JP2008133300A - ヒトオーファンgタンパク質共役型受容体 - Google Patents
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Abstract
【課題】膜貫通受容体、より具体的には内在性のヒトオーファンGタンパク質共役型受容体の提供。
【解決手段】特定の塩基配列から成るcDNAによりコードされるGタンパク質共役型受容体([GPCR])。特定の塩基配列から成るcDNAを含んで成るプラスミド。前記プラスミドを含んでなる宿主細胞。ヒトGPCRの同定はジェンバンク(GenBank)データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトGPCRのいくつかを同定した。他の開示される内在性ヒトGPCRは特定のESTクローンをクエリ配列として使用するESTデータベース(dbsest)のBLAST検索を実施することにより同定した。そのあと、同定された特定のESTクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【選択図】なし
【解決手段】特定の塩基配列から成るcDNAによりコードされるGタンパク質共役型受容体([GPCR])。特定の塩基配列から成るcDNAを含んで成るプラスミド。前記プラスミドを含んでなる宿主細胞。ヒトGPCRの同定はジェンバンク(GenBank)データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトGPCRのいくつかを同定した。他の開示される内在性ヒトGPCRは特定のESTクローンをクエリ配列として使用するESTデータベース(dbsest)のBLAST検索を実施することにより同定した。そのあと、同定された特定のESTクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【選択図】なし
Description
本特許文書は、以下の出願(全部は示された出願日に米国特許・商標庁(theUnited States Patent and TrademarkOffice)に米国エクスプレスメール(U.S.ExpressMail)を介して出願された)、すなわち1998年11月20日に出願された米国仮出願第60/109,213号の利益を主張する1999年2月26日に出願された米国仮出願第60/121,852号;1999年2月16日に出願された米国仮出願第60/120,416号;1999年3月12日に出願された米国仮出願第60/123,946号;1999年3月12日に出願された米国仮出願第60/123,949号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/136,436号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/136,439号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/136,567号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/137,127号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/137,131号;1999年5月28日に出願された米国仮出願第60/136,437号からの優先権を主張する1999年6月29日に出願された米国仮出願第141,448号;1999年9月29日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(ArenaPharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号CHN10−1);1999年9月29日に出願された米国仮出願第60/156,333号;1999年9月29日に出願された米国仮出願第60/156,555号;1999年9月29日に出願された米国仮出願第60/156,634号;1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号RUP6−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号
RUP7−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号CHN6−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号RUP5−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号CHN9−1)のそれぞれの優先権の利益を主張する。本特許文書は、1998年10月13日に申請された米国第09/170,496号、および1999年10月12日に(米国エクスプレスメール(U.S.ExpressMail)を介して)出願された米国第(不明)号(ウッドコック(Woodcock)ウォッシュバーン(Washburn)クルツ(Kurtz)マキエヴィッツ(Mackiewicz)とノリス(Norris)、LLP処理予定事項表番号AREN−0054)(双方は引用により本明細書に組み込まれる)に関する。本特許文書は、1999年7月30日に出願された米国第09/364,425号(そっくりそのまま引用により組み込まれる)にもまた関する。本出願は、1999年10月12日に(米国エクスプレスメール(U.S.ExpressMail)を介して)出願された米国第____号(ウッドコック(Woodcock)、ウォッシュバーン(Washburn)、クルツ(Kurtz)、マキエヴィッツ(Makiewicz)とノリス(Norris)、LLP処理予定事項表番号AREN−0050)(そっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる)に対する優先権もまた主張する。前述の出願のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
RUP7−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号CHN6−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号RUP5−1);1999年10月1日に出願された米国仮出願第____号(アリーナファーマシューティカルズインク(Arena Pharmaceuticals,Inc.)処理予定事項表番号CHN9−1)のそれぞれの優先権の利益を主張する。本特許文書は、1998年10月13日に申請された米国第09/170,496号、および1999年10月12日に(米国エクスプレスメール(U.S.ExpressMail)を介して)出願された米国第(不明)号(ウッドコック(Woodcock)ウォッシュバーン(Washburn)クルツ(Kurtz)マキエヴィッツ(Mackiewicz)とノリス(Norris)、LLP処理予定事項表番号AREN−0054)(双方は引用により本明細書に組み込まれる)に関する。本特許文書は、1999年7月30日に出願された米国第09/364,425号(そっくりそのまま引用により組み込まれる)にもまた関する。本出願は、1999年10月12日に(米国エクスプレスメール(U.S.ExpressMail)を介して)出願された米国第____号(ウッドコック(Woodcock)、ウォッシュバーン(Washburn)、クルツ(Kurtz)、マキエヴィッツ(Makiewicz)とノリス(Norris)、LLP処理予定事項表番号AREN−0050)(そっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる)に対する優先権もまた主張する。前述の出願のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
本特許文書に開示される発明は、膜貫通受容体、およびより具体的には内在性のオーファンヒトGタンパク質共役型受容体(「GPCR」)に関する。
ヒトでは多数の受容体のクラスが存在するが、はるかに最も豊富かつ治療に関係するものは、Gタンパク質共役型受容体(GPCRもしくは複数のGPCR)のクラスにより代表される。ヒトゲノム内には数十万個の遺伝子が存在することが推定されており、そしてこれらのなかでおよそ2%もしくは2,000個の遺伝子がGPCRをコードすると推定されている。内在性リガンドが同定されている、GPCRを包含する受容体は「既知」受容体と称される一方、内在性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と称される。GPCRは製薬学的製品の開発に重要な一領域を代表する。すなわち、100種の既知のGPCRのおよそ20種から全処方薬の60%が開発されている。この卓越性は、とりわけGPCRの場合には単に意味論上でない。従って、オーファンGPCRは、製薬業界にとって、金が19世紀後半のカリフォルニアにとって、成長、拡張、増強および開発の契機となったところのものである。
GPCRは1つの共通の構造モチーフを共有する。全部のこれらの受容体は、7個のαヘリックスを形成する22ないし24個の間の疎水性アミノ酸の7個の連なりを有し、そのそれぞれは膜に広がっている(各広がり(span)は数字により同定されている。すなわち膜貫通−1(TM−1)、膜貫通−2(TM−2)など)。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外もしくは「細胞外」側で、膜貫通−2と膜貫通−3、膜貫通−4と膜貫通−5、および膜貫通−6と膜貫通−7の間でアミノ酸の鎖により結合されている(これらはそれぞれ「細胞外」領域1、2および3(EC−1、EC−2およびEC−3)と称される)。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の内もしくは「細胞内」側で、膜貫通−1と膜貫通−2、膜貫通−3と膜貫通−4、および膜貫通−5と膜貫通−6の間でもまたアミノ酸の鎖により結合されている(これらはそれぞれ「細胞内」領域1、2および3(IC−1、IC−2およびIC−3)と称される)。受容体の「カルボキシ」(「C」)末端は細胞内の細胞内空隙中に存し、また、受容体の「アミノ」(「N」)末端は細胞の外側の細胞外空隙中に存する。
一般に、内在性リガンドが受容体と結合する場合(しばしば受容体の「活性化」と称される)、細胞内領域のコンホメーションの変化が存在し、それは細胞内領域と細胞内の「Gタンパク質」との間の共役(coupling)を可能にする。GPCRはGタンパク質に関して「***性」であること、すなわちGPCRは1種以上のGタンパク質と相互作用する可能性があることが報告されている。ケナキン(Kenakin,T.)、43LifeSciences 1095(1988)を参照されたい。他のGタンパク質が存在するが、現在のところGq、Gs、GiおよびGoが同定されたGタンパク質である。Gタンパク質との内在性リガンドで活性化されたGPCRの共役がシグナル伝達カスケード過程(「シグナル伝達」と称される)を開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は最終的に細胞の活性化もしくは細胞の阻害をもたらす。受容体のIC−3ループならびにカルボキシ末端がGタンパク質と相互作用すると考えられている。
GPCRは、生理学的条件下では2種の異なるコンホメーション、すなわち「不活性」状態と「活性状態」との間の平衡で細胞膜中に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内のシグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生じさせることが不可能である。受容体のコンホメーションの活性状態への変化は(Gタンパク質を介する)伝達経路への連鎖を可能にし、そして生物学的応答を生じさせる。受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定化させることができる。
ヒト内在性オーファンGタンパク質共役型受容体を本明細書で開示する。
上記課題を解決するために、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) 配列番号1を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目2) 配列番号2を含んで成る配列番号1のcDNAによりコードされるヒトGタ
ンパク質共役型受容体。
(項目3) ベクターおよび配列番号1のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目4) 項目3記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目5) 配列番号3を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目6) 配列番号4を含んで成る配列番号3のcDNAによりコードされるヒトGタ
ンパク質共役型受容体。
(項目7) ベクターおよび配列番号3のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目8) 項目7記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目9) 配列番号5を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目10) 配列番号6を含んで成る配列番号5のcDNAによりコードされるヒトG
タンパク質共役型受容体。
(項目11) ベクターおよび配列番号5のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目12) 項目11記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目13) 配列番号7を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcD
NA。
(項目14) 配列番号8を含んで成る配列番号7のcDNAによりコードされるヒトG
タンパク質共役型受容体。
(項目15) ベクターおよび配列番号7のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目16) 項目15記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目17) 配列番号9を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcD
NA。
(項目18) 配列番号10を含んで成る配列番号9のcDNAによりコードされるヒト
Gタンパク質共役型受容体。
(項目19) ベクターおよび配列番号9のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目20) 項目19記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目21) 配列番号11を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目22) 配列番号12を含んで成る配列番号11のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目23) ベクターおよび配列番号11のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目24) 項目23記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目25) 配列番号13を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目26) 配列番号14を含んで成る配列番号13のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目27) ベクターおよび配列番号13のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目28) 項目27記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目29) 配列番号15を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目30) 配列番号16を含んで成る配列番号15のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目31) ベクターおよび配列番号15のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目32) 項目31記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目33) 配列番号17を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目34) 配列番号18を含んで成る配列番号17のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目35) ベクターおよび配列番号17のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目36) 項目35記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目37) 配列番号19を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目38) 配列番号20を含んで成る配列番号19のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目39) ベクターおよび配列番号19のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目40) 項目39記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目41) 配列番号21を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目42) 配列番号22を含んで成る配列番号21のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目43) ベクターおよび配列番号21のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目44) 項目43記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目45) 配列番号23を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目46) 配列番号24を含んで成る配列番号23のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目47) ベクターおよび配列番号23のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目48) 項目47記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目49) 配列番号25を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目50) 配列番号26を含んで成る配列番号25のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目51) ベクターおよび配列番号25のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目52) 項目51記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目53) 配列番号27を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目54) 配列番号28を含んで成る配列番号27のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目55) ベクターおよび配列番号27のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目56) 項目55記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目57) 配列番号29を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目58) 配列番号30を含んで成る配列番号29のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目59) ベクターおよび配列番号29のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目60) 項目59記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目61) 配列番号31を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目62) 配列番号32を含んで成る配列番号31のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目63) ベクターおよび配列番号31のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目64) 項目63記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目65) 配列番号33を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目66) 配列番号34を含んで成る配列番号33のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目67) ベクターおよび配列番号33のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目68) 項目67記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目69) 配列番号35を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目70) 配列番号36を含んで成る配列番号35のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目71) ベクターおよび配列番号35のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目72) 項目71記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目73) 配列番号37を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目74) 配列番号38を含んで成る配列番号37のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目75) ベクターおよび配列番号37のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目76) 項目75記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目1) 配列番号1を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目2) 配列番号2を含んで成る配列番号1のcDNAによりコードされるヒトGタ
ンパク質共役型受容体。
(項目3) ベクターおよび配列番号1のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目4) 項目3記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目5) 配列番号3を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目6) 配列番号4を含んで成る配列番号3のcDNAによりコードされるヒトGタ
ンパク質共役型受容体。
(項目7) ベクターおよび配列番号3のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目8) 項目7記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目9) 配列番号5を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDN
A。
(項目10) 配列番号6を含んで成る配列番号5のcDNAによりコードされるヒトG
タンパク質共役型受容体。
(項目11) ベクターおよび配列番号5のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目12) 項目11記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目13) 配列番号7を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcD
NA。
(項目14) 配列番号8を含んで成る配列番号7のcDNAによりコードされるヒトG
タンパク質共役型受容体。
(項目15) ベクターおよび配列番号7のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目16) 項目15記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目17) 配列番号9を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcD
NA。
(項目18) 配列番号10を含んで成る配列番号9のcDNAによりコードされるヒト
Gタンパク質共役型受容体。
(項目19) ベクターおよび配列番号9のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目20) 項目19記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目21) 配列番号11を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目22) 配列番号12を含んで成る配列番号11のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目23) ベクターおよび配列番号11のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目24) 項目23記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目25) 配列番号13を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目26) 配列番号14を含んで成る配列番号13のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目27) ベクターおよび配列番号13のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目28) 項目27記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目29) 配列番号15を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目30) 配列番号16を含んで成る配列番号15のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目31) ベクターおよび配列番号15のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目32) 項目31記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目33) 配列番号17を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目34) 配列番号18を含んで成る配列番号17のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目35) ベクターおよび配列番号17のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目36) 項目35記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目37) 配列番号19を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目38) 配列番号20を含んで成る配列番号19のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目39) ベクターおよび配列番号19のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目40) 項目39記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目41) 配列番号21を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目42) 配列番号22を含んで成る配列番号21のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目43) ベクターおよび配列番号21のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目44) 項目43記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目45) 配列番号23を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目46) 配列番号24を含んで成る配列番号23のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目47) ベクターおよび配列番号23のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目48) 項目47記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目49) 配列番号25を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目50) 配列番号26を含んで成る配列番号25のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目51) ベクターおよび配列番号25のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目52) 項目51記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目53) 配列番号27を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目54) 配列番号28を含んで成る配列番号27のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目55) ベクターおよび配列番号27のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目56) 項目55記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目57) 配列番号29を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目58) 配列番号30を含んで成る配列番号29のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目59) ベクターおよび配列番号29のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目60) 項目59記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目61) 配列番号31を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目62) 配列番号32を含んで成る配列番号31のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目63) ベクターおよび配列番号31のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目64) 項目63記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目65) 配列番号33を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目66) 配列番号34を含んで成る配列番号33のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目67) ベクターおよび配列番号33のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目68) 項目67記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目69) 配列番号35を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目70) 配列番号36を含んで成る配列番号35のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目71) ベクターおよび配列番号35のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目72) 項目71記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
(項目73) 配列番号37を含んで成るヒトGタンパク質共役型受容体をコードするc
DNA。
(項目74) 配列番号38を含んで成る配列番号37のcDNAによりコードされるヒ
トGタンパク質共役型受容体。
(項目75) ベクターおよび配列番号37のcDNAを含んで成るプラスミド。
(項目76) 項目75記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有するリガンドを指す多数の用語を採用している。明快さおよび一貫性のため、本特許文書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用語の他の定義と対立する限において、以下の定義が支配する:本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表1に示す:
組成物は最低1種の成分を含んで成る物質を意味する。
内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でなく「受容体」という用語に関しての内在性は、哺乳動物(例えば、そして制限でなくヒト)もしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に、この情況における非内在性という用語は、哺乳動物(例えば、そして制限でなくヒト)もしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。
宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび/もしくはベクターを有することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは宿主細胞が複製する際に自律的分子として典型的に複製され(一般に、プラスミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される);真核生物宿主細胞の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、プラスミドが宿主細胞の細胞DNAに組込まれる。好ましくは、本明細書に開示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくは293、293TおよびCOS−7細胞より成る群から選択される。
リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。
非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグナル伝達経路を活性化する。
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていないかもしくは未知である内在性受容体を意味する。
プラスミドはベクターおよびcDNAの組み合わせを意味する。一般に、プラスミドは、cDNAの複製および/もしくはタンパク質としてのその発現の目的上、宿主細胞に導入される。
cDNAに関するベクターは、最低1個のcDNAを組み込むことが可能かつ宿主細胞への組込みが可能な環状DNAを意味する。
以下のセクションの順序は表象的な効率について示され、また、後に続く開示もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈されるべきでもない。
ヒトGPCRの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノム内に配置されている核酸配列に関する夥しい量の情報の同定をもたらし;それは、この努力によって、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するかも知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴うことなく、遺伝子配列情報が利用可能にされているというのが実情である。ヒトゲノム内の核酸配列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、本明細書で開示される多様なGPCRは、ジェンバンク[GenBank](商標)データベースを再検討することにより発見された一方、他のGPCRは、既に配列決定されたGPCRの核酸配列を利用してESTデータベースのBLAST(商標)検索を実施することにより発見された。下の表Aは、GPCRのそれぞれの相同なGPCRと一緒に、開示される内在性のオーファンGPCRを列挙する。
ヒトGPCRの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノム内に配置されている核酸配列に関する夥しい量の情報の同定をもたらし;それは、この努力によって、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するかも知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴うことなく、遺伝子配列情報が利用可能にされているというのが実情である。ヒトゲノム内の核酸配列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、本明細書で開示される多様なGPCRは、ジェンバンク[GenBank](商標)データベースを再検討することにより発見された一方、他のGPCRは、既に配列決定されたGPCRの核酸配列を利用してESTデータベースのBLAST(商標)検索を実施することにより発見された。下の表Aは、GPCRのそれぞれの相同なGPCRと一緒に、開示される内在性のオーファンGPCRを列挙する。
受容体の相同性は、人体内での開示される受容体の役割の正しい認識を得ることに関して有用である。加えて、こうした相同性は、開示されるオーファンGPCRの天然の活性化物質であることができる可能な内在性リガンド(1種もしくは複数)に関しての洞察を提供する可能性がある。
B.受容体スクリーニング
受容体の伝統的研究は、アンタゴニストおよび受容体に影響を及ぼす可能性のある他の分子を見出すように発見を進行させることができる前に内在性リガンドを最初に同定しなければならないという演繹的過程(歴史的に基づく)から常に進行したため、内在性リガンドの同定(これは主として受容体の内在性リガンドを必要とする受容体結合アッセイの実施の一手段を提供するという目的上)のための技術は過去数年のあいだにより容易に利用可能になった。最初にアンタゴニストが知られているかも知れない場合でさえ、探索は内在性リガンドを探すように直ちに拡大した。この思考様式は、構成的に活性化される受容体の発見後でさえも受容体の研究に存続している。これまで認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび反作用薬を発見するのに最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患にとって、治療薬で望ましいものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬物ではなく、それぞれ受容体の活性状態を減少させるかもしくは受容体の活性を高めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させるもしくは高める化合物は内在性リガンドと同一部位で結合する必要がないためである。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物についてのいかなる探索もリガンド非依存的な活性状態に対する化合物のスクリーニングにより開始すべきである。
B.受容体スクリーニング
受容体の伝統的研究は、アンタゴニストおよび受容体に影響を及ぼす可能性のある他の分子を見出すように発見を進行させることができる前に内在性リガンドを最初に同定しなければならないという演繹的過程(歴史的に基づく)から常に進行したため、内在性リガンドの同定(これは主として受容体の内在性リガンドを必要とする受容体結合アッセイの実施の一手段を提供するという目的上)のための技術は過去数年のあいだにより容易に利用可能になった。最初にアンタゴニストが知られているかも知れない場合でさえ、探索は内在性リガンドを探すように直ちに拡大した。この思考様式は、構成的に活性化される受容体の発見後でさえも受容体の研究に存続している。これまで認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび反作用薬を発見するのに最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患にとって、治療薬で望ましいものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬物ではなく、それぞれ受容体の活性状態を減少させるかもしくは受容体の活性を高めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させるもしくは高める化合物は内在性リガンドと同一部位で結合する必要がないためである。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物についてのいかなる探索もリガンド非依存的な活性状態に対する化合物のスクリーニングにより開始すべきである。
当該技術分野で既知であるとおり、GPCRはそれへの受容体の内在性リガンドの結合を伴わなくてもそれらの内在性の状態で「活性」であることができる。こうした天然に活性の受容体を、とりわけ反作用薬の直接同定のために(すなわち受容体の内在性リガンドを必要とせずに)スクリーニングすることができる。あるいは、例えば受容体の内在性リガンドの非存在下で活性である非内在性バージョンの受容体を確立するための受容体の突然変異を介して受容体を「活性化する」ことができる。
本明細書に開示される、内在性のもしくは非内在性の構成的に活性化されるバージョンのヒトオーファンGPCRに対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を提供することができる。本明細書に開示される内在性のバージョンのヒトGPCRが発現および/もしくは過剰発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および/もしくは過剰発現を伴う関連疾患/障害状態を決定することが可能であり;こうした一アプローチを本特許文書で開示する。
本明細書に開示されるヒトオーファンGPCRの構成的活性化を明示するかも知れない突然変異の創製に関して、GPCRのTM6内(典型的にはTM6/IC3界面に近づく)に配置されると想定されているプロリン残基からの距離に基づく(こうしたプロリン残基は極めて保存されているようである)。この残基から16アミノ酸残基に配置されるアミノ酸残基(おそらく受容体のIC3領域中に配置される)を最も好ましくはリシン残基に突然変異することにより、こうした活性化を得ることができる。この目的を達成するためにはこの位置の突然変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。
C.疾患/障害の同定および/もしくは選択
好ましくは、(a)組織mRNAに対するドットブロット分析、および/もしくは(b)組織サンプル中の受容体の発現のRT−PCR同定のためのプローブを作成するのにヒトオーファンGPCRのDNA配列を使用することができる。組織供給源、もしくは疾患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ましく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
D.候補化合物のスクリーニング
1.包括的GPCRスクリーニングアッセイの技術
Gタンパク質受容体が構成的に活性(すなわちそれに結合する内在性リガンドの非存在下で活性)になった場合、それはGタンパク質(例えばGq、Gs、Gi、Go)に結合しかつGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。その後、Gタンパク質がGTPアーゼとして作用し、そしてGTPをGDPにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常な条件下で失活型になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はGDPをGTPに交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニターするのに、GTPの加水分解不可能な類似物[35S]GTPγSを使用することができる。[35S]GTPγSはリガンドの不存在下および存在下での膜へのGタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告されている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は、1995年にトレイノル(Traynor)とナホルスキ(Nahorski)により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質に関係なく、全部のGタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能であるからである。
2.特異的GPCRスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Gタンパク質共役型受容体アッセイ(すなわちアゴニスト、部分的アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ)を使用して候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わりに細胞内ドメインからGタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
a.GsおよびGi
Gsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Gi(およびGo)はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはATPのcAMPへの転化を触媒し;従って、Gsタンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの増大された細胞レベルと関連する。他方、Gi(もしくはGo)タンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの低下された細胞レベルと関連する。一般に、“IndirectMechanismsof Synaptic Transmission,”第8章、From Neuron To Brain(第3版)ニコルス(Nichols,J.G.)ら編 サイナウアアソシエーツ インク(SinauerAssociates,Inc.)(1992)を参照されたい。従って、cAMPを検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬(すなわちこうした化合物はcAMPのレベルを低下させることができる)であるかどうかを決定することができる。cAMPを測定するための当該技術分野で既知の多様なアプローチを利用することができ;最も好ましいアプローチはELISAに基づく形式での抗cAMP抗体の使用に頼る。利用することができる別の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状AMPは、cAMP応答性のDNA結合タンパク質もしくは転写因子(CREB)(その後cAMP応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する)の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子(例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ)の前に複数のcAMP応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたGsに結合された受容体は、cAMPの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる(チェン(Chen)ら1995)。
GoおよびGq
GqおよびGoは酵素ホスホリパーゼCの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質PIP2を加水分解して、2種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)を放出する。IP3の増大された蓄積はGqおよびGo会合型受容体の活性化と関連する。一般に、“IndirectMechanisms of Synaptic Transmission,”第8章、From Neuron To Brain(第3版)ニコルス(Nichols,J.G.)ら編サイナウア アソシエーツ インク(SinauerAssociates,Inc.)(1992)を参照されたい。IP3の蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が例えばGqもしくはGo会合型受容体に対する反作用薬である(すなわちこうした化合物はIP3のレベルを低下させることができる)かどうかを決定することができる。Gq会合型受容体はAP1レポーターアッセイ(ここでGq依存性のホスホリパーゼCがAP1要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こす)を使用してもまた検査することができ;従って、活性化されたGq会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それにより、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
3.GPCR融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングのための内在性の構成的に活性化されるオーファンGPCRもしくは非内在性の構成的に活性化されるオーファンGPCRの使用は興味深い挑戦を提供し、ここでは定義によりそれに結合される内在性リガンドの不存在下でさえ該受容体は活性である。従って、活性化された受容体により得られるシグナルを高めることが可能であるアプローチを利用することがしばしば有用である。好ましい一アプローチはGPCR融合タンパク質の使用である。
C.疾患/障害の同定および/もしくは選択
好ましくは、(a)組織mRNAに対するドットブロット分析、および/もしくは(b)組織サンプル中の受容体の発現のRT−PCR同定のためのプローブを作成するのにヒトオーファンGPCRのDNA配列を使用することができる。組織供給源、もしくは疾患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ましく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
D.候補化合物のスクリーニング
1.包括的GPCRスクリーニングアッセイの技術
Gタンパク質受容体が構成的に活性(すなわちそれに結合する内在性リガンドの非存在下で活性)になった場合、それはGタンパク質(例えばGq、Gs、Gi、Go)に結合しかつGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。その後、Gタンパク質がGTPアーゼとして作用し、そしてGTPをGDPにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常な条件下で失活型になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はGDPをGTPに交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニターするのに、GTPの加水分解不可能な類似物[35S]GTPγSを使用することができる。[35S]GTPγSはリガンドの不存在下および存在下での膜へのGタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告されている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は、1995年にトレイノル(Traynor)とナホルスキ(Nahorski)により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質に関係なく、全部のGタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能であるからである。
2.特異的GPCRスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Gタンパク質共役型受容体アッセイ(すなわちアゴニスト、部分的アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ)を使用して候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わりに細胞内ドメインからGタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
a.GsおよびGi
Gsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Gi(およびGo)はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはATPのcAMPへの転化を触媒し;従って、Gsタンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの増大された細胞レベルと関連する。他方、Gi(もしくはGo)タンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの低下された細胞レベルと関連する。一般に、“IndirectMechanismsof Synaptic Transmission,”第8章、From Neuron To Brain(第3版)ニコルス(Nichols,J.G.)ら編 サイナウアアソシエーツ インク(SinauerAssociates,Inc.)(1992)を参照されたい。従って、cAMPを検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬(すなわちこうした化合物はcAMPのレベルを低下させることができる)であるかどうかを決定することができる。cAMPを測定するための当該技術分野で既知の多様なアプローチを利用することができ;最も好ましいアプローチはELISAに基づく形式での抗cAMP抗体の使用に頼る。利用することができる別の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状AMPは、cAMP応答性のDNA結合タンパク質もしくは転写因子(CREB)(その後cAMP応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する)の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子(例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ)の前に複数のcAMP応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたGsに結合された受容体は、cAMPの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる(チェン(Chen)ら1995)。
GoおよびGq
GqおよびGoは酵素ホスホリパーゼCの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質PIP2を加水分解して、2種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)を放出する。IP3の増大された蓄積はGqおよびGo会合型受容体の活性化と関連する。一般に、“IndirectMechanisms of Synaptic Transmission,”第8章、From Neuron To Brain(第3版)ニコルス(Nichols,J.G.)ら編サイナウア アソシエーツ インク(SinauerAssociates,Inc.)(1992)を参照されたい。IP3の蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が例えばGqもしくはGo会合型受容体に対する反作用薬である(すなわちこうした化合物はIP3のレベルを低下させることができる)かどうかを決定することができる。Gq会合型受容体はAP1レポーターアッセイ(ここでGq依存性のホスホリパーゼCがAP1要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こす)を使用してもまた検査することができ;従って、活性化されたGq会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それにより、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
3.GPCR融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングのための内在性の構成的に活性化されるオーファンGPCRもしくは非内在性の構成的に活性化されるオーファンGPCRの使用は興味深い挑戦を提供し、ここでは定義によりそれに結合される内在性リガンドの不存在下でさえ該受容体は活性である。従って、活性化された受容体により得られるシグナルを高めることが可能であるアプローチを利用することがしばしば有用である。好ましい一アプローチはGPCR融合タンパク質の使用である。
一般に、GPCRが上で示されたアッセイ技術(ならびに他者)を使用して構成的に活性化される、もしくはされていることが決定されれば、内在性GPCRと共役する優勢なGタンパク質を決定することが可能である。GPCRへのGタンパク質の共役は評価することが可能なシグナル伝達経路を提供する。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが起こることが最も好ましいため、こうした系はその中に内在性Gタンパク質を有することが期待されよう。従って、定義により、こうした系においては、構成的に活性化されたオーファンGPCRが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングの情況でそれが反作用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろうことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。
GPCR融合タンパク質は、GPCRと共役するGタンパク質の効力を高めることを意図している。GPCR融合タンパク質は非内在性の構成的に活性化されたGPCRを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたアプローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを増大させるからであるが、とは言えGPCR融合タンパク質は内在性の構成的に活性化されたGPCRとともに使用することもまた可能であり、そして好ましくは使用する。これは大きな「S/N」比の助長で重要であり;こうした大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要かつ好ましい。
GPCR融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたGPCR融合タンパク質構築物に対する重要な基準は、GPCR配列およびGタンパク質配列の双方が同じ読み枠にある(好ましくはGPCRの配列がGタンパク質の配列の上流にある)こと、および、GPCRの発現に際してGタンパク質もまた発現することが可能であるようにGPCRの「終止」コドンを欠失もしくは置き換えなくてはならないことである。GPCRはGタンパク質に直接連結することができるか、もしくは2者の間にスペーサー残基(好ましくは約12を越えないが、この数字は当業者により容易に確かめることが可能である)が存在することができる。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペーサーとなるであろうことに、スペーサーの使用の(便宜性に基づく)好みを有する。最も好ましくは、GPCR融合タンパク質構築物の創製に先立ちGPCRに共役するGタンパク質を同定することができる。同定された数種のみのGタンパク質が存在するため、その中の内在性のGPCR配列の挿入にGタンパク質の配列を含んで成る構築物(すなわち普遍的Gタンパク質構築物)が利用可能であることが好ましく;これは、異なる配列を有する多様な異なった内在性GPCRの大スケールのスクリーニングの情況で効率を提供する。
E.他の利用性
本明細書に開示されるヒトオーファンGPCRの好ましい使用は、(好ましくは製薬学的作用物質としての使用のための)反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであることができるが、これらのバージョンのヒトGPCRは研究の設定でもまた利用することができる。例えば、GPCRを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解(それがシグナル伝達カスケードの理解に適用されるため)に利用することができる。ヒトオーファンGPCRの価値は、身体内でのこうした受容体の位置(1種もしくは複数)を決定することにより、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容体の役割を理解するのにGPCRを使用することができることにおいて、研究ツールとしてのその利用性が高められることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許文書の検討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
E.他の利用性
本明細書に開示されるヒトオーファンGPCRの好ましい使用は、(好ましくは製薬学的作用物質としての使用のための)反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであることができるが、これらのバージョンのヒトGPCRは研究の設定でもまた利用することができる。例えば、GPCRを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解(それがシグナル伝達カスケードの理解に適用されるため)に利用することができる。ヒトオーファンGPCRの価値は、身体内でのこうした受容体の位置(1種もしくは複数)を決定することにより、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容体の役割を理解するのにGPCRを使用することができることにおいて、研究ツールとしてのその利用性が高められることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許文書の検討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
以下の実施例は本発明の解明の目的上(そして制限でなく)提示する。特定の核酸およびアミノ酸の配列が本明細書で開示される一方、当業者は、下に報告される同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さな改変を行う能力があると信じられる。下に別の方法で示されない限り、開示される内在性オーファンヒトGPCRの全部の核酸配列は配列決定しかつ確認している。同等の受容体の目的上、当業者は、機能的に同等な受容体を得るために開示された配列に対し保存的置換を行うことができることを容易に認識するであろう。
実施例1
内在性のヒトGPCR
1.ヒトGPCRの同定
ジェンバンク(GenBank)データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトGPCRのいくつかを同定した。データベースを検索する間に以下のcDNAクローンを下に明示されるとおり同定した。
内在性のヒトGPCR
1.ヒトGPCRの同定
ジェンバンク(GenBank)データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトGPCRのいくつかを同定した。データベースを検索する間に以下のcDNAクローンを下に明示されるとおり同定した。
他の開示される内在性ヒトGPCRは、以下のESTクローンをクエリ配列として使用するESTデータベース(dbest)のBLAST検索を実施することにより同定した。その後、同定された以下のESTクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
2.完全長のクローニング
a.hG2A(配列番号23および24)
マウスESTクローン1179426を使用して、3種のアミノ酸hG2Aコーディング配列以外の全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディング配列の5’端は5’RACE(商標)を使用することにより得、また、PCRのための鋳型はクロンテック(Clontech)のヒト脾マラソン−レディ[Marathon−ready](商標)cDNAであった。開示されるヒトG2Aは、以下:
5’−CTGTGTACAGCAGTTCGCAGAGTG−3’(配列番号39;1回目のPCR)
5’−GAGTGCCAGGCAGAGCAGGTAGAC−3’(配列番号40;2回目のPCR)
のような配列番号39および配列番号40に示されるような第一回および第二回のPCRのためのG2AのcDNAに特異的なプライマーを使用するPCRにより増幅した。PCRは、94℃30秒間、次いで94℃5秒間および72℃4分間の5周期;ならびに94°5秒間および70°4分間の30周期で、アドバンテージ[Advantage](商標)GCポリメラーゼキット(クロンテック(Clontech);製造説明書に従うことができる)を使用して実施した。およそ1.3kbのPCRフラグメントをアガロースゲルから精製し、HindIIIおよびXbaIで消化し、そして発現ベクターpRC/CMV2(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化した。T7シークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(USBアマーシャム(USBAmersham);製造元の説明書に従うことができる)を使用してクローン化された挿入物を配列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。P32標識されたフラグメントを用いてRNAドットブロット(クロンテック(Clontech);製造元の説明書に従うことができる)をプロービングすることによりヒトG2Aの発現を検出することができる。
b.hCHN9(配列番号33および34)
ESTクローン1541536の配列決定は、hCHN9が1個の開始コドンのみを有する(すなわち終止コドンは欠けていた)部分的cDNAクローンであることを示した。hCHN9をデータベース(nr)に対して「BLAST検索する(blast)」のに使用した場合、hCHN9の3’の配列はロイコトリエンB4受容体のcDNAの5’非翻訳領域(hCHN9のコーディング配列と同じ読み枠に終止コドンを含有した)に100%相同であった。LTB4RのcDNAの5’非翻訳領域がhCHN9の3’配列であったかどうかを決定するために、hCHN9に見出される開始コドンに隣接する5’配列およびLTB4Rの5’非翻訳領域に見出される終止コドンを取り巻く3’配列に基づくプライマーを使用してPCRを実施した。利用された5’プライマー配列は以下のとおりであった:
5’−CCCGAATTCCTGCTTGCTCCCAGCTTGGCCC−3’(配列番号41;センス)および
5’−TGTGGATCCTGCTGTCAAAGGTCCCATTCCGG−3’(配列番号42;アンチセンス)
製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺cDNAおよびrTthポリメラーゼ(パーキンエルマー(Perkin Elmer))を使用してPCRを実施した。周期条件は、94℃1分間、65℃1分間ならびに72℃1分および10秒間の30周期であった。予測された大きさと一致する1.1kbのフラグメントをPCRから得た。本PCRフラグメントをpCMVにサブクローニングし(下を参照されたい)そして配列決定した(配列番号33を参照されたい)。c.hRUP4(配列番号37および38)
鋳型としてヒト脳cDNA(クロンテック(Clontech))を用いるRT−PCRにより完全長のhRUP4をクローン化した:
5’−TCACAATGCTAGGTGTGGTC−3’(配列番号43;センス)および
5’−TGCATAGACAATGGGATTACAG−3’(配列番号44;アンチセンス)。
以下の周期、すなわち94℃2分間;94℃30秒間;55℃30秒間、72℃45秒間および72℃10分間により、タックプラス[TaqPlus](商標)プレシジョン
[Precision](商標)ポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene);製造説明書に従うことができる)を使用してPCRを実施した。周期2から4を30回反復した。
a.hG2A(配列番号23および24)
マウスESTクローン1179426を使用して、3種のアミノ酸hG2Aコーディング配列以外の全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディング配列の5’端は5’RACE(商標)を使用することにより得、また、PCRのための鋳型はクロンテック(Clontech)のヒト脾マラソン−レディ[Marathon−ready](商標)cDNAであった。開示されるヒトG2Aは、以下:
5’−CTGTGTACAGCAGTTCGCAGAGTG−3’(配列番号39;1回目のPCR)
5’−GAGTGCCAGGCAGAGCAGGTAGAC−3’(配列番号40;2回目のPCR)
のような配列番号39および配列番号40に示されるような第一回および第二回のPCRのためのG2AのcDNAに特異的なプライマーを使用するPCRにより増幅した。PCRは、94℃30秒間、次いで94℃5秒間および72℃4分間の5周期;ならびに94°5秒間および70°4分間の30周期で、アドバンテージ[Advantage](商標)GCポリメラーゼキット(クロンテック(Clontech);製造説明書に従うことができる)を使用して実施した。およそ1.3kbのPCRフラグメントをアガロースゲルから精製し、HindIIIおよびXbaIで消化し、そして発現ベクターpRC/CMV2(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化した。T7シークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(USBアマーシャム(USBAmersham);製造元の説明書に従うことができる)を使用してクローン化された挿入物を配列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。P32標識されたフラグメントを用いてRNAドットブロット(クロンテック(Clontech);製造元の説明書に従うことができる)をプロービングすることによりヒトG2Aの発現を検出することができる。
b.hCHN9(配列番号33および34)
ESTクローン1541536の配列決定は、hCHN9が1個の開始コドンのみを有する(すなわち終止コドンは欠けていた)部分的cDNAクローンであることを示した。hCHN9をデータベース(nr)に対して「BLAST検索する(blast)」のに使用した場合、hCHN9の3’の配列はロイコトリエンB4受容体のcDNAの5’非翻訳領域(hCHN9のコーディング配列と同じ読み枠に終止コドンを含有した)に100%相同であった。LTB4RのcDNAの5’非翻訳領域がhCHN9の3’配列であったかどうかを決定するために、hCHN9に見出される開始コドンに隣接する5’配列およびLTB4Rの5’非翻訳領域に見出される終止コドンを取り巻く3’配列に基づくプライマーを使用してPCRを実施した。利用された5’プライマー配列は以下のとおりであった:
5’−CCCGAATTCCTGCTTGCTCCCAGCTTGGCCC−3’(配列番号41;センス)および
5’−TGTGGATCCTGCTGTCAAAGGTCCCATTCCGG−3’(配列番号42;アンチセンス)
製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺cDNAおよびrTthポリメラーゼ(パーキンエルマー(Perkin Elmer))を使用してPCRを実施した。周期条件は、94℃1分間、65℃1分間ならびに72℃1分および10秒間の30周期であった。予測された大きさと一致する1.1kbのフラグメントをPCRから得た。本PCRフラグメントをpCMVにサブクローニングし(下を参照されたい)そして配列決定した(配列番号33を参照されたい)。c.hRUP4(配列番号37および38)
鋳型としてヒト脳cDNA(クロンテック(Clontech))を用いるRT−PCRにより完全長のhRUP4をクローン化した:
5’−TCACAATGCTAGGTGTGGTC−3’(配列番号43;センス)および
5’−TGCATAGACAATGGGATTACAG−3’(配列番号44;アンチセンス)。
以下の周期、すなわち94℃2分間;94℃30秒間;55℃30秒間、72℃45秒間および72℃10分間により、タックプラス[TaqPlus](商標)プレシジョン
[Precision](商標)ポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene);製造説明書に従うことができる)を使用してPCRを実施した。周期2から4を30回反復した。
PCR産物を1%アガロースゲルで分離し、そして500bpのPCRフラグメントを単離しかつpCRII−TOPOベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))およびSP6/T7プライマー(ストラタジーン(Stratagene))を使用して配列決定した。配列分析は、該PCRフラグメントが実際に、他のGPCRとの類似性をもつ1個の連続的読取り枠を有する代替スプライシングされた形態のAI307658であったことを示した。このPCRフラグメントの完了された配列は以下のとおりであった:
上の配列に基づき、2種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組:
5’−CTGCTTAGAAGAGTGGACCAG−3’(配列番号46;オリゴ1)、
5’−CTGTGCACCAGAAGATCTACAC−3’(配列番号47;オリゴ2)
および、2種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組:
5’−CAAGGATGAAGGTGGTGTAGA−3’(配列番号48;オリゴ3)5’−GTGTAGATCTTCTGGTGCACAGG−3’(配列番号49;オリゴ4)
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ[Marathon−Ready](商標)cDNA(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7400−1)を用いる3’−および5’−racePCRに使用した。RACEPCRにより生成されたDNAフラグメントをpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてSP6/T7プライマー(ストラタジーン(Stratagene))および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。3’RACE産物はポリ(A)テール(tail)およびTAA終止コドンで終了する1個の完了される読取り枠を含有した。5’RACE産物は不完全な5’端を含有した(すなわちATG開始コドンが存在しなかった)。
5’−CTGCTTAGAAGAGTGGACCAG−3’(配列番号46;オリゴ1)、
5’−CTGTGCACCAGAAGATCTACAC−3’(配列番号47;オリゴ2)
および、2種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組:
5’−CAAGGATGAAGGTGGTGTAGA−3’(配列番号48;オリゴ3)5’−GTGTAGATCTTCTGGTGCACAGG−3’(配列番号49;オリゴ4)
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ[Marathon−Ready](商標)cDNA(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7400−1)を用いる3’−および5’−racePCRに使用した。RACEPCRにより生成されたDNAフラグメントをpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてSP6/T7プライマー(ストラタジーン(Stratagene))および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。3’RACE産物はポリ(A)テール(tail)およびTAA終止コドンで終了する1個の完了される読取り枠を含有した。5’RACE産物は不完全な5’端を含有した(すなわちATG開始コドンが存在しなかった)。
新たな5’配列に基づき、オリゴ3および以下のプライマー:
5’−GCAATGCAGGTCATAGTGAGC−3’(配列番号50;オリゴ5)を第2回の5’RACE PCRに使用し、そしてPCR産物を上のとおり分析した。第3回の5’RACEPCRは、アンチセンスプライマー:
5’−TGGAGCATGGTGACGGGAATGCAGAAG−3’(配列番号51;オリゴ6)および
5’−GTGATGAGCAGGTCACTGAGCGCCAAG−3’(配列番号52;オリゴ7)
を利用して実施した。5’RACE PCRの産物の配列は開始コドンATGの存在を示し、また、さらなる回の5’RACE PCRはいかなるそれ以上の5’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
5’−GCAATGCAGGCGCTTAACATTAC−3’(配列番号53;オリゴ8)
およびオリゴ4を使用するRT−PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7404−1)から生成された650bpのPCR産物の配列分析により、完了された5’配列を確認した。オリゴ2および以下のアンチセンスプライマー:
5’−TTGGGTTACAATCTGAAGGGCA−3’(配列番号54;オリゴ9)
を使用するRT−PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7404−1)から生成された670bpのPCR産物の配列分析により、完了された3’配列を確認した。
d.hRUP5(配列番号9および10)
以下の配列:
5’−ACTCCGTGTCCAGCAGGACTCTG−3’(配列番号55)
5’−TGCGTGTTCCTGGACCCTCACGTG−3’(配列番号56)
を有した、ATG開始コドンから上流のセンスプライマー(配列番号55)、および終止コドンとしてTCAを含有するアンチセンスプライマー(配列番号56)、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のhRUP5をクローン化した。段階2から段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃15秒間;69℃40秒間;72℃3分間;および72℃6分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ(Advantage)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech))を使用した。1.4kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))を用いてクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した。配列番号9を参照されたい。
e.hRUP6(配列番号11および12)
プライマー:
5’−CAGGCCTTGGATTTTAATGTCAGGGATGG−3’(配列番号57)および
5’−GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG−3’(配列番号58)
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ[Marathon−Ready](商標)cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のhRUP6をクローン化した。以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃5秒間;66℃40秒間;72℃2.5秒間および72℃7分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ(Advantage)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech)、製造元の説明書に従う)を使用した。周期2から4を30回反復した。1.3kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてABIビッグダイ ターミネーター[Big Dye Terminator](商標)キット(P.E.バイオシステム(P.E.Biosystem))を使用して完全に配列決定した(配列番号11を参照されたい)。
f.hRUP7(配列番号13および14)
プライマー:
5’−TGATGTGATGCCAGATACTAATAGCAC−3’(配列番号59;センス)および
5’−CCTGATTCATTTAGGTGAGATTGAGAC−3’(配列番号60;アンチセンス)
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のRUP7をクローン化した。段階2ないし段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃2分間;94℃15秒間;60℃20秒間;72℃2分間;72℃10分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ[Advantage](商標)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech))を使用した。1.25kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてABIビッグ ダイ ターミネーター[Big DyeTerminator](商
標)キット(P.E.バイオシステム(P.E.Biosystem))を使用して完全に配列決定した。配列番号13を参照されたい。
g.hARE−5(配列番号5および6)
hARE5特異的プライマー5’−CAGCGCAGGGTGAAGCCTGAGAGC−3’配列番号69(センス、開始コドンATGの5’)および5’−GGCACCTGCTGTGACCTGTGCAGG−3’配列番号70(アンチセンス、終止コドンTGAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−5をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち、96℃、2分;96℃、20秒;58℃、30秒;72℃、2分;および72℃、10分による増幅に、タックプラスプレシジョン[TaqPlusPrecision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
5’−GCAATGCAGGTCATAGTGAGC−3’(配列番号50;オリゴ5)を第2回の5’RACE PCRに使用し、そしてPCR産物を上のとおり分析した。第3回の5’RACEPCRは、アンチセンスプライマー:
5’−TGGAGCATGGTGACGGGAATGCAGAAG−3’(配列番号51;オリゴ6)および
5’−GTGATGAGCAGGTCACTGAGCGCCAAG−3’(配列番号52;オリゴ7)
を利用して実施した。5’RACE PCRの産物の配列は開始コドンATGの存在を示し、また、さらなる回の5’RACE PCRはいかなるそれ以上の5’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
5’−GCAATGCAGGCGCTTAACATTAC−3’(配列番号53;オリゴ8)
およびオリゴ4を使用するRT−PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7404−1)から生成された650bpのPCR産物の配列分析により、完了された5’配列を確認した。オリゴ2および以下のアンチセンスプライマー:
5’−TTGGGTTACAATCTGAAGGGCA−3’(配列番号54;オリゴ9)
を使用するRT−PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型(クロンテック(Clontech)、カタログ番号7404−1)から生成された670bpのPCR産物の配列分析により、完了された3’配列を確認した。
d.hRUP5(配列番号9および10)
以下の配列:
5’−ACTCCGTGTCCAGCAGGACTCTG−3’(配列番号55)
5’−TGCGTGTTCCTGGACCCTCACGTG−3’(配列番号56)
を有した、ATG開始コドンから上流のセンスプライマー(配列番号55)、および終止コドンとしてTCAを含有するアンチセンスプライマー(配列番号56)、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のhRUP5をクローン化した。段階2から段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃15秒間;69℃40秒間;72℃3分間;および72℃6分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ(Advantage)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech))を使用した。1.4kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))を用いてクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した。配列番号9を参照されたい。
e.hRUP6(配列番号11および12)
プライマー:
5’−CAGGCCTTGGATTTTAATGTCAGGGATGG−3’(配列番号57)および
5’−GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG−3’(配列番号58)
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ[Marathon−Ready](商標)cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のhRUP6をクローン化した。以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃5秒間;66℃40秒間;72℃2.5秒間および72℃7分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ(Advantage)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech)、製造元の説明書に従う)を使用した。周期2から4を30回反復した。1.3kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてABIビッグダイ ターミネーター[Big Dye Terminator](商標)キット(P.E.バイオシステム(P.E.Biosystem))を使用して完全に配列決定した(配列番号11を参照されたい)。
f.hRUP7(配列番号13および14)
プライマー:
5’−TGATGTGATGCCAGATACTAATAGCAC−3’(配列番号59;センス)および
5’−CCTGATTCATTTAGGTGAGATTGAGAC−3’(配列番号60;アンチセンス)
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNA(クロンテック(Clontech))を使用するRT−PCRにより完全長のRUP7をクローン化した。段階2ないし段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃2分間;94℃15秒間;60℃20秒間;72℃2分間;72℃10分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ[Advantage](商標)cDNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech))を使用した。1.25kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてABIビッグ ダイ ターミネーター[Big DyeTerminator](商
標)キット(P.E.バイオシステム(P.E.Biosystem))を使用して完全に配列決定した。配列番号13を参照されたい。
g.hARE−5(配列番号5および6)
hARE5特異的プライマー5’−CAGCGCAGGGTGAAGCCTGAGAGC−3’配列番号69(センス、開始コドンATGの5’)および5’−GGCACCTGCTGTGACCTGTGCAGG−3’配列番号70(アンチセンス、終止コドンTGAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−5をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち、96℃、2分;96℃、20秒;58℃、30秒;72℃、2分;および72℃、10分による増幅に、タックプラスプレシジョン[TaqPlusPrecision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
予測された大きさの1.1kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマー
シャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した(配列番号5)。
h.hARE−4(配列番号3および4)
hARE−4特異的プライマー5’−CTGGTGTGCTCCATGGCATCCC−3’配列番号67(センス、開始コドンATGの5’)および5’−GTAAGCCTCCCAGAACGAGAGG−3’配列番号68(アンチセンス、終止コドンTGAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−4をクローン化した。段階2ないし段階3が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、30秒;59℃、2分;72℃、10分による増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))および5%DMSOを使用した。
シャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した(配列番号5)。
h.hARE−4(配列番号3および4)
hARE−4特異的プライマー5’−CTGGTGTGCTCCATGGCATCCC−3’配列番号67(センス、開始コドンATGの5’)および5’−GTAAGCCTCCCAGAACGAGAGG−3’配列番号68(アンチセンス、終止コドンTGAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−4をクローン化した。段階2ないし段階3が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、30秒;59℃、2分;72℃、10分による増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))および5%DMSOを使用した。
予測された大きさの1.12kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した(配列番号3)。
i.hARE−3(配列番号1および2)
hARE−3特異的プライマー5’−gatcaagcttCCATCCTACTGAAACCATGGTC−3’配列番号65(センス、小文字のヌクレオチドはHindIIIのオーバーハングを表し、開始コドンとしてのATG)および5’−gatcagatctCAGTTCCAATATTCACACCACCGTC−3’配列番号66(アンチセンス、小文字のヌクレオチドはXbaIのオーバーハングを表し、終止コドンとしてのTCA)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−3をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、1分;55℃、1分;72℃、2分;72℃、10分による増幅にタックプラスプレシジョン[TaqPlus Precision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
i.hARE−3(配列番号1および2)
hARE−3特異的プライマー5’−gatcaagcttCCATCCTACTGAAACCATGGTC−3’配列番号65(センス、小文字のヌクレオチドはHindIIIのオーバーハングを表し、開始コドンとしてのATG)および5’−gatcagatctCAGTTCCAATATTCACACCACCGTC−3’配列番号66(アンチセンス、小文字のヌクレオチドはXbaIのオーバーハングを表し、終止コドンとしてのTCA)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhARE−3をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、1分;55℃、1分;72℃、2分;72℃、10分による増幅にタックプラスプレシジョン[TaqPlus Precision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
予測された大きさの1.3kbのPCRフラグメントを単離し、そしてHindIIIおよびXbaIで消化し、pRC/CMV2ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にHindIIIおよびXbaI部位でクローン化し、そしてT7DN
Aシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した(配列番号1)。
j.hRUP3(配列番号7および8)
hRUP3特異的プライマー5’−GTCCTGCCACTTCGAGACATGG−3’配列番号71(センス、開始コドンとしてのATG)および5’−GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC−3’配列番号72(アンチセンス、終止コドンTAAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhRUP3をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、1分;58℃、1分;72℃、2分;72℃、10分による増幅にタックプラスプレシジョン[TaqPlus Precision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
Aシークェナーゼ[Sequenase](商標)キット(アマーシャム(Amersham))を使用して完全に配列決定した(配列番号1)。
j.hRUP3(配列番号7および8)
hRUP3特異的プライマー5’−GTCCTGCCACTTCGAGACATGG−3’配列番号71(センス、開始コドンとしてのATG)および5’−GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC−3’配列番号72(アンチセンス、終止コドンTAAの3’)、ならびに鋳型としてヒトゲノムDNAを使用するPCRにより完全長のhRUP3をクローン化した。段階2ないし段階4が35回反復された以下の周期、すなわち94℃、3分;94℃、1分;58℃、1分;72℃、2分;72℃、10分による増幅にタックプラスプレシジョン[TaqPlus Precision](商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
予測された大きさの1.0kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII−TOPO(商標)ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen))にクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼキット(アマーシャム(Amersham))を
使用して完全に配列決定した(配列番号7)。
使用して完全に配列決定した(配列番号7)。
実施例2
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞を利用することが最も好ましい。これの主な理由は実地的なことに基づく。すなわち、例えばGPCRの発現のための酵母細胞の利用は、可能な一方で、受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい(事実、酵母の場合は包含しない)非哺乳動物細胞、および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のうちCOS−7、293および293T細胞がとりわけ好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。開示されるGPCRの発現のための一般的手順は以下のとおりである。
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞を利用することが最も好ましい。これの主な理由は実地的なことに基づく。すなわち、例えばGPCRの発現のための酵母細胞の利用は、可能な一方で、受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい(事実、酵母の場合は包含しない)非哺乳動物細胞、および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のうちCOS−7、293および293T細胞がとりわけ好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。開示されるGPCRの発現のための一般的手順は以下のとおりである。
第1日に、150mmプレートあたり1×107個の293T細胞をプレート培養した。第2日に2本の反応チューブを準備することができる(各チューブについて後に続く比率はプレート1枚あたりである)。すなわち、チューブAは、1.2mlの血清を含まないDMEM(アーヴィンサイエンティフィック(IrvineScientific)、カリフォルニア州アーヴィン)中に20μgのDNA(例えばpCMVベクター;受容体cDNAを含むpCMVベクター、など)を混合することにより準備することができ;チューブBは1.2mlの血清を含まないDMEM中に120μlのリポフェクタミン(ギブコ(Gibco)BRL)を混合することにより準備することができる。チューブAおよびBは反転(数回)により混合し、次いで室温で30〜45分間インキュベートする。混合状態を「トランスフェクション混合物」と称することができる。プレート培養された293T細胞を1×PBSで洗浄し、次いで10mlの血清を含まないDMEMを添加する。その後、細胞に2.4mlのトランスフェクション混合物を添加し、次いで37℃/5%CO2で4時間インキュベートすることができる。その後、トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで25mlのDMEM/10%ウシ胎児血清を添加した。それから細胞を37℃/5%CO2でインキュベートすることができる。72時間のインキュベーション後に、細胞をそれから収穫しかつ分析に利用することができる。
実施例3
開示されるヒトGPCRの組織分布
本明細書に開示されるGPCRの組織分布の測定にはいくつかのアプローチを使用することができる。
1.ドットブロット分析
商業的に入手可能なヒト組織のドットブロット形式を使用して、内在性オーファンGPCRが局在化されている領域の決定のため、こうした受容体をプロービングした。実施例1のGPCRからのcDNAフラグメント(放射標識された)をプローブとして使用したか、もしくは使用することができる。すなわち、製造元の説明書に従って、プライム−イットII[Prime−It II](商標)ランダムプライマー標識キット(ストラタジーン(Stratagene))、#300385)を使用する完全な受容体のcDNA(ベクターから切り出された)を使用して、放射標識されたプローブを生成したか、もしくは生成することができる。製造元の説明書に従い、ヒトRNAマスターブロット[MasterBlot](商標)(クロンテック(Clontech)、#7770−1)を内在性ヒトGPCR放射標識プローブとハイブリダイズさせ、そしてストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットを−80℃で一夜、コダック(Kodak)バイオマックス[BioMax](商標)オートラジオグラフィーフィルムに露光させた。数種の受容体についての結果を表BおよびCに要約する(多様な組織およびそれらの位置を同定する格子についてはそれぞれ図1Aおよび1Bを参照されたい)。hCHN3およびhCHN8を使用して生じられた結果についての例示的ドットブロットを、それぞれ図2Aおよび2Bに提供する。
開示されるヒトGPCRの組織分布
本明細書に開示されるGPCRの組織分布の測定にはいくつかのアプローチを使用することができる。
1.ドットブロット分析
商業的に入手可能なヒト組織のドットブロット形式を使用して、内在性オーファンGPCRが局在化されている領域の決定のため、こうした受容体をプロービングした。実施例1のGPCRからのcDNAフラグメント(放射標識された)をプローブとして使用したか、もしくは使用することができる。すなわち、製造元の説明書に従って、プライム−イットII[Prime−It II](商標)ランダムプライマー標識キット(ストラタジーン(Stratagene))、#300385)を使用する完全な受容体のcDNA(ベクターから切り出された)を使用して、放射標識されたプローブを生成したか、もしくは生成することができる。製造元の説明書に従い、ヒトRNAマスターブロット[MasterBlot](商標)(クロンテック(Clontech)、#7770−1)を内在性ヒトGPCR放射標識プローブとハイブリダイズさせ、そしてストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットを−80℃で一夜、コダック(Kodak)バイオマックス[BioMax](商標)オートラジオグラフィーフィルムに露光させた。数種の受容体についての結果を表BおよびCに要約する(多様な組織およびそれらの位置を同定する格子についてはそれぞれ図1Aおよび1Bを参照されたい)。hCHN3およびhCHN8を使用して生じられた結果についての例示的ドットブロットを、それぞれ図2Aおよび2Bに提供する。
2.RT−PCR
a.hRUP3
hRUP3のmRNAの組織分布を確かめるため、hRUP3特異的プライマーおよび鋳型としてのヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。40μlの反応中で以下の反応周期、すなわち94℃2分間;94℃15秒間;55℃30秒間;72℃1分間;72℃、10分間を使用するPCR反応にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を利用した。プライマーは以下のとおりであった:
5’−GACAGGTACCTTGCCATCAAG−3’(配列番号61;センス)
5’−CTGCACAATGCCAGTGATAAGG−3’(配列番号62;アンチセンス)。
a.hRUP3
hRUP3のmRNAの組織分布を確かめるため、hRUP3特異的プライマーおよび鋳型としてのヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。40μlの反応中で以下の反応周期、すなわち94℃2分間;94℃15秒間;55℃30秒間;72℃1分間;72℃、10分間を使用するPCR反応にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を利用した。プライマーは以下のとおりであった:
5’−GACAGGTACCTTGCCATCAAG−3’(配列番号61;センス)
5’−CTGCACAATGCCAGTGATAAGG−3’(配列番号62;アンチセンス)。
反応の20μlを1%アガロースゲルに負荷し;結果を図3に示す。
図3のデータにより支持されるとおり、利用されたcDNAパネル中の16のヒト組織(脳、結腸、心、腎、肺、卵巣、膵、胎盤、前立腺、骨格、小腸、脾、精巣、胸腺白血球および肝)のうち、単一のhRUP3のバンドは膵からのみ明らかである。他のGPCRを用いるhRUP3のタンパク質配列の付加的な比較分析は、hRUP3の内在性リガンドが小分子であることが予測されるような、小分子の内在性リガンドを有するGPCRにhRUP3が関することを示唆する。
b.hRUP4
プライマーとしてhRUP4 オリゴ8および4、ならびに鋳型としてヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。周期2から4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃30秒間、94℃10秒間、55℃30秒間、72℃2分間および72℃5分間による40μlの反応中での増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
b.hRUP4
プライマーとしてhRUP4 オリゴ8および4、ならびに鋳型としてヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。周期2から4が30回反復された以下の周期、すなわち94℃30秒間、94℃10秒間、55℃30秒間、72℃2分間および72℃5分間による40μlの反応中での増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。
20μlの反応を1%アガロースゲルに負荷してRT−PCR産物を分析し、そして、hRUP4のmRNAは多くのヒト組織で発現されて見出され、心および腎で最も強い発現であった(図4を参照されたい)。PCRフラグメントの真正性を確認するために、hRUP4の5’端由来の300bpのフラグメントをサザンブロット分析のプローブとして使用した。該プローブは、プライム−イットII[Prime−ItII](商標)
ランダムプライマー標識キット(ストラタジーン(Stratagene))を使用して32P−dCTPで標識し、そしてプローブクワント[ProbeQuant](商標)G−50微小カラム(アマーシャム(Amersham))を使用して精製した。12時間のプレハイブリダイゼーション後に42℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを最後に65℃で0.1×SSCで洗浄した。サザンブロットは、該PCRフラグメントをhRUP4として確認した。
c.hRUP5
以下のhRUP5特異的プライマー:
5’−CTGACTTCTTGTTCCTGGCAGCAGCGG−3’(配列番号63;センス)
5’−AGACCAGCCAGGGCACGCTGAAGAGTG−3’(配列番号64;アンチセンス)
および、鋳型としてヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。以下の周期、すなわち94℃30秒間、94℃10秒間、62℃1.5分間、72℃5分間によりかつ周期2から3が30回反復された40μlの反応中での増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。20μlの反応を1.5%アガロースゲルに負荷してRT−PCR産物を分析し、そしてhRUP5のmRNAは末梢血白血球でのみ発現されて見出された(データは示されない)。
d.hRUP6
hRUP6の発現を確認しかつその組織分布を決定するためにRT−PCRを適用した。AC005871およびGPR66セグメントの整列に基づく、使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列:
5’−CCAACACCAGCATCCATGGCATCAAG−3’(配列番号73;センス)
5’−GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG−3’(配列番号74;アンチセンス)
を有し、また、ヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を鋳型として使用した。以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃5秒間;66℃40秒間、72℃2.5分間および72℃7分間により40μlの反応中でタックプラスプレシジョン[TaqPlusPrecision](商標)ポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene);製造説明書に従うことができる)を使用してPCRを実施した。周期2から4を30回反復した。
ランダムプライマー標識キット(ストラタジーン(Stratagene))を使用して32P−dCTPで標識し、そしてプローブクワント[ProbeQuant](商標)G−50微小カラム(アマーシャム(Amersham))を使用して精製した。12時間のプレハイブリダイゼーション後に42℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを最後に65℃で0.1×SSCで洗浄した。サザンブロットは、該PCRフラグメントをhRUP4として確認した。
c.hRUP5
以下のhRUP5特異的プライマー:
5’−CTGACTTCTTGTTCCTGGCAGCAGCGG−3’(配列番号63;センス)
5’−AGACCAGCCAGGGCACGCTGAAGAGTG−3’(配列番号64;アンチセンス)
および、鋳型としてヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を使用してRT−PCRを実施した。以下の周期、すなわち94℃30秒間、94℃10秒間、62℃1.5分間、72℃5分間によりかつ周期2から3が30回反復された40μlの反応中での増幅にタック(Taq)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene))を使用した。20μlの反応を1.5%アガロースゲルに負荷してRT−PCR産物を分析し、そしてhRUP5のmRNAは末梢血白血球でのみ発現されて見出された(データは示されない)。
d.hRUP6
hRUP6の発現を確認しかつその組織分布を決定するためにRT−PCRを適用した。AC005871およびGPR66セグメントの整列に基づく、使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列:
5’−CCAACACCAGCATCCATGGCATCAAG−3’(配列番号73;センス)
5’−GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG−3’(配列番号74;アンチセンス)
を有し、また、ヒト多組織cDNAパネル(MTC、クロンテック(Clontech))を鋳型として使用した。以下の周期、すなわち94℃30秒間;94℃5秒間;66℃40秒間、72℃2.5分間および72℃7分間により40μlの反応中でタックプラスプレシジョン[TaqPlusPrecision](商標)ポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene);製造説明書に従うことができる)を使用してPCRを実施した。周期2から4を30回反復した。
反応の20μlを1.2%アガロースゲルに負荷してRT−PCR産物を分析し、そして、主として胸腺で、また、心、腎、肺、前立腺、小腸および精巣中でより少ない発現で、hRUP6を表す特異的な760bpのDNAフラグメントが発現された(図5を参照されたい)。
本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれによりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。
当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした変形物は本発明および後に続く請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
多様なベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方のヒトGPCRに対する利用の目的上、利用されるベクターはpCMVであることが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約(the BudapestTreatyfor the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose of Patent Procedure)の規定の下に、1998年10月13日にアメリカン タイプ カルチャーコレクション(American TypeCulture Collection)(ATCC)(10801University Blvd.,米国バージニア州マナサス20110−2209)に寄託された。該DNAはATCCにより試験され、そしてそうであることが決定された。ATCCはpCMVに対し以下の寄託番号:ATCC#203351を割り当てている。
Claims (1)
- 出願当初明細書に記載されるGタンパク質共役型受容体をコードする、単離されたポリペプチド。
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