JP2003508026A - ヒトｇ−タンパク質共役型受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、これらによりコードされるポリペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびこれらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＩＧＳ１−ファミリーと呼ばれるＧタンパク質共役型受容体ファミリーに関する。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関し、ここでＩＧＳ１遺伝子は過剰発現、非発現、過少発現または抑制（ノックアウト動物）のいずれかである。本発明は、さらに該Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＩＧＳ１のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物をスクリーニングするための方法およびＩＧＳ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドおよびＩＧＳ１受容体ファミリーに対するアゴニストまたはアンタゴニストの神経医学およびＣＮＳ障害の治療における使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】

本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、これらによりコードされるポ
リペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用およびこ
れらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に関し、これを以後ＩＧＳ
１と呼ぶ。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻
害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む
宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関し、ここでＩＧＳ１遺伝子は過剰
発現、非発現、過少発現および／または抑制（ノックアウト動物）のいずれかで
ある。本発明は、さらに、該Ｇタンパク質共役型受容体ＩＧＳ１のアゴニストま
たはアンタゴニストとして作用できる化合物をスクリーニングするための方法に
も関する。

【０００２】

【発明の背景】

多数の医療的に重要な生物学的過程が、Ｇタンパク質および／またはセカンド
メッセンジャー、例えばｃＡＭＰを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質
により媒介されることは良く証明されている(Lefkowitz, Nature 1991, 351:353
-354) 。本明細書中でこれらのタンパク質は、Ｇタンパク質と一緒に経路に関与
するタンパク質と呼ばれる。これらのタンパク質の一部の例は、ＧＰＣ受容体、
例えばアドレナリン作動剤およびドーパミン(Kobilka, B.K. et al., Proc. Nat
l. Acad, Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K. et al., Science, 1987,
238:650-656; Bunzow, J.R., et al., Nature, 1988, 336:783-787) 、Ｇタンパ
ク質自体、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シク
ラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、およびアクチュエータータンパク質、例
えばタンパク質キナーゼＡおよびタンパク質キナーゼＣ(Simon, M.I., et al.,
Science, 1991, 252:802-8) である。

【０００３】 例えば、シグナル伝達の一つの形においてＧＰＣＲへのホルモン結合の際に、
受容体は、ヘテロ三量体状Ｇタンパク質と相互作用してそしてグアニンヌクレオ
チド−結合部位からＧＤＰの分離を誘導する。グアニンヌクレオチドの正常の細
胞濃度において、ＧＴＰは部位を直ちに満たす。Ｇタンパク質のα−サブユニッ
トへのＧＴＰの結合は、受容体からＧタンパク質の分離およびＧタンパク質のα
ならびにβγサブユニットへの分離を起こす。次いで、ＧＰＴを有する形は、ア
デニル酸シクラーゼに結合して活性化する。Ｇタンパク質自体により触媒される
ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解（αサブユニットは固有のＧＴＰアーゼ活性を有す
る）は、Ｇタンパク質をその基底の不活性形に返還させる。αサブユニットのＧ
ＴＰアーゼ活性は、本質的には、オン／オフスイッチを制御する内部時計である
。αサブユニットのＧＤＰ結合形はβγに対する高い親和性を有しそしてαＧＤ
Ｐのβγとの引き続く再結合は、系を基底状態に返還させる。このように、Ｇタ
ンパク質は二重の役割、すなわち受容体からエフェクター（この例ではアデニル
酸シクラーゼ）へのシグナルを中継する中間体としておよびシグナルの存続期間
を制御する時計としての役割を有する。

【０００４】 Ｇタンパク質共役型受容体の膜結合スーパーファミリーは、７個の推定膜貫通
ドメインを有するとして特性化されている。ドメインは、細胞外または細胞質ル
ープにより連結された膜貫通αらせんを示すと考えられている。Ｇタンパク質共
役型受容体は、広範囲の生物学的活性受容体、例えばホルモン、ウイルス、成長
因子および神経受容体を含む。

【０００５】 Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーは、ＣＮＳ障害の治療に使用される神経
弛緩性薬剤に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーの成員の他の例
は、カルシトニン、アドレナリン作動薬、神経ペプチドＹ、ソマストタチン、ニ
ューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＣＲＦ、
ＣＣＫ、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドテリン、ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリニン作用薬、アセチルコリン、セロトニン、ヒス
タミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−
１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイルス受容体を含むが、こ
れらに限定はされない。

【０００６】 大部分のＧタンパク質共役型受容体は、機能的タンパク質構造を安定化すると
考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループのそれぞ
れの中に単独保存システイン残基を有する。７個の膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ
２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ５とＴＭ６
とを結合する細胞質ループは、Ｇタンパク質結合ドメインの主要な成分であろう
。

【０００７】 大部分のＧタンパク質共役型受容体は、第三細胞質ループおよび／またはカル
ボキシ末端内に潜在的リン酸化部位を含む。数種のＧタンパク質共役型受容体、
例えばβ−アドレナリン受容体に対して、タンパク質キナーゼＡおよび／または
特定の受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体脱感作を媒介する。

【０００８】 最近、ある種のＧＰＣＲは、カルシトニン受容体様受容体と同様に、受容体活
性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）と呼ばれる小さい一回通過膜タンパク質と相互作
用するらしいことが発見された。ＧＰＣＲとある種のＲＡＭＰとのこの相互作用
は、天然のリガンドがＧＰＣＲ−ＲＡＭＰ組合わせに対する関連親和性を有しそ
して複合体の機能的シグナル伝達活性を調節することに決定的である(McLathie,
L.M. et al., Nature (1998) 393:333-339)。

【０００９】 ある種の受容体に対して、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位は、
数種のＧタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケッ
トを含んでなり、そのソケットはＧタンパク質共役型受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられる。それぞれのＧタンパク質共役型受容体膜貫通らせん
の親水性側は、内側に向き、そして極性リガンド−結合部位を形成すると考えら
れる。ＴＭ３は、数種のＧタンパク質共役型受容体においてリガンド−結合部位
、例えばＴＭ３アスパラギン酸残基を有すると考えられている。ＴＭ５セリン、
ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６およびＴＭ７フェニルアラニンまたはチロシン
もリガンド結合に関係する。

【００１０】 Ｇタンパク質共役型受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内
酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内結合できる（Johnson
et al., Endoc. Rev., 1989, 10:317-331 参照）。種々のＧタンパク質αサブユ
ニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して種々の生物学的機能を細胞内
で調節する。Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質内残基のリン酸化は、ある種の
Ｇタンパク質共役型受容体のＧタンパク質結合の調節のための重要な機構として
同定された。Ｇタンパク質共役型受容体は哺乳類宿主内の多数の部位に見いださ
れている。

【００１１】 主としてＧＰＣＲクラスの受容体は、現在既知の薬剤の半分以上を誘導した(D
rews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516)。これは、これらの受容体が、治
療標的として確立され、証明された経歴を有することを示す。本発明中に記載す
る新規のＩＧＳ１ ＧＰＣＲは、機能不全、障害、または疾患（以後全体的に「
疾患」と呼ぶ）の診断、防止、改善または矯正において役立つことができる別の
受容体の同定および特性決定のために当該技術分野での要求を明らかに満足する
。「疾患」は、精神***症、間欠性発作不安（ＥＰＡ）障害、例えば強迫症（Ｏ
ＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニック、重症抑
うつ障害、双極性障害、パーキンソン病、一般不安障害、自閉症、せん妄、多発
性硬化症、アルツハイマー病／痴呆およびその他の神経変性疾患、重症精神遅滞
、運動障害、ハンチントン病、ツレット症候群、チック、振せん、ジストニー、
痙攣、食欲不振、食欲亢進、脳卒中、耽溺／依存／渇望、睡眠障害、テンカン、
偏頭痛、注意散漫／活動過多障害（ＡＤＨＤ）を含む精神医学およびＣＮＳ障害
、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、低血圧、高血圧−例えば本態性
高血圧、腎高血圧、または肺高血圧、血栓症、動脈硬化症、脳血管痙攣、クモ膜
下出血、脳虚血、脳梗塞、末梢血管疾患、レイノー症を含む心血管疾患、腎臓疾
患−例えば腎不全、異脂肪症、肥満、嘔吐、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性
腸疾患（ＩＢＤ）、胃食道反射疾患（ＧＥＲＤ）、運動性障害および遅延空胃腸
症状、例えば手術後または糖尿病胃不全麻痺、および糖尿病、潰瘍−例えば胃潰
瘍を含む胃腸疾患、下痢、骨そしょう症を含むその他の疾患、炎症、感染症、例
えば細菌、真菌、原虫およびウイルス感染症、特にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２による感染、苦痛、ガン、化学治療誘発障害、腫瘍侵入、免疫疾患、残尿、喘
息、アレルギー、関節炎、良性前立腺肥大、内毒素ショック、敗血症、真性糖尿
病の合併症、および婦人科障害を含み、これらに限定はされない。

【００１２】 特に、本発明に記載の新規のＩＧＳ１ ＧＰＣＲは、精神医学およびＣＮＳ不
全、障害および疾患、特には運動障害、障害または疾患、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の診断、防止、改善または矯正に重要な役割を演じることができるとい
う別の受容体の同定および特性決定のための当該技術分野の要求を満足する。

【００１３】

【発明の要旨】

一つの態様では、本発明は、ＩＧＳ１ポリペプチドおよび組換え物質およびこ
れらの製造のための方法に関する。本発明の別の態様は、このようなＩＧＳ１ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドの使用のための方法に関する。このような使
用は、上記のような「疾患」の一つの治療を含み、これに限定はされない。特に
は使用は、精神医学およびＣＮＳ障害、特には運動障害、例えばチック、振せん
、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニーお
よび痙攣の治療を含む。

【００１４】 さらに別の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いるアゴニ
ストおよびアンタゴニストの同定のため、および同定された化合物を用いるＩＧ
Ｓ１平衡失調に関連する状態を治療する方法に関する。本発明のさらに別の態様
は、不適当なＩＧＳ１活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断ア
ッセイに関する。本発明のさらに別の態様は、ＩＧＳ１の異常な発現または活性
から起きる障害に対するモデルとして挙動する動物に基づく系に関する。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】 ［発明の詳細な説明］ 配列およびモチーフの範囲内での構造類似性は、本発明のＩＧＳ１ ＧＰＣＲ
とその他のヒトＧＰＣＲとの間で存在する。さらにＩＧＳ１は、脳組織、特には
尾状核および被殻内に発現される。従って、ＩＧＳ１はなかでも上記の「疾患」
に関与すると考えられる。特にＩＧＳ１は、精神医学およびＣＮＳ障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット症候群、パーキンソン病、ハンチン
トン病、運動異常、ジストニーおよび痙攣に関与すると考えられる。

【００１８】 別途に断らない限り、本明細書中に使用される技術的および科学的用語は、本
発明が属する当該分野の通常の熟練者により共通して理解されると同様の意味を
有する。本明細書中に記載のものに類似または等価なあらゆる方法および物質が
本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法、装置および物質
をここに記載する。本明細書中に引用したすべての公開文献は、すべての公開文
献を特定して個別に完全に記載すると同様に本明細書中に引用して組み込むと同
様に、引用することにより本明細書中に編入される。

【００１９】

【定義】

以下の定義は、本明細書中にしばしば使用される一部の用語の理解を助けるた
めに記載される。

【００２０】 「ＩＧＳ１」は、なかでも、配列番号２中に記載のアミノ酸配列またはその対
立遺伝子変種を含んでなるポリペプチドを呼ぶ。

【００２１】 「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」は、該ＩＧＳ１の代謝または
生理的機能を呼び、同様の活性または改善された活性または低下した望ましくな
い副作用を有するこれらの活性を含む。該ＩＧＳ１の抗原性および免疫原性活性
も含まれる。

【００２２】 「ＩＧＳ１遺伝子」は、配列番号１中に記載のヌクレオチド配列またはこれら
の対立遺伝子変種および／またはこれらの相補物を含んでなるポリヌクレオチド
を呼ぶ。

【００２３】 本明細書中に使用される「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗
体、キメラ、一本鎖、および人体適応化された抗体、ならびにＦａｂ断片を含み
、これにはＦａｂまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物も含
まれる。

【００２４】 「単離された」は、「人手により」本来（天然）の状態から改変および／また
は本来の環境から分離されたことを意味する。従って、本来的に存在する「単離
された」組成物または物質が「単離」されると、その当初の環境から変化または
移動または両方を受ける。例えば、本来的に生きた動物内に存在するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、しかしその本来の状態で
一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離され」ており、このように本明細書中で用語が使用される。

【００２５】 「ポリヌクレオチド」は、一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾Ｒ
ＮＡもしくはＤＮＡであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを呼ぶ。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖
状ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖
状ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または
さらに典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよい
ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含むが、これに限定はされ
ない。さらに「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよ
びＤＮＡの両方を含んでなる三本鎖領域も含んでもよい。用語ポリヌクレオチド
は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性また
はその他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修
飾された」塩基は、例えばトリチル化された塩基および通常ではない塩基例えば
イノシンを含む。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ、従って、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された、典型的に天
然に見いだされるポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡ
およびＲＮＡ特性の化学的形のポリヌクレオチドの形を包含する。「ポリヌクレ
オチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。

【００２６】 「ポリペプチド」は、たがいにペプチド結合または変形ペプチド結合、すなわ
ちペプチドアイソスターで結合された２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでな
るあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶ。「ポリペプチド」は、一般にペプ
チド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にタンパク
質と呼ばれるさらに長い鎖、および／またはこれらの組み合わせを呼ぶ。ポリペ
プチドは、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポ
リペプチド」は、天然の過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技
術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含
む。このような修飾は基本的教科書中およびさらの長大な論文中ならびに大量の
研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起きるこ
とができる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド中の種々の部位におい
て同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられた
ポリペプチドは多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン
化の結果として分枝してもよく、そしてこれらは分枝を有するかまたは有してい
ない環状であってもよい。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後
の天然のプロセシングからもたらされてもよくまたは合成法により作製されても
よい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン
の共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノ
シトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共
有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガ
ンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸
のトランスファーＲＮＡ媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含
む。例えば、「タンパク質−構造および分子的性質」(PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company,
New York, 1993)および「翻訳後タンパク質修飾- 前途および予想」(Wold, F.,
Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pg
s. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Joh
nson, Ed. Academic Press, New York, 1983) 、「タンパク質修飾および非タン
パク質補因子の分析」(Seifter et al., "Analysis for protein modifications
and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646)および「タ
ンパク質合成：翻訳後修飾および熟成」(Ratten et al., "Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 66
3:48-62)を参照。

【００２７】 本明細書中の用語としての「変種」は、比較するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な性質、例えば本質的な生物学的、構造
的、調節的または生化学的性質は保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
である。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の比較ポリヌクレオチドとはヌ
クレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列中の変化は、比較ポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化してもしなくても
よい。ヌクレオチド変化は、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を比較
配列によりコードされるポリペプチド中にもたらしてもよく、これは以下に考察
する。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が他の比較ポリペプチドと
異なる。一般に、相違は、比較ポリペプチドおよび変種の配列が全体的には密接
に類似しそして多くの領域で一致している程度に限定される。変種および比較ポ
リペプチドは、アミノ酸配列内で１個またはそれ以上の置換、付加、および欠失
のあらゆる組み合により異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残
基は、遺伝子暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する例えば対立遺伝子変種であ
ってもよく、またはこれは天然に存在するとは知られていない変種であってもよ
い。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非−天然存在変種は、突然変異技術
または直接合成により作製されてもよい。

【００２８】 「同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一
般に、配列は最高度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は
、当該技術分野で認められた意味を有しそして公開された技術を用いて算出でき
る。例えば下記参照：「コンピューターによる分子生物学」(COMPUTATIONAL MOL
ECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988
);「バイオコンピューティング: 情報学およびゲノムプロジェクト」(BIOCOMPUT
ING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press,
New York, 1993);「配列データのコンピューター分析、第一部」(COMPUTER ANAL
YSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., H
umana Press, Newe Jersey, 1994); 「分子生物学における配列解析」(SEQUENC
E ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G. Academic Press, 1987);お
よび「配列解析プライマー」(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and De
vereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991)。２個のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在するけれ
ども、用語「同一性」は、当該技術分野の熟練者には周知である(Carillo, H.,
and Lipton, D., SIAM J. Applied Math, (1988) 48:1073) 。２個の配列の間の
同一性または類似性を決定するために一般的に使用される方法は、「大型コンピ
ューターへのガイド(Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Acade
mic Press, San Diego, 1994) およびCarillo, H., and Lipton, D., SIAM J. A
pplied Math, (1988) 48:1073 中に開示されたものを含むが、これに限定はされ
ない。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラム
中にコード化されている。配列間の同一性および類似性を決定するための好まし
いコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J.
et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳ
ＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403)を
含むが、これに限定はされない。用語「相同」は、「同一性」に置換してもよい
。

【００２９】 説明として、配列番号１の比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９
５％「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の比較
ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個それぞれに対して５個以下のヌクレオ
チド相違を含んでもよいことを除いて、比較配列と同一であることを意味する。
換言すると、比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を有すポリヌクレオチドを得るためには、比較配列中のヌクレオチド
の５％以下が欠失または他のヌクレオチドにより置換されてもよいか、または比
較配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドが比較配列内に挿入さ
れてもよいか、または比較配列内の全ヌクレオチドのいずれかの５％以下のヌク
レオチドの数において欠失、挿入および置換の組み合わせがあってもよい。比較
配列のこれらの変異は、比較ヌクレオチド配列の５または３末端位置においてま
たはこれらの末端位置の間のいかなる位置でも、比較配列中のヌクレオチドの間
で個別に、または比較配列内の１個またはそれ以上の連続基内のヌクレオチドの
いずれかに散在して起きてもよい。

【００３０】 同様に、例えば、配列番号２の比較アミノ酸配列に対して少なくとも９５％「
同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が
配列番号２の比較配列のアミノ酸１００個のそれぞれに対して５個以下のアミノ
酸変化を含んでもよいことを除いてポリペプチドのアミノ酸配列が比較配列と同
一であること意味する。換言すると、比較アミノ酸配列に少なくとも９５％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、比較配列内のアミノ
酸残基の５％以下が欠失または他のアミノ酸で置換されていてもよいか、または
比較配列内の全アミノ酸残基の５％以下の数のアミノ酸が比較配列中に挿入され
てもよい。比較配列のこれらの変更は、比較アミノ酸配列のアミノもしくはカル
ボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のあらゆる位置で、比較配
列内の残基間に個別にまたは比較配列内の１個またはそれ以上の隣接基内のいず
れかに散在して存在してもよい。本発明のポリペプチド 一つの態様では、本発明は、ＩＧＳ１ポリペプチド（ＩＧＳ１タンパク質も含
む）に関する。ＩＧＳ１ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドおよびCent
raalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）に１９９９年７月１
５日付けで寄託された寄託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに配列番号２の
アミノ酸配列およびCentraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ
国）において寄託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコ
ードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、および配列番号２のものと
少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列および／またはその全長にわた
ってCentraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）において寄
託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミ
ノ酸配列、そしてさらに好ましくは、該アミノ酸配列に少なくとも９０％同一、
そしてその上にさらに好ましくは少なくとも９５％一致を有するポリペプチドを
含むポリペプチドを含む。さらに、少なくとも９７％同一、特には少なくとも９
９％が最も好ましい。ＩＧＳ１ポリペプチド中には、配列番号２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはCentraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、
オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してその全長にわた
って少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含
まれ、そしてさらに好ましくは配列番号２に少なくとも９０％同一、そしてその
上にさらに好ましくは少なくとも９５％同一である。さらに、少なくとも９７％
、特には少なくとも９９％が最も好ましい。好ましくは、ＩＧＳ１ポリペプチド
は受容体の少なくとも一つの生物学的活性を示す。

【００３１】 ＩＧＳ１ポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形であってもよくまたはさら
に大きいタンパク質、例えば融合タンパク質の一部分であってもよい。分泌また
はリーダー配列、プロ配列、精製において支援する配列、例えば重複ヒスチジン
残基を含む追加のアミノ酸配列、または組換え物産生の間の安定性のための追加
の配列を含むとしばしば有利である。

【００３２】 ＩＧＳ１ポリペプチドの断片も本発明中に含まれる。断片とは、上記のＩＧＳ
１ポリペプチドのアミノ酸配列の一部分ではあるが全体ではないものと同様のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＧＳ１ポリペプチドと同様に、断片
は「自立」、すなわちこれらが部分または領域を形成するさらに大きいポリペプ
チド内で、最も好ましくは単独の連続領域を含んでなってもよい。本発明のポリ
ペプチド断片の代表的な例は、例えば、ＩＧＳ１ポリペプチドのアミノ酸番号約
１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１
から末端の断片を含む。この範囲内で、「約」は一方または両端のいずれかにお
ける数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸ほど大きいかまたは小さい特定
の列挙の範囲を含む。

【００３３】 好ましい断片は、例えば、アミノ末端を含む残基の一連の連続物もしくはカル
ボキシ末端を含む残基の一連の連続物の欠失、またはアミノ末端を含むものおよ
びカルボキシ末端を含むものの残基の２個の連続物の欠失を除き、ＩＧＳ１ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを含む。構造的または機能的
属性、例えばアルファらせんおよびアルファらせん形成性領域、ベータシートお
よびベータシート形成性領域、ターンおよびターン形成性領域、コイルおよびコ
イル形成性領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両性領域、ベータ両性領域
、フレキシブル領域、表面形成性領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を
含んでなる断片により特徴付けられる断片も好ましい。その他の好ましい断片は
、生物学的活性の断片である。生物学的活性の断片は、受容体活性を媒介するも
のであり、類似した活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望
ましくない活性を有するものを含む。動物中特にはヒト中で抗原または免疫原性
であるものも好ましい。

【００３４】 従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２のものと少なくとも８０％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび／またはCentraalbureau voor
Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２０４９
号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドまたは相当する断片に対して少なくとも８０％の同一性を有するこれらの断
片を含む。好ましくは、これら全てのポリペプチド断片は、抗原活性を含む受容
体の生物学的活性を保持する。定義された配列および断片の変種も、本発明の一
部を形成する。好ましい変種は、保存性アミノ酸置換により比較物とは異なるも
のである。すなわち、残基を類似した別の特性のものと置換したものである。こ
のような置換基の典型は、特にＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＬｉｅ、特にＳｅ
ｒおよびＴｈｒ、特に酸残基ＡｓｐおよびＧｌｕ、特にＡｓｎおよびＧｌｎ、お
よび特に塩基残基ＬｙｓおよびＡｒｇ、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒで
ある。特に好ましいものは、その中で数個、５−１０個、１−５個、または１−
２個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失、または付加された変種であ
る。

【００３５】 本発明のＩＧＳ１ポリペプチドは、あらゆる適当な方法で作製できる。このよ
うなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え作製され
たポリペプチド、合成して作製されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み
合わせで作製されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの作製方法は
、当該技術分野では周知である。本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様はＩＧＳ１ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ１ポリヌクレ
オチドは、ＩＧＳ１ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、およびこれに密接に関連したポリヌクレオチドを含む。さらに具体的に
は、本発明のＩＧＳ１ポリヌクレオチドは、配列番号１中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含んでなるポリヌクレオチド、例えば配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチ
ドをコードできるもの、配列番号１の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよ
びCentraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）において寄託
番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的に相当するポリヌ
クレオチドを含む。

【００３６】 ＩＧＳ１ポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列に対してその全体にわたって少なくとも８０％の同一性を有
するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、配列番号１のものにその
全長にわたって少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリ
ヌクレオチドおよびCentraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ
国）において寄託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的
に相当するポリヌクレオチドをさらに含む。

【００３７】 これに関して、少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドが特に好ましく、そ
して少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドがさらに好ましい。さらに、少な
くとも９７％のものが高度に好ましく、少なくとも９８−９９％のものが最も高
度に好ましく、少なくとも９９％のものが最も好ましい。ＩＧＳ１ポリヌクレオ
チドとして、配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列に対しまたはCentraalbu
reau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１
０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物に対して十分な一致性を有するヌクレオ
チド配列も、増幅のためまたはプローブまたはマーカーとしての使用のために使
用可能な条件下でハイブリダイズするために含まれる。本発明は、これらのＩＧ
Ｓ１ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。

【００３８】 本発明のＩＧＳ１は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質
に構造的に関連し、これは公開データベース中のＢＬＡＳＴサーチの結果により
示される。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は、約３０％の同一性（ＢＬＡＳ
Ｔ使用、Altscul S.F. et al.,[1997], Nucleic Acids Res.. 25:3389-3402）を
主要部分（アミノ酸残基７−２２２および３９６−４７０）においてラビットア
ルファ−１ｃアドレナリン受容体（アクセッション番号＃Ｏ０２８２４，Miyasa
to et al. RL Life Sci. (1997) 60:2069-2074）と、そして約３３％の同一性を
アミノ酸残基３１−２２０において、ヒトＧタンパク質共役型受容体ＲＥ２（ジ
ーンバンクアクセッション＃ＡＦ０９１８９０）と有する。表１のヌクレオチド
配列（配列番号１）は、５７％の同一性をヒトα−１ａ／ｄアドレナリン受容体
（アクセッション番号＃Ｌ３１７２２、Bruno J.F., et al. Biochem. Biophys.
Res. Commun. (1991) 179:1485-1490）と２６６ヌクレオチド残基で有し、そし
て４４％の同一性をヒトＧタンパク質共役型受容体ＲＥ２と最初の１４２６ヌク
レオチド残基（ジーンバンクアクセッション＃ＡＦ０９１８９０）において有す
る。さらに、ＩＧＳ１タンパク質配列のヒドロパシー分析(Hoffmann, K., Stoff
el, W(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347:166) は、膜貫通領域７個の存在を
示した。従って、本発明のＩＧＳ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、な
かでもこれらの相同的ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似した生物学的
機能／性質を有すると予想され、そしてこれらの有用性は当該技術分野のすべて
の熟練者に明白である。

【００３９】 本発明のポリヌクレオチドは、天然起源、例えばゲノムＤＮＡから得ることが
できる。特には、縮重(degerated) ＰＣＲプライマーは、特定のＧＰＣＲ遺伝子
サブファミリー内の保存された領域をコードするように設計できる。縮重プライ
マーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ上のＰＣＲ増幅反応は、考慮している
遺伝子ファミリーの数種のメンバー（公知および新規の両方）の増幅をもたらす
（ゲノム鋳型を用いる場合には、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなけ
ればならない）（Libert et al., Science, 1989, 244:569-572 ）。本発明のポ
リヌクレオチドは、周知で商業的に利用できる技術を用いて合成もできる。

【００４０】 配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番
号１中に含まれる配列をコードするポリペプチドと同一であってもよい（ヌクレ
オチド番号３６から１５５９）か、またはこれは、遺伝子コードの重複（縮重）
の結果として、配列番号１内に含まれる配列をコードするポリペプチドと比較し
て変化を示すが、しかし配列番号２のポリペプチドもコードする異なるヌクレオ
チド配列であってもよい。

【００４１】 本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ１ポリペプチドの組換え産生に使用される
場合には、ポリペプチドは成熟ポリペプチドに対するコーディング配列またはそ
の断片をそれ自体に成熟ポリペプチドに対するコーディング配列または他のコー
ディング配列を有する読み取り枠内の断片、例えばリーダーまたは分泌配列、プ
レ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列またはその他の融合ペプチ
ド部分をコードするものを含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容
易とするマーカー配列がコードされることができる。本発明のこの実施における
ある好ましい態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、こ
れはｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)として提供され、そしてGentz et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されており、またはＨＡタグ
である。ポリヌクレオチドは、非−コーディング５’および３’配列、例えば転
写された非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソ
ーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列も含んでもよい。

【００４２】 さらに好ましい態様は、数個、５−１０、１−５、１−３、１−２または１個
のアミノ酸残基があらゆる組み合わせで置換、欠失または付加された配列番号２
のＩＧＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるＩＧＳ１変種をコードする
ポリヌクレオチドである。

【００４３】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、お
よび／または発現の変性を含むが、これに限定はされない種々の目的のためにＩ
ＧＳ１コード化配列を改変するために当該技術分野では一般に公知の方法を用い
て操作することができる。ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡシャフリ
ングおよび遺伝子断片ならびに合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を、ヌク
レオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒
介の部位指定突然変異誘発は、アミノ酸置換の創成、新規の制限部位の創成、修
飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）パターンの改変、コドン優先の変化、
スプライス変種の産生などの変異を導入するために使用してもよい。

【００４４】 本発明は、さらに、本明細書中に以上に記載した配列にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、ストリンジェントな条件下
で本明細書中に以上に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドに特に関する。本明細書中に使用される用語「ストリンジェント条件」
は、少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに好ま
しくは少なくとも９５％、それ以上に好ましくは少なくとも９７％、特には少な
くとも９９％の同一性が配列間で存在する場合にのみハイブリダイゼーションが
起きることを意味する。

【００４５】 配列番号１またはその断片中に含まれるヌクレオチド配列に同一または十分に
同一である本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対する
ハイブリダイゼーションプローブとして、全長ｃＤＮＡとＩＧＳ１をコードする
ゲノムクローンとを単離しそしてｃＤＮＡとＩＧＳ１遺伝子に高度の配列類似性
を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体をコードす
る遺伝子を含む）のゲノムクローンとを単離するために使用してもよい。当該技
術分野の熟練者は、このようなハイブリダイゼーション技術を熟知している。典
型的にはこれらのヌクレオチド配列は、比較物のものと８０％同一、好ましくは
９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。プローブは、一般に、少なく
とも５個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも８個のヌクレオチド、そ
してさらに好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、もっと好ましくは少な
くとも１２個のヌクレオチド、特には少なくとも１５個のヌクレオチドを含んで
なる。最も好ましくは、このようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチド
そして少なくとも５０個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブ
は、３０から５０個の範囲内のヌクレオチドである。

【００４６】 ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体を含むＩＧＳ１ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを得るための一つの態様は、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で、配列番号１またはその断片を有する標識プロー
ブを用いる適当なライブラリーのスクリーニング、および全長ＤＮＡならびに該
ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階を含んでなる。この
ようなハイブリダイゼーション技術は当該技術分野の熟練者には周知である。ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に定義されたもの、また
は４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデ
ンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性せん断サケ
***ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、次いで０．１ｘＳＳＣ中
、約６５℃でフィルターを洗浄する条件と定義される。

【００４７】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒト疾患に対す
る治療および診断の発見のための研究用試薬および材料として使用してもよい。ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベ
クター、および本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞および
組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。細胞を含まない翻訳
系も、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いるこのようなタンパク質の
産生に使用できる。

【００４８】 組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドに対する発現系
またはこれらの部分を組み込むために遺伝子的に操作できる。宿主細胞内へのポ
リヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば「分子生物学に
おける基本的方法」(Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986
))および「分子クローニング：実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) に記載された方法、例えばリン酸カルシ
ウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション
、トランスヴェクション(transvection)、ミクロ注入、カチオン性脂質媒介トラ
ンスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、
バリスティック導入(Ballistic introduction)または感染により行うことができ
る。

【００４９】 適当な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ状球菌、大
腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞および
アスペルギルス属細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプ
テラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ
１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボウズ・メラノーマ(Bowes melan
oma)細胞、および植物細胞を含む。

【００５０】 広範な各種の発現系が使用できる。このような系は、なかでも、染色体、エピ
ソームおよびウイルス誘導系、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージ
から、トランスポソンから、酵母エピソームから、挿入要素から、酵母染色体要
素から、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばＳＶ４
０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス
およびレトロウイルスに由来するベクター、およびこれらの組み合わせに由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素、例えばコス
ミドおよびファジェミドに由来するものを含む。発現系は、発現を調節ならびに
発生する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中にポリペプチドを産生するた
めのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するために適するあらゆる系また
はベクターを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、各種の周知で慣用の
技術、例えば「分子クローニング：実験マニュアル」(Sambrook et al., MOLECU
LAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、上記）に記載のもののいずれを用いてでも
発現系内に挿入してもよい。

【００５１】 小胞体の内腔内へ、細胞周辺腔内へまたは細胞外環境内への翻訳されたタンパ
ク質の分泌のために、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド内に組み込んで
もよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在性であってもよくまたは非相
同性シグナルであってもよい。

【００５２】 スクリーニングアッセイで使用するためにＩＧＳ１ポリペプチドが発現される
場合に、一般にポリペプチドが細胞の表面で産生されることが好ましい。このイ
ベントにおいて、細胞をスクリーニングアッセイに使用する前に採取してもよい
。ＩＧＳ１ポリペプチドの親和性または機能的活性が受容体活性調節タンパク質
（ＲＡＭＰ）により変性される場合に、細胞表面におけると考えられる関係する
ＲＡＭＰの同時発現が好ましく、しばしば要求される。このイベントの場合にも
、ＩＧＳ１ポリペプチドおよび関係するＲＡＭＰを発現する細胞のスクリーニン
グアッセイ使用前での採取も要求される。ＩＧＳ１ポリペプチドが培地内で分泌
される場合には、培地は、ポリペプチドを回収および精製するために回収できる
。細胞内で産生される場合には、ポリペプチドを回収する前に細胞を先ず溶解し
なければならない。

【００５３】 ＩＧＳ１ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製できる。最
も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。タンパク質を
リフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが単離および／また
は精製の間に変性される場合に活性配座を再生するために使用してもよい。診断アッセイ 本発明は、診断試薬としての使用のためのＩＧＳ１ポリヌクレオチドの使用に
も関する。機能不全と関連するＩＧＳ１遺伝子の変異形の検出は、ＩＧＳ１の過
少発現、過剰発現または改変された発現からもたらされる疾患または疾患への罹
病性の診断に追加またはこれを決定することができる診断手段を提供する。この
イベントにおいても、関連する受容体活性調節タンパク質の同時発現は、所望の
品質の診断アッセイを得るために要求できる。ＩＧＳ１遺伝子内に変異を有する
個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出してもよい。

【００５４】 診断のための核酸は、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖
検物質から得てもよい。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用してもよくまたは
分析の前にＰＣＲまたはその他の増幅技術を使用して酵素的に増幅してもよい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様の方法で使用してもよい。欠失および挿入は、正常
の遺伝子型と比較して増幅の大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅し
たＤＮＡを標識ＩＧＳ１ヌクレオチド配列にハイブリダイズして同定できる。完
全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ消化によりまたは溶融温度の相違によりミス
マッチ二本鎖から区別できる。ＤＮＡ配列の相違は、変性剤を加えまたは加えな
いゲル内のＤＮＡ断片の電気泳動の移動性の改変により、または直接のＤＮＡ配
列決定により検出してもよい。例えばMyers et al., Science (1985) 230:1242
参照。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮ
アーゼおよびＳ１保護または化学開裂法により解明してもよい。Cotton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401参照。別の態様では、ＩＧ
Ｓ１ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブ
のアレイを例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築するこ
とができる。アレイ技術の方法は周知であり、そして一般的な用途を有しそして
遺伝子発現、遺伝子連結、および遺伝子変化を含む分子遺伝学における各種の問
題を解明するために使用できる（例えばM. Chee et al., Science, Vol 274, pp
610-613(1996) 参照）。

【００５５】 診断アッセイは、記載の方法によるＩＧＳ１遺伝子内の変異の検出を通じて、
なかでも上記の「疾患」への罹病性を診断または決定するための方法を提供する
。診断アッセイは、特に、神経医学およびＣＮＳ障害、特には運動障害、例えば
チック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジ
ストニアおよび痙攣に対する罹病性を、上記の方法によるＩＧＳ１遺伝子内の変
異の検出を通じて診断または検出するための方法を提供する。

【００５６】 さらに、なかでも上記の「疾患」は、患者に由来する試料からＩＧＳ１ポリペ
プチドまたはＩＧＳ１ｍＲＮＡの異常な低下または増加したレベルから決定する
ことを含んでなる方法により診断できる。特に神経医学およびＣＮＳ障害、特に
は運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチント
ン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を患者から誘導した試料からＩＧＳ１ポ
リペプチドまたはＩＧＳ１ｍＲＮＡの異常な低下または増加したレベルから決定
することを含んでなる方法により診断できる。

【００５７】 低下または増加した発現は、ポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野で
は周知の方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロテ
ィングおよびその他のハイブリダイゼーション法のいずれかを用いてＲＮＡレベ
ルで測定できる。宿主に由来する試料中のタンパク質、例えばＩＧＳ１のレベル
を決定するために使用できるアッセイ技術は、当該技術分野の熟練者には周知で
ある。このようなアッセイ方法は、放射免疫検定、競合的結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。

【００５８】 別の態様では、本発明はなかでも「疾患」または上記の「疾患」のひとつに対
する罹病性に対する診断キットに関する、具体的には、本発明は、神経医学およ
びＣＮＳ障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキン
ソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する診断キット
に関する。

【００５９】 このキットは、 （ａ）ＩＧＳ１ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、
またはその断片、および／または （ｂ）（ａ）のものに対して相補的なヌクレオチド配列、および／または （ｃ）ＩＧＳ１ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはそ
の断片、および／または （ｄ）ＩＧＳ１ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２のポリペプチ
ドに対する抗体、および／または （ｅ）ＩＧＳ１のポリペプチドの関連する生物学的または抗原的性質に対して必
要なＲＡＭＰポリペプチド を含んでなってもよい。

【００６０】 このようないずれもキットでも、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ
）は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は、染色体同定に対しても価値がある。配列は、個
別のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的設定されそしてこれとハイブリダ
イズできる。本発明に従う染色体の関連配列の地図作製は、これらの配列を遺伝
子関連疾患と相関させるために重要な第一段階である。配列が正確に染色***置
に場所決定された場合に、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと
相関できる。このようなデータは、例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance
in Man （Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで
入手可能）内に見いだされる。次いで、同じ染色体領域に場所決定された遺伝子
と疾患との関係は、連鎖分析により同定される（物理的に隣接した遺伝子の同時
遺伝）。

【００６１】 影響および非影響個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違も決定できる。
変異が影響を受けた個体の一部またはすべてに観察されるがしかし正常個体内に
は観察されない場合には、変異は疾患の原因薬剤であろう。抗体 本発明のポリペプチドもしくはこれらの断片もしくはこれらの類似体、または
関連ＲＡＭＰと一緒に要求される場合にこれらを発現する細胞は、ＩＧＳ１ポリ
ペプチドに対して免疫特異性な抗体を産生する免疫原として使用してもよい。用
語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドに対するこれら
の親和性よりも本質的に大きい本発明のポリペプチドへの親和性を有することを
意味する。

【００６２】 ＩＧＳ１ポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドまたはエピトー
プ−保持断片、類似体または細胞を動物、好ましくはヒト以外に慣用のプロトコ
ールを通じて投与して得てもよい。モノクローナル抗体の作製のために、連続細
胞様培養により産生される抗体を供給するあらゆる技術を使用してもよい。その
例は、ハイブリドーマ技術(Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:
495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞技術(Kozbor et al., Immunology Tod
ay (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp77-96, Alan R. Liss, Ic., 1985) を含む
。

【００６３】 上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するため
またはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために
使用してもよい。

【００６４】 ＩＧＳ１ポリペプチド自体に対する抗体、またはＩＧＳ１ポリペプチド−ＲＡ
ＭＰ複合体に対する抗体は、なかでも上記の「疾患」を治療するために使用して
もよい。特には、ＩＧＳ１ポリペプチド自体に対する抗体、またはＩＧＳ１ポリ
ペプチド−ＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、神経医学およびＣＮＳ障害、特には
運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、ハンチントン
病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用してもよい。動物 本発明の別の態様は、ＩＧＳ１の異常な発現または活性から起きる障害に対す
るモデルとして挙動するヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に
基づくモデル系は、ＩＧＳ１遺伝子の活性をさらに特徴付けるために使用しても
よい。このような系は、ＩＧＳ１に基づく疾患、例えばなかでも上記の「疾患」
を治療できる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分と
して使用してもよい。特には、この系はＩＧＳ１に基づく神経医学およびＣＮＳ
障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病、
ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣を治療するために使用できる
化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分として使用して
もよい。

【００６５】 この方法で、動物に基づくモデルは、ＩＧＳ１の異常な発現または活性の障害
の治療において有効であるような薬剤化合物、治療および介入を同定するために
使用してもよい。さらにこのような動物モデルは、動物患者内のＬＤ₅₀およびＥ
Ｄ₅₀を測定するために使用してもよい。これらのデータは、潜在的ＩＧＳ１障害
治療の生体内効力を決定するために使用してもよい。

【００６６】 異常なＩＧＳ１発現また活性に基づくＩＧＳ１に基づく障害の動物に基づくモ
デル系は、非−組換え動物ならびに組換え操作トランスジェニック動物の両方を
含んでもよい。

【００６７】 ＩＧＳ１障害に対する動物モデルは、例えば遺伝子モデルを含んでもよい。Ｉ
ＧＳ１に基づく障害様症候群を示す動物モデルは、例えばＩＧＳ１配列、例えば
上記のもののような配列を、当該技術分野の熟練者に周知のトランスジェニック
動物作製のための技術と組み合わせて使用して操作してもよい。例えば、ＩＧＳ
１配列は、関係する動物のゲノム内に導入、そして過剰発現および／または発現
欠失しても、または内在性ＩＧＳ１配列が存在する場合には、これらを過剰発現
、発現欠失のいずれでもよく、または、その代わりに、ＩＧＳ１遺伝子発現を過
少発現または不活性化するために破壊してもよい。

【００６８】 ＩＧＳ１遺伝子配列を過剰発現または発現欠失するために、ＩＧＳ１遺伝子配
列のコーディング部分は、高レベル遺伝子発現または関係する動物種で遺伝子が
正常では発現されない細胞種内での発現を駆動することが可能な調節配列に連結
されてもよい。このような調節領域は、当該技術分野の熟練者には周知であり、
そして不当に多くの実験を行わないで使用してもよい。

【００６９】 内在性ＩＧＳ１遺伝子配列の過少発現のために、このような配列を単離および
操作して、関係する動物のゲノム内に再導入された場合に、内在性ＩＧＳ１遺伝
子対立遺伝子が不活性化、すなわち「ノックアウト」されてもよい。好ましくは
、操作されたＩＧＳ１遺伝子配列は、遺伝子標的法を介して、例えば動物ゲノム
内へ操作されたＩＧＳ１遺伝子配列の組込みの際に内在性ＩＧＳ１配列が破壊さ
れるように導入される。

【００７０】 マウス、ラット、ラビット、リス、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、およ
び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル、および類人猿を含むが、これに限定はさ
れないあらゆる種の動物を、ＩＧＳ１関連障害の動物モデルを作製するために使
用してもよい。

【００７１】 当該技術分野で公知のあらゆる技術は、ＩＧＳ１導入遺伝子を動物内に導入し
てトランスジェニック動物の創始株を作製するために使用してもよい。このよう
な技術は、前核ミクロ注入(Hoppe, P.C. and Wagner, T.E. 1989, 米国特許(US)
第4,873,191 号);レトロウイルス媒介の生殖細胞系内への遺伝子導入(van der P
utten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985); 胚幹細胞内
での遺伝子標的法(Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989); 胚の電気穿孔(L
o, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814, 1983); および***媒介遺伝子導入(Lavitra
no et al., Cell 57:717-723, 1989) 等を含むが、これらに限定はされない。こ
のような技術の概説は、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytrol. 115
:171-229, 1989参照。

【００７２】 本発明は、すべてのこれらの細胞内にＩＧＳ１導入遺伝子を有するトランスジ
ェニック動物、ならびに一部であるがすべてではない細胞内に導入遺伝子を有す
る動物、すなわちモザイク動物を提供する (例えばJakobovitz, Curr. Biol. 4:
761-763, 1994に記載の技術参照) 。導入遺伝子は、単独の導入遺伝子として、
またはコンカテマー、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム内に組み込ま
れてもよい。導入遺伝子は、例えばラスコらの教示(Lasko, M. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236, 1992) に従って、特定の細胞種内に選択的
に導入しそして活性化してもよい。

【００７３】 このような細胞種特異性活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細
胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかである。

【００７４】 ＩＧＳ１導入遺伝子を内在性ＩＧＳ１遺伝子の染色体部位内に組み込むことを
望む場合には、遺伝子標的法が好ましい。要約すると、この技術を用いる場合に
は、関係する内在性ＩＧＳ１遺伝子に相同なあるヌクレオチド配列（例えばマウ
スＩＧＳ１遺伝子のヌクレオチド配列）を含むベクターを、染色体配列との相同
組換えを介して、内在性ＩＧＳ１遺伝子または遺伝子対立遺伝子のヌクレオチド
配列内に組込み、そしてその機能を破壊する目的で設計される。導入遺伝子は、
特定の細胞種内に選択的に導入されてもよく、これによりその細胞種内でのみ関
係する内在性遺伝子を不活性化し、これは例えばグらの教示に従う(Gu, H. et a
l., Science 265:103-106, 1996)。このような細胞種特異性不活性化のために必
要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者
には明らかであろう。

【００７５】 トランスジェニック動物が作製されると、組換えＩＧＳ１遺伝子およびタンパ
ク質の発現を標準技術を用いてアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、
導入遺伝子の組込みが起きたかどうかをアッセイするために動物組織を分析する
ために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術により行ってもよい。トランスジ
ェニック動物の組織内のＩＧＳ１導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは、動物か
ら得た組織試料のノーザンブロット分析、in situ ハイブリダイゼーション技術
，およびＲＴ−ＰＣＲを含むがこれに限定はされない技術を用いて評価してもよ
い。標的遺伝子−発現組織の試料を、関係する標的遺伝子導入遺伝子産物に対す
る抗体特異性を用いて免疫細胞化学的に評価してもよい。容易に検出できるレベ
ルでＩＧＳ１遺伝子ｍＲＮＡまたはＩＧＳ１導入遺伝子ペプチドを発現するＩＧ
Ｓ１トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を用いて
免疫細胞化学的に検出）を、次いでさらに、特徴的なＩＧＳ１に基づく疾障害候
群を示すこれらの動物を同定するために続いて評価してもよい。

【００７６】 ＩＧＳ１トランスジェニック創始動物（すなわち、関係する細胞または組織内
にＩＧＳ１タンパク質を発現し、そしてこれは好ましくは、ＩＧＳ１に基づく障
害の症候群を示す動物）が作製されると、特定の動物のコロニーを作製するため
にこれらを育種、同系交配、異系交配、または交雑交配してもよい。このような
育種戦略の例は、分離した株を確立するために１種を越える組込み部位を有する
創始動物の異系交配、それぞれのＩＧＳ１導入遺伝子の付加発現の効果のために
高いレベルで関係するＩＧＳ１導入遺伝子を発現する複合ＩＧＳ１トランスジェ
ニックを産生するための分離した株の同系交配、増加した発現およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの考えられる必要性を除くために、与えられた組込
み部位に対して異型接合の動物を作製するための異型接合トランスジェニック動
物の交雑、複合異型接合または同型接合株を作製するための分離した同型接合株
の交雑、ＩＧＳ１導入遺伝子の発現およびＩＧＳ１様症候群の発生に対する対立
遺伝子変性の効果を検討するための種々の同系交配遺伝子背景への動物の育種を
含むがこれらの限定はされない。このような方法の一つは、ＩＧＳ１関連障害様
症候群、例えば上記のものを示すＦ１世代を作製するために、ＩＧＳ１トランス
ジェニック創始動物と野生型株との交雑である。次いで、異型接合標的遺伝子ト
ランスジェニック動物が生育可能である場合に、異型接合株を発生させるために
、Ｆ１世代を同型交配してもよい。ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、
これは、哺乳類にＩＧＳ１ポリペプチドまたはその断片を、所要の場合には抗体
および／またはＴ細胞免疫反応を発生するために適するＲＡＭＰポリペプチドと
一緒に投与（例えば接種）して、なかでも上記の「疾患」の一つから該動物を保
護することを含んでなる。

【００７７】 本発明のさらに別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に
関し、これは動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫学的反応を誘導
するために、ＩＧＳ１ポリペプチドを生体内でのＩＧＳ１ポリヌクレオチドの発
現を指令するベクターを介して供給することを含んでなる。

【００７８】 本発明の別の態様は、哺乳類宿主内に導入された場合に、ＩＧＳ１ポリペプチ
ドに対する哺乳類内の免疫学的反応を誘導する免疫学的／ワクチン調剤（組成物
）に関し、ここでその組成物はＩＧＳ１ポリペプチドまたはＩＧＳ１遺伝子を含
んでなる。このような免疫学的／ワクチン調剤（組成物）は、治療用の免疫学的
／ワクチン調剤または予防用の免疫学的／ワクチン調剤のいずれかであってもよ
い。ワクチン調剤は、さらに適当なキャリヤーを含んでなってもよい。ＩＧＳ１
ポリペプチドは胃内で分解されるので、これは好ましくは非経口的に投与される
（皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む）。非経口投与のために適する
調剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調剤をレシピエントの血液と等張性と
するための溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液剤、および懸濁剤ま
たは増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌注液剤を含む。調剤は、単位投
与または複数投与容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアル内に存在しても
よく、そして使用の直前に滅菌液体キャリヤーを加えるだけでよい凍結乾燥状態
で貯蔵してもよい。ワクチン調剤は、調剤の免疫原性を増強するためのアジュバ
ント系、例えば水中油系およびその他の当該技術分野では公知の系を含んでもよ
い。用量はワクチンの活性に依存しそして日常的な試験により容易に決定できる
。スクリーニングアッセイ 本発明のＩＧＳ１ポリペプチドは、受容体を結合しそして本発明の受容体ポリ
ペプチドの活性化（アゴニスト）または活性化の阻害（アンタゴニスト）をする
化合物に対するスクリーニングプロセスに使用してもよい。従って、本発明のポ
リペプチドは、小分子基質および例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学ライ
ブラリー、および天然産物混合物内のリガンドの結合を評価するために使用して
もよい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであっても
または構造的または機能的疑似体であってもよい。

【００７９】 ＩＧＳ１ポリペプチドは、病理学を含む生物学的機能の原因である。従って、
一方ではＩＧＳ１を刺激し、そして他方ではＩＧＳ１の機能を阻害できる化合物
または薬剤を発見することが望ましい。一般に、アゴニストはなかでも上記の「
疾患」の病状に対する治療および予防の目的で使用される。特に、アゴニストは
、神経医学およびＣＮＳ障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレッ
ト病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対
する治療および予防の目的で使用される。

【００８０】 アンタゴニストは、なかでも上記の「疾患」の病状に対する種々の治療および
予防の目的で使用してもよい。特には、アンタゴニストは、神経医学およびＣＮ
Ｓ障害、特には運動障害、例えばチック、振せん、ツレット病、パーキンソン病
、ハンチントン病、運動異常、ジストニアおよび痙攣に対する種々の治療および
予防の目的で使用してもよい。

【００８１】 一般に、このようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペプチドをそ
の表面に発現しそして、必須の場合にはその表面にＲＡＭＰの同時発現をする産
生に適する細胞を含む。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエま
たは大腸菌からの細胞を含む。次いで、受容体を発現する細胞（または発現され
た受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触させ、結合、または機能性反応の刺
激もしくは阻害を観察する。

【００８２】 一つのスクリーニング技術は、受容体活性化により起きる細胞外ｐＨ、細胞内
ｐＨ、または細胞内カルシウム変化を測定する、系内に本発明の受容体を発現す
る細胞（例えばトランスフェクションされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技
術において、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させて
もよい。セカンドメッセンジャー反応、例えばシグナル伝達、ｐＨ変化、または
カルシウムレベルの変化を次いで測定して、潜在的化合物が受容体を活性化また
は阻害するかどうかを決定する。

【００８３】 別の方法は、受容体−媒介シグナル、例えばｃＡＭＰ蓄積および／またはアデ
ニル酸シクラーゼ活性の調節を決定することによる受容体阻害剤に関するスクリ
ーニングを含む。このような方法は、真核細胞を本発明の受容体を用いてトラン
スフェクションして細胞表面上に受容体を発現させることを含む。次いで、細胞
を、潜在的アンタゴニストの存在下で本発明の受容体に対するアゴニストに暴露
する。潜在的アンタゴニストが受容体を結合しこれにより受容体結合を阻害する
場合には、アゴニスト媒介シグナルは調節されるであろう。

【００８４】 本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法
は、米国特許（ＵＳ）第５，４８２，８３５号に記載の酵母に基づけ技術である
。

【００８５】 アッセイは、単なる候補化合物の試験結合でもよく、ここで受容体を有する細
胞への接着は、候補化合物と直接または間接に会合した標識を用いるか、または
標識競合物との競合を含むアッセイにより検出される。さらに、これらのアッセ
イは、候補化合物が受容体の活性化により発生するシグナルをもたらすかどうか
を試験してもよく、これには表面において受容体を有する細胞に適する検出系を
用いる。活性化の阻害剤は、一般に、既知のアゴニストの存在下で、そして候補
化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する効果を観察してアッセイさ
れる。

【００８６】 さらに、アッセイは、混合物を形成するためのＩＧＳ１ポリペプチドを含む溶
液と候補化合物とを混合し、混合物中のＩＧＳ１活性を測定し、そして混合物の
ＩＧＳ１活性を標準と比較する段階を単に含んでなってもよい。

【００８７】 ＩＧＳ１ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、細胞内のＩ
ＧＳ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物による効果を検
出するためのアッセイを形成するために使用してもよい。例えば、ＥＬＩＳＡは
、当該技術分野に公知の標準方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗
体を用いてＩＧＳ１タンパク質の分泌または細胞関連レベルを測定するために構
築されてもよく、そしてこれは適当に操作された細胞または組織からのＩＧＳ１
の産生を阻害または促進するであろう薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴ
ニストとも呼ばれる）を発見するために使用できる。スクリーニングアッセイを
行うための標準方法は、当該技術分野では周知である。

【００８８】 潜在的ＩＧＳ１アンタゴニストの例は、抗体または、ある場合にはＩＧＳ１の
リガンド、例えばリガンドの断片に密接に関係したオリゴヌクレオチドまたはタ
ンパク質、または受容体に結合するが反応は行わない小分子を含み、受容体の活
性を阻止する。

【００８９】 従って、別の態様では、本発明は、ＩＧＳ１ポリペプチドに対するアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するためのスクリ
ーニングキット、または （ａ）ＩＧＳ１ポリペプチド、好ましくは配列番号２のもの、 （ｂ）ＩＧＳ１ポリペプチドを発現する組換え細胞、好ましくは配列番号２のも
の、 （ｃ）ＩＧＳ１ポリペプチドを発現する細胞膜、好ましくは配列番号２のもの、
または （ｄ）ＩＧＳ１ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２のもの を含んでなるＩＧＳ１ポリペプチドの産生を低下または促進する化合物に関する
。

【００９０】 あらゆるこのようなキット内で、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は本質
的な成分を含んでなってもよいことが認められる。予防および治療方法 本発明は、ＩＧＳ１活性の過剰および／または不十分な量の両方に関連する異
常な状態を治療するための方法を提供する。

【００９１】 ＩＧＳ１の活性が過剰な場合には、数種の方法が利用できる。一つの方法は、
以上に記載した阻害化合物（アンタゴニスト）を、薬剤的に許容できるキャリヤ
ーと一緒に、ＩＧＳ１に対するリガンドの結合を遮断することにより、またはＲ
ＡＭＰポリペプチドまたはセカンドシグナルとの相互作用を阻害することにより
活性化を阻害し、これにより異状状態を緩和するために有効な量を患者の投与す
ることを含んでなる。

【００９２】 他の方法では、内在性ＩＧＳ１と競合してリガンドをまだ結合できるＩＧＳ１
ポリペプチドの可溶性の形を投与してもよい。このような競合物の典型的な態様
は、ＩＧＳ１ポリペプチドの断片を含んでなる。

【００９３】 さらに別の方法では、内在性ＩＧＳ１をコードする遺伝子の発現は、発現遮断
技術を用いて阻害できる。既知のこのような技術は、内部産生または別途に投与
したアンチセンス配列の使用を含む。例えばO'Conner, J. Neurochem. (1991) 5
6:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n, CRC Press, Boca Raton, Florida USA (1988)参照。あるいは、遺伝子と三重
らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給できる。例えばLee et al., Nuclei
c Acids Res. (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Derva
n et al., Science (1991) 251: 1360参照。これらのオリゴマーは、それ自体を
投与できるかまたは関連するオリゴマーを生体内で発現できる。合成したアンチ
センスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾され
た骨格を有してもよい。後者の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアート
またはペプチド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解か
らの保護を与えるためにアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド内に
組み込まれ、これは当該技術分野には周知である。これらまたはその他の修飾さ
れた骨格を有する合成されたアンチセンスおよび三重らせん分子は、本発明の一
部を形成する。

【００９４】 さらに、ＩＧＳ１ポリペプチドの発現は、ＩＧＳ１ ｍＲＮＡ配列に特異性の
リボザイムを用いて回避してもよい。リボザイムは、天然または合成であること
ができる触媒活性ＲＮＡである（例えばUsman et al., Curr. Opin. Struct. Bi
ol. (1996) 6(4), 527-33 参照）。合成リボザイムは、選択された位置で特異的
にＩＧＳ１ ｍＲＮＡを開裂し、これによりＩＧＳ１ ｍＲＮＡの機能性ポリペ
プチド内への翻訳を避けるように設計できる。リボザイムは天然リン酸リボース
骨格および天然塩基、例えばＲＮＡ分子中に通常見いだされるものを用いて合成
してもよい。あるいは、リボザイムは非天然骨格を用いて、リボヌクレアーゼ分
解からの保護を与えるように、例えば２’−Ｏ−メチル ＲＮＡに合成してもよ
くそして修飾塩基を含んでもよい。

【００９５】 ＩＧＳ１およびその活性の低い発現に関連する異常な状態を治療するために、
種々の方法も利用できる。一つの方法は、ＩＧＳ１を活性化する化合物、すなわ
ち上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を薬剤的に許容できるキャリヤー
と一緒に患者に投与して、これにより異常な状態を緩和することを含んでなる。
あるいは、患者内の関連細胞によるＩＧＳ１の内在的産生を行うために遺伝子治
療を利用してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に考察した複
製欠失レトロウイルスベクター内の発現に関して操作してもよい。次いでレトロ
ウイルス発現構築物を単離して、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージン
グ細胞内に導入してもよく、これによりパッケージング細胞は関係する遺伝子を
含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生体細胞は、生体内における細
胞の操作のためおよび生体内におけるポリペプチドの発現のために患者に投与し
てもよい。遺伝子治療の概説については、Human Molecular Genetics, Strachan
T.and Read A.P., BIOS Scientific Publishers, Ltd(1986) 中の「遺伝子治療
およびその他の分子遺伝子に基づく治療方法」の第２０章(Chapter 20, Gene Th
erapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches) およびそ
の中の引用文献を参照のこと。

【００９６】 上記のあらゆる治療方法は、例えば哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、
ラビット、サル、および最も好ましくはヒトを含む治療が必要なあらゆる患者に
適用してもよい。調剤および投与 ペプチド、例えばＩＧＳ１ポリペプチドの可溶性形、およびアゴニストおよび
アンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な薬剤キャリヤーと組み合わせて
調剤してもよい。このような調剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化
合物、および薬剤的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含んでなる。調剤は
投与の形態に適合しなければならず、そして当該技術分野の熟練者の範囲内に十
分に入る。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の１種またはそれ以上の成
分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装物およびキットに
も関する。

【００９７】 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独または他の化合物、例え
ば治療用化合物と一緒に使用してもよい。

【００９８】 薬剤組成物の全身投与の好ましい形は、注射、典型的には静脈内注射を含む。
他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内が使用できる。全身投与の別
の手段は、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤
を用いる粘膜経由または経皮投与を含む。さらに、経口およびカプセル化調剤に
適当に調剤された場合には、経口投与も可能であろう。

【００９９】 所要の投与範囲はペプチドまたは化合物の選択、投与の経路、調剤の性質、患
者の病状の性質、および担当医師の判断に依存する。適当な用量は、１〜１００
μｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲内である。しかし、種々の使用化合物および投与
の種々の経路の異なる効率を考慮して、所要用量の広範な変化も予想される。例
えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い用量を必要とすると予想さ
れる。これらの用量レベルの変化は、最適化のための標準的な経験慣行を用いて
調整でき、これは当該技術分野では良く理解されている。

【０１００】 治療に使用されるペプチドは、上記のようにしばしば「遺伝子治療」と呼ばれ
る治療モダリティーにおいて、患者内に内在的に発生されることもできる。従っ
て、例えば、患者からの細胞は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ
を用いて生体外で、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いてポ
リペプチドをコードするように操作してもよい。次いで細胞を患者内に導入する
。

【０１０１】 以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することのみを意図するものであ
り、従ってこれらの実施例は本発明をいかなる意味でも制限するとはみなされな
い。

【０１０２】

【実施例】

実施例１． 新規のＧタンパク質共役型受容体をコードするＣＤＮＡのクローニ
ング 実施例１ａ．新規のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするゲノム
断片の相同性ＰＣＲクローニング ＰＣＲに基づく相同性クローニング戦略を、新規のＧタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムＤＮＡ配列を単離するために使用した。下記の前進（Ｆ
１１）および後退（Ｒ１３）縮重ＰＣＲプライマーをニューロテンシン受容体遺
伝子の保存領域内で膜貫通ドメイン１（ＭＴ１）内および膜貫通ドメイン３の境
界においてそれぞれ細胞内ループ第２（ＴＭ３／１２）をそれぞれ用いて設計し
た。 Ｆ１１（ＴＭ１）： ５’−ＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＣ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｇ（Ｃま
たはＴ）（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＧＧ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＡＡ−３’ （配列番号３） Ｒ１３（ＴＭ３／１２）： ５’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡ（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）（Ｃま
たはＴ）Ａ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｃ（ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＴＣ−３’ （配列番号４） さらに、３’ブロックされたオリゴプライマー（ＨＮＴＲ１Ｆ１ＳＴＯＰ）を
設計した。 ＨＮＴＲ１Ｆ１ＳＴＯＰ： ５’−ＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴ−３’−３’−
ｄＡ （配列番号５） ３’ブロックされたプライマーは、ＴＭ１コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体（ＮＴＲ１）ｃＤＮＡに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複（および競合）している。この３’末端は、３’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒延伸を避ける（Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302）。

【０１０３】 ＰＣＲ反応は、体積６０μｌで行いそして１００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ(Clont
ech)、６μｌ １０ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８
．３；５００ｍＭ ＫＣｌ，Perkin Elmer）、３．６μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ 、０．３６μｌ ｄＮＴＰ類（それぞれのｄＮＴＰの２５ｍＭ）、１．５単位
ＡｍｐｌｉＴａｑ^TMポリメラーゼ(Perkin Elmer ）、縮重前進および後退プライ
マーそれぞれの３０ピコモルおよび３’ブロックされたプライマーの１００ピコ
モルを含んでいた。反応管を９４℃で２分間加熱し、次いで変性（９４℃、３０
秒間）、アニーリング（５５℃、１分間、タッチダウン−０．２５℃／サイクル
）および延伸（７２℃、１分間）の２０サイクル、次いでさらに変性（９４℃、
３０秒間、アニーリング（５０℃、１分間）および延伸（７２℃、１分間）の２
０サイクルを行った。最後に反応管を５分間、７２℃で加熱した。ＰＣＲ反応産
物を２％アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染色し
た。期待した大きさの断片（±３００ｂｐ）をＱｉａｅｘ−ＩＩ^TM精製キット(Q
iagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Promega)
により推奨された手順に従ってｐＧＥＭ−Ｔプラスミド内に連結した。このよう
にして作製した組換えプラスミドを適応性(competent) 大腸菌ＳＵＲＥ^TM２細菌
(Stratagene)を形質転換するために使用した。

【０１０４】 形質転換した細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（０．５
ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガープレート上にプレ
ーティングした。コロニーをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜(Amersham)上にリフトしそし
てＤＮＡを変性しそしてBuluwela et al. のマイクロ波オーブン法(Nucleic aci
ds Research 17, p452; 1989) に従って固定した。コロニーリフトを変性Ｃｈｕ
ｒｃｈ緩衝液（０．５Ｍリン酸塩、７％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５
℃で２時間でプレハイブリダイズし、次いで³²Ｐ標識ヒトニューロテンシン受容
体１および２ｃＤＮＡプローブ（ＮＴＲ１／２）の等モル量の２ｘ１０⁶ ｃｐｍ
／ｍｌを含む同じ緩衝液中、６５℃で一晩ハイブリダイズした。ヒトＮＴＲ１お
よびＮＴＲ２の全コーディング配列を含むｃＤＮＡプローブを、〔α−³²Ｐ〕ｄ
ＣＴＰのランダム開始組換えを介して、比放射能＞１０⁹ ｃｐｍ／μｇまで、Ｐ
ｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキット^TM(Stratagene)を用い、供給者が提供した指針に従
って放射標識した。ハイブリダイズしたフィルターを高ストリンジェンシー（２
ｘ３０分間、室温、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、次いで４０分間、６５℃で
の０．１ｘＳＳｃ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄２回）で洗浄しそして一晩オート
ラジオグラフィーを行った。高ストリンジェンシー洗浄の後にハイブリダイゼー
ションシグナルを示さない多数のランダム白色コロニーをＤＮＡ配列分析のため
に選択した。

【０１０５】 ＤＮＡ配列決定反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^TM ＢｉｇＤｙｅターミネーター
サイクル配列決定反応キット(PE-ABI)を用いて行った。サイクル配列決定反応産
物をＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈降を介して精製しそしてＡＢＩ３７３自動化配列決
定装置に負荷した。２個のほとんど同一であるクローン（ＨＮＴ６４２およびＨ
ＮＴ７６８）を同定し、これはＧＰＣＲファミリーの新規のメンバーの一部分を
コードすると考えられた。我々はこの新規のＧＰＣＲをＩＧＳ１と名付けた。

【０１０６】

【表３】

【０１０７】 実施例１ｂ．完全なＩＧＳ１コーディング配列を含むｃＤＮＡ断片のクローニン
グ ＩＧＳ１ ｃＤＮＡの完全なコーディング配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅を
介して得られた（ＲＡＣＥ分析）。５’−および３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを、Ma
rathon-Ready^TMヒト脳ｃＤＮＡ(Clontech, no.7400-1) 上で、Marathon^TMｃＤＮ
Ａ増幅キット(Clontech, K1802-1) と一緒に提供されたアダプタープライマー（
ＡＰ１、配列番号６）およびＩＧＳ１特異性プライマーＩＰ１１２６１（３’Ｒ
ＡＣＥ、配列番号９）およびＩＰ１１２６２ならびにＩＰ１１２６３（５’ＲＡ
ＣＥ、それぞれ配列番号１０および１１）を用い、クローンＨＮＴ６４２および
ＨＮＴ７６８のＤＮＡ配列に基づいて行った（図１）。次いで、ネスト(nest)し
たＲＡＣＥ ＰＣＲをアダプタープライマー２（ＡＰ２；配列番号７）およびＩ
ＧＳ１特異性ネストしたプライマーＩＰ１１２６０（３’ＲＡＣＥ、配列番号８
）およびＩＰ１１５１５およびＩＰ１１５１６（５’ＲＡＣＥ、それぞれ配列番
号１３および１４）を用いて行った。一次およびネストしたＰＣＲ ＲＡＣＥ反
応を、Clontechから提供されたMarathon-Ready^TMｃＤＮＡユーザーマニュアルの
指示に従って行った。ネストしたＰＣＲ ＲＡＣＥ産物を１％アガロースゲル上
で分離しそしてＥｔＢｒを用いて染色した。ゲルをＨｙｂｏｎｄ Ｎ⁺ 膜上にブ
ロットしそしてＣｈｕｒｃｈハイブリダイゼーション緩衝液中、６５℃でクロー
ンＨＮＴ６４２の³²Ｐ標識挿入物を用いて一晩ハイブリダイズした。

【０１０８】 ＡＰ２／ＩＰ１１５１５およびＡＰ２／ＩＰ１１５１６ ５’ＲＡＣＥネスト
ＰＣＲ反応物の両方のサザンブロット分析は、数個の陽性バンドを示した（±２
００ｂｐ、±２５０ｂｐ、±３３０ｂｐ、±３６０ｂｐ、±４００ｂｐおよび±
７００ｂｐ）。これらのバンドそれぞれをゲルから精製し、そしてｐＧＥＭ−Ｔ
プラスミドベクター内にクローンした（ＩＰ１１５１５およびＩＰ１１５１６ネ
スト５’ＲＡＣＥ反応物からのそれぞれのＰＣＲ断片をクローニングの前にプー
ルした）。それぞれの断片からの３〜４個のランダムコロニーを配列決定した（
＝クローンＨＮＴ１３９３−１４１２）（図１）。

【０１０９】 ネストしたＡＰ−２／ＩＰ１１２６０ ３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応物は、数
本のバンドを示した。ＩＧＳ１プローブとハイブリダイズした最大の３’ネスト
ＲＡＣＥ ＰＣＲ断片（±１，５５０ｂｐ）をゲルから精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ(P
romega) 内に連結しそして適応性大腸菌ＳＵＲＥ ＩＩ細胞を形質転換するため
に使用した。この連結反応からのＩＧＳ１特異性形質転換体を、クローンＨＮＴ
６４２の³²Ｐ−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの後に同定
した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズしそして
高ストリンジェンシー（０．１ｘＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ、６５℃で３０分間）
で洗浄した。３’ＲＡＣＥネストＰＣＲライブラリーのハイブリダイゼーション
スクリーニングは、３個の陽性クローンを生成した。これらの２個（ＨＮＴ１４
１３−１４１４）を配列決定した。

【０１１０】 追加の２回の実験で、３個の別の３’ＲＡＣＥ ｃＤＮＡクローン（ＨＢ４６
８６、ＨＢ４６８７およびＨＢ４６８８）がMarathon-Ready^TMヒト脳ｃＤＮＡ(C
lontech)から、供給者から提供されたマニュアル(Clontech PT1156-1) に記載さ
れた手順に従って得られた。一つの実験において、一次３’ＲＡＣＥ反応（ＩＧ
Ｓ１特異性プライマーＩＰ１１２６１およびアダプタープライマーＡＰ１を用い
て得られた）からの産物をヘミ(hemi)−ネストしたプライマー対ＩＰ１１２６０
／ＩＰ１１２６１（それぞれ配列番号８および１６）を用いて再増幅した。これ
は、予想された±１４００ｂｐ断片を生成しこれをゲルから精製しそしてｐＧＥ
Ｍ−Ｔプラスミドベクター内にクローンすると、クローンＨＢ４６８６およびＨ
Ｂ４６８７が生成した。別の実験において、一次３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物（Ｉ
ＧＳ１特異性プライマーＩＰ１１２６４（配列番号１５）およびアダプタープラ
イマーＡＰ１を用いて得られた）をネストしたプライマー対ＩＰ１１２６０／Ｉ
Ｐ１１２６１を用いて再増幅した。この反応から得られた±１４００ｂｐ断片を
精製しそしてｐＧＥＭ−Ｔプラスミドベクター内にクローニングすると、クロー
ンＨＢ４６８８が得られた。

【０１１１】 単離されたすべてのＩＧＳ１ ｃＤＮＡクローンを完全に配列決定しそして単
一コンティグ内に構築できた（図１）。少なくとも４回の独立したｃＤＮＡクロ
ーンから決定されたこの連続ｃＤＮＡの一部分をＩＧＳ１ＤＮＡとして本明細書
に記載する（配列番号１）。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、５０８アミノ酸のタンパク質が予想されこれはＧＰＣＲタンパク
質に良い相同性を示した（ＩＧＳ１ＰＲＯＴ；配列番号２）。発現された配列タ
グデータベース（ｄｂａｓｅ）に対するＩＧＳ１コンティグのＤＮＡ配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、ＥＳＴ２０８８９（アクセション番号ＡＡ３１
８７１７）およびＥＳＴアクセション番号ＡＩ６７２１４１の存在を示し、これ
らは両方共にＩＧＳ１コンティグの３’末端と重複するがしかしＩＧＳ１オープ
ン読み取り枠の外側である（図１）。 実施例１ｃ．完全ＩＧＳ１コーディング配列を含む連続ｃＤＮＡ断片の単離 連続ＩＧＳ１ ｃＤＮＡクローンをクローンＨＮＴ１３９８およびＨＮＴ１４
１３鋳型上で重複−ＰＣＲを介して作製した。ＨＮＴ１３９８プラスミドＤＮＡ
の１００ｎｇおよびＨＮＴ１４１３プラスミドの１００ｎｇを、それぞれプライ
マー対ＩＰ１２２６４／ＩＰ１１２６４（それぞれ配列番号１８および１２）お
よびＩＰ１１２６０／ＩＰ１２２６２（それぞれ配列番号８および１１）を用い
て別々の反応（５０μｌ）でＰＣＲ増幅した（変性〔９４℃、３０秒間〕、アニ
ーリング〔６０℃、３０秒間〕および延伸〔７２℃、１分間〕の３０ＰＣＲサイ
クル、Expand^TM High Fidelity ＰＣＲシステム[Boehringer]使用）。それぞれ
のＰＣＲ反応物の１μｌの量を一緒にしそしてプライマー対ＩＰ１２２６４／Ｉ
Ｐ１２２６１を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−ＰＣＲ反応物は、±
１７３０ｂｐのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてｐＧＥＭ−Ｔプラ
スミドベクター中に連結した。適応性大腸菌ＤＨ５αＦ’菌を形質転換するため
に組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を含むＬＢアガプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを
多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を介して決
定した。±１７３０ｂｐ挿入物を含むクローン３個を配列決定した。クローンＨ
Ｂ４６９３の配列は、共通ＩＧＳ１ ｃＤＮＡ配列と完全に一致した（図１参照
）。プラスミドＨＢ４６９３を内包する細胞株を、アンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢアガープレート上に再プレーティングした後に再クローンし、そし
てInnogenetics strain list（ＩＣＣＧ＃４２９７）およびCentraalbureau voo
r Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国）（寄託番号ＣＢＳ１０２０４９
）の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドＤＮＡを再
度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだした。

【０１１２】 注：我々は、その後、プライマーＩＰ１２２６２配列がクローンＨＮＴ１４１
３の挿入配列中に含まれていないことおよびその結果、ＨＮＴ１４１３鋳型から
アンプリコンが産生できなかったことを見いだした。従って、我々は、重複断片
の成功した増幅は、ＨＮＴ１４１３プラスミドＤＮＡ（重複ＰＣＲ反応管内に持
ち込まれた）とＨＮＴ１３９８鋳型から生成したアンプリコンとの間の直接重複
を介して発生したと推定する。 実施例２．ＩＧＳ１のノーザンおよび「ＭＴＥアレイ」分析 実施例２ａ．ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｕＩＧＳ１発現ベクターの構築 ５μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen)をＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断
し（３時間、３７℃）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍＭｆ．ｃ．）の存在下でＴ４ポリ
メラーゼを用いて平滑化し、そしてゲル上で分析した。線状化したＤＮＡをゲル
から溶出し（Qiaex II抽出キット(Qiagen)使用）そして４０μｌ Ｈ₂ Ｏ中に溶
かした。このＤＮＡをＮｏｔＩを用いて消化し、そして再度ゲル上で分析した。
得られた５３６４ｂｐベクター断片をQiaex IIゲル抽出キットを用いてゲルから
溶出しそして４０μｌ Ｈ₂ Ｏ中に溶かした。５μｌをゲル上で分析して大きさ
、量よび純度を検査した。

【０１１３】 ヒトＩＧＳ１コーディング配列を、５μｇ ｐＧＥＭ−ＴｈｕｌＧＳ１プラス
ミド（ＩＣＣＧ＃４２９７）のＮａｅＩ／ＮｏｔＩ消化（３時間、３７℃）の後
に入手した。消化は、アガロースゲル電気泳動により４００ｂｐ、１６２９ｂｐ
および２７０２ｂｐの断片３個をもたらした。１６２９ｂｐ断片をゲル（QiaexI
I)から溶出しそして４０μｌ Ｈ₂ Ｏ中に再び溶かした。５μｌをゲル上で分析
した。

【０１１４】 ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの１μｌ、挿入物３
μｌおよび１６μｌ Ｈ₂ ＯをReady-To-Go リガーゼ管（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech）に加えそして１時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の２μｌを化学的適応性ＤＨ５αＦ’菌を形質転換するため
に使用した。形質転換した細菌２００μｌをＬＢプレート上にプレーティングし
（１００μｇアンピシリン／ｍｌ）そして一晩３７℃で培養した。１６個のラン
ダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で培養した。
プラスミドＤＮＡをBioRobot^TM9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて作製しそ
してＮｏｔＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ制限酵素を用いる制限分析を介して分析
した。正しい制限パターンを有する１個のコロニーからのＤＮＡを部分的に配列
決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだした。部分
的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist （ＩＣＣＧ＃４３５０）
に寄託しそして大量のＤＮＡ(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託した株から
調製した。この大規模ＤＮＡプレプ（３μｇ／μｌの５００μｌ）の配列分析が
期待の配列を確認した。 実施例２ｂ．ＭＴＥ（多組織発現）アレイ分析 ２５ｎｇヒトＩＧＳ１ ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＩＧＳ１（ＩＣＣＧ＃
４３５０）からの１０９３ｂｐ ＡａｔＩＩ挿入物）を（α−³²Ｐ）−ｄＣＴＰ
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。１６ｘ１０⁶ ｃｐｍの標識したｈｕＩＧＳ１ ｃＤＮＡプロー
ブを、Ｃ₀ ｔ−１ ＤＮＡの３０μｇ、せん断ニシン***ＤＮＡの１５０μｇお
よび５０μｌ ２０ｘＳＳＣを用いて、全量２００μｌになるように混合し、５
分間、９５で加熱し次いで３０分間、６８℃でインキュベーションした。この混
合物を５ｍｌのExpress Hyb 溶液に加えそしてヒト多組織発現（ＭＴＥ）アレイ
(Clotech #7775-1) 上に均等に分布させた。アレイを一晩、６８℃でハイブリダ
イズした。ブロットを２０分間、６５℃、２ＸＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で４回、そ
して２０分間、５５℃、０．１ＸＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で２回リンスした。
ブロットをＸ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。

【０１１５】 ＩＧＳ１プローブのＭＴＥアレイ上のハイブリダイゼーションは、尾状核およ
び被殻上にのみ強いシグナルを示した（図２）。 実施例２ｃ．ノーザンブロット分析 ２５ｎｇヒトＩＧＳ１ ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＩＧＳ１（ＩＣＣＧ＃
４３５０）からの１０９３ｂｐ ＡａｔＩＩ挿入物）を（α−³²Ｐ）−ｄＣＴＰ
を用いて標識した。標識したプローブをMicro Bio-Spin P-30 カラム(BioRad)を
用いて精製した。８ｘ１０⁶ ｃｐｍの標識したｈｕＩＧＳ１ ｃＤＮＡプローブ
を、５分間、９５℃で変性しそして５ｍｌのExpress Hyb 溶液を加えそしてヒト
脳ＭＴＮブロットＩＩまたはＩＶ (それぞれClotech #7775-1 および#7769-1)上
に均等に分布させた。ブロットを一晩、６８℃でハイブリダイズした。ブロット
を１０分間、室温、２ＸＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ中で４回、そして４０分間、
５０℃、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回リンスしした。ブロットをＸ
線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。

【０１１６】 種々のヒト脳領域からのＲＮＡのノーザンブロット上のＩＧＳ１プローブのハ
イブリダイゼーションは、尾状核および被殻の両方で薬剤的に許容できる約４．
４００および９．０００ヌクレオチド（ｎｔ）の２個の強いバンドを示した（図
３）。この低い方のバンドは、尾状核の方が僅かに強く、被殻ではその逆であっ
た。４．４００および９．０００ｎｔバンドは視床でも見られたが両方共に非常
に弱かった。さらに非常にかすかな９．０００ｎｔ転写物が黒質中に検出された
が４．４００バンドにはなかった。最後に、極端に弱い９．０００ｎｔバンドが
小脳、骨髄および扁桃に観察された。４．４００ｎｔバンドは視床および黒質中
には観察できなかった。これらの結果は、ＭＴＥ分析の結果と、ＩＧＳ１の最強
の発現が尾状核および被殻で観察されたという意味で同一である。しかし、２個
の転写物の存在は予想されなかった。４．４００ｎｔバンドはＩＧＳ１ｍＲＮＡ
に相当すると最も考えられるが、９．０００ｎｔバンドの起源は明らかでない。
ＩＧＳ１遺伝子はイントロンを含まないので（少なくともコーディング領域内で
は含まない）、９．０００ｎｔ転写物は多分非スプライスまたは交互にスプライ
スされた転写物によるのではない。これは交互のポリ−アデニル化部位を有する
ＩＧＳ１転写物であるかまたはこれは交差ハイブリダイゼーション種そのもので
あろう。我々は、弱い９．０００ｎｔ転写物のみが検出されそして４．４００ｎ
ｔ転写物は検出されない場合には、これは９．０００ｎｔ転写物が４．４００ｎ
ｔ転写物よりも僅かに強く、従ってこの低い方のバンドがノーザンアッセイの検
出限界の丁度下にあることによると想定する。

【０１１７】 これらの結果は、ラット脳内のＩＧＳ１のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョン分析により確認され、この場合にはＩＧＳ１発現は上記と解剖学的に同じ領
域中で検出された。 実施例３．ＩＧＳ１に対する推定リガンドのスクリーニング 実施例３ａ．ＩＧＳ−１トランスフェクションＣＨＯＧ １６−細胞の構築 ＩＧＳ１に対するリガンドを同定するために、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞をＩＧＳ１を用いて安定してトランスフェクションした。ＩＧＳ１
のＧタンパク質共役機構は未知なので、ＧＰＣＲに対する「汎用アダプター」と
して知られる(Milligan G. et al., (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235-7)
Ｇ−タンパク質Ｇ１６（ＣＨＯＧ１６、Molecular Devices ）を発現する特異性
ＣＨＯ−細胞を使用した。

【０１１８】 使用した材料は下記を含む：ＩＧＳ１−ｐＲＥＰ９ベクター；SuperFect トラ
ンスフェクション試薬(Qiagen)；増殖−培地(Growth medium) ：１０％ＦＣＳ，
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ ４００μｇ／ｍｌを補足したＣ
ＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ(Gibco BRL) 、選択−培地；１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ
−グルタミン、ハイグロマイシンＢ ４００μｇ／ｍｌおよびジェネティシン５
００μｇ／ｍｌを補足したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ(Gibco BRL) ；RNeasy Min
i キット(Qiagen)、DNase I （Ambion、２Ｕ／μｌ）、SuperScript II(Gibco B
RL) 、SuperScript II 200U(Gibco BRL)、AmpliTaq(Perkin Elmer)。

【０１１９】 ＩＧＳ１コーディング配列をｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＩＧＳ１（ＩＣＣＧ＃４３
５０）からｐＲＥＰ９(Invitrogen)中にＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ部位を介してクロー
ンした。ＣＨＯＧα１６細胞をSuperFect (Qiagen)を用い、供給者の記載の通り
にしてトランスフェクションした。トランスフェクションはＴ２５フラスコ内で
行った。増殖−培地内で２４時間経過した後、培地を除去しそして選択−培地に
置換した。選択−培地内で集密に達するまで培養した後、ポリクローナル体をＴ
７５フラスコ内を２回通過させた。モノクローナル体を得るために、細胞をLimi
ted Dilution内に接種した。

【０１２０】 モノクローナル体の選択は、ＲＴ−ＰＣＲにより行った。モノクローナル体１
４個を試験した。提供されたプロトコールに従ってRNeasy Mini キット(Qiagen)
を用いてＲＮＡをモノクローナル体から単離した（２４ウエルプレートから１個
の集密ウエル）。試料当たりにDNase I （Ambion、２Ｕ／μｌ）１Ｕを用いてＲ
ＮＡを処理した。ＲＮＡ試料の半分をSuperScript II(Gibco BRL) を用いるＲＴ
−ＰＣＲに使用した。プライマーアニーリングは、ＲＮＡおよびオリゴ−ｄＴ１
６（０．６μＭ）を用い、１０分間、６５℃〜１５℃で行った。それぞれｄＮＨ
Ｐの０．４３ｍＭを有するFirst Strand Buffer(Gibco BRL)、ＤＴＴ １０ｍＭ
、２０Ｕ RNasin(Promega, ４０Ｕ／μｌ）およびSuperScript II 200U(Gibco
BRL,２００Ｕ／μｌ）を最終体積３０μｌまで加え、次いで４２℃で１時間イン
キュベーションした。

【０１２１】 ＰＣＲをAmpliTaq(Perkin Elmer)を用い、ＩＧＳ１特異性内部プライマーを用
いて２５μｌ中で行った。最初に、３５サイクルのＰＣＲを行った。陽性モノク
ローナルを確認するためおよび最善のものを選択するために、サイクル数が少な
くそしてより高いアニーリング温度を用いる別のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応あ
たりに、２μｌのFirst Strand cDNA(30μｌから) を使用した。

【０１２２】 ６個の最善のモノクローナル体を集密となるまでＴ７５フラスコ内で培養しそ
して１０％ＤＭＳＯを含む増殖培地内で冷凍した。 実施例３ｂ．細胞内カルシウム測定 ＣＨＯＧ １６−ＩＧＳ１細胞をFluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)
上で機能的にスクリーニングして、推定リガンドに反応する細胞内カルシウムの
移動度を測定した。

【０１２３】 細胞調製のために、下記の材料を使用した。透明で平底の黒色ウエル９６ウエ
ルプレート(Costar)；増殖培地：１０％牛胎児血清(Gibco) を補足したGlutamax
(Gibco) を有するNut-Mix F-12(HAM) ；インキュベーター：５％ＣＯ２、３７℃
(Nuaire)。

【０１２４】 実験の２４時間または４８時間前に黒色壁マイクロプレート内に細胞を接種し
た。細胞密度は、４８時間培養に対しては０．８ｘ１０^-4細胞／ウエル、そして
２４時間培養に対しては２．２ｘ１０^-4細胞／ウエルであった。すべての段階を
滅菌条件下で行った。

【０１２５】 染料負荷のために、下記の材料を使用した：２ｍＭ染料ストック：４４３μｌ
の低水分ＤＭＳＯ(Sigma) 中で可溶性化した１ｍｇ Fluo-4(Molecular Probes)
（アリコートは−２０で貯蔵）；２０％プルロン酸(Pluronic acid) 溶液：２ｍ
ｌの低水分ＤＭＳＯ(Sigma) 中、３７℃で可溶性化した４００ｍｇプルロン酸(S
igma) （室温で貯蔵）；染料／プルロン酸混合物：使用直前に等量の染料ストッ
クおよび２０％プルロン酸と混合した（染料およびプルロン酸は、最終濃度それ
ぞれ１ｍＭおよび１０％であった）；プロベンシッド、２５０ｍＭストック溶液
：５ｍｌ １Ｎ ＮａＯＨ溶液中で可溶化しそして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足
したフェノールレッド(Gibco) を欠いた５ｍｌハンク(Hank's)ＢＳＳと混合した
７１０ｍｇプロベンシッド(Gibco) ；負荷−緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補
足したフェノールレッド(Gibco) を欠いた１０．５ｍｌ ハンクＢＳＳ、１０５
μｌプロベンシッド、２１０μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ；洗浄−緩衝液：２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳおよび２．５ｍＭプロベンシッドを補足したフェノールレッド(Gib
co) を欠いたハンクＢＳＳ。

【０１２６】 ２ｍＭ染料ストックを負荷−緩衝液に加える直前に等量の２０％（ｗ／ｖ）プ
ルロン酸と混合した。集密化細胞層を攪乱しないようにして増殖−培地をウエル
から吸引除去した。１００μｌの負荷−緩衝液をMultidrop(Labsystems) を用い
てそれぞれのウエル中に分配した。細胞を５％ＣＯ₂ 、３７℃のインキュベータ
ー中で３０分間インキュベーションした。背景蛍光を算出するために、一部のウ
エルには染料を負荷しなかった。染料負荷の後、洗浄−緩衝液を用いて細胞を３
回洗浄して（自動化したDanley細胞洗浄装置）、基底蛍光を背景上２０．０００
〜２５．０００カウントに低下させた。１００μｌの洗浄−緩衝液を加えそして
細胞を３７℃で実験の開始までインキュベーションした。

【０１２７】 スクリーニングする化合物を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡ(Sig
ma) を補足したフェノールレッド(Gibco) を欠いたハンクＢＳＳ中で希釈した。
ＦＬＩＰＲを用いる細胞内カルシウム検出は、製造者(Molecular Devices) によ
る記載のようにして行った。ＦＬＩＰＲセットアップパラメーターは、暴露長さ
０．４秒、フィルター１、５０μｌ液体添加、ピペッター(pipetter)高さ１２５
μｌ、分配速度４０μｌ／秒、攪拌なしに設定した。

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 共通ＩＧＳ１コンティグを生成するように単離された種々のクローンの相対位
置の図示。クローニングのために使用したＰＣＲプライマーは、（ＩＰ＃）で指
示する。クローンＨＢ４６９３は、ＨＮＴ１３９８とＨＮＴ１４１３との重複Ｐ
ＣＲを介して得た。ＩＧＳ１コーディング配列（ＩＧＳ１ＰＲＯＴ）の位置は、
星印「＊」で指示した。ＥＳＴ２０８８９およびＥＡＴアクセッション番号Ａ１
６７２１４１の位置は「＝＝」で、ＩＧＳ１ＤＮＡの位置は「＋＋」で指示した
。ＩＧＳ１ＤＮＡはＩＧＳ１コンティグの一部分であり、その配列はそれぞれの
ヌクレオチド位置における少なくとも４個の独立したｃＤＮＡクローンに対して
決定した。

【図２】 ヒトＩＧＳ１プローブを用いた多重組織発現アレイ分析。この膜上には痕跡的
な多数のシグナルが存在する。矢印で指示したシグナルだけが、寄託したＲＮＡ
の位置と一致しそして特異的である。

【図３】 種々の脳領域からのＲＮＡに対するヒトＩＧＳ１のノーザンブロット分析。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１１月１日（２００２．１１．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項６】 発現系が適合性宿主細胞内に存在する場合に、該発現系が配
列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配
列を含んでなるＩＧＳ１ポリペプチドを産生することができる、該発現系を含ん
でなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。

【請求項７】 請求項６の発現系を含んでなる宿主細胞。

【請求項８】 酵母細胞である、請求項７記載の宿主細胞。

【請求項９】 動物細胞である、請求項７記載の宿主細胞。

【請求項１０】 請求項７から９までに記載の細胞に由来するＩＧＳ１受容
体膜調製物。

【請求項１１】 ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項７の宿
主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなるＩＧＳ１
ポリペプチドを産生するための方法。

【請求項１２】 適当な培養条件下で、細胞がＩＧＳ１ポリペプチドを産生
することができるように、請求項６の発現系を用いて細胞を形質転換またはトラ
ンスフェクションすることを含んでなる、細胞のＩＧＳ１ポリペプチドを産生す
る細胞を産生するための方法。

【請求項１３】 配列番号２記載のアミノ酸配列に対してその全長にわたっ
て少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、ＩＧＳ１ポリペプ
チド。

【請求項１４】 配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１３記載
のポリペプチド。

【請求項１５】 請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対して免疫特異
性の抗体。

【請求項１６】 請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチド受容体の活性また
は発現を増強することを要する患者の治療のための方法において、 （ａ）該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／
または、 （ｂ）配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し
てその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ま
たはインビボで該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対し
て相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者
に提供する ことを含んでなる方法。

【請求項１７】 請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチド受容体の活性また
は発現を阻害することを要する患者の治療のための方法において （ａ）該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、およ
び／または （ｂ）該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチ
ドを患者に投与し、および／または （ｃ）リガンドに対して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患
者に投与する ことを含んでなる方法。

【請求項１８】 患者内の請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチドの発現ま
たは活性に関して患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法に
おいて （ａ）該患者のゲノム内の該ＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列内の突然変異の存在または不存在を決定し、および／または （ｂ）該患者に由来する試料内のＩＧＳ１ポリペプチド発現の存在または量を分
析する ことを含んでなる方法。

【請求項１９】 請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対するアゴニス
トを同定するための方法において、 （ａ）ＩＧＳ１ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして （ｂ）試験化合物がＩＧＳ１ポリペプチドの活性化により発生するシグナルに影
響するかどうかを決定する ことを含んでなる方法。

【請求項２０】 請求項１９記載の方法により同定されるアゴニスト。

【請求項２１】 請求項１３記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対するアンタゴ
ニストを同定するための方法において、 （ａ）ＩＧＳ１ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして （ｂ）該アゴニストにより発生されたシグナルが候補化合物の存在下で減衰する
かどうかを決定する ことを含んでなる方法。

【請求項２２】 請求項２１記載の方法により同定されるアンタゴニスト。

【請求項２３】 ＩＧＳ１ポリペプチドを発現する請求項１２記載の方法に
より産生された組換え宿主細胞またはその膜。

【請求項２４】 遺伝的に改変された非−ヒト動物を創成する方法において
、 ａ）アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タ
イプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または ｂ）アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質をコードする核酸配列または
その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
分を操作し、そして、アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質または生物
学的に活性な断片をコードする内在性遺伝子対立遺伝子を完全にまたは部分的に
不活性化するような方法で動物のゲノム内に該配列を再導入する 段階を含んでなる方法。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０２】

【実施例】 実施例１． 新規のＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡのクローニ
ング 実施例１ａ．新規のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするゲノム
断片の相同性ＰＣＲクローニング ＰＣＲに基づく相同性クローニング戦略を、新規のＧタンパク質共役型受容体
をコードする部分ゲノムＤＮＡ配列を単離するために使用した。下記の前進（Ｆ
１１）および後退（Ｒ１３）縮重ＰＣＲプライマーを、膜貫通ドメイン１（ＴＭ １）内および膜貫通ドメイン３と細胞内ループ２の境界（ＴＭ３／１２）のそれ
ぞれのニューロテンシン受容体遺伝子の保存領域内で設計した。 Ｆ１１（ＴＭ１）： ５’−ＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＣ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｇ（Ｃま
たはＴ）（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＧＧ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＡＡ−３’ （配列番号３） Ｒ１３（ＴＭ３／１２）： ５’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡ（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）（Ｃま
たはＴ）Ａ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｃ（ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＴＣ−３’ （配列番号４） さらに、３’ブロックされたオリゴプライマー（ＨＮＴＲ１Ｆ１ＳＴＯＰ）を
設計した。 ＨＮＴＲ１Ｆ１ＳＴＯＰ： ５’−ＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴ−３’−３’−
ｄＡ （配列番号５） ３’ブロックされたプライマーは、ＴＭ１コード化領域内のヒトニューロテン
シン受容体（ＮＴＲ１）ｃＤＮＡに対して特異性でありそして縮重前進プライマ
ーと部分的に重複（および競合）している。この３’末端は、３’−デオキシア
デノシン基によりブロックされており、ポリメラーゼ−触媒伸張を避ける（Euro
gentic、ベルギー国、カタログ番号OL-0401-0302）。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０３】 ＰＣＲ反応は、体積６０μｌで行いそして１００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ(Clont
ech)、６μｌ １０ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８
．３；５００ｍＭ ＫＣｌ，Perkin Elmer）、３．６μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ
２ 、０．３６μｌ ｄＮＴＰ類（それぞれのｄＮＴＰの２５ｍＭ）、１．５単
位ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭポリメラーゼ(Perkin Elmer )、縮重前進および後退プ
ライマーそれぞれの３０ピコモルおよび３’ブロックされたプライマーの１００
ピコモルを含んでいた。反応管を９４℃で２分間加熱し、次いで変性（９４℃、
３０秒間）、アニーリング（５５℃、１分間、タッチダウン−０．２５℃／サイ
クル）および伸張（７２℃、１分間）の２０サイクル、次いでさらに変性（９４
℃、３０秒間、アニーリング（５０℃、１分間）および伸張（７２℃、１分間）
の２０サイクルを行った。最後に反応管を５分間、７２℃で加熱した。ＰＣＲ反
応産物を２％アガロースゲル上でサイズ分級しそして臭化エチジウムを用いて染
色した。期待した大きさの断片（±３００ｂｐ）をＱｉａｅｘ−ＩＩＴＭ精製キ
ット(Qiagen Inc.) を用いてゲルから精製し、そして供給者(pGEM-T キット、Pr
omega)により推奨された手順に従ってｐＧＥＭ−Ｔプラスミド内に連結した。こ
のようにして作製した組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＳＵＲＥＴＭ２細
菌(Stratagene)を形質転換するために使用した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０９】 ネストしたＡＰ−２／ＩＰ１１２６０ ３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応物は、数
本のバンドを示した。ＩＧＳ１プローブとハイブリダイズした最大の３’ネスト
ＲＡＣＥ ＰＣＲ断片（±１，５５０ｂｐ）をゲルから精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ(P
romega) 内に連結しそしてコンピテント大腸菌ＳＵＲＥ ＩＩ細胞を形質転換す
るために使用した。この連結反応からのＩＧＳ１特異性形質転換体を、クローン
ＨＮＴ６４２の３２Ｐ−標識挿入物を用いるコロニーハイブリダイゼーションの
後に同定した。コロニーブロットを以前に指定されたプローブにハイブリダイズ
しそして高ストリンジェンシー（０．１ｘＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ、６５℃で３
０分間）で洗浄した。３’ＲＡＣＥネストＰＣＲライブラリーのハイブリダイゼ
ーションスクリーニングは、３個の陽性クローンを生成した。これらの２個（Ｈ
ＮＴ１４１３−１４１４）を配列決定した。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１１】 単離されたすべてのＩＧＳ１ ｃＤＮＡクローンを完全に配列決定しそして単
一コンティグ内に構築できた（図１）。少なくとも４回の独立したｃＤＮＡクロ
ーンから決定されたこの連続ｃＤＮＡの一部分をＩＧＳ１ＤＮＡとして本明細書
に記載する（配列番号１）。このコンティグの翻訳は、長いオープン読み取り枠
を明らかにし、５０８アミノ酸のタンパク質が予想されこれはＧＰＣＲタンパク
質に良い相同性を示した（ＩＧＳ１ＰＲＯＴ；配列番号２）。発現された配列タ
グデータベース（ｄｂａｓｅ）に対するＩＧＳ１コンティグのＤＮＡ配列のコン
ピューター支援相同性サーチ(Blastn; Altschul S.F. et al., (1997), Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402) は、ＥＳＴ２０８８９（アクセション番号ＡＡ３１
８７１７）およびＥＳＴアクセション番号ＡＩ６７２１４１の存在を示し、これ
らは両方共にＩＧＳ１コンティグの３’末端と重複するがしかしＩＧＳ１オープ
ン読み取り枠の外側である（図１）。 実施例１ｃ．完全ＩＧＳ１コーディング配列を含む連続ｃＤＮＡ断片の単離 連続ＩＧＳ１ ｃＤＮＡクローンをクローンＨＮＴ１３９８およびＨＮＴ１４
１３鋳型上で重複−ＰＣＲを介して作製した。ＨＮＴ１３９８プラスミドＤＮＡ
の１００ｎｇおよびＨＮＴ１４１３プラスミドの１００ｎｇを、それぞれプライ
マー対ＩＰ１２２６４／ＩＰ１１２６４（それぞれ配列番号１８および１２）お
よびＩＰ１１２６０／ＩＰ１２２６２（それぞれ配列番号８および１１）を用い
て別々の反応（５０μｌ）でＰＣＲ増幅した（変性〔９４℃、３０秒間〕、アニ
ーリング〔６０℃、３０秒間〕および伸張〔７２℃、１分間〕の３０ＰＣＲサイ
クル、ExpandＴＭ High Fidelity ＰＣＲシステム[Boehringer]使用）。それぞ
れのＰＣＲ反応物の１μｌの量を一緒にしそしてプライマー対ＩＰ１２２６４／
ＩＰ１２２６１を用い、同じ条件下で再増幅した。この重複−ＰＣＲ反応物は、
±１７３０ｂｐのバンドを生成し、これをゲルから精製しそしてｐＧＥＭ−Ｔプ
ラスミドベクター中に連結した。コンピテント大腸菌ＤＨ５αＦ’菌を形質転換
するために組換えプラスミドを使用した。形質転換した細胞をアンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガプレート上にプレーティングした。プラスミド
ＤＮＡを多数のランダムコロニーから作製しそして挿入物の大きさを制限消化を
介して決定した。±１７３０ｂｐ挿入物を含むクローン３個を配列決定した。ク
ローンＨＢ４６９３の配列は、共通ＩＧＳ１ ｃＤＮＡ配列と完全に一致した（
図１参照）。プラスミドＨＢ４６９３を内包する細胞株を、アンピシリン１００
μｇ／ｍｌを含むＬＢアガープレート上に再プレーティングした後に再クローン
し、そしてInnogenetics strain list（ＩＣＣＧ＃４２９７）およびCentraalbu
reau voor Schimmelculturen(CBS) (Baarn、オランダ国）（寄託番号ＣＢＳ１０
２０４９）の両方に寄託した。再クローンした単離物から作製したプラスミドＤ
ＮＡを再度配列決定しそして以前に決定した共通配列と同一であることを見いだ
した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１４】 ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの１μｌ、挿入物３
μｌおよび１６μｌ Ｈ₂ ＯをReady-To-Go リガーゼ管（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
、Amersham Pharmacia Biotech）に加えそして１時間、室温でインキュベーショ
ンした。連結混合物の２μｌを化学的コンピテントＤＨ５αＦ’菌を形質転換す
るために使用した。形質転換した細菌２００μｌをＬＢプレート上にプレーティ
ングし（１００μｇアンピシリン／ｍｌ）そして一晩３７℃で培養した。１６個
のランダムコロニーを採取しそしてアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で培養
した。プラスミドＤＮＡをBioRobotＴＭ9600核酸精製システム(Qiagen)を用いて
作製しそしてＮｏｔＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ制限酵素を用いる制限分析を介
して分析した。正しい制限パターンを有する１個のコロニーからのＤＮＡを部分
的に配列決定して挿入点を確認しそして期待の配列を有していることを見いだし
た。部分的に配列決定したコロニーをInnogenetics strainlist （ＩＣＣＧ＃４
３５０）に寄託しそして大量のＤＮＡ(MegaPrep 、Qiagen 500キット) を寄託し
た株から調製した。この大規模ＤＮＡプレプ（３μｇ／μｌの５００μｌ）の配
列分析により期待された配列が確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/08 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 1/04 1/12 ４Ｃ０８６ 1/08 1/14 ４Ｈ０４５ 1/12 3/04 1/14 3/06 3/04 3/10 3/06 7/02 3/10 9/04 7/02 9/06 9/04 9/10 9/06 １０１ 9/10 9/12 １０１ 11/06 9/12 13/10 11/06 13/12 13/10 19/02 13/12 19/10 19/02 25/00 19/10 25/06 25/00 25/08 25/06 25/14 25/08 25/16 25/14 25/18 25/16 25/20 25/18 25/22 25/20 25/24 25/22 25/28 25/24 25/30 25/28 31/04 25/30 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 33/02 31/18 35/00 33/02 37/00 35/00 37/08 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/08 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツアング，フアン オランダ・エヌエル−1381シーピー ウエ ースプ・シージエイバンホウテンラーン36 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA61 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA11 HA14 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QQ79 QR32 QR35 QR48 QR51 QR55 QR77 QS34 QX07 4B064 AG20 CA05 CA10 CA19 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 AA16 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA08 ZA12 ZA16 ZA18 ZA22 ZA29 ZA36 ZA40 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA59 ZA66 ZA68 ZA69 ZA70 ZA71 ZA73 ZA81 ZA96 ZA97 ZB07 ZB13 ZB26 ZB32 ZB33 ZB35 ZB38 ZC33 ZC35 ZC39 ZC55 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA07 ZA08 ZA12 ZA16 ZA18 ZA22 ZA29 ZA36 ZA40 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA59 ZA66 ZA68 ZA69 ZA70 ZA71 ZA72 ZA73 ZA75 ZA81 ZA84 ZA94 ZA96 ZA97 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB33 ZB35 ZB38 ZC33 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）配列番号２記載のＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌ
   クレオチド配列； ｂ）Centraalbureau voor Schimmelcultures（Baarn 、オランダ国）における寄
   託番号ＣＢＳ１０２０４９号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリ
   ペプチドをコードするヌクレオチド配列、特には配列番号１に相当するヌクレオ
   チド配列； ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なく
   とも８０％（好ましくは少なくとも９０％）の配列の同一性を有するヌクレオチ
   ド配列； ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレ
   オチド配列 からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオ
   チド。
2. 【請求項２】 該ポリヌクレオチドが配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチドを
   コードする配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記
   載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 該ポリヌクレオチドが配列番号１に対してその全長にわたっ
   て少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記載
   のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、請求項３記載のポリ
   ヌクレオチド。
5. 【請求項５】 ＤＮＡまたＲＮＡである、請求項１−４に記載のポリヌクレ
   オチド。
6. 【請求項６】 請求項１のポリヌクレオチドまたは少なくとも５個のヌクレ
   オチドそして好ましくは３０個と５０個との間のヌクレオチドのその断片を含ん
   でなるハイブリダイゼーションプローブ。
7. 【請求項７】 発現系が適合性宿主細胞内に存在する場合に、該発現系が配
   列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％のの同一性を有するアミノ酸
   配列を含んでなるＩＧＳ１ポリペプチドを産生することができる、該発現系を含
   んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７の発現系を含んでなる宿主細胞。
9. 【請求項９】 酵母細胞である、請求項８記載の宿主細胞。
10. 【請求項１０】 動物細胞である、請求項８記載の宿主細胞。
11. 【請求項１１】 請求項８から１０までに記載の細胞に由来するＩＧＳ１受
    容体膜調製物。
12. 【請求項１２】 ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項８の宿
    主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなるＩＧＳ１
    ポリペプチドを産生するための方法。
13. 【請求項１３】 適当な培養条件下で、細胞がＩＧＳ１ポリペプチドを産生
    することができるように、請求項７の発現系を用いて細胞を形質転換またはトラ
    ンスフェクションすることを含んでなる、細胞のＩＧＳ１ポリペプチドを産生す
    る細胞を産生するための方法。
14. 【請求項１４】 配列番号２記載のアミノ酸配列に対してその全長にわたっ
    て少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、ＩＧＳ１ポリペプ
    チド。
15. 【請求項１５】 配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４記載
    のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対して免疫特異
    性の抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチド受容体の活性また
    は発現を増強することを要する患者の治療のための方法において、 （ａ）該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／
    または、 （ｂ）配列番号２のＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し
    てその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ま
    たはインビボで該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対し
    て相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者
    に提供する ことを含んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチド受容体の活性また
    は発現を阻害することを要する患者の治療のための方法において （ａ）該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、およ
    び／または （ｂ）該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチ
    ドを患者に投与し、および／または （ｃ）リガンドに対して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患
    者に投与する ことを含んでなる方法。
19. 【請求項１９】 患者内の請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチドの発現ま
    たは活性に関して患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法に
    おいて （ａ）該患者のゲノム内の該ＩＧＳ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列内の突然変異の存在または不存在を決定し、および／または （ｂ）該患者に由来する試料内のＩＧＳ１ポリペプチド発現の存在または量を分
    析する ことを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対するアゴニス
    トを同定するための方法において、 （ａ）ＩＧＳ１ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして （ｂ）試験化合物がＩＧＳ１ポリペプチドの活性化により発生するシグナルに影
    響するかどうかを決定する ことを含んでなる方法。
21. 【請求項２１】 請求項２０記載の方法により同定されるアゴニスト。
22. 【請求項２２】 請求項１４記載のＩＧＳ１ポリペプチドに対するアンタゴ
    ニストを同定するための方法において、 （ａ）ＩＧＳ１ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして （ｂ）該アゴニストにより発生されたシグナルが候補化合物の存在下で減衰する
    かどうかを決定する ことを含んでなる方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載の方法により同定されるアンタゴニスト。
24. 【請求項２４】 ＩＧＳ１ポリペプチドを発現する請求項１３記載の方法に
    より産生された組換え宿主細胞またはその膜。
25. 【請求項２５】 遺伝的に改変された非−ヒト動物を創成する方法において
    、 ａ）アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質をコードする核酸配列または
    その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
    分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タ
    イプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または ｂ）アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質をコードする核酸配列または
    その生物学的に活性な断片から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部
    分を操作し、そして、アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質または生物
    学的に活性な断片をコードする内在性遺伝子対立遺伝子を完全にまたは部分的に
    不活性化するような方法で動物のゲノム内に該配列を再導入する 段階を含んでなる方法。