハイブリダイゼーションを、例えば1％ SDS、1M NaCl、2μM EDTA、1％ BSA中で50℃において一夜行うことができる。洗浄は0.1xSSC、1％ SDSを用いて50℃で行えばよい。マウス・プロエキセンジンプローブを用いる新規プロエキセンジンのヒト相同体のクローニングに関しては、ハイブリダイゼーションを、例えば、Church'sバッファー（7％ SDS，250mM NaHPO₄，2μM EDTA，1％ BSA）中で65℃において一夜行うことができる。洗浄は2xSSC、0.1％ SDSを用いて65℃で、次に0.1xSSC、0 .1％ SDSを用いて65℃で行う。低度のストリンジェンシー条件は当業者には周知であり、ライブラリーおよび標識配列が誘導された特定の生物に応じて予測可能に変更されるだろう。このような条件に関する手引書として、例えば、Sambrook ら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pre ss，N.Y.;およびAusubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology， Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.を参照のこと。エキセンジン相同体の単離は、典型的には、膵臓、心臓または骨格筋組織の新鮮な供給源からの全メッセンジャーRNAの抽出、これに続くメッセージのcDNAへの変換と、例えば細菌プラスミド、より典型的にはバクテリオファージ内へのライブラリーの作製を必然的に伴うだろう。ヒトDNAの断片を担うこうしたバクテリオファージは、典型的には感受性E.coli細菌の菌叢上にプレートすることで増やして、個々のファージプラークまたはコロニーを単離できるようにする。次に、ファージコロニーにより担持されるDNAを、典型的にはニトロセルロースまたはナイロン系のハイブリダイゼーション膜上に固定し、その後入念に制御した条件下で放射能（または他の方法）で標識したプローブ配列にハイブリダイズさせて、特に関心のあるDNA（この場合にはプロエキセンジン相同体）の断片を担う特定のファージコロニーを同定する。続いて、外来遺伝子をより簡単に特性決定するために、関心のある特定の遺伝子をもつファージをライブラリーに含まれる他のあらゆるファージから分離・精製する。一般的には、遺伝子またはその一部を、便宜上は、特にそのDNA配列の完全な配列決定に関しては、プラスミドベクターにサブクローニングする。したがって、本明細書においてトカゲ・プロエキセンジン遺伝子を提供したが、分子生物学分野の当業者であれば、哺乳類の膵臓、心臓または骨格筋cDNAもしくはゲノムライブラリーを、プローブとしてトカゲ・エキセンジン遺伝子またはその断片を用いてスクリーニングすることにより、標準的な分子生物学の技術を使って、トカゲ・エキセンジン遺伝子の哺乳類相同体を取得できることが理解されよう。さらに、本明細書において開示した新規プロエキセンジン遺伝子産物内のアミノ酸配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行うことにより、関心のある生物の核酸からプロエキセンジン遺伝子相同体を単離することができる。この反応のための鋳型は、このようなプロエキセンジン遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られているまたは予想される、例えばヒトまたはヒト以外の細胞系もしくは細胞型（心臓、骨格筋、膵臓細胞型など）から調製されたmRNAの逆転写により得られるcDNAでありうる。本発明はまた、変異型プロエキセンジン、プロエキセンジンのペプチド断片、末端切断型プロエキセンジンタンパク質、およびプロエキセンジン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。特に好ましいポリヌクレオチドは、プロエキセンジンの機能性ドメインをコードするもの、例えば、47アミノ酸EN TPペプチド、45アミノ酸ENTPペプチド、推定上の23アミノ酸分泌シグナル、22アミノ酸ENTPペプチド、およびエキセンジンペプチド1-40、1-39および9-39である。融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、得られる融合タンパク質の精製または検出に役立つエピトープタグ、またはマーカーとして使用できる酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質などの無関係のタンパク質もしくはペプチドに融合された全長プロエキセンジン、末端切断型プロエキセンジン、またはプロエキセンジンのペプチドもしくは断片を含みうるが、これらに限らない。プロエキセンジン遺伝子配列はさらに変異型プロエキセンジン遺伝子対立遺伝子を単離するためにも使用できる。このような変異型対立遺伝子は、代謝異常の症状に関与する遺伝子型をもつことが知られた個体、またはこの種の遺伝子型をもつと提唱された個体から単離することができる。加えて、このようなプロエキセンジン遺伝子配列は、代謝疾患に関与しうるプロエキセンジン遺伝子調節(例：プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー)欠陥を検出するためにも使用できる。さらに、推定上の分泌シグナル配列をコードするヌクレオチドは、異種遺伝子産物をコードするヌクレオチドに読み枠を合わせて融合させることができ、こうして、このような遺伝子産物の分泌を指令するために使用することができる。本発明はまた、(a)前記プロエキセンジンコード配列および／またはそれらの相補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含むDNAベクター、(b)前記プロエキセンジンコード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記コード配列のいずれかを含むDNA発現ベクター、および(c)宿主細胞内での前記プロエキセンジンコード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記コード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞、を包含する。プロエキセンジンをコードする核酸を手中に収めたので、プロエキセンジン遺伝子産物は、in vitro転写および適切な発現ベクターへのDNAの組み込みと適切な宿主（例えばE.collのような細菌、酵母または哺乳動物細胞）内での発現を含めて、いくつかの方法で生産することができる。ある物質が通常自然界で一緒に存在する物質から実質的に精製されている場合には、その物質は「単離された」または「実質的に天然の汚染物質を含まない」と言われることに留意すべきである。本明細書中で用いる「組換え体ポリヌクレオチド」という用語は、そのポリヌクレオチドが天然の環境中に存在せず、例えばポリヌクレオチドが異種核酸配列と機能的に結合していることを意味する点に留意すべきである。種々の遺伝子発現系がこれらの宿主と共に使用するのに適するように改作されており、これらは現在では市販されている。エキセンジンをコードするDNAを発現させるために、これらの系のいずれか一つを選択することができる。発現ベクターは、プロエキセンジンをコードするDNAを一過性にまたは安定した状態で発現する形質転換細胞系をもたらすように選択される。一過性の発現の場合は、典型的には、哺乳動物細胞内で機能的する複製起点をもつ発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。安定した発現の場合は、このような複製起点は必要でないが、ベクターはそれらの選別を可能にするために、形質転換細胞に生存上の利益を付与する産物をコードする遺伝子、例えばネオマイシン耐性をコードする遺伝子(この場合は形質転換細胞をネオマイシンを補足した培地にプレートする)、を保有するだろう。これらの系は、典型的にはプラスミドベクターの形態で利用可能であり、機能的成分が発現調節配列構成DNAを含んでいる発現カセットを組み込んでいる。この発現カセットは宿主認識性のものであり、プロエキセンジン-コードDNAの５’ 側に連結されて該プロエキセンジン-コードDNAの発現を可能にする。この系はさらに、プロエキセンジン-コード領域の３’側に連結されて発現を終結させるDNA 配列を組み込んでいる。したがって、選択した哺乳動物細胞宿主内で発現させた場合、宿主によって認識される発現調節DNA配列にプロエキセンジン-コードDNA が連結している組換えDNA発現構築物が得られ、この組換えDNA発現構築物は、発現を駆動するためのプロエキセンジン-コードDNAの５’側領域と、発現を終結させるための３’側領域とを含む。エキセンジンコードDNAの哺乳動物細胞での発現を達成するのに用い得る種々の組換えDNA発現系としては、哺乳動物細胞に感染するウイルスのプロモーター［例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、シミアンウイルス(SV40)、マウス乳腺癌ウイルス（MMTV）等に由来するプロモーター］を利用するものが含まれる。レトロウイルスのLTRのようなプロモーター、昆虫細胞プロモーター(例えば、温度によって制御されるもの)、およびショウジョウバエ (Drosophila)から単離したプロモーター、ならびに哺乳動物遺伝子プロモーター（例えば、重金属によって制御されるもの；すなわち、メタロチオネイン遺伝子プロモーターおよび他のステロイド誘導性プロモーター）もまた、発現の駆動に有用である。新規なプロエキセンジン・ポリペプチドおよびペプチド断片、突然変異型、末端切断型または欠損型のプロエキセンジン、ならびにプロエキセンジン融合タンパク質は様々な用途のために調製することができ、その用途としては、例えば、診断アッセイにおける試薬としての抗体の作製；代謝障害の治療に使用可能な化合物をスクリーニングするアッセイにおける試薬としての、および糖尿病等の代謝障害の治療に有用な医薬的試薬としての、細胞代謝の制御に関与する他の細胞性遺伝子産物の同定が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のプロエキセンジン・アミノ酸配列は、図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。さらに、他の種のプロエキセンジンも本発明に包含される。事実、上記のプロエキセンジン・ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であればいずれも、ENTP配列またはエキセンジンの新規なカルボキシル末端のいずれかを含む限り、本発明の範囲内である。特に、（例えば毒物、膵臓、心臓または骨格筋細胞内で）エキセンジンおよび ENTPの存在の有無および／または存在位置を検出するのに用いる場合、本発明は、もう１つの態様において、ENTPペプチドまたはエキセンジンに対する抗体を提供する。プロエキセンジン・ペプチド配列に対する抗体（プロエキセンジンのドメインに特異的な抗体を含む）はさまざまな目的に有用である。例えば、プロエキセンジン（ENTPペプチドを含む）は、組織特異的な活性のマーカーとして使用できる。異常な量のプロエキセンジンまたはプロエキセンジンの断片を分泌する内分泌腫瘍は、プロエキセンジンまたはプロエキセンジン断片の循環レベルについてアッセイすることにより検出できる。具体的には、プロエキセンジンは膵臓、心臓および骨格筋組織により発現されることが知られている。さらに、プロエキセンジン発現組織の器官または組織不全は、検出可能なプロエキセンジンの量の変化または減少によって明らかにできる。さらに、上記の抗体は、爬虫類に噛まれて毒物が体内に入り込んだヒトにおける毒物ペプチドの存在の有無およびレベルを検出するのに有用である。さらに、上記の抗体は、毒物タンパク質の中和に有用である。上記の抗体を生起させるために、微生物または哺乳動物宿主細胞内で上記のようにして、または標準的なペプチド合成技術によって作製されるENTP遺伝子産物、エキセンジンまたはそれらの免疫原性断片が使用できる。具体的には、45アミノ酸ENTPもしくは22アミノ酸ENTP、またはそれらの免疫原性断片がこれに使用可能である。標準的な免疫プロトコールは次のとおりである。典型的には、上記ペプチドはPBS中に配合するが、その免疫原にアジュバント（例えば、フロイントまたはミョウバン等）を混合してもよい。通常、分子量が10kd未満のペプチドの場合には、該ペプチドはキーホルリンペットヘモシアニンのような担体に結合させる。１つの有用な免疫プロトコールにおいて、被検動物は、典型的には、ボーラス当たり上記ペプチドを0.5〜1mgのオーダーで含む免疫原を皮下注射し、約２〜３週間後にペプチド（PBS中に配合したもの）100〜200μgを用いて筋肉内追加免疫注射を行う。この筋肉内注射は、試験血液(test bleeds)から必要であると判明した場合には、２〜３間後にもう一度行ってもよい。目的とするプロエキセンジン遺伝子産物またはその断片に対する抗体の１つの供給源は、上記の免疫原で免疫した動物の血液からである。あるいはまた、モノクローナル抗体を産生させる場合には、免疫した動物から免疫担当細胞(例えば、脾細胞)を取り出し、ハイブリドーマ技術を用いて骨髄腫細胞と融合させる。モノクローナル抗体は、単一のエピトープに特異的な抗体を作製するのに特に好ましい。次に、選択培地で培養することにより融合産物をスクリーニングし、抗体産生細胞を回収し、続けて増殖させて抗体を回収する。回収した抗体は、次いで、検出可能な標識（例えば、放射能標識、酵素標識、発光標識など）と共有結合させることができる。これは、この目的のために確立されたリンカー技術を用いて行う。プロエキセンジン遺伝子産物の生理学的および挙動的役割を解明する動物モデル系は、コードされたペプチドの活性が増大もしくは低減するか、または目的とする発現されたプロエキセンジン・ペプチドのアミノ酸配列が変化するトランスジェニック動物を種々の技術により創成することによって作製される。これらの技術の例としては、(1)トランスジェニック動物を作製するための、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レトロウイルスによるトランスフェクションまたは他の当業者に周知の手段による、プロエキセンジン・ペプチドをコードするDNAの正常型または突然変異型のものの、適切な受精胚への挿入、または(2)これらのペプチド配列の発現調節または構造を改変するための、トランスジェニック動物における生来の遺伝子座を有するこれらの遺伝子の突然変異型または正常型のヒトまたは動物バージョンの相同的組換え、が挙げられるが、それらに限定されない。相同性組換えの技術は当業界で周知である。この技術は、生来の遺伝子を挿入した遺伝子と置換えるものであり、したがって、生来のプロエキセンジン・ペプチドは発現できないが、例えば挿入した突然変異型プロエキセンジン・ペプチドは発現する動物の作製に有用である。この場合、動物ゲノム内の生来のプロエキセンジン・ペプチドは組換えによって置換されており、その結果、該ペプチドは過小発現される。マイクロインジェクションは、遺伝子をゲノムから取り除くのではなくゲノムに追加（付加）するものであり、したがって、自身のプロエキセンジン・ペプチドと追加されたプロエキセンジン・ペプチドとを発現する動物の作製に有用であり、その結果、目的とするプロエキセンジンまたはペプチドは過剰発現される。マウスを例とするトランスジェニック動物の作製に利用し得る１つの手段は、以下の通りである。メスのマウスを交尾させ、得られた受精卵をその輸卵管から摘出する。受精卵をM2培地等の適切な培地中で保存する。プロエキセンジンペプチドをコードするDNAまたはcDNAを含むベクターを、当該技術分野で周知の方法により塩化セシウム精製にかける。誘導性プロモーターをDNAのコード領域と融合させて、トランスジーンの発現を調節する実験的な手段を提供することもできる。あるいは、もしくはさらに、組織特異的調節エレメントをコード領域と融合させてトランスジーンの組織特異的発現を可能にすることもできる。DNA(適切には緩衝溶液中のもの)をマイクロインジェクション針(ピペット引き具(piper pul ler)を用いて毛管状材料から作製可能)へ入れ、凹部を有するスライドガラスに注入を受ける受精卵を置く。針を受精卵の前核へ挿入し、DNA溶液を注入する。次いで注入の終わった受精卵を偽妊娠状態のマウス(適切なホルモンで刺激して妊娠状態を維持したマウス、但し実際には妊娠していない)の輸卵管へ移す。受精卵は子宮へ移動して着床し、発育して出産される。上述したように、マイクロインジェクションはDNAを卵細胞へ挿入するための唯一の方法ではなく、本明細書では例示の目的で使用したに過ぎない。実施例１プロエキセンジン遺伝子の単離酸グアニジウムチオシアネート法(acid guanidium thiocyanate method)(Chom czynski,P.ら，1987,Anal.Chem.169,158-159)により、トカゲHeloderma suspect umの唾液腺由来の全細胞RNAを単離した。第１鎖cDNA合成のため、5μgの全細胞R NAをSuperScript Preamplificationシステム(Gibco-Bethesda Research Laborat ories(BRL),Gaithersburg,MD)を用いて逆転写した。続いて、第１鎖cDNAのアリコート(0.1容量)をPCR(35サイクル、アニーリング温度50℃、伸長温度72℃)によって増幅した。トカゲのエキセンジンを単離するため、縮重プライマーをLE(A)；5'-GCG GAA TTC AYG GNG ARG GNA CNTT-3'およびLE(B)；5' -CGC GGA TCC RTT YTT NAR CCA YTC-3'とした。増幅産物をTAクローニングベクターpCRII(Invitrogen製、San Diego,CA)へクローニングし、配列決定した。トカゲの唾液腺由来のRNAより予測サイズ(95bp)のPCR産物を得、この部分cDNAの配列決定からエキセンジン４の配列をコードすることが判明した。完全長エキセンジンcDNAを単離するため、トカゲ唾液腺のcDNAライブラリーを作製し、次いで部分エキセンジンcDNAプローブでスクリーニングした。H.suspectumのcDNAライブラリーを、ポリ(A)と成体トカゲの唾液腺から単離したmRNAから作製した。このc DNAライブラリーは、pcDNAIIベクター(Invitrogen,SanDiego,CA)のEcoRI部位に構築した１×10⁶個の独立した組換えファージミドからなる。このcDNAライブラリーを、まさに上述したようにRT-PCRによって作製した前記95bpヌクレオチド配列EcoRI/BamHI[α32P]-dATP標識トカゲcDNAでスクリーニングした。このライブラリーから、エキセンジン(図１のアミノ酸48〜87)および該エキセンジン配列のＮ末端側の45アミノ酸ペプチド(図１のアミノ酸１〜45)をコードする単一クラスのエキセンジンcDNAクローンを単離した。この45アミノ酸ペプチドはエキセンジンＮ末端ペプチド(ENTP)と命名する。ENTP配列には、プロホルモン・コンバターゼ切断部位を特徴とするアミノ酸の二塩基性対、即ちリシンおよびアルギニンと、40アミノ酸エキセンジン配列が続く。実施例２エキセンジンの哺乳動物相同体の同定トカゲのエキセンジンヌクレオチドプローブを使用して、標準的な分子生物学的手法により哺乳動物エキセンジンcDNAを得ることができる。本実施例では、トカゲのエキセンジンプローブをランダムプライミング手法によって³²P標識し、ノーザンブロット分析(ハイブリダイゼーションは１M NaCl、1％SDS中50℃で行い、洗浄は0.1×SSC、１％SDS中50℃で行った)に使用して対応のマウスのエキセンジンmRNA転写産物をマウスの各種組織で検出した。マウスのエキセンジンmRNA転写産物(約1.2kbのサイズ)をマウスの心臓由来のRNA中で検出した。マウスのエキセンジンmRNA(約1.0kbのサイズ)は骨格筋由来のRNA中でも検出され、約1.0kbのマウスのエキセンジンRNA転写産物はマウスの膵臓由来のRNA中で検出できる。当業者であれば、マウスのエキセンジンcDNAだけでなく、完全長ヌクレオチド哺乳動物エキセンジンcDNAを含む他の哺乳動物エキセンジンcDNAも、これらの組織からトカゲのエキセンジンプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、またはRT-PCRを利用することによって得ることができる。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきものではない。この実施形態は、本発明の個々の態様の単なる例示と解釈され、機能的に等価な方法と成分は本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に記載されたものだけでなく、本発明の各種改変が以上の記載や添付の図面より当業者には明らかであろう。このような改変は、添付の請求の範囲内にあるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドであって、組換え体であるか、または単離された形態である該ポリヌクレオチド。２．該ポリヌクレオチドが図１の配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．図２のペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。４．図２のアミノ酸1-47、1-23、24-47、24-45、48-87または48-86をコードする組換えポリヌクレオチド。５．ストリンジェントな条件下で請求項１から４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体とハイブリダイズする組換えポリヌクレオチド。６．該組換えポリペプチドがトカゲHeloderma horridumに由来する、請求項５に記載の組換えポリヌクレオチド。７．中程度のストリンジェンシー条件下で請求項１から５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズし、かつ哺乳動物DNA から得られる組換えポリヌクレオチド。８．図２のアミノ酸1-47のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。９．図２のアミノ酸1-45のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。 10．図２のアミノ酸24-45のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。 11．図２のアミノ酸48-87のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。 12．図２のアミノ酸48-86のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。 13．図２に示すアミノ酸配列を有する実質的に精製されたペプチド。 14．図２のアミノ酸1-45のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたペプチド。 15．図２のアミノ酸24-45のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたペプチド。 16．図２のアミノ酸48-87のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたペプチド。 17．請求項13から16のいずれか１つに記載のペプチドを投与することを含む、動物に免疫応答を誘導する方法。 18．該ペプチドが図２のアミノ酸残基24-45である、請求項18に記載の方法。 19．請求項17に記載の方法で動物に免疫応答を誘導し、そして該動物からプロエキセンジンペプチドを特異的に認識する抗体を単離することを含む、プロエキセンジンペプチドに特異的な抗体を作製する方法。