JP2003508026A - ヒトg−タンパク質共役型受容体 - Google Patents
ヒトg−タンパク質共役型受容体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、これらによりコードされるポリペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびこれらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、IGS1−ファミリーと呼ばれるGタンパク質共役型受容体ファミリーに関する。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関し、ここでIGS1遺伝子は過剰発現、非発現、過少発現または抑制(ノックアウト動物)のいずれかである。本発明は、さらに該Gタンパク質共役型受容体ファミリーIGS1のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物をスクリーニングするための方法およびIGS1ポリペプチドおよびポリヌクレオチドおよびIGS1受容体ファミリーに対するアゴニストまたはアンタゴニストの神経医学およびCNS障害の治療における使用に関する。
Description
【0001】
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、これらによりコードされるポ
リペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用およびこ
れらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドは、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に関し、これを以後IGS
1と呼ぶ。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻
害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む
宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関し、ここでIGS1遺伝子は過剰
発現、非発現、過少発現および/または抑制(ノックアウト動物)のいずれかで
ある。本発明は、さらに、該Gタンパク質共役型受容体IGS1のアゴニストま
たはアンタゴニストとして作用できる化合物をスクリーニングするための方法に
も関する。
リペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用およびこ
れらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドは、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に関し、これを以後IGS
1と呼ぶ。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻
害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む
宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関し、ここでIGS1遺伝子は過剰
発現、非発現、過少発現および/または抑制(ノックアウト動物)のいずれかで
ある。本発明は、さらに、該Gタンパク質共役型受容体IGS1のアゴニストま
たはアンタゴニストとして作用できる化合物をスクリーニングするための方法に
も関する。
【0002】
多数の医療的に重要な生物学的過程が、Gタンパク質および/またはセカンド
メッセンジャー、例えばcAMPを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質
により媒介されることは良く証明されている(Lefkowitz, Nature 1991, 351:353
-354) 。本明細書中でこれらのタンパク質は、Gタンパク質と一緒に経路に関与
するタンパク質と呼ばれる。これらのタンパク質の一部の例は、GPC受容体、
例えばアドレナリン作動剤およびドーパミン(Kobilka, B.K. et al., Proc. Nat
l. Acad, Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K. et al., Science, 1987,
238:650-656; Bunzow, J.R., et al., Nature, 1988, 336:783-787) 、Gタンパ
ク質自体、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼC、アデニル酸シク
ラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、およびアクチュエータータンパク質、例
えばタンパク質キナーゼAおよびタンパク質キナーゼC(Simon, M.I., et al.,
Science, 1991, 252:802-8) である。
メッセンジャー、例えばcAMPを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質
により媒介されることは良く証明されている(Lefkowitz, Nature 1991, 351:353
-354) 。本明細書中でこれらのタンパク質は、Gタンパク質と一緒に経路に関与
するタンパク質と呼ばれる。これらのタンパク質の一部の例は、GPC受容体、
例えばアドレナリン作動剤およびドーパミン(Kobilka, B.K. et al., Proc. Nat
l. Acad, Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K. et al., Science, 1987,
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ク質自体、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼC、アデニル酸シク
ラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、およびアクチュエータータンパク質、例
えばタンパク質キナーゼAおよびタンパク質キナーゼC(Simon, M.I., et al.,
Science, 1991, 252:802-8) である。
【0003】
例えば、シグナル伝達の一つの形においてGPCRへのホルモン結合の際に、
受容体は、ヘテロ三量体状Gタンパク質と相互作用してそしてグアニンヌクレオ
チド−結合部位からGDPの分離を誘導する。グアニンヌクレオチドの正常の細
胞濃度において、GTPは部位を直ちに満たす。Gタンパク質のα−サブユニッ
トへのGTPの結合は、受容体からGタンパク質の分離およびGタンパク質のα
ならびにβγサブユニットへの分離を起こす。次いで、GPTを有する形は、ア
デニル酸シクラーゼに結合して活性化する。Gタンパク質自体により触媒される
GTPのGDPへの加水分解(αサブユニットは固有のGTPアーゼ活性を有す
る)は、Gタンパク質をその基底の不活性形に返還させる。αサブユニットのG
TPアーゼ活性は、本質的には、オン/オフスイッチを制御する内部時計である
。αサブユニットのGDP結合形はβγに対する高い親和性を有しそしてαGD
Pのβγとの引き続く再結合は、系を基底状態に返還させる。このように、Gタ
ンパク質は二重の役割、すなわち受容体からエフェクター(この例ではアデニル
酸シクラーゼ)へのシグナルを中継する中間体としておよびシグナルの存続期間
を制御する時計としての役割を有する。
受容体は、ヘテロ三量体状Gタンパク質と相互作用してそしてグアニンヌクレオ
チド−結合部位からGDPの分離を誘導する。グアニンヌクレオチドの正常の細
胞濃度において、GTPは部位を直ちに満たす。Gタンパク質のα−サブユニッ
トへのGTPの結合は、受容体からGタンパク質の分離およびGタンパク質のα
ならびにβγサブユニットへの分離を起こす。次いで、GPTを有する形は、ア
デニル酸シクラーゼに結合して活性化する。Gタンパク質自体により触媒される
GTPのGDPへの加水分解(αサブユニットは固有のGTPアーゼ活性を有す
る)は、Gタンパク質をその基底の不活性形に返還させる。αサブユニットのG
TPアーゼ活性は、本質的には、オン/オフスイッチを制御する内部時計である
。αサブユニットのGDP結合形はβγに対する高い親和性を有しそしてαGD
Pのβγとの引き続く再結合は、系を基底状態に返還させる。このように、Gタ
ンパク質は二重の役割、すなわち受容体からエフェクター(この例ではアデニル
酸シクラーゼ)へのシグナルを中継する中間体としておよびシグナルの存続期間
を制御する時計としての役割を有する。
【0004】
Gタンパク質共役型受容体の膜結合スーパーファミリーは、7個の推定膜貫通
ドメインを有するとして特性化されている。ドメインは、細胞外または細胞質ル
ープにより連結された膜貫通αらせんを示すと考えられている。Gタンパク質共
役型受容体は、広範囲の生物学的活性受容体、例えばホルモン、ウイルス、成長
因子および神経受容体を含む。
ドメインを有するとして特性化されている。ドメインは、細胞外または細胞質ル
ープにより連結された膜貫通αらせんを示すと考えられている。Gタンパク質共
役型受容体は、広範囲の生物学的活性受容体、例えばホルモン、ウイルス、成長
因子および神経受容体を含む。
【0005】
Gタンパク質共役型受容体ファミリーは、CNS障害の治療に使用される神経
弛緩性薬剤に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーの成員の他の例
は、カルシトニン、アドレナリン作動薬、神経ペプチドY、ソマストタチン、ニ
ューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、VIP、CGRP、CRF、
CCK、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドテリン、c
AMP、アデノシン、ムスカリニン作用薬、アセチルコリン、セロトニン、ヒス
タミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−
1、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイルス受容体を含むが、こ
れらに限定はされない。
弛緩性薬剤に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーの成員の他の例
は、カルシトニン、アドレナリン作動薬、神経ペプチドY、ソマストタチン、ニ
ューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、VIP、CGRP、CRF、
CCK、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドテリン、c
AMP、アデノシン、ムスカリニン作用薬、アセチルコリン、セロトニン、ヒス
タミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−
1、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイルス受容体を含むが、こ
れらに限定はされない。
【0006】
大部分のGタンパク質共役型受容体は、機能的タンパク質構造を安定化すると
考えられているジスルフィド結合を形成する最初の2個の細胞外ループのそれぞ
れの中に単独保存システイン残基を有する。7個の膜貫通領域は、TM1、TM
2、TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と呼ばれる。TM5とTM6
とを結合する細胞質ループは、Gタンパク質結合ドメインの主要な成分であろう
。
考えられているジスルフィド結合を形成する最初の2個の細胞外ループのそれぞ
れの中に単独保存システイン残基を有する。7個の膜貫通領域は、TM1、TM
2、TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と呼ばれる。TM5とTM6
とを結合する細胞質ループは、Gタンパク質結合ドメインの主要な成分であろう
。
【0007】
大部分のGタンパク質共役型受容体は、第三細胞質ループおよび/またはカル
ボキシ末端内に潜在的リン酸化部位を含む。数種のGタンパク質共役型受容体、
例えばβ−アドレナリン受容体に対して、タンパク質キナーゼAおよび/または
特定の受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体脱感作を媒介する。
ボキシ末端内に潜在的リン酸化部位を含む。数種のGタンパク質共役型受容体、
例えばβ−アドレナリン受容体に対して、タンパク質キナーゼAおよび/または
特定の受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体脱感作を媒介する。
【0008】
最近、ある種のGPCRは、カルシトニン受容体様受容体と同様に、受容体活
性調節タンパク質(RAMP)と呼ばれる小さい一回通過膜タンパク質と相互作
用するらしいことが発見された。GPCRとある種のRAMPとのこの相互作用
は、天然のリガンドがGPCR−RAMP組合わせに対する関連親和性を有しそ
して複合体の機能的シグナル伝達活性を調節することに決定的である(McLathie,
L.M. et al., Nature (1998) 393:333-339)。
性調節タンパク質(RAMP)と呼ばれる小さい一回通過膜タンパク質と相互作
用するらしいことが発見された。GPCRとある種のRAMPとのこの相互作用
は、天然のリガンドがGPCR−RAMP組合わせに対する関連親和性を有しそ
して複合体の機能的シグナル伝達活性を調節することに決定的である(McLathie,
L.M. et al., Nature (1998) 393:333-339)。
【0009】
ある種の受容体に対して、Gタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位は、
数種のGタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケッ
トを含んでなり、そのソケットはGタンパク質共役型受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられる。それぞれのGタンパク質共役型受容体膜貫通らせん
の親水性側は、内側に向き、そして極性リガンド−結合部位を形成すると考えら
れる。TM3は、数種のGタンパク質共役型受容体においてリガンド−結合部位
、例えばTM3アスパラギン酸残基を有すると考えられている。TM5セリン、
TM6アスパラギンおよびTM6およびTM7フェニルアラニンまたはチロシン
もリガンド結合に関係する。
数種のGタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケッ
トを含んでなり、そのソケットはGタンパク質共役型受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられる。それぞれのGタンパク質共役型受容体膜貫通らせん
の親水性側は、内側に向き、そして極性リガンド−結合部位を形成すると考えら
れる。TM3は、数種のGタンパク質共役型受容体においてリガンド−結合部位
、例えばTM3アスパラギン酸残基を有すると考えられている。TM5セリン、
TM6アスパラギンおよびTM6およびTM7フェニルアラニンまたはチロシン
もリガンド結合に関係する。
【0010】
Gタンパク質共役型受容体は、ヘテロ三量体Gタンパク質により種々の細胞内
酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内結合できる(Johnson
et al., Endoc. Rev., 1989, 10:317-331 参照)。種々のGタンパク質αサブユ
ニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して種々の生物学的機能を細胞内
で調節する。Gタンパク質共役型受容体の細胞質内残基のリン酸化は、ある種の
Gタンパク質共役型受容体のGタンパク質結合の調節のための重要な機構として
同定された。Gタンパク質共役型受容体は哺乳類宿主内の多数の部位に見いださ
れている。
酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内結合できる(Johnson
et al., Endoc. Rev., 1989, 10:317-331 参照)。種々のGタンパク質αサブユ
ニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して種々の生物学的機能を細胞内
で調節する。Gタンパク質共役型受容体の細胞質内残基のリン酸化は、ある種の
Gタンパク質共役型受容体のGタンパク質結合の調節のための重要な機構として
同定された。Gタンパク質共役型受容体は哺乳類宿主内の多数の部位に見いださ
れている。
【0011】
主としてGPCRクラスの受容体は、現在既知の薬剤の半分以上を誘導した(D
rews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516)。これは、これらの受容体が、治
療標的として確立され、証明された経歴を有することを示す。本発明中に記載す
る新規のIGS1 GPCRは、機能不全、障害、または疾患(以後全体的に「
疾患」と呼ぶ)の診断、防止、改善または矯正において役立つことができる別の
受容体の同定および特性決定のために当該技術分野での要求を明らかに満足する
。「疾患」は、精神***症、間欠性発作不安(EPA)障害、例えば強迫症(O
CD)、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、恐怖症およびパニック、重症抑
うつ障害、双極性障害、パーキンソン病、一般不安障害、自閉症、せん妄、多発
性硬化症、アルツハイマー病/痴呆およびその他の神経変性疾患、重症精神遅滞
、運動障害、ハンチントン病、ツレット症候群、チック、振せん、ジストニー、
痙攣、食欲不振、食欲亢進、脳卒中、耽溺/依存/渇望、睡眠障害、テンカン、
偏頭痛、注意散漫/活動過多障害(ADHD)を含む精神医学およびCNS障害
、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、低血圧、高血圧−例えば本態性
高血圧、腎高血圧、または肺高血圧、血栓症、動脈硬化症、脳血管痙攣、クモ膜
下出血、脳虚血、脳梗塞、末梢血管疾患、レイノー症を含む心血管疾患、腎臓疾
患−例えば腎不全、異脂肪症、肥満、嘔吐、過敏性腸症候群(IBS)、炎症性
腸疾患(IBD)、胃食道反射疾患(GERD)、運動性障害および遅延空胃腸
症状、例えば手術後または糖尿病胃不全麻痺、および糖尿病、潰瘍−例えば胃潰
瘍を含む胃腸疾患、下痢、骨そしょう症を含むその他の疾患、炎症、感染症、例
えば細菌、真菌、原虫およびウイルス感染症、特にはHIV−1またはHIV−
2による感染、苦痛、ガン、化学治療誘発障害、腫瘍侵入、免疫疾患、残尿、喘
息、アレルギー、関節炎、良性前立腺肥大、内毒素ショック、敗血症、真性糖尿
病の合併症、および婦人科障害を含み、これらに限定はされない。
rews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516)。これは、これらの受容体が、治
療標的として確立され、証明された経歴を有することを示す。本発明中に記載す
る新規のIGS1 GPCRは、機能不全、障害、または疾患(以後全体的に「
疾患」と呼ぶ)の診断、防止、改善または矯正において役立つことができる別の
受容体の同定および特性決定のために当該技術分野での要求を明らかに満足する
。「疾患」は、精神***症、間欠性発作不安(EPA)障害、例えば強迫症(O
CD)、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、恐怖症およびパニック、重症抑
うつ障害、双極性障害、パーキンソン病、一般不安障害、自閉症、せん妄、多発
性硬化症、アルツハイマー病/痴呆およびその他の神経変性疾患、重症精神遅滞
、運動障害、ハンチントン病、ツレット症候群、チック、振せん、ジストニー、
痙攣、食欲不振、食欲亢進、脳卒中、耽溺/依存/渇望、睡眠障害、テンカン、
偏頭痛、注意散漫/活動過多障害(ADHD)を含む精神医学およびCNS障害
、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、低血圧、高血圧−例えば本態性
高血圧、腎高血圧、または肺高血圧、血栓症、動脈硬化症、脳血管痙攣、クモ膜
下出血、脳虚血、脳梗塞、末梢血管疾患、レイノー症を含む心血管疾患、腎臓疾
患−例えば腎不全、異脂肪症、肥満、嘔吐、過敏性腸症候群(IBS)、炎症性
腸疾患(IBD)、胃食道反射疾患(GERD)、運動性障害および遅延空胃腸
症状、例えば手術後または糖尿病胃不全麻痺、および糖尿病、潰瘍−例えば胃潰
瘍を含む胃腸疾患、下痢、骨そしょう症を含むその他の疾患、炎症、感染症、例
えば細菌、真菌、原虫およびウイルス感染症、特にはHIV−1またはHIV−
2による感染、苦痛、ガン、化学治療誘発障害、腫瘍侵入、免疫疾患、残尿、喘
息、アレルギー、関節炎、良性前立腺肥大、内毒素ショック、敗血症、真性糖尿
病の合併症、および婦人科障害を含み、これらに限定はされない。
【0012】
特に、本発明に記載の新規のIGS1 GPCRは、精神医学およびCNS不
全、障害および疾患、特には運動障害、障害または疾患、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の診断、防止、改善または矯正に重要な役割を演じることができるとい
う別の受容体の同定および特性決定のための当該技術分野の要求を満足する。
全、障害および疾患、特には運動障害、障害または疾患、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の診断、防止、改善または矯正に重要な役割を演じることができるとい
う別の受容体の同定および特性決定のための当該技術分野の要求を満足する。
【0013】
一つの態様では、本発明は、IGS1ポリペプチドおよび組換え物質およびこ
れらの製造のための方法に関する。本発明の別の態様は、このようなIGS1ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドの使用のための方法に関する。このような使
用は、上記のような「疾患」の一つの治療を含み、これに限定はされない。特に
は使用は、精神医学およびCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の治療を含む。
れらの製造のための方法に関する。本発明の別の態様は、このようなIGS1ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドの使用のための方法に関する。このような使
用は、上記のような「疾患」の一つの治療を含み、これに限定はされない。特に
は使用は、精神医学およびCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の治療を含む。
【0014】
さらに別の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いるアゴニ
ストおよびアンタゴニストの同定のため、および同定された化合物を用いるIG
S1平衡失調に関連する状態を治療する方法に関する。本発明のさらに別の態様
は、不適当なIGS1活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断ア
ッセイに関する。本発明のさらに別の態様は、IGS1の異常な発現または活性
から起きる障害に対するモデルとして挙動する動物に基づく系に関する。
ストおよびアンタゴニストの同定のため、および同定された化合物を用いるIG
S1平衡失調に関連する状態を治療する方法に関する。本発明のさらに別の態様
は、不適当なIGS1活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断ア
ッセイに関する。本発明のさらに別の態様は、IGS1の異常な発現または活性
から起きる障害に対するモデルとして挙動する動物に基づく系に関する。
【0015】
【表1】
【0016】
【表2】
【0017】
[発明の詳細な説明]
配列およびモチーフの範囲内での構造類似性は、本発明のIGS1 GPCR
とその他のヒトGPCRとの間で存在する。さらにIGS1は、脳組織、特には
尾状核および被殻内に発現される。従って、IGS1はなかでも上記の「疾患」
に関与すると考えられる。特にIGS1は、精神医学およびCNS障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチン
トン病、運動異常、ジストニーおよび痙攣に関与すると考えられる。
とその他のヒトGPCRとの間で存在する。さらにIGS1は、脳組織、特には
尾状核および被殻内に発現される。従って、IGS1はなかでも上記の「疾患」
に関与すると考えられる。特にIGS1は、精神医学およびCNS障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチン
トン病、運動異常、ジストニーおよび痙攣に関与すると考えられる。
【0018】
別途に断らない限り、本明細書中に使用される技術的および科学的用語は、本
発明が属する当該分野の通常の熟練者により共通して理解されると同様の意味を
有する。本明細書中に記載のものに類似または等価なあらゆる方法および物質が
本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法、装置および物質
をここに記載する。本明細書中に引用したすべての公開文献は、すべての公開文
献を特定して個別に完全に記載すると同様に本明細書中に引用して組み込むと同
様に、引用することにより本明細書中に編入される。
発明が属する当該分野の通常の熟練者により共通して理解されると同様の意味を
有する。本明細書中に記載のものに類似または等価なあらゆる方法および物質が
本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法、装置および物質
をここに記載する。本明細書中に引用したすべての公開文献は、すべての公開文
献を特定して個別に完全に記載すると同様に本明細書中に引用して組み込むと同
様に、引用することにより本明細書中に編入される。
【0019】
以下の定義は、本明細書中にしばしば使用される一部の用語の理解を助けるた
めに記載される。
めに記載される。
【0020】
「IGS1」は、なかでも、配列番号2中に記載のアミノ酸配列またはその対
立遺伝子変種を含んでなるポリペプチドを呼ぶ。
立遺伝子変種を含んでなるポリペプチドを呼ぶ。
【0021】
「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」は、該IGS1の代謝または
生理的機能を呼び、同様の活性または改善された活性または低下した望ましくな
い副作用を有するこれらの活性を含む。該IGS1の抗原性および免疫原性活性
も含まれる。
生理的機能を呼び、同様の活性または改善された活性または低下した望ましくな
い副作用を有するこれらの活性を含む。該IGS1の抗原性および免疫原性活性
も含まれる。
【0022】
「IGS1遺伝子」は、配列番号1中に記載のヌクレオチド配列またはこれら
の対立遺伝子変種および/またはこれらの相補物を含んでなるポリヌクレオチド
を呼ぶ。
の対立遺伝子変種および/またはこれらの相補物を含んでなるポリヌクレオチド
を呼ぶ。
【0023】
本明細書中に使用される「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗
体、キメラ、一本鎖、および人体適応化された抗体、ならびにFab断片を含み
、これにはFabまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物も含
まれる。
体、キメラ、一本鎖、および人体適応化された抗体、ならびにFab断片を含み
、これにはFabまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物も含
まれる。
【0024】
「単離された」は、「人手により」本来(天然)の状態から改変および/また
は本来の環境から分離されたことを意味する。従って、本来的に存在する「単離
された」組成物または物質が「単離」されると、その当初の環境から変化または
移動または両方を受ける。例えば、本来的に生きた動物内に存在するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、しかしその本来の状態で
一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離され」ており、このように本明細書中で用語が使用される。
は本来の環境から分離されたことを意味する。従って、本来的に存在する「単離
された」組成物または物質が「単離」されると、その当初の環境から変化または
移動または両方を受ける。例えば、本来的に生きた動物内に存在するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、しかしその本来の状態で
一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離され」ており、このように本明細書中で用語が使用される。
【0025】
「ポリヌクレオチド」は、一般に、非修飾RNAもしくはDNAまたは修飾R
NAもしくはDNAであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを呼ぶ。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖
状DNA、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるDNA、一本鎖および二本鎖
状RNA、および一本鎖および二本鎖の領域の混合であるRNA、一本鎖または
さらに典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよい
DNAおよびRNAを含んでなるハイブリッド分子を含むが、これに限定はされ
ない。さらに「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAおよ
びDNAの両方を含んでなる三本鎖領域も含んでもよい。用語ポリヌクレオチド
は、1個またはそれ以上の修飾塩基を含むDNAまたはRNAおよび安定性また
はその他の理由により修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修
飾された」塩基は、例えばトリチル化された塩基および通常ではない塩基例えば
イノシンを含む。種々の修飾がDNAおよびRNAに対して行われ、従って、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された、典型的に天
然に見いだされるポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよび細胞のDNA
およびRNA特性の化学的形のポリヌクレオチドの形を包含する。「ポリヌクレ
オチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。
NAもしくはDNAであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを呼ぶ。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖
状DNA、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるDNA、一本鎖および二本鎖
状RNA、および一本鎖および二本鎖の領域の混合であるRNA、一本鎖または
さらに典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよい
DNAおよびRNAを含んでなるハイブリッド分子を含むが、これに限定はされ
ない。さらに「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAおよ
びDNAの両方を含んでなる三本鎖領域も含んでもよい。用語ポリヌクレオチド
は、1個またはそれ以上の修飾塩基を含むDNAまたはRNAおよび安定性また
はその他の理由により修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修
飾された」塩基は、例えばトリチル化された塩基および通常ではない塩基例えば
イノシンを含む。種々の修飾がDNAおよびRNAに対して行われ、従って、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された、典型的に天
然に見いだされるポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよび細胞のDNA
およびRNA特性の化学的形のポリヌクレオチドの形を包含する。「ポリヌクレ
オチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。
【0026】
「ポリペプチド」は、たがいにペプチド結合または変形ペプチド結合、すなわ
ちペプチドアイソスターで結合された2個またはそれ以上のアミノ酸を含んでな
るあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶ。「ポリペプチド」は、一般にペプ
チド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にタンパク
質と呼ばれるさらに長い鎖、および/またはこれらの組み合わせを呼ぶ。ポリペ
プチドは、20個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポ
リペプチド」は、天然の過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技
術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含
む。このような修飾は基本的教科書中およびさらの長大な論文中ならびに大量の
研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起きるこ
とができる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド中の種々の部位におい
て同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられた
ポリペプチドは多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン
化の結果として分枝してもよく、そしてこれらは分枝を有するかまたは有してい
ない環状であってもよい。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後
の天然のプロセシングからもたらされてもよくまたは合成法により作製されても
よい。修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビン
の共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノ
シトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共
有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガ
ンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸
のトランスファーRNA媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含
む。例えば、「タンパク質−構造および分子的性質」(PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company,
New York, 1993)および「翻訳後タンパク質修飾- 前途および予想」(Wold, F.,
Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pg
s. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Joh
nson, Ed. Academic Press, New York, 1983) 、「タンパク質修飾および非タン
パク質補因子の分析」(Seifter et al., "Analysis for protein modifications
and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646)および「タ
ンパク質合成:翻訳後修飾および熟成」(Ratten et al., "Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 66
3:48-62)を参照。
ちペプチドアイソスターで結合された2個またはそれ以上のアミノ酸を含んでな
るあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶ。「ポリペプチド」は、一般にペプ
チド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にタンパク
質と呼ばれるさらに長い鎖、および/またはこれらの組み合わせを呼ぶ。ポリペ
プチドは、20個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポ
リペプチド」は、天然の過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技
術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含
む。このような修飾は基本的教科書中およびさらの長大な論文中ならびに大量の
研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起きるこ
とができる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド中の種々の部位におい
て同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられた
ポリペプチドは多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン
化の結果として分枝してもよく、そしてこれらは分枝を有するかまたは有してい
ない環状であってもよい。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後
の天然のプロセシングからもたらされてもよくまたは合成法により作製されても
よい。修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビン
の共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノ
シトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共
有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガ
ンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸
のトランスファーRNA媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含
む。例えば、「タンパク質−構造および分子的性質」(PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company,
New York, 1993)および「翻訳後タンパク質修飾- 前途および予想」(Wold, F.,
Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pg
s. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Joh
nson, Ed. Academic Press, New York, 1983) 、「タンパク質修飾および非タン
パク質補因子の分析」(Seifter et al., "Analysis for protein modifications
and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646)および「タ
ンパク質合成:翻訳後修飾および熟成」(Ratten et al., "Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 66
3:48-62)を参照。
【0027】
本明細書中の用語としての「変種」は、比較するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な性質、例えば本質的な生物学的、構造
的、調節的または生化学的性質は保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
である。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の比較ポリヌクレオチドとはヌ
クレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列中の変化は、比較ポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化してもしなくても
よい。ヌクレオチド変化は、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を比較
配列によりコードされるポリペプチド中にもたらしてもよく、これは以下に考察
する。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が他の比較ポリペプチドと
異なる。一般に、相違は、比較ポリペプチドおよび変種の配列が全体的には密接
に類似しそして多くの領域で一致している程度に限定される。変種および比較ポ
リペプチドは、アミノ酸配列内で1個またはそれ以上の置換、付加、および欠失
のあらゆる組み合により異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残
基は、遺伝子暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する例えば対立遺伝子変種であ
ってもよく、またはこれは天然に存在するとは知られていない変種であってもよ
い。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非−天然存在変種は、突然変異技術
または直接合成により作製されてもよい。
ペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な性質、例えば本質的な生物学的、構造
的、調節的または生化学的性質は保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
である。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の比較ポリヌクレオチドとはヌ
クレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列中の変化は、比較ポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化してもしなくても
よい。ヌクレオチド変化は、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を比較
配列によりコードされるポリペプチド中にもたらしてもよく、これは以下に考察
する。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が他の比較ポリペプチドと
異なる。一般に、相違は、比較ポリペプチドおよび変種の配列が全体的には密接
に類似しそして多くの領域で一致している程度に限定される。変種および比較ポ
リペプチドは、アミノ酸配列内で1個またはそれ以上の置換、付加、および欠失
のあらゆる組み合により異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残
基は、遺伝子暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する例えば対立遺伝子変種であ
ってもよく、またはこれは天然に存在するとは知られていない変種であってもよ
い。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非−天然存在変種は、突然変異技術
または直接合成により作製されてもよい。
【0028】
「同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一
般に、配列は最高度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は
、当該技術分野で認められた意味を有しそして公開された技術を用いて算出でき
る。例えば下記参照:「コンピューターによる分子生物学」(COMPUTATIONAL MOL
ECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988
);「バイオコンピューティング: 情報学およびゲノムプロジェクト」(BIOCOMPUT
ING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press,
New York, 1993);「配列データのコンピューター分析、第一部」(COMPUTER ANAL
YSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., H
umana Press, Newe Jersey, 1994); 「分子生物学における配列解析」(SEQUENC
E ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G. Academic Press, 1987);お
よび「配列解析プライマー」(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and De
vereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991)。2個のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在するけれ
ども、用語「同一性」は、当該技術分野の熟練者には周知である(Carillo, H.,
and Lipton, D., SIAM J. Applied Math, (1988) 48:1073) 。2個の配列の間の
同一性または類似性を決定するために一般的に使用される方法は、「大型コンピ
ューターへのガイド(Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Acade
mic Press, San Diego, 1994) およびCarillo, H., and Lipton, D., SIAM J. A
pplied Math, (1988) 48:1073 中に開示されたものを含むが、これに限定はされ
ない。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラム
中にコード化されている。配列間の同一性および類似性を決定するための好まし
いコンピュータープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.
et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLAS
TN、FASTA(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403)を
含むが、これに限定はされない。用語「相同」は、「同一性」に置換してもよい
。
般に、配列は最高度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は
、当該技術分野で認められた意味を有しそして公開された技術を用いて算出でき
る。例えば下記参照:「コンピューターによる分子生物学」(COMPUTATIONAL MOL
ECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988
);「バイオコンピューティング: 情報学およびゲノムプロジェクト」(BIOCOMPUT
ING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press,
New York, 1993);「配列データのコンピューター分析、第一部」(COMPUTER ANAL
YSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., H
umana Press, Newe Jersey, 1994); 「分子生物学における配列解析」(SEQUENC
E ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G. Academic Press, 1987);お
よび「配列解析プライマー」(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and De
vereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991)。2個のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在するけれ
ども、用語「同一性」は、当該技術分野の熟練者には周知である(Carillo, H.,
and Lipton, D., SIAM J. Applied Math, (1988) 48:1073) 。2個の配列の間の
同一性または類似性を決定するために一般的に使用される方法は、「大型コンピ
ューターへのガイド(Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Acade
mic Press, San Diego, 1994) およびCarillo, H., and Lipton, D., SIAM J. A
pplied Math, (1988) 48:1073 中に開示されたものを含むが、これに限定はされ
ない。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラム
中にコード化されている。配列間の同一性および類似性を決定するための好まし
いコンピュータープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.
et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLAS
TN、FASTA(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403)を
含むが、これに限定はされない。用語「相同」は、「同一性」に置換してもよい
。
【0029】
説明として、配列番号1の比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば9
5%「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が配列番号1の比較
ヌクレオチド配列のヌクレオチド100個それぞれに対して5個以下のヌクレオ
チド相違を含んでもよいことを除いて、比較配列と同一であることを意味する。
換言すると、比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一であるヌクレ
オチド配列を有すポリヌクレオチドを得るためには、比較配列中のヌクレオチド
の5%以下が欠失または他のヌクレオチドにより置換されてもよいか、または比
較配列中の全ヌクレオチドの5%以下の数のヌクレオチドが比較配列内に挿入さ
れてもよいか、または比較配列内の全ヌクレオチドのいずれかの5%以下のヌク
レオチドの数において欠失、挿入および置換の組み合わせがあってもよい。比較
配列のこれらの変異は、比較ヌクレオチド配列の5または3末端位置においてま
たはこれらの末端位置の間のいかなる位置でも、比較配列中のヌクレオチドの間
で個別に、または比較配列内の1個またはそれ以上の連続基内のヌクレオチドの
いずれかに散在して起きてもよい。
5%「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が配列番号1の比較
ヌクレオチド配列のヌクレオチド100個それぞれに対して5個以下のヌクレオ
チド相違を含んでもよいことを除いて、比較配列と同一であることを意味する。
換言すると、比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一であるヌクレ
オチド配列を有すポリヌクレオチドを得るためには、比較配列中のヌクレオチド
の5%以下が欠失または他のヌクレオチドにより置換されてもよいか、または比
較配列中の全ヌクレオチドの5%以下の数のヌクレオチドが比較配列内に挿入さ
れてもよいか、または比較配列内の全ヌクレオチドのいずれかの5%以下のヌク
レオチドの数において欠失、挿入および置換の組み合わせがあってもよい。比較
配列のこれらの変異は、比較ヌクレオチド配列の5または3末端位置においてま
たはこれらの末端位置の間のいかなる位置でも、比較配列中のヌクレオチドの間
で個別に、または比較配列内の1個またはそれ以上の連続基内のヌクレオチドの
いずれかに散在して起きてもよい。
【0030】
同様に、例えば、配列番号2の比較アミノ酸配列に対して少なくとも95%「
同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が
配列番号2の比較配列のアミノ酸100個のそれぞれに対して5個以下のアミノ
酸変化を含んでもよいことを除いてポリペプチドのアミノ酸配列が比較配列と同
一であること意味する。換言すると、比較アミノ酸配列に少なくとも95%同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、比較配列内のアミノ
酸残基の5%以下が欠失または他のアミノ酸で置換されていてもよいか、または
比較配列内の全アミノ酸残基の5%以下の数のアミノ酸が比較配列中に挿入され
てもよい。比較配列のこれらの変更は、比較アミノ酸配列のアミノもしくはカル
ボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のあらゆる位置で、比較配
列内の残基間に個別にまたは比較配列内の1個またはそれ以上の隣接基内のいず
れかに散在して存在してもよい。本発明のポリペプチド 一つの態様では、本発明は、IGS1ポリペプチド(IGS1タンパク質も含
む)に関する。IGS1ポリペプチドは、配列番号2のポリペプチドおよびCent
raalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)に1999年7月1
5日付けで寄託された寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド;ならびに配列番号2の
アミノ酸配列およびCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ
国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物によりコ
ードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、および配列番号2のものと
少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列および/またはその全長にわた
ってCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄
託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物によりコードされるアミ
ノ酸配列、そしてさらに好ましくは、該アミノ酸配列に少なくとも90%同一、
そしてその上にさらに好ましくは少なくとも95%一致を有するポリペプチドを
含むポリペプチドを含む。さらに、少なくとも97%同一、特には少なくとも9
9%が最も好ましい。IGS1ポリペプチド中には、配列番号2のアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、
オランダ国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してその全長にわた
って少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含
まれ、そしてさらに好ましくは配列番号2に少なくとも90%同一、そしてその
上にさらに好ましくは少なくとも95%同一である。さらに、少なくとも97%
、特には少なくとも99%が最も好ましい。好ましくは、IGS1ポリペプチド
は受容体の少なくとも一つの生物学的活性を示す。
同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が
配列番号2の比較配列のアミノ酸100個のそれぞれに対して5個以下のアミノ
酸変化を含んでもよいことを除いてポリペプチドのアミノ酸配列が比較配列と同
一であること意味する。換言すると、比較アミノ酸配列に少なくとも95%同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、比較配列内のアミノ
酸残基の5%以下が欠失または他のアミノ酸で置換されていてもよいか、または
比較配列内の全アミノ酸残基の5%以下の数のアミノ酸が比較配列中に挿入され
てもよい。比較配列のこれらの変更は、比較アミノ酸配列のアミノもしくはカル
ボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のあらゆる位置で、比較配
列内の残基間に個別にまたは比較配列内の1個またはそれ以上の隣接基内のいず
れかに散在して存在してもよい。本発明のポリペプチド 一つの態様では、本発明は、IGS1ポリペプチド(IGS1タンパク質も含
む)に関する。IGS1ポリペプチドは、配列番号2のポリペプチドおよびCent
raalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)に1999年7月1
5日付けで寄託された寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド;ならびに配列番号2の
アミノ酸配列およびCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ
国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物によりコ
ードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、および配列番号2のものと
少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列および/またはその全長にわた
ってCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄
託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物によりコードされるアミ
ノ酸配列、そしてさらに好ましくは、該アミノ酸配列に少なくとも90%同一、
そしてその上にさらに好ましくは少なくとも95%一致を有するポリペプチドを
含むポリペプチドを含む。さらに、少なくとも97%同一、特には少なくとも9
9%が最も好ましい。IGS1ポリペプチド中には、配列番号2のアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、
オランダ国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してその全長にわた
って少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含
まれ、そしてさらに好ましくは配列番号2に少なくとも90%同一、そしてその
上にさらに好ましくは少なくとも95%同一である。さらに、少なくとも97%
、特には少なくとも99%が最も好ましい。好ましくは、IGS1ポリペプチド
は受容体の少なくとも一つの生物学的活性を示す。
【0031】
IGS1ポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形であってもよくまたはさら
に大きいタンパク質、例えば融合タンパク質の一部分であってもよい。分泌また
はリーダー配列、プロ配列、精製において支援する配列、例えば重複ヒスチジン
残基を含む追加のアミノ酸配列、または組換え物産生の間の安定性のための追加
の配列を含むとしばしば有利である。
に大きいタンパク質、例えば融合タンパク質の一部分であってもよい。分泌また
はリーダー配列、プロ配列、精製において支援する配列、例えば重複ヒスチジン
残基を含む追加のアミノ酸配列、または組換え物産生の間の安定性のための追加
の配列を含むとしばしば有利である。
【0032】
IGS1ポリペプチドの断片も本発明中に含まれる。断片とは、上記のIGS
1ポリペプチドのアミノ酸配列の一部分ではあるが全体ではないものと同様のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。IGS1ポリペプチドと同様に、断片
は「自立」、すなわちこれらが部分または領域を形成するさらに大きいポリペプ
チド内で、最も好ましくは単独の連続領域を含んでなってもよい。本発明のポリ
ペプチド断片の代表的な例は、例えば、IGS1ポリペプチドのアミノ酸番号約
1−20、21−40、41−60、61−80、81−100、および101
から末端の断片を含む。この範囲内で、「約」は一方または両端のいずれかにお
ける数個、5、4、3、2または1個のアミノ酸ほど大きいかまたは小さい特定
の列挙の範囲を含む。
1ポリペプチドのアミノ酸配列の一部分ではあるが全体ではないものと同様のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。IGS1ポリペプチドと同様に、断片
は「自立」、すなわちこれらが部分または領域を形成するさらに大きいポリペプ
チド内で、最も好ましくは単独の連続領域を含んでなってもよい。本発明のポリ
ペプチド断片の代表的な例は、例えば、IGS1ポリペプチドのアミノ酸番号約
1−20、21−40、41−60、61−80、81−100、および101
から末端の断片を含む。この範囲内で、「約」は一方または両端のいずれかにお
ける数個、5、4、3、2または1個のアミノ酸ほど大きいかまたは小さい特定
の列挙の範囲を含む。
【0033】
好ましい断片は、例えば、アミノ末端を含む残基の一連の連続物もしくはカル
ボキシ末端を含む残基の一連の連続物の欠失、またはアミノ末端を含むものおよ
びカルボキシ末端を含むものの残基の2個の連続物の欠失を除き、IGS1ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを含む。構造的または機能的
属性、例えばアルファらせんおよびアルファらせん形成性領域、ベータシートお
よびベータシート形成性領域、ターンおよびターン形成性領域、コイルおよびコ
イル形成性領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両性領域、ベータ両性領域
、フレキシブル領域、表面形成性領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を
含んでなる断片により特徴付けられる断片も好ましい。その他の好ましい断片は
、生物学的活性の断片である。生物学的活性の断片は、受容体活性を媒介するも
のであり、類似した活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望
ましくない活性を有するものを含む。動物中特にはヒト中で抗原または免疫原性
であるものも好ましい。
ボキシ末端を含む残基の一連の連続物の欠失、またはアミノ末端を含むものおよ
びカルボキシ末端を含むものの残基の2個の連続物の欠失を除き、IGS1ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを含む。構造的または機能的
属性、例えばアルファらせんおよびアルファらせん形成性領域、ベータシートお
よびベータシート形成性領域、ターンおよびターン形成性領域、コイルおよびコ
イル形成性領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両性領域、ベータ両性領域
、フレキシブル領域、表面形成性領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を
含んでなる断片により特徴付けられる断片も好ましい。その他の好ましい断片は
、生物学的活性の断片である。生物学的活性の断片は、受容体活性を媒介するも
のであり、類似した活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望
ましくない活性を有するものを含む。動物中特にはヒト中で抗原または免疫原性
であるものも好ましい。
【0034】
従って、本発明のポリペプチドは、配列番号2のものと少なくとも80%同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび/またはCentraalbureau voor
Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託番号CBS102049
号内に含まれるDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドまたは相当する断片に対して少なくとも80%の同一性を有するこれらの断
片を含む。好ましくは、これら全てのポリペプチド断片は、抗原活性を含む受容
体の生物学的活性を保持する。定義された配列および断片の変種も、本発明の一
部を形成する。好ましい変種は、保存性アミノ酸置換により比較物とは異なるも
のである。すなわち、残基を類似した別の特性のものと置換したものである。こ
のような置換基の典型は、特にAla、Val、LeuおよびLie、特にSe
rおよびThr、特に酸残基AspおよびGlu、特にAsnおよびGln、お
よび特に塩基残基LysおよびArg、または芳香族残基PheおよびTyrで
ある。特に好ましいものは、その中で数個、5−10個、1−5個、または1−
2個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失、または付加された変種であ
る。
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび/またはCentraalbureau voor
Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託番号CBS102049
号内に含まれるDNA挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドまたは相当する断片に対して少なくとも80%の同一性を有するこれらの断
片を含む。好ましくは、これら全てのポリペプチド断片は、抗原活性を含む受容
体の生物学的活性を保持する。定義された配列および断片の変種も、本発明の一
部を形成する。好ましい変種は、保存性アミノ酸置換により比較物とは異なるも
のである。すなわち、残基を類似した別の特性のものと置換したものである。こ
のような置換基の典型は、特にAla、Val、LeuおよびLie、特にSe
rおよびThr、特に酸残基AspおよびGlu、特にAsnおよびGln、お
よび特に塩基残基LysおよびArg、または芳香族残基PheおよびTyrで
ある。特に好ましいものは、その中で数個、5−10個、1−5個、または1−
2個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失、または付加された変種であ
る。
【0035】
本発明のIGS1ポリペプチドは、あらゆる適当な方法で作製できる。このよ
うなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え作製され
たポリペプチド、合成して作製されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み
合わせで作製されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの作製方法は
、当該技術分野では周知である。本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様はIGS1ポリヌクレオチドに関する。IGS1ポリヌクレ
オチドは、IGS1ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、およびこれに密接に関連したポリヌクレオチドを含む。さらに具体的に
は、本発明のIGS1ポリヌクレオチドは、配列番号1中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含んでなるポリヌクレオチド、例えば配列番号2のIGS1ポリペプチ
ドをコードできるもの、配列番号1の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよ
びCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託
番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物に本質的に相当するポリヌ
クレオチドを含む。
うなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え作製され
たポリペプチド、合成して作製されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み
合わせで作製されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの作製方法は
、当該技術分野では周知である。本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様はIGS1ポリヌクレオチドに関する。IGS1ポリヌクレ
オチドは、IGS1ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、およびこれに密接に関連したポリヌクレオチドを含む。さらに具体的に
は、本発明のIGS1ポリヌクレオチドは、配列番号1中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含んでなるポリヌクレオチド、例えば配列番号2のIGS1ポリペプチ
ドをコードできるもの、配列番号1の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよ
びCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託
番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物に本質的に相当するポリヌ
クレオチドを含む。
【0036】
IGS1ポリヌクレオチドは、配列番号2のIGS1ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列に対してその全体にわたって少なくとも80%の同一性を有
するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、配列番号1のものにその
全長にわたって少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリ
ヌクレオチドおよびCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ
国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物に本質的
に相当するポリヌクレオチドをさらに含む。
るヌクレオチド配列に対してその全体にわたって少なくとも80%の同一性を有
するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、配列番号1のものにその
全長にわたって少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリ
ヌクレオチドおよびCentraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ
国)において寄託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物に本質的
に相当するポリヌクレオチドをさらに含む。
【0037】
これに関して、少なくとも90%同一のポリヌクレオチドが特に好ましく、そ
して少なくとも95%同一のポリヌクレオチドがさらに好ましい。さらに、少な
くとも97%のものが高度に好ましく、少なくとも98−99%のものが最も高
度に好ましく、少なくとも99%のものが最も好ましい。IGS1ポリヌクレオ
チドとして、配列番号1内に含まれるヌクレオチド配列に対しまたはCentraalbu
reau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託番号CBS1
02049号内に含まれるDNA挿入物に対して十分な一致性を有するヌクレオ
チド配列も、増幅のためまたはプローブまたはマーカーとしての使用のために使
用可能な条件下でハイブリダイズするために含まれる。本発明は、これらのIG
S1ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
して少なくとも95%同一のポリヌクレオチドがさらに好ましい。さらに、少な
くとも97%のものが高度に好ましく、少なくとも98−99%のものが最も高
度に好ましく、少なくとも99%のものが最も好ましい。IGS1ポリヌクレオ
チドとして、配列番号1内に含まれるヌクレオチド配列に対しまたはCentraalbu
reau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)において寄託番号CBS1
02049号内に含まれるDNA挿入物に対して十分な一致性を有するヌクレオ
チド配列も、増幅のためまたはプローブまたはマーカーとしての使用のために使
用可能な条件下でハイブリダイズするために含まれる。本発明は、これらのIG
S1ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【0038】
本発明のIGS1は、Gタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質
に構造的に関連し、これは公開データベース中のBLASTサーチの結果により
示される。表2のアミノ酸配列(配列番号2)は、約30%の同一性(BLAS
T使用、Altscul S.F. et al.,[1997], Nucleic Acids Res.. 25:3389-3402)を
主要部分(アミノ酸残基7−222および396−470)においてラビットア
ルファ−1cアドレナリン受容体(アクセッション番号#O02824,Miyasa
to et al. RL Life Sci. (1997) 60:2069-2074)と、そして約33%の同一性を
アミノ酸残基31−220において、ヒトGタンパク質共役型受容体RE2(ジ
ーンバンクアクセッション#AF091890)と有する。表1のヌクレオチド
配列(配列番号1)は、57%の同一性をヒトα−1a/dアドレナリン受容体
(アクセッション番号#L31722、Bruno J.F., et al. Biochem. Biophys.
Res. Commun. (1991) 179:1485-1490)と266ヌクレオチド残基で有し、そし
て44%の同一性をヒトGタンパク質共役型受容体RE2と最初の1426ヌク
レオチド残基(ジーンバンクアクセッション#AF091890)において有す
る。さらに、IGS1タンパク質配列のヒドロパシー分析(Hoffmann, K., Stoff
el, W(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347:166) は、膜貫通領域7個の存在を
示した。従って、本発明のIGS1ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、な
かでもこれらの相同的ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似した生物学的
機能/性質を有すると予想され、そしてこれらの有用性は当該技術分野のすべて
の熟練者に明白である。
に構造的に関連し、これは公開データベース中のBLASTサーチの結果により
示される。表2のアミノ酸配列(配列番号2)は、約30%の同一性(BLAS
T使用、Altscul S.F. et al.,[1997], Nucleic Acids Res.. 25:3389-3402)を
主要部分(アミノ酸残基7−222および396−470)においてラビットア
ルファ−1cアドレナリン受容体(アクセッション番号#O02824,Miyasa
to et al. RL Life Sci. (1997) 60:2069-2074)と、そして約33%の同一性を
アミノ酸残基31−220において、ヒトGタンパク質共役型受容体RE2(ジ
ーンバンクアクセッション#AF091890)と有する。表1のヌクレオチド
配列(配列番号1)は、57%の同一性をヒトα−1a/dアドレナリン受容体
(アクセッション番号#L31722、Bruno J.F., et al. Biochem. Biophys.
Res. Commun. (1991) 179:1485-1490)と266ヌクレオチド残基で有し、そし
て44%の同一性をヒトGタンパク質共役型受容体RE2と最初の1426ヌク
レオチド残基(ジーンバンクアクセッション#AF091890)において有す
る。さらに、IGS1タンパク質配列のヒドロパシー分析(Hoffmann, K., Stoff
el, W(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347:166) は、膜貫通領域7個の存在を
示した。従って、本発明のIGS1ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、な
かでもこれらの相同的ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似した生物学的
機能/性質を有すると予想され、そしてこれらの有用性は当該技術分野のすべて
の熟練者に明白である。
【0039】
本発明のポリヌクレオチドは、天然起源、例えばゲノムDNAから得ることが
できる。特には、縮重(degerated) PCRプライマーは、特定のGPCR遺伝子
サブファミリー内の保存された領域をコードするように設計できる。縮重プライ
マーを用いるゲノムDNAまたはcDNA上のPCR増幅反応は、考慮している
遺伝子ファミリーの数種のメンバー(公知および新規の両方)の増幅をもたらす
(ゲノム鋳型を用いる場合には、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなけ
ればならない)(Libert et al., Science, 1989, 244:569-572 )。本発明のポ
リヌクレオチドは、周知で商業的に利用できる技術を用いて合成もできる。
できる。特には、縮重(degerated) PCRプライマーは、特定のGPCR遺伝子
サブファミリー内の保存された領域をコードするように設計できる。縮重プライ
マーを用いるゲノムDNAまたはcDNA上のPCR増幅反応は、考慮している
遺伝子ファミリーの数種のメンバー(公知および新規の両方)の増幅をもたらす
(ゲノム鋳型を用いる場合には、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなけ
ればならない)(Libert et al., Science, 1989, 244:569-572 )。本発明のポ
リヌクレオチドは、周知で商業的に利用できる技術を用いて合成もできる。
【0040】
配列番号2のIGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番
号1中に含まれる配列をコードするポリペプチドと同一であってもよい(ヌクレ
オチド番号36から1559)か、またはこれは、遺伝子コードの重複(縮重)
の結果として、配列番号1内に含まれる配列をコードするポリペプチドと比較し
て変化を示すが、しかし配列番号2のポリペプチドもコードする異なるヌクレオ
チド配列であってもよい。
号1中に含まれる配列をコードするポリペプチドと同一であってもよい(ヌクレ
オチド番号36から1559)か、またはこれは、遺伝子コードの重複(縮重)
の結果として、配列番号1内に含まれる配列をコードするポリペプチドと比較し
て変化を示すが、しかし配列番号2のポリペプチドもコードする異なるヌクレオ
チド配列であってもよい。
【0041】
本発明のポリヌクレオチドがIGS1ポリペプチドの組換え産生に使用される
場合には、ポリペプチドは成熟ポリペプチドに対するコーディング配列またはそ
の断片をそれ自体に成熟ポリペプチドに対するコーディング配列または他のコー
ディング配列を有する読み取り枠内の断片、例えばリーダーまたは分泌配列、プ
レ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列またはその他の融合ペプチ
ド部分をコードするものを含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容
易とするマーカー配列がコードされることができる。本発明のこの実施における
ある好ましい態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、こ
れはpQEベクター(Qiagen, Inc.)として提供され、そしてGentz et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されており、またはHAタグ
である。ポリヌクレオチドは、非−コーディング5’および3’配列、例えば転
写された非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソ
ーム結合部位およびmRNAを安定化する配列も含んでもよい。
場合には、ポリペプチドは成熟ポリペプチドに対するコーディング配列またはそ
の断片をそれ自体に成熟ポリペプチドに対するコーディング配列または他のコー
ディング配列を有する読み取り枠内の断片、例えばリーダーまたは分泌配列、プ
レ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列またはその他の融合ペプチ
ド部分をコードするものを含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容
易とするマーカー配列がコードされることができる。本発明のこの実施における
ある好ましい態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、こ
れはpQEベクター(Qiagen, Inc.)として提供され、そしてGentz et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されており、またはHAタグ
である。ポリヌクレオチドは、非−コーディング5’および3’配列、例えば転
写された非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソ
ーム結合部位およびmRNAを安定化する配列も含んでもよい。
【0042】
さらに好ましい態様は、数個、5−10、1−5、1−3、1−2または1個
のアミノ酸残基があらゆる組み合わせで置換、欠失または付加された配列番号2
のIGS1ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるIGS1変種をコードする
ポリヌクレオチドである。
のアミノ酸残基があらゆる組み合わせで置換、欠失または付加された配列番号2
のIGS1ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるIGS1変種をコードする
ポリヌクレオチドである。
【0043】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、お
よび/または発現の変性を含むが、これに限定はされない種々の目的のためにI
GS1コード化配列を改変するために当該技術分野では一般に公知の方法を用い
て操作することができる。ランダムフラグメンテーションによるDNAシャフリ
ングおよび遺伝子断片ならびに合成オリゴヌクレオチドのPCR再構築を、ヌク
レオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒
介の部位指定突然変異誘発は、アミノ酸置換の創成、新規の制限部位の創成、修
飾(例えばグリコシル化またはリン酸化)パターンの改変、コドン優先の変化、
スプライス変種の産生などの変異を導入するために使用してもよい。
よび/または発現の変性を含むが、これに限定はされない種々の目的のためにI
GS1コード化配列を改変するために当該技術分野では一般に公知の方法を用い
て操作することができる。ランダムフラグメンテーションによるDNAシャフリ
ングおよび遺伝子断片ならびに合成オリゴヌクレオチドのPCR再構築を、ヌク
レオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒
介の部位指定突然変異誘発は、アミノ酸置換の創成、新規の制限部位の創成、修
飾(例えばグリコシル化またはリン酸化)パターンの改変、コドン優先の変化、
スプライス変種の産生などの変異を導入するために使用してもよい。
【0044】
本発明は、さらに、本明細書中に以上に記載した配列にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、ストリンジェントな条件下
で本明細書中に以上に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドに特に関する。本明細書中に使用される用語「ストリンジェント条件」
は、少なくとも80%、そして好ましくは少なくとも90%、そしてさらに好ま
しくは少なくとも95%、それ以上に好ましくは少なくとも97%、特には少な
くとも99%の同一性が配列間で存在する場合にのみハイブリダイゼーションが
起きることを意味する。
リヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、ストリンジェントな条件下
で本明細書中に以上に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドに特に関する。本明細書中に使用される用語「ストリンジェント条件」
は、少なくとも80%、そして好ましくは少なくとも90%、そしてさらに好ま
しくは少なくとも95%、それ以上に好ましくは少なくとも97%、特には少な
くとも99%の同一性が配列間で存在する場合にのみハイブリダイゼーションが
起きることを意味する。
【0045】
配列番号1またはその断片中に含まれるヌクレオチド配列に同一または十分に
同一である本発明のポリヌクレオチドは、cDNAおよびゲノムDNAに対する
ハイブリダイゼーションプローブとして、全長cDNAとIGS1をコードする
ゲノムクローンとを単離しそしてcDNAとIGS1遺伝子に高度の配列類似性
を有する他の遺伝子(ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体をコードす
る遺伝子を含む)のゲノムクローンとを単離するために使用してもよい。当該技
術分野の熟練者は、このようなハイブリダイゼーション技術を熟知している。典
型的にはこれらのヌクレオチド配列は、比較物のものと80%同一、好ましくは
90%同一、さらに好ましくは95%同一である。プローブは、一般に、少なく
とも5個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも8個のヌクレオチド、そ
してさらに好ましくは少なくとも10個のヌクレオチド、もっと好ましくは少な
くとも12個のヌクレオチド、特には少なくとも15個のヌクレオチドを含んで
なる。最も好ましくは、このようなプローブは少なくとも30個のヌクレオチド
そして少なくとも50個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブ
は、30から50個の範囲内のヌクレオチドである。
同一である本発明のポリヌクレオチドは、cDNAおよびゲノムDNAに対する
ハイブリダイゼーションプローブとして、全長cDNAとIGS1をコードする
ゲノムクローンとを単離しそしてcDNAとIGS1遺伝子に高度の配列類似性
を有する他の遺伝子(ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体をコードす
る遺伝子を含む)のゲノムクローンとを単離するために使用してもよい。当該技
術分野の熟練者は、このようなハイブリダイゼーション技術を熟知している。典
型的にはこれらのヌクレオチド配列は、比較物のものと80%同一、好ましくは
90%同一、さらに好ましくは95%同一である。プローブは、一般に、少なく
とも5個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも8個のヌクレオチド、そ
してさらに好ましくは少なくとも10個のヌクレオチド、もっと好ましくは少な
くとも12個のヌクレオチド、特には少なくとも15個のヌクレオチドを含んで
なる。最も好ましくは、このようなプローブは少なくとも30個のヌクレオチド
そして少なくとも50個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブ
は、30から50個の範囲内のヌクレオチドである。
【0046】
ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体を含むIGS1ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを得るための一つの態様は、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で、配列番号1またはその断片を有する標識プロー
ブを用いる適当なライブラリーのスクリーニング、および全長DNAならびに該
ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階を含んでなる。この
ようなハイブリダイゼーション技術は当該技術分野の熟練者には周知である。ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に定義されたもの、また
は42℃で、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15m
Mクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデ
ンハート溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性せん断サケ
***DNAを含む溶液中で一晩インキュベーションし、次いで0.1xSSC中
、約65℃でフィルターを洗浄する条件と定義される。
コードするポリヌクレオチドを得るための一つの態様は、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で、配列番号1またはその断片を有する標識プロー
ブを用いる適当なライブラリーのスクリーニング、および全長DNAならびに該
ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階を含んでなる。この
ようなハイブリダイゼーション技術は当該技術分野の熟練者には周知である。ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に定義されたもの、また
は42℃で、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15m
Mクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデ
ンハート溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性せん断サケ
***DNAを含む溶液中で一晩インキュベーションし、次いで0.1xSSC中
、約65℃でフィルターを洗浄する条件と定義される。
【0047】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒト疾患に対す
る治療および診断の発見のための研究用試薬および材料として使用してもよい。ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベ
クター、および本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞および
組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。細胞を含まない翻訳
系も、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いるこのようなタンパク質の
産生に使用できる。
る治療および診断の発見のための研究用試薬および材料として使用してもよい。ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベ
クター、および本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞および
組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。細胞を含まない翻訳
系も、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いるこのようなタンパク質の
産生に使用できる。
【0048】
組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドに対する発現系
またはこれらの部分を組み込むために遺伝子的に操作できる。宿主細胞内へのポ
リヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば「分子生物学に
おける基本的方法」(Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986
))および「分子クローニング:実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) に記載された方法、例えばリン酸カルシ
ウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション
、トランスヴェクション(transvection)、ミクロ注入、カチオン性脂質媒介トラ
ンスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、
バリスティック導入(Ballistic introduction)または感染により行うことができ
る。
またはこれらの部分を組み込むために遺伝子的に操作できる。宿主細胞内へのポ
リヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば「分子生物学に
おける基本的方法」(Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986
))および「分子クローニング:実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) に記載された方法、例えばリン酸カルシ
ウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション
、トランスヴェクション(transvection)、ミクロ注入、カチオン性脂質媒介トラ
ンスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、
バリスティック導入(Ballistic introduction)または感染により行うことができ
る。
【0049】
適当な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ状球菌、大
腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞および
アスペルギルス属細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエS2およびスポドプ
テラ(Spodoptera)Sf9細胞、動物細胞、例えばCHO、COS、Hela、C
127、3T3、BHK、HEK293およびボウズ・メラノーマ(Bowes melan
oma)細胞、および植物細胞を含む。
腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞および
アスペルギルス属細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエS2およびスポドプ
テラ(Spodoptera)Sf9細胞、動物細胞、例えばCHO、COS、Hela、C
127、3T3、BHK、HEK293およびボウズ・メラノーマ(Bowes melan
oma)細胞、および植物細胞を含む。
【0050】
広範な各種の発現系が使用できる。このような系は、なかでも、染色体、エピ
ソームおよびウイルス誘導系、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージ
から、トランスポソンから、酵母エピソームから、挿入要素から、酵母染色体要
素から、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばSV4
0、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス
およびレトロウイルスに由来するベクター、およびこれらの組み合わせに由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素、例えばコス
ミドおよびファジェミドに由来するものを含む。発現系は、発現を調節ならびに
発生する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中にポリペプチドを産生するた
めのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するために適するあらゆる系また
はベクターを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、各種の周知で慣用の
技術、例えば「分子クローニング:実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECU
LAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、上記)に記載のもののいずれを用いてでも
発現系内に挿入してもよい。
ソームおよびウイルス誘導系、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージ
から、トランスポソンから、酵母エピソームから、挿入要素から、酵母染色体要
素から、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばSV4
0、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス
およびレトロウイルスに由来するベクター、およびこれらの組み合わせに由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素、例えばコス
ミドおよびファジェミドに由来するものを含む。発現系は、発現を調節ならびに
発生する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中にポリペプチドを産生するた
めのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するために適するあらゆる系また
はベクターを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、各種の周知で慣用の
技術、例えば「分子クローニング:実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECU
LAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、上記)に記載のもののいずれを用いてでも
発現系内に挿入してもよい。
【0051】
小胞体の内腔内へ、細胞周辺腔内へまたは細胞外環境内への翻訳されたタンパ
ク質の分泌のために、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド内に組み込んで
もよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在性であってもよくまたは非相
同性シグナルであってもよい。
ク質の分泌のために、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド内に組み込んで
もよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在性であってもよくまたは非相
同性シグナルであってもよい。
【0052】
スクリーニングアッセイで使用するためにIGS1ポリペプチドが発現される
場合に、一般にポリペプチドが細胞の表面で産生されることが好ましい。このイ
ベントにおいて、細胞をスクリーニングアッセイに使用する前に採取してもよい
。IGS1ポリペプチドの親和性または機能的活性が受容体活性調節タンパク質
(RAMP)により変性される場合に、細胞表面におけると考えられる関係する
RAMPの同時発現が好ましく、しばしば要求される。このイベントの場合にも
、IGS1ポリペプチドおよび関係するRAMPを発現する細胞のスクリーニン
グアッセイ使用前での採取も要求される。IGS1ポリペプチドが培地内で分泌
される場合には、培地は、ポリペプチドを回収および精製するために回収できる
。細胞内で産生される場合には、ポリペプチドを回収する前に細胞を先ず溶解し
なければならない。
場合に、一般にポリペプチドが細胞の表面で産生されることが好ましい。このイ
ベントにおいて、細胞をスクリーニングアッセイに使用する前に採取してもよい
。IGS1ポリペプチドの親和性または機能的活性が受容体活性調節タンパク質
(RAMP)により変性される場合に、細胞表面におけると考えられる関係する
RAMPの同時発現が好ましく、しばしば要求される。このイベントの場合にも
、IGS1ポリペプチドおよび関係するRAMPを発現する細胞のスクリーニン
グアッセイ使用前での採取も要求される。IGS1ポリペプチドが培地内で分泌
される場合には、培地は、ポリペプチドを回収および精製するために回収できる
。細胞内で産生される場合には、ポリペプチドを回収する前に細胞を先ず溶解し
なければならない。
【0053】
IGS1ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製できる。最
も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。タンパク質を
リフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが単離および/また
は精製の間に変性される場合に活性配座を再生するために使用してもよい。診断アッセイ 本発明は、診断試薬としての使用のためのIGS1ポリヌクレオチドの使用に
も関する。機能不全と関連するIGS1遺伝子の変異形の検出は、IGS1の過
少発現、過剰発現または改変された発現からもたらされる疾患または疾患への罹
病性の診断に追加またはこれを決定することができる診断手段を提供する。この
イベントにおいても、関連する受容体活性調節タンパク質の同時発現は、所望の
品質の診断アッセイを得るために要求できる。IGS1遺伝子内に変異を有する
個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出してもよい。
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製できる。最
も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。タンパク質を
リフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが単離および/また
は精製の間に変性される場合に活性配座を再生するために使用してもよい。診断アッセイ 本発明は、診断試薬としての使用のためのIGS1ポリヌクレオチドの使用に
も関する。機能不全と関連するIGS1遺伝子の変異形の検出は、IGS1の過
少発現、過剰発現または改変された発現からもたらされる疾患または疾患への罹
病性の診断に追加またはこれを決定することができる診断手段を提供する。この
イベントにおいても、関連する受容体活性調節タンパク質の同時発現は、所望の
品質の診断アッセイを得るために要求できる。IGS1遺伝子内に変異を有する
個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出してもよい。
【0054】
診断のための核酸は、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖
検物質から得てもよい。ゲノムDNAは検出のために直接使用してもよくまたは
分析の前にPCRまたはその他の増幅技術を使用して酵素的に増幅してもよい。
RNAまたはcDNAを同様の方法で使用してもよい。欠失および挿入は、正常
の遺伝子型と比較して増幅の大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅し
たDNAを標識IGS1ヌクレオチド配列にハイブリダイズして同定できる。完
全にマッチした配列は、RNアーゼ消化によりまたは溶融温度の相違によりミス
マッチ二本鎖から区別できる。DNA配列の相違は、変性剤を加えまたは加えな
いゲル内のDNA断片の電気泳動の移動性の改変により、または直接のDNA配
列決定により検出してもよい。例えばMyers et al., Science (1985) 230:1242
参照。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRN
アーゼおよびS1保護または化学開裂法により解明してもよい。Cotton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401参照。別の態様では、IG
S1ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブ
のアレイを例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築するこ
とができる。アレイ技術の方法は周知であり、そして一般的な用途を有しそして
遺伝子発現、遺伝子連結、および遺伝子変化を含む分子遺伝学における各種の問
題を解明するために使用できる(例えばM. Chee et al., Science, Vol 274, pp
610-613(1996) 参照)。
検物質から得てもよい。ゲノムDNAは検出のために直接使用してもよくまたは
分析の前にPCRまたはその他の増幅技術を使用して酵素的に増幅してもよい。
RNAまたはcDNAを同様の方法で使用してもよい。欠失および挿入は、正常
の遺伝子型と比較して増幅の大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅し
たDNAを標識IGS1ヌクレオチド配列にハイブリダイズして同定できる。完
全にマッチした配列は、RNアーゼ消化によりまたは溶融温度の相違によりミス
マッチ二本鎖から区別できる。DNA配列の相違は、変性剤を加えまたは加えな
いゲル内のDNA断片の電気泳動の移動性の改変により、または直接のDNA配
列決定により検出してもよい。例えばMyers et al., Science (1985) 230:1242
参照。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRN
アーゼおよびS1保護または化学開裂法により解明してもよい。Cotton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401参照。別の態様では、IG
S1ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブ
のアレイを例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築するこ
とができる。アレイ技術の方法は周知であり、そして一般的な用途を有しそして
遺伝子発現、遺伝子連結、および遺伝子変化を含む分子遺伝学における各種の問
題を解明するために使用できる(例えばM. Chee et al., Science, Vol 274, pp
610-613(1996) 参照)。
【0055】
診断アッセイは、記載の方法によるIGS1遺伝子内の変異の検出を通じて、
なかでも上記の「疾患」への罹病性を診断または決定するための方法を提供する
。診断アッセイは、特に、神経医学およびCNS障害、特には運動障害、例えば
チック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジ
ストニアおよび痙攣に対する罹病性を、上記の方法によるIGS1遺伝子内の変
異の検出を通じて診断または検出するための方法を提供する。
なかでも上記の「疾患」への罹病性を診断または決定するための方法を提供する
。診断アッセイは、特に、神経医学およびCNS障害、特には運動障害、例えば
チック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジ
ストニアおよび痙攣に対する罹病性を、上記の方法によるIGS1遺伝子内の変
異の検出を通じて診断または検出するための方法を提供する。
【0056】
さらに、なかでも上記の「疾患」は、患者に由来する試料からIGS1ポリペ
プチドまたはIGS1mRNAの異常な低下または増加したレベルから決定する
ことを含んでなる方法により診断できる。特に神経医学およびCNS障害、特に
は運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチント
ン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を患者から誘導した試料からIGS1ポ
リペプチドまたはIGS1mRNAの異常な低下または増加したレベルから決定
することを含んでなる方法により診断できる。
プチドまたはIGS1mRNAの異常な低下または増加したレベルから決定する
ことを含んでなる方法により診断できる。特に神経医学およびCNS障害、特に
は運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチント
ン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を患者から誘導した試料からIGS1ポ
リペプチドまたはIGS1mRNAの異常な低下または増加したレベルから決定
することを含んでなる方法により診断できる。
【0057】
低下または増加した発現は、ポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野で
は周知の方法、例えばPCR、RT−PCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロテ
ィングおよびその他のハイブリダイゼーション法のいずれかを用いてRNAレベ
ルで測定できる。宿主に由来する試料中のタンパク質、例えばIGS1のレベル
を決定するために使用できるアッセイ技術は、当該技術分野の熟練者には周知で
ある。このようなアッセイ方法は、放射免疫検定、競合的結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析およびELISAアッセイを含む。
は周知の方法、例えばPCR、RT−PCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロテ
ィングおよびその他のハイブリダイゼーション法のいずれかを用いてRNAレベ
ルで測定できる。宿主に由来する試料中のタンパク質、例えばIGS1のレベル
を決定するために使用できるアッセイ技術は、当該技術分野の熟練者には周知で
ある。このようなアッセイ方法は、放射免疫検定、競合的結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析およびELISAアッセイを含む。
【0058】
別の態様では、本発明はなかでも「疾患」または上記の「疾患」のひとつに対
する罹病性に対する診断キットに関する、具体的には、本発明は、神経医学およ
びCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキン
ソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する診断キット
に関する。
する罹病性に対する診断キットに関する、具体的には、本発明は、神経医学およ
びCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキン
ソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する診断キット
に関する。
【0059】
このキットは、
(a)IGS1ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号1のヌクレオチド配列、
またはその断片、および/または (b)(a)のものに対して相補的なヌクレオチド配列、および/または (c)IGS1ポリペプチド、好ましくは配列番号2のポリペプチド、またはそ
の断片、および/または (d)IGS1ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号2のポリペプチ
ドに対する抗体、および/または (e)IGS1のポリペプチドの関連する生物学的または抗原的性質に対して必
要なRAMPポリペプチド を含んでなってもよい。
またはその断片、および/または (b)(a)のものに対して相補的なヌクレオチド配列、および/または (c)IGS1ポリペプチド、好ましくは配列番号2のポリペプチド、またはそ
の断片、および/または (d)IGS1ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号2のポリペプチ
ドに対する抗体、および/または (e)IGS1のポリペプチドの関連する生物学的または抗原的性質に対して必
要なRAMPポリペプチド を含んでなってもよい。
【0060】
このようないずれもキットでも、(a)、(b)、(c)、(d)または(e
)は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は、染色体同定に対しても価値がある。配列は、個
別のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的設定されそしてこれとハイブリダ
イズできる。本発明に従う染色体の関連配列の地図作製は、これらの配列を遺伝
子関連疾患と相関させるために重要な第一段階である。配列が正確に染色***置
に場所決定された場合に、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと
相関できる。このようなデータは、例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance
in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで
入手可能)内に見いだされる。次いで、同じ染色体領域に場所決定された遺伝子
と疾患との関係は、連鎖分析により同定される(物理的に隣接した遺伝子の同時
遺伝)。
)は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は、染色体同定に対しても価値がある。配列は、個
別のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的設定されそしてこれとハイブリダ
イズできる。本発明に従う染色体の関連配列の地図作製は、これらの配列を遺伝
子関連疾患と相関させるために重要な第一段階である。配列が正確に染色***置
に場所決定された場合に、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと
相関できる。このようなデータは、例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance
in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで
入手可能)内に見いだされる。次いで、同じ染色体領域に場所決定された遺伝子
と疾患との関係は、連鎖分析により同定される(物理的に隣接した遺伝子の同時
遺伝)。
【0061】
影響および非影響個体の間のcDNAまたはゲノム配列の相違も決定できる。
変異が影響を受けた個体の一部またはすべてに観察されるがしかし正常個体内に
は観察されない場合には、変異は疾患の原因薬剤であろう。抗体 本発明のポリペプチドもしくはこれらの断片もしくはこれらの類似体、または
関連RAMPと一緒に要求される場合にこれらを発現する細胞は、IGS1ポリ
ペプチドに対して免疫特異性な抗体を産生する免疫原として使用してもよい。用
語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドに対するこれら
の親和性よりも本質的に大きい本発明のポリペプチドへの親和性を有することを
意味する。
変異が影響を受けた個体の一部またはすべてに観察されるがしかし正常個体内に
は観察されない場合には、変異は疾患の原因薬剤であろう。抗体 本発明のポリペプチドもしくはこれらの断片もしくはこれらの類似体、または
関連RAMPと一緒に要求される場合にこれらを発現する細胞は、IGS1ポリ
ペプチドに対して免疫特異性な抗体を産生する免疫原として使用してもよい。用
語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドに対するこれら
の親和性よりも本質的に大きい本発明のポリペプチドへの親和性を有することを
意味する。
【0062】
IGS1ポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドまたはエピトー
プ−保持断片、類似体または細胞を動物、好ましくはヒト以外に慣用のプロトコ
ールを通じて投与して得てもよい。モノクローナル抗体の作製のために、連続細
胞様培養により産生される抗体を供給するあらゆる技術を使用してもよい。その
例は、ハイブリドーマ技術(Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:
495-497)、トリオーマ技術、ヒトB−細胞技術(Kozbor et al., Immunology Tod
ay (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp77-96, Alan R. Liss, Ic., 1985) を含む
。
プ−保持断片、類似体または細胞を動物、好ましくはヒト以外に慣用のプロトコ
ールを通じて投与して得てもよい。モノクローナル抗体の作製のために、連続細
胞様培養により産生される抗体を供給するあらゆる技術を使用してもよい。その
例は、ハイブリドーマ技術(Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:
495-497)、トリオーマ技術、ヒトB−細胞技術(Kozbor et al., Immunology Tod
ay (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp77-96, Alan R. Liss, Ic., 1985) を含む
。
【0063】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するため
またはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために
使用してもよい。
またはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために
使用してもよい。
【0064】
IGS1ポリペプチド自体に対する抗体、またはIGS1ポリペプチド−RA
MP複合体に対する抗体は、なかでも上記の「疾患」を治療するために使用して
もよい。特には、IGS1ポリペプチド自体に対する抗体、またはIGS1ポリ
ペプチド−RAMP複合体に対する抗体は、神経医学およびCNS障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン
病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用してもよい。動物 本発明の別の態様は、IGS1の異常な発現または活性から起きる障害に対す
るモデルとして挙動するヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に
基づくモデル系は、IGS1遺伝子の活性をさらに特徴付けるために使用しても
よい。このような系は、IGS1に基づく疾患、例えばなかでも上記の「疾患」
を治療できる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分と
して使用してもよい。特には、この系はIGS1に基づく神経医学およびCNS
障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、
ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用できる
化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分として使用して
もよい。
MP複合体に対する抗体は、なかでも上記の「疾患」を治療するために使用して
もよい。特には、IGS1ポリペプチド自体に対する抗体、またはIGS1ポリ
ペプチド−RAMP複合体に対する抗体は、神経医学およびCNS障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン
病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用してもよい。動物 本発明の別の態様は、IGS1の異常な発現または活性から起きる障害に対す
るモデルとして挙動するヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に
基づくモデル系は、IGS1遺伝子の活性をさらに特徴付けるために使用しても
よい。このような系は、IGS1に基づく疾患、例えばなかでも上記の「疾患」
を治療できる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分と
して使用してもよい。特には、この系はIGS1に基づく神経医学およびCNS
障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、
ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用できる
化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分として使用して
もよい。
【0065】
この方法で、動物に基づくモデルは、IGS1の異常な発現または活性の障害
の治療において有効であるような薬剤化合物、治療および介入を同定するために
使用してもよい。さらにこのような動物モデルは、動物患者内のLD50およびE
D50を測定するために使用してもよい。これらのデータは、潜在的IGS1障害
治療の生体内効力を決定するために使用してもよい。
の治療において有効であるような薬剤化合物、治療および介入を同定するために
使用してもよい。さらにこのような動物モデルは、動物患者内のLD50およびE
D50を測定するために使用してもよい。これらのデータは、潜在的IGS1障害
治療の生体内効力を決定するために使用してもよい。
【0066】
異常なIGS1発現また活性に基づくIGS1に基づく障害の動物に基づくモ
デル系は、非−組換え動物ならびに組換え操作トランスジェニック動物の両方を
含んでもよい。
デル系は、非−組換え動物ならびに組換え操作トランスジェニック動物の両方を
含んでもよい。
【0067】
IGS1障害に対する動物モデルは、例えば遺伝子モデルを含んでもよい。I
GS1に基づく障害様症候群を示す動物モデルは、例えばIGS1配列、例えば
上記のもののような配列を、当該技術分野の熟練者に周知のトランスジェニック
動物作製のための技術と組み合わせて使用して操作してもよい。例えば、IGS
1配列は、関係する動物のゲノム内に導入、そして過剰発現および/または発現
欠失しても、または内在性IGS1配列が存在する場合には、これらを過剰発現
、発現欠失のいずれでもよく、または、その代わりに、IGS1遺伝子発現を過
少発現または不活性化するために破壊してもよい。
GS1に基づく障害様症候群を示す動物モデルは、例えばIGS1配列、例えば
上記のもののような配列を、当該技術分野の熟練者に周知のトランスジェニック
動物作製のための技術と組み合わせて使用して操作してもよい。例えば、IGS
1配列は、関係する動物のゲノム内に導入、そして過剰発現および/または発現
欠失しても、または内在性IGS1配列が存在する場合には、これらを過剰発現
、発現欠失のいずれでもよく、または、その代わりに、IGS1遺伝子発現を過
少発現または不活性化するために破壊してもよい。
【0068】
IGS1遺伝子配列を過剰発現または発現欠失するために、IGS1遺伝子配
列のコーディング部分は、高レベル遺伝子発現または関係する動物種で遺伝子が
正常では発現されない細胞種内での発現を駆動することが可能な調節配列に連結
されてもよい。このような調節領域は、当該技術分野の熟練者には周知であり、
そして不当に多くの実験を行わないで使用してもよい。
列のコーディング部分は、高レベル遺伝子発現または関係する動物種で遺伝子が
正常では発現されない細胞種内での発現を駆動することが可能な調節配列に連結
されてもよい。このような調節領域は、当該技術分野の熟練者には周知であり、
そして不当に多くの実験を行わないで使用してもよい。
【0069】
内在性IGS1遺伝子配列の過少発現のために、このような配列を単離および
操作して、関係する動物のゲノム内に再導入された場合に、内在性IGS1遺伝
子対立遺伝子が不活性化、すなわち「ノックアウト」されてもよい。好ましくは
、操作されたIGS1遺伝子配列は、遺伝子標的法を介して、例えば動物ゲノム
内へ操作されたIGS1遺伝子配列の組込みの際に内在性IGS1配列が破壊さ
れるように導入される。
操作して、関係する動物のゲノム内に再導入された場合に、内在性IGS1遺伝
子対立遺伝子が不活性化、すなわち「ノックアウト」されてもよい。好ましくは
、操作されたIGS1遺伝子配列は、遺伝子標的法を介して、例えば動物ゲノム
内へ操作されたIGS1遺伝子配列の組込みの際に内在性IGS1配列が破壊さ
れるように導入される。
【0070】
マウス、ラット、ラビット、リス、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、およ
び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル、および類人猿を含むが、これに限定はさ
れないあらゆる種の動物を、IGS1関連障害の動物モデルを作製するために使
用してもよい。
び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル、および類人猿を含むが、これに限定はさ
れないあらゆる種の動物を、IGS1関連障害の動物モデルを作製するために使
用してもよい。
【0071】
当該技術分野で公知のあらゆる技術は、IGS1導入遺伝子を動物内に導入し
てトランスジェニック動物の創始株を作製するために使用してもよい。このよう
な技術は、前核ミクロ注入(Hoppe, P.C. and Wagner, T.E. 1989, 米国特許(US)
第4,873,191 号);レトロウイルス媒介の生殖細胞系内への遺伝子導入(van der P
utten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985); 胚幹細胞内
での遺伝子標的法(Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989); 胚の電気穿孔(L
o, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814, 1983); および***媒介遺伝子導入(Lavitra
no et al., Cell 57:717-723, 1989) 等を含むが、これらに限定はされない。こ
のような技術の概説は、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytrol. 115
:171-229, 1989参照。
てトランスジェニック動物の創始株を作製するために使用してもよい。このよう
な技術は、前核ミクロ注入(Hoppe, P.C. and Wagner, T.E. 1989, 米国特許(US)
第4,873,191 号);レトロウイルス媒介の生殖細胞系内への遺伝子導入(van der P
utten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985); 胚幹細胞内
での遺伝子標的法(Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989); 胚の電気穿孔(L
o, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814, 1983); および***媒介遺伝子導入(Lavitra
no et al., Cell 57:717-723, 1989) 等を含むが、これらに限定はされない。こ
のような技術の概説は、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytrol. 115
:171-229, 1989参照。
【0072】
本発明は、すべてのこれらの細胞内にIGS1導入遺伝子を有するトランスジ
ェニック動物、ならびに一部であるがすべてではない細胞内に導入遺伝子を有す
る動物、すなわちモザイク動物を提供する (例えばJakobovitz, Curr. Biol. 4:
761-763, 1994に記載の技術参照) 。導入遺伝子は、単独の導入遺伝子として、
またはコンカテマー、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム内に組み込ま
れてもよい。導入遺伝子は、例えばラスコらの教示(Lasko, M. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236, 1992) に従って、特定の細胞種内に選択的
に導入しそして活性化してもよい。
ェニック動物、ならびに一部であるがすべてではない細胞内に導入遺伝子を有す
る動物、すなわちモザイク動物を提供する (例えばJakobovitz, Curr. Biol. 4:
761-763, 1994に記載の技術参照) 。導入遺伝子は、単独の導入遺伝子として、
またはコンカテマー、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム内に組み込ま
れてもよい。導入遺伝子は、例えばラスコらの教示(Lasko, M. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236, 1992) に従って、特定の細胞種内に選択的
に導入しそして活性化してもよい。
【0073】
このような細胞種特異性活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細
胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかである。
胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかである。
【0074】
IGS1導入遺伝子を内在性IGS1遺伝子の染色体部位内に組み込むことを
望む場合には、遺伝子標的法が好ましい。要約すると、この技術を用いる場合に
は、関係する内在性IGS1遺伝子に相同なあるヌクレオチド配列(例えばマウ
スIGS1遺伝子のヌクレオチド配列)を含むベクターを、染色体配列との相同
組換えを介して、内在性IGS1遺伝子または遺伝子対立遺伝子のヌクレオチド
配列内に組込み、そしてその機能を破壊する目的で設計される。導入遺伝子は、
特定の細胞種内に選択的に導入されてもよく、これによりその細胞種内でのみ関
係する内在性遺伝子を不活性化し、これは例えばグらの教示に従う(Gu, H. et a
l., Science 265:103-106, 1996)。このような細胞種特異性不活性化のために必
要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者
には明らかであろう。
望む場合には、遺伝子標的法が好ましい。要約すると、この技術を用いる場合に
は、関係する内在性IGS1遺伝子に相同なあるヌクレオチド配列(例えばマウ
スIGS1遺伝子のヌクレオチド配列)を含むベクターを、染色体配列との相同
組換えを介して、内在性IGS1遺伝子または遺伝子対立遺伝子のヌクレオチド
配列内に組込み、そしてその機能を破壊する目的で設計される。導入遺伝子は、
特定の細胞種内に選択的に導入されてもよく、これによりその細胞種内でのみ関
係する内在性遺伝子を不活性化し、これは例えばグらの教示に従う(Gu, H. et a
l., Science 265:103-106, 1996)。このような細胞種特異性不活性化のために必
要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者
には明らかであろう。
【0075】
トランスジェニック動物が作製されると、組換えIGS1遺伝子およびタンパ
ク質の発現を標準技術を用いてアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、
導入遺伝子の組込みが起きたかどうかをアッセイするために動物組織を分析する
ために、サザンブロット分析またはPCR技術により行ってもよい。トランスジ
ェニック動物の組織内のIGS1導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、動物か
ら得た組織試料のノーザンブロット分析、in situ ハイブリダイゼーション技術
,およびRT−PCRを含むがこれに限定はされない技術を用いて評価してもよ
い。標的遺伝子−発現組織の試料を、関係する標的遺伝子導入遺伝子産物に対す
る抗体特異性を用いて免疫細胞化学的に評価してもよい。容易に検出できるレベ
ルでIGS1遺伝子mRNAまたはIGS1導入遺伝子ペプチドを発現するIG
S1トランスジェニック動物(標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を用いて
免疫細胞化学的に検出)を、次いでさらに、特徴的なIGS1に基づく疾障害候
群を示すこれらの動物を同定するために続いて評価してもよい。
ク質の発現を標準技術を用いてアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、
導入遺伝子の組込みが起きたかどうかをアッセイするために動物組織を分析する
ために、サザンブロット分析またはPCR技術により行ってもよい。トランスジ
ェニック動物の組織内のIGS1導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、動物か
ら得た組織試料のノーザンブロット分析、in situ ハイブリダイゼーション技術
,およびRT−PCRを含むがこれに限定はされない技術を用いて評価してもよ
い。標的遺伝子−発現組織の試料を、関係する標的遺伝子導入遺伝子産物に対す
る抗体特異性を用いて免疫細胞化学的に評価してもよい。容易に検出できるレベ
ルでIGS1遺伝子mRNAまたはIGS1導入遺伝子ペプチドを発現するIG
S1トランスジェニック動物(標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を用いて
免疫細胞化学的に検出)を、次いでさらに、特徴的なIGS1に基づく疾障害候
群を示すこれらの動物を同定するために続いて評価してもよい。
【0076】
IGS1トランスジェニック創始動物(すなわち、関係する細胞または組織内
にIGS1タンパク質を発現し、そしてこれは好ましくは、IGS1に基づく障
害の症候群を示す動物)が作製されると、特定の動物のコロニーを作製するため
にこれらを育種、同系交配、異系交配、または交雑交配してもよい。このような
育種戦略の例は、分離した株を確立するために1種を越える組込み部位を有する
創始動物の異系交配、それぞれのIGS1導入遺伝子の付加発現の効果のために
高いレベルで関係するIGS1導入遺伝子を発現する複合IGS1トランスジェ
ニックを産生するための分離した株の同系交配、増加した発現およびDNA分析
による動物のスクリーニングの考えられる必要性を除くために、与えられた組込
み部位に対して異型接合の動物を作製するための異型接合トランスジェニック動
物の交雑、複合異型接合または同型接合株を作製するための分離した同型接合株
の交雑、IGS1導入遺伝子の発現およびIGS1様症候群の発生に対する対立
遺伝子変性の効果を検討するための種々の同系交配遺伝子背景への動物の育種を
含むがこれらの限定はされない。このような方法の一つは、IGS1関連障害様
症候群、例えば上記のものを示すF1世代を作製するために、IGS1トランス
ジェニック創始動物と野生型株との交雑である。次いで、異型接合標的遺伝子ト
ランスジェニック動物が生育可能である場合に、異型接合株を発生させるために
、F1世代を同型交配してもよい。ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、
これは、哺乳類にIGS1ポリペプチドまたはその断片を、所要の場合には抗体
および/またはT細胞免疫反応を発生するために適するRAMPポリペプチドと
一緒に投与(例えば接種)して、なかでも上記の「疾患」の一つから該動物を保
護することを含んでなる。
にIGS1タンパク質を発現し、そしてこれは好ましくは、IGS1に基づく障
害の症候群を示す動物)が作製されると、特定の動物のコロニーを作製するため
にこれらを育種、同系交配、異系交配、または交雑交配してもよい。このような
育種戦略の例は、分離した株を確立するために1種を越える組込み部位を有する
創始動物の異系交配、それぞれのIGS1導入遺伝子の付加発現の効果のために
高いレベルで関係するIGS1導入遺伝子を発現する複合IGS1トランスジェ
ニックを産生するための分離した株の同系交配、増加した発現およびDNA分析
による動物のスクリーニングの考えられる必要性を除くために、与えられた組込
み部位に対して異型接合の動物を作製するための異型接合トランスジェニック動
物の交雑、複合異型接合または同型接合株を作製するための分離した同型接合株
の交雑、IGS1導入遺伝子の発現およびIGS1様症候群の発生に対する対立
遺伝子変性の効果を検討するための種々の同系交配遺伝子背景への動物の育種を
含むがこれらの限定はされない。このような方法の一つは、IGS1関連障害様
症候群、例えば上記のものを示すF1世代を作製するために、IGS1トランス
ジェニック創始動物と野生型株との交雑である。次いで、異型接合標的遺伝子ト
ランスジェニック動物が生育可能である場合に、異型接合株を発生させるために
、F1世代を同型交配してもよい。ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、
これは、哺乳類にIGS1ポリペプチドまたはその断片を、所要の場合には抗体
および/またはT細胞免疫反応を発生するために適するRAMPポリペプチドと
一緒に投与(例えば接種)して、なかでも上記の「疾患」の一つから該動物を保
護することを含んでなる。
【0077】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に
関し、これは動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫学的反応を誘導
するために、IGS1ポリペプチドを生体内でのIGS1ポリヌクレオチドの発
現を指令するベクターを介して供給することを含んでなる。
関し、これは動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫学的反応を誘導
するために、IGS1ポリペプチドを生体内でのIGS1ポリヌクレオチドの発
現を指令するベクターを介して供給することを含んでなる。
【0078】
本発明の別の態様は、哺乳類宿主内に導入された場合に、IGS1ポリペプチ
ドに対する哺乳類内の免疫学的反応を誘導する免疫学的/ワクチン調剤(組成物
)に関し、ここでその組成物はIGS1ポリペプチドまたはIGS1遺伝子を含
んでなる。このような免疫学的/ワクチン調剤(組成物)は、治療用の免疫学的
/ワクチン調剤または予防用の免疫学的/ワクチン調剤のいずれかであってもよ
い。ワクチン調剤は、さらに適当なキャリヤーを含んでなってもよい。IGS1
ポリペプチドは胃内で分解されるので、これは好ましくは非経口的に投与される
(皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む)。非経口投与のために適する
調剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調剤をレシピエントの血液と等張性と
するための溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液剤、および懸濁剤ま
たは増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌注液剤を含む。調剤は、単位投
与または複数投与容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアル内に存在しても
よく、そして使用の直前に滅菌液体キャリヤーを加えるだけでよい凍結乾燥状態
で貯蔵してもよい。ワクチン調剤は、調剤の免疫原性を増強するためのアジュバ
ント系、例えば水中油系およびその他の当該技術分野では公知の系を含んでもよ
い。用量はワクチンの活性に依存しそして日常的な試験により容易に決定できる
。スクリーニングアッセイ 本発明のIGS1ポリペプチドは、受容体を結合しそして本発明の受容体ポリ
ペプチドの活性化(アゴニスト)または活性化の阻害(アンタゴニスト)をする
化合物に対するスクリーニングプロセスに使用してもよい。従って、本発明のポ
リペプチドは、小分子基質および例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学ライ
ブラリー、および天然産物混合物内のリガンドの結合を評価するために使用して
もよい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであっても
または構造的または機能的疑似体であってもよい。
ドに対する哺乳類内の免疫学的反応を誘導する免疫学的/ワクチン調剤(組成物
)に関し、ここでその組成物はIGS1ポリペプチドまたはIGS1遺伝子を含
んでなる。このような免疫学的/ワクチン調剤(組成物)は、治療用の免疫学的
/ワクチン調剤または予防用の免疫学的/ワクチン調剤のいずれかであってもよ
い。ワクチン調剤は、さらに適当なキャリヤーを含んでなってもよい。IGS1
ポリペプチドは胃内で分解されるので、これは好ましくは非経口的に投与される
(皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む)。非経口投与のために適する
調剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調剤をレシピエントの血液と等張性と
するための溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液剤、および懸濁剤ま
たは増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌注液剤を含む。調剤は、単位投
与または複数投与容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアル内に存在しても
よく、そして使用の直前に滅菌液体キャリヤーを加えるだけでよい凍結乾燥状態
で貯蔵してもよい。ワクチン調剤は、調剤の免疫原性を増強するためのアジュバ
ント系、例えば水中油系およびその他の当該技術分野では公知の系を含んでもよ
い。用量はワクチンの活性に依存しそして日常的な試験により容易に決定できる
。スクリーニングアッセイ 本発明のIGS1ポリペプチドは、受容体を結合しそして本発明の受容体ポリ
ペプチドの活性化(アゴニスト)または活性化の阻害(アンタゴニスト)をする
化合物に対するスクリーニングプロセスに使用してもよい。従って、本発明のポ
リペプチドは、小分子基質および例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学ライ
ブラリー、および天然産物混合物内のリガンドの結合を評価するために使用して
もよい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであっても
または構造的または機能的疑似体であってもよい。
【0079】
IGS1ポリペプチドは、病理学を含む生物学的機能の原因である。従って、
一方ではIGS1を刺激し、そして他方ではIGS1の機能を阻害できる化合物
または薬剤を発見することが望ましい。一般に、アゴニストはなかでも上記の「
疾患」の病状に対する治療および予防の目的で使用される。特に、アゴニストは
、神経医学およびCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレッ
ト病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対
する治療および予防の目的で使用される。
一方ではIGS1を刺激し、そして他方ではIGS1の機能を阻害できる化合物
または薬剤を発見することが望ましい。一般に、アゴニストはなかでも上記の「
疾患」の病状に対する治療および予防の目的で使用される。特に、アゴニストは
、神経医学およびCNS障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレッ
ト病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対
する治療および予防の目的で使用される。
【0080】
アンタゴニストは、なかでも上記の「疾患」の病状に対する種々の治療および
予防の目的で使用してもよい。特には、アンタゴニストは、神経医学およびCN
S障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病
、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する種々の治療および
予防の目的で使用してもよい。
予防の目的で使用してもよい。特には、アンタゴニストは、神経医学およびCN
S障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病
、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する種々の治療および
予防の目的で使用してもよい。
【0081】
一般に、このようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペプチドをそ
の表面に発現しそして、必須の場合にはその表面にRAMPの同時発現をする産
生に適する細胞を含む。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエま
たは大腸菌からの細胞を含む。次いで、受容体を発現する細胞(または発現され
た受容体を含む細胞膜)を試験化合物と接触させ、結合、または機能性反応の刺
激もしくは阻害を観察する。
の表面に発現しそして、必須の場合にはその表面にRAMPの同時発現をする産
生に適する細胞を含む。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエま
たは大腸菌からの細胞を含む。次いで、受容体を発現する細胞(または発現され
た受容体を含む細胞膜)を試験化合物と接触させ、結合、または機能性反応の刺
激もしくは阻害を観察する。
【0082】
一つのスクリーニング技術は、受容体活性化により起きる細胞外pH、細胞内
pH、または細胞内カルシウム変化を測定する、系内に本発明の受容体を発現す
る細胞(例えばトランスフェクションされたCHO細胞)の使用を含む。この技
術において、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させて
もよい。セカンドメッセンジャー反応、例えばシグナル伝達、pH変化、または
カルシウムレベルの変化を次いで測定して、潜在的化合物が受容体を活性化また
は阻害するかどうかを決定する。
pH、または細胞内カルシウム変化を測定する、系内に本発明の受容体を発現す
る細胞(例えばトランスフェクションされたCHO細胞)の使用を含む。この技
術において、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させて
もよい。セカンドメッセンジャー反応、例えばシグナル伝達、pH変化、または
カルシウムレベルの変化を次いで測定して、潜在的化合物が受容体を活性化また
は阻害するかどうかを決定する。
【0083】
別の方法は、受容体−媒介シグナル、例えばcAMP蓄積および/またはアデ
ニル酸シクラーゼ活性の調節を決定することによる受容体阻害剤に関するスクリ
ーニングを含む。このような方法は、真核細胞を本発明の受容体を用いてトラン
スフェクションして細胞表面上に受容体を発現させることを含む。次いで、細胞
を、潜在的アンタゴニストの存在下で本発明の受容体に対するアゴニストに暴露
する。潜在的アンタゴニストが受容体を結合しこれにより受容体結合を阻害する
場合には、アゴニスト媒介シグナルは調節されるであろう。
ニル酸シクラーゼ活性の調節を決定することによる受容体阻害剤に関するスクリ
ーニングを含む。このような方法は、真核細胞を本発明の受容体を用いてトラン
スフェクションして細胞表面上に受容体を発現させることを含む。次いで、細胞
を、潜在的アンタゴニストの存在下で本発明の受容体に対するアゴニストに暴露
する。潜在的アンタゴニストが受容体を結合しこれにより受容体結合を阻害する
場合には、アゴニスト媒介シグナルは調節されるであろう。
【0084】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法
は、米国特許(US)第5,482,835号に記載の酵母に基づけ技術である
。
は、米国特許(US)第5,482,835号に記載の酵母に基づけ技術である
。
【0085】
アッセイは、単なる候補化合物の試験結合でもよく、ここで受容体を有する細
胞への接着は、候補化合物と直接または間接に会合した標識を用いるか、または
標識競合物との競合を含むアッセイにより検出される。さらに、これらのアッセ
イは、候補化合物が受容体の活性化により発生するシグナルをもたらすかどうか
を試験してもよく、これには表面において受容体を有する細胞に適する検出系を
用いる。活性化の阻害剤は、一般に、既知のアゴニストの存在下で、そして候補
化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する効果を観察してアッセイさ
れる。
胞への接着は、候補化合物と直接または間接に会合した標識を用いるか、または
標識競合物との競合を含むアッセイにより検出される。さらに、これらのアッセ
イは、候補化合物が受容体の活性化により発生するシグナルをもたらすかどうか
を試験してもよく、これには表面において受容体を有する細胞に適する検出系を
用いる。活性化の阻害剤は、一般に、既知のアゴニストの存在下で、そして候補
化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する効果を観察してアッセイさ
れる。
【0086】
さらに、アッセイは、混合物を形成するためのIGS1ポリペプチドを含む溶
液と候補化合物とを混合し、混合物中のIGS1活性を測定し、そして混合物の
IGS1活性を標準と比較する段階を単に含んでなってもよい。
液と候補化合物とを混合し、混合物中のIGS1活性を測定し、そして混合物の
IGS1活性を標準と比較する段階を単に含んでなってもよい。
【0087】
IGS1cDNA、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、細胞内のI
GS1mRNAおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物による効果を検
出するためのアッセイを形成するために使用してもよい。例えば、ELISAは
、当該技術分野に公知の標準方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗
体を用いてIGS1タンパク質の分泌または細胞関連レベルを測定するために構
築されてもよく、そしてこれは適当に操作された細胞または組織からのIGS1
の産生を阻害または促進するであろう薬剤(それぞれアンタゴニストまたはアゴ
ニストとも呼ばれる)を発見するために使用できる。スクリーニングアッセイを
行うための標準方法は、当該技術分野では周知である。
GS1mRNAおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物による効果を検
出するためのアッセイを形成するために使用してもよい。例えば、ELISAは
、当該技術分野に公知の標準方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗
体を用いてIGS1タンパク質の分泌または細胞関連レベルを測定するために構
築されてもよく、そしてこれは適当に操作された細胞または組織からのIGS1
の産生を阻害または促進するであろう薬剤(それぞれアンタゴニストまたはアゴ
ニストとも呼ばれる)を発見するために使用できる。スクリーニングアッセイを
行うための標準方法は、当該技術分野では周知である。
【0088】
潜在的IGS1アンタゴニストの例は、抗体または、ある場合にはIGS1の
リガンド、例えばリガンドの断片に密接に関係したオリゴヌクレオチドまたはタ
ンパク質、または受容体に結合するが反応は行わない小分子を含み、受容体の活
性を阻止する。
リガンド、例えばリガンドの断片に密接に関係したオリゴヌクレオチドまたはタ
ンパク質、または受容体に結合するが反応は行わない小分子を含み、受容体の活
性を阻止する。
【0089】
従って、別の態様では、本発明は、IGS1ポリペプチドに対するアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するためのスクリ
ーニングキット、または (a)IGS1ポリペプチド、好ましくは配列番号2のもの、 (b)IGS1ポリペプチドを発現する組換え細胞、好ましくは配列番号2のも
の、 (c)IGS1ポリペプチドを発現する細胞膜、好ましくは配列番号2のもの、
または (d)IGS1ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号2のもの を含んでなるIGS1ポリペプチドの産生を低下または促進する化合物に関する
。
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するためのスクリ
ーニングキット、または (a)IGS1ポリペプチド、好ましくは配列番号2のもの、 (b)IGS1ポリペプチドを発現する組換え細胞、好ましくは配列番号2のも
の、 (c)IGS1ポリペプチドを発現する細胞膜、好ましくは配列番号2のもの、
または (d)IGS1ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号2のもの を含んでなるIGS1ポリペプチドの産生を低下または促進する化合物に関する
。
【0090】
あらゆるこのようなキット内で、(a)、(b)、(c)または(d)は本質
的な成分を含んでなってもよいことが認められる。予防および治療方法 本発明は、IGS1活性の過剰および/または不十分な量の両方に関連する異
常な状態を治療するための方法を提供する。
的な成分を含んでなってもよいことが認められる。予防および治療方法 本発明は、IGS1活性の過剰および/または不十分な量の両方に関連する異
常な状態を治療するための方法を提供する。
【0091】
IGS1の活性が過剰な場合には、数種の方法が利用できる。一つの方法は、
以上に記載した阻害化合物(アンタゴニスト)を、薬剤的に許容できるキャリヤ
ーと一緒に、IGS1に対するリガンドの結合を遮断することにより、またはR
AMPポリペプチドまたはセカンドシグナルとの相互作用を阻害することにより
活性化を阻害し、これにより異状状態を緩和するために有効な量を患者の投与す
ることを含んでなる。
以上に記載した阻害化合物(アンタゴニスト)を、薬剤的に許容できるキャリヤ
ーと一緒に、IGS1に対するリガンドの結合を遮断することにより、またはR
AMPポリペプチドまたはセカンドシグナルとの相互作用を阻害することにより
活性化を阻害し、これにより異状状態を緩和するために有効な量を患者の投与す
ることを含んでなる。
【0092】
他の方法では、内在性IGS1と競合してリガンドをまだ結合できるIGS1
ポリペプチドの可溶性の形を投与してもよい。このような競合物の典型的な態様
は、IGS1ポリペプチドの断片を含んでなる。
ポリペプチドの可溶性の形を投与してもよい。このような競合物の典型的な態様
は、IGS1ポリペプチドの断片を含んでなる。
【0093】
さらに別の方法では、内在性IGS1をコードする遺伝子の発現は、発現遮断
技術を用いて阻害できる。既知のこのような技術は、内部産生または別途に投与
したアンチセンス配列の使用を含む。例えばO'Conner, J. Neurochem. (1991) 5
6:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n, CRC Press, Boca Raton, Florida USA (1988)参照。あるいは、遺伝子と三重
らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給できる。例えばLee et al., Nuclei
c Acids Res. (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Derva
n et al., Science (1991) 251: 1360参照。これらのオリゴマーは、それ自体を
投与できるかまたは関連するオリゴマーを生体内で発現できる。合成したアンチ
センスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾され
た骨格を有してもよい。後者の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアート
またはペプチド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解か
らの保護を与えるためにアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド内に
組み込まれ、これは当該技術分野には周知である。これらまたはその他の修飾さ
れた骨格を有する合成されたアンチセンスおよび三重らせん分子は、本発明の一
部を形成する。
技術を用いて阻害できる。既知のこのような技術は、内部産生または別途に投与
したアンチセンス配列の使用を含む。例えばO'Conner, J. Neurochem. (1991) 5
6:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n, CRC Press, Boca Raton, Florida USA (1988)参照。あるいは、遺伝子と三重
らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給できる。例えばLee et al., Nuclei
c Acids Res. (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Derva
n et al., Science (1991) 251: 1360参照。これらのオリゴマーは、それ自体を
投与できるかまたは関連するオリゴマーを生体内で発現できる。合成したアンチ
センスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾され
た骨格を有してもよい。後者の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアート
またはペプチド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解か
らの保護を与えるためにアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド内に
組み込まれ、これは当該技術分野には周知である。これらまたはその他の修飾さ
れた骨格を有する合成されたアンチセンスおよび三重らせん分子は、本発明の一
部を形成する。
【0094】
さらに、IGS1ポリペプチドの発現は、IGS1 mRNA配列に特異性の
リボザイムを用いて回避してもよい。リボザイムは、天然または合成であること
ができる触媒活性RNAである(例えばUsman et al., Curr. Opin. Struct. Bi
ol. (1996) 6(4), 527-33 参照)。合成リボザイムは、選択された位置で特異的
にIGS1 mRNAを開裂し、これによりIGS1 mRNAの機能性ポリペ
プチド内への翻訳を避けるように設計できる。リボザイムは天然リン酸リボース
骨格および天然塩基、例えばRNA分子中に通常見いだされるものを用いて合成
してもよい。あるいは、リボザイムは非天然骨格を用いて、リボヌクレアーゼ分
解からの保護を与えるように、例えば2’−O−メチル RNAに合成してもよ
くそして修飾塩基を含んでもよい。
リボザイムを用いて回避してもよい。リボザイムは、天然または合成であること
ができる触媒活性RNAである(例えばUsman et al., Curr. Opin. Struct. Bi
ol. (1996) 6(4), 527-33 参照)。合成リボザイムは、選択された位置で特異的
にIGS1 mRNAを開裂し、これによりIGS1 mRNAの機能性ポリペ
プチド内への翻訳を避けるように設計できる。リボザイムは天然リン酸リボース
骨格および天然塩基、例えばRNA分子中に通常見いだされるものを用いて合成
してもよい。あるいは、リボザイムは非天然骨格を用いて、リボヌクレアーゼ分
解からの保護を与えるように、例えば2’−O−メチル RNAに合成してもよ
くそして修飾塩基を含んでもよい。
【0095】
IGS1およびその活性の低い発現に関連する異常な状態を治療するために、
種々の方法も利用できる。一つの方法は、IGS1を活性化する化合物、すなわ
ち上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を薬剤的に許容できるキャリヤー
と一緒に患者に投与して、これにより異常な状態を緩和することを含んでなる。
あるいは、患者内の関連細胞によるIGS1の内在的産生を行うために遺伝子治
療を利用してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に考察した複
製欠失レトロウイルスベクター内の発現に関して操作してもよい。次いでレトロ
ウイルス発現構築物を単離して、そして本発明のポリペプチドをコードするRN
Aを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージン
グ細胞内に導入してもよく、これによりパッケージング細胞は関係する遺伝子を
含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生体細胞は、生体内における細
胞の操作のためおよび生体内におけるポリペプチドの発現のために患者に投与し
てもよい。遺伝子治療の概説については、Human Molecular Genetics, Strachan
T.and Read A.P., BIOS Scientific Publishers, Ltd(1986) 中の「遺伝子治療
およびその他の分子遺伝子に基づく治療方法」の第20章(Chapter 20, Gene Th
erapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches) およびそ
の中の引用文献を参照のこと。
種々の方法も利用できる。一つの方法は、IGS1を活性化する化合物、すなわ
ち上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を薬剤的に許容できるキャリヤー
と一緒に患者に投与して、これにより異常な状態を緩和することを含んでなる。
あるいは、患者内の関連細胞によるIGS1の内在的産生を行うために遺伝子治
療を利用してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に考察した複
製欠失レトロウイルスベクター内の発現に関して操作してもよい。次いでレトロ
ウイルス発現構築物を単離して、そして本発明のポリペプチドをコードするRN
Aを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージン
グ細胞内に導入してもよく、これによりパッケージング細胞は関係する遺伝子を
含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生体細胞は、生体内における細
胞の操作のためおよび生体内におけるポリペプチドの発現のために患者に投与し
てもよい。遺伝子治療の概説については、Human Molecular Genetics, Strachan
T.and Read A.P., BIOS Scientific Publishers, Ltd(1986) 中の「遺伝子治療
およびその他の分子遺伝子に基づく治療方法」の第20章(Chapter 20, Gene Th
erapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches) およびそ
の中の引用文献を参照のこと。
【0096】
上記のあらゆる治療方法は、例えば哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、
ラビット、サル、および最も好ましくはヒトを含む治療が必要なあらゆる患者に
適用してもよい。調剤および投与 ペプチド、例えばIGS1ポリペプチドの可溶性形、およびアゴニストおよび
アンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な薬剤キャリヤーと組み合わせて
調剤してもよい。このような調剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化
合物、および薬剤的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含んでなる。調剤は
投与の形態に適合しなければならず、そして当該技術分野の熟練者の範囲内に十
分に入る。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の1種またはそれ以上の成
分を充填した1個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装物およびキットに
も関する。
ラビット、サル、および最も好ましくはヒトを含む治療が必要なあらゆる患者に
適用してもよい。調剤および投与 ペプチド、例えばIGS1ポリペプチドの可溶性形、およびアゴニストおよび
アンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な薬剤キャリヤーと組み合わせて
調剤してもよい。このような調剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化
合物、および薬剤的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含んでなる。調剤は
投与の形態に適合しなければならず、そして当該技術分野の熟練者の範囲内に十
分に入る。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の1種またはそれ以上の成
分を充填した1個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装物およびキットに
も関する。
【0097】
本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独または他の化合物、例え
ば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
ば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【0098】
薬剤組成物の全身投与の好ましい形は、注射、典型的には静脈内注射を含む。
他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内が使用できる。全身投与の別
の手段は、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤
を用いる粘膜経由または経皮投与を含む。さらに、経口およびカプセル化調剤に
適当に調剤された場合には、経口投与も可能であろう。
他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内が使用できる。全身投与の別
の手段は、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤
を用いる粘膜経由または経皮投与を含む。さらに、経口およびカプセル化調剤に
適当に調剤された場合には、経口投与も可能であろう。
【0099】
所要の投与範囲はペプチドまたは化合物の選択、投与の経路、調剤の性質、患
者の病状の性質、および担当医師の判断に依存する。適当な用量は、1〜100
μg/kg(患者体重)の範囲内である。しかし、種々の使用化合物および投与
の種々の経路の異なる効率を考慮して、所要用量の広範な変化も予想される。例
えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い用量を必要とすると予想さ
れる。これらの用量レベルの変化は、最適化のための標準的な経験慣行を用いて
調整でき、これは当該技術分野では良く理解されている。
者の病状の性質、および担当医師の判断に依存する。適当な用量は、1〜100
μg/kg(患者体重)の範囲内である。しかし、種々の使用化合物および投与
の種々の経路の異なる効率を考慮して、所要用量の広範な変化も予想される。例
えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い用量を必要とすると予想さ
れる。これらの用量レベルの変化は、最適化のための標準的な経験慣行を用いて
調整でき、これは当該技術分野では良く理解されている。
【0100】
治療に使用されるペプチドは、上記のようにしばしば「遺伝子治療」と呼ばれ
る治療モダリティーにおいて、患者内に内在的に発生されることもできる。従っ
て、例えば、患者からの細胞は、ポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNA
を用いて生体外で、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いてポ
リペプチドをコードするように操作してもよい。次いで細胞を患者内に導入する
。
る治療モダリティーにおいて、患者内に内在的に発生されることもできる。従っ
て、例えば、患者からの細胞は、ポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNA
を用いて生体外で、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いてポ
リペプチドをコードするように操作してもよい。次いで細胞を患者内に導入する
。
【0101】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することのみを意図するものであ
り、従ってこれらの実施例は本発明をいかなる意味でも制限するとはみなされな
い。
り、従ってこれらの実施例は本発明をいかなる意味でも制限するとはみなされな
い。
【0102】
実施例1. 新規のGタンパク質共役型受容体をコードするCDNAのクローニ
ング 実施例1a.新規のGタンパク質共役型受容体(GPCR)をコードするゲノム
断片の相同性PCRクローニング PCRに基づく相同性クローニング戦略を、新規のGタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムDNA配列を単離するために使用した。下記の前進(F
11)および後退(R13)縮重PCRプライマーをニューロテンシン受容体遺
伝子の保存領域内で膜貫通ドメイン1(MT1)内および膜貫通ドメイン3の境
界においてそれぞれ細胞内ループ第2(TM3/12)をそれぞれ用いて設計し
た。 F11(TM1): 5’−CATCTTCGTCGTCGGCAC(A,C,GまたはT)G(Cま
たはT)(A,C,GまたはT)GG(A,C,GまたはT)AA−3’ (配列番号3) R13(TM3/12): 5’−GGGTGGCAGATGGCCA(AまたはG)(AまたはG)(Cま
たはT)A(A,C,GまたはT)C(CまたはT)(CまたはT)TC−3’ (配列番号4) さらに、3’ブロックされたオリゴプライマー(HNTR1F1STOP)を
設計した。 HNTR1F1STOP: 5’−ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT−3’−3’−
dA (配列番号5) 3’ブロックされたプライマーは、TM1コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体(NTR1)cDNAに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複(および競合)している。この3’末端は、3’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒延伸を避ける(Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302)。
ング 実施例1a.新規のGタンパク質共役型受容体(GPCR)をコードするゲノム
断片の相同性PCRクローニング PCRに基づく相同性クローニング戦略を、新規のGタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムDNA配列を単離するために使用した。下記の前進(F
11)および後退(R13)縮重PCRプライマーをニューロテンシン受容体遺
伝子の保存領域内で膜貫通ドメイン1(MT1)内および膜貫通ドメイン3の境
界においてそれぞれ細胞内ループ第2(TM3/12)をそれぞれ用いて設計し
た。 F11(TM1): 5’−CATCTTCGTCGTCGGCAC(A,C,GまたはT)G(Cま
たはT)(A,C,GまたはT)GG(A,C,GまたはT)AA−3’ (配列番号3) R13(TM3/12): 5’−GGGTGGCAGATGGCCA(AまたはG)(AまたはG)(Cま
たはT)A(A,C,GまたはT)C(CまたはT)(CまたはT)TC−3’ (配列番号4) さらに、3’ブロックされたオリゴプライマー(HNTR1F1STOP)を
設計した。 HNTR1F1STOP: 5’−ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT−3’−3’−
dA (配列番号5) 3’ブロックされたプライマーは、TM1コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体(NTR1)cDNAに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複(および競合)している。この3’末端は、3’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒延伸を避ける(Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302)。
【0103】
PCR反応は、体積60μlで行いそして100ngヒトゲノムDNA(Clont
ech)、6μl 10xPCR緩衝液II(100mM トリス−HCl pH8
.3;500mM KCl,Perkin Elmer)、3.6μl 25mM MgCl 2 、0.36μl dNTP類(それぞれのdNTPの25mM)、1.5単位
AmpliTaqTMポリメラーゼ(Perkin Elmer )、縮重前進および後退プライ
マーそれぞれの30ピコモルおよび3’ブロックされたプライマーの100ピコ
モルを含んでいた。反応管を94℃で2分間加熱し、次いで変性(94℃、30
秒間)、アニーリング(55℃、1分間、タッチダウン−0.25℃/サイクル
)および延伸(72℃、1分間)の20サイクル、次いでさらに変性(94℃、
30秒間、アニーリング(50℃、1分間)および延伸(72℃、1分間)の2
0サイクルを行った。最後に反応管を5分間、72℃で加熱した。PCR反応産
物を2%アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染色し
た。期待した大きさの断片(±300bp)をQiaex−IITM精製キット(Q
iagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Promega)
により推奨された手順に従ってpGEM−Tプラスミド内に連結した。このよう
にして作製した組換えプラスミドを適応性(competent) 大腸菌SURETM2細菌
(Stratagene)を形質転換するために使用した。
ech)、6μl 10xPCR緩衝液II(100mM トリス−HCl pH8
.3;500mM KCl,Perkin Elmer)、3.6μl 25mM MgCl 2 、0.36μl dNTP類(それぞれのdNTPの25mM)、1.5単位
AmpliTaqTMポリメラーゼ(Perkin Elmer )、縮重前進および後退プライ
マーそれぞれの30ピコモルおよび3’ブロックされたプライマーの100ピコ
モルを含んでいた。反応管を94℃で2分間加熱し、次いで変性(94℃、30
秒間)、アニーリング(55℃、1分間、タッチダウン−0.25℃/サイクル
)および延伸(72℃、1分間)の20サイクル、次いでさらに変性(94℃、
30秒間、アニーリング(50℃、1分間)および延伸(72℃、1分間)の2
0サイクルを行った。最後に反応管を5分間、72℃で加熱した。PCR反応産
物を2%アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染色し
た。期待した大きさの断片(±300bp)をQiaex−IITM精製キット(Q
iagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Promega)
により推奨された手順に従ってpGEM−Tプラスミド内に連結した。このよう
にして作製した組換えプラスミドを適応性(competent) 大腸菌SURETM2細菌
(Stratagene)を形質転換するために使用した。
【0104】
形質転換した細胞を、アンピシリン(100μg/ml)、IPTG(0.5
mM)およびX−gal(50μg/ml)を含むLBアガープレート上にプレ
ーティングした。コロニーをHybond N+膜(Amersham)上にリフトしそし
てDNAを変性しそしてBuluwela et al. のマイクロ波オーブン法(Nucleic aci
ds Research 17, p452; 1989) に従って固定した。コロニーリフトを変性Chu
rch緩衝液(0.5Mリン酸塩、7%SDS、10mM EDTA)中、65
℃で2時間でプレハイブリダイズし、次いで32P標識ヒトニューロテンシン受容
体1および2cDNAプローブ(NTR1/2)の等モル量の2x106 cpm
/mlを含む同じ緩衝液中、65℃で一晩ハイブリダイズした。ヒトNTR1お
よびNTR2の全コーディング配列を含むcDNAプローブを、〔α−32P〕d
CTPのランダム開始組換えを介して、比放射能>109 cpm/μgまで、P
rime−It IIキットTM(Stratagene)を用い、供給者が提供した指針に従
って放射標識した。ハイブリダイズしたフィルターを高ストリンジェンシー(2
x30分間、室温、2xSSC/0.1%SDS中、次いで40分間、65℃で
の0.1xSSc、0.1%SDS中での洗浄2回)で洗浄しそして一晩オート
ラジオグラフィーを行った。高ストリンジェンシー洗浄の後にハイブリダイゼー
ションシグナルを示さない多数のランダム白色コロニーをDNA配列分析のため
に選択した。
mM)およびX−gal(50μg/ml)を含むLBアガープレート上にプレ
ーティングした。コロニーをHybond N+膜(Amersham)上にリフトしそし
てDNAを変性しそしてBuluwela et al. のマイクロ波オーブン法(Nucleic aci
ds Research 17, p452; 1989) に従って固定した。コロニーリフトを変性Chu
rch緩衝液(0.5Mリン酸塩、7%SDS、10mM EDTA)中、65
℃で2時間でプレハイブリダイズし、次いで32P標識ヒトニューロテンシン受容
体1および2cDNAプローブ(NTR1/2)の等モル量の2x106 cpm
/mlを含む同じ緩衝液中、65℃で一晩ハイブリダイズした。ヒトNTR1お
よびNTR2の全コーディング配列を含むcDNAプローブを、〔α−32P〕d
CTPのランダム開始組換えを介して、比放射能>109 cpm/μgまで、P
rime−It IIキットTM(Stratagene)を用い、供給者が提供した指針に従
って放射標識した。ハイブリダイズしたフィルターを高ストリンジェンシー(2
x30分間、室温、2xSSC/0.1%SDS中、次いで40分間、65℃で
の0.1xSSc、0.1%SDS中での洗浄2回)で洗浄しそして一晩オート
ラジオグラフィーを行った。高ストリンジェンシー洗浄の後にハイブリダイゼー
ションシグナルを示さない多数のランダム白色コロニーをDNA配列分析のため
に選択した。
【0105】
DNA配列決定反応は、ABI PrismTM BigDyeターミネーター
サイクル配列決定反応キット(PE-ABI)を用いて行った。サイクル配列決定反応産
物をEtOH/NaOAc沈降を介して精製しそしてABI373自動化配列決
定装置に負荷した。2個のほとんど同一であるクローン(HNT642およびH
NT768)を同定し、これはGPCRファミリーの新規のメンバーの一部分を
コードすると考えられた。我々はこの新規のGPCRをIGS1と名付けた。
サイクル配列決定反応キット(PE-ABI)を用いて行った。サイクル配列決定反応産
物をEtOH/NaOAc沈降を介して精製しそしてABI373自動化配列決
定装置に負荷した。2個のほとんど同一であるクローン(HNT642およびH
NT768)を同定し、これはGPCRファミリーの新規のメンバーの一部分を
コードすると考えられた。我々はこの新規のGPCRをIGS1と名付けた。
【0106】
【表3】
【0107】
実施例1b.完全なIGS1コーディング配列を含むcDNA断片のクローニン
グ IGS1 cDNAの完全なコーディング配列は、cDNA末端の迅速増幅を
介して得られた(RACE分析)。5’−および3’−RACE PCRを、Ma
rathon-ReadyTMヒト脳cDNA(Clontech, no.7400-1) 上で、MarathonTMcDN
A増幅キット(Clontech, K1802-1) と一緒に提供されたアダプタープライマー(
AP1、配列番号6)およびIGS1特異性プライマーIP11261(3’R
ACE、配列番号9)およびIP11262ならびにIP11263(5’RA
CE、それぞれ配列番号10および11)を用い、クローンHNT642および
HNT768のDNA配列に基づいて行った(図1)。次いで、ネスト(nest)し
たRACE PCRをアダプタープライマー2(AP2;配列番号7)およびI
GS1特異性ネストしたプライマーIP11260(3’RACE、配列番号8
)およびIP11515およびIP11516(5’RACE、それぞれ配列番
号13および14)を用いて行った。一次およびネストしたPCR RACE反
応を、Clontechから提供されたMarathon-ReadyTMcDNAユーザーマニュアルの
指示に従って行った。ネストしたPCR RACE産物を1%アガロースゲル上
で分離しそしてEtBrを用いて染色した。ゲルをHybond N+ 膜上にブ
ロットしそしてChurchハイブリダイゼーション緩衝液中、65℃でクロー
ンHNT642の32P標識挿入物を用いて一晩ハイブリダイズした。
グ IGS1 cDNAの完全なコーディング配列は、cDNA末端の迅速増幅を
介して得られた(RACE分析)。5’−および3’−RACE PCRを、Ma
rathon-ReadyTMヒト脳cDNA(Clontech, no.7400-1) 上で、MarathonTMcDN
A増幅キット(Clontech, K1802-1) と一緒に提供されたアダプタープライマー(
AP1、配列番号6)およびIGS1特異性プライマーIP11261(3’R
ACE、配列番号9)およびIP11262ならびにIP11263(5’RA
CE、それぞれ配列番号10および11)を用い、クローンHNT642および
HNT768のDNA配列に基づいて行った(図1)。次いで、ネスト(nest)し
たRACE PCRをアダプタープライマー2(AP2;配列番号7)およびI
GS1特異性ネストしたプライマーIP11260(3’RACE、配列番号8
)およびIP11515およびIP11516(5’RACE、それぞれ配列番
号13および14)を用いて行った。一次およびネストしたPCR RACE反
応を、Clontechから提供されたMarathon-ReadyTMcDNAユーザーマニュアルの
指示に従って行った。ネストしたPCR RACE産物を1%アガロースゲル上
で分離しそしてEtBrを用いて染色した。ゲルをHybond N+ 膜上にブ
ロットしそしてChurchハイブリダイゼーション緩衝液中、65℃でクロー
ンHNT642の32P標識挿入物を用いて一晩ハイブリダイズした。
【0108】
AP2/IP11515およびAP2/IP11516 5’RACEネスト
PCR反応物の両方のサザンブロット分析は、数個の陽性バンドを示した(±2
00bp、±250bp、±330bp、±360bp、±400bpおよび±
700bp)。これらのバンドそれぞれをゲルから精製し、そしてpGEM−T
プラスミドベクター内にクローンした(IP11515およびIP11516ネ
スト5’RACE反応物からのそれぞれのPCR断片をクローニングの前にプー
ルした)。それぞれの断片からの3〜4個のランダムコロニーを配列決定した(
=クローンHNT1393−1412)(図1)。
PCR反応物の両方のサザンブロット分析は、数個の陽性バンドを示した(±2
00bp、±250bp、±330bp、±360bp、±400bpおよび±
700bp)。これらのバンドそれぞれをゲルから精製し、そしてpGEM−T
プラスミドベクター内にクローンした(IP11515およびIP11516ネ
スト5’RACE反応物からのそれぞれのPCR断片をクローニングの前にプー
ルした)。それぞれの断片からの3〜4個のランダムコロニーを配列決定した(
=クローンHNT1393−1412)(図1)。
【0109】
ネストしたAP−2/IP11260 3’−RACE PCR反応物は、数
本のバンドを示した。IGS1プローブとハイブリダイズした最大の3’ネスト
RACE PCR断片(±1,550bp)をゲルから精製し、pGEM−T(P
romega) 内に連結しそして適応性大腸菌SURE II細胞を形質転換するため
に使用した。この連結反応からのIGS1特異性形質転換体を、クローンHNT
642の32P−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの後に同定
した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズしそして
高ストリンジェンシー(0.1xSSC 0.1%SDS、65℃で30分間)
で洗浄した。3’RACEネストPCRライブラリーのハイブリダイゼーション
スクリーニングは、3個の陽性クローンを生成した。これらの2個(HNT14
13−1414)を配列決定した。
本のバンドを示した。IGS1プローブとハイブリダイズした最大の3’ネスト
RACE PCR断片(±1,550bp)をゲルから精製し、pGEM−T(P
romega) 内に連結しそして適応性大腸菌SURE II細胞を形質転換するため
に使用した。この連結反応からのIGS1特異性形質転換体を、クローンHNT
642の32P−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの後に同定
した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズしそして
高ストリンジェンシー(0.1xSSC 0.1%SDS、65℃で30分間)
で洗浄した。3’RACEネストPCRライブラリーのハイブリダイゼーション
スクリーニングは、3個の陽性クローンを生成した。これらの2個(HNT14
13−1414)を配列決定した。
【0110】
追加の2回の実験で、3個の別の3’RACE cDNAクローン(HB46
86、HB4687およびHB4688)がMarathon-ReadyTMヒト脳cDNA(C
lontech)から、供給者から提供されたマニュアル(Clontech PT1156-1) に記載さ
れた手順に従って得られた。一つの実験において、一次3’RACE反応(IG
S1特異性プライマーIP11261およびアダプタープライマーAP1を用い
て得られた)からの産物をヘミ(hemi)−ネストしたプライマー対IP11260
/IP11261(それぞれ配列番号8および16)を用いて再増幅した。これ
は、予想された±1400bp断片を生成しこれをゲルから精製しそしてpGE
M−Tプラスミドベクター内にクローンすると、クローンHB4686およびH
B4687が生成した。別の実験において、一次3’RACE PCR産物(I
GS1特異性プライマーIP11264(配列番号15)およびアダプタープラ
イマーAP1を用いて得られた)をネストしたプライマー対IP11260/I
P11261を用いて再増幅した。この反応から得られた±1400bp断片を
精製しそしてpGEM−Tプラスミドベクター内にクローニングすると、クロー
ンHB4688が得られた。
86、HB4687およびHB4688)がMarathon-ReadyTMヒト脳cDNA(C
lontech)から、供給者から提供されたマニュアル(Clontech PT1156-1) に記載さ
れた手順に従って得られた。一つの実験において、一次3’RACE反応(IG
S1特異性プライマーIP11261およびアダプタープライマーAP1を用い
て得られた)からの産物をヘミ(hemi)−ネストしたプライマー対IP11260
/IP11261(それぞれ配列番号8および16)を用いて再増幅した。これ
は、予想された±1400bp断片を生成しこれをゲルから精製しそしてpGE
M−Tプラスミドベクター内にクローンすると、クローンHB4686およびH
B4687が生成した。別の実験において、一次3’RACE PCR産物(I
GS1特異性プライマーIP11264(配列番号15)およびアダプタープラ
イマーAP1を用いて得られた)をネストしたプライマー対IP11260/I
P11261を用いて再増幅した。この反応から得られた±1400bp断片を
精製しそしてpGEM−Tプラスミドベクター内にクローニングすると、クロー
ンHB4688が得られた。
【0111】
単離されたすべてのIGS1 cDNAクローンを完全に配列決定しそして単
一コンティグ内に構築できた(図1)。少なくとも4回の独立したcDNAクロ
ーンから決定されたこの連続cDNAの一部分をIGS1DNAとして本明細書
に記載する(配列番号1)。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、508アミノ酸のタンパク質が予想されこれはGPCRタンパク
質に良い相同性を示した(IGS1PROT;配列番号2)。発現された配列タ
グデータベース(dbase)に対するIGS1コンティグのDNA配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、EST20889(アクセション番号AA31
8717)およびESTアクセション番号AI672141の存在を示し、これ
らは両方共にIGS1コンティグの3’末端と重複するがしかしIGS1オープ
ン読み取り枠の外側である(図1)。 実施例1c.完全IGS1コーディング配列を含む連続cDNA断片の単離 連続IGS1 cDNAクローンをクローンHNT1398およびHNT14
13鋳型上で重複−PCRを介して作製した。HNT1398プラスミドDNA
の100ngおよびHNT1413プラスミドの100ngを、それぞれプライ
マー対IP12264/IP11264(それぞれ配列番号18および12)お
よびIP11260/IP12262(それぞれ配列番号8および11)を用い
て別々の反応(50μl)でPCR増幅した(変性〔94℃、30秒間〕、アニ
ーリング〔60℃、30秒間〕および延伸〔72℃、1分間〕の30PCRサイ
クル、ExpandTM High Fidelity PCRシステム[Boehringer]使用)。それぞれ
のPCR反応物の1μlの量を一緒にしそしてプライマー対IP12264/I
P12261を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−PCR反応物は、±
1730bpのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてpGEM−Tプラ
スミドベクター中に連結した。適応性大腸菌DH5αF’菌を形質転換するため
に組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン(100μg
/ml)を含むLBアガプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを
多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を介して決
定した。±1730bp挿入物を含むクローン3個を配列決定した。クローンH
B4693の配列は、共通IGS1 cDNA配列と完全に一致した(図1参照
)。プラスミドHB4693を内包する細胞株を、アンピシリン100μg/m
lを含むLBアガープレート上に再プレーティングした後に再クローンし、そし
てInnogenetics strain list(ICCG#4297)およびCentraalbureau voo
r Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国)(寄託番号CBS102049
)の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドDNAを再
度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだした。
一コンティグ内に構築できた(図1)。少なくとも4回の独立したcDNAクロ
ーンから決定されたこの連続cDNAの一部分をIGS1DNAとして本明細書
に記載する(配列番号1)。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、508アミノ酸のタンパク質が予想されこれはGPCRタンパク
質に良い相同性を示した(IGS1PROT;配列番号2)。発現された配列タ
グデータベース(dbase)に対するIGS1コンティグのDNA配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、EST20889(アクセション番号AA31
8717)およびESTアクセション番号AI672141の存在を示し、これ
らは両方共にIGS1コンティグの3’末端と重複するがしかしIGS1オープ
ン読み取り枠の外側である(図1)。 実施例1c.完全IGS1コーディング配列を含む連続cDNA断片の単離 連続IGS1 cDNAクローンをクローンHNT1398およびHNT14
13鋳型上で重複−PCRを介して作製した。HNT1398プラスミドDNA
の100ngおよびHNT1413プラスミドの100ngを、それぞれプライ
マー対IP12264/IP11264(それぞれ配列番号18および12)お
よびIP11260/IP12262(それぞれ配列番号8および11)を用い
て別々の反応(50μl)でPCR増幅した(変性〔94℃、30秒間〕、アニ
ーリング〔60℃、30秒間〕および延伸〔72℃、1分間〕の30PCRサイ
クル、ExpandTM High Fidelity PCRシステム[Boehringer]使用)。それぞれ
のPCR反応物の1μlの量を一緒にしそしてプライマー対IP12264/I
P12261を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−PCR反応物は、±
1730bpのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてpGEM−Tプラ
スミドベクター中に連結した。適応性大腸菌DH5αF’菌を形質転換するため
に組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン(100μg
/ml)を含むLBアガプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを
多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を介して決
定した。±1730bp挿入物を含むクローン3個を配列決定した。クローンH
B4693の配列は、共通IGS1 cDNA配列と完全に一致した(図1参照
)。プラスミドHB4693を内包する細胞株を、アンピシリン100μg/m
lを含むLBアガープレート上に再プレーティングした後に再クローンし、そし
てInnogenetics strain list(ICCG#4297)およびCentraalbureau voo
r Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国)(寄託番号CBS102049
)の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドDNAを再
度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだした。
【0112】
注:我々は、その後、プライマーIP12262配列がクローンHNT141
3の挿入配列中に含まれていないことおよびその結果、HNT1413鋳型から
アンプリコンが産生できなかったことを見いだした。従って、我々は、重複断片
の成功した増幅は、HNT1413プラスミドDNA(重複PCR反応管内に持
ち込まれた)とHNT1398鋳型から生成したアンプリコンとの間の直接重複
を介して発生したと推定する。 実施例2.IGS1のノーザンおよび「MTEアレイ」分析 実施例2a.pcDNA3.1(+)huIGS1発現ベクターの構築 5μgのpcDNA3.1(+)(Invitrogen)をHindIIIを用いて切断
し(3時間、37℃)、dNTP(0.25mMf.c.)の存在下でT4ポリ
メラーゼを用いて平滑化し、そしてゲル上で分析した。線状化したDNAをゲル
から溶出し(Qiaex II抽出キット(Qiagen)使用)そして40μl H2 O中に溶
かした。このDNAをNotIを用いて消化し、そして再度ゲル上で分析した。
得られた5364bpベクター断片をQiaex IIゲル抽出キットを用いてゲルから
溶出しそして40μl H2 O中に溶かした。5μlをゲル上で分析して大きさ
、量よび純度を検査した。
3の挿入配列中に含まれていないことおよびその結果、HNT1413鋳型から
アンプリコンが産生できなかったことを見いだした。従って、我々は、重複断片
の成功した増幅は、HNT1413プラスミドDNA(重複PCR反応管内に持
ち込まれた)とHNT1398鋳型から生成したアンプリコンとの間の直接重複
を介して発生したと推定する。 実施例2.IGS1のノーザンおよび「MTEアレイ」分析 実施例2a.pcDNA3.1(+)huIGS1発現ベクターの構築 5μgのpcDNA3.1(+)(Invitrogen)をHindIIIを用いて切断
し(3時間、37℃)、dNTP(0.25mMf.c.)の存在下でT4ポリ
メラーゼを用いて平滑化し、そしてゲル上で分析した。線状化したDNAをゲル
から溶出し(Qiaex II抽出キット(Qiagen)使用)そして40μl H2 O中に溶
かした。このDNAをNotIを用いて消化し、そして再度ゲル上で分析した。
得られた5364bpベクター断片をQiaex IIゲル抽出キットを用いてゲルから
溶出しそして40μl H2 O中に溶かした。5μlをゲル上で分析して大きさ
、量よび純度を検査した。
【0113】
ヒトIGS1コーディング配列を、5μg pGEM−ThulGS1プラス
ミド(ICCG#4297)のNaeI/NotI消化(3時間、37℃)の後
に入手した。消化は、アガロースゲル電気泳動により400bp、1629bp
および2702bpの断片3個をもたらした。1629bp断片をゲル(QiaexI
I)から溶出しそして40μl H2 O中に再び溶かした。5μlをゲル上で分析
した。
ミド(ICCG#4297)のNaeI/NotI消化(3時間、37℃)の後
に入手した。消化は、アガロースゲル電気泳動により400bp、1629bp
および2702bpの断片3個をもたらした。1629bp断片をゲル(QiaexI
I)から溶出しそして40μl H2 O中に再び溶かした。5μlをゲル上で分析
した。
【0114】
HindIII消化したpcDNA3.1(+)ベクターの1μl、挿入物3
μlおよび16μl H2 OをReady-To-Go リガーゼ管(T4 DNAリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech)に加えそして1時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の2μlを化学的適応性DH5αF’菌を形質転換するため
に使用した。形質転換した細菌200μlをLBプレート上にプレーティングし
(100μgアンピシリン/ml)そして一晩37℃で培養した。16個のラン
ダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むLB培地3ml中で培養した。
プラスミドDNAをBioRobotTM9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて作製しそ
してNotI、PstIおよびSphI制限酵素を用いる制限分析を介して分析
した。正しい制限パターンを有する1個のコロニーからのDNAを部分的に配列
決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだした。部分
的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist (ICCG#4350)
に寄託しそして大量のDNA(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託した株から
調製した。この大規模DNAプレプ(3μg/μlの500μl)の配列分析が
期待の配列を確認した。 実施例2b.MTE(多組織発現)アレイ分析 25ngヒトIGS1 DNA(pcDNA3.1huIGS1(ICCG#
4350)からの1093bp AatII挿入物)を(α−32P)−dCTP
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。16x106 cpmの標識したhuIGS1 cDNAプロー
ブを、C0 t−1 DNAの30μg、せん断ニシン***DNAの150μgお
よび50μl 20xSSCを用いて、全量200μlになるように混合し、5
分間、95で加熱し次いで30分間、68℃でインキュベーションした。この混
合物を5mlのExpress Hyb 溶液に加えそしてヒト多組織発現(MTE)アレイ
(Clotech #7775-1) 上に均等に分布させた。アレイを一晩、68℃でハイブリダ
イズした。ブロットを20分間、65℃、2XSSC/1%SDS中で4回、そ
して20分間、55℃、0.1XSSC/0.5%SDS中で2回リンスした。
ブロットをX線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
μlおよび16μl H2 OをReady-To-Go リガーゼ管(T4 DNAリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech)に加えそして1時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の2μlを化学的適応性DH5αF’菌を形質転換するため
に使用した。形質転換した細菌200μlをLBプレート上にプレーティングし
(100μgアンピシリン/ml)そして一晩37℃で培養した。16個のラン
ダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むLB培地3ml中で培養した。
プラスミドDNAをBioRobotTM9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて作製しそ
してNotI、PstIおよびSphI制限酵素を用いる制限分析を介して分析
した。正しい制限パターンを有する1個のコロニーからのDNAを部分的に配列
決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだした。部分
的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist (ICCG#4350)
に寄託しそして大量のDNA(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託した株から
調製した。この大規模DNAプレプ(3μg/μlの500μl)の配列分析が
期待の配列を確認した。 実施例2b.MTE(多組織発現)アレイ分析 25ngヒトIGS1 DNA(pcDNA3.1huIGS1(ICCG#
4350)からの1093bp AatII挿入物)を(α−32P)−dCTP
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。16x106 cpmの標識したhuIGS1 cDNAプロー
ブを、C0 t−1 DNAの30μg、せん断ニシン***DNAの150μgお
よび50μl 20xSSCを用いて、全量200μlになるように混合し、5
分間、95で加熱し次いで30分間、68℃でインキュベーションした。この混
合物を5mlのExpress Hyb 溶液に加えそしてヒト多組織発現(MTE)アレイ
(Clotech #7775-1) 上に均等に分布させた。アレイを一晩、68℃でハイブリダ
イズした。ブロットを20分間、65℃、2XSSC/1%SDS中で4回、そ
して20分間、55℃、0.1XSSC/0.5%SDS中で2回リンスした。
ブロットをX線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
【0115】
IGS1プローブのMTEアレイ上のハイブリダイゼーションは、尾状核およ
び被殻上にのみ強いシグナルを示した(図2)。 実施例2c.ノーザンブロット分析 25ngヒトIGS1 DNA(pcDNA3.1huIGS1(ICCG#
4350)からの1093bp AatII挿入物)を(α−32P)−dCTP
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。8x106 cpmの標識したhuIGS1 cDNAプローブ
を、5分間、95℃で変性しそして5mlのExpress Hyb 溶液を加えそしてヒト
脳MTNブロットIIまたはIV (それぞれClotech #7775-1 および#7769-1)上
に均等に分布させた。ブロットを一晩、68℃でハイブリダイズした。ブロット
を10分間、室温、2XSSC/0.05%SDS中で4回、そして40分間、
50℃、0.1XSSC/0.1%SDS中で2回リンスしした。ブロットをX
線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
び被殻上にのみ強いシグナルを示した(図2)。 実施例2c.ノーザンブロット分析 25ngヒトIGS1 DNA(pcDNA3.1huIGS1(ICCG#
4350)からの1093bp AatII挿入物)を(α−32P)−dCTP
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。8x106 cpmの標識したhuIGS1 cDNAプローブ
を、5分間、95℃で変性しそして5mlのExpress Hyb 溶液を加えそしてヒト
脳MTNブロットIIまたはIV (それぞれClotech #7775-1 および#7769-1)上
に均等に分布させた。ブロットを一晩、68℃でハイブリダイズした。ブロット
を10分間、室温、2XSSC/0.05%SDS中で4回、そして40分間、
50℃、0.1XSSC/0.1%SDS中で2回リンスしした。ブロットをX
線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
【0116】
種々のヒト脳領域からのRNAのノーザンブロット上のIGS1プローブのハ
イブリダイゼーションは、尾状核および被殻の両方で薬剤的に許容できる約4.
400および9.000ヌクレオチド(nt)の2個の強いバンドを示した(図
3)。この低い方のバンドは、尾状核の方が僅かに強く、被殻ではその逆であっ
た。4.400および9.000ntバンドは視床でも見られたが両方共に非常
に弱かった。さらに非常にかすかな9.000nt転写物が黒質中に検出された
が4.400バンドにはなかった。最後に、極端に弱い9.000ntバンドが
小脳、骨髄および扁桃に観察された。4.400ntバンドは視床および黒質中
には観察できなかった。これらの結果は、MTE分析の結果と、IGS1の最強
の発現が尾状核および被殻で観察されたという意味で同一である。しかし、2個
の転写物の存在は予想されなかった。4.400ntバンドはIGS1mRNA
に相当すると最も考えられるが、9.000ntバンドの起源は明らかでない。
IGS1遺伝子はイントロンを含まないので(少なくともコーディング領域内で
は含まない)、9.000nt転写物は多分非スプライスまたは交互にスプライ
スされた転写物によるのではない。これは交互のポリ−アデニル化部位を有する
IGS1転写物であるかまたはこれは交差ハイブリダイゼーション種そのもので
あろう。我々は、弱い9.000nt転写物のみが検出されそして4.400n
t転写物は検出されない場合には、これは9.000nt転写物が4.400n
t転写物よりも僅かに強く、従ってこの低い方のバンドがノーザンアッセイの検
出限界の丁度下にあることによると想定する。
イブリダイゼーションは、尾状核および被殻の両方で薬剤的に許容できる約4.
400および9.000ヌクレオチド(nt)の2個の強いバンドを示した(図
3)。この低い方のバンドは、尾状核の方が僅かに強く、被殻ではその逆であっ
た。4.400および9.000ntバンドは視床でも見られたが両方共に非常
に弱かった。さらに非常にかすかな9.000nt転写物が黒質中に検出された
が4.400バンドにはなかった。最後に、極端に弱い9.000ntバンドが
小脳、骨髄および扁桃に観察された。4.400ntバンドは視床および黒質中
には観察できなかった。これらの結果は、MTE分析の結果と、IGS1の最強
の発現が尾状核および被殻で観察されたという意味で同一である。しかし、2個
の転写物の存在は予想されなかった。4.400ntバンドはIGS1mRNA
に相当すると最も考えられるが、9.000ntバンドの起源は明らかでない。
IGS1遺伝子はイントロンを含まないので(少なくともコーディング領域内で
は含まない)、9.000nt転写物は多分非スプライスまたは交互にスプライ
スされた転写物によるのではない。これは交互のポリ−アデニル化部位を有する
IGS1転写物であるかまたはこれは交差ハイブリダイゼーション種そのもので
あろう。我々は、弱い9.000nt転写物のみが検出されそして4.400n
t転写物は検出されない場合には、これは9.000nt転写物が4.400n
t転写物よりも僅かに強く、従ってこの低い方のバンドがノーザンアッセイの検
出限界の丁度下にあることによると想定する。
【0117】
これらの結果は、ラット脳内のIGS1のin situハイブリダイゼーシ
ョン分析により確認され、この場合にはIGS1発現は上記と解剖学的に同じ領
域中で検出された。 実施例3.IGS1に対する推定リガンドのスクリーニング 実施例3a.IGS−1トランスフェクションCHOG 16−細胞の構築 IGS1に対するリガンドを同定するために、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞をIGS1を用いて安定してトランスフェクションした。IGS1
のGタンパク質共役機構は未知なので、GPCRに対する「汎用アダプター」と
して知られる(Milligan G. et al., (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235-7)
G−タンパク質G16(CHOG16、Molecular Devices )を発現する特異性
CHO−細胞を使用した。
ョン分析により確認され、この場合にはIGS1発現は上記と解剖学的に同じ領
域中で検出された。 実施例3.IGS1に対する推定リガンドのスクリーニング 実施例3a.IGS−1トランスフェクションCHOG 16−細胞の構築 IGS1に対するリガンドを同定するために、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞をIGS1を用いて安定してトランスフェクションした。IGS1
のGタンパク質共役機構は未知なので、GPCRに対する「汎用アダプター」と
して知られる(Milligan G. et al., (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235-7)
G−タンパク質G16(CHOG16、Molecular Devices )を発現する特異性
CHO−細胞を使用した。
【0118】
使用した材料は下記を含む:IGS1−pREP9ベクター;SuperFect トラ
ンスフェクション試薬(Qiagen);増殖−培地(Growth medium) :10%FCS,
2mM L−グルタミン、ハイグロマイシンB 400μg/mlを補足したC
HO−S−SFM II(Gibco BRL) 、選択−培地;10%FCS、2mM L
−グルタミン、ハイグロマイシンB 400μg/mlおよびジェネティシン5
00μg/mlを補足したCHO−S−SFM II(Gibco BRL) ;RNeasy Min
i キット(Qiagen)、DNase I (Ambion、2U/μl)、SuperScript II(Gibco B
RL) 、SuperScript II 200U(Gibco BRL)、AmpliTaq(Perkin Elmer)。
ンスフェクション試薬(Qiagen);増殖−培地(Growth medium) :10%FCS,
2mM L−グルタミン、ハイグロマイシンB 400μg/mlを補足したC
HO−S−SFM II(Gibco BRL) 、選択−培地;10%FCS、2mM L
−グルタミン、ハイグロマイシンB 400μg/mlおよびジェネティシン5
00μg/mlを補足したCHO−S−SFM II(Gibco BRL) ;RNeasy Min
i キット(Qiagen)、DNase I (Ambion、2U/μl)、SuperScript II(Gibco B
RL) 、SuperScript II 200U(Gibco BRL)、AmpliTaq(Perkin Elmer)。
【0119】
IGS1コーディング配列をpcDNA3.1huIGS1(ICCG#43
50)からpREP9(Invitrogen)中にXhoI/NheI部位を介してクロー
ンした。CHOGα16細胞をSuperFect (Qiagen)を用い、供給者の記載の通り
にしてトランスフェクションした。トランスフェクションはT25フラスコ内で
行った。増殖−培地内で24時間経過した後、培地を除去しそして選択−培地に
置換した。選択−培地内で集密に達するまで培養した後、ポリクローナル体をT
75フラスコ内を2回通過させた。モノクローナル体を得るために、細胞をLimi
ted Dilution内に接種した。
50)からpREP9(Invitrogen)中にXhoI/NheI部位を介してクロー
ンした。CHOGα16細胞をSuperFect (Qiagen)を用い、供給者の記載の通り
にしてトランスフェクションした。トランスフェクションはT25フラスコ内で
行った。増殖−培地内で24時間経過した後、培地を除去しそして選択−培地に
置換した。選択−培地内で集密に達するまで培養した後、ポリクローナル体をT
75フラスコ内を2回通過させた。モノクローナル体を得るために、細胞をLimi
ted Dilution内に接種した。
【0120】
モノクローナル体の選択は、RT−PCRにより行った。モノクローナル体1
4個を試験した。提供されたプロトコールに従ってRNeasy Mini キット(Qiagen)
を用いてRNAをモノクローナル体から単離した(24ウエルプレートから1個
の集密ウエル)。試料当たりにDNase I (Ambion、2U/μl)1Uを用いてR
NAを処理した。RNA試料の半分をSuperScript II(Gibco BRL) を用いるRT
−PCRに使用した。プライマーアニーリングは、RNAおよびオリゴ−dT1
6(0.6μM)を用い、10分間、65℃〜15℃で行った。それぞれdNH
Pの0.43mMを有するFirst Strand Buffer(Gibco BRL)、DTT 10mM
、20U RNasin(Promega, 40U/μl)およびSuperScript II 200U(Gibco
BRL,200U/μl)を最終体積30μlまで加え、次いで42℃で1時間イン
キュベーションした。
4個を試験した。提供されたプロトコールに従ってRNeasy Mini キット(Qiagen)
を用いてRNAをモノクローナル体から単離した(24ウエルプレートから1個
の集密ウエル)。試料当たりにDNase I (Ambion、2U/μl)1Uを用いてR
NAを処理した。RNA試料の半分をSuperScript II(Gibco BRL) を用いるRT
−PCRに使用した。プライマーアニーリングは、RNAおよびオリゴ−dT1
6(0.6μM)を用い、10分間、65℃〜15℃で行った。それぞれdNH
Pの0.43mMを有するFirst Strand Buffer(Gibco BRL)、DTT 10mM
、20U RNasin(Promega, 40U/μl)およびSuperScript II 200U(Gibco
BRL,200U/μl)を最終体積30μlまで加え、次いで42℃で1時間イン
キュベーションした。
【0121】
PCRをAmpliTaq(Perkin Elmer)を用い、IGS1特異性内部プライマーを用
いて25μl中で行った。最初に、35サイクルのPCRを行った。陽性モノク
ローナルを確認するためおよび最善のものを選択するために、サイクル数が少な
くそしてより高いアニーリング温度を用いる別のPCRを行った。PCR反応あ
たりに、2μlのFirst Strand cDNA(30μlから) を使用した。
いて25μl中で行った。最初に、35サイクルのPCRを行った。陽性モノク
ローナルを確認するためおよび最善のものを選択するために、サイクル数が少な
くそしてより高いアニーリング温度を用いる別のPCRを行った。PCR反応あ
たりに、2μlのFirst Strand cDNA(30μlから) を使用した。
【0122】
6個の最善のモノクローナル体を集密となるまでT75フラスコ内で培養しそ
して10%DMSOを含む増殖培地内で冷凍した。 実施例3b.細胞内カルシウム測定 CHOG 16−IGS1細胞をFluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)
上で機能的にスクリーニングして、推定リガンドに反応する細胞内カルシウムの
移動度を測定した。
して10%DMSOを含む増殖培地内で冷凍した。 実施例3b.細胞内カルシウム測定 CHOG 16−IGS1細胞をFluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)
上で機能的にスクリーニングして、推定リガンドに反応する細胞内カルシウムの
移動度を測定した。
【0123】
細胞調製のために、下記の材料を使用した。透明で平底の黒色ウエル96ウエ
ルプレート(Costar);増殖培地:10%牛胎児血清(Gibco) を補足したGlutamax
(Gibco) を有するNut-Mix F-12(HAM) ;インキュベーター:5%CO2、37℃
(Nuaire)。
ルプレート(Costar);増殖培地:10%牛胎児血清(Gibco) を補足したGlutamax
(Gibco) を有するNut-Mix F-12(HAM) ;インキュベーター:5%CO2、37℃
(Nuaire)。
【0124】
実験の24時間または48時間前に黒色壁マイクロプレート内に細胞を接種し
た。細胞密度は、48時間培養に対しては0.8x10-4細胞/ウエル、そして
24時間培養に対しては2.2x10-4細胞/ウエルであった。すべての段階を
滅菌条件下で行った。
た。細胞密度は、48時間培養に対しては0.8x10-4細胞/ウエル、そして
24時間培養に対しては2.2x10-4細胞/ウエルであった。すべての段階を
滅菌条件下で行った。
【0125】
染料負荷のために、下記の材料を使用した:2mM染料ストック:443μl
の低水分DMSO(Sigma) 中で可溶性化した1mg Fluo-4(Molecular Probes)
(アリコートは−20で貯蔵);20%プルロン酸(Pluronic acid) 溶液:2m
lの低水分DMSO(Sigma) 中、37℃で可溶性化した400mgプルロン酸(S
igma) (室温で貯蔵);染料/プルロン酸混合物:使用直前に等量の染料ストッ
クおよび20%プルロン酸と混合した(染料およびプルロン酸は、最終濃度それ
ぞれ1mMおよび10%であった);プロベンシッド、250mMストック溶液
:5ml 1N NaOH溶液中で可溶化しそして20mM HEPESを補足
したフェノールレッド(Gibco) を欠いた5mlハンク(Hank's)BSSと混合した
710mgプロベンシッド(Gibco) ;負荷−緩衝液:20mM HEPESを補
足したフェノールレッド(Gibco) を欠いた10.5ml ハンクBSS、105
μlプロベンシッド、210μl 1M HEPES;洗浄−緩衝液:20mM
HEPESおよび2.5mMプロベンシッドを補足したフェノールレッド(Gib
co) を欠いたハンクBSS。
の低水分DMSO(Sigma) 中で可溶性化した1mg Fluo-4(Molecular Probes)
(アリコートは−20で貯蔵);20%プルロン酸(Pluronic acid) 溶液:2m
lの低水分DMSO(Sigma) 中、37℃で可溶性化した400mgプルロン酸(S
igma) (室温で貯蔵);染料/プルロン酸混合物:使用直前に等量の染料ストッ
クおよび20%プルロン酸と混合した(染料およびプルロン酸は、最終濃度それ
ぞれ1mMおよび10%であった);プロベンシッド、250mMストック溶液
:5ml 1N NaOH溶液中で可溶化しそして20mM HEPESを補足
したフェノールレッド(Gibco) を欠いた5mlハンク(Hank's)BSSと混合した
710mgプロベンシッド(Gibco) ;負荷−緩衝液:20mM HEPESを補
足したフェノールレッド(Gibco) を欠いた10.5ml ハンクBSS、105
μlプロベンシッド、210μl 1M HEPES;洗浄−緩衝液:20mM
HEPESおよび2.5mMプロベンシッドを補足したフェノールレッド(Gib
co) を欠いたハンクBSS。
【0126】
2mM染料ストックを負荷−緩衝液に加える直前に等量の20%(w/v)プ
ルロン酸と混合した。集密化細胞層を攪乱しないようにして増殖−培地をウエル
から吸引除去した。100μlの負荷−緩衝液をMultidrop(Labsystems) を用い
てそれぞれのウエル中に分配した。細胞を5%CO2 、37℃のインキュベータ
ー中で30分間インキュベーションした。背景蛍光を算出するために、一部のウ
エルには染料を負荷しなかった。染料負荷の後、洗浄−緩衝液を用いて細胞を3
回洗浄して(自動化したDanley細胞洗浄装置)、基底蛍光を背景上20.000
〜25.000カウントに低下させた。100μlの洗浄−緩衝液を加えそして
細胞を37℃で実験の開始までインキュベーションした。
ルロン酸と混合した。集密化細胞層を攪乱しないようにして増殖−培地をウエル
から吸引除去した。100μlの負荷−緩衝液をMultidrop(Labsystems) を用い
てそれぞれのウエル中に分配した。細胞を5%CO2 、37℃のインキュベータ
ー中で30分間インキュベーションした。背景蛍光を算出するために、一部のウ
エルには染料を負荷しなかった。染料負荷の後、洗浄−緩衝液を用いて細胞を3
回洗浄して(自動化したDanley細胞洗浄装置)、基底蛍光を背景上20.000
〜25.000カウントに低下させた。100μlの洗浄−緩衝液を加えそして
細胞を37℃で実験の開始までインキュベーションした。
【0127】
スクリーニングする化合物を20mM HEPESおよび0.1%BSA(Sig
ma) を補足したフェノールレッド(Gibco) を欠いたハンクBSS中で希釈した。
FLIPRを用いる細胞内カルシウム検出は、製造者(Molecular Devices) によ
る記載のようにして行った。FLIPRセットアップパラメーターは、暴露長さ
0.4秒、フィルター1、50μl液体添加、ピペッター(pipetter)高さ125
μl、分配速度40μl/秒、攪拌なしに設定した。
ma) を補足したフェノールレッド(Gibco) を欠いたハンクBSS中で希釈した。
FLIPRを用いる細胞内カルシウム検出は、製造者(Molecular Devices) によ
る記載のようにして行った。FLIPRセットアップパラメーターは、暴露長さ
0.4秒、フィルター1、50μl液体添加、ピペッター(pipetter)高さ125
μl、分配速度40μl/秒、攪拌なしに設定した。
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【配列表】
【図1】
共通IGS1コンティグを生成するように単離された種々のクローンの相対位
置の図示。クローニングのために使用したPCRプライマーは、(IP#)で指
示する。クローンHB4693は、HNT1398とHNT1413との重複P
CRを介して得た。IGS1コーディング配列(IGS1PROT)の位置は、
星印「*」で指示した。EST20889およびEATアクセッション番号A1
672141の位置は「==」で、IGS1DNAの位置は「++」で指示した
。IGS1DNAはIGS1コンティグの一部分であり、その配列はそれぞれの
ヌクレオチド位置における少なくとも4個の独立したcDNAクローンに対して
決定した。
置の図示。クローニングのために使用したPCRプライマーは、(IP#)で指
示する。クローンHB4693は、HNT1398とHNT1413との重複P
CRを介して得た。IGS1コーディング配列(IGS1PROT)の位置は、
星印「*」で指示した。EST20889およびEATアクセッション番号A1
672141の位置は「==」で、IGS1DNAの位置は「++」で指示した
。IGS1DNAはIGS1コンティグの一部分であり、その配列はそれぞれの
ヌクレオチド位置における少なくとも4個の独立したcDNAクローンに対して
決定した。
【図2】
ヒトIGS1プローブを用いた多重組織発現アレイ分析。この膜上には痕跡的
な多数のシグナルが存在する。矢印で指示したシグナルだけが、寄託したRNA
の位置と一致しそして特異的である。
な多数のシグナルが存在する。矢印で指示したシグナルだけが、寄託したRNA
の位置と一致しそして特異的である。
【図3】
種々の脳領域からのRNAに対するヒトIGS1のノーザンブロット分析。
【手続補正書】
【提出日】平成14年11月1日(2002.11.1)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項6】 発現系が適合性宿主細胞内に存在する場合に、該発現系が配
列番号2のポリペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配
列を含んでなるIGS1ポリペプチドを産生することができる、該発現系を含ん
でなるDNAまたはRNA分子。
列番号2のポリペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配
列を含んでなるIGS1ポリペプチドを産生することができる、該発現系を含ん
でなるDNAまたはRNA分子。
【請求項7】 請求項6の発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項8】 酵母細胞である、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項9】 動物細胞である、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項10】 請求項7から9までに記載の細胞に由来するIGS1受容
体膜調製物。
体膜調製物。
【請求項11】 ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項7の宿
主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなるIGS1
ポリペプチドを産生するための方法。
主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなるIGS1
ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項12】 適当な培養条件下で、細胞がIGS1ポリペプチドを産生
することができるように、請求項6の発現系を用いて細胞を形質転換またはトラ
ンスフェクションすることを含んでなる、細胞のIGS1ポリペプチドを産生す
る細胞を産生するための方法。
することができるように、請求項6の発現系を用いて細胞を形質転換またはトラ
ンスフェクションすることを含んでなる、細胞のIGS1ポリペプチドを産生す
る細胞を産生するための方法。
【請求項13】 配列番号2記載のアミノ酸配列に対してその全長にわたっ
て少なくとも80%が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、IGS1ポリペプ
チド。
て少なくとも80%が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、IGS1ポリペプ
チド。
【請求項14】 配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる、請求項13記載
のポリペプチド。
のポリペプチド。
【請求項15】 請求項13記載のIGS1ポリペプチドに対して免疫特異
性の抗体。
性の抗体。
【請求項16】 請求項13記載のIGS1ポリペプチド受容体の活性また
は発現を増強することを要する患者の治療のための方法において、 (a)該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および/
または、 (b)配列番号2のIGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し
てその全長にわたって少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、ま
たはインビボで該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対し
て相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者
に提供する ことを含んでなる方法。
は発現を増強することを要する患者の治療のための方法において、 (a)該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および/
または、 (b)配列番号2のIGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し
てその全長にわたって少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、ま
たはインビボで該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対し
て相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者
に提供する ことを含んでなる方法。
【請求項17】 請求項13記載のIGS1ポリペプチド受容体の活性また
は発現を阻害することを要する患者の治療のための方法において (a)該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、およ
び/または (b)該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチ
ドを患者に投与し、および/または (c)リガンドに対して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患
者に投与する ことを含んでなる方法。
は発現を阻害することを要する患者の治療のための方法において (a)該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、およ
び/または (b)該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチ
ドを患者に投与し、および/または (c)リガンドに対して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患
者に投与する ことを含んでなる方法。
【請求項18】 患者内の請求項13記載のIGS1ポリペプチドの発現ま
たは活性に関して患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法に
おいて (a)該患者のゲノム内の該IGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列内の突然変異の存在または不存在を決定し、および/または (b)該患者に由来する試料内のIGS1ポリペプチド発現の存在または量を分
析する ことを含んでなる方法。
たは活性に関して患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法に
おいて (a)該患者のゲノム内の該IGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列内の突然変異の存在または不存在を決定し、および/または (b)該患者に由来する試料内のIGS1ポリペプチド発現の存在または量を分
析する ことを含んでなる方法。
【請求項19】 請求項13記載のIGS1ポリペプチドに対するアゴニス
トを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして (b)試験化合物がIGS1ポリペプチドの活性化により発生するシグナルに影
響するかどうかを決定する ことを含んでなる方法。
トを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして (b)試験化合物がIGS1ポリペプチドの活性化により発生するシグナルに影
響するかどうかを決定する ことを含んでなる方法。
【請求項20】 請求項19記載の方法により同定されるアゴニスト。
【請求項21】 請求項13記載のIGS1ポリペプチドに対するアンタゴ
ニストを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして (b)該アゴニストにより発生されたシグナルが候補化合物の存在下で減衰する
かどうかを決定する ことを含んでなる方法。
ニストを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして (b)該アゴニストにより発生されたシグナルが候補化合物の存在下で減衰する
かどうかを決定する ことを含んでなる方法。
【請求項22】 請求項21記載の方法により同定されるアンタゴニスト。
【請求項23】 IGS1ポリペプチドを発現する請求項12記載の方法に
より産生された組換え宿主細胞またはその膜。
より産生された組換え宿主細胞またはその膜。
【請求項24】 遺伝的に改変された非−ヒト動物を創成する方法において
、 a)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タ
イプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または b)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を操作し、そして、アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質または生物
学的に活性な断片をコードする内在性遺伝子対立遺伝子を完全にまたは部分的に
不活性化するような方法で動物のゲノム内に該配列を再導入する 段階を含んでなる方法。
、 a)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タ
イプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または b)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を操作し、そして、アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質または生物
学的に活性な断片をコードする内在性遺伝子対立遺伝子を完全にまたは部分的に
不活性化するような方法で動物のゲノム内に該配列を再導入する 段階を含んでなる方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0102
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0102】
【実施例】
実施例1. 新規のGタンパク質共役型受容体をコードするcDNAのクローニ
ング 実施例1a.新規のGタンパク質共役型受容体(GPCR)をコードするゲノム
断片の相同性PCRクローニング PCRに基づく相同性クローニング戦略を、新規のGタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムDNA配列を単離するために使用した。下記の前進(F
11)および後退(R13)縮重PCRプライマーを、膜貫通ドメイン1(TM 1)内および膜貫通ドメイン3と細胞内ループ2の境界(TM3/12)のそれ
ぞれのニューロテンシン受容体遺伝子の保存領域内で設計した。 F11(TM1): 5’−CATCTTCGTCGTCGGCAC(A,C,GまたはT)G(Cま
たはT)(A,C,GまたはT)GG(A,C,GまたはT)AA−3’ (配列番号3) R13(TM3/12): 5’−GGGTGGCAGATGGCCA(AまたはG)(AまたはG)(Cま
たはT)A(A,C,GまたはT)C(CまたはT)(CまたはT)TC−3’ (配列番号4) さらに、3’ブロックされたオリゴプライマー(HNTR1F1STOP)を
設計した。 HNTR1F1STOP: 5’−ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT−3’−3’−
dA (配列番号5) 3’ブロックされたプライマーは、TM1コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体(NTR1)cDNAに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複(および競合)している。この3’末端は、3’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒伸張を避ける(Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302)。
ング 実施例1a.新規のGタンパク質共役型受容体(GPCR)をコードするゲノム
断片の相同性PCRクローニング PCRに基づく相同性クローニング戦略を、新規のGタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムDNA配列を単離するために使用した。下記の前進(F
11)および後退(R13)縮重PCRプライマーを、膜貫通ドメイン1(TM 1)内および膜貫通ドメイン3と細胞内ループ2の境界(TM3/12)のそれ
ぞれのニューロテンシン受容体遺伝子の保存領域内で設計した。 F11(TM1): 5’−CATCTTCGTCGTCGGCAC(A,C,GまたはT)G(Cま
たはT)(A,C,GまたはT)GG(A,C,GまたはT)AA−3’ (配列番号3) R13(TM3/12): 5’−GGGTGGCAGATGGCCA(AまたはG)(AまたはG)(Cま
たはT)A(A,C,GまたはT)C(CまたはT)(CまたはT)TC−3’ (配列番号4) さらに、3’ブロックされたオリゴプライマー(HNTR1F1STOP)を
設計した。 HNTR1F1STOP: 5’−ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT−3’−3’−
dA (配列番号5) 3’ブロックされたプライマーは、TM1コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体(NTR1)cDNAに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複(および競合)している。この3’末端は、3’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒伸張を避ける(Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302)。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0103
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
PCR反応は、体積60μlで行いそして100ngヒトゲノムDNA(Clont
ech)、6μl 10xPCR緩衝液II(100mM トリス−HCl pH8
.3;500mM KCl,Perkin Elmer)、3.6μl 25mM MgCl
2 、0.36μl dNTP類(それぞれのdNTPの25mM)、1.5単
位AmpliTaqTMポリメラーゼ(Perkin Elmer )、縮重前進および後退プ
ライマーそれぞれの30ピコモルおよび3’ブロックされたプライマーの100
ピコモルを含んでいた。反応管を94℃で2分間加熱し、次いで変性(94℃、
30秒間)、アニーリング(55℃、1分間、タッチダウン−0.25℃/サイ
クル)および伸張(72℃、1分間)の20サイクル、次いでさらに変性(94
℃、30秒間、アニーリング(50℃、1分間)および伸張(72℃、1分間)
の20サイクルを行った。最後に反応管を5分間、72℃で加熱した。PCR反
応産物を2%アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染
色した。期待した大きさの断片(±300bp)をQiaex−IITM精製キ
ット(Qiagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Pr
omega)により推奨された手順に従ってpGEM−Tプラスミド内に連結した。こ
のようにして作製した組換えプラスミドをコンピテント大腸菌SURETM2細
菌(Stratagene)を形質転換するために使用した。
ech)、6μl 10xPCR緩衝液II(100mM トリス−HCl pH8
.3;500mM KCl,Perkin Elmer)、3.6μl 25mM MgCl
2 、0.36μl dNTP類(それぞれのdNTPの25mM)、1.5単
位AmpliTaqTMポリメラーゼ(Perkin Elmer )、縮重前進および後退プ
ライマーそれぞれの30ピコモルおよび3’ブロックされたプライマーの100
ピコモルを含んでいた。反応管を94℃で2分間加熱し、次いで変性(94℃、
30秒間)、アニーリング(55℃、1分間、タッチダウン−0.25℃/サイ
クル)および伸張(72℃、1分間)の20サイクル、次いでさらに変性(94
℃、30秒間、アニーリング(50℃、1分間)および伸張(72℃、1分間)
の20サイクルを行った。最後に反応管を5分間、72℃で加熱した。PCR反
応産物を2%アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染
色した。期待した大きさの断片(±300bp)をQiaex−IITM精製キ
ット(Qiagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Pr
omega)により推奨された手順に従ってpGEM−Tプラスミド内に連結した。こ
のようにして作製した組換えプラスミドをコンピテント大腸菌SURETM2細
菌(Stratagene)を形質転換するために使用した。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0109
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0109】
ネストしたAP−2/IP11260 3’−RACE PCR反応物は、数
本のバンドを示した。IGS1プローブとハイブリダイズした最大の3’ネスト
RACE PCR断片(±1,550bp)をゲルから精製し、pGEM−T(P
romega) 内に連結しそしてコンピテント大腸菌SURE II細胞を形質転換す
るために使用した。この連結反応からのIGS1特異性形質転換体を、クローン
HNT642の32P−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの
後に同定した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズ
しそして高ストリンジェンシー(0.1xSSC 0.1%SDS、65℃で3
0分間)で洗浄した。3’RACEネストPCRライブラリーのハイブリダイゼ
ーションスクリーニングは、3個の陽性クローンを生成した。これらの2個(H
NT1413−1414)を配列決定した。
本のバンドを示した。IGS1プローブとハイブリダイズした最大の3’ネスト
RACE PCR断片(±1,550bp)をゲルから精製し、pGEM−T(P
romega) 内に連結しそしてコンピテント大腸菌SURE II細胞を形質転換す
るために使用した。この連結反応からのIGS1特異性形質転換体を、クローン
HNT642の32P−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの
後に同定した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズ
しそして高ストリンジェンシー(0.1xSSC 0.1%SDS、65℃で3
0分間)で洗浄した。3’RACEネストPCRライブラリーのハイブリダイゼ
ーションスクリーニングは、3個の陽性クローンを生成した。これらの2個(H
NT1413−1414)を配列決定した。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0111
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0111】
単離されたすべてのIGS1 cDNAクローンを完全に配列決定しそして単
一コンティグ内に構築できた(図1)。少なくとも4回の独立したcDNAクロ
ーンから決定されたこの連続cDNAの一部分をIGS1DNAとして本明細書
に記載する(配列番号1)。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、508アミノ酸のタンパク質が予想されこれはGPCRタンパク
質に良い相同性を示した(IGS1PROT;配列番号2)。発現された配列タ
グデータベース(dbase)に対するIGS1コンティグのDNA配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、EST20889(アクセション番号AA31
8717)およびESTアクセション番号AI672141の存在を示し、これ
らは両方共にIGS1コンティグの3’末端と重複するがしかしIGS1オープ
ン読み取り枠の外側である(図1)。 実施例1c.完全IGS1コーディング配列を含む連続cDNA断片の単離 連続IGS1 cDNAクローンをクローンHNT1398およびHNT14
13鋳型上で重複−PCRを介して作製した。HNT1398プラスミドDNA
の100ngおよびHNT1413プラスミドの100ngを、それぞれプライ
マー対IP12264/IP11264(それぞれ配列番号18および12)お
よびIP11260/IP12262(それぞれ配列番号8および11)を用い
て別々の反応(50μl)でPCR増幅した(変性〔94℃、30秒間〕、アニ
ーリング〔60℃、30秒間〕および伸張〔72℃、1分間〕の30PCRサイ
クル、ExpandTM High Fidelity PCRシステム[Boehringer]使用)。それぞ
れのPCR反応物の1μlの量を一緒にしそしてプライマー対IP12264/
IP12261を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−PCR反応物は、
±1730bpのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてpGEM−Tプ
ラスミドベクター中に連結した。コンピテント大腸菌DH5αF’菌を形質転換
するために組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン(1
00μg/ml)を含むLBアガプレート上にプレーティングした。プラスミド
DNAを多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を
介して決定した。±1730bp挿入物を含むクローン3個を配列決定した。ク
ローンHB4693の配列は、共通IGS1 cDNA配列と完全に一致した(
図1参照)。プラスミドHB4693を内包する細胞株を、アンピシリン100
μg/mlを含むLBアガープレート上に再プレーティングした後に再クローン
し、そしてInnogenetics strain list(ICCG#4297)およびCentraalbu
reau voor Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国)(寄託番号CBS10
2049)の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドD
NAを再度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだ
した。
一コンティグ内に構築できた(図1)。少なくとも4回の独立したcDNAクロ
ーンから決定されたこの連続cDNAの一部分をIGS1DNAとして本明細書
に記載する(配列番号1)。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、508アミノ酸のタンパク質が予想されこれはGPCRタンパク
質に良い相同性を示した(IGS1PROT;配列番号2)。発現された配列タ
グデータベース(dbase)に対するIGS1コンティグのDNA配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、EST20889(アクセション番号AA31
8717)およびESTアクセション番号AI672141の存在を示し、これ
らは両方共にIGS1コンティグの3’末端と重複するがしかしIGS1オープ
ン読み取り枠の外側である(図1)。 実施例1c.完全IGS1コーディング配列を含む連続cDNA断片の単離 連続IGS1 cDNAクローンをクローンHNT1398およびHNT14
13鋳型上で重複−PCRを介して作製した。HNT1398プラスミドDNA
の100ngおよびHNT1413プラスミドの100ngを、それぞれプライ
マー対IP12264/IP11264(それぞれ配列番号18および12)お
よびIP11260/IP12262(それぞれ配列番号8および11)を用い
て別々の反応(50μl)でPCR増幅した(変性〔94℃、30秒間〕、アニ
ーリング〔60℃、30秒間〕および伸張〔72℃、1分間〕の30PCRサイ
クル、ExpandTM High Fidelity PCRシステム[Boehringer]使用)。それぞ
れのPCR反応物の1μlの量を一緒にしそしてプライマー対IP12264/
IP12261を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−PCR反応物は、
±1730bpのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてpGEM−Tプ
ラスミドベクター中に連結した。コンピテント大腸菌DH5αF’菌を形質転換
するために組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン(1
00μg/ml)を含むLBアガプレート上にプレーティングした。プラスミド
DNAを多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を
介して決定した。±1730bp挿入物を含むクローン3個を配列決定した。ク
ローンHB4693の配列は、共通IGS1 cDNA配列と完全に一致した(
図1参照)。プラスミドHB4693を内包する細胞株を、アンピシリン100
μg/mlを含むLBアガープレート上に再プレーティングした後に再クローン
し、そしてInnogenetics strain list(ICCG#4297)およびCentraalbu
reau voor Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国)(寄託番号CBS10
2049)の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドD
NAを再度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだ
した。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0114
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0114】
HindIII消化したpcDNA3.1(+)ベクターの1μl、挿入物3
μlおよび16μl H2 OをReady-To-Go リガーゼ管(T4 DNAリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech)に加えそして1時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の2μlを化学的コンピテントDH5αF’菌を形質転換す
るために使用した。形質転換した細菌200μlをLBプレート上にプレーティ
ングし(100μgアンピシリン/ml)そして一晩37℃で培養した。16個
のランダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むLB培地3ml中で培養
した。プラスミドDNAをBioRobotTM9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて
作製しそしてNotI、PstIおよびSphI制限酵素を用いる制限分析を介
して分析した。正しい制限パターンを有する1個のコロニーからのDNAを部分
的に配列決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだし
た。部分的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist (ICCG#4
350)に寄託しそして大量のDNA(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託し
た株から調製した。この大規模DNAプレプ(3μg/μlの500μl)の配
列分析により期待された配列が確認された。
μlおよび16μl H2 OをReady-To-Go リガーゼ管(T4 DNAリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech)に加えそして1時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の2μlを化学的コンピテントDH5αF’菌を形質転換す
るために使用した。形質転換した細菌200μlをLBプレート上にプレーティ
ングし(100μgアンピシリン/ml)そして一晩37℃で培養した。16個
のランダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むLB培地3ml中で培養
した。プラスミドDNAをBioRobotTM9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて
作製しそしてNotI、PstIおよびSphI制限酵素を用いる制限分析を介
して分析した。正しい制限パターンを有する1個のコロニーからのDNAを部分
的に配列決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだし
た。部分的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist (ICCG#4
350)に寄託しそして大量のDNA(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託し
た株から調製した。この大規模DNAプレプ(3μg/μlの500μl)の配
列分析により期待された配列が確認された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 48/00 A61P 1/08 4C084
A61P 1/04 1/12 4C086
1/08 1/14 4H045
1/12 3/04
1/14 3/06
3/04 3/10
3/06 7/02
3/10 9/04
7/02 9/06
9/04 9/10
9/06 101
9/10 9/12
101 11/06
9/12 13/10
11/06 13/12
13/10 19/02
13/12 19/10
19/02 25/00
19/10 25/06
25/00 25/08
25/06 25/14
25/08 25/16
25/14 25/18
25/16 25/20
25/18 25/22
25/20 25/24
25/22 25/28
25/24 25/30
25/28 31/04
25/30 31/10
31/04 31/12
31/10 31/18
31/12 33/02
31/18 35/00
33/02 37/00
35/00 37/08
37/00 C07K 14/705
37/08 16/28
C07K 14/705 C12N 1/15
16/28 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 C12P 21/02 C
1/21 C12Q 1/02
5/10 1/68 A
C12P 21/02 G01N 33/15 Z
C12Q 1/02 33/50 Z
1/68 33/53 D
G01N 33/15 M
33/50 33/566
33/53 C12N 15/00 ZNAA
5/00 B
33/566 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG
,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,
AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C
N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES
,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,
ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,K
R,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV
,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,
NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,S
I,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA
,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW
(72)発明者 ツアング,フアン
オランダ・エヌエル−1381シーピー ウエ
ースプ・シージエイバンホウテンラーン36
Fターム(参考) 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13
DA14 DA36 FB02
4B024 AA01 AA11 BA61 BA63 CA04
DA02 EA04 GA11 HA01 HA11
HA14
4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ42
QQ52 QQ79 QR32 QR35 QR48
QR51 QR55 QR77 QS34 QX07
4B064 AG20 CA05 CA10 CA19 DA01
DA13
4B065 AA26X AA91X AA93Y AB01
BA02 CA24 CA44 CA46
4C084 AA13 AA16 NA14 ZA02 ZA05
ZA06 ZA08 ZA12 ZA16 ZA18
ZA22 ZA29 ZA36 ZA40 ZA42
ZA43 ZA45 ZA54 ZA59 ZA66
ZA68 ZA69 ZA70 ZA71 ZA73
ZA81 ZA96 ZA97 ZB07 ZB13
ZB26 ZB32 ZB33 ZB35 ZB38
ZC33 ZC35 ZC39 ZC55
4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 NA14
ZA02 ZA05 ZA06 ZA07 ZA08
ZA12 ZA16 ZA18 ZA22 ZA29
ZA36 ZA40 ZA42 ZA43 ZA45
ZA54 ZA59 ZA66 ZA68 ZA69
ZA70 ZA71 ZA72 ZA73 ZA75
ZA81 ZA84 ZA94 ZA96 ZA97
ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26
ZB33 ZB35 ZB38 ZC33 ZC35
ZC55
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
CA40 DA50 DA75 EA20 FA74
Claims (25)
- 【請求項1】 a)配列番号2記載のIGS1ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列; b)Centraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn 、オランダ国)における寄
託番号CBS102049号内に含まれるDNA挿入物によりコードされるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列、特には配列番号1に相当するヌクレオ
チド配列; c)(a)または(b)のヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なく
とも80%(好ましくは少なくとも90%)の配列の同一性を有するヌクレオチ
ド配列; d)(a)または(b)または(c)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレ
オチド配列 からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオ
チド。 - 【請求項2】 該ポリヌクレオチドが配列番号2のIGS1ポリペプチドを
コードする配列番号1内に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項3】 該ポリヌクレオチドが配列番号1に対してその全長にわたっ
て少なくとも80%が同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 配列番号1のポリヌクレオチドである、請求項3記載のポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項5】 DNAまたRNAである、請求項1−4に記載のポリヌクレ
オチド。 - 【請求項6】 請求項1のポリヌクレオチドまたは少なくとも5個のヌクレ
オチドそして好ましくは30個と50個との間のヌクレオチドのその断片を含ん
でなるハイブリダイゼーションプローブ。 - 【請求項7】 発現系が適合性宿主細胞内に存在する場合に、該発現系が配
列番号2のポリペプチドに対して少なくとも80%のの同一性を有するアミノ酸
配列を含んでなるIGS1ポリペプチドを産生することができる、該発現系を含
んでなるDNAまたはRNA分子。 - 【請求項8】 請求項7の発現系を含んでなる宿主細胞。
- 【請求項9】 酵母細胞である、請求項8記載の宿主細胞。
- 【請求項10】 動物細胞である、請求項8記載の宿主細胞。
- 【請求項11】 請求項8から10までに記載の細胞に由来するIGS1受
容体膜調製物。 - 【請求項12】 ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項8の宿
主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなるIGS1
ポリペプチドを産生するための方法。 - 【請求項13】 適当な培養条件下で、細胞がIGS1ポリペプチドを産生
することができるように、請求項7の発現系を用いて細胞を形質転換またはトラ
ンスフェクションすることを含んでなる、細胞のIGS1ポリペプチドを産生す
る細胞を産生するための方法。 - 【請求項14】 配列番号2記載のアミノ酸配列に対してその全長にわたっ
て少なくとも80%が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、IGS1ポリペプ
チド。 - 【請求項15】 配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる、請求項14記載
のポリペプチド。 - 【請求項16】 請求項14記載のIGS1ポリペプチドに対して免疫特異
性の抗体。 - 【請求項17】 請求項14記載のIGS1ポリペプチド受容体の活性また
は発現を増強することを要する患者の治療のための方法において、 (a)該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および/
または、 (b)配列番号2のIGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し
てその全長にわたって少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列、ま
たはインビボで該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対し
て相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者
に提供する ことを含んでなる方法。 - 【請求項18】 請求項14記載のIGS1ポリペプチド受容体の活性また
は発現を阻害することを要する患者の治療のための方法において (a)該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、およ
び/または (b)該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチ
ドを患者に投与し、および/または (c)リガンドに対して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患
者に投与する ことを含んでなる方法。 - 【請求項19】 患者内の請求項14記載のIGS1ポリペプチドの発現ま
たは活性に関して患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法に
おいて (a)該患者のゲノム内の該IGS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列内の突然変異の存在または不存在を決定し、および/または (b)該患者に由来する試料内のIGS1ポリペプチド発現の存在または量を分
析する ことを含んでなる方法。 - 【請求項20】 請求項14記載のIGS1ポリペプチドに対するアゴニス
トを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして (b)試験化合物がIGS1ポリペプチドの活性化により発生するシグナルに影
響するかどうかを決定する ことを含んでなる方法。 - 【請求項21】 請求項20記載の方法により同定されるアゴニスト。
- 【請求項22】 請求項14記載のIGS1ポリペプチドに対するアンタゴ
ニストを同定するための方法において、 (a)IGS1ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして (b)該アゴニストにより発生されたシグナルが候補化合物の存在下で減衰する
かどうかを決定する ことを含んでなる方法。 - 【請求項23】 請求項22記載の方法により同定されるアンタゴニスト。
- 【請求項24】 IGS1ポリペプチドを発現する請求項13記載の方法に
より産生された組換え宿主細胞またはその膜。 - 【請求項25】 遺伝的に改変された非−ヒト動物を創成する方法において
、 a)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タ
イプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または b)アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を操作し、そして、アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質または生物
学的に活性な断片をコードする内在性遺伝子対立遺伝子を完全にまたは部分的に
不活性化するような方法で動物のゲノム内に該配列を再導入する 段階を含んでなる方法。
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