HU219674B - Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra - Google Patents

Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra Download PDF

Info

Publication number
HU219674B
HU219674B HU9500596A HU9500596A HU219674B HU 219674 B HU219674 B HU 219674B HU 9500596 A HU9500596 A HU 9500596A HU 9500596 A HU9500596 A HU 9500596A HU 219674 B HU219674 B HU 219674B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
glucagon
glucagon receptor
dna
cells
sequence
Prior art date
Application number
HU9500596A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT74352A (en
HU9500596D0 (en
Inventor
Donald C. Foster
Francis J. Grant
Laura J. Jelinek
Wayne R. Kindsvogle
Joseph L. Kuijper
Si Lok
Patrick J. O'hara
Paul O. Sheppard
Original Assignee
Novo Nordisk A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/086,631 external-priority patent/US5776725A/en
Application filed by Novo Nordisk A/S filed Critical Novo Nordisk A/S
Publication of HU9500596D0 publication Critical patent/HU9500596D0/hu
Publication of HUT74352A publication Critical patent/HUT74352A/hu
Publication of HU219674B publication Critical patent/HU219674B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/605—Glucagons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát glukagonreceptort kódoló DNS-molekulák, a DNS-molekulákat hordozó vektorok, a vektorokkal transzformált gazdasejtek,glukagonreceptor-peptidek, a DNS-molekulákhoz hibridizálódni képeshibridizációs próbák és glukagonreceptort blokkoló monoklonálisellenanyagok képezik, valamint eljárások glukagonreceptor ésglukagonreceptor-peptidek előállítására és glukagonantagonistákazonosítására. ŕ

Description

A találmány tárgyát sejtfelszíni receptorok, közelebbről glukagonreceptorok képezik.
A találmány tárgyát képezik még közelebbről glukagonreceptort kódoló DNS-molekulák, a DNS-molekulákat hordozó vektorok, a vektorokkal transzformált gazdasejtek, glukagonreceptor-peptidek, a DNS-molekulákhoz hibridizálódni képes hibridizációs próbák, glukagonreceptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, valamint eljárások glukagonreceptor és glukagonreceptorpeptidek előállítására és glukagonantagonisták azonosítására.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható új glukagonantagonista hatású vegyületek azonosítására, valamint ilyen hatású gyógyászati készítmények kifejlesztésére és előállítására.
A glukagon egy 29 aminosavból álló hormon, amelyet a hasnyálmirigy szigeteinek alfa-sejtjei termelnek. A glukagon mint az inzulin hatását ellensúlyozó hormon, sok állatban - és az emberben is - a normál vércukorszint fenntartásáért felelős. Részletesebben kifejtve, míg az inzulin köztudottan gyorsan lecsökkenti a vércukorszintet, addig a glukagon ellensúlyozza ezt a hatást, hozzájárulva a vércukorszint emelkedéséhez.
A test vércukorszintjének fenntartása szempontjából nagyon fontosak a glukagon és az inzulin kölcsönhatásai. Feltételezik, hogy a glukagon vagy az inzulin egyensúlyának hiánya számos betegségben játszik szerepet, például a diabetes mellitusban és a diabetes ketoacidosisban is. Egy elmélet szerint a diabetes mellitus során kialakuló hiperglikémiás állapot nemcsak a glükóz csökkent felhasználásának következménye (ez a csökkent inzulinszinttel magyarázható), hanem a glukagon megemelkedett szintjének is köszönhető [Unger: Diabetes 25;136 (1976); Unger és Őrei: Láncét 7.14 (1975)].
A glukagon, és a glukagonbetegségekben - mint például a diabetes mellitus - játszott szerepének vizsgálatában igen fontos faktor a glukagonreceptor. A glukagonreceptor glukagon megkötése esetén jelet továbbít a sejtnek, ezáltal glikogenolízist (glikogénhidrolízist) és glükoneogenézist (glükózszintézist) váltva ki.
Jelenleg feltételezik, hogy a glukagon hatása részben a ciklikus adenozin-monofoszfát (cAMP) sejten belüli szintjének emelkedése révén közvetítődik. Részletesebben kifejtve, a glukagon celluláris receptorhoz történő kötődése aktiválja az adenilát-ciklázt, ami ennek következtében cAMP-t termel, emelve ezáltal a sejten belüli cAMP-szintet. Feltételezik, hogy a cAMP sejten belüli szintjének ezen növekedése glikogenolízist és glükoneogenezist idéz elő, és ezeknek köszönhetően a májban megnövekedett glükóztermelést [Unson és munkatársai: Peptides 10:1171 (1989)].
További reakcióutakat is feltételeznek azonban, amelyek réven a glikogenolízis és a glükoneogenezis serkentődhet. Részletesebben kifejtve, megfigyelték, hogy a glukagon kötődik olyan, a májsejtek membránjában található receptorokhoz, amelyek egy G-fehérjén át foszfolipáz C-vel kapcsoltak. Stimuláció estén ez a fehérje a foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát lebomlását idézi elő, inozitol-trifoszfáttá és 1,2-diacil-glicerinné, melyek másodlagos hírvivő anyagok [Wakelam és munkatársai: Natúré 323:68 (1986), Unson és munkatársai: Peptides 70:1171 (1989), Pittner és Fain: Biochem. J. 277:371 (1991)]. A glikogenolízis és glükoneogenezis a glukagon által történő stimulálásának egy további útja lehet az inozitol-foszfolipid-anyagcsere glukagon által történő serkentése.
A találmány tárgyát a glukagonreceptor(ok), valamint a receptorok alkalmazásán alapuló eljárások képezik.
A találmány tárgyát egyrészt glukagonreceptort kódoló, izolált DNS-molekulák képezik. Az „izolált DNSmolekula” kifejezés - a leírásban használt értelemben - olyan DNS-molekulákra és -szekvenciákra vonatkozik, amelyek különállóak, különválasztottak vagy más komponensektől elkülönítettek. Például egy DNSmolekulát akkor nevezünk izoláltnak, ha azt más DNSmolekuláktól különválasztottuk, beleértve azokat a kromoszomális szekvenciákat, amelyekkel természetes körülmények közt a genomban asszociálva van, és főként ha mentes más srukturális génektől. Egy izolált DNSmolekula tartalmazhat olyan 5’- és 3’-végi le nem fordítódó régiókat, melyekkel természetes körülmények között asszociált. A találmány egy megvalósítási módja szerint a glukagonreceptor a patkány és az ember glukagonreceptorainak valamelyike. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képező DNS-molekula tartalmazza a 14. azonosító számú szekvencia 145-1599. nukleotidjainak szekvenciáját. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képező DNS-molekula olyan glukagonreceptort kódol, amely tartalmazza a 15. azonosító számú szekvencia 1. aminosavszámú metioninjától, a 485. aminosavszámú treoninjáig tartó aminosavszekvenciát. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képező DNS-molekula tartalmazza a 24. azonosító számú szekvencia 53-1486. nukleotidjainak megfelelő szekvenciát. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képező DNS-molekula egy olyan glukagonreceptort kódol, amely tartalmazza a 25. azonosító számú szekvencia 1. aminosavszámú metioninjától a 477. aminosavszámú fenil-alaninjáig tartó aminosavszekvencia-részletet. Szintén a találmány tárgyát képezik olyan DNS-konstrukciók, amelyek tartalmaznak egy első, glukagonreceptort kódoló DNS-szegmenst, amelyhez funkcionálisan hozzá vannak kötve további DNS-szegmensek, melyek szükségesek az első DNS-szegmens expressziójához. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti DNS-konstrukciókat hordozó gazdasejtek, valamint eljárások glukagonreceptor előállítására, mely eljárások tartalmaznak egy lépést, amelyben a gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, mely körülmények elősegítik a glukagonreceptort kódoló DNS-szegmens expresszióját.
A találmány tárgyát másrészt glukagonreceptor-peptidek képezik. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az izolált glukagonreceptor-peptid tartalmazza a 15. azonosító számú szekvenciának a 28. aminosavszámú glutaminjától a 142. aminosavszámú tirozinjáig tartó szekvenciát.
HU 219 674 Β
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan izolált ellenanyagok, amelyek specifikusan kötődnek a glukagonreceptorokhoz. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az ellenanyag monoklonális. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyag képes a glukagon glukagonreceptorhoz történő kötődését megakadályozni. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti monoklonális ellenanyagokat termelő hibridomasejtek.
A találmány tárgyát képezi másrészt egy eljárás glukagonantagonisták jelenlétének kimutatására, amely a következő lépéseket tartalmazza:
i) glukagonagonista jelenlétében érintkeztetünk egy vegyületet egy válasz-reakcióúttal kapcsolt rekombináns glukagonreceptorral, megfelelő körülmények közt és elegendő ideig ahhoz, hogy a vegyület a receptorhoz kötődhessen és a megfelelő válasz kialakulhasson a reakcióúton, és ii) detektáljuk a válasz-reakcióút stimuláltságának - a vegyület glukagonreceptorhoz való kötődése következtében bekövetkező - csökkenését, a válasz-reakcióút olyan mértékű stimuláltságához viszonyítva, amit a glukagonagonista önmagában alkalmazva okozna, és ezáltal kimutatjuk a glukagonantagonista jelenlétét.
A találmány különböző megvalósítási módjai szerint a válasz-reakcióút egy membránhoz kötött adenilátcikláz válasz-reakcióút, és a kimutatási lépés magában foglalja a membránkötött adenilát-cikláz válasz-reakcióúton termelődő cAMP keletkezési sebessége csökkenésének mérését. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a válasz-reakcióút luciferázalapú jelzőrendszert alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan legalább 12 nukleotid hosszúságú hibridizációs próbák, melyek képesek glukagonreceptort kódoló nukleinsavakkal hibridizálódni.
A találmány szerinti megoldás már ismertetett és további sajátságai világossá fognak válni az alábbi részletes leírás és a csatolt ábrák alapján. A továbbiakban ezenfelül idézni fogunk különböző szakirodalmi publikációkat, amelyek részletesen ismertetnek a találmány tárgykörébe tartozó bizonyos eljárásokat és összetevőket (például plazmidokat stb.), ezek a közlemények teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra egy jellegzetes glukagonreceptor szerkezetét mutatja. Az alkalmazott jelölések jelentése a következő: EATD (sejten kívüli aminoterminális dómén), pontozott vonallal körülkerítve; CM (sejtmembrán); ED (effektordomén), szaggatott vonallal körülkerítve; 1ID, az első sejten belüli hurokdomén; 2ID, a második sejten belüli hurokdomén; 3ID, a harmadik sejten belüli hurokdomén; C-ID, a karboxiterminális sejten belüli dómén; 1ELD az első sejten kívüli hurokdomén; 2ELD a második sejten kívüli hurokdomén; 3ELD a harmadik sejten kívüli hurokdomén; TMD1 az első transzmembrán dómén; TMD2 a második transzmembrán dómén; TMD3 a harmadik transzmembrán dómén; TMD4 a negyedik transzmembrán dómén; TMD5 az ötödik transzmembrán dómén; TMD6 a hatodik transzmembrán dómén; TMD7 a hetedik transzmembrán dómén.
A 2. ábrán egy patkány-glukagonreceptor hidrofób sajátságának grafikus ábrázolását láthatjuk.
A 3. ábrán a 125I-glukagon glukagonreceptorokhoz történő kötődésének grafikus ábrázolását láthatjuk.
A 4. ábrán a glukagonreceptor látszólagos Kd-értékének Scatchard-analízisét láthatjuk.
Az 5. ábrán egy patkány-glukagonreceptor aminosavszekvenciáját láthatjuk, ahol a transzmembrán domént felülhúzással jelöltük.
Ahogy fentebb említettük a találmány tárgyát képezik olyan izolált DNS-molekulák, amelyek glukagonreceptorokat kódolnak. Feltételezik, hogy a glukagonreceptorok természetes állapotukban membránhoz kötött fehérjék, és tartalmaznak egy sejten kívüli N-terminális domént, valamint több kisebb külső és belső domént (1. ábra). A leírásban használt értelemben a „glukagonreceptorok” kifejezés az ilyen fehérjékre és a hozzájuk lényegében hasonló származékokra vonatkozik. Az említett származékok lehetnek például allélikus variánsok és genetikailag manipulált variánsok, melyek konzervatív aminosavszubsztitúciókat tartalmaznak és/vagy kis jelentőségű aminosavaddíciókat, -cseréket vagy -deléciókat. A találmány tárgyát képező glukagonreceptorok képesek a glukagont megkötni, és a glukagon által kiváltott jelet valamely sejt felé továbbítani. A találmány szerinti glukagonreceptorok képesek a glukagont megkötni előnyösen Kd=100 nmol vagy kisebb, előnyösebben Kd=50 nmol vagy kisebb, és legelőnyösebben Kd=33 nmol vagy kisebb disszociációs állandóval. A glukagonreceptor kötődésének meghatározására alkalmas vizsgálati eljárások részletes leírása megtalálható a 3. és 6. példákban.
A jelátvitel tipikusan akkor történik, amikor egy külső jel, olyan válasz-reakcióutat indukál, mely általában - de nem mindig - közvetlenül össze kapcsolva egy membránkötött receptorral. A válasz-reakcióút általában a sejtben olyan válaszokat indukál, mint például sejten kívüli mátrix kiválasztása a reagáló sejtvonalakból, hormonelválasztás, kemotaxis, differentáció, vagy a reagáló sejtvonalak sejtosztódásának megindítása vagy gátlása. A leírásban használt értelemben akkor mondjuk, hogy egy receptor egy válasz-reakcióúthoz kapcsolt, ha a receptor a válasz-reakcióutat közvetlenül vagy másodlagos hírvivő - mint például a G-fehérje általi jeltovábbításon keresztül aktiválja.
A glukagonreceptor különböző válasz-reakcióutakat használhat a glukagonkötődési jel sejtbe történő továbbítására. Ilyen jelátviteli utak az adenilát-ciklázon és az intracelluláris kalciumszinten alapuló válasz-reakcióutak. Az adenilát-cikláz aktivitásának mérésére alkalmas módszerek a technika állása szerint jól ismertek, ezek közé tartozik a Lin és munkatársai által leírt módszer is [Biochemistry 74.1559 (1975)]. A találmány tárgykörébe tartozik a glukagonreceptor biológiai aktivitásának mérése, egyrészt a sejten belüli kalciumkoncentráció mérésén keresztül [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260:3440 (1985)], más3
HU 219 674 Β részt a későbbiekben részletesen leírt luciferázon alapuló jelzőrendszeren keresztül. Továbbá az inozitol-trifoszfát-reakcióúton keresztül megvalósuló válaszok jól becsülhetők az inozitol-foszfát-anyagcsere mérése révén, ahogy az Subers és Nathanson [J. Mól. Cell. Cardiol. 20.131 (1988)], valamint Pittner és Fain [Biochem. J. 277:371 (1991)] publikációiban található.
Meg kell jegyeznünk, hogy a találmány szerinti megoldás vonatkozásában nem szükséges az összes válasz-reakcióút jelenléte ahhoz, hogy a glukagonreceptor jelet továbbítson a sejtnek. Bizonyos sejtműködésbeli válaszreakciók, mint például a sejten belüli kalciumszint növekedése, kiváltható a glukagonreceptor kötődése révén a cAMP- vagy az inozitol-trifoszfát-jel hiányának esetén is.
Ahogy azt már említettük, a találmány tárgyát képezik glukagonreceptort kódoló DNS-molekulák. Glukagonreceptorokat kódoló genomiális és cDNS-molekulák az alább és a példákban leírt eljárások alkalmazásával, különböző sejtekből és szövetekből készült génkönyvtárakból izolálhatok. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható sejteket és szöveteket különböző emlősökből izolálhatunk, így például emberből, makákóból, marhából, sertésből, kutyából, patkányból és egérből. Előnyösen alkalmazható sejtek, szövetek többek között a zsír-, vese-, hasnyálmirigy-, szív- és májszövetek, valamint -sejtek.
A találmány szerinti patkány-glukagonreceptor például az alább leírtak szerint izolálható és klónozható. Röviden, Sprague-Dawley-patkányokból poli(A)+-RNS-t izoláltunk, és az izolátumot cDNS-szintézis templátjaként használtuk, lényegében Houamed és munkatársai [Science 252:1318 (1991)] eljárásának alkalmazásával, teljes hosszúságú cDNS-molekulák izolálása céljából. Ezután emlőssejtekben alkalmazható expressziós plazmidban körülbelül lxlO6 klónból álló génkönyvtárat hoztunk létre, a 800 bázispámál hosszabb cDNS-darabok irányított klónozásával. Ezután 5000-5000 kiónt tartalmazó részkönyvtárakból plazmid-DNS-t izoláltunk, majd az izolátumokat COS-7-sejtekbe transzfektáltuk, amelyeket mikroszkópos tárgylemezen szelektáltunk és növesztettünk. A transzfektált sejteket 72 óra elteltével 125I-glukagon-kötődést követő emulziós radiográfia [McMahan és munkatársai: EMBO J. 70.2821 (1991)] segítségével elemeztük. A pozitív részkönyvtárakat több lépésben addig szűkítettük, amíg egyetlen izolált pozitív kiónt kaptunk. Az ebből a klónból izolált plazmidot pLJ4-nek neveztük el. Ez a plazmid egy körülbelül 2,0 kilobázisnyi inzertet tartalmaz, amely egy 485 aminosavból álló fehéqét kódol, s amely fehérje számított molekulatömege 54 962 D (15. azonosító számú szekvencia).
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások humán glukagonreceptor izolálására és klónozására. Erre a célra a találmány szerinti megoldásban több különböző eljárás alkalmazható. Amplifikálhatunk például glukagonreceptort kódoló szekvenciákat a polimeráz-láncreakció („PCR”) alkalmazásával (4. példa), amely szekvenciákat azután felhasználhatunk humán glukagonreceptort kódoló szekvenciákat tartalmazó génkönyvtárak azonosítására, majd a megfelelő könyvtárból megklónozzuk a receptort (5. példa). A humán glukagonreceptorok klónozásának különösen előnyös stratégiáit a 4. és 5. példákban mutatjuk be. Más eljárás alkalmazásával, megfelelő RNS-forrásból lényegében az 1. példában leírtak szerint cDNS-eket tartalmazó expressziós könyvtárat készíthetünk, és a 3. példában leírtak alapján rostálhatok ki a működő humán glukagonreceptort expresszáló kiónok.
Rekombináns glukagonreceptorok előállítása
A találmány tárgyát képezi egy eljárás rekombináns glukagonreceptorok előállítására, olyan DNS-konstrukciót tartalmazó gazdasejtek tenyésztése útján, mely konstrukció tartalmaz egy glukagonreceptort kódoló első DNS-szegmenst, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva további DNS-szegmensekhez, melyek szükségesek az első DNS-szegmens expressziójához. Ahogy arra már utaltunk, a leírás szerinti értelemben a „glukagonreceptorok” kifejezés vonatkozik a glukagonreceptorokhoz lényegében hasonló származékokra is. Továbbá a találmány szerinti DNS-szekvenciákhoz lényegében hasonló DNS-szekvenciák is kódolhatnak glukagonreceptorokat. A leírásban használt értelemben akkor mondjuk, hogy egy DNS-szekvencia „lényegében hasonló” egy találmány szerinti glukagonreceptort kódoló DNS-szekvenciához, ha: a) a kérdéses DNSszekvencia egy natív glukagonreceptor-gén kódolórégiójából származik (beleértve például a találmány szerinti szekvenciák allélikus variációit is); b) a DNS-szekvencia képes egy találmány szerinti DNS-szekvenciával erősen vagy kevéssé sztringens körülmények között hibridizálódni [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: „A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)]; vagy c) a DNS-szekvencia az a) vagy b) pontban definiált DNSszekvenciák valamelyikének degeneráltja, a genetikai kód degeneráltságának figyelembevételével.
Azok a nukleotidszekvencia-mutációk, melyeket a különböző glukagonreceptorok expresszálása céljából hozunk létre, megőrzik a kódolószekvenciák eredeti leolvasási fázisát. Továbbá a kialakított mutációk előnyösen nem hoznak létre olyan komplementer régiókat, melyek következtében az mRNS-ben olyan másodlagos szerkezetek keletkeznének, mint például a hurkok vagy hajtűalakzatok, amely szerkezetek hátrányosan befolyásolnák a receptor mRNS-transzlációját. Bár a mutáció helyét előre meghatározhatjuk, nem szükséges, hogy maga a mutáció természete is meg legyen előre határozva. Annak érdekében, hogy kiválaszthassuk egy adott pozícióban a legoptimálisabb sajátságokkal rendelkező mutánst, végrehajthatunk például a célkodonon véletlenszerű mutagenezist, és az így kialakított glukagonreceptor-mutánsokat biológiai aktivitás szempontjából vizsgálhatjuk.
Bizonyos kiválasztott pozíciókban létrehozhatunk mutációkat oly módon, hogy olyan mutáns szekvenciát tartalmazó oligonukleotidokat szintetizálunk, mely szekvenciákat restrikciós hasítóhelyek szegélyeznek, és ily módon lehetővé válik a mutáns szekvenciát tartó ffagmensek natív szekvenciához történő ligálása. A ligálást
HU 219 674 Β követően olyan szekvenciához jutunk, amely a kívánt aminosavinszerciót, -szubsztitúciót vagy -deléciót tartalmazó receptorszármazékot kódolja.
Eljárhatunk úgy is, hogy a kívánt szubsztitúciónak, deléciónak vagy inszerciónak megfelelő megváltoztatott kodonszerkezetet tartalmazó megváltoztatott gént oligonukleotiddal kiváltott helyspecifikus mutagenezises eljárással hozzuk létre. A helyspecifikus mutációk bevitelére alkalmas eljárásokat találhatunk többek között a következő publikációkban: Walder és munkatársai: Gene 42, 133 (1986), Bauer és munkatársai: Gene 37, 73 (1985), Craik: Bio Techniques, January, 12. oldal (1985); Smith és munkatársai: Generic Engineering: Princoples and Methods, Plenum Press (1981); és Sambrook és munkatársai: mint fent.
A glukagonreceptor elsődleges aminosavszerkezetét úgy is módosíthatjuk, hogy kovalens vagy agregációs konjugátumokat állítunk elő egyéb kémiai anyagokkal, mint például glikozilcsoportokkal, lipidekkel, foszfáttal, acetilcsoportokkal vagy egyéb proteinekkel, vagy polipeptidekkel. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a glukagonreceptorokat fúzionáltathatjuk is olyan peptidekkel, melyek megkönnyítik a glukagonreceptorok tisztítását vagy azonosítását. Előállítható például egy glukagonreceptor a FLAG-polipeptidszekvenciával képzett fúziós proteinként is [4.851.341 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Hopp és munkatársai: Bio/Technology 6, 1204 (1988)]. A FLAG-polipeptidszekvencia rendkívül erősen antigén tulajdonságú, és a fúziós proteinben olyan epitópot képez, amely képes egy specifikus monoklonális ellenanyaghoz kötődni, ami az expresszált rekombináns protein tisztítását meggyorsítja. Ezt az aminosavszekvenciát a bovin mucosal eredetű enterokináz képes specifikusan elhasítani, közvetlenül az Asp-Lys aminosavpár után.
Kényelmi szempontból számos olyan DNS-konstrukció előállítható, amely a fent említett natív, vagy variáns glukagonreceptorokat kódoló nukleotidszekvenciák valamely részét vagy egészét tartalmazza. A leírás szerinti értelemben a „DNS-konstrukció” kifejezés alatt olyan DNS-molekulát, vagy -molekula-klónt értünk (a DNS-molekula lehet egy- vagy kétszálú), melyet emberi beavatkozással úgy módosítottak, hogy különböző DNS-szegmenseket oly módon kombinálva és egymás mellé helyezve tartalmaz, és az ilyen elrendezés a természetben egészében nem található meg. A találmány szerinti DNS-konstrukciók tartalmaznak egy glukagonreceptort kódoló DNS-szegmenst, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva további DNS-szegmensekhez, melyek szükségesek az első DNS-szegmens expressziójához. A találmány szerinti megoldás vonatkozásában a további DNS-szegmensek általában lehetnek promoterek és transzkripciós terminátorok, de lehetnek enhanszerek és egyéb elemek is.
Az expressziós vektorként is ismert DNS-konstrukciók tartalmazhatnak olyan DNS-szegmenseket is, melyek a kívánt polipeptid sejtből történő kiválasztásához szükségesek. Az ilyen DNS-szegmensek tartalmazhatnak legalább egy szekréciós szignálszekvenciát. Előnyös szekréciós szignálszekvenciák például a glukagon szekréciós szignálszekvenciája (pre-pro szekvencia), az alfafaktor szignálszekvenciája [pre-pro szekvencia; Kuijan és Herskowitz, Cell 30, 933 (1982); Kínján és munkatársai: 4.546.082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Brake: EP 116.201 számú európai szabadalmi leírás], a PHO5-szignálszekvencia (Beck és munkatársai: WO 86/00637 számú közzétételi irat), a BARl-szekréciós szignálszekvencia (MacKay és munkatársai: 4.613.572 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; MacKay, WO 87/002670 számú közzétételi irat), az SUC2-szignálszekvencia [Carlson és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3, 439 (1983)] kettő, az a1- antitripszin-szignálszekvencia [Kurachi és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6826 (1981)], az a2- plazmininhibitor szignálszekvenciája [Tone és munkatársai: J. Biochem (Tokyo) 102, 1033 (1987)], a szöveti plazminogén-aktivátor szignálszekvenciája [Pennica és munkatársai: Natúré 301, 214 (1983)], az E. coli Phoaszignálszekvencia [Yuan és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 13 528 (1990)], vagy bármely bakteriális szignálszekvencia, melyek összefoglaló leírását megtalálhatjuk például a következő publikációban: Olivér: Ann. Rév. Microbiol. 39, 615 (1985). Eljárhatunk úgy is, hogy bizonyos szabályok szerint szekréciós szignálszekvenciát szintetizálunk. Ilyen szabályokat állapított meg például von Heinje [Eur. J. Biochem. 133, 17 (1983); J. Mól. Bioi. 184, 99 (1985); Nuc. Acids 14, 4683 (1986)].
A szekréciós szignálszekvenciákat alkalmazhatjuk önmagukban vagy alkalmazhatjuk azok kombinációját is. Az első szekréciós szignálszekvenciát alkalmazhatjuk például kombinációban Barrier harmadik doménjének kódolószekvenciájával (amely szekvencialeírás megtalálható az 5.037.243 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amely teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi). A Barrier harmadik doménjét kódoló szekvenciát megfelelő leolvasási fázisban a kívánt DNS-szekvenciától 3’-irányban helyezhetjük el, vagy a DNS-szegmenstől 5’-irányban, és a szekvenciának azonos leolvasási fázisban kell lennie mind a szekréciós szignálszekvenciával, mind pedig a kívánt DNS-szegmenssel.
A glukagonreceptorokat kódoló DNS-molekulákat expresszió céljából alkalmas DNS-konstrukcióba juttatjuk, amelyet azután az expresszió céljából megfelelő gazdasejtekbe transzformálunk vagy transzfektálunk. A találmány szerinti megoldás kivitelezése céljából alkalmas gazdasejtek többek között az emlős-, a madár-, a növény-, a rovar-, a baktérium- és a gombasejtek. Előnyösen alkalmazható eukariótasejtek például a tenyésztett emlőssejtvonalak (például rágcsáló- vagy humánsejt-vonalak), valamint a gombasejtek, többek között az élesztőfajok (például a Saccharomyces törzsek, különösen az S. cerevisiae, a Schizosaccharomyces törzsek, vagy a Kluyveromyces törzsek) vagy a fonalas gombák (például Aspergillus törzsek, Neurospora törzsek). A Saccharomyces cerevisiae törzsek különösen előnyösek. Rekombináns proteinek előállítására alkalmas eljárások számos prokarióta és eukarióta gazdasejtben a technika állása szerint általánosan ismertek, lásd pél5
HU 219 674 Β dául: „Gene Expression Technology”, Methods in Enzymology, 185. kötet, szerkesztő: Goeddel, Academic Press, San Diego, CA. (1990); „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”, Methods in Enzymology, szerkesztő: Guthrie és Fink, Academic Press, San Diego, CA. (1991). Az alkalmas gazdasejtet általában azon az alapon választjuk ki, hogy képes-e a kívánt proteint nagy mennyiségben termelni, vagy hogy képes-e a protein biológiai aktivitásának megnyilvánulásához szükséges processziós lépések közül legalább némelyeket végrehajtani. Az elmondottak értelmében a gazdasejtbe transzfektálandó DNS-szekvenciák számát lehetőleg minimálisra kell csökkenteni, a biológiailag aktív protein kitermelését pedig maximalizálni kell.
A találmány szerinti megoldás kivitelezésére alkalmas élesztővektorok például: YRp7 [Struhl és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035 (1978)], YEpl3 (Broach és munkatársai: Gene 8, 121 (1979)], a POT-vektorok [Kawasaki és munkatársai: 4.931.373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi), pJDB249 és pJDB219 [Beggs: Natúré 275, 104 (1978)], valamint a felsorolt vektorok származékai. Az alkalmas vektorok általában tartalmaznak szelektálható markert, amely marker egy vagy több olyan gén lehet, mely gének valamely olyan domináns fenotípust kódolnak, melynek vonatkozásában létezik valamely vizsgálati eljárás, amely lehetővé teszi, hogy a markergéneket hordozó transzformánsokat szelektáljuk. Előnyös szelektálható markerek például a gazdasejtek auxotrófiáját komplementáló markergének, az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát kódoló gének, valamint azok a gének, melyek lehetővé teszik, hogy a sejtek speciális szénfonásokat is fel tudjanak használni. Ilyen markergének például: LEU2 (Broach és munkatársai: ugyanott), URA3 (Botstein és munkatársai: Gene 8, 17 (1979), HIS3 (Struhl és munkatársai : ugyanott), valamint POT1 (Kawasaki és munkatársai: ugyanott). Egy másik alkalmas szelektálható markergén a CAT-gén, amely az élesztősejteket klóramfenikol-rezisztenssé teszi.
Az élesztőkben alkalmazható előnyös promoterek többek között az élesztő glikolitikus génekből származó promoterek [Hitzeman és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 12 073 (1980); Alber és Kawasaki: J. Mól. Appl. Génét. 1, 419 (1982); Kawasaki: 4.599.311 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], valamint az alkohol-dehidrogenáz-gének promoterei [Young és munkatársai: „Genetic Engineering of Microorganizmus fór Chemicals”, szerkesztő: Hollaender és munkatársai: 355. oldal, Plenum, New York (1982); Ammerer: Meth. Enzymol. 101, 192 (1983)]. Az említett vonatkozásban különösen előnyös promoter a TPI1 promoter [Kawasaki: 4.599.311 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1986)], valamint az ADH2-4C promoter [Russell és munkatársai: Natúré 304, 652 (1983); Iráni és Kilgore: 07/784.653 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi]. Az expressziós egységek tartalmazhatnak transzkripciós terminátorokat is. Előnyös transzkripciós terminátor például a TPI1 terminátor (Alber és Kawasaki: ugyanott).
Az élesztőkön kívül a találmány szerinti fehérjéket expresszálhatjuk fonalas gombákban is, például Aspergillus törzsekben (McKnight és munkatársai: 4.935.349 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi).
Aspergillus törzsekben alkalmazható promoterek például az Aspergillus nidulans glikolitikus génjeinek promoterei, mint például az ADH3 promoter [McKnight és munkatársai: EMBO J. 4, 2093 (1985)], valamint a tpiA promoter. Alkalmas terminátor például az ADH3 terminátor [McKnight és munkatársai: ugyanott (1985)]. Az említett komponenseket tartalmazó expressziós egységeket olyan vektorokba klónozzuk, melyek képesek az Aspergillus törzsek kromoszomális DNS-ébe integrálódni.
A gombasejtek transzformálására alkalmas eljárások szakember számára jól ismertek, és ezekre vonatkozó kitanítást találhatunk többek között a következő publikációkban: Beggs (ugyanott), Hinnen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978); Yelton és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1740 (1984), és Russel: Natúré 301, 167 (1983). A kiválasztott gazdasejtek genotípusa általában tartalmaz valamilyen genetikus hibát, melyet az expressziós vektoron található szelektálható markergén képes kijavítani. Szakember számára nem okoz gondot a megfelelő gazdasejt és az alkalmas szelektálható markergén kiválasztása. Amennyiben például élesztőkben kívánjuk heterológ fehéijék expresszióját optimizálni, előnyös, ha a gazdasejt hordoz egy olyan mutációt, mint például az élesztő pép4 mutációja [Jones: Generics 85, 23 (1977)], melynek következtében a gazdasejt csökkent proteolitikus aktivitású.
A találmány szerinti megoldás kivitelezéséhez gombasejteken kívül emlőssejteket is alkalmazhatunk. Előnyös tenyésztett emlőssejtek, például a COS-l-sejtek (ATCC-szám: CRL 1650), a COS-7-sejtek (ATCCszám: CRL 1651), a BHK-sejtek (ATCC-szám: 1632), valamint a 293 [ATCC-szám: CRL 1573, Graham és munkatársai: J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]. Előnyös BHK-sejtvonal például a BHK—570-sejtvonal (az „American Type Culture Collection”-nél CRL 10 314 nyilvántartási számon letétbe helyezve). Alkalmazhatunk a találmány szerinti megoldásban ezenfelül számos emlőseredetű sejtvonalat is, például: Rat Hep I (ATCC-szám: CRL 1600), Rat Hep II (ATCC-szám: CRL 1548), TCMK (ATCC-szám: CRL 139), humán tüdősejtvonal (ATCC-szám: CRL 75.1), humán hepatóma-sejtvonal (ATCC-szám: HTB-52), Hep G2 (ATCC-szám: HB 8065), egérmájsejtvonal (ATCC-szám: CCL 1581), NCTC 1469 (ATCC-szám: CCL 9.1), SP2/0-Agl4 (ATCC-szám: 1581), HIT-T15 (ATCC-szám: CRL 1777), valamint RINm 5AHT2B [Orskov és Nielson, FEBS 229 (1), 175 (1988)].
A találmány szerinti megoldás megvalósításában alkalmazható emlőssejtekben működő expressziós vekto6
HU 219 674 Β rok tartalmaznak valamilyen promotert is, amely alkalmas arra, hogy a klónozott gén vagy cDNS transzkripcióját vezérelje. Előnyösen alkalmazható promoterek a virális és a cellurális promoterek. Alkalmas virális promoterek többek között: a citomegalovírus közvetlen korai promotere [Boshart és munkatársai: Cell 41, 521 (1985)], valamint az SV40 promoter [Subramani és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 1, 854 (1981)]. Alkalmas cellurális promoterek például: az egér-metallotioein-l-gén promotere (Palmiter és munkatársai: 4.579.821 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), az egér-VK-promoter [Bergman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7041 (1983)]; Grant és munkatársai: Nuc. Acids. Rés. 75, 5496 (1987)], valamint az egér-VH-promoter [Loh és munkatársai: Cell 33, 85 (1983)]. Különösen előnyösen promoter az adenovírus-2 fő késői promotere [Kaufman és Sharp: Mól. Cell. Bioi. 2, 1304 (1982)]. Az alkalmas expressziós vektorok tartalmazhatnak RNS-érési hasítóhelyeket (,,splicing”-helyeket) is, melyek a promotertől 3’-irányban és a kívánt peptidet vagy proteint kódoló DNS-szekvenciától 5’-irányban helyezkednek el. Előnyös RNS-érési hasítóhelyek izolálhatók adenovírus- és/vagy immunglubolingénekből. A találmány szerinti expressziós vektorok tartalmazhatnak a kívánt kódolószekvenciától 3’-irányban elhelyezkedő poliadenilációs szignálszekvenciát is. Alkalmas poliadenilációs szignálok többek között az SV40 vírus korai vagy késői poliadenilációs szignáljai (Kaufman és Sharp: ugyanott), az adenovírus 5-ElB-régiójának poliadenilációs szignálja, valamint a humán növekedési hormon génjének terminátora [DeNoto és munkatársai: Nuc. Acids. Rés. 9, 3719 (1981)]. A találmány szerinti expressziós vektorok tartalmazhatnak nem kódoló virális „leader’-szekvenciát is, mint például az adenovírus-2 háromszoros leaderszekvenciája, amely szekvencia a promoter és az RNS-érési hasítóhelyek között helyezkedik el. A találmány szerinti előnyös vektorok tartalmazhatnak enhanszerszekvenciákat is, mint például az SV40-enhanszert vagy az egér-p-enhanszert [Gillies, Cell 33, 717 (1983)]. A találmány szerinti expressziós vektorok tartalmazhatnak az adenovírus VA-RNS-t kódoló szekvenciákat is. Alkalmas vektorok beszerezhetők kereskedelmi forrásokból (például Stratagene, La Jolla, CA.).
A megklónozott DNS-szekvenciákat tenyésztett emlőssejtekbe juttathatjuk, például a kalcium-foszfát alkalmazásán alapuló transzfekciós eljárással [Wigler és munkatársai: Cell 74, 725 (1978); Corsaro és Pearson: Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981); Graham és Van dér Eb: Virology 52, 456 (1973)], elektroporációval [Neumann és munkatársai: EMBO J. 7, 841 (1982)], vagy a DEAE-dextrán alkalmazásán alapuló transzfekciós eljárással [Ausubel és munkatársai (szerkesztő): „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Inc. NY (1987)], az idézett publikációk teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik. Abból a célból, hogy azonosítani tudjuk azokat a sejteket, melyekbe a klónozott DNS stabilan beépült, általában szelektálható markergént is juttatunk a sejtekbe, a kívánt génnel vagy cDNS-sel együtt. Tenyésztett emlőssejtekben előnyösen alkalmazható szelektálható markergének a különböző hatóanyagokkal - például neomycinnel, hygromycinnel és methotexrate-tal - szemben rezisztenciát okozó gének. A szelektálható markergén lehet amplifikálható gén is. Előnyös amplifikálható szelektálható markergének többek között a DHFR-gén és a neomicin-rezisztenciagén. A szelektálható markergének áttekintő összefoglalása megtalálható a következő publikációban Thilly: „Mammalian Cell Technology”, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, mely publikációt teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi. Szakember számára a megfelelő szelektálható markergén kiválasztása könnyen elvégezhető rutinfeladat.
A szelektálható markergéneket bejuttathatjuk a gazdasejtekbe a glukagonreceptor-szekvenciát hordozó vektorral egyidejűleg külön vektoron, de elhelyezkedhet a bejuttatandó markergén ugyanazon a vektoron is. Amennyiben a markergén a glukagonreceptor-szekvenciát hordozó vektoron található, a markergén és a glukagonreceptor-szekvencia transzkripcióját vezérelheti két különböző promoter, de irányíthatja a transzkripciót egyazon promoter is. Ez utóbbi esetben a transzkripció eredményeként egy kétcisztronos mRNS-t kapunk. Ilyenfajta vektorkonstrukciók a technika állása szerint jól ismertek (lásd például: Levinson és Silnonsen: 4.713.339 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Előnyös lehet a sejtekbe juttatandó DNSkeverékhez további, úgynevezett hordozó DNS-t adni.
A transzfektált emlőssejteket egy bizonyos ideig tipikusan 1-2 napig, növekedni engedjük, a kívánt DNSszekvencia (-szekvenciák) expressziójának megindulásáig. Ezután a sejtek táptalajához szelekciós hatóanyagot adunk, és ily módon kiszelektáljuk azokat a sejteket, melyek a markergént stabilan beépülve tartalmazzák. Azon sejtek esetében, melyekbe amplifikálható markergént juttattunk, a szelekciós hatóanyag koncentrációját a táptalajban fokozatosan növelhetjük, és ily módon olyan sejteket szelektálhatunk, melyekben a klónozott szekvenciák kópiaszáma megnövekedett, ami nagyobb mértékű expressziót tesz lehetővé. A beépítetett szekvenciákat expresszáló sejtek közül ezután kiszelektáljuk azokat, amelyek a kívánt proteint a megfelelő formában vagy megfelelő mértékben termelik. Az ily módon szelektált sejteket azután klónozhatjuk, és a termeléshez szükséges mennyiségben elszaporíthatjuk.
A találmány szerinti megoldás megvalósítására alkalmas előnyös prokarióta gazdasejtek az Escherichia coli törzsek, bár a bacillusokhoz és egyéb nemzetségekhez tartozó sejtek is alkalmazhatók. Az ilyen gazdasejtek transzformálását célzó eljárások, valamint a sejtekbe klónozott idegen DNS-szekvenciák expresszálására alkalmas eljárások a technika állása szerint jól ismertek [lásd például: Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi; vagy Sambrook és munkatársai, lásd fent]. A klónozott DNS-szekvenciák a bakteriális gazdasejtekben történő
HU 219 674 Β expresszálására alkalmas vektorok általában tartalmaznak szelekciós markergéneket, mint például antibiotikumrezisztenciát okozó géneket, valamint egy gazdasejtben működőképes promotert. Alkalmas promoterek többek között: a trp-promoter [Nichols és Yanofsky: Meth. Enzymol. 101, 155 (1983)], a lac-promoter [Casadaban és munkatársai: J. Bacteriol. 143, 971 (1980)], valamint a λ-fág-promotereiből kialakított promoterrendszerek [Queen. J.: Mól. Appl. Génét. 2, 1 (1983)]. Baktériumok transzformálására alkalmas vektorok többek között a pBR322-plazmid [Bolivár és munkatársai: Gene 2, 95 (1977)], a pUC-plazmidok [Messing: Meth. Enzymol. 101, 20 (1983); Vieira és Messing: Gene 19, 259 (1982)], a pCQV2-plazmid (Queen, ugyanott), valamint ezek származékai. Az alkalmazható plazmidok tartalmazhatnak mind virális, mind bakteriális elemeket.
A leírásban adott kitanítás tükrében a találmány szerinti expressziós vektorokban alkalmazható promoterek és terminátorok, valamint azok az eljárások, amelyek alkalmasak a találmány szerinti glukagonreceptorokat kódoló expressziós vektorok növényi, madár-, valamint rovarsejtekbe juttatására, szakember számára kézenfekvőek. A rovarsejtekben heterológ DNS-szekvenciák expresszálására alkalmas baculovírus-vektorok összefoglaló leírását megtalálhatjuk például Atkinson és munkatársai publikációjában [Pestic. Sci. 28, 215 (1990)]. Továbbá a növényi sejtekben különböző gének expresszálására alkalmas Agrobacterium rhizogenes alapú vektorok összefoglalását megtalálhatjuk Sinkar és munkatársai közleményében [J. Biosci (Bangalore) 11, 47 (1987)].
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat tartalmazó gazdasejteket a glukagonreceptort kódoló DNS-szegmens expresszálása céljából tenyésztjük. A sejteket közismert eljárások alkalmazásával tenyésztjük olyan táptalajban, amely tartalmazza a kiválasztott gazdasejtek növekedéséhez szükséges tápanyagokat. A technika állása szerint sok különböző alkalmas táptalaj ismeretes, és ezek általában tartalmaznak szénforrást, nitrogénforrást, esszenciális aminosavakat, vitaminokat és ásványi anyagokat, valamint egyéb komponenseket, mint például növekedési faktorokat vagy szérumot, melyekre az adott gazdasejt növekedéséhez szükség lehet. Az alkalmazott táptalaj általában szelekciós hatást gyakorol a DNS-konstrukciót (-konstrukciókat) tartalmazó sejtekre, ez a szelekciós hatás lehet például valamilyen hatóanyaggal szembeni rezisztencia, vagy egy szelektálható markergén, ami a DNS-konstrukción található vagy a DNS-konstrukcióval együtt transzfektáltuk a gazdasejtbe, lehetővé teszi a transzfektált deficiens gazdasejtek számára, hogy valamilyen esszenciális tápanyagot a tápanyagban található összetevőkből fölépítsen.
Élesztősejteket tenyészhetünk például kémiailag definiált táptalajban, amely tartalmaz nitrogénforrást - a nitrogénforrás lehet aminosavat nem tartalmazó nitrogénforrás vagy élesztőkivonat - szervetlen sókat, vitaminokat, valamint esszenciális aminosavakat, és a tenyésztési hőmérséklet 4 °C és 37 °C közötti, különösen előnyös a 30 °C tenyésztési hőmérséklet. Ha a táptalaj pH-értékét előnyösen 2 és 8 között tartjuk, előnyösebben a pH-érték 5 és 6 közötti. Stabil pH-érték kialakítására alkalmas eljárások többek között a pufferoldatok alkalmazása, valamint az automatikus konstans pHszabályozás. A pH-szabályozás előnyös hatóanyaga például a nátrium-hidroxid. Előnyös pufferhatóanyag például a borostyánkősav és a Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Mivel ismert, hogy az élesztőgazdasejtek hajlamosak a heterológ proteineket hiperglikolizálni, előnyös lehet a találmány szerinti glukagonreceptorokat olyan élesztősejtekben expresszálni, melyekben valamely aszparaginkapcsolt glikozilációhoz szükséges gén működésképtelen. Az ilyen sejteket előnyösen ozmotikus stabilizálószert tartalmazó táptalajban tenyésztjük. Előnyös ozmotikus stabilizálószer a szorbitol, melyet a táptalajban 0,1 mol/1 és 1,5 mol/1, előnyösen 0,5 mol/1 és 1,0 mol/1 közötti koncentrációban alkalmazunk. Az emlőssejteket általában kereskedelmi forgalomban beszerezhető szérumtartalmú vagy szérummentes táptalajban tenyésztjük. Szakember számára az alkalmazott sejtvonalhoz megfelelő táptalaj és tenyésztési körülmények megválasztása rutinfeladat.
A találmány szerinti glukagonreceptorokat expreszszálhatják transzgenikus állatok is, előnyösen transzgenikus meleg vérű állatok. A transzgenikus állatok, például egerek, patkányok, nyulak, birkák és sertések előállítására alkalmas eljárások a technika állása szerint jól ismertek, és ilyen eljárásokra példát találhatunk a következő közleményekben: Hammer és munkatársai: [Natúré 315, 680 (1985), Palmiter és munkatársai: [Science 222, 809 (1983)], Brinster és munkatársai: [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438 (1985)], Palmiter és Brinster [Cell 41, 343 (1985)], 4.736.866 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, mely közlemények teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanitás részét képezik. Röviden összefoglalva: a megtermékenyített petesejtek prosejtmagjaiba bejuttatunk egy expressziós egységet, amely tartalmazza az expresszáltatni kívánt DNS-szekvenciát, megfelelően elhelyezett expressziós szabályozószekvenciák társaságában. A DNS bejuttatását általában mikroinjektálással végezzük. A beinjektált DNS beépülését a szöveti mintákból kinyert DNS blotanalízisével ellenőrizzük, tipikusan a farokszövetekből veszünk mintát. Általában előnyös, ha a bejuttatott DNS beépül a transzgenikus állat ivarsejtjeibe is, aminek következtében az állat utódaiban is megtalálható lesz.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint olyan transzgenikus állatot fejlesztünk ki, például egeret, amelyben egy célzott mutáció elrontja a glukagonreceptort kódoló szekvenciát [lásd Mansour és munkatársai: „Disruption of the protooncogene in-2 in mouse embyro-derived stem. cells: a generál strategy fór targeting mutations to non-selectable genes”, Natúré 336, 348 (1988)]. Az ilyen transzgenikus állatok kiválóan alkalmasak a glukagonreceptor anyagcserében játszott szerepének tanulmányozására.
Glukagonreceptor-peptidek
Amint azt már említettük, a találmány tárgyát képezik glukagonreceptor-peptidek is. A leírásban használt
HU 219 674 Β értelemben a glukagonreceptor-peptid olyan peptid, amely valamely glukagonreceptomak vagy glukagonreceptor-származéknak - ahogy azt a fentiekben definiáltuk - egy részletét tartalmazza, nem tartalmaz transzmembrán doménokat, és legalább 10 aminosav hosszúságú. Röviden, az elsődleges transzlációs termék ismeretében a glukagonreceptor szerkezete, valamint a receptor feltételezett transzmembrán doménjainak helyzete megjósolható például a „P/C Gene” vagy „Intelligenetics Suite” számítógépes programok alkalmazásával (Intelligenetics, Mt. View. CA), de megjósolhatjuk a receptor szerkezetét Kyte és Doolittle eljárása alapján is [J. Mól. Bioi. 157, 105 (1982)]. A patkány glukagonreceptorának hidrofób sajátságát ábrázoló grafikont a 2. ábrán láthatjuk. Bár egyetlen grafikus ábrázolást sem tartunk kizárólagosan helyesnek, a 2. ábrán látható hidrofóbsajátság-vizsgálat alapján feltételezzük, hogy a glukagonreceptorok az 1. ábrán bemutatott általános szerkezettel rendelkeznek. Részletezve, feltételezzük, hogy ezek a receptorok tartalmaznak egy extracellurális aminoterminális domént, három extracellurális hurokdomént, valamint négy intracellurális hurokdomént, melyeket egymástól transzmembrán domének választanak el.
A találmány tárgyát képezi egy izolált glukagonreceptor-peptid, amely tartalmazza egy glukagonreceptor extracellurális aminoterminális doménjét. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az izolált glukagonreceptor-peptid tartalmazza a 15. azonosító számú szekvencia 28. glutaminjától a 142. tirozinjáig terjedő aminosavszekvencia-részletet. Szintén a találmány tárgyát képezik azok az izolált glukagonreceptor-peptidek, melyek a glukagonreceptor extracellurális és intracellurális hurokdoménjei közül kiválasztott domént tartalmaznak (1. és 5. ábra). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a glukagonreceptorpeptid az alábbiakban felsorolt domének valamelyikét tartalmazza: 1ID (szekvenciaazonosító szám: 15, a 169. lizintől a 178. hisztidinig), 1ELD (szekvenciaazonosító szám: 15, a 203. tirozintól a 231. izoleucinig), 2ID (szekvenciaazonosító szám: 15, a 259. fenil-alanintól a 266. szerinig), 2ELD (szekvenciaazonosító szám: 15, a 293. valintól a 307. izoleucinig), 3ID (szekvenciaazonosító szám: 15, a 334. leucintól a 345. lizinig), valamint 3ELD (szekvenciaazonosító szám: 15, a 371. aszparaginsavtól a 380. szerinig).
A találmány szerinti glukagonreceptor-peptideket előállíthatjuk a fentiekben tárgyalt rekombináns eljárások alkalmazásával, de előállíthatjuk őket szintetikusan is, és az előállított peptideket az alábbiak szerint tisztíthatjuk.
A glukagonreceptor-peptidek tisztítása
A találmány szerinti izolált glukagonreceptor-peptideket előállíthatjuk többek között oly módon, hogy tenyésztjük az alkalmas gazdasejt/vektor rendszereket, a találmány szerinti rekombináns transzlációs termékek előállítása céljából. Az ilyen sejtvonalak felülúszóját azután különféle tisztítási eljárásoknak vethetjük alá, a glukagonreceptor-peptidek izolálása céljából, A sejtek felülúszóját például első lépésben betöményíthetjük valamely kereskedelmi forgalomban hozzáférhető proteinkoncentráló berendezés alkalmazásával, mint például az „Amicon” vagy „Millipore Pellicon” ultraszűrő berendezés. A felülúszó betöményítését követően a koncentrátumot érintkezésbe hozhatjuk valamely alkalmas kromatográfiás töltettel, például olyan szilárd hordozóval, amelyhez glukagont, vagy antiglukagonreceptorellenanyagot kötöttek. Eljárhatunk úgy is, hogy a receptor vagy a peptid tisztítására anion- vagy kationcserélő gyantát alkalmazunk. Végül a glukagonreceptor-peptid további tisztítására alkalmazhatunk egy vagy több reverz fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC) lépést is. A leírásban használt értelemben egy glukagonreceptor-peptidet akkor tekintünk „izoláltnak” vagy „tisztítottnak”, amennyiben a peptidet SDSpoliakrilamid-gélelektroforézissel vizsgálva az elektroforézisgélen „Coomassie Brillant Blue” festékkel festve csak egyetlen fehéijecsík észlelhető.
Glukagonreceptorok ellen termeltetett ellenanyagok
A találmány szerinti glukagonreceptorokat, azok származékait, részleteit vagy fragmenseit, csakúgy mint a fent tárgyalt glukagonreceptor-peptideket felhasználhatjuk glukagonreceptor-kötő ellenanyagok előállítására. Az így előállított ellenanyagok szintén a találmány tárgyát képezik. A leírásban használt értelemben az „ellenanyagok” kifejezés vonatkozik poliklonális ellenanyagokra, monoklonális ellenanyagokra, valamint ezek ffagmenseire, mint például az F(ab’)2- és a Fabfragmensek, de a kifejezés vonatkozik a rekombináns eljárással előállított kötőmolekulákra is. Ezeket a kötőmolekulákat kódoló gének tartalmazzák valamely specifikusan kötődő ellenanyag génjének variábilis régióit. Akkor mondjuk, hogy egy ellenanyag specifikusan kötődik a glukagonreceptorhoz, ha a kötődési állandó (IQ) nagyobb vagy egyenlő 107 mol/1 '-nél. Egy monoklonális ellenanyag vagy kötőmolekula kötési affinitását szakember könnyen meg tudja határozni (Scatchard: Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 51, 660, (1949)].
Poliklonális ellenanyagok előállítása szakember számára nem okoz gondot. Poliklonális ellenanyagok nyerhetők különböző meleg vérű állatokból, például lovakból, marhákból, kecskékből, birkákból, kutyákból, csirkékből, nyulakból, egerekből, valamint patkányokból. Röviden összefoglalva: az állatok immunizálására glukagonreceptort alkalmazunk intraperitoneális, intramuszkuláris, intraokuláris, vagy szubkután injektálással. Valamely glukagonreceptor vagy glukagonreceptor-peptid immunogenitása fokozható valamely adjuváns, például a Freund-féle komplett vagy nem komplett adjuváns alkalmazásával. Néhány megerősítő immunizálást követően kis mennyiségű szérummintát veszünk, és teszteljük a minták glukagonreceptor-kötő aktivitását. Különböző vizsgálati eljárásokat alkalmazhatunk a glukagonreceptorhoz specifikusan kötődő ellenanyagok kimutatására. Ilyen vizsgálati eljárások leírását megtalálhatjuk a következő kézikönyvben: „Antibodies: A Laboratory Manual”, szerkesztő: Harlow és Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Az alkalmazható vizsgálati eljárások példáiként megemlítjük: az ellenáramú immunelektroforézist (CIEP),
HU 219 674 Β a „radioimmunoassay”-ket, a radioimmunkicsapásokat, az enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárást (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), a „dot-blot”-elj árasokat, az inhibíciós és kompetíciós vizsgálati eljárásokat, valamint a szendvicselrendezésű vizsgálati eljárásokat [4.376.110 és 4.486.530 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; „Antibodies: A Laboratory Manual”, fent). A megfelelő ellenszérum előnyösen a háttérhez viszonyítva legalább háromszoros jelet ad az alkalmazott vizsgálati eljárásban. Amennyiben egy állat ellenanyagtitere a glukagonreceptorhoz való reaktivitás tekintetében tovább már nem emelkedik, nagyobb mennyiségű ellenszérumhoz juthatunk akár hetenként alkalmazott vérvétellel, akár az állat elvéreztetése útján.
Monoklonális ellenanyagokat is könnyen előállíthatunk a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával [RE 32.011,4.902.614,4.543.439 és 4.411.993 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; „Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses”, Plenum Press, szerkesztő: Kennett, McKeam és Bechtol (1980), és „Antibodies : A Laboratory Manual”, szerkesztő: Harlow és Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]. Röviden összefoglalva: a találmány egy megvalósítási módja szerint a kiválasztott kísérleti állatot - például patkányt vagy egeret - olyan glukagonreceptor-készítménnyel injektálunk be, amely alkalmas arra, hogy az állat a glukagonreceptor ellen immunválaszt adjon. Alkalmas glukagonreceptor-készítmények például a glukagonreceptort expresszáló sejteket tartalmazó készítmények, vagy a glukagonreceptor szekvenciáján alapuló szekvenciájú peptideket tartalmazó készítmények. Továbbá a technika állása szerint sok olyan eljárás ismeretes, amely alkalmas a kiváltott immunválasz fokozására, kapcsolhatjuk például a receptort vagy a receptorpeptidet valamelyik egyéb proteinhez, például az ovalbuminhoz vagy a kulcslyukkagyló-hemocianinhoz (keyhole limpet hemocyanin, KLH), de alkalmazhatunk adjuvánsokat is, mint például a Freund-féle komplett vagy nem komplett adjuváns. Az első immunizálást végrehajthatjuk intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, intraokulárisan vagy szubkután módon.
Az első immunizálást követően egy és két hét közötti idő elteltével megerősítő immunizálást hajthatunk végre az állaton. Az állatból ezután vért vehetünk, és a levett szérumot a fent említett vizsgálati eljárások alkalmazásával glukagonreceptor-kötő aktivitásra vizsgálhatjuk. További megerősítő immunizálásokat hajthatunk végre mindaddig, míg az állat glukagonreceptorkötő titerértéke tovább már nem nő. Ezután az állat egy végső megerősítő immunizálást kaphat glukagonreceptor-készítménnyel vagy glukagonreceptorpeptid-készítménnyel, majd az állatot három-négy nap múlva elpusztítjuk. Ekkor izoláljuk az állat lépét és nyirokcsomóit, majd az izolált szervekből különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítünk oly módon, hogy a szerveket szűrőn átpasszírozzuk, vagy pedig szétroncsoljuk a lépvagy nyirokcsomómembránokat, melyek a sejteket együtt tartják. A találmány egy megvalósítási módja szerint vörössejteket hipotóniás oldat hozzáadásával lizáltatjuk, majd a szuszpenziót azonnal izotóniásra állítjuk vissza.
A találmány egy megvalósítási módja szerint a monoklonális ellenanyagok előállítására alkamas sejteket in vitro immunizációs eljárások alkalmazásával állítjuk elő. Röviden, egy állatot elpusztítunk és a fent leírtak szerint kinyerjük belőle a lép- és nyirokcsomósejteket. Ezután különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítünk és a sejteket olyan táptalajban tenyésztjük, amely tartalmazza a fent említett immunválasz kiváltására alkalmas glukagonreceptor-készítményt. Ezután kinyeijük a limfocitákat és az alábbiak szerint fúzionáltatjuk őket.
Az in vitro immunizálás útján vagy az immunizált állatokból fentiek szerint kinyert sejteket Epstein-Barrvírussal (EBV) történő transzfektálás útján tehetjük halhatatlanná [Glasky és Reading: Hybridoma 8 (4), 377 (1989)]. Eljárhatunk úgy is a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, hogy a kinyert lép- és/vagy nyirokcsomósejt-szuszpenziót alkalmas mielomasejtekkel fúzionáltatjuk, és ily módon monoklonális ellenanyagokat szekretáló hibridomasejteket kapunk. Az alkalmas mieloma-sejtvonalak előnyösen nem termelnek vagy expresszálnak ellenanyagokat, és ezenfelül előnyösen az immunizált állattal szingenetikusak. A technika állása szerint sok ilyen alkalmas mieloma-sejtvonal ismeretes, és ezek különböző törzsgyűjteményekből beszerezhetők, mint például az „American Type Culture Collection” (ATCC), Rockville, Maryland (lásd az ATCC 1988-as „Catalogue Cell Liner & Hybridomas” című katalógusát (6. kiadás). Alkalmas mieloma-sejtvonalak többek között: humán sejtvonalak: UC 729-6 (ATCCszám: 8061), MC/CAR-Z2 (ATCC-szám: CRL 8147), valamint SKO-007 (ATCC-szám: CRL 8033); egérsejtvonalak: SP2/0-Agl4 (ATCC-szám: CRL 1581), valamint P3X63Ag8 (ATCC-szám: TIB 9); patkánysejtvonalak: Y3-Agl.2.3 (ATCC-szám: CRL 1631), valamint YB2/0 (ATCC-szám: CRL 1662). Különösen előnyös fúziós sejtvonalak az NS-1 (ATCC-szám: TIB 18), valamint a P3X63-Ag8.653 (ATCC-szám: CRL 1631), ezeket a sejtvonalakat fúzionáltathatjuk mind egér-, mind patkány-, mind humán sejtvonalakkal. Az immunizált állatból származó sejteket számos különböző eljárás alkalmazásával fúzionáltathatjuk a mieloma-sejtvonallal, ilyen például a polietilénglikol (PEG) alkalmazásán alapuló eljárás [„Antibodies: A Laboratory Manual”, szerkesztő: Harlow és Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)] vagy az elektrofúzió [Zimmerman és Vienken: J. Mebrane Bioi. 67, 165 (1982)].
A fúziót követően a sejteket megfelelő táptalajt tartalmazó tenyésztőcsészékbe helyezzük, a táptalaj lehet például RPMI1640 vagy DMEM (Dulbecco-féle módosított Eagle táptalaj; JRH Biosciences, Lenexa, Kan). A táptalaj tartalmazhat további összetevőket is, mint például a magzati borjúsavó (fetal bovine serum, FBS, amely beszerezhető például: Hyclone, Logan, Utah, vagy JRH Biosciences), az immunizált állattal azonos fajtájú újszülött állatból izolált timociták, vagy az agar, amely alkalmas a táptalaj megszilárdítására. Ezenfelül
HU 219 674 Β a táptalajnak tartalmaznia kell valamely olyan reagenst, amely szelektíven engedi növekedni a fuzionált lép- és mielomasejteket. Különösen előnyös a HAT táptalaj (hipoxantin, aminopterin, és timidin, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) alkalmazása. Körülbelül 7 nap elteltével a kapott fuzionált sejteket vagy hibridomákat szűrővizsgálatnak vetjük alá, annak eldöntése érdekében, hogy termelnek-e glukagonreceptort felismerő ellenanyagokat. Ezután néhány klónhígítási lépést hajtunk végre, majd ismételt szűrővizsgálattal olyan hibridomát izolálhatunk, amely glukagonreceptorhoz kötődő ellenanyagokat termel. Alkalmazhatunk más eljárásokat is a monoklonális ellenanyagok előállítására [William D. Huse és munkatársai: „Generation of a Large Combinational Library of the Imunoglobulin Repertoire in Phage Lambda”, Science 246, 1275 (1989. december); L. Sastry és munkatársai: „Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli fór Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5728, (1989. augusztus); Michelle Alting-Mees és munkatársai: „Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Altemative to Hybridomas”, Strategies in Molecular Biology 3, 1 (1990. január); ezek a publikációk egy olyan kereskedelmi forgalomban beszerezhető - Stratacyte, La Jolla, CA. - expressziós rendszert írnak le, amely lehetővé teszi ellenanyagok előállítását rekombináns eljárások alkalmazásával]. Röviden összefoglalva egy B-sejtpopulációból mRNS-t izolálunk, és az izolált mRNS-frakciót használjuk immunglobulin könnyű- és nehézlánc cDNS-expressziós könyvtár előállítására, a XIMMUNOZAP(H)- és a XIMMUNOZAP(L)-vektorokban. Ezeket a vektorokat külön-külön szűrővizsgálatnak vethetjük alá, vagy expresszálhatjuk őket együttesen is, és ily módon Fab-ffagmenseket vagy ellenanyagokat kapunk (Huse és munkatársai: fent; Sastry és munkatársai: fent). A pozitív plakkokból izolált vektorokból azután nem litikus plazmidokat állíthatunk elő, melyek lehetővé teszik a monoklonális ellenanyagfragmensek nagy mennyiségű termeltetését E. coliban.
Hasonló módon előállíthatunk olyan kötőmolekulákat is rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával, melynek génjébe valamely specifikusan kötődő ellenanyag génjének variábilis régiókat kódoló szakaszát építjük be. Ilyen proteinek előállítása szakember számára a leírásban adott feltárás figyelembevételével könnyen megoldható feladat [James W. Larrick és munkatársai: „Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Humán Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells”, Biotechnology 7, 934 (1989. szeptember); Riechmann és munkatársai: „Reshaping Humán Antibodies fór Therapy”, Natúré 332, 323 (1988); Roberts és munkatársai: „Generation of an Antibody with Enhanced Affinity and Specificity fór this Antigén by Protein Engineering”, Natúré 328, 731 (1987); Verhoeyen és munkatársai: „Reshaping Humán Antibodies: Grafting an Antilysosyme Activity”, Science 239, 1534 (1988); Chaudhary és munkatársai: „A Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin”, Natúré 339, 394 (1989), az 5.132.405 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás „Biosynthetic Antibody Binding Sites”]. Röviden összefoglalva a találmány egy megvalósítási módja szerint, glukagonreceptort specifikusan kötő ellenanyagokat termelő hibridomákból kinyert glukagonreceptor-specifikus antigénkötő domént kódoló DNS-szegmenst amplifikálunk, és az amplifikált DNS-t közvetlenül egy humán ellenanyagokat termelő sejt genomjába építjük (Verhoeyen és munkatársai: fent; Reichman és munkatársai : fent). Ezzel az eljárással lehetővé válik, hogy egy specifikusan kötődő egér vagy patkány monoklonális ellenanyag antigénkötő helyét humán ellenanyagba építsük. Az ilyen ellenanyagokat előnyösen alkalmazhatjuk humán terápiás célokra, mert ezek nem olyan erős antigének, mint a patkány- vagy egérellenanyagok.
Eljárhatunk úgy is, hogy az antigénkötő helyeket (variábilis régió) vagy hozzákapcsoljuk, vagy beépítjük valamely teljesen más proteinbe (Chaudhary és munkatársai: fent), és ily módon olyan új proteint kapunk, amely egyrészt rendelkezik az ellenanyag antigénkötő helyével, másrészt a másik említett protein funkcionális aktivitásával. Szakember számára kézenfekvő, hogy az ellenanyagok antigénkötő helyei vagy glukagonreceptor-kötő doménje az ellenanyag variábilis régiójában található. Továbbá a találmány szerinti megoldás kivitelezésekor alkalmazhatók olyan DNS-szekvenciák is, melyek az ellenanyag vagy a variábilis régióknak olyan kisebb részletét kódolják, melyek specifikusan kötődnek az emlős-glukagonreceptorokhoz. Az ilyen kötődésre képes molekularészleteket azonosíthatjuk az alábbiakban leírt glukagonreceptor alkalmazásán alapuló vizsgálati eljárások segítségével.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kívánt monoklonális ellenanyagot termelő hibridomasejt variábilis régiót kódoló génjeit amplifikáljuk, a variábilis régióra specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Szakember számára az ilyen oligonukleotidok megszintetizálása nem okoz nehézséget, de azok kereskedelmi forrásból is beszerezhetők. A Stratacyte (La Jolla, CA.) cég például árul olyan láncindító oligonukleotidokat, amelyek humán és egér variábilis régiókra specifikusak, többek között a VHa-, VHb-> VHc-> VHd-, CH1-, VL- és CL-régiókra specifikus oligonukleotidokat. Ezek a láncindító oligonukleotidok alkalmasak mind a nehéz-, mind a könnyűlánc variábilis régióinak amplifikálására, majd az amplifikált DNSfragmenseket olyan vektorokba építhetjük, mint például az IMMUNOZAP*(H) vagy IMMUNOZAP*(L) (Stratacyte). Ezeket a vektorokat azután expresszió céljából E. coli sejtekbe juttathatjuk. Ezzel az eljárással nagy mennyiségben előállíthatunk olyan egyláncú proteint, amely a VH és a VL domének fúzióját tartalmazza [Bírd és munkatársai: Science 242, 423 (1988)].
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a kötőmolekula génjét az expressziós vektoron belül fúzionáltathatjuk valamely más protein génjével, például egy toxingénnel. Az ily módon előállított fúziós kötő11
HU 219 674 Β molekula a benne található toxindoménnek köszönhetően elpusztítja azokat a sejteket amelyhez hozzákötődik (Chaudhary és munkatársai: fent).
Amennyiben sikerült a megfelelő ellenanyagokat vagy kötőmolekulákat előállítanunk, azokat a technika állása szerint ismert eljárások valamelyike alkalmazásával izolálhatjuk és megtisztíthatjuk (, Antibodies: A Laboratory Manual”, fent). Az izolálásra és tisztításra alkalmazható eljárások példáiként megemlítjük a proteinaffinitás-oszlopokat, a HPLC-t vagy az RP-HPLC-t, a protein-A- vagy protein-G-oszlopokon történő tisztítást, valamint ezek kombinációit. A leírásban használt értelemben az „izolált” kifejezés olyan ellenanyagokat és kötőmolekulákat jelöl, melyek „lényegében mentesek a vér egyéb alkotórészeitől”.
A találmány szerinti ellenanyagokat és kötőmolekulákat számos területen alkalmazhatjuk. Az ellenanyagokat alkalmazhatjuk például flow-citometriás eljárásokban glukagonreceptort hordozó sejtek szelektálására, vagy alkalmazhatjuk ezeket az ellenanyagokat glukagonreceptort tartalmazó szövetek hisztokémiai festésére. Röviden, a glukagonreceptorok jelenlétét sejtek felszínén oly módon detektálhatjuk, hogy a sejteket olyan jelzett monoklonális ellenanyaggal inkubáljuk, melyek specifikusan kötődnek a glukagonreceptorokhoz, majd kimutatjuk a megkötődött ellenanyagok jelenlétét. Az említett eljárási lépéseket egyéb lépések is kiegészíthetik, mint például a nem specifikusan kötött ellenanyag eltávolítására szolgáló mosási lépések. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható jelölőágensek a technika állása szerint jól ismertek, például fluoreszcein-izotiocianát (FITC), Phycoerythrin (PE), torma-peroxidáz (Horse Radish Peroxidase, HRP), valamint kolloid arany. Flow-citometriás eljárásokban különösen előnyös a FITC alkalmazása, melyet a tisztított ellenanyaghoz például Keltkamp eljárása alapján kapcsolhatunk [Immunology 18, 865 (1970); Immunology 18, 875 (1970); lásd még Goding: J. Immunoi. Methods: 13, 215 (1970)]. Hisztokémiai festésre a HRP a legalkalmasabb, melyet a tisztított ellenanyaghoz például Nakane és Kawaoi eljárása alapján kapcsolhatunk [J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974); Tijssen és Kurstak: Anal. Biochem. 136, 451 (1984)].
Továbbá a találmány szerinti tisztított ellenanyagokat és kötőmolekulákat alkalmazhatjuk terápiásán is, a glukagonreceptorhoz történő kötődésének megakadályozására in vitro vagy in vivő. Röviden, azokat az ellenanyagokat nevezzük blokkoló ellenanyagoknak, melyek a glukagonreceptor valamely epitópjához oly módon kötődnek, hogy megakadályozzák a glukagonreceptorhoz történő kötődését, vagy megakadályozzák azt, hogy a kötődött glukagon jeltovábbítást indukáljon. Amint azt már említettük, több különböző vizsgálati eljárás is alkalmazható az olyan ellenanyagok azonosítására, melyek képesek blokkolni vagy gátolni a glukagon glukagonreceptorhoz történő kötődését, például alkalmazhatók a fent említett inhibíciós és kompetíciós vizsgálati eljárások. A találmány egy megvalósítási módja szerint a fentiekben leírtak szerint előállított monoklonális ellenanyagok glukagonreceptor-kötő képességét megvizsgáljuk mind glukagon hiányában, mind pedig különböző glukagonkoncentrációk jelenlétében. A blokkoló ellenanyagok vagy kötőmolekulák az említett eljárás szerint például azok, melyek egyrészt kötődnek a glukagonreceptorokhoz, másrészt pedig glukagon jelenlétében blokkolják vagy gátolják a glukagonnak a glukagonreceptorhoz történő kötődését.
Azokat a találmány szerinti ellenanyagokat és kötőmolekulákat, melyeket terápiás célra kívánunk alkalmazni, előnyösen gyógyászati készítmény formájában alkalmazzuk, melyekben az ellenanyag vagy kötőmolekula fiziológiásán elfogadható hordozóban vagy oldószerben van jelen. Alkalmas hordozók és oldószerek többek között: semleges puffereit sóoldatok vagy sóoldatok, és az ilyen gyógyászati készítmények tartalmazhatnak még kötőanyagokat vagy stabilizálószereket is, például puffereket, cukrot, például glükózt, szacharózt vagy dextrózt, kelátorokat, mint például EDTA, valamint különböző konzerválóanyagokat.
Glukagonantagonisták
Ahogy azt már említettük, a találmány tárgyát képezik glukagonantagonisták detektálására szolgáló eljárások is. A leírásban használt értelemben az „antagonista” kifejezés olyan molekulát jelöl, amely képes valamely receptorhoz kötődni, a kötődés azonban nem stimulálja a sejten belüli válasz-reakcióutat, vagy csökkenti annak stimuláltságát. Közelebbről a glukagonantagonistákat általában azon az alapon azonosítjuk, hogy képesek a glukagonreceptorhoz kötődni, és ezáltal a sejten belüli válasz-reakcióút stimuláltságát csökkenteni.
A találmány tárgyát képezik eljárások glukagonantagonisták jelenlétének kimutatására, melyek a következő lépéseket foglalják magukban:
i) egy vizsgált vegyületet glukagonagonista jelenlétében válasz-reakcióúthoz kapcsolt rekombináns glukagonreceptorral érintkeztetünk, olyan körülmények között és annyi ideig, ami elégséges ahhoz, hogy a vizsgált vegyület a receptorhoz kötődhessen, és a válaszreakcióútban a kötődésnek megfelelő válasz kialakulhasson; és ii) kimutatjuk a vizsgált vegyület glukagonreceptorhoz történő kötődésének következtében kialakult, válasz-reakcióút stimuláltságában beálló csökkenést, ahhoz a stimuláltsági szinthez viszonyítva, melyet a glukagonagonista önmagában receptorhoz adva előidézne, és ily módon a glukagonantagonista jelenlétét kimutatjuk.
A leírásban használt értelemben a „glukagonantagonista” kifejezés olyan molekulákra vonatkozik (többek között magára a glukagonra is), melyek képesek a glukagonreceptorhoz kötődni, és ezáltal a sejten belüli válasz-reakcióutat stimulálni.
Az említett eljárások alkalmazásával egy egész sor különböző vegyületet lehet vizsgálni. Ilyen vegyületek lehetnek például a fent említett blokkoló ellenanyagok, glukagonreceptor-peptidek, valamint glukagonanalógok (mind peptid, mind nem peptid ligandumok). A 07/741.931 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés például eljárásokat ismertet nagy mennyiségű glukagonanalóg előállítására, az ilyen analógokat kódoló DNS-szekvencia-keverékek alkalmazá12
HU 219 674 Β sával. Az ilyen glukagonanalógokat kódoló DNS-szekvencia-keverékeket oly módon állíthatjuk elő, hogy a glukagont kódoló DNS-szekvenciákat telítési mutagenezisnek [Little: Gene 88, 113 (1990); Hembers és munkatársai: Gene 88, 143 (1989)], szegmensre irányított mutagenezisnek [Shortle és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5375 (1980)], vagy nukleotidok hibás beépülését kierőszakoló eljárásnak vetjük alá [Liao és Wise: Gene 88, 107 (1990)], vagy előállíthatunk ilyen szekvenciakeverékeket véletlenszerűen mutagenizált oligonukleotidok alkalmazásával is [Hutchison és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 710 (1986)]. Ezután a glukagonanalógokat expresszálható transzformánsokat egyenként klónozhatjuk, a fent leírtak alkalmazásával, de alkalmazhatjuk a transzformánsok keverékét is.
A vizsgálandó vegyületeket glukagonagonista jelenlétében rekombináns glukagonreceptorral érintkeztetjük olyan körülmények között és annyi ideig, ami lehetővé teszi a vizsgált vegyület receptorhoz történő kötődését, és az ezzel kapcsolatos válasz kialakulását a kapcsolt reakcióúton. A találmány szerinti megoldás alkalmazásakor a glukagonantagonista kötődésére alkalmas körülmények és időtartamok az alkalmazott receptortól függően különbözőek lehetnek, mindazáltal a kötődésre alkalmas körülmények általában a következők: a hőmérséklet 4 °C és 55 °C közötti, és olyan pufferoldatot alkalmazunk, melynek NaCl-koncentrációja 0 és 2 mol/1 közötti, előnyösen 0 és 0,9 mol/1 közötti, legelőnyösebben 0,1 mol/1, és a puffer pH-értéke 5 és 9 közötti, előnyösen 6,8 és 8 közötti. A kötődéshez és a válasz kialakulásához elégséges idő általában 5 és 15 perc közötti, a receptorral való érintkeztetést követően.
Amennyiben a vizsgált vegyületet glukagonagonista jelenlétében egy rekombináns glukagonreceptorral érintkeztetjük, olyan körülmények között és annyi ideig, ami lehetővé teszi a vizsgált vegyület receptorhoz történő kötődését, a válasz-reakcióút stimuláltságában csökkenést lehet észlelni, amennyiben a vizsgált vegyület versenyez a glukagonagonistával a rekombináns glukagonreceptorhoz történő kötődésben. A találmány egy megvalósítási módja szerint a válasz-reakcióút egy membránhoz kötött adenilát-cikláz válasz-reakcióút, és a detektálási lépés magában foglalja a membránkötött adenilát-cikláz válasz-reakcióút cAMP-termelése csökkenésének mérését, ahhoz az értékhez viszonyítva, melyet akkor mérnénk, ha kizárólag a glukagonagonista volna jelen. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösnek tekintjük, ha a válasz-reakcióút stimuláltságában bekövetkező csökkenés egyenlő vagy nagyobb annál, mint amit a des-His1-glukagon vált ki. Az adenilát-cikláz aktivitásának meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásokat végrehajthatjuk például Lin és munkatársai módszerének alkalmazásával [Biochem 14, 1559 (1974)], valamint a példákban leírt eljárások végrehajtásával. Ezek szerint az eljárások szerint mérjük a cAMP-szint stimuláltságát, a natív glukagon által kiváltott szinthez viszonyítva és általában úgy járunk el, hogy biológiailag aktív rekombináns glukagonreceptort expresszáló sejtekből előállított készítményt glukagonból és a vizsgált vegyületből álló keverékkel érintkeztetünk, radioaktívan jelölt ATP jelenlétében.
A cAMP termelődését mérhetjük a technika állása szerint közismert eljárások alkalmazásával, ilyenek például a Salomon és munkatársai által leírt eljárások [Anal. Biochem. 58, 541 (1976)], valamit Krishna és munkatársai eljárásai [J. Pharmacol. Exp. Ther. 163, 379 (1968)], de előnyösen alkalmazhatunk kereskedelmi forgalomban beszerezhető reakciókészleteket is, mint például az Amersham Corp. által forgalmazott „Scintillation Proximitry Assay Kit” alkalmazásával. A „Scintillation Proximitry Assay Kit” alkalmazásával oly módon határozhatjuk meg a cAMP-termelődés mértékét, hogy mérjük a termelődött cAMP, valamint jóddal jelölt cAMP anti-cAMP-ellenanyagokhoz való kötődésének kompetícióját. Az ilyen vizsgálati eljárásokban a különösen előnyösen glukagonreceptorok biológiai aktivitása: ED5O<1 nmol/1 (ED50=az 50%-os erősségű válasz kiváltásához szükséges koncentráció), még előnyösebben az ED50<0,7 nmol/1, és legelőnyösebben EDS0<0,25 nmol/1.
A talámány egy további megvalósítási módja szerint a válasz-reakcióút magában foglal egy luciferáz enzimen alapuló jelzőrendszert. Röviden, a luciferáz olyan enzim, amely fotonok felszabadulását katalizálja luciferinből kiindulva, és ily módon ennek az enzimnek a jelenléte luciferin alkalmazásával könnyen kimutatható [Álam és Cook: Anal. Biochem. 188, 245 (1990)]. Amint azt a későbbiekben részletesen ki fogjuk fejteni, a találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint egy cAMP-reszponzív szekvenciaelemet például a proenkefalin cAMP reszponzív elemét - tartalmazó DNS-konstrukciót állítunk elő, és ezt a DNSkonstrukciót funkcionálisan luciferáz-cDNS-hez kapcsoljuk. Ezután a luciferáz-cDNS-t is tartalmazó DNSkonstrukciót stabilan valamely gazdasejtbe transzfektáljuk. A gazdasejtet ezután egy második DNS-konstrukcióval transzfektáljuk, mely konstrukció tartalmaz egy glukagonreceptort kódoló első DNS-szegmenst, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva további DNS-szegmensekhez, melyek szükségesek a receptor expressziójához. Amennyiben az ily módon transzfektált gazdasejthez glukagonreceptor-agonista kötődik, a megemelkedett cAMP-szint luciferázexpressziót indukál. Az expresszálódott luciferázt ezután luciferinnel érintkeztetjük, és a luciferin luciferáz által történő oxidációja során felszabaduló fotonokat detektáljuk.
A találmány más megvalósítási módjai szerint a válasz-reakcióút aktiválásának eredménye a szabad kalcium koncentrációjának intracellurális növekedése lesz. Az intracellurális szabad kalciumkoncentrációt több különböző vizsgálati eljárás alkalmazásával meghatározhatjuk, például a Charest és munkatársai által leírt „calcium fluor QuinZ”-eljárás alkalmazásával [J. Bioi. Chem. 259, 8769 (1983)], vagy a Nakajima-Shimada által leírt aqorinfotoproteint alkalmazó eljárás végrehajtásával [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6878 (1991)]. Különösen előnyös eljárás a 6. példában részletesen leírt intracellurális kalciumszint meghatározására alkalmas fotoleképezéses eljárás. Röviden, a találmány egy
HU 219 674 Β megvalósítási módja szerint sejteket transzformálunk glukagonreceptort expresszáltató plazmiddal, és szokásos tenyésztési körülmények között a sejteket három napig tenyésztjük. A táptalajt ezután eltávolítjuk a sejtekről, és helyette 10 pmol/l füra-2AM-et tartalmazó oldatot helyezünk a sejtekre [Grynkiewicz és munkatársai:
J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985)]. A sejteket ezután 30 percig sötétben állni hagyjuk, ezután a sejteket megmossuk, majd ismételten 30-120 percig állni hagyjuk őket. A fotoleképezést elvégezhetjük egy „Nikon Diaphot” invertált fluoreszcenciamikroszkóp alkalmazásával, amely higanylámpával („mercury arcl48) van felszerelve. A sejteket ezután legalább 60 másodpercig mérjük alapvonal felvétele céljából, majd glukagontartalmú pufferrel stimuláljuk őket. A fotoleképezést általában a stimulációt követően legalább 3 percig végezzük. A felvett képeket például az „Inovision” (Research Triangle Park, N. C.) szoftverének alkalmazásával dolgozhatjuk fel és értékelhetjük ki.
Az azonosított glukagonantagonistákat a fent leírtak szerint ioncserélő és megoszlási kromatográfiával tisztíthatjuk, például Coy és munkatársai eljárása szerint [„Peptides Structure md Function”, Pierce Chemical Company, Rockford IL., 369. oldal (1983)], de alkalmazhatunk reverz fázisú kromatográfíát [Andreu és Merrifield: Eur. J. Biochem. 164, (1987)] vagy HPLCeljárást is [Kofod és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 32, 436 (1988)]. További tisztításként alkalmazhatunk hagyományos kémiai tisztítási eljárásokat, például folyadékkromatográfíát, gradienscentrifugálást, és gélelektroforézist, valamint egyéb eljárásokat. A különböző fehérjetisztítási eljárások a technika állása szerint jól ismertek [összefoglaló mű: Scopes, R.: „Protein Purification”, Springer Verlag, NY (1982)], és a találmány szerinti rekombináns glukagonantagonistákat a technika állása szerint ismert eljárásokkal tisztíthatjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a találmány szerinti glukagonantagonistákat Bárány és Merrifield szilárd fázisú szintézise alapján megszintetizáljuk [„The Peptides”, 2A kötet, szerkesztő: Gross és Meienhofer, Academic Press, NY, 1-284 (1979)], a szintézishez alkalmazhatunk automatikus peptidszintetizátort is.
A lényegében tiszta rekombináns glukagonantagonisták előnyösen legalább körülbelül 50%-ban homogének, előnyösebben legalább 70-80%-ban homogének, és legelőnyösebben 95-99%-ban vagy még inkább homogének, különösen a gyógyászati célra alkalmas készítmények. A találmány szerinti glukagonantagonisták megfelelő mértékben vagy homogenitásig tisztítva alkalmasak terápiás felhasználásra is. A glukagonantagonistákat általában parenterálisan vagy infúzióban alkalmazzuk. A készítményekben a glukagonantagonisták általában szabad bázisként vagy savakkal képzett só formájában fordulnak elő. Az antagonisták megfelelő sói gyögyászatilag elfogadhatók. Példaként megemlítjük a fémsókat, az alkáli- és alkáliföldfémsókat, mint például a kálium- vagy nátriumsókat. További gyögyászatilag elfogadható sók például: a citromsavval, borostyánkősavval, tejsavval, sósavval és hidrogén-bromiddal képezett sók. A parenterális készítményeket izotóniás vizes oldatok formájában szerelhetjük ki, melyek pH-értéke 5,6 és 7,4 közötti. Alkalmas izotóniás oldatok többek között: a NaCl, a dextróz, a bórsav-nátrium-tartarát, valamint a propilénglikol-oldatok. Az antagonistákat tartalmazó terápiás készítmények egyidejűleg alkalmazhatók az inzulinnal, a hatóanyagok egy készítményben is jelen lehetnek, de adagolhatjuk őket külön készítmények formájában is.
A glukagonreceptor-géneket kimutató hibridizációs próbák diagnosztikai alkalmazása
A találmány tárgyát képezik továbbá a glukagonreceptorok detektálására alkalmas hibridizációs próbák és láncindító oligonukleotidok. A találmány tárgyát képezik a glukagonreceptor-DNS-sel vagy -RNS-sel hibridizálódni képes hibridizációs próbák. A leírásban használt értelemben egy hibridizációs próba akkor „képes hibridizálódni” a glukagonreceptor-DNS-hez, ha a próba akár nagyon sztringens, akár kevéssé sztringens körülmények között képes hibridizálódni a DNS-hez (Sambrook és munkatársai: fent). A találmány szerinti hibridizációs próbát előnyösen a következő körülmények között alkalmazzuk: 6xSSC-oldat, lxDenhardtoldat (Sambrook és munkatársai: fent), 0,1% SDS, 65 °C, és végrehajtunk legalább egy mosási lépést a feleslegben lévő hibridizációs próba eltávolítására, a következő körülmények között: 2 χ SSC, 1 χ Denhardtoldat, 0,1% SDS, 65 °C. A hibridizációs próbák szekvenciáját előnyösen úgy tervezzük, hogy képesek legyenek a glukagonreceptor-szekvenciákkal hibrizálódni, de ne hibridizálódjanak a szekretin, a kalcitonin vagy a paratioid hormonreceptorát kódoló szekvenciákkal.
A találmány szerinti hibridizációs próbák lehetnek mind dezoxiribonukleinsav (DNS), mind pedig ribonukleinsav (RNS) hibridizációs próbák, és lehetnek mindössze 12 nukleotid hosszúságúak, általában azonban 14-18 nukleotid hosszúságúak, de lehetnek olyan hosszúak is, mint a teljes glukagonreceptort kódoló szekvencia. A próba méretének megválasztása bizonyos mértékig függ attól, hogy milyen célra kívánjuk használni az illető hibridizációs próbát. Ha például meg kívánjuk határozni, hogy egy vizsgált alanyban a glukagonreceptor polimorfikus formái közül melyik van jelen, előnyös a glukagonreceptort kódoló szekvencia teljes hosszával lényegében megegyező hosszúságú hibridizációs próbát alkalmazni. A glukagonreceptort detektáló' hibridizációs próbák alkalmasak a glukagonreceptor-gén polimorfizmusának azonosítására [Weber: Genomics 7, 524 (1990); Weber és May: Amer. J. Hűm.: Gén. 44, 388 (1989)]. Az ilyen polimorfizmusok összefüggésben lehetnek bizonyos öröklött betegségekkel, mint például a diabétesz.
A hibridizációs próbákat előállíthatjuk és megjelölhetjük a technika állása szerint közismert eljárások alkalmazásával. A rövidebb próbák, például a 12 bázishosszúságú próbák előállíthatok szintetikus úton. A hosszabb hibridizációs próbákat, melyek körülbelül 75-1500 bázist tartalmaznak, előnyösen például PCRamplifikáció útján állítjuk elő, jelzett prekurzorok jelenlétében, mint például 32P-dCTP, digoxigenin-dUTP, vagy biotin-dATP. Az 1500 bázisnál hosszabb hibridi14
HU 219 674 Β zációs próbákat általában legkönnyebben úgy amplifikálhatjuk, hogy egy sejtet olyan plazmiddal transzfektálunk, amely tartalmazza a megfelelő hibridizációs próbaszekvenciát, majd a transzfektált sejtet nagy mennyiségben növesztjük, és a megfelelő próbaszekvenciát izoláljuk a sejtekből (Sambrook és munkatársai: fent).
A hibridizációs próbákat megjelölhetjük különböző jelzőanyagok alkalmazásával, például radioaktív, fluoreszcens, enzimatikus, valamint kromogén jelzőanyagok alkalmazásával. Hibridizációs próbák jelölésére különösen alkalmas a 32P izotóp.
A találmány szerinti hibridizációs próbák alkalmasak egy vizsgált mintában a glukagonreceptort kódoló mRNS vagy DNS jelenlétének kimutatására. Mihdazáltal amennyiben a glukagonreceptorokat kódoló szekvenciák csak kis mennyiségben vannak jelen, vagy amennyiben arra van szükség, hogy egy csekély mértékben jelen lévő kiválasztott mutáns szekvenciát detektáljunk, vagy amennyiben kívánatos, hogy a glukagonreceptort kódoló gént valamely kiválasztott meleg vérű állatból megklónozzuk, előnyös lehet a kívánt szekvencia amplifikációja, mert az amplifikált szekvenciát azután könnyebben detektálhatjuk, vagy izolálhatjuk.
Egy kiválasztott szekvenciát különböző módszerek alkalmazásával amplifikálhatunk, alkalmazhatunk például RNS-amplifikációt [Lizardi és munkatársai: Bio/Technology 6, 1197 (1988); Kramer és munkatársai: Natúré 339, 401 (1989); Lomeli és munkatársai: Clinical Chem. 35 (9), 1826 (1989); 4.786.600 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], valamint DNS-amplifikációt, polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával (4.683.195; 4.683.202 és 4.800.159; valamint a 4.876.187 és 5.011.769 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, melyek egy, az előbbiektől eltérő detekciós/amplifikációs rendszert tárnak fel, amely elhasítható kötések alkalmazásán alapul).
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint PC-amplifikációt alkalmazunk a glukagonreceptort kódoló DNS kimutatására vagy kinyerésére. Röviden, ahogy azt az alábbiakban részletesen ismertetjük, a DNS-mintát 95 °C-on denaturáljuk, egyszálú DNS előállítása céljából. Ezután az alábbiakban részletezett módon specifikus láncindító molekulákat hibridizálunk a denaturált DNS-hez, 37-70 °C-on, az alkalmazandó hibridizációs hőmérsékletet a láncindító oligonukleotidok AT/GC aránya határozza meg. A láncindító molekulákat 72 °C-on Taq-polimeráz jelenlétében meghosszabbítjuk, és ily módon előállítjuk a templáttal ellentétes értelmű (antiszensz) szálat. Az eddig ismertetett lépések egy amplifikációs ciklust jelentenek, és ezeket a lépéseket a kiválasztott szekvencia amplifikálása céljából megismételjük.
A kiválasztott szekvencia amplifikálására olyan láncindító oligonukleotidokat alkalmazunk, melyek szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy azok nagymértékben specifikusak legyenek, és a célszekvenciával stabil duplexeket képezzenek. Az alkalmazott láncindító oligonukleotidok előnyösen nem tartalmaznak önmagukkal vagy a többi láncindítóval komplementer szekvenciákat, különösen a 3’-végükön nem, nem képesek önmagukkal vagy egyéb láncindítókkal dimereket létrehozni, és nem hoznak létre az amplifikálandó DNS egyéb régióival másodlagos szerkezeteket vagy duplexeket. Általában a 18-20 nukleotidhosszúságú láncindító oligonukleotidok az előnyösek, melyeket könnyen előállíthatunk a technika állása szerint közismert eljárások alkalmazásával. Az I. táblázatban különösen előnyös láncindító oligonukleotidokat mutatunk be, ilyenek többek között a ZC4715 és ZC4701 jelű degenerált oligonukleotidok (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 9 és 8), valamint a ZC4758- és ZC4778-oligonukleotidok (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 10 és 11).
A glukagonreceptorokat kódoló nukleotidszekvenciák további felhasználási lehetőségei
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan betegségek kezelésére alkalmas virális vektorok, mely betegségekre jellemző, hogy a glukagonreceptor (vagy egy mutáns glukagonreceptor) túlzott mértékben expresszálódik, vagy amely betegségek esetén glukagonreceptor egyáltalán nem expresszálódik. Röviden, a találmány tárgyát képezik olyan virális vektorok, melyek képesek antiszensz glukagonreceptor-RNS termelődését előidézni, és ily módon gátolni a glukagonreceptorok túltermelődését vagy a mutáns glukagonreceptorok termelődését. A találmány tárgyát képezik olyan virális vektorok is, melyek képesek megvalósítani a glukagonreceptorcDNS expresszi óját. A találmány szerinti megoldás kivitelezéséhez alkalmazható virális vektorok többek között: a rekombináns vacciniavektorok (4.603.112 és 4.769.330 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), a rekombináns poxvírus eredetű vektorok (WO 89/01973 számon közzétett PCT szabadalmi bejelentés), valamint előnyösen a rekombináns retrovirális vektorok (WO 90/02806; WO 89/07150 és WO 103451 számú PCT-közzétételi iratok).
Amint azt már említettük, a találmány szerinti virális vektorok alkalmasak olyan rendellenes állapotok kezelésére, melyekben vagy túltermelődik a glukagonreceptor, vagy valamilyen mutáns glukagonreceptor termelődik, vagy amelyekben glukagonreceptor egyáltalán nem expresszálódik.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal kívánjuk tovább szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa cDNS-szintézis cDNS-könyvtárak előállítása
A) Patkánymájból származó cDNS előállítása
Eltávolítottuk 30 g nőstény Sprague-Dawley-patkányok (Simonsan Labs, Gilroy, CA.) májait, és azokat azonnal folyékony nitrogénbe helyeztük. A májszövetből a guanidium-izotiocianát alkalmazásán és CsClcentrifúgáláson alapuló eljárás [Chirgwin és munkatársai: Biochemistry 18, 52 (1979)] alkalmazásával összRNS-t izoláltunk. Az izolált RNS-preparátumból oligon-d(T)-cellulóz-kromatográfia alkalmazásával [Aviv és Leder: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)] poli(A)+-RNS-t izoláltunk.
Az első cDNS-szálat kétszeresen poli-d(T)-szelektált májeredetű poli(A)+-RNS-t templátként alkalmaz15
HU 219 674 Β va szintetizáltuk. 10 μΐ 10 pg máj-poli(A)+-RNS-t tartalmazó oldatot összekevertünk 2 pl 20 pmol/μΐ koncentrációjú első szál láncindítóval (ZC3747, szekvenciaazonosító szám: 7), valamint 4 μΐ dietil-pirokarbonáttal kezelt vízzel. A reakcióelegyet 4 percig 65 °C-on melegítettük, majd jégen lehűtöttük.
Az első cDNS-lánc szintézisét oly módon indítottuk, hogy az RNS-láncindító oligonukleotid-keverékhez hozzáadtunk 8 μΐ 5 χ SUPERSCRIPT-puffert (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 4 μΐ 100 mmol/1 koncentrációjú ditiotreitol-oldatot, valamint 2,0 μΐ dezoxinukleotid-trifoszfát-oldatot, amely a következő összetevőket tartalmazza: dATP, dGTP, dTTP, valamennyiből 10 mmol/1, valamint 5-metil-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N. J.). A reakcióelegyet ezután 42 °C-on 3 percig inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyhez 6,0 μΐ 200 E/μΙ SUPERSCRIPT reverz transzkriptázt (GIBCO BRL) adtunk. Az első szál szintézisének hatékonyságát úgy ellenőriztük, hogy egy párhuzamos kísérletben a reakcióelegyből kivett 10 pl mintához 10 pCi 32P-adCTP-t adtunk, és ily módon a reakciótermékeket radioaktívan megjelöltük. A reakcióelegyeket, melyekben az első szál szintézise történt 45 percig 45 °C-on inkubáltuk, amit 15 perces 50 °C-os inkubálás követett. A reakciókat oly módon állítottuk le, hogy a reakcióelegyhez 100 μΐ végtérfogatig vizet adtunk, és ezután két fenol/kloroformos (1:1), valamint egy kloroform/izoamil-alkoholos (24:1) extrakciót hajtottunk végre. A be nem épült nukleotidokat oly módon távolítottuk el a reakcióelegyből, hogy a cDNS-t 6 pg glikogén mint hordozó, 2,5 mol/1 ammónium-acetát, valamint 2,5 térfogat etanol jelenlétében kétszer kicsaptuk. A jelöletlen cDNS-t 50 μΐ vízben felszuszpendáltuk, és a második szál szintéziséhez használtuk. Az első cDNS-szál hosszúságát úgy állapítottuk meg, hogy a jelzett cDNS-t 20 μΐ vízben feloldottuk, majd a cDNS méretét agarózgélben végzett elektroforézis útján határoztuk meg.
A második szál szintézisét az első szál szintézisével előállított RNS-DNS-hibridből kiindulva olyan körülmények között végeztük, melyek elősegítették, hogy a második szál szintéziséhez az első szál szolgáljon láncindítóként oly módon, hogy hajtű alakú DNS-szerkezetek keletkezzenek.
A következő összetételű reakcióelegyet állítottuk elő: 20,0 μΐ 5xpolimeráz-1-puffer [100 mmol/1 Tris, pH=7,4,500 mmol/1 KC1,25 mmol/1 MgCl2, 50 mmol/1 (NH4)2SO4], 4,0 μΐ 100 mmol/1 ditiotreitol-oldat, 1,0 μΐ dezoxinukleotid-trifoszfát-oldat, amely valamennyi dezoxinukleotid-trifoszfátra nézve 10 mmol/1 koncentrációjú volt, 3,0 μΐ β-NAD, 15,0 μΐ 3 Ε/μ1 E. coli DNSligáz (NBL Enzymes Ltd., Cramlington, Northumbria, England), 5,0 μΐ 10 Ε/μ1 E. coli DNS-polimeráz-1 (GIBCO BRL), valamint 50,0 μΐ jelöletlen első DNSszál. A második szál szintézisének hatékonyságát úgy ellenőriztük, hogy a második szál szintézisére alkalmas reakcióelegyből 10 μΐ mintát vettünk, és ezt megjelöltük 10 pCi 32P-adCTP hozzáadásával. A reakcióelegyet ezután 4 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd a reakcióelegyhez 1,5 μΐ 2 Ε/μΙ-es RNáz-H-t (GIBCO
BRL). A reakcióelegyet ezután 15 cl-es RNáz-H-t (GIBCO BRL). A reakcióelegyet ezután 15 °C-on két óráig állni hagytuk, majd 15 perces szobahőmérsékleten végzett inkubálás következett. A reakciót 4 μΐ 500 mmol/l-es EDTA-oldat hozzáadásával állítottuk le, majd ezt követően fenol/kloroformos, valamint kloroform/lizoamil-alkoholos extrakciókat hajtottunk végre, a fent leírtak szerint. Ezután a reakcióelegyből a DNS-t
2,5 mol/1 ammónium-acetát jelenlétében etanollal kicsaptuk. A jelöletlen reakcióban keletkezett DNS-t 50 μΐ vízben feloldottuk. A jelölt DNS-t a fent leírtak szerint feloldottuk és elektroforézisnek vetettük alá.
A hajtűszerkezetű egyszálú DNS-t mung bean nukleáz alkalmazásával elhasítottuk. A reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta: 10 μΐ lOxwiwng bean nukleáz puffer (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Califomia), 4 μΐ 200 mmol/l-es ditiotreitol-oldat, 34 μΐ víz, 50 μΐ kétszálú cDNS-t tartalmazó oldat, valamint 2 μΐ 10X-szeresre hígított mung bean nukleáz (Promega Corporation, Madison, Wis.) „Stratagene MB” hígítópufferben hígítva (Stratagene Cloning Systems). A reakcióelegyet 37 °C-on 15 percig állni hagytuk, majd a reakciót 20 μΐ pH=8,0 Tris-HCl-puffer hozzáadása után végrehajtott fenol/kloroformos, majd kloroform/lizoamil-alkoholos extrakciókkal állítottuk le, a fent leírtak szerint. Az extrakciókat követően a DNS-t etanollal kicsaptuk, majd vízben újra feloldottuk. Az újrafeloldott cDNS-t T4 DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk. A cDNS-t, melyet 192 μΐ vízben oldottunk fel, összekevertük 50 μΐ 5xT4 DNSpolimeráz-pufferrel (250 mmol/1 Tris-HCl, pH=8,0, 250 mmol/1 KC1, 25 mmol MgCl2), 3 μΐ 100 mmol/l-es ditriotreitol-oldattal, 3 μΐ valamennyi dezoxinukleotidtrifoszfátra nézve 10 mmol/l-es oldattal, valamint 2 μΐ 6,7 Ε/μ1 T4 DNS-polimerázzal (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). A reakcióelegyet 30 percig 15 °C-on állni hagytuk, majd a reakciót 2 μΐ 500 mmol/l-es EDTA-oldat hozzáadása után végzett fenol/kloroformos, majd kloroform/izoamil-alkoholos kicsapásokkal állítottuk le, a fent leírtak szerint. A DNS-t ezután etanollal kicsaptuk, és 30 μΐ vízben feloldottuk. A beépült 32P-dCTP mennyiségét figyelembe véve úgy becsültük, hogy 4 pg cDNS-t állítottunk elő, 10 pg mRNS-templátból kiindulva.
B) Patkánymáj-cDNS-könyvtár előállítása
A fentiek szerint előállított cDNS-hez EcoRI-adaptereket (Invitrogen, San Diego, Califomia) ligáltunk, a cDNS emlős expressziós vektorba történő klónozásának elősegítése céljából. Az előállított cDNS-ből 10 pl-t összekevertünk 800 pmol adapterrel (12 pl), majd az elegyhez a következő összetevőket adtuk: 4,0 pl lOxligázpuffer (Stratagene Cloning Systems), 4,0 pl 10 mmol/1 ATP, 6,0 pl víz, valamint 16 egység T4 DNS-ligáz (4,0 pl; Stratagene Cloning Systems). A reakcióelegyet 16 órán át állni hagytuk, mialatt 4 és 15 °C között hőmérséklet-gradienst alkalmaztunk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy az elegyhez hozzáadtunk 185 pl vizet, 25 pl „REACT 2”-puffert (GIBCO BRL), majd az elegyet 30-60 percig 65 °C-on állni hagytuk. A 65 °C-os inkubálást követően a reakcióele16
HU 219 674 Β gyet fenol/kloroformos, majd kloroform/izoamil-alkoholos extrakciónak vetettük alá, majd a DNS-t etanollal kicsaptuk, a fent leírtak szerint. A reakcióelegyet ezután lecentrifugáltuk, majd a DNS-csapadékot 70%-os etanollal mostuk és levegőn megszárítottuk. A csapadékot ezután 180 μΐ vízben oldottuk fel.
Abból a célból, hogy a cDNS megfelelő orientációban épüljön be az emlős expressziós vektorba, a cDNS-t Xhol-enzimmel megemésztettük, és ily módon olyan cDNS-t kaptunk, amely 5’-végén EcoRI ragadós véget, 3’-végén pedig Xhol ragadós véget tartalmazott. A cDNS 3’-végén az Xhol hasítási helyet a ZC3747 jelű láncindító oligonukleotid (szekvenciaazonosító szám: 7) alkalmazásával építettük be. A restrikciós emésztés fenol/kloroformos, majd kloroform/izoamil-alkoholos extrakciókkal állítottuk le. A cDNS-t ezután etanollal kicsaptuk, és a kapott csapadékot 70%-os etanollal mostuk, majd levegőn megszárítottuk. A csapadékot ezután lxfelvivőpufferben (10 mmol/l-es foszfátpuffer, pH=8,8, 5% glicerin, 0,125% brómfenolkék).
A pufferben felvett cDNS-t 10 percig 65 °C-on melegítettük, majd jégen lehűtöttük, és 0,9%-os alacsony olvadáspontú agarózgélben elektroforetizáltunk (Seaplaque GTG Low Melt Agarose, FMC Corp., Rockland, Me.), molekulatömeg-markerként a „BRL 1 kb” móltömeglétrát (GIBCO BRL), valamint a „Pharmacia 100 bp” móltömeglétrát (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) alkalmaztuk. A szennyeződésként jelen lévő adaptereket, valamint a 800 bp-nál kisebb méretű fragmenseket a gélből kivágtuk. Ezután az elektródák polaritását megváltoztattuk, és a cDNS-t tovább elektroforetizáltuk, míg a sáv elején összekoncentrálódott. Ezután a bekoncentrálódott DNS-t tartalmazó gélrészletet a gélből kivágtuk, mikrocentrifúgacsőbe helyeztük, és meghatároztuk a gélszelet közelítő térfogatát. Ezután a csőhöz a gélszelet térfogata felének megfelelő térfogatú TE-puffert adtunk, majd az agarózszeletet 65 °C-on 15 percig végzett melegítéssel megolvasztottuk. Ezután a reakcióelegy hőmérsékletét 42 °C-ra állítottuk be, majd körülbelül 5 egység β-agaráz-I enzimet (New England Biolaps, Beverly, Mass.) adtunk hozzá. A reakcióelegyet ezután az agaróz megemésztésének céljából 90 percig inkubáltuk. A reakcióelegyhez ezután 0,1 térfogat 3 mol/l-es nátrium-acetát-oldatot adtunk, és az elegyet 15 percig jégen hűtöttük. A reakcióelegyet ezután 15 percig 4 °C-on 14 000 g-vel centrifugáltuk, az emésztetlen agaróz eltávolítása céljából. Ezután a felülúszóban található cDNS-t etanollal kicsaptuk. A cDNS-t tartalmazó csapadékot 70%-os etanollal mostuk, levegőn megszárítottuk, majd 10 μΐ vízben feloldottuk.
A kapott cDNS-t a pZCEP jelű E. coli vektorba klónoztuk, amely vektor a pCDNAl jelű vektor (Invitrogen) származéka, melyet úgy lehet előállítani, hogy az Ml3 eredetű replikációs origót, valamint a SupF szelekciós markért a pUC18-plazmidból származó βlaktamáz expressziós egységre cseréljük. A pZCEPplazmidot EcoRI és Xhol enzimekkel végzett hasítással linearizáltuk, majd a linearizált plazmidot az EcoRI/XhoI emésztett cDNS-sel összeligáltuk. A ligálás eredményeként kapott plazmidokat a „CH10B
ELECTROMAX” elnevezésű (GIBCO BRL) E. coli sejtekbe juttattuk, elektroporáció útján.
C) cDNS előállítása humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből
Szigetsejteket izoláltunk humán pankreászokból, melyeket olyan transzplantációs donorokból nyertünk ki, melyekhez megfelelő recipiens nem volt elérhető. UW-oldattal (Du Pont, Boston, Mass.) végzett in situ perfúziót követően a pankreászokat óvatosan kihasítottuk, a pankreász kivezetőcsövét kannuláltuk, és infúzióban 4 mg/ml-es kollagenázoldatot („Type V”, Sigma, St. Louis, Mo.) juttattunk be, konstans folyási sebességgel, először 4 °C-on majd 39 °C-on. A mirigyet ezután kártolással feldaraboltuk, a lehasított darabokat centrifügálással mostuk, majd egyre szűkülő átmérőjű fecskendőtűkön passzíroztuk keresztül, majd a kapott apró darabokat lépcsős Ficoll sűrűséggradiens alkalmazásával centrifúgálással tisztítottuk [Wamock, Diabetes 35 (Suppl. 1) 136, (1989)]. A centrifúgálás után a centrifúgacsövek fölső-középső részéből kinyert anyagot összeöntöttük, és meghatároztuk a mennyiségét, miután a szigetek tisztaságát ditiazonfestéssel meghatároztuk. A cDNS-könyvtár előállításához alkalmas szigetek több mint 65%-ig tiszták voltak, a Northem-blotanalízishez használt szigetek pedig több mint 40%-ban tiszták voltak. Az átlagos szigetátmérő 175 μπι volt. Továbbá az izolált szigetek tömény glükózoldattal vagy izobutil-metil-xantin-oldattal (IBMX) végzett perfúzió után mind első, mind pedig második fázisú inzulinszekréciós funkcióval rendelkeztek.
A poly(A)+-RNS-frakciót a „FASTTRACK” (Invitrogen) mRNS-izoláló reagenskészlet alkalmazásával a gyártó utasításait betartva állítottuk elő. Röviden, 30 ezer izolált szigetet lízispufferben hirtelen lizáltattunk, a lizátumot csökkenő átmérőjű fecskendőtűk alkalmazásával elhomogenizáltuk, majd proteináz-K és RNasin enzimekkel emésztettük, majd az elegyből a poly(A)+-RNS-t oligo-d(T)-cellulóz-kromatográfía alkalmazásával izoláltuk. Az eluált frakciók koncentrációját és tisztaságát OD260/2g0-méréssel állapítottuk meg.
A humán hasnyálmirigyszigetekből izolált poly(A)+-RNS-ből körülbelül 2,5 pg-ot használtunk fel cDNS-könyvtár készítéshez, a „LIBRARIAN R II” cDNS-könyvtár-készítő reagenskészlet (Invitrogen), valamint DH10B ELECTROMAX jelű E. coli sejtek (GIBCO BRL) alkalmazásával, a gyártó utasítása szerint. Röviden, körülbelül 2,5 pg humán hasnyálmirigyszigetekből izolált poly(A)+-RNS-ből kiindulva kettős szálú cDNS-t készítettünk, majd a cDNS-hez nem palindrom jellegű BstXI-adaptereket (Invitrogen) ligáltunk. A cDNS-t méret szerint elválasztottuk, és a nem kötődött adaptereket agaróz-gélelektroforézissel és elektroelúcióval eltávolítottuk. A 600 bázispárnál hosszabb DNS-szálakat izoláltuk.
2. példa
A patkány-glukagonreceptort kódoló cDNS izolálása polimeráz-láncreakció alkalmazásával
A glukagonreceptor-szekvenciák amplifikálásához templátként patkánymáj-cDNS-t használtunk, a reak17
HU 219 674 Β ciót degenerált láncindító oligonukleotidok (ZC4715 és ZC4701; szekvenciaazonosító számok sorrendben:
és 8) alkalmazásával hajtottuk végre, melyek szekvenciája megfelelt a szekretin géncsalád egy-egy erősen konzervált régiójának. Az amplifíkációs reakciót 50 μΐ térfogatban hajtottuk végre, a reakcióelegy 5 ng templát-cDNS-t [l.A) példa] 100 pmol ZC4715 (szekvenciaazonosító szám: 9), valamint 100 pmol ZC4701 (szekvenciaazonosító szám: 8) láncindító oligonukleotidot; 0,25 mmol/1 dezoxinukleotid-trifoszfátot (valamennyi nukleotid-trifoszfátot; Cetus, Emeryville, CA); tízszeresre hígított lOxPromega-puffert (Promega Corp.); valamint 1,25 egység Taq-polimerázt (Promega) tartalmazott. A PCR-reakciót negyven ciklusban hajtottuk végre (egy perc 95 °C, egy perc 42 °C, valamint két perc 72 °C), majd a reakcióelegyet hét percig 72 °C-on inkubáltuk.
A keletkezett 650 bázispáros PCR-terméket gélelektroforézist követően izoláltuk, majd a pCRlOOO plazmidba ligáltuk (Stratagene Cloning Systems). A kapott plazmiddal E. coli XL-l-sejteket transzformáltunk. Egy kiválasztott transzformánsból plazmid DNS-t izoláltunk, és a plazmidot G13/pCRl000-nek neveztük el, majd meghatároztuk a plazmid bázissorrendjét (szekvenciaazonosító szám: 14). A meghatározott szekvenciából arra következtettünk, hogy a plazmidban található inzert a szekretinreceptorral rokon polipeptidet kódolt.
3. példa
Teljes hosszúságú patkány-glukagonreceptor-cDNS klónozása
Teljes hosszúságú glukagonreceptor-cDNS-t oly módon izoláltunk, hogy az l.B) példában leírt cDNSkönyvtárt glukagonkötési vizsgálati eljárás alkalmazásával átvizsgáltuk. A könyvtárat oly módon szélesztettük, hogy egymillió független klón álljon rendelkezésünkre. Az egyes tenyésztőlemezeken található transzformánsokat külön-külön 10-10 ml LB-Amp-oldatba (Sambrook és munkatársai: fent) kapartuk. A kapott sejtszuszpenzióból a sejteket centrifugálással kiülepítettük, majd a felülúszót elöntöttük. A sejteket tartalmazó üledéket ezután 4 ml LB-Amp-oldatban felszuszpendáltuk, amely 15% glicerint is tartalmazott, majd a kapott sejtszuszpenziót négy egyenlő részre osztottuk, és -80 °Con tároltuk. Az első glicerines törzsszuszpenzió titerét meghatároztuk, és 100 lemezre szélesztettük oly módon, hogy lemezenként 5000 kiónt kapjunk. Miután a kolóniák kinőttek, minden egyes lemezről a sejteket 1010 ml LB-Amp-oldatba kapartuk. Minden egyes ily módon kialakított sejtszuszpenzióból plazmid-DNS-izolálás céljából mintát vettünk. A maradék sejtszuszpenziókhoz 15% végkoncentrációban glicerint adtunk, majd a szuszpenziókat egyenlő részekre osztva lefagyasztottuk -80 °C-on. Minden egyes sejtszuszpenzióból vett mintából plazmid-DNS-t izoláltunk, és az izolált DNS-t RNázzal emésztettünk (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), a gyártó utasításai szerint. Az RNáz-reakciót fenol/kloroform/izoamil-alkoholos (24:24:1) extrakcióval állítottuk le, és a DNS-t etanollal kicsaptuk.
A különböző sejtszuszpenziókból származó plazmid-DNS-sel COS-7-sejteket (ATCC CRL 1651) transzfektáltunk, és a transzfektánsokat glukagonreceptor jelenlétére vizsgáltuk, egy 125I-glukagon megkötésén alapuló vizsgálati eljárás alkalmazásával. Röviden, a transzfekciót egy nappal megelőzően körülbelül 2 χ 105 COS-7-sejtet szélesztettünk steril egykamrás lemezekre (Nunc AS, Roskilde, Denmark), melyet előzőleg 10 mg/ml-es humán fibronektinoldat (1. táblázat) alkalmazásával „coatoltunk”, 30 percig, szobahőmérsékleten, majd foszfáttal puffereit sóoldattal mostuk (PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Minden egyes sejtszuszpenzióból származó DNS-preparátumból 2-2 pg-ot használtunk különböző lemezekre szélesztetett sejtek transzfektálására, lényegében McMahan és munkatársai eljárásának alkalmazásával [EMBO J.: 10, 2821 (1991); az idézett publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi]. A transzfekciót követően a sejteket 72 órán át növesztettük 37 °C-on 5%o-os CO2-atmoszférában.
1. táblázat Humán fibronektin
4g liofilizált humán plazmafibronektin-por (Alpha Therapeutic Corp., Los Angeles, Calif.)
50 ml 1 mmol/l-es NaPO4-oldat, pH=7,4 (mono- és dinátriumsó keveréke), 300 mmol/1 NaCl
A liofilizált port feloldjuk a pufferoldatban. Ezután az oldathoz 25% koncentrációig ammónum-szulfátot adunk, majd az oldatot csapadékképződés céljából két órán át 4 °C-on állni hagyjuk. A fibronektin-csapadékot egy asztali centrifugában (Beckman Instruments, Inc. Irvine, Calif.) 1000 fordulat/perccel 15 percig végzett centrifugálással kiülepítjük. A felülúszót elöntjük, majd az üledéket a fenti NaPO4-pufferoldat 10 ml-ében feloldjuk.
Az előállított fibronektinoldatot 16,9 ml végtérfogatban egy éjszakán át 11 fenti NaPO4-pufferoldattal szemben dializáljuk. A dializált anyagot ezután háromszorosra hígítjuk 1 mmol/l-es NaPO4-oldattal (pH=7,4), és ily módon 100 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó 1 mmol/l-es NaPO4-oldatot (pH=7,4) állítunk elő. A fibronektinoldatot ezután desztillált vízzel kétszeresre hígítjuk. Az oldhatatlan rostos csapadékot üvegbot alkalmazásával eltávolítjuk.
A fibronektinoldatot ezután FPLC-eljárásnak vetjük alá, 50 ml-es „DEAE FF Sepharose” oszlop alkalmazásával (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N. J.), melyet előzetesen a következő összetevőket tartalmazó oldat háromszoros térfogatával ekviribráltunk: 10 mmol Tris, pH=8,l 50 mmol/1 NaCl. Miután az oszlopot a fenti oldattal addig mossuk, míg stabil alapvonalat kapunk, a fibronektint sógradienssel eluáljuk, a gradiens végpontja: 10 mmol/1 Tris, pH=8,l, 300 mmol/1 NaCl. A frakciókat ezután összegyűjtjük és mintát veszünk belőlük, a mintákat akrilamid gélen elektroforetizáljuk, majd a géleket „Coomasie Blue” festéssel és Westem-blot-eljárással analizáljuk. A fehérjecsúcsot tartalmazó frakciókat összeöntjük, és a következő
HU 219 674 Β összetételű oldattal szemben dializáljuk: 10 mmol CAPS [3-(ciklohexil-amin)-l-propánszulfonsav, Sigma], pH=ll,0, 10 mmol/1 CaCl2, 150 mmol/1 NaCl. A kapott oldatot -80 °C-on tároljuk.
Abból a célból, hogy a transzfektánsokat a 125I-glukagon alkalmazásán alapuló vizsgálati eljáráshoz előkészítsük, az elhasználódott táptalajt a sejtekről eltávolítjuk, majd a sejteket háromszor hideg (4 °C-os) PBSoldattal mossuk. Az utolsó mosás után a sejtekre kötő táptalajt helyeztünk (2. táblázat), majd 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk őket. Ezután a táptalajt 0,5 ml 0,5 nmol/1 125I-glukagont (Amersham receptorminőség, specifikus aktivitás: 2000 Ci/mmol; Amersham) tartalmazó kötő táptalajra cseréltük. A sejteket ezután egy órán át 30 °C-on rázattuk. A táptalajt ezután eltávolítottuk a sejtekről, majd a sejtekhez glukagont nem tartalmazó hideg (4 °C-os) kötő táptalajt adtunk, majd a sejteket 5 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A táptalajt ezután eltávolítottuk a sejtekről, és a sejteket háromszor hideg (4 °C-os) PBS-oldattal mostuk. Az utolsó mosás után a sejteket 1 ml PBS-oldatban készített 2,5%-os glutáraldehidoldattal fixáltuk szobahőmérsékleten, 20 percen keresztül. A glutáraldehidoldatot ezután eltávolítottuk, és a sejteket háromszor mostuk PBS-oldattal. A lemezeket ezután levegőn megszárítottuk egy órán keresztül szobahőmérsékleten, majd fotoemulzióba mártottuk őket (Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y.), a gyártó utasításai szerint, majd a lemezeket szobahőmérsékleten legalább 30 percig sötétben szárítottuk. A lemezeket ezután 72 órán át 4 °C-on tartottuk fényt át nem eresztő fotókazettában. A glukagon kötésére képes sejteket 2,5-szeres nagyításnál világos hátterű megvilágítással detektáltuk. Az ismertetett eljárással sikerült azonosítanunk egy sejtszuszpenziót (az 57-es számút), amely tartalmazott glukagon megkötésére képes sejteket.
2. táblázat Kötő táptalaj
RMI1640 (Sigma), amely az alábbi összetevőket tartalmazza :
pg/ml bacitracin (Sigma) mmol/1 HEPES-puffer, pH=7,4 1% penicillin/sztreptomicin (Sigma) mmol/1 glutamin
E/ml aprotinin (Sigma)
1% marha-szérumalbumin, V frakció (Sigma) mol/l nátrium-bikarbonát
A nátrium-bikarbonátot 100 ml-es, kupakkal ellátható mérőlombikba töltjük, majd 80 ml desztillált vizet adunk hozzá. Az oldatot addig kevertetjük, míg a szilárd anyag feloldódik. Ezután az oldatot desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki. Az oldatot ismét összekeverjük és 4 °C-on tartjuk kupakkal ellátott üvegben. Nátrium-bikarbonát-oldat
Egy liter desztillált vízhez 1 ml 1 mol-os nátriumbikarbonát-oldatot adunk. Négy liter oldatot készítünk elő vagy úgy, hogy az oldatot előre elkészítjük és egy éjszakán keresztül hűtjük, vagy úgy, hogy az oldatot hűtött desztillált vízzel készítjük.
69%-os szacharózoldat 69 g szacharóz
A szacharózt 31 ml desztillált vízben oldjuk melegítés közben. Az oldat koncentrációját refraktométerben mérjük. Az oldathoz ezután vagy szilárd cukrot vagy vizet adunk, hogy koncentrációját 69±0,5%-ra beállítsuk. 42,3%-os szacharózoldat g szacharóz
A szacharózt 57 ml desztillált vízben oldjuk melegítés közben. Az oldat koncentrációját refraktométerben határozzuk meg. Az oldathoz ezután 69%-os szacharózoldatot vagy vizet adunk, és koncentrációját 42,3± 1%-ra állítjuk be.
x kötöpuffer
100 mmol/1 HEPES, pH=7,3
300 mmol/1 NaCl mmol EDTA
2% marha-szérumalbumin
1.6 mg/ml bacitracin Leképezőpuffer
140 mmol/1 NaCl 10 mmol/1 HEPES
5.6 mmol glükóz mmol KC1 mmol/1 MgSO4 mmol/1 CaCl2 Fura-2-AM-oldat mg Fura-2-ΑΜ (Molecular Probes) ml DMSO 5 ml leképezőpuffer ml Fura-2-AM-et feloldunk 50 ml DMSO-ban. A szilárd feloldódása után az oldatot 50 ml leképezőpufferrel összekeverjük.
Az 57-es számú sejtszuszpenzióból izolált plazmidDNS egy részletét a ZC4701 és a ZC4715 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 8 és 9) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával PCR-amplifikációnak vetettük alá. Az 50 μΐ térfogatú reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta: 200-400 ng 57-es számú sejtszuszpenzióból származó plazmid-DNS; 100 pmol ZC4601 és 100 pmol ZC4715 jelű láncindító oligonukleotid (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 8 és 9); 50 mmol/1 KC1; 10 mmol/1 Tris-HCl, pH=9,0 (20 °C-on); 1,5 mmol/1 MgCl2; 0,01% zselatin; 0,1% triton X-100; 0,2 mmol/1 valamennyi dezoxinukleotidtrifoszfátból (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), valamint egy egység Taq-polimeráz (Promega). A PCRreakciót 30 ciklusban végeztük (2 perc 95 °C, 2 perc 45 °C, 2 perc 72 °C), majd a reakcióelegyet 7 percig 72 °C-on inkubáltuk. A reakcióelegyet ezután 4 °C-on tároltuk. A PCR-termék gélelektroforézisével kimutattuk egy 700 bázispáros csík jelenlétét, melynek mérete közelítőleg megegyezett a 2. példában leírt termékkel.
Ezután meghatároztuk az 57-es számú sejtszuszpenzió titerét, majd a szuszpenzióból szélesztéssel 20 darab 500 kolóniát tartalmazó lemezt állítottunk elő. A különböző lemezeken található kiónokból egy-egy sejtszuszpenziót készítettünk, melyekből a fent leírtak sze19
HU 219 674 Β rint glicerines törzsoldatot és plazmid-DNS-t állítottunk elő. A plazmid-DNS-t COS-7-sejtekbe transzfektáltuk, majd a transzfektánsokat a glukagonkötődés kimutatásán alapuló vizsgálati eljárással analizáltuk. Ezzel az eljárással azonosítani tudtunk egy sejtszuszpenziót, az 57-18-as számút, amely tartalmazott glukagon megkötésére képes sejteket.
Az 57-18-as számú sejtszuszpenzióból izolált plazmid-DNS egy részletét PCR-amplifikációnak vetettük alá, a ZC4701 és a ZC4715 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 8 és 9) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, a fent leírtak szerint. A PCR-termék gélelektroforézises analízisével egy 700 bázispáros DNS-csík jelenlétét mutattuk ki, ami igazolta a glukagonreceptort kódoló DNS-szekvenciák jelenlétét. Az 57-18 jelű glicerines törzsoldat titerét ezután meghatároztuk, majd a szuszpenzióból szélesztéssel 6 darab 50-50 kiónt és 47 darab 20-20 kiónt tartalmazó lemezt állítottunk elő. A különböző tenyésztőlemezeken található klónokból sejtszuszpenziókat készítettünk, és a fent leírtak szerint glicerines törzsoldatokat és plazmidDNS-t állítottunk elő a szuszpenzióból. Minden egyes sejtszuszpenzióból készített plazmid-DNS egy részletével COS-7-sejteket transzfektáltunk, és a transzfektánsokat a fent leírt glukagon kötődésén alapuló vizsgálati eljárással szelektáltuk. Ezenfelül minden egyes sejtszuszpenzióból készített plazmid-DNS-ből mintát vettünk és azt PCR-amplifikációnak vetettük alá, a ZC4701 és a ZC4715 jelű láncindító oligonukleotidok alkalmazásával (szekvenciaazonosító számok sorrendben : 8 és 9), a fent leírtak szerint. Az ismertetett eljárással 4 pozitív sejtszuszpenziót azonosítottunk (57-18-16, 57-18-18, 57-18-36 és 57-18-48), mely szuszpenziók tartalmaztak olyan sejteket, melyek képesek voltak glukagon megkötésére, és a belőlük izolált plazmid-DNS-en végzett PCR-amplifikációval ki tudtuk mutatni a 700 bázispáros DNS-csík jelenlétét.
A cDNS izolálása céljából az 57-18 jelű sejtszuszpenziót két 150 mm átmérőjű lemezre szélesztettük, melyek mindegyike 250 kiónt tartalmazott. A lemezekről másolatot készítettünk, szűrőpapír alkalmazásával, lényegében Hanahan és Meselson [Gene: 10, 63 (1980)], valamint Sambrook és munkatársai (ugyanott) eljárásai alapján, az idézett publikációk teljes teijedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik. Az alkalmazott hibridizációs próbát az 57-es számú sejtszuszpenzióból izolált plazmid-DNS-en végrehajtott PCRamplifikációval állítottuk elő, a fent leírt láncindító oligonukleotidok és eljárások alkalmazásával. A PCRterméket alacsony olvadáspontú agarózgélből izoláltuk, és „random-priming” eljárással jelöltük a „MEGAPRIME” reagenskészlet alkalmazásával (Amersham, Arlington Heights, 111.), a gyártó utasításai szerint. A replikafiltereket a következő összetevőket tartalmazó oldatban hibridizáltuk: 6 χ SSC, 5 χ Denhardt-oldat, 5% SDS, 200 pg/ml ultrahangozott lazacsperma-DNS, valamint 2xl05 cpm/ml 32P-jelzett PCR-fragmens. A filtereket egy éjszakán át 65 °C-on hibridizáltuk. A fölöslegben maradt próbát ezután 1% SDS-t tartalmazó 2xSSC-oldattal végzett háromszoros mosással 65 °C-on eltávolítottuk. A filtereket ezután 4 órán át autoradiográfiás filmmel exponáltuk, -80 °C-on, két erősítőfólia alkalmazásával. Egy pozitív kiónt azonosítottunk, melyet pLJ4nek neveztünk el, és a plazmidon szekvenciaanalízist hajtottunk végre. A pLJ4 plazmidot E. coli transzformáns formájában 1992. augusztus 21-én letétbe helyeztük az „American Type Culture Collection”-nél (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852), ahol az 59056-os nyilvántartási számot kapta. A pLJ4 plazmid restrikciós endonukleázos vizsgálata, valamint a szekvenciaanalízis azt mutatta, hogy a plazmid egy körülbelül 2 kb hosszúságú inzertet tartalmaz, amely egy 485 aminosav hosszúságú fehéijét kódol, melynek számított molekulatömege 54 962 D. Az inzert nukleinsavszekvenciáját, valamint a fehéqe kikövetkeztetett aminosavsorrendjét a 14. és 15. azonosító számon adjuk meg. A Kyte és Doolittle [J. Mól. Bioi. 157, 132 (1982); az idézett publikáció teljes teijedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi] eljárásának alkalmazásával végzett hidropátiás analízis kimutatta, hogy a fehérje N-terminális részlete tartalmaz 8 különálló hidrofób aminosavakat tartalmazó egységet, és a fehérjében 7 transzmembrán dómén található (2. ábra). A kikövetkeztett aminosav további analízise kimutatta, hogy a fehérjében egy hosszú hidrofil szekvenciarészletben található 4 potenciális Nglikozilációs hely, és ugyanebben a régióban található 6 cisztein.
4. példa
A humán glukagonreceptor-cDNS izolálása polimerázláncreakciós amplifikáció alkalmazásával
A humán glukagonreceptor-szekvenciák amplifikálásához templátként humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből előállított cDNS-t [l.C) példa] használtunk, és láncindító oligonukleotidként a ZC4715 és a ZC4701 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 9 és 8) degenerált oligonukleotidokat alkalmaztuk. Az amplifikációs reakciót 50 pl térfogatban végeztük a következő összetételű reakcióelegyben: 5 ng templát-cDNS [l.C) példa]; 100 pmol ZC4715 jelű (szekvenciaazonosító szám: 9), valamint 100 pmol ZC4701 jelű (szekvenciaazonosító szám: 8) oligonukleotid; 0,25 mmol/1 valamennyi dezoxinukleotid-trifoszfátból (Cetus, Emeryville, Calif.); tízszeresen hígított tízszeres Promega-puffer (Promega), valamint 1,25 egység Taq-polimeráz (Promega). A PCR-reakciót negyven ciklusban végeztük (1 perc 95 °C, 1 perc 45 °C, 2 perc 72 °C), majd a reakcióelegyet 7 percig 72 °C-on állni hagytuk.
A PCR-reakció termékéből egy körülbelül 750 bázispáros amplifikált fragmenst gélelektroforézissel izoláltunk. Az izolált PCR-termék 1/10 részét egy következő PCR-reakcióban templátként használtuk föl, a ZC4758 jelű, valamint a ZC4778 jelű (szekvenciaazonosító számok: 10 és 11) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyek szekvenciáját úgy terveztük meg, hogy az alkalmazásukkal előállított PCR-termék 3’-végére egy BamH-1, 5’-végére pedig egy EcoRI restrikciós hasítóhely épüljön be, a szubklónozás megkönnyítése céljából. A reakciót 50 pl térfogatban a fent leírtak szerint hajtottuk végre. A PCR-reakciót negyven ciklusban
HU 219 674 Β végeztük (1 perc 95 °C, 1 perc 50 °C, 0,5 perc 72 °C), majd a reakcióelegyet 7 percig 72 °C-on állni hagytuk.
Humán glukagonreceptor-szekvenciákat hordozó transzformánsok izolálása céljából a transzformánsokban található DNS-inzerteket amplifikáltuk, a ZC447 és a ZC976 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 1 és 2) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyek univerzális pUC-szekvenáló láncindító oligonukleotidok, és a PCR-termék inzertet szegélyező pUCszekvenciákhoz hibridizálódtak. A 48 különböző transzformánsból izolált DNS-eket egyenként 25 μΐ térfogatban amplifikáltuk, a reakcióelegyek a következő összetevőket tartalmazták: mindkét oligonukleotidból 20 pmol; 0,125 mmol/1 valamennyi dezoxinukleotid-trifoszfátból (Cetus, Emeryville, Calif.); tízszeresen hígított lOxPromega-puffer (Promega); valamint 1,25 egység Taq-polimeráz (Promega). A PCR-reakciót harminc ciklusban hajtottuk végre (1 perc 95 °C, 1 perc 45 °C, 1,5 perc 72 °C), majd a reakcióelegyet 7 percig 72 °C-on állni hagytuk.
A PCR-termékeket ezután Southem-hibridizációs eljárással analizáltuk [Southern, J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975); és Sambrook és munkatársai: ugyanott; mely publikációk teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik]. Hibridizációs próbaként a pLJ4 plazmid „random priming” eljárás alkalmazásával megjelölt EcoRI/XhoI íragmensét alkalmaztuk, a jelöléshez az Amersham által forgalmazott „MEGAPRIME” reagenskészletet alkalmaztuk. Egy olyan kiónt találtunk, a G30 jelűt, amely hibridizálódott a teljes hosszúságú patkány-cDNS hibridizációs próbával. A G30 jelű klón szekvenciáját a 16. szekvenciaazonosító számon adjuk meg.
5. példa
Teljes hosszúságú humán glukagonreceptort kódoló cDNS klónozása
A humán glukagonreceptort kódoló cDNS-szekvenciákat tartalmazó könyvtárat oly módon azonosítottuk, hogy több különböző könyvtárat PCR-eljárással szűrővizsgálatnak vetettünk alá, a ZC5733 és ZC5432 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 13 és 12) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyek szekvenciáját a fent említett G30 jelű klón szekvenciája alapján terveztük. Kereskedelmi forgalomban beszerzett és saját előállítású májból, hasnyálmirigy-szigetsejtekből, HepG2 sejtekből, agyból, valamint placentából készített cDNS-könyvtárakat vizsgáltunk át (3. táblázat). A különböző könyvtárakból izolált DNS-eket templátként alkalmazva a PCR-reakciókat 50 μΐ térfogatban végeztük, a reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta: DNS-templát a 4. táblázatban megadott térfogatban; 20 pmol/μΐ ZC5433 és ZC5432 jelű (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 13 és 12) láncindító oligonukleotid; 0,25 mmol/1 valamennyi dezoxiribonukleotid-trifoszfátból; 5 μΐ 10 xTaq-1-puffer (Promega); 15 mmol/1 MgCl2; 19,5 μΐ desztillált víz; valamint 0,5 μΐ 5 E/μΙ Taq-l-polimeráz (Promega). Az elmondottakon felül végeztünk pozitív és negatív kontrollkísérleteket is, a pozitív kísérletben a pLJ4 plazmidDNS volt a templát, a negatív kontrollkísérletben nem volt DNS.
3. táblázat
Génkönyvtárak és DNS-források
Könyvtár/DNS Forrás
NIH humán máj-cDNS R. Bertolloti (NIH, Bethesda, Md.)
Humán genomi #946203 Stratagene
Humán genomi #944201 Stratagene
Humán hasnyálmirigyszigetsejt-cDNS l.C) példa
Xgtll HEPG2 Hagen és munkatársai eljárása alapján előállítva (4.784.950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi)
Humán agy első szál cDNS Clontech
Humán placenta első szál cDNS Clontech
Humán máj első szál cDNS Clontech
4. táblázat Reakció-térfogatok
Könyvtár/DNS Térfogat (vízzel 15 μΐ-re hígítva)
NIH humán máj-cDNS 1 μΐ, 400 ng/pl-es törzsoldatból
Humán genomi #946203 15 μΐ fág-törzsoldat
Humán genomi #944201 15 μΐ fág-törzsoldat
Humán hasnyálmirigyszigetsejt-cDNS 1 μΐ, háromszorosra hígított 1,2 μΐ/ml-es törzsoldatból
Xgtll HEPG2 15 μΐ fág-törzsoldat
Humán agy első szál cDNS 1 μΐ, 10 ng/pl-cs törzsoldatból
Humán placenta első szál cDNS 1 μΐ, 10 ng^l-es törzsoldatból
Humán máj első szál cDNS 1 μΐ, 10 ng/ml-es törzsoldatból
A PCR-reakciókat 30 ciklusban végeztük (1 perc 94 °C, 1 perc 50 °C, 1,5 perc 72 °C), majd a reakcióelegyeket 10 percig 72 °C-on állni hagytuk. A PCRtermékeket agaróz-gélelektroforézissel analizáltuk. Csak az NIH-ből beszerzett májeredetű könyvtárból sikerült egy 320-410 bázispáros fragmenst amplifikálnunk, amely ffagmens azonos méretű volt a pLJ4-DNS-t tartalmazó pozitív kontrollreakcióban amplifikálódott fragmenssel.
HU 219 674 Β
A pcD2-plazmidba klónozott [Chen és Okayama, Mól. Cell. Bioi. 7, 2745 (1987)] humán májeredetű könyvtárat, melyet dr. Roger Bertollottitól (National Instituts of Health, Bethesda, Md.) szereztünk be, használtuk a teljes hosszúságú humán glukagonreceptort kódoló cDNS-klón izolálására. A könyvtárat oly módon szélesztettük, hogy egymillió független kiónt kapjunk. A különböző tenyésztőlemezeken található kolóniákat 10-10 ml LB-Amp (Sambrook és munkatársai: fent) oldatba kapartuk. A sejtszuszpenziót lecentrifügáltuk, és a táptalajt elöntöttük. A sejteket tartalmazó üledékeket 4 ml 15% glicerint tartalmazó LB-Amp-oldatban felszuszpendáltuk, és a szuszpenziót négy egyenlő részre osztottuk, és az alikvotokat -80 °C-on tároltuk. Az egyik glicerines törzsoldat titerét meghatároztuk, majd a sejtszuszpenziót oly módon szélesztettük, hogy száz, egyenként 5000 kolóniát tartalmazó lemezt kapjunk. Miután a kolóniák felnövekedtek, minden egyes lemezről a sejteket 10-10 ml LB-Amp-oldatba kapartuk. Minden sejtszuszpenzióból mintát vettünk plazmid-DNS izolálása céljára. A sejtszuszpenzió maradékához 15% végkoncentrációig glicerint adtunk, egyenlő részekre osztottuk a szuszpenziókat, és -80 °C-on lefagyasztottuk őket. Minden egyes sejtszuszpenzióból plazmidDNS-t izoláltunk, és az izolált DNS-t RNázzal megemésztettük (Boehringer Mannheim, Indianapolis, In.) a gyártó utasításai szerint. Az RNáz-reakciót fenol/klorofom/izoamil-alkoholos (24:24:1) extrakcióval állítottuk le, és a DNS-t etanollal kicsaptuk.
A különböző sejtszuszpenziókból izolált plazmidDNS-ekből egyenlő térfogatot tízes csoportonként összekevertünk (például 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, stb.). A plazmid-DNS-t tartalmazó oldatot hússzorosára hígítottuk, és minden egyes DNS-keverékből 1 μΐ-t használtunk PCR-reakció templátjaként, a reakcióelegy összetétele megegyezett a fent leírt összetétellel. A PCR-reakciót a fent leírt körülmények között hajtottuk végre. A PCR-termékek agaróz-gélelektroforézises analízise azt mutatta, hogy a 31-40. sejtszuszpenzióból izolált plazmid-DNS-ek keverékét tartalmazó DNStempláton a pozitív kontrollal azonos méretű 320-410 bázispáros fragmens amplifíkálódott.
Ezután az eredeti 31-40. számú sejtszuszpenziókból izolált plazmid-DNS-eket külön-külön huszadrészére hígítottuk, majd 1-1 μΐ DNS-t templátként használva a fentiekkel azonos körülmények között PCR-reakciókat végeztünk. A PCR-reakciókat minden tekintetben a fentiek szerint hajtottuk végre. A PCR-termékek agaróz-gélelektroforézises analízise alapján azt találtuk, hogy a 40. számú sejtszuszpenzióból izolált plazmidDNS-templáton egy körülbelül 310-420 bázispáros fragmens amplifíkálódott.
A plazmid-DNS-oldat koncentrációját körülbelül 70 ng/pl-nek becsültük oly módon, hogy tízszeresére hígított 40-es számú szuszpenzióból származó DNS-oldat 1 μΐ-ét agaróz-gélelektroforézisnek vetettük alá. A 40-es számú sejtszuszpenzióból izolált plazmid-DNS 70 ngját elektroporációval E. coli DHlOB-sejtekbe juttattuk. Az elektroporáció körülményei a következők voltak: 2,3 kV, 400 Ω, 25 pF. Az elektroporáció után a sejteket ml SOC-oldatban (Sambrook és munkatársai, fent) felszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióból négy különböző hígítást készítettünk: ΙΟ2-, 103- és 104-szeres hígításokat. A különböző hígításokból 100-100 μΐ-t négy-négy tenyésztőlemezre szélesztettünk. A százszorosán hígított szuszpenzió szélesztésével előállított lemezeken a kolóniák száma közelítőleg 10 000-10 000 volt, az ezerszeresen hígított szuszpenzió szélesztésével előállított lemezeken körülbelül 1000-1000 kolónia volt található. Két-két replikafilter-másolatot készítettünk mind a négy lemezről, melyekre az ezerszeresre hígított szuszpenziót szélesztettük, valamint az egyik olyan lemezről, amelyre a százszorosán hígított szuszpenziót szélesztettük. A lemezeket 1—5-ig számoztuk. A lemezekről készített egyik replikafiltert szilárd táptalajra helyeztük, és szemmel látható kolóniák kialakulásáig inkubáltuk őket. A kolóniákat ezután lekapartuk, és a sejtekből PCRamplifikáció céljára plazmid-DNS-t izoláltunk. Ezenfelül a további három lemezről, melyekre a százszorosán hígított szuszpenziót szélesztettük, a sejteket lekapartuk, és ezekből a sejtekből is plazmid-DNS-t állítottunk elő.
Az előzőekben fel nem használt replikafiltereket 65 °C-on végzett 12 órán át tartó rázatással 0,5% SDS-t tartalmazó 3 xSSC-oldatban előmostuk, a bakteriális törmelékek eltávolítása céljából.
A filtereket ezután Ullrich-pufferben [Ullrich, EMBO J. 3, 361 (1984)] egy éjszakán át 37 °C-on előhibridizáltuk, a puffer tartalmazott még 50% formamidot és 1% SDS-t is. A G30 klónból izolált DNS-oldatot, melyet előzőleg az Amersham által forgalmazott „MEGAPRIME” reagenskészlet alkalmazásával a gyártó utasításait figyelembe véve megjelöltünk, felforraltunk, majd 6xl05 cpm/ml végkoncentrációban hibridizációs oldathoz adtuk (Ullrich-puffer+50% formamid). A filtereket egy éjszakán át 37 °C-on rázatás közben inkubáltuk. Az éjszakán át végzett inkubálás után a hibridizációs próbát tartalmazó oldatot a filterekről eltávolítottuk, majd a filtereket 65 °C-on 5 percig mostuk 0,1% SDS-t tartalmazó 2 χ SSC-oldattal. Az első mosást követően a filtereket ugyanabban az oldatban ismételten mostuk 65 °C-on 15 percig, majd a filtereket az oldatban 5 percig szobahőmérsékleten rázattuk. Ez utóbbi mosási lépést még kétszer végrehajtottuk. A filtereket szobahőmérsékleten autoradiográfiás filmre leképeztük. A 2. számú lemezen, amelyre a 2. számú sejtszuszpenzió sejtjeit szélesztettük, azonosítottunk egy G30DNS-sel hibridizáló kiónt. Ezt a kiónt a lemezről fölvettük és újabb lemezre szélesztettük. Az így kapott független kiónok közül néhányból izolált plazmid DNS-t szekvenciaanalízisnek vettettünk alá. Az egyik kiónt, a 40-2-2 jelűt, további szekvencianalízisnek vetettünk alá, és letétbe helyeztük az „American Type Culture Collection”-nél (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852), 1992. augusztus 21-én, E. coli transzformáns formájában, és a klón a 69055 nyilvántartási számot kapta. A 40-2-2 jelű klón részleges DNS-szekvenciáját, valamint az abból kikövetkeztetett aminosavsorrendet a 17. és 18. szekvenciaazonosító számon adjuk meg.
Abból a célból, hogy igazoljuk, hogy a hibridizációval kimutatott szekvenciák valóban glukagonreceptort
HU 219 674 Β kódoló szekvenciák voltak; valamennyi plazmid-DNSpreparátumon (a replikafilterekról készített plazmidDNS-preparátumokon, valamint mind a három olyan lemezen található sejtekből készített plazmid-DNS-preparátumokon, melyekre a százszorosán hígított sejtszuszpenziókat szélesztettük) PCR-amplifikációs reakciókat hajtottunk végre. A plazmid-DNS-preparátumokat vízzel hússzorosra hígítottuk, és minden DNS-preparátumból 1 ml-t használtunk a PCR-reakció templátjaként, a PCR-reakciókat a fent leírtak szerint végeztük. A kapott PCR-termékek agaróz-gélelektroforézises analízise útján megállapítottuk, hogy a 2. számú sejtszuszpenzióból plazmid-DNS-templát, valamint a négy 10 000 kiónt tartalmazó sejtszuszpenzió közül háromból készített plazmid-DNS-templáton keletkezett 310-420 bázispáros amplifikált ffagmens. A 2. számú sejtszuszpenzióból - amelyik a 2. számú tenyésztőlemeznek felel meg - izolált DNS-templátról amplifikálódott PCR-fragmens jelenléte igazolta, hogy a sejtszuszpenzió tartalmaz olyan sejteket, melyekben glukagonreceptort kódoló DNS-szekvenciák találhatók.
F) A humán glukagonreceptor 5 ’-végi szekvenciájának klönozási stratégiája
A 40-2-2-klónban található parciális cDNS-szekvencia, valamint a teljes hosszúságú patkány-glukagonreceptor cDNS-szekvenciájának összehasonlító elemzése kimutatta, hogy a 40-2-2-klónból körülbelül 25 aminosavat kódoló N-terminális szekvencia hiányzik. A humán glukagonreceptor-cDNS 5’-végi szekvenciáját Frohman és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998 (1988)] eljárásának alkalmazásával - azt részben módosítva - izoláltuk. Röviden, előállítottunk egy láncindító oligonukleotidot, melynek szekvenciáját úgy terveztük meg, hogy a 40-2-2-klónban található kódolószekvencia 5’-végéhez közeli szekvenciával legyen képes hibridizálódni. Ezt a láncindítót egy G-farkazott humán májeredetű első szál cDNStempláthoz hibridizáltuk, és a láncindító oligonukleotidot az 5’-vég irányában meghosszabbítottuk Taq-1 DNS-polimeráz alkalmazásával. Ezután egy második poli-d(C) láncindítót hibridizáltunk a G-farkazott cDNS-templáthoz, ily módon lehetővé téve a PCR-reakció végrehajtását, az azt követő klónozási lépéseket, a szekvenálást, és a 40-2-2-klónban jelen levő kódolószekvenciához történő illesztést.
Három cDNS-templátot készítettünk. Az első templát kereskedelmi forgalomban hozzáférhető humán májeredetű első szál cDNS volt. A második és a harmadik cDNS-templátot úgy állítottuk elő, hogy kereskedelmi forgalomban hozzáférhető humán májeredetű mRNSről (Clontech) kiindulva első cDNS-szálat szintetizáltunk, vagy humán glukagonreceptor-szekvenciára specifikus láncindító oligonukleotid vagy pedig a hagyományos ,,oligo-d(T) priming” eljárás alkalmazásával.
A második cDNS-templátot humán májeredetű mRNS-ről kiindulva szintézissel állítottuk elő, a ZC5433 jelű oligonukleotid (szekvenciaazonosító szám: 13) alkalmazásával, mely láncindító oligonukleotid a humán glukagonreceptor kódolószekvenciájára specifikus. Következő összetételű reakcióelegyet állítottuk elő: 2 ml mg/ml-es humán máj eredetű mRNS-oldat, 8 ml 20 pmol/ml-es ZC5433-oldat (szekvenciaazonosító szám: 13), 0,5 pl 10 mmol/l-es Tris-puffer, pH=7,4, 0,1 mmol/1 EDTA, és a reakcióelegyet 7 percig 68 °C-on inkubáltuk, majd 2 percen keresztül jégen állni hagytuk. Ezután a reakcióelegyhez a következő összetevőket adtuk: 4 μΐ 5 χ „SUPERSCRIPT”-puffer (GIBCO BRL), 1 μΐ 200 mmol/l-es ditiotreitol-oldat, 1 μΐ valamennyi dNTP-re nézve 10 mmol/l-es oldat, 1 μΐ 0,25 pCi/pl a32P-dCTP, valamint 5 μΐ „SUPERSCRIPT” reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet egy órán át 45 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a reakcióelegyet 10 percig 50 °C-on inkubáltuk. A reakciót 80 μΐ ΤΕ-puffer hozzáadásával állítottuk le. Az RNS-t ezután 1 μΐ 0,5 mol/l-es EDTA-oldat, valamint 1 μΐ KOH hozzáadásával elhidrolizáltuk. A hidrolízist 5 percig 65 °C-on végeztük. A hidrolízist követően a mintát 0,1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 50 mmol/l-es KOH-oldattal 1 ml-re hígítottuk, majd a mintát „CENTRICON 100” koncentrátoron juttattuk keresztül (Amicon, Danvers, Mass.). Az oszlopot 1 ml 0,1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 50 mmol/l-es KOH-oldattal mostuk. A bekoncentrált cDNS-oldatot összegyűjtöttük, majd 0,5 térfogat 100 mmol/l-es HCl-oldattal semlegesítettük. A semlegesített cDNS-oldatból a DNS-t etanollal kicsaptuk, majd a csapadékot 26 μΐ desztillált vízben feloldottuk.
A harmadik cDNS-templátot humán májeredetű mRNS-ről történő szintézissel állítottuk elő, kereskedelmi forgalomban beszerzett oligo-d(T) láncindító alkalmazásával. A reakciót a következő reakcióelegyben hajtottuk végre: 2 μΐ 1 pg/ml-es humán májeredetű mRNS, 1 μΐ 1 pg/ml-es oligo-d(T)-18-oldat (New England, Biolabs, Beverly, Mass.), valamint 5 μΐ 10 mmol/l-es Trispuffer, pH=7,4 és 0,1 mmol/1 EDTA. A cDNS-szintézist a fent leírt körülmények között végeztük.
Az első cDNS-szálat ezután G-farkaztuk. A reakcióedények a következő összetevőket tartalmazták: 4 μΐ humán májeredetű első szál cDNS (QUICK CLONE; Clontech, Palo Alto, Calif.), 4 μΐ humán májeredetű első szál cDNS, melyet a ZC5433 jelű (szekvenciaazonosító szám: 13) láncindító oligonukleotid alkalmazásával állítottunk elő, vagy 4 μΐ humán májeredetű első szál cDNS, melyet az oligo-d(T) láncindító alkalmazásával állítottunk elő. A reakcióedény tartalmazott még 22 μΐ vizet, 8 μΐ 5xPromega-puffert (Promega), 4 μΐ 10 mmol/l-es dGTP-oldatot, valamint 2 μΐ 15 Ε/μΙ-es terminált transzferázoldatot, a reakciókat 30 percig 37 °Con inkubáltuk, majd 10 perces 65 °C-os inkubáció következett. A reakcióelegyeket ezután 90 μΐ-re hígítottuk, 10 mmol/1 Tris-puffert (pH=7,4) és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldattal, majd a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsaptuk.
A G-farkazott cDNS-ek második szálának szintézisét azonos módon hajtottuk vége. A cDNS-eket először 50 μΐ desztillált vízben feloldottuk. A cDNS-oldatokhoz ezután 100 pmol ZC4814 jelű (szekvenciaazonosító szám: 20) láncindító oligonukleotidot adtunk, 5 μΐ térfogatban. A cDNS-eket ezután hibridizáltuk a láncindító oligonukleotiddal a reakcióelegyek 5 perces 68 °C-os inkubálása útján, azután a reakcióelegyeket két percig jé23
HU 219 674 Β gén állni hagytuk. Miután a láncindító a cDNS-hez hibridizálódott, a reakcióelegyekhez 20 μΐ 5xpolimeráz-lpuffert adtunk (1. példa), valamint 1 μΐ 100 mmol/l-es ditriotreitol-oldatot, 2 μΐ valamennyi dNTP-re nézve 10 mmol/l-es oldatot, 2 μΐ 0,5 pCi/pl a32P-dCTP-oldatot, 1 μΐ 3 Ε/μΙ-es E. coli DNS-ligáz-oldatot (New England, Biolabs), 5 μΐ 7 Ε/μΙ-es DNS-polimeráz E. coli oldatot (Amersham). A reakcióelegyeket ezután 5 percig 22 °C-on inkubáltuk, majd 1,5 μΐ 2 Ε/μΙ-es RNáz-H-oldatot adtunk hozzájuk (GIBCO BRL), majd további inkubálás következett két órán át 16 °C-on. A reakciót a következő oldatok hozzáadásával állítottuk le: 200 μΐ 10 mmol/l-es Tris-puffer (pH=8,0), amely 1 mmol/1 EDTA-t is tartalmazott, 150 μΐ vízzel telített fenol, valamint 150 μΐ kloroform. A reakcióelegyet ezután összevortexeltük, majd a fázisok szétválasztása céljából 22 °C-on 3 percig centrifugáltuk. A vizes fázist kinyertük, majd az előzőek szerint ismételten fenol/kloroformos extrakciónak vetettük alá. A második fenol/kloroformos extrakció után a vizes fázist még egyszer kloroformmal extraháltuk. A vizes fázisban található cDNS-t 5 pg kagylóglikogén, 100 μΐ 8 mol/l-es ammóniumacetát, valamint 300 μΐ izopropanol hozzáadásával kicsaptuk. Ezzel a módszenei csak a nagyméretű nukleinsavak csapódnak ki, és a be nem épült oligonukleotid láncindítók a felülúszóban maradnak. A cDNS-csapadékot centrifugálással kiülepítettük, és az üledéket 70%-os etanollal mostuk, majd levegőn megszárítottuk. A cDNS-üledéket ezután 15 μΐ kétszer desztillált vízben feloldottuk.
A kettős szálú cDNS-eket ezután 5 párhuzamos kísérletben amplifikációnak vetettük alá, egyrészt a ZC4814 oligonukleotid (szekvenciaazonosító szám: 20) 5’-végével homológ oligonukleotid láncindító alkalmazásával, amely oligonukleotid a szubklónozás megkönnyítése céljából restrikciós hasítóhelyeket tartalmazott, másrészt pedig egy olyan oligonukleotid láncindítót alkalmaztunk, amely a 40-2-2-klónban található kódolószekvencia 5’-végére volt specifikus. A reakcióelegyek a következő összetevőket tartalmazták: 5 μΐ lOxTaq-l-puffer, 3 μΐ 25 mmol/l-es MgCl2-oldat, 5 μΐ valamennyi dNTP-re nézve 2,5 mmol/l-es oldat, 1 μΐ kettős szálú cDNS-oldat, valamint 0,5 μΐ Taql-polimeráz (Promega). A reakcióelegyekhez 50 μΐ végtérfogatig desztillált vizet adtunk. A reakcióelegyekben a cDNS-t 5 perces 98 °C-on inkubálással denaturáltuk, majd a reakcióelegyekhez adtunk 1-1 μΐ 10 pmol/ml-es ZC5624-oldatot (szekvenciaazonosító szám: 21), valamint 20 pmol/ml-es ZC4812-oldatot (szekvenciaazonosító szám: 19). Valamennyi reakcióelegy fölé 70 μΐ ásványi olajat rétegeztünk, melyet előzőleg 90 °C-on tartottunk. Az amplifikációs reakciókat 30 ciklusban végeztük (60 másodperc 95 °C, 40 másodperc 57 °C, 60 másodperc 72 °C), majd 7 perces 72 °C-on végzett láncnövesztés következett.
A PCR-termékeket agaróz-gélelektroforézissel vizsgáltuk, az amplifikálódott ffagmenseket a gélből izoláltuk, és pCRlOOO-plazmidba szubklónoztuk, a „TA” klónozóreagens-készlet (Invitrogen) alkalmazásával. Minden egyes ligálást követően három transzformáns kiónt választottunk ki, és a belőlük izolált plazmid-DNS inzerttartalmát vizsgáltuk oly módon, hogy külön-külön PCR-reakciókat hajtottunk végre olyan reakcióelegyekben, melyek templátként az illető kiónból izolált plazmid-DNS-t tartalmazták, láncindító oligonukleotidként pedig a ZC5624 (szekvenciaazonosító szám: 21), valamint a ZC4812 (szekvenciaazonosító szám: 19) oligonukleotidokat. A PCR-reakciókat a fent leírtak szerint végeztük; azzal az eltéréssel, hogy csak 30 amplifikációs ciklust hajtottunk végre. Mindegyik eredeti PCR-reakcióból származó 1-1 inzert pozitív kiónt DNS-szekvenciaanalízisnek vetettünk alá. A vizsgált kiónok közül kettő tartalmazta a humán glukagonreceptort kódoló szekvencia 5’-végét hibátlanul, és ezek közül az egyiket kiválasztottuk a humán glukagonreceptort kódoló szekvencia 5’-végi részletének izolálása céljára. A kiválasztott 9A jelű klónból izolált plazmidDNS-t EcoRI és KpnI enzimekkel emésztettük, és így egy 551 bázispáros fragmenst kaphatunk, amely tartalmazta a glukagonreceptort tartalmazó szekvencia 5’végi részletét. A glukagonreceptort kódoló szekvencia 3’-végi részletét a 40-2-2-klónból izolált plazmidDNS-ből nyertük ki, egy 561 bázispáros Kpn-BamHIfragmens formájában. Az előzőek szerint izolált EcoRI/Kpn fragmenst összeligáltuk az 561 bázispáros KpnI/BamHI fragmenssel, a konkatamerizáció megakadályozása céljából EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázok jelenlétében. A ligálás eredményeként kapott 1112 bázispáros fragmenst gélből izoláltuk, és 9Al-fragmensnek neveztük el. Kényelmi szempontokból a 9A1-fragmenst EcoRI/BamHI emésztett pUC 18-vektorba ligáltuk. A ligációs elegyet E. coli DH lOb-sejtekbe transzformáltuk, és kiválasztott ki ónokat megvizsgáltunk az inzert jelenlétére vonatkozóan. A vizsgált kiónok közül egy, a 9A11 jelű tartalmazta az inzertet.
A glukagonreceptort kódoló szekvenciát beépítettük egy emlős expressziós vektorba, a p9All-plazmid, valamint a 40-2-2-klónból izolált plazmid felhasználásával, és ily módon az expressziós vektorba a teljes glukagonreceptort kódoló szekvenciát építettük be. A p9All-plazmidot PvuII és BamHI enzimekkel emésztettük, és izoláltuk a 967 bázispáros fragmenst. A 40-2-2-klónból izolált plazmidot BamHI és SacI enzimekkel emésztettük és izoláltuk a 828 bázispáros fragmenst, amely a humán glukagonreceptort kódoló szekvencia 3’-végi részletét tartalmazta. A pHZl jelű emlős expressziós vektort EcoRI-emésztéssel linearizáltuk és T4 DNS-polimeráz alkalmazásával tompa végűvé tettük. A tompa végűvé tett linearizált vektort ezután SacI enzimmel emésztettük. Ezután a 967 bázispáros PvuII/BamHI fragmenst, valamint a 828 bázispáros BamHI/SacI fragmenst a linearizált tompa és Sacl-végződésekkel rendelkező pHZl-vektorba ligáltuk.
A pHZl-plazmid egy olyan expressziós vektor, amely alkalmas emlőssejtekben fehérjék expresszálására, vagy alkalmazható in vitro átírt mRNS-ek békapete-transzlációs rendszerben történő expresszálására is. A pHZl expressziós egység tartalmazza az egéreredetű metalontionein-1-promotert, a T7 bakteriofág pro24
HU 219 674 Β motert, melyet többszörös klónozóhelyek szegélyeznek, melyek között kódolószekvenciák beépítésére alkalmas egyedi restrikciós hasítóhelyek is találhatók, tartalmazza továbbá a humán növekedési hormon génjének terminátorát, valamint a T7 bakteriofág terminátorát. Ezenfelül a pHZl tartalmaz egy E. coli replikációs origót, egy bakteriális β-laktamázgént, valamint egy emlősökben alkalmazható szelekciós markert kifejező expressziós egységet, amely magában foglalja az SV40 promotert, az SV40 replikációs origót, egy neomicinrezisztenciát kódoló gént, valamint az SV40 transzkripciós terminátorát.
A glukagonreceptort kódoló cDNS-szekvenciát a promoterhez képest megfelelő orientációban tartalmazó pHZl-plazmidszármazékot pLJ6’-plazmidnak neveztük el. Az inzert és a vektor kapcsolódási helyeinek környékét megszekvenáltuk, és ily módon igazoltuk a kívánt szekvenciák jelenlétét. A pLJ6’-plazmidot 1993. január 15-én letétbe helyeztük az „American Type Culture Collection”-nél (12301 ParkLawn Drive, Rockville, MD 20852), ahol a 69183 nyilvántartási számot kapta. A pLJ6’ plazmidban található glukagonreceptort kódoló cDNS szekvenciáját, valamint a belőle kikövetkeztetett aminosavszekvenciát a 24. és 25. szekvenciaazonosító számokon mutatjuk be.
6. példa
Glukagonreceptor-cDNS klónozása humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből
Azonfelül, hogy a glukagonreceptort kódoló szekvenciát humán májsejtekből kiindulva megklónoztuk, humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből készített könyvtárból is izoláltuk a glukagonreceptort kódoló cDNS-t. A humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből előállított cDNS-könyvtárból [l.C) példa] izolált DNS egy részletét PCR-amplifikációnak vetettük alá, egyrészt a ZC5763 jelű (szekvenciaazonosító szám: 22) oligonukleotid alkalmazásával, amely egy szensz oligonukleotid, és egy EcoRI-hasítóhelyet tartalmaz, melyet a humán glukagonreceptor-cDNS 5’-végi nem transzlálódó szekvenciái szegélyeznek, másrészt a ZC5849 jelű (szekvenciaazonosító szám: 23) oligonukleotid alkalmazásával, mely egy antiszensz oligonukleotid, és Xhol-hasítási helyet tartalmaz, melyet a humán glukagonreceptor-cDNS 3’-végi nem transzlálódó szekvenciái szegélyeznek. A láncindító oligonukleotidok szekvenciája a PCR-termékek megfelelő plazmidvektorba történő megfelelő orientációjú klónozásának megkönnyítése céljából tartalmazott restrikciós hasítóhelyeket. A PCR-reakció végrehajtásához a következő reakcióelegyet állítottuk össze: 4 pl szigetsejt-cDNSkönyvtárból izolált DNS-oldat [l.C) példa], 8 μΐ 10 χ Promega PCR-puffer (Promega), 20 pmol ZC5763 jelű (szekvenciaazonosító szám: 22), valamint 20 pmol ZC5849 jelű (szekvenciaazonosító szám: 23) láncindító oligonukleotid, 1 μΐ valamennyi dezoxiribonukleotidra nézve 20 mmol/l-es oldat, valamint 46,5 μΐ víz. A reakcióelegyet 3 percen át 95 °C-ra hevítettük, majd a hőmérsékletet 3 percen át 80 °C-on tartottuk. A reakcióelegyet a reakció megindításáig 80 °C-on tartottuk.
A reakciót 20 μΐ enzimkeverék hozzáadásával indítottuk, mely a következő összetevőket tartalmazta: 2 μΐ 10 χ Promega PCR-puffer (Promega), 2 μΐ 5 Ε/μΙ-es Taql-polimerázoldat (Cetus), valamint 16 μΐ víz. A reakcióelegy fölé 50 μΐ ásványi olajat rétegeztünk (Sigma), és a reakciót 30 ciklusban végeztük (1 perc 95 °C, 1 perc 55 °C, 2 perc 72 °C, valamint 15 másodperc 72 °C-on, ezt az inkubálási lépést minden ciklusban 3 másodperccel meghosszabbítottuk), majd 10 perces inkubálás következett 72 °C-on. Az utolsó 72 °C-os inkubálás után a reakcióelegyet 4 °C-on tartottuk. A PCR-termék 10 μΐ-ének agaróz-gélelektroforézisével kimutattuk, egy körülbelül 1,8,1,9 kb-os fragmens amplifikálódását. A pLJ6’-plazmidban található humán glukagonreceptort kódoló cDNS inzertméretéből kiindulva egy körülbelül 1846 bázispáros fragmens amplifikálódását vártuk.
A PCR-reakcióelegyet kloroformmal extraháltuk, amit kétszeri fenol/kloroformos extrakció, majd egy végső kloroformos extrakció követett. Az utolsó extrakció után 5 μΐ 4 pg/pl-es glikogénhordozót (Boehringer Mannheim Corp.) adtunk az elegyhez, majd a DNS-t ammónium-acetát jelenlétében etanollal kicsaptuk. A DNS-csapadékot centrifúgálással kiülepítettük, majd az üledéket 70%-os etanollal mostuk. A DNSüledéket vízben feloldottuk és a DNS-t Xhol és EcoRI restrikciós enzimekkel megemésztettük. Az emésztett DNS-t gélelektroforézissel tisztítottuk, majd Xhol és EcoRI emésztéssel linearizált pBLUESCRIPT-SK+plazmidba (Stratagene Cloning System) szubklónoztuk. A ligációs elegyet E. coli DHlO-sejtekbe (GIBCO BRL) transzformáltuk. Kiválasztott transzformánsokból plazmid-DNS-t izoláltunk, és a DNS-t restrikciós enzimes, valamint „Southem-blot” analízisnek vetettük alá. A transzformánsokból izolált plazmidokat a pLJ6’plazmidban található humán glukagonreceptor-kódoló cDNS-inzerttel hasonlítottuk össze. A restrikciós enzimekkel végzett azonosítást követően a kiválasztott plazmidot a szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A szekvenciaanalízis alapján megállapítottuk, hogy az egyik klónból izolált plazmid a pSLIGR-1 jelű glukagonreceptor-kódoló szekvenciákat tartalmazott. A pSLIGR- 1-plazmidban található glukagonreceptort kódoló régió szekvenciája három nukleotidban tért el a pLJ6’-plazmidban található májeredetű cDNS-szekvenciától. Az egyik nukleotideltérés csendes mutációt eredményezett, a másik két eltérés konzervatív aminosavcseréket kódolt, ahogy az az 5. táblázatban is látható. Az eltérések analíziséből arra következtethetünk, hogy ezek allélikus variációkat képviselő polimorfikus különbségek eredményei.
5. táblázat
Az amino- sav sorszáma A májeredetű cDNSszekvenciában található aminosav A szigetsejt eredetű cDNS-szekvenciában található aminosav
184. Phe Leu
265. Ser Gly
HU 219 674 Β
7. példa
A humán glukagonreceptor génjének klónozása
A humán glukagonreceptor genomi kiónjának előállítása céljából két genomi DNS-könyvtárat vizsgáltunk át, hibridizációs próbaként a humán glukagonreceptort kódoló cDNS-t alkalmazva. A humán glukagonreceptor génjének izolálása céljából a következő két amplifikált humán genomi könyvtárat vizsgáltuk át: egy kaukázusi típusú placentából XFIX II-ben előállított genomi könyvtárat, valamint egy humán tüdő-XFIX genomi könyvtárat (mindkét génkönyvtárat a Stratagene Cloning Systemstől szereztük be, katalógusszámok sorrendben: 946203 és 944201).
Az amplifikált humán tüdőeredetű genomi könyvtár titerét meghatároztuk, majd a könyvtárat E. coli LE392-sejtekkel (Stratagene Cloning Systems) együtt szélesztettük oly módon, hogy harminc darab 150 mm átmérőjű tenyésztőlemezre egyenként körülbelül x1ο4 plakkformáló egység (plaque farming units, pfú) kerüljön a könyvtárat alkotó fágokból. Készítettünk ezenfelül tíz lemezt, melyekre E. coli LE392-sejteket szélesztettünk, valamint körülbelül lemezenként 6χ 104 píu bakteriofágot. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on állni hagytuk, majd átvizsgálás céljára harminc lemezt kiválasztottunk.
Mind a harminc lemezről két-két replikafiltert készítettünk. A replikafiltereket úgy állítottuk elő, hogy a tenyésztőlemezre „HYBOND” nejlonmembránt fektettünk (Amersham) a gyártó utasításai szerint. A filtereket felemeltük a lemezekről, majd a sejteket 1,5 mol/1 NaCl-ot tartalmazó 0,5 mol/l-es NaOH-dal lizáltattuk, percen át, szobahőmérsékleten. A filtereket ezután 5 percig 1,5 mol/1 NaCl-ot tartalmazó 1 mol/l-es TrisHCl-pufferrel (pH=7,5) semlegesítettük, majd a filtereket 1200 pjoule-os UV-energiával fixáltuk egy „STRATALINKER” berendezésben (Stratagene Cloning System). Fixálás után a filtereket háromszor előmostuk a következő összetételű oldattal: 0,25xSSC, 0,25% SDS, 1 mmol/1 EDTA, 65 °C-on. Előmosás után a filtereket hat darab tízes csoportba osztottuk, majd előhibridizáltuk őket a következő összetételű előhibridizációs oldatban: 5xSSC, 5χDenhardt-oldat, 0,2% SDS, 1 mmol/1 EDTA, az előhibridizáló oldatot alkalmazás előtt 0,45 pm pórusátmérőjű szűrőn átszűrtük, és közvetlenül felhasználás előtt 100 pg/ml végkoncentrációban hődenaturált lazacsperma-DNS-t adtunk hozzá. A filtereket 65 cg/ml végkoncentrációban hődenaturált lazacsperma-DNS-t adtunk hozzá. A filtereket 65 °Con egy éjszakán át előhibridizáltuk.
A p40-2-2-plazmidból izolált humán glukagonreceptort kódoló cDNS-t „random priming” eljárással, az Amersham által forgalmazott „MEGAPRIME” reagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint megjelöltük. Az előhibridizációs oldatot minden filtercsoport esetében 28,5 χ 106 cpm hibridizációs próbát tartalmazó friss előhibridizációs oldatra cseréltük. A filtereket ezután 20 órán keresztül 65 °C-on hibridizáltuk. A hibridizáció befejeztével a hibridizációs oldatot elöntöttük, majd a filtereket négyszer vagy ötször szobahőmérsékleten előmostuk a következő összetételű mosófolyadékban: 0,25xSSC, 0,2% SDS, 1 mmol/1 EDTA. Az előmosás után a filtereket a mosófolyadékkal 65 °C-on nyolc egymást követő lépésben mostuk, majd egy utolsó 70 °C-os mosási lépés következett. A 70 °Cos mosást követően a filtereket autoradiográfiás filmmel exponáltuk (XAR-5; Eastman Kodak Co.; Rochester, NY) négy napon keresztül -70 °C-on, erősítőfólia alkalmazásával.
Az autoradiográfiás felvételek vizsgálata alapján négy különböző, a radioaktív hibridizációs próbával reagáló régiót azonosítottunk. Mind a négy hibridizációs régiónak megfelelő térrészből egy-egy agardarabkát további tisztítás céljára izoláltunk. Mindegyik agardarabkát egy éjszakán át áztattuk 1 ml SM-oldatban [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, (1982), mely kézikönyv teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], amely 1% kloroformot is tartalmazott. Az egy éjszakán át folytatott inkubálás után az agardarabkákból izolált fágmennyiséget SMoldattal ezerszeresre hígítottuk. A hígított fágszuszpenzióból 5, 25 és 50 pl-nyi mennyiséget E. coli LE392sejtekkel szélesztettünk. A tenyésztőlemezeket inkubáltuk, majd azokról a lemezekről, melyekről az 5 és a 25 pl fágszuszpenziót szélesztettük egy-egy replikafiltert készítettünk. A filtereket a fentiek szerint előkészítettük, előhibridizáltuk és hibridizáltuk. A filtereket autoradiográfiás filmmel exponáltuk.
Az autoradiográfiás felvételek vizsgálatával megállapítottuk, hogy mind a négy izolált klón leszármazottai tartalmaztak a hibridizációs próbával reagáló kiónokat. A hibridizációs kísérletben pozitívnak mutatkozott térrészekből összesen tíz agardarabkát izoláltunk, a tíz agardarabka izolálási helyét úgy választottuk meg, hogy minden egyes eredeti kiónt legalább két izolált agardarabka reprezentáljon. Az izolált agardarabkákat a fentiek szerint kezeltük. Az agardarabkákból izolált fágszuszpenziókat SM-oldattal 10 000-szeresre hígítottuk. A hígított fágszuszpenzióból 2,5 és 10 pl-es mintákat E. coli LE392-sejtekkel együtt szélesztettünk. A lemezeket inkubáltuk, majd egy-egy replikafiltert készítettünk azokról a lemezekről, melyeken a plakkok megfelelő távolságban voltak egymástól. A filtereket a fent leírtak szerint készítettük elő és hibridizáltuk. Az autoradiográfiás felvételek alapján pozitívan reagáló plakkokat azonosítottunk. Tizenkét pozitív plakkot izoláltunk, melyek között volt legalább egy-egy olyan klón, melyek az eredeti négy pozitív klón valamelyikét reprezentálták. Minden egyes tenyésztőlemezről egy plakkot választottunk ki további analízis céljából.
A 2-2-1, 3-1-1, 14-2-1, valamint 11-2-1 fágplakkokat reprezentáló agardarabkákat a fent leírtak szerint kezeltük. Az agardarabkákból előállított fágszuszpenziókat SM-oldattal ezerszeresre hígítottuk, majd a fágszuszpenzióval E. coli LE392-sejtek tenyészetét beoltottuk. A fágokkal fertőzött sejtekből kettős szálú DNS-t izoláltunk lényegében Grossberger eljárása szerint [Nuc. Acids Rés. 15, 6737 (1987); amely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi]. Az izolált kettős szálú DNS-t
HU 219 674 Β
Xbal-enzimmel emésztettük a genomi eredetű inzert kihasítása céljából. Az emésztett DNS-ek agaróz-gélelektroforézises analízise kimutatta, hogy a 2-2-1- és a 11-2-1-klónok 9 kb-os Xbal-inzertet tartalmaztak, a 14-2-1-klón egy 15 kb-os inzertet és a 3-3-1-klón egy 13 kb-os inzertet tartalmazott. Az említett kiónok Xbal enzimmel, valamint Xbal/BamHI enzimekkel emésztett DNS-ének Southem-blot-analízise kimutatta, hogy a humán glukagonreceptort kódoló cDNS a 6. táblázatban feltüntetett fragmensekkel hibridizálódott.
6. táblázat
A klón új elnevezése A klón eredeti elnevezése Hibridizálódó Xbal-frag- mens Hibridizálódó Xbal/BamHI fragmens
1. klón 2-2-1 -9kb 4,2 kb, 1,9 kb
6. klón 11-2-1 -9kb 4,2 kb, 1,9 kb
2. klón 14-2-1 -15 kb 4,2 kb, 1,9 kb
5. klón 3-3-1 -13 kb 1,6
A 11-2-1- és a 14-2-1-klónokat választottuk ki további analízis céljára. A 2-2-1-klón azonosnak tűnt a 11-2-1-kiónnal, és ezért további vizsgálatnak vetettük alá. Kényelmi szempontokból a kiónok eredeti elnevezését megváltoztattuk a 6. táblázatban megadott módon. Valamennyi fágklónból plazmidvektorban történő szubklónozás céljára kettős szálú DNS-t izoláltunk, lényegében a Maniatis által leírt eljárás alkalmazásával. A DNS-t Xbal enzimmel emésztettük, gélből tisztítottuk, majd a pBLUESCRIPT-SK+-plazmidba szubklónoztuk (Stratagene Cloning Systems), a plazmidot előzőleg Xbal enzimmel linearizáltuk, és a recirkularizáció megakadályozása céljából boíjúeredetű lúgos foszfatázzal emésztettük. A ligációs elegyet ELECTROMAX DHlOB-sejtekbe (GIBCO BRL) juttattuk elektroporáció útján, egy Bio-Rad által forgalmazott „GENEPULSER” berendezésben (Bio-Rad Laboratories Richmond CA.) a következő körülmények között: 400 ohm, 25 pfarad, 2,3 kvolt. Ezután kiválasztott transzformánsokból plazmid-DNS-t izoláltunk. A 6. és 2. fágklónból származó genomi eredetű inzerteket tartalmazó plazmidokat sorrendben pSLHGR6-nak és pSLHGR2-nek neveztük el. A pSLHGRó- és pSLHGR2-plazmidokat szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A meghatározott szekvenciák vizsgálata, valamint a kódolórégiók szekvenciájának humán glukagonreceptort kódoló cDNSszekvenciákkal történő összehasonlítása alapján megállapítottuk, hogy a kódolórégió 12 exont tartalmaz. Az izolált gén kromoszomális pozícióját metafázisú kromoszómákon határoztuk meg, lényegében a Dumám és munkatársai által leírt eljárás szerint [Mól. Cell. Bioi. 8, 1863 (1988); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], biotiniált humán glukagonreceptor-génből származó hibridizációs próba, valamint 17. kromoszómára specifikus centroméra hibridizációs próba alkalmazásával. A kromoszómák denaturálását, a hibridizálást és a detektálást lényegében Pinkel és munkatársai módszere szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 2934 (1986); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó ki tanítás részét képezi], mely eljárást Kievits és munkatársai módosítottak [Cytogenet. Cell Génét. 53, 134 (1990); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], az eljárást azzal a különbséggel hajtottuk végre, hogy a hibridizációt 65 térfogat%-os formamid/10% dextrán-szulfát/2 χ SSC-oldatban hajtottuk végre, a hibridizációt követő mosásokat pedig 65% formamid/2 χ SSC-oldatban, 42 °C-on, majd 0,1 SSC-oldatban 55 °C-on, ahogy azt Palmiter és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89, 6333 (1992); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], A q25-lokációt hibridizált metafázisú kromoszómák DAPI-festésével igazoltuk, Testa és munkatársai eljárása szerint [Cytogenet. Cell. Génét. 60, 247 (1992); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi]. A DAPI-festés egy Q-sávszerű mintázatot hozott létre.
Az amplifikált humán placentaeredetű genomi könyvtár (Stratagene) glukagonreceptor-génre történő átvizsgálása, melyet lényegében a fentiek szerint végeztünk, eredménytelennek bizonyult. Röviden, a könyvtár titerét meghatároztuk, és harminc darab 150 mm átmérőjű tenyésztőlemezre E. coli LE392-sejtekkel együtt körülbelül 5x10* pfú bakteriofágot szélesztettünk. Ezenfelül szélesztettünk E. coli LE392-sejteket tizenegy darab 150 mm átmérőjű tenyésztőlemezre is, melyekre közelítőleg 105 pfú bakteriofág került. A lemezeket egy éjszakán 37 °C-on inkubáltuk, majd 31 lemezt kiválasztottunk átvizsgálásra.
Nejlonfilter alkalmazásával replikafiltereket készítettünk, melyeket a fentiek szerint mostunk és előhibridizáltunk. A G30 jelű humán hasnyálmirigy-szigetsejtekből izolált glukagonreceptort kódoló cDNS-fragmenst (4. példa) „random priming” eljárással, az Amersham által forgalmazott „MEGAPRIME” reagenskészlet alkalmazásával a gyártó utasításai szerint megjelöltük. A filtercsoportokon az előhibridizációs oldatot 1,1 χ 106 cpm-hibridizációs próbát tartalmazó friss előhibridizációs oldatra cseréltük. A filtereket ezután egy éjszakán át 65 °C-on hibridizáltuk. A hibridizáció befejeztével a hibridizációs oldatot elöntöttük, majd a filtereket ötször szobahőmérsékleten előmostuk, a következő összetételű mosófolyadékban: 0,25xSSC, 0,25% SDS, 1 mmol/1 EDTA. Az előmosós után a filtereket 8 egymást követő lépésben 65 °C-on mostuk az említett mosófolyadékban. Végül egy 70 °C-os mosási lépés következett, majd a filtereket négy napon keresztül -70 °C-on erősítőfólia alkalmazásával autoradiografáltuk (XAR-5 film; Eastman Kodak Co.).
Az autoradiográfiás felvételek alapján meggyőző pozitív jeleket nem találtunk, mindazáltal hét gyenge pozitív jelet adó régiót további analízisnek vetettünk alá. A kiválasztott kiónokat másodlagos szűrővizsgálatnak vetettük alá a fent leírtak szerint, de a második szűrővizsgálat során készített autoradiográfiákon pozitív jelet nem találtunk. Ezeket a kiónokat tovább nem vizsgáltuk.
HU 219 674 Β
8. példa
A glukagonreceptor-cDNS expresszálása emlőssejtekben
A) Patkány-glukagonreceptor expresszálása BHK570sejtekben
A pLJ4-plazmidot a pLJl-plazmiddal együtt BHK570-sejtekbe kotranszfektáltuk (letétbe helyezve az „American Type Culture Collection”-nél, nyilvántartási szám: 10314), akalcium-foszfátos eljárás alkalmazásával, lényegében Graham és Van dér Eb eljárása szerint [Virology 52, 456 (1973); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], A pLJl-plazmidot a p416-plazmidból állítottuk elő, mely plazmid tartalmazza az adenovírus-5 replikációs origót, az SV40 enhanszert, az adenovírus-2 fő késői promotert, az adenovírus-2 háromszoros szignálszekvenciát, 5’- és 3’-végi „splicing”-helyeket, a DHFRr-cDNS-t, az SV40 poliadenilációs szignált, valamint a pML-1-vektorszekvenciákat [Lusky és Botchan, Natúré 293, 79 (1981)]. A p416-plazmidból izolált EcoRI/Xbal ffagmensen található DHFR expressziós egységet az EcoRI- és Xbal-emésztéssel linearizált pUC18-plazmidba ligáltuk, ily módon kialakítva a pLJl-plazmidot. A transzfektált sejteket növekedési táptalajban tenyésztettük [10% magzati borjúsavót, lxPSN antibiotikumkeveréket (GIBCO BRL 600-5640), valamint 2,0 mmol/1 1-glutamint tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle táptalaj (DMEM)]. Miután a sejteket néhány napig nem szelektív táptalajban tenyésztettük, a táptalajt szelekciós táptalajra cseréltük [250 mmol/1 methotrexate-ot (MTX) tartalmazó növekedési táptalaj). A sejteket ezután egymástól elválasztottuk, majd a sejtszuszpenziót szelekciós táptalajjal 10 cm-es tenyésztőlemezekben 20-szorosra és 50-szeresre hígítottuk. Hét-tíz napos, 250 mmol/1 MTX-et tartalmazó táptalajban végzett szelekció után a kiónokat klónozóhengerrel fölszedtük, és 24 mélyületű tenyésztőtálcákba helyeztük őket. A kapott kiónokat a 3. példában leírtak szerint glukagonkötő képességre vizsgáltuk. A glukagonkötési vizsgálatot elvégeztük egész sejteken is oly módon, hogy egy 24 mélyületű tenyésztőtálcába valamennyi kiónból 2 χ 105-2 χ 105 sejtet helyeztünk. A tálcákat 72 órán át 5% CO2-atmoszférában 37 °C-on inkubáltuk. A glukagonkötési vizsgálatot a 3. ábrában leírtak szerint hajtottuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az utolsó PBS-oldattal végzett mosás után a sejteket a tenyésztőlemezről tripszines kezeléssel leválasztottuk és kémcsövekbe juttattuk. A csövek radioaktivitását gamma-számlálóban határoztuk meg. A legnagyobb beütésszámot mutató sejteket, melyek következésképpen a legtöbb glukagont kötötték meg, tovább jellemeztük. A kiválasztott transzformánsokat glukagonközvetített cAMP-válasz szempontjából is megvizsgáltuk, a 8.D) példában leírtak szerint, majd vizsgáltuk a glukagon közvetítette intracellurális kalciumszintválaszt is, a 8.E) példában leírtak szerint. A glukagonkötődési vizsgálatokat szintén a transzfektánsokból készített membránpreparátumokon végeztük, az alábbiak szerint.
B) Glukagonkötődési vizsgálat membránpreparátumokon
A pLJ4-plazmiddal transzfektált BHK-sejtekből készített membránpreparátumok 125I-glukagon-kötő képességét összehasonlítottuk patkánymájsejtekből készített preparátumok 125I-glukagon-kötő képességével. A membránpreparátumokat lényegében Rodbell és munkatársai eljárásai szerint készítettük [J. Bioi., Chem. 246, 1861 (1971); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi]. Két különböző májsejtmembrán-preparátumot készítettünk, mindkét preparátumot körülbelül 80 gramm májból kiindulva készítettük, melyet 12-16 dekapitált fiatal nőstény patkányból nyertünk ki. A májakat gyorsan kinyertük a dekapitált állatokból, majd jégre helyeztük. A májakat 10 grammos adagokban szétosztottuk. Az adagokat ollóval apróra vagdaltuk, és a vagdalás közben a kötőszövetet eltávolítottuk. Az adagokat ezután egymástól elkülönítve Dounce-homogenizátorban elhomogenizáltuk. Minden adat feldolgozásakor az összevagdalt szövethez a homogenizátorban 25 ml táptalajt (2. táblázat) adtunk, majd a szövetet jégen elhomogenizáltuk, a homogenizálófeltéttel végzett nyolc határozott ütés útján. A homogenizálás után a homogenizátumokat 450 ml hideg táptalajban (2. táblázat) összeöntöttük. Az összeöntött homogenizátumokat három percig kevertettük, majd keresztülszűrtük három réteg gézen, majd ezt követően négy réteg gézen szűrtük keresztül. A homogenizátumokat ezután 30 percig 1500 g-vel centrifugáltuk 4 °C-on. A felülúszókat ezután elöntöttük, és az üledékeket egy Dounce-homogenizátorba összeöntöttük. Az üledékeket a laza homogenizálófeltéttel végrehajtott három enyhe ütéssel felszuszpendáltuk. A felszuszpendált üledékeket átöntöttük egy 250 ml-es mérőhengerbe, amely 62 ml 69%-os szacharózoldatot (2. táblázat) tartalmazott. Ezután az oldathoz 110 ml végtérfogatig desztillált vizet adtunk, majd az elegyet alaposan összekevertük és hidegen tartottuk. Az oldat koncentrációját reffaktométeres (Bausch & Lomb, Rochester, NY) mérés segítségével 69%-os szacharózoldat alkalmazásával 44,0±0,l%-ra állítottuk be. A szacharózt tartalmazó szuszpenziót egyenletesen szétosztottuk 25 χ 89 mm-es ultracentrifuga-csövekbe. Valamennyi szuszpenziót óvatosan fölülrétegeztük 20 ml 42,3%-os szacharózoldattal (2. táblázat), majd a szuszpenziókat 4 °C-on 150 percig 24 000 fordulat/perccel centrifugáltuk egy SV28 jelű rotorban (Sorvall, Dupont Company, Wilmington, Del.).
A centrifugálás befejeztével valamennyi cső tetejéről leszívtuk a keletkezett habot, 10 ml-es fecskendő alkalmazásával, 18-as kaliberű tűn keresztül. A különböző csövekből összegyűjtött anyagot összeöntöttük, és körülbelül 10 ml táptalajban (2. táblázat) felszuszpendáltuk oly módon, hogy az elegyet a tűn keresztül felszívtuk és egy centrifugacsőbe visszanyomtuk. A centrifugacsövet ezután táptalajjal (2. táblázat) feltöltöttük, majd 15 percig 15 000 fordulat/perccel centrifugáltuk egy SS34 jelű rotorban (Sorvall).
A felülúszót óvatosan leöntöttük az üledékről és kidobtuk. Az üledéket táptalajban (2. táblázat) felszusz28
HU 219 674 Β pendáltuk, majd desztillált vízzel ezerszeresre hígítottuk. Az oldat fehéqekoncentrációját 1 cm-es küvettában végrehajtott abszorbanciameghatározással állapítottuk meg. A fehéijekoncentrációt az alábbi képlet szerint határoztuk meg:
A224nm-A23e nm
-χ hígítási faktor=mg fehéije/ml
6,45
A membránpreparátumot ezután egyenlő részekre osztottuk, majd szárazjég-etanol elegyben hirtelen lefagyasztottuk és azután -80 °C-on tároltuk.
A BHK-transzfektánsokból, melyeket előzőleg 150 mm-es lemezen szelekciós táptalajon konfluenciáig növesztettünk, a következők szerint készítettünk membránpreparátumot. Két konfluens rétegben transzfektánsokat tartalmazó lemezt kétszer leöblítettünk hideg foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), majd mindegyik lemezhez 10 ml 1 mmol/1 PMSF-et tartalmazó PBS-oldatot adtunk. A sejteket ezután a lemezek felületéről a PBSoldatba kapartuk, majd a lemezekről a sejtszuszpenziót tiszta centrifugacsövekbe juttattuk. Mindkét lemezt még egyszer leöblítettük 5-5 ml 1 mmol/1 PMSF-et tartalmazó PBS-oldattal, majd az öblítőoldatokat a megfelelő centrifugacsövekbe öntöttük. A sejteket asztali centrifugában 4 °C-on 2000 fordulat/perccel lecentrifugáltuk. A felülúszókat elöntöttük, majd a sejteket a következő összetételű oldatban felszuszpendáltuk: 30 ml 5 mmol/l-es Hepes-puffer, 1 mmol/1 PMSF, pH=7,5. A sejteket ezután 15 percig jégen állni hagytuk, majd 4 °C-on 47 800 g-vel lecentrifugáltuk őket. A sejteket tartalmazó üledékeket 1 mól PMSF-et tartalmazó PBSoldatban felszuszpendáltuk, a szuszpenziót egyenlő részekre osztottuk, és -80 °C-on lefagyasztottuk.
A patkánymájsejtekből és a BHK-transzformánsokból készített membránpreparátumokon glukagonkötési vizsgálati eljárások alkalmazásával kompetíciós analízist hajtottunk végre. Röviden, a reakcióedényekbe 20 ml 10 mmol/l-es HOAc-oldatban hígított 10-11 mol/1 és 10 6 mol/1 közötti koncentrációjú a glukagonoldatot vagy 20 pl BSA-t helyeztünk. Ezután valamennyi reakcióedényhez a következő oldatokat adtuk: 100 μΐ kétszer kötő puffer; 20 μΐ 125I-glukagon (Amersham); 20 μΐ 1 mmol/l-es NaHCO3-oldat; 20 μΐ 10 mmol/l-es HOAcoldat, 0,5% BSA (Novo Nordisk N/A, Bagsvaerd, Dánia); 40 μΐ desztillált víz. A kötési reakciót 20 μΐ membránpreparátum reakcióedényekbe történő adásával iniciáltuk. A reakcióedényeket 30 percig 30 °C-on állni hagytuk. A membránokat ezután mikrocentrifugában történő centrifugálás útján kiülepítettük. A centrifúgálást nagy sebességgel 10 percig 4 °C-on végeztük. A felülúszókat ezután elöntöttük, és az üledékek radioaktivitását meghatároztuk. A jelöletlen glukagonnal végzett kompetició közel azonos szigmoid görbéket eredményezett a glukagonkötés vonatkozásában (3. ábra). Scatchard-analízis alapján [Scatchard, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 51, 660 (1949); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi] a látszólagos Kd a klónozott receptorra 50 nm/l-nek a patkánymájmembránokra 49 nm/l-nek adódott (4. ábra).
A pLJ4-plazmid által kódolt receptor specifítását úgy vizsgáltuk, hogy kompetíciós kötési kísérletet hajtottunk végre hasonló szerkezetű peptidhormonok, valamint 125I-glukagon alkalmazásával. A fönt leírt kötődésvizsgálati eljárás alkalmazásával a pLJ4-transzfektánsokból készített membránpreparátumokhoz külön kísérletekben 125l-glukagonnal együtt mikromólos mennyiségben glukagont és hasonló szerkezetű peptideket adtunk (7. táblázat). A kísérletben kizárólag a natív glukagon és a glukagonantagonista des-His'-fGlu’j-glukagon-amid volt képes a membránokon található kötőhelyekért a 125I-glukagonnal versenyezni.
7. táblázat
1 pmol/l humán glukagon (Sigma)
1 pmol/l des-His*-[Glu9]-glukagon-amid [„Applied Biosystems 431 A” peptidszintetizátoron szintetizálva, „RINK AMIDÉ MGHA” gyanta alkalmazásával (Bachem Bioscience Inc., Philadelphia, Penn.)]
200 nmol/1 humán glukagonszerű peptid (GLP, Sigma)
20 nmol/1 sertéseredetű vasoactive intestinal peptide (VIP, Sigma)
1 pmol/l lazaceredetű kalcitonin (Sigma)
1 pmol/l sertéseredetű szekretin (Sigma)
1 pmol/l marhaeredetű paratiroid hormon (ΡΤΉ, Sigma)
C) A patkány-glukagonreceptor expresszálása COS- 7sejtekben
A pLJ4-plazmiddal transzfektált COS-7-sejtek azon képességét, hogy képesek-e a glukagonstimulusra a cAMP-szintet növelni, az Amersham által forgalmazott „SPA”-reagenskészlet alkalmazásával az alább leírtak szerint [8.D) példa] vizsgáltuk. A vizsgálati eljárással kimutattuk, hogy a glukagonnal stimulált pJL4-transzfektánsok körülbelül ötször annyit cAMP-t halmoztak fel, mint a kontroll-COS-7-sejtek, melyek kizárólag a vektorral voltak transzfektálva. A glukagonhoz hasonló szerkezetű peptideket - szekretin, VIP, PTH, GLP és kalcitonin - a transzfektánsokhoz 100 nmol/1 és 1000 nmol/1 közötti koncentrációban adtuk, és vizsgáltuk, hogy indukálnak-e cAMP-szint-emelkedést. A vizsgálat eredményeként megállapítottuk, hogy egyik hasonló szerkezetű peptid sem volt képes a cAMP-koncentrációban jelentős növekedést indukálni.
Egész sejteken végrehajtott luciferáz- és adenilát-cikláz-aktivitás-mérésen alapuló vizsgálati eljárások
A patkány-glukagonreceptort kódoló cDNS-t BHK570-sejtekben expresszáltattuk, amely stabilan transzfektálva volt a ZK6 expressziós egységgel, amely tartalmazott egy promotert, amely legalább egy cAMPreszponzív elemet foglalt magában, tartalmazta a luciferázt kódoló cDNS-t, valamint a hGH-terminátort. Ez a sejtvonal lehetővé teszi, hogy a glukagonreceptorhoz történő kötődése eredményeként luciferázaktivitás, adenilát-cikláz-aktivitás, és intracellurális kalciumkoncentráció-növekedést mérjünk.
HU 219 674 Β
A ZK6-plazmidon található proenkefalingénből származó cAMP-reszponzív elemet (CRE) a Zem233-plazmidból izoláltuk. A Zem233, a Zem67- és a Zeml06plazmid származéka. A Zeml06-plazmidot a Zem93prekurzoiplazmidból állítottuk elő. A Zem93-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy az MThGHlll-plazmidból [Palmiter és munkatársai: Science 222, 809 (1983)] izoláltuk az MT-l-promotert tartalmazó KpnI/BamHI fragmenst és azt a pUC18-plazmidba építettük. A Zem93plazmidot ezután Sstl-enzimmel megemésztettük és újraligáltuk, ily módon előállítva a Zeml06-plazmidot, amelyből az MT-l-promotertől 5’-irányban lévő szekvenciából mintegy 600 bázispárnyi szakasz eliminálódott.
A proenkefalin-CRE-t a ZemlOó-plazmidban található SP40 promoter 5’-végi részébe inzertáltuk oly módon, hogy az M106-plazmidot előzőleg EcoRI- és Sstlenzimekkel emésztettük, majd izoláltuk a vektort tartalmazó fragmenst. A ZC982- és ZC983-oligonukleotidokat (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 3 és 4) úgy terveztük, hogy egymáshoz hibridizálva a proenkefalin-CRE-t kódolják a -71-től a -133. nukleotidig [Comb és munkatársai: Natúré 323, 353 (1986)], 5’EcoRI és 3’-SST-l hasítóhellyel szegélyezve. A ZC982 és ZC983 oligonukleotidokat (szekvenciaazonosító számok sorrendben : 3 és 4) megkinázoztuk, egymáshoz hibridizáltuk, majd a linearizált Zeml06-plazmiddal ligáltuk, ily módon kialakítva a Zem224-plazmidot.
A Zem67-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy először megemésztettük a pIC19R-plazmidot [Marsh és munkatársai : Gene 32, 481 (1984)] Smal és HindlII enzimekkel. Az SV40 vírus replikációs origóját a géntérkép 270 pozíciójától (PvuII) 5171 pozíciójáig (HindlII) a linearizált pICI9R-plazmidba ligáltuk, ily módon előállítva a Zem67-plazmidot. A Zem220-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pSV2-neoplazmid (American Type Culture Collection nyilvántartási szám: 37149) neomicin-rezisztenciagént és SV40 terminátort tartalmazó HindlII/BamHI fragmensét a HindlII-mal és BglII-vel emésztett Zem67-plazmidba ligáltuk.
Az SV40 promotert, a neomicin-rezisztenciagént és az SV40 terminátort tartalmazó expressziós egységet a Zem220-plazmidból EcoRI-fragmensként izoláltuk. A Zem224-plazmidot megemésztettük EcoRI enzimmel, majd a recirkularizáció megelőzése céljából borjúeredetű lúgos foszfatázzal kezeltük. Ezután a linearizált Zem224-et és a neomicin expressziós egységet összeligáltuk. Az így kialakított plazmidot, amely a CREhez közel tartalmazta az SV40 promotert Zem233-plazmidnak neveztük el.
A Zem233-plazmidot ezután oly módon módosítottuk, hogy a proenkefalin-CRE-szekvenciától közvetlenül 3’-irányban beépítettünk egy további CRE-szekvenciát, egy TATA-boxot, valamint a lacZ-kódoló- és poli(A)-szekvenciáinak egy részletét oly módon, hogy a kialakított expressziós egység orientációja ellentétes lett a Zem233-plazmidban található neomicinrezisztenciát kódoló expressziós egység orientációjával. A Zem233-plazmidot ezután SstI és BamHI enzimekkel végzett emésztéssel linearizáltuk. A ZC35O9 és ZC3510 oligonukleotidok (szekvenciaazonosító számok sorrendben: 5 és 6) szekvenciáját úgy terveztük, hogy egymáshoz hibridizálódva a kialakult duplex az α-glikoprotein-CRE-t [Delegeane és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 7, 3994 (1987)] kódolja, 5’-sST-I és 3’-EcoRI ragadós végekkel szegélyezve. Az oligonukleotidokat közismert módon hibridizáltuk össze. A timidin-kináz TATA-boxát egy EcoRI/PstI fragmensen izoláltuk, mely a timidin-kináz-gén (-79)-(+18) nukleotidjait foglalta magában [McKnight: Cell 31, 355 (1982)]. A lacZ-gén 3’-végi szekvenciáját és a kapcsolt poli(A)-szekvenciát a pLacF-plazmidból Pstl/BamHI fragmensként izoláltuk (a pLacF-plazmidot Jaques Peschon-tól kaptuk, Immunex Corp., Seattle, Washington). A pLacF-plazmid pUC 18-vektorba klónozva tartalmazza a lacZ kódolórégiót és az egérprotaminterminátor-szekvenciát. Az Sstl/BamHI emésztéssel linearizált Zem223-plazmidot, az Sstl/EcoRI végződésekkel rendelkező ZC3509/ZC3510 adaptert, az EcoRI/PstlTATA-box fragmenst, valamint a Pstl/BamHI fragmensen található lacZ-szekvenciát összeligáltuk. A ligáció eredményeként kapott plazmidot, amely a Zem233-ból származó neomicin-rezisztenciagént kifejező expreszsziós egységhez képest megfelelő orientációban tartalmazta az expressziós egységet, KZ5-plazmidnak neveztük el.
A KZ5-plazmidban található lacZ-kódoló- és poli(A)-szekvenciákat a luciferázgénnel és a humán növekedési hormon (hGH) terminátorszekvenciákkal helyettesítettük. A luciferázgént eredetileg az a-1681uc-plazmidból [Delegeane és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 7, 3994 (1987); és deWet és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 7, 725 (1987)] származó 1,7 kb-os Xhol/Xbal fragmensként izoláltuk. A hGH terminátorszekvenciát a Zem219b-plazmidból (E. coli transzformánsként letétbe helyezve az „American Type Culture Collectiori’nél, nyilvántartási szám: ATCC 68979) származó Xbal/Sall fragmensként izoláltuk. A luciferázgént és a hGH terminátorszekvenciát Xhol/Sall emésztéssel linerizált pIC19H-plazmidba (Marsh és munkatársai, ugyanott) szubklónoztuk, kényelmi szempontokból. A kapott KZ8 elnevezésű plazmidot Xhol és Sáli enzimekkel emésztettük, a luciferáz-hGH-terminátorszekvenciák izolálása céljából. A KZ5-plazmidot Sáli enzimmel emésztettük, a vektort tartalmazó fragmenst izoláltuk, majd a recirkularizáció megakadályozása céljából borjúeredetű lúgos foszfatázzal emésztettük. A luciferázhGH-terminátorszekvenciákat tartalmazó Xhol/Sall fragmenst a Sall-emésztett KZ5-plazmiddal összeligáltuk. A kapott plazmidot, amely a luciferáz-hGH-terminátorszekvenciát a promoterhez képest helyes orientációban tartalmazta, KZ6-plazmidnak neveztük el.
A KZ6-plazmidot BHK570-sejtekbe transzfektáltuk (letétbe helyezve az „American Type Culture Collection”-nél, nyilvántartási szám: 10314), a kalciumfoszfát-kicsapásos eljárás alkalmazásával, lényegében Graham és Van dér Eb eljárása alapján [Virology 52, 456 (1973); mely publikáció teljes teijedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi].
HU 219 674 Β
A transzfektált sejteket növekedést elősegítő táptalajban [Dulbecco-féle módosított Eagle táptalaj (DMEM), amely 10% magzati boqúsavót, lxPSN antibiotikumkeveréket (GIBCO BRL), valamint 2,0 mmol/1 L-glutamint tartalmazott]. Néhány napos nem szelektív táptalajban történő tenyésztés után a táptalajt G418 szelekciós táptalajra cseréltük (növekedést elősegítő táptalaj, amely 500 pg/ml G418-at tartalmazott). A sejteket ezután a konfluencia eléréséig növekedni engedtük, majd tripszinnel kezeltük őket, és határhígítással 96 mélyületű tenyésztőtálcákba szélesztettük őket. A sejteket ezután egy-két hétig G418 szelekciós táptalajban növesztettük. Ezután a mélyületekben található elkülönült kolóniákat megvizsgáltuk, hogy képesek-e reagálni forskolinkezelésre az alábbiakban leírt luciferázaktivitás kimutatásán alapuló vizsgálati eljárásban. A forskolin megnöveli a cAMP-koncentrációt, és ily módon aktiválja a cAMP-függő válasz-reakcióutakat, receptortól független módon. Izoláltunk egy kiónt, amely képes volt forskolinra reagálni, és BHK/KZ6-19-46-nak neveztük el.
A BHK/KZ6-19-46-sejteket pLJ4- és pLJl- vagy pZCEP- és pLJl-plazmidokkal kotranszfektáltuk (a pZCEP-transzfektánsokat negatív kontrollként alkalmaztuk), a fent leírt módon, a kalcium-foszfátos transzfektálási eljárás alkalmazásával. A transzfektánsokat 250 nmol/1 metotrexát jelenlétében szelektáltuk, a korábbiakban leírtak szerint. A transzfektánsokat három párhuzamos kísérletben vizsgáltuk CRE-luciferáz válaszra nézve, kiválasztott agonisták alkalmazásával. Hat véletlenszerűen kiválasztott pLJ4-transzfektánst, valamint véletlenszerűen kiválasztott pZCEP-transzfektánsokat (negatív kontrollok) vizsgáltunk. Mikrotitertálcákat töltöttünk meg a sejtekkel oly módon, hogy minden egyes mélyület 2xl04 sejtet tartalmazzon 100 pl szelekciós táptalajban, és a sejteket egy éjszakán át növesztettük. Az agonistákat az alkalmazott koncentrációhoz viszonyítva kétszeres töménységben oldottuk fel szelekciós táptalajban. A következő agonistákat alkalmaztuk:
pmol/l glukagon
200 nmol/1 glukagonszerű peptid (GLP) nmol/1 vasoactive intestinal peptid (VIP)
100 nmol/1 kalcitonin (CT) pmol/l forskolin (CalBiochem, San Diego, CA.)
Az indukálást úgy végeztük, hogy a kétszeres töménységű oldatokból 100 pl-nyit 3-3 mélyületbe bemértünk. Az indukálatlan enzimaktivitás-szinteket 3-3 olyan mélyületből határoztuk meg, melyekhez csak 100 pl 10% magzati boqúsavót tartalmazó DMEM táptalajt adtunk. A tálcákat 4 órán át 37 °C-on 5% CO2-atmoszférában inkubáltuk, a luciferáz termelődésének indukciója céljából.
Az indukciót követően a táptalajt eltávolítottuk, és a mélyületeket 200-200 pl PBS-oldattal egyszer mostuk. A mosást követően a mélyületekbe 25 pl egyszer „Cell Culture Lysis Reagenf’-et (Luciferase Assay System, Promega Corp., Madison, Wis.) adtunk, majd a tálcákat 15 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk.
A mikrotitertálcákat ezután egy Labsystems által forgalmazott „Luminoskan” mikrotiter-luminométerbe helyeztük (Labsystems Inc., Morton Grove, 111.), mely berendezés a mélyületekbe 40 pl „Luciferase Assay Substrate” reagenst (Luciferase Assay System, Promega) adott, majd a reakcióelegyeket három másodpercig kevertette, és a luciferázjelet mélyületenként két másodpercen keresztül tartó integrálással leolvasta. A luciferáz indukálásának mértékét valamennyi agonista vonatkozásában a következő képlet alapján határoztuk meg:
indukált jel-nem indukált jel Aktiválás mértéke =nem indukált jel
Az egyik pLJ4-transzfektáns klón, a KZ6/rGR-DHFR-2 jelű glukagonra 6-10-szeres luciferázindukciót mutatott, de nem volt indukálható GLP-vel, VIP-pel vagy CT-vel.
A KZ6/rGR-DHFR-2 transzfektáns klón cAMP-válaszát glukagon és forskolin vonatkozásában „radioimmunoassay” eljárással is vizsgáltuk, a ,,cAMP[125I] Scintillatin Proximitry Assay System” reagenskészlet alkalmazásával (Amersham), a gyártó előírásainak megfelelően. Röviden, egy sokmélyületű tenyésztőlemez mélyületeibe mélyületenként 100 pl 2 χ 105 sejt/ml töménységű KZ6/rGR-DHFR-2 sejtszuszpenziót mértünk be, és a sejteket egy éjszakán át szelekciós táptalajban tenyésztettük. A glukagon- és forskolinreagensek a következő összetételűek voltak: DMEM, 10% magzati boíjúsavó, 10 pmol/l IBMX, 0,0001-1000 nm/1 glukagon vagy 25 pmol/l forskolin.
A táptalajt mélyületenként 50 pl agonistaoldatra cseréltük (glukagon- vagy forskolinoldatra). A sejteket 10 percig 37 °C-on 5% CO2-atmoszférában inkubáltuk az agonistaoldattal. Az inkubálást követően a sejteket mélyületenként 200 pl forrásban lévő víz hozzáadásával lizáltattuk. 15 perc elteltével a felülúszókat begyűjtöttük és acetátpufferrel 5-szörösre vagy 40-szeresre hígítottuk („cAMP[125I] Scintillation Proximity Assay System”; Amersham). A mintákat ezután trietil-amin és ecetsavanhidrid hozzáadásával acetileztük, a gyártó előírásai szerint.
Minden acetilált mintából 100 pl-t kivettünk, és 75 pl [125I]cAMP-vel, 75 pl antiszukcinil-cAMP-ellenszérummal, valamint 75 pl SPA-részecskékhez kötött, szamárban termeltetett antinyúl-IgG-ellenanyaggal elegyítettük (valamennyi felsorolt reagens a ,,cAMP[125I] Scintillation Proximity Assay System” reagenskészlet tartozéka volt; Amersham) egy LKB által forgalmazott T-tálca mélyületeiben. A tálcákat lezártuk, és egy éjszakán át 200 fordulat/perc sebességgel rázattuk egy körkörösen működő rázógép alkalmazásával. A minták radioaktivitását egy „1205 BETAPLATE” folyadékszcintillációs számlálóban határoztuk meg (Pharmacia LKB Instruments Inc., Gaithersburg, Md.) Fölvettünk egy kalibrációs görbét is, 2-128 fmol acetilált cAMP-oldat jelének meghatározása útján. Meghatároztuk a teljes kötött [125I]cAMP-jelet és a nemspecifikus kötés útján keletkező jelet is. A KZ6/rGR-DHFR-2-klón esetében telítési glukagonkoncentrációnál (10-100 nmol/1) a cAMPkoncentráció 140-szeres indukálódását tapasztaltuk, és az ED50-érték 0,25 nmol/l-nek adódott
HU 219 674 Β
E) Az intracellurális kalciumkoncentráció meghatározása
A pLJ4-transzfektánsok glukagon hatására bekövetkező intracellurális kalciumkoncentráció-változásban megnyilvánuló válaszreakcióit lényegében a Grynkiewicz és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük [J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985); mely publikáció teljes terjedelmében a technika állásához tartozó kitanítás részét képezi], A pLJ4-plazmiddal transzfektált BHKsejteket kétmélyületű tárgylemezre helyeztük (NUNC) kamránként 5 x1ο4 sejtet juttatva a tárgylemezve. A sejteket ezután szokásos tenyésztési körülmények között 1-3 napig tenyésztettük metotrexát szelekciós táptalajban. A táptalajt ezután a sejtekről leszívattuk és a kamrákat 2x1 mm leképezőpufferrel (3. táblázat) kiöblítettük. A sejteket ezután 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk 0,5 ml Fura-2-AM-oldattal (3. táblázat). Az inkubálás után a Fura-2-AM-oldatot eltávolítottuk, és a sejteket 3x1 mm leképezőpufferrel leöblítettük. Az utolsó öblítés után minden kamrában 0,5 puffért hagytunk. A sejteket ezután szobahőmérsékleten sötétben állni hagytuk 30-120 percig.
A leképezést egy „Nikon Diaphot” inverz fluoreszcens mikroszkópberendezéssel hajtottuk végre, higanyívlámpa, valamint 10-szeres és 40-szeres „Nikon Fluor” száraz objektívlencsék alkalmazásával. A kísérleteket egy „Sun SPARC II” munkaállomás alkalmazásával ellenőriztük és analizáltuk, az Inovision (Research Triangle Park, N. C.) által forgalmazott „RATIOTOOL” szoftver felhasználásával. Az alternáló gerjesztési hullámhosszt ennek a szoftvernek a segítségével kontrolláltuk, egy automatikus szűrőkerék alkalmazásával, amely 340 nm-es és 380 nm-es „bánd pass” szűrőket tartalmazott. A kibocsátott fényt egy dikroitikus tükör irányította (380 nm-es vágás) egy „Dage-MTI 72 CCD” videokamerára, amely egy „Genesis II” képerősítő berendezéssel volt felszerelve, és a képet a szoftver digitálisan rögzítette.
Az intracellurális kalciumkoncentrációt oly módon követtük, hogy kiszámítottuk a két gerjesztési hullámhosszhoz tartozó emissziók intenzitásának arányát (340/380), a digitális mikroszkópos leképezőmező minden egyes pontjában (512x480). Grynkiewicz és munkatársai (ugyanott) kimutatták, hogy ennek a hányadosnak az értéke arányos a kalciumkoncentrációval, amelyet a sejteken belül a Fura-2-festék tesz láthatóvá, mivel a sejtekbe juttatott Fura-2-ΑΜ acetoxi-metil-származékot a sejtek miután azt felvették Fura-2-festékké dezészterifíkálják. A „RATIOTOOL” szoftver ezt az információt hamis színezésű képként megjeleníti, amely képet azután kalciumkoncentrációra lehet kalibrálni. Egy-egy kép felvétele és az említett számítások elvégzése az említett szoftver alkalmazásával minden egyes kísérletben 5 másodperces időintervallumokban történt.
A sejteket legalább 60 másodpercig figyeltük (12 leképezés) az alapvonal meghatározásának céljából, a stimuláció megkezdése előtt. A stimulációt 200 nmol/1 glukagont tartalmazó 0,5 ml leképezőpuffemek a tárgylemezkamrában található 0,5 ml leképezőpufferhez történő hozzáadásával hajtottuk végre, és ily módon a kamrákban 100 nmol/1 glukagon-végkoncentráció alakult ki. A stimuláció után a sejteket legalább három percig figyeltük, és digitális képeket készítettünk róla.
Valamennyi leképezőmezőben találtunk számos olyan sejtet, melyeknek a fentiek szerint kialakított digitális képe a glukagon hozzáadása után drámaian rövid idő alatt megváltozott. Ennek a változásnak a mértékét a „RATIOTOOL” szoftver alkalmazásával kvantifikáltuk, és ily módon a digitális kép válaszreakciót adó sejteknek megfelelő specifikus régióit egy átlagértékkel tudtuk jellemezni. Azon sejtek arányszáma, melyek 1,4 körüli nyugalmi arányszámmal rendelkeztek, a stimuláció hatására gyorsan 3-4-re nőtt. Az arányszám 40-50 másodpercig a magas értéktartományban maradt, majd fokozatosan az alapvonalszintre süllyedt. Független kalibrációs kísérletekben kimutattuk, hogy az arányszámok nagyságában bekövetkezett fenti változás az intracellurális kalciumkoncentrációban 150 nmol/l-es nyugalmi koncentrációról 400 nmol/l-es csúcskoncentrációra történő változásnak felel meg.
F) Az inozitol-foszfát meghatározása
A glukagonreceptort a pLJ4-plazmidról expresszáló BHK570-sejteket vagy „mock-transzfektált” BHK570sejteket 24 mélyületű szövettenyésztő tálcákra szélesztettünk, mélyületenként 200 ezer sejtet juttatva a tálcákra. 24 óra elteltével a sejteket valamennyi mélyületben radioaktívan megjelöltük oly módon, hogy a sejtekhez 0,5 ml MTX-szelekciós táptalajt adtunk, amely 2,0 pCi myo-(2-3H)-inozitolt tartalmazott (specifikus aktivitás: 20 Ci/mmol; Amersham). A sejteket ezt követően 24 órán át állni hagytuk, majd 1 ml előmelegített DMEM táptalajjal mostuk őket (Dulbecco-féle módosított Eagle táptalaj; JRH Biosciences, Lenexa, Kan.), melyet 20 mmol/1 Hepes-pufferrel pH=7,0-ra pufferoltunk (Sigma Chemical Company), amely 10 mmol/1 LiCl-ot is tartalmazott. A mosó táptalajt leszívatással eltávolítottuk, majd 900 μΐ friss pufferolt táptalajjal helyettesítettük. A sejteket ezután 5 percig 37 °C-on állni hagytuk. Az inkubáció befejeztével az agonistákat és az antagonistákat 3-3 mélyülethez adtuk, és a 8. táblázatban megadott körülmények szerint és az ott megadott térfogatokban inkubáltuk a reakcióelegyeket.
8. táblázat
A ligandum térfogata Az inkubálás időtartama
pLJ4-transzfektánsok
100 μΐ 1000 nmol/1 glukagon 10 perc
100 μΐ 10 nmol/glukagon 10 perc
100 μΐ 100 nmol/1 forskolin 10 perc
,mock”-transzfektánsok
100 μΐ 1000 nmol/1 glukagon 10 perc
100 μΐ 1000 nmol/1 izoproterenol 10 perc
pLJ4-transzfektánsok
100 μΐ 50 nmol/1 glukagon 30 perc
100 μΐ 50 nmol/1 des Hís'[Glu9]-glukagon 30 perc
HU 219 674 Β
A reakciót a sejtek jégre helyezésével állítottuk le. A táptalaj leszívatását követően a sejteket 1 ml DMEM táptalaj és 1 ml jéghideg 10%-os perklórsav hozzáadásával lizáltattuk. 10 perc elteltével a sejtlizátumokat jégen tartott csövekbe vittük át, melyek mindegyike 500 μΐ 10 mmol/l-es EDTA-oldatot tartalmazott (pH=7,0). A mintákat 900 μΐ 60 mmol/l-es Hepes-pufferben készített 1,5 mol/l-es KOH-oldat hozzáadásával semlegesítettük oly módon, hogy a KOH-Hepes-oldatot cseppenként addig adtuk a mintához, míg a pHérték 7 és 7,5 közé be nem állt. A semlegesített mintákat egy éjszakán át -20 °C-on fagyasztottuk. A megfagyott mintákat ezután felolvasztottuk, és hagytuk, hogy a csapadék a mintákból kiülepedjen. A felülúszókat „AMPREP” minioszlopokra (Amicon) vittük fel, melyet előzőleg egymást követő lépésekben mostuk először 5 ml metanollal, majd 1 mol/l-es KHCO3-oldattal, végül 15 ml vízzel. Miután a mintákat fölvittük, az elfolyót összegyűjtöttük. Az oszlopot ezután 4 χ 1 ml vízzel mostuk, és minden mosás után 1 ml mintát vettünk. Az inozitol-foszfátokat az oszlopról 0,25 mol/l-es KHCO3oldat 1 ml-ének négy egymást követő lépésben történő felvitelével eluáltuk, és az eluálószer minden felvitele után 1 ml-es mintát vettünk. Ezután 10 ml „OPTIFLUOR”-oldatot (Packard Instrument Co., Menden, Conn.) adtunk valamennyi mintához, és meghatároztuk a minták radioaktivitását. Az inozitol-foszfát-reakcióút stimulációját a jelzett inozitol-foszfát-koncentráció emelkedése jelezte. Egyik mintában sem észleltük az inozitol-foszfát-termelődés stimulációját.
G) Humán glukagonreceptor expresszálása COS- 7-sejtekben
A pLJó’-plazmidot COS-7-sejtekbe transzfektáltuk, a fent leírt DEAE-dextrános eljárás alkalmazásával. A sejteket a 3. példában leírtakhoz hasonlóan kamrákat tartalmazó üveglemezeken tenyésztettük. Ezután a 3. példában leírtak szerint 125I-glukagon alkalmazásával glukagonkötődési vizsgálati eljárást hajtottunk végre, melyet emulziós autoradiográfia követett. A pLJ6’plazmiddal transzfektált sejteknek több mint 50%-a specifikusan kötött glukagont.
H) A humán glukagonreceptor expresszálása BHK570sejtekben
BHK570-sejteket (letétbe helyezve az „American Type Culture Collection”-nél, nyilvántartási szám: 10314) pLJ6’-plazmiddal transzfektáltunk, a kalciumfoszfátos transzfekciós eljárás alkalmazásával (8. példa). A transzfektált sejteket G418 jelenlétében szelektáltuk, míg különálló kolóniákat nem kaptunk. A különálló kolóniákat klónozóhengerek alkalmazásával klónoztuk. A kiónok glukagonkötő képességét a fent leírtak szerint in situ jódozott glukagonkötésén alapuló vizsgálati eljárással határoztuk meg.
A pLJ6’-plazmiddal transzfektált sejteket megvizsgáltuk cAMP-akkumuláció vonatkozásában, lényegében a 8.C) példában leírtak szerint. A transzfektánsokat vizsgálatnak vetettük alá glukagonnal, szekretinnel, VIP-pel, vagy GLP-I-gyel történő stimulálás után. A vizsgálati eljárás kimutatta, hogy a pLJ6’-plazmiddal transzfektált sejtek glukagonnal történő stimulálást követően a kontrollsejtekhez képest megnövekedett cAMP-koncentrációt halmoztak fel. A transzfektánsok szekretinnel, VIP-pel vagy GLP-I-gyel végzett stimulálása nem eredményezte a felhalmozódott cAMP-koncentráció növekedését. A sejtek intracellurális kalciumkoncentráció-növekedésben megnyilvánuló válaszreakcióját lényegében a 8.E) példában leírtak szerint határoztuk meg. A pLJ6’-plazmiddal transzfektált sejtek glukagonstimuláció hatására megnövekedett intracellurális kalciumkoncentráció kialakulásával válaszoltak, amint az a kalciumindikátor Fura-2 festék fluoreszcenciájában megnövekedett hirtelen változás útján kimutatható volt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a pLJ6’-plazmid funkcionális humán glukagonreceptort kódol, amely képes glukagont kötni, és szignáltranszdukciót végrehajtani.
Az elmondottak vonatkozásában szakember számára nyilvánvaló, hogy szemléltetés céljából a leírásban a találmány szerinti megoldásnak csak bizonyos előnyös megvalósítási módjait ismertettük, az elmondottakon túl a találmány szerinti megoldás számos más megvalósítása is elképzelhető anélkül, hogy a találmány szellemétől és az igényelt oltalmi körtől eltérnénk. Az elmondottak értelmében a találmány oltalmi körét a csatolt szabadalmi igénypontokon kívül semmi más nem korlátozza.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS : ZC447-klón
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TAACAATTTC ACACAGG 17
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC976-klón
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGTTGTAAAA CGACGGCC 1 8
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
HOSSZA: 71 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC982-klón
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
HU 219 674 Β
AATTCCCCTC CCGCAAGGC GTCGGCGCGG GGCTGGCGTA GGGCCTGCGT CAGCTGCAGC 60 CCGCCGGAGC T 71
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 63 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC983-klón
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCGGCGGGCT GCAGCTGACG CAGGCCCTAC GCCAGCCCCG CGCCGACGCC TTCGCGGGAG 60 GGG 63
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 38 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC3509-klón
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAAATTGACG TCATGGTAAA AATTGACGTC ATGGTAAG 38
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 46 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ : egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC3510-klón
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCTTACC ATGACGTCAA TTTTTACCAT GACGTCAATT TGAGCT 46
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 42 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC3747-klón
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACAGAGCAC AGAATTCACT ACTCGAGTTT TTTTTTTTTT TT 4 2
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4701-klón
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTCTCCGGT TNARRAARCA RT ANA 25
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 219 674 Β
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4715-klón
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCCACGGT AYACNGTNGG NTAYWS 26
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ : egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4758-klón
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGGAATTCK MNAYNGTNGG NYAYWS 26
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4778-klón
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGATCCY SRTTNMRRAA RCARTA 26
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC5432-klón
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA:
CAGGACCCGC TACAGCCAGA A 21
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 22 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC5433-klón
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LE ÍRÁSA:
CACCAGAAGC CCATGTTGTC A 21
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1875 bázispár TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS EREDETI FORRÁS:
SZÖVETTÍPUS: máj
KÖZVETLEN FORRÁS: pLJ4-klón SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 145...1599
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAATTCGCGG CCGCCGCCGG GCCCCAGATC CCAGTGCGCG AGGAGCCCAG TCCTAGACCC 60
AGCAACCTGA GGAGAGGTGC ACACACCCCC AAGGACCCAG GCACCCAACC TCTGCCAGAT 120
GTGGGGGGGT GGCTACCCAG AGGC ATG CTC CTC ACC CAG CTC CAC TGT CCC 171
Met Leu Leu Thr Gin Leu His Cys Pro
5
TAC CTG CTG CTG CTG CTG GTG GTG CTG TCA TGT CTG CCA AAG GCA CCC 219
Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Alá Pro
IS 20 25
TCT GCC CAG GTA ATG GAC TTT TTG TTT GAG AAG TGG AAG CTC TAT AGT 267
Ser Alá Gin Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser
35 40
HU 219 674 Β
GAC CAG TGC CAC CAC AAC CTA AGC CTG CTG CCC CCA CCT ACT GAG CTG 315
Asp Gin Cys His 45 His Asn Leu Ser Leu Leu 50 Pro Pro Pro Thr 55 Glu Leu
GTC TGC AAC AGA ACT ne GAC AAG TAC TCC TGC TGG CCT GAC ACC CCT 363
Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro
60 65 70
CCC AAC ACC ACT GCC AAC ATT TCC TGC CCC TGG TAC CTA CCT TGG TAC 411
Pro Asn Thr Thr Alá Asn Ile Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr
75 80 85
CAC AAA GTG CAG CAC CGC CTA GTG ne AAG AGG TGT GGG CCT GAT GGG 459
His Lys Val Gin His Arg Leu Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly
90 95 100 105
CAG TGG GTT CGA GGG CCA CGG GGG CAG TCA TGG CGC GAC GCC TCC CAA 507
Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gin Ser Trp Arg Asp Alá Ser Gin
110 115 120
TGT CAG ATG GAT GAT GAC GAG ATC GAG GTC CAG AAG GGG GTA GCC AAG 555
Cys Gin Met Asp Asp Asp Glu Ile Glu Val Gin Lys Gly Val Alá Lys
125 130 135
ATG TAT AGC AGC TAC CAG GTG ATG TAC ACT GTG GGC TAC AGT CTG TCC 603
Hét Tyr Ser Ser Tyr Gin Val Hét Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser
140 145 150
CTG GGG GCC TTG CTC CTG GCG CTG GTC ATC CTG CTG GGC CTC AGG AAG 651
Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys
155 160 165
CTG CAC TGC ACC CGG AAC TAC ATC CAC GGG AAC ' CTG HC GCG TCC ne 699
Leu HIS Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Gly Asn Leu Phe Alá Ser Phe
170 175 180 185
GTG CTC AAG GCT GGC TCT GTG CTG GTC ATT GAT TGG CTG CTC AAG ACA 747
Val Leu Lys Alá Gly Ser Val Leu Val Ile Asp Trp 1 Leu Leu Lys Thr
190 195 200
CGC TAT AGC CAG AAG ATT GGA GAT GAC CTC AGT GTG i AGC GTC TGG CTC 795
Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp Asp Leu Ser Val : Ser Val Trp Leu
205 210 215
HU 219 674 Β
AGT Ser GAT GGG GCG GTG GCT Alá Val Alá GGC Gly TGC AGA GTG GCC ACA GTG ATC ATG CAG Gin 843
Asp Gly 220 Cys 225 Arg Val Alá Thr Val 230 lle Met
TAC GGC ATC ATA GCC AAC TAC TGC TGG TTG CTG GTG GAG GGT GTG TAC 891
Tyr Gly lle lle Alá Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr
235 240 245
CTG TAC AGC CTG CTG AGC ATC ACC ACC HC TCG GAG AAG AGC ne TTC 939
Leu Tyr Ser Leu Leu Ser lle Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe
250 255 260 265
TCC CTC TAT CTG TGC ATC GGC TGG GGA TCT CCC CTG CTG TTT GTC ATC 987
Ser Leu Tyr Leu Cys lle Gly Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val lle
270 275 280
CCC TGG GTG GTG GTC AAG TGT CTG TTT GAG AAT GTC CAG TGC TGG ACC 1035
Pro Trp Val Val Val Lys cys Leu Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr
285 290 295
AGC AAT GAC AAT ATG GGA ne TGG TGG ATC CTG CGT ATC CCT GTA CTC 1083
Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp He Leu Arg He Pro Val Leu
300 305 310
CTG GCC ATA CTG ATC AAT TTT ne ATC TTT GTC CGC ATC ATT CAT cn 1131
Leu Alá lle Leu lle Asn Phe Phe He Phe Val Arg He lle His Leu
315 320 325
CTT GTG GCC AAG CTG CGT GCC CAT CAG ATG CAC TAT GCT GAT TAC AAG 1179
Leu Val Alá Lys Leu Arg Alá His Gin Met His Tyr Alá Asp Tyr Lys
330 335 340 345
ne CGG CTA GCC AGG TCC ACG CTG ACC CTC ATT CCT CTG CTG GGA GTC 1227
Phe Arg Leu Alá Arg Ser Thr Leu Thr Leu lle Pro Leu Leu Gly Val
350 355 360
CAC GAA GTG GTC TTT GCC TTT GTG ACT GAT GAG CAT GCC CAG GGC ACC 1275
His Glu Val Val Phe Alá Phe Val Thr Asp Glu His Alá Gin Gly Thr
365 370 375
CTG CGC TCC ACC AAG CTC TTT TTT GAC CTG TTC ne AGC TCC TTT CAG 1323
Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gin
380
385
390
HU 219 674 Β
GGT CTG CTG GTG GCT GTT Val CTC TAC TGT TTC CTC AAC AAG GAG GTG CAG 1371
Gly Leu Leu 395 Val Alá Leu 400 Tyr Cys Phe Leu Asn 405 Lys Glu Val Gin
GCA GAG CTA CTG CGG CGT TGG AGG CGA TGG CAA GAA GGC AAA GCT cn 1419
Alá Glu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Arg Trp Gin Glu Gly Lys Alá Leu
410 415 420 425
CAG GAG GAA AGG ATG GCC AGC AGC CAT GGC AGC CAC ATG GCC CCA GCA 1467
Gin Glu Glu Arg Met Alá Ser Ser His Gly Ser His Met Alá Pro Alá
430 435 440
GGG ACT TGT CAT GGT GAT CCC TGT GAG AAA CTT CAG cn ATG AGT GCA 1515
Gly Thr Cys His Gly Asp Pro Cys Glu Lys Leu Gin Leu Met Ser Alá
445 450 455
GGC AGC AGC AGT GGG ACT GGC TGT GAG CCC TCT GCG AAG ACC TCA TTG 1563
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly Cys Glu Pro Ser Alá Lys Thr Ser Leu
460 465 470
GCC AGT AGT CTC CCA AGG CTG GCT GAC AGC CCC ACC TGAATCTCCA 1609
Alá Ser Ser Leu Pro Arg Leu Alá Asp Ser Pro Thr
475 480 485
CTGGACTCCA GCCAAGTTGG ATTCAGAAAG GGCCTCACAA GACAACCCAG AAACAGATGC 1669
CTGGCCAAGG CTGAAGAGGC AAAGCAGCAA GACAGCAGCT TGTACTATCC ACACTCCCCT 1729
AACCTGTCCT GGCCGGGTAC AGGCCACATT GATGGAGTAG GGGCTGGATA TGATGGAGTA 1789
GCCATGCTAT GAACIATGGG TGTTCCCATG AGTGTTGCCA TGTTCCATGC ACACAGATAT 1849
GACCTTCAGT AAAGAGCTCC CGTAGG 1875
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 485 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Hét Leu Leu Thr Gln Leu H1s Cys Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Valu Val
5 10 15 5
Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Alá Pro Ser Alá Gin Val Met Asp PheP Phe
25 30
HU 219 674 Β
Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gin Cys His His Asn Leu
35 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp
50 55 60
Lys Tyr Ser cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Alá Asn Ile
65 70 75 80
Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gin His Arg Leu
90 95
Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg
100 105 110
Gly Gin Ser Trp Arg Asp Alá Ser Gin Cys Gin Hét Asp Asp Asp Glu
115 120 125
Ile Glu Val Gin Lys Gly Val Alá Lys Hét Tyr Ser Ser Tyr Gin Val
130 135 140
Hét Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá
145 150 155 160
Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr
165 170 175
Ile His Gly Asn Leu Phe Alá Ser Phe Val Leu Lys Alá Gly Ser Val
180 185 190
Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly
195 200 205
Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Alá Val Alá Gly
210 215 220
Cys Arg Val Alá Thr Val Ile Hét Gin Tyr Gly Ile Ile Alá Asn Tyr
225 230 235 240
Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Ile
245 250 255
HU 219 674 Β
Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr
260 265
Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val lle Pro Trp Val
275 280
Leu Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp
290 295 300
Trp Trp lle Leu Arg lle Pro Val Leu Leu Alá lle
305 310 315
Phe lle Phe Val Arg lle lle His Leu Leu Val Alá
325 330
His Gin Met His Tyr Alá Asp Tyr Lys Phe Arg Leu
340 345
Leu Thr Leu lle Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val
355 360
Val Thr Asp Glu His Alá Gin Gly Thr Leu Arg Ser
370 375 380
Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gin Gly Leu Leu
385 390 395
Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gin Alá Glu Leu
405 410
Arg Arg Trp Gin Glu Gly Lys Alá Leu Gin Glu Glu
420 425
Ser His Gly Ser His Met Alá Pro Alá Gly Thr Cys
435 440
Cys Glu Lys Leu Gin Leu Met Ser Alá Gly Ser Ser
450 455 460
Leu Cys lle Gly 270
Val Val Lys Cys 285
Asn Met Gly Phe
Leu lle Asn Phe 320
Lys Leu Arg Alá 335
Alá Arg Ser Thr 350
Val Phe Alá Phe 365
Thr Lys Leu Phe
Val Alá Val Leu 400
Lsu Arg Arg Trp 415
Arg Met Alá Ser 430
His Gly Asp Pro 445
Ser Gly Thr Gly
HU 219 674 Β
Cys Glu Pro Ser Alá Lys Thr Ser Leu Alá Ser Ser Leu Pro Arg Leu 465 470 475 480
Alá Asp Ser Pro Thr 485
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 576 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: G30-klón
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: intron ELHELYEZKEDÉS: 225...314
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: exon ELHELYEZKEDÉS: 1...225
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: exon ELHELYEZKEDÉS: 315...576
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACATGGTAG GTCACAGCCT GTCCCTGGGG GCCCTGCTCC TCGCCTTGGC CATCCTGGGG 60
GGCCTCAGCA AGCTGCACTG CACCCGCAAT GCCATCCACG CGAATCTGTT TGCGTCCTTC 120
GTGCTGAAAG CCAGCTCCGT GCTGGTCATT GATGGGCTGC TCAGGACCCG CTACAGCCAG 180
AAAATTGGCG ACGACCTCAG TGTCAGCACC TGGCTCAGTG ATGGAGTGAG CCCCCCTCGG 240
CGGCCCCAGG CAGGTGGGTG GGTGGGCAGC CAGGCAGGTG GCCACGTAGC CGCGTCACAC 300
TGCACCTGTA CCAGGCGGTG GCTGGCTGCC GTGTGGCCGC GGTGTTCATG CAATATGGCA 360
TCGTGGCCAA CTACTGCTGG CTGCTGGTGG AGGGCCTGTA CCTGCACAAC CTGCTGGGCC 420
TGGCCACCTT CCCCGAGAGG AGCTTCTTCA GCCTCTACCT GGGCATCGGC TGGGGTGCCC 480
CCATGCTGTT CGTCGTCCCC TGGGCAGTGG TCAAGTGTCT GTTCGAGAAC GTCCAGTGCT 540
GGACCAGCAA TGACAACATG GGCTTCTGGT GGATCC 576
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 487 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
HU 219 674 Β
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: 40-2-2-klón
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS SAJÁTSÁG: 1...486
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAC ATG GTA GGT CAC AGC CTG TCC CTG GGG GCC CTG CTC CTC GCC TTG 48
Asp Hét Val Gly His Ser Leu Ser Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá Leu
1 5 10 15
GCC ATC CTG GGG GGC CTC AGC AAG CTG CAC TGC ACC CGC AAT GCC ATC 96
Alá He Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Alá Ile
20 25 30
CAC GCG AAT CTG TTT GCG TCC TTC GTG CTG AAA GCC AGC TCC GTG CTG 144
His Alá Asn Leu Phe Alá Ser Phe Val Leu Lys Alá Ser Ser Val Leu
35 40 45
GTC ATT GAT GGG CTG CTC AGG ACC CGC TAC AGC CAG AAA ATT GGC GAC 192
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp
50 55 60
GAC CTC AGT GTC AGC ACC TGG CTC AGT GAT GGA GCG GTG GCT GGC TGC 240
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Alá Val Alá Gly Cys
65 70 75 80
CGT GTG GCC GCG GTG ne ATG CAA TAT GGC ATC GTG GCC AAC TAC TGC 288
Arg Val Alá Alá Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Alá Asn Tyr Cys
85 90 95
TGG CTG CTG GTG GAG GGC CTG TAC CTG CAC AAC CTG CTG GGC CTG GCC 336
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Alá
100 105 110
ACC ne CCC GAG AGG AGC ne ne AGC CTC TAC CTG GGC ATC GGC TGG 384
Thr Phe Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
115 120 125
GGT GCC CCC ATG CTG ne GTC GTC CCC TGG GCA GTG GTC AAG TGT CTG 432
Gly Alá Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Alá Val Val Lys Cys Leu
130 135 140
HU 219 674 Β
TTC GAG AAC GTC CAG TGC TGG ACC AGC AAT GAC AAC ATG GGC TTC TGG 480
Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp
145 150 155 160
TGG ATC C 487
Trp Ile
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 162 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Hét Val Gly His Ser Leu Ser Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá Leu
1 5 10 15
Alá Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Alá He
20 25 30
His Alá Asn Leu Phe Alá Ser Phe Val Leu Lys Alá Ser Ser Val Leu
35 40 45
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp
50 55 60
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Alá Val Alá Gly Cys
65 70 • 75 80
Arg Val Alá Alá Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Alá Asn Tyr Cys
85 90 95
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Alá
100 105 110
Thr Phe Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
115 120 125
Gly Alá Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Alá Val Val Lys Cys Leu
130 135 140
HU 219 674 Β
Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Hét Gly Phe Trp 145 150 155 160
Trp Ile
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4812-klón
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGAGTTCAC GAATTCCATG G 21
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC4814
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGTTCACGAA TTCCATGGCC CCCCCCCCCC CCCC 34
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC5624
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCATCTCTT GAACACGAAG 20
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 41 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS: ZC5763
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGAGAGAGA GAGAATTCGG AGGAGCGTAC ACACACACCA G 41
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 44 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
KÖZVETLEN FORRÁS : ZC5849
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TTTATTGTTG GAGGACATTT CCAT 44
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1809 bázispár
HU 219 674 Β
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettő
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
EREDETI FORRÁS:
ÉLŐLÉNY: homo sapiens
KÖZVETLEN FORRÁS: pLJ6’-klón
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS SAJÁTSÁG: 53-1486
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAATTCTGTG CAGCCCCTGC CAGATGTGGG AGGCAGCTAG CTGCCCAGAG GC ATG 55
Met
CCC CCC TGC CAG CCA CAG CGA CCC CTG CTG CTG TTG CTG CTG CTG CTG 103
Pro Pro Cys Gin Pro Gin Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
5 10 15
GCC TGC CAG CCA CAG GTC CCC TCC GCT CAG GTG ATG GAC ne CTG TTT 151
Alá Cys Gin Pro Gin Val Pro Ser Alá Gin Val Met Asp Phe Leu Phe
20 25 30
GAG AAG TGG AAG CTC TAC GGT GAC CAG TGT CAC CAC AAC CTG AGC CTG 199
Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gin Cys His His Asn Leu Ser Leu
35 40 45
CTG CCC CCT CCC ACG GAG CTG GTG TGC AAC AGA ACC ne GAC AAG TAT 247
Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr
50 55 60 65
TCC TGC TGG CCG GAC ACC CCC GCC AAT ACC ACG GCC AAC ATC TCC TGC 295
Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Alá Asn Thr Thr Alá Asn Ile Ser Cys
70 75 80
CCC TGG TAC CTG CCT TGG CAC CAC AAA GTG CAA CAC CGC ne GTG ne 343
Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gin His Arg Phe Val Phe
85 90 95
AAG AGA TGC GGG CCC GAC GGT CAG TGG GTG CGT GGA CCC CGG GGG CAG 391
Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gin
100 105 110
CCT TGG CGT GAT GCC TCC CAG TGC CAG ATG GAT GGC GAG GAG ATT GAG 439
Pro Trp Arg Asp Alá Ser Gin Cys Gin Met Asp Gly Glu Glu Ile Glu
115 120 125
HU 219 674 Β
GTC Val 130 CAG AAG GAG GTG GCC AAG ATG TAC AGC AGC HC CAG GTG ATG TAC 487
Gin Lys Glu Val Alá Lys Met 135 Tyr Ser Ser 140 Phe Gin Val Met Tyr 145
ACA GTG GGC TAC AGC CTG TCC CTG GGG GCC CTG CTC CTC GCC TTG GCC 535
Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá Leu Alá
150 155 160
ATC CTG GGG GGC CTC AGC AAG CTG CAC TGC ACC CGC AAT GCC ATC CAC 583
Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Alá Ile His
165 170 175
GCG AAT CTG TTT GCG TCC ne GTG CTG AAA GCC AGC TCC GTG CTG GTC 631
Alá Asn Leu Phe A1a Ser Phe Val Leu Lys Alá Ser Ser Val Leu Val
180 185 190
ATT GAT GGG CTG CTC AGG ACC CGC TAC AGC CAG AAA ATT GGC GAC GAC 679
Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp Asp
195 200 205
CTC AGT GTC AGC ACC TGG CTC AGT GAT GGA GCG GTG GCT GGC TGC CGT 727
Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Alá Val Alá Gly Cys Arg
210 215 220 225
GTG GCC GCG GTG ne ATG CAA TAT GGC ATC GTG GCC AAC TAC TGC TGG 775
Val Alá Alá Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Alá Asn Tyr Cys Trp
230 235 240
CTG CTG GTG GAG GGC CTG TAC CTG CAC AAC CTG CTG GGC CTG GCC ACC 823
Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Alá Thr
245 250 255
CTC CCC GAG AGG AGC ne TTC AGC CTC TAC CTG GGC ATC GGC TGG GGT 871
Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp Gly
260 265 270
GCC CCC ATG CTG ne GTC GTC CCC TGG GCA GTG GTC AAG TGT CTG ne 919
Alá Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Alá Val Val Lys Cys Leu Phe
275 280 285
GAG AAC GTC CAG TGC TGG ACC AGC AAT GAC AAC ATG GGC TTC TGG TGG 967
Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp
290
295
300
305
HU 219 674 Β
ATC CTG CGG TTC CCC GTC TTC CTG GCC ATC CTG ATC AAC TTC TTC ATC 1015
Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Alá Ile Leu Ile Asn Phe Phe Ile
310 315 320
HC GTC CGC ATC GTT CAG CTG CTC GTG GCC AAG CTG CGG GCA CGG CAG 1063
Phe Val Arg Ile Val Gin Leu Leu Val Alá Lys Leu Arg Alá Arg Gin
325 330 335
ATG CAC CAC ACA GAC TAC AAG TTC CGG CTG GCC AAG TCC ACG CTG ACC 1111
Hét His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Alá Lys Ser Thr Leu Thr
340 345 350
CTC ATC CCT CTG CTG GGC GTC CAC GAA GTG GTC TTT GCC HC GTG ACG 1159
Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Alá Phe Val Thr
355 360 365
GAC GAG CAC GCC CAG GGC ACC CTG CGC TCC GCC AAG CTC CTC TTC GAC 1207
Asp Glu His Alá Gin Gly Thr Leu Arg Ser Alá Lys Leu Phe Phe Asp
370 375 380 385
CTC TTC CTC AGC TCC TTC CAG GGC CTG CTG GTG GCT GTC CTC TAC TGC 1255
Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gin Gly Leu Leu Val Alá Val Leu Tyr Cys
390 395 400
HC CTC AAC AAG GAG GTG CAG TCG GAG CTG CGG CGG CGT TGG CAC CGC 1303
Phe Leu Asn Lys Glu Val Gin Ser Glu Leu Arg Arg Arg trp His Arg
405 410 415
TGG CGC CTG GGC AAA GTG CTA TGG GAG GAG CGG AAC ACC AGC AAC CAC 1351
Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn His
420 425 430
AGG GCC TCA TCT TCG CCC GGC CAC GGC CCT CCC AGC AAG GAG CTG CAG 1399
Arg Alá Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu Gin
435 440 445
TTT GGG AGG GGT GGT GGC AGC CAG GAT TCA TCT GCG GAG ACC CCC TTG 1447
Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gin Asp Ser Ser Alá Glu Thr Pro Leu
450 455 460 465
HU 219 674 Β
GCT GGT GGC CTC CCT AGA TTG GCT GAG AGC CCC TTC TGAACCCTGC 1493
Alá Gly Gly Leu Pro Arg Leu Alá Glu Ser Pro Phe
470 475
TGGGACCCCA GCTAGGGCTG GACTCTGGCA CCCAGAGGCG TCGCTGGACA ACCCAGAACT 1553
GGACGCCCAG CTGAGGCTGG GGGCGGGGGA GCCAACAGCA GCCCCCACCT ACCCCCCACC 1613
CCCAGTGTGG CTGTCTGCGA GATTGGGCCT CCTCTCCCTG CACCTGCCTT GTCCCTGGTG 1673
CAGAGGTGAG CAGAGGAGTC CAGGGCGGGA GTGGGGGCTG TGCCGTGAAC TGCGTGCCAG 1733
TGTCCCCACG TATGTCGGCA CGTCCCATGT GCATGGAAAT GTCCTCCAAC AATAAAGAGC 1793
TCAAGTGGTC ACCGAG 1809
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 477 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Hét Pro Pro Cys Gin Pro Gin Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Alá Cys Gin Pro Gin Val Pro Ser Alá Gin Val Met Asp Phe Leu 20 25 30
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gin Cys His His Asn Leu Ser 35 40 45
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys 50 55 60
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Alá Asn Thr Thr Alá Asn IIe Ser
70 75 80
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gin His Arg Phe Val
90 95
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly 100 105 110
HU 219 674 Β
Gin Pro Trp Arg Asp Alá Ser Gin Cys Gin Met Asp Gly Glu Glu Ile 115 120 125
Glu Val Gin Lys Glu Val Alá Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gin Val Met 130 135 140
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Alá Leu Leu Leu Alá Leu
145 150 155 160
Alá Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Alá Ile
165 170 175
His Alá Asn Leu Phe Alá Ser Phe Val Leu Lys Alá Ser Ser Val Leu 180 185 190
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp 195 200 205
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Alá Val Alá Gly Cys 210 215 220
Arg Val Alá Alá Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Alá Asn Tyr Cys 225 230 235 240
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Alá 245 250 255
Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp 260 265 270
Gly Alá Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Alá Val Val Lys Cys Leu 275 280 285
Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp 290 295 300
Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Alá Ile Leu Ile Asn Phe Phe 305 310 315 320
HU 219 674 Β
Ile Phe Val Arg Ile Val Gin Leu 325
Gin Hét His His Thr Asp Tyr Lys
340
Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val
355 360
Thr Asp Glu His Alá Gin Gly Thr
370 375
Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gin
385 390
Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gin
405
Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu
420
His Arg Alá Ser Ser Ser Pro Gly
435 440
Gin Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser
450 455
Leu Alá Gly Gly Leu Pro Arg Leu
465 470
Leu Val Alá Lys Leu Arg Alá Arg
330 335
Phe Arg Leu Alá Lys Ser Thr Leu
345 350
His Glu Val Val Phe Alá Phe Val
365
Leu Arg Ser Alá Lys Leu Phe Phe
380
Gly Leu Leu Val Alá Val Leu Tyr
395 400
Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His
410 415
Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn
425 430
His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu
445
Gin Asp Ser Ser Alá Glu Thr Pro
460
Alá Glu Ser Pro Phe
475
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (14)

1. Izolált DNS-molekula, amely glukagonreceptorpolipeptidet vagy -peptidet kódol, azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciák bármelyikét tartalmazza:
a) a 14. azonosító számú nukleotidszekvencia 145-1599. nukleotidjainak szekvenciája;
b) a 14. azonosító számú nukleotidszekvencia 226-570. nukleotidjainak szekvenciája;
c) a 24. azonosító számú nukleotidszekvencia 53-1483. nukleotidjainak szekvenciája; vagy
d) az a), b) vagy c) bekezdés szerinti nukleotidszekvencia komplementerével hibridizálódni képes szekvencia.
2. Az 1. igénypont szerinti DNS-molekula, azzaljellemezve, hogy az általa kódolt glukagonreceptor-polipeptid szekvenciája tartalmazza a következő aminosavszekvenciák bármelyikét:
a) a 15. azonosító számú aminosavszekvencia 1. metioninjától 485. treoninjáig terjedő szekvenciarészlet;
b) a 15. azonosító számú aminosavszekvencia 28. glutaminjától 142. tirozinjáig terjedő szekvenciarészlet; vagy
c) a 25. aminosavszekvencia 1. metioninjától 477. fenil-alaninjáig terjedő szekvenciarészlet.
3. DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 1. igénypont szerinti, glukagonreceptor-poli50
HU 219 674 Β peptidet vagy -peptidet kódoló DNS-szegmenst, amely szegmens funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy, az első DNS-szegmens expresszálódásához szükséges további DNS-szegmenshez.
4. A 3. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy az első DNS-szegmens szekvenciája megegyezik egy 2. igénypont szerinti DNS-molekula szekvenciájával.
5. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 3. vagy 4. igénypont szerinti DNS-konstrukciót tartalmaz.
6. Eljárás glukagonreceptor-polipeptid vagy -peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy 5. igénypont szerinti gazdasejtet az első DNS-szegmens expresszióját elősegítő körülmények között tenyésztünk.
7. Izolált glukagonreceptor-polipeptid, azzal jellemezve, hogy 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-molekula kódolja.
8. A 7. igénypont szerinti izolált glukagonreceptorpolipeptid, azzal jellemezve, hogy aminosavsorrendje tartalmazza a 15. azonosító számú aminosavszekvencia 28. glutaminjától a 150. tirozinjáig terjedő szekvenciarészletet.
9. Izolált glukagonreceptor-peptid, azzal jellemezve, hogy 7. vagy 8. igénypont szerinti polipeptid legalább 10 aminosav hosszúságú fragmense.
10. Izolált monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy képes specifikusan kötődni 7-9. igénypontok bármelyike szerinti izolált glukagonreceptor-polipeptidhez vagy -pepiidhez, és gátolja a glukagon glukagonreceptorhoz történő kötődését.
11. Legalább 12 nukleotidból álló hibridizációs próba, azzal jellemezve, hogy képes 1. vagy 2. igénypont szerinti, glukagonreceptort vagy glukagonreceptor-polipeptidet kódoló nukleinsawal hibridizálódni.
12. Eljárás glukagonantagonisták jelenlétének kimutatására, azzal jellemezve, hogy
i) egy vizsgált vegyületet glukagonagonista jelenlétében alkalmas körülmények között válasz-reakcióúthoz kapcsolt, 7. vagy 8. igénypont szerinti rekombináns glukagonreceptor-polipeptiddel érintkeztetünk a vizsgált vegyületnek a receptorhoz kötődéséhez és a válasz-reakcióútban a kötődésnek megfelelő válasz kialakulásához elégséges ideig; és ii) kimutatjuk a vizsgált vegyület glukagonreceptorhoz történő kötődésének következtében kialakult, válasz-reakcióút stimuláltságában beálló csökkenést, ahhoz a stimuláltsági szinthez viszonyítva, melyet a glukagonagonista önmagában receptorhoz adva előidézne, és ily módon a glukagonantagonista jelenlétét kimutatjuk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy válasz-reakcióútként membránkötött adenilátciklázon alapuló válasz-reakcióutat alkalmazunk.
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy válasz-reakcióútként egy luciferáz enzimen alapuló jelzőrendszert magában foglaló válasz-reakcióutat alkalmazunk.
HU9500596A 1992-08-28 1993-08-30 Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra HU219674B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93833192A 1992-08-28 1992-08-28
US08/086,631 US5776725A (en) 1992-08-28 1993-07-01 Recombinant production of glucagon receptors
PCT/US1993/008174 WO1994005789A1 (en) 1992-08-28 1993-08-30 Glucagon receptors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9500596D0 HU9500596D0 (en) 1995-04-28
HUT74352A HUT74352A (en) 1996-12-30
HU219674B true HU219674B (hu) 2001-06-28

Family

ID=26774970

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500596A HU219674B (hu) 1992-08-28 1993-08-30 Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5770445A (hu)
EP (1) EP0658200B1 (hu)
JP (1) JP3515112B2 (hu)
AT (1) ATE285472T1 (hu)
AU (1) AU689078B2 (hu)
CA (1) CA2142819C (hu)
DE (1) DE69333726T8 (hu)
HU (1) HU219674B (hu)
NZ (1) NZ255922A (hu)
PL (1) PL178685B1 (hu)
RU (1) RU2184779C2 (hu)
WO (1) WO1994005789A1 (hu)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE204325T1 (de) * 1993-04-29 2001-09-15 Unilever Nv Herstellung von antikörpern oder funktionstüchtig gemachten teilen davon, abgeleitet von schweren ketten von immunglobulinen von camelidae
US6340588B1 (en) 1995-04-25 2002-01-22 Discovery Partners International, Inc. Matrices with memories
EP1003904B1 (en) 1997-05-23 2007-07-11 BioArray Solutions Ltd. Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
US6223560B1 (en) * 1998-03-20 2001-05-01 Cerocon S.A. Process of producing a glassy product for multiple applications and products obtained by the process
US6608173B1 (en) * 1998-04-04 2003-08-19 Kenji Sakamoto Method for searching physiologically active substances, process for producing these substances and drugs found by the searching method
ES2257303T3 (es) * 1999-07-12 2006-08-01 Genentech, Inc. Vectores de expresion y procedimientos.
US20050005310A1 (en) * 1999-07-12 2005-01-06 Genentech, Inc. Expression vectors and methods
AU2002239538A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-18 Deltagen, Inc. Transgenic mice containing glucagon receptor gene disruptions
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
WO2004111078A2 (en) * 2003-06-18 2004-12-23 Theratechnologies Inc. Compounds that modulate the glucagon response and uses thereof
US20070087987A1 (en) * 2005-09-19 2007-04-19 Monia Brett P Modulation of glucagon receptor expression
JP5781308B2 (ja) * 2008-02-19 2015-09-16 バイオコン・リミテッドＢｉｏｃｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 異種タンパク質を得る方法およびインスリン類似体
AR070844A1 (es) 2008-03-27 2010-05-05 Lilly Co Eli Fragmento fab o anticuerpo monoclonal humanizado que comprende el fragmento fab, y su uso para la manufactura de un medicamento antagonista del polipeptido del receptor de glucagon para el tratamiento o prevencion de diabetes de tipo 1 o 2
BR112012005208A2 (pt) * 2009-09-08 2016-11-22 Neopharm Co Ltd antiocorpos contra o receptor de glucagon e seu uso
US8771696B2 (en) 2010-11-23 2014-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of reducing the severity of stress hyperglycemia with human antibodies to the glucagon receptor
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
EP2758533B1 (en) 2011-09-20 2018-04-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of gcgr expression
JP2016520058A (ja) 2013-05-07 2016-07-11 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 抗グルカゴン受容体抗体およびその使用方法
SG11201901355SA (en) 2016-08-30 2019-03-28 Regeneron Pharma Methods of treating severe insulin resistance by interfering with glucagon receptor signaling
EP3529278A1 (en) 2016-10-20 2019-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
KR102627311B1 (ko) 2017-01-27 2024-01-22 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 글루카곤 수용체 결합 단백질 및 이의 사용 방법
JP2020531532A (ja) 2017-08-22 2020-11-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド グルカゴン受容体シグナル伝達に干渉することによって尿素サイクル異常症を治療する方法
EP3829636A1 (en) 2018-07-27 2021-06-09 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Use of glucagon receptor antagonists with immunotherapeutic agent
JP7418788B2 (ja) * 2019-10-16 2024-01-22 国立研究開発法人産業技術総合研究所 グルカゴン認識ペプチド並びにグルカゴン検出法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430326A (en) * 1981-12-22 1984-02-07 University Patents, Inc. Method of diminishing glucose levels resulting from endogenous glucagon
ES2085004T3 (es) * 1991-01-17 1996-05-16 Zymogenetics Inc Metodos para detectar antagonistas de glucagon.
DK39892D0 (da) * 1992-03-25 1992-03-25 Bernard Thorens Peptid

Also Published As

Publication number Publication date
PL307746A1 (en) 1995-06-12
JP3515112B2 (ja) 2004-04-05
CA2142819A1 (en) 1994-03-17
RU95106629A (ru) 1997-03-27
HUT74352A (en) 1996-12-30
EP0658200B1 (en) 2004-12-22
CA2142819C (en) 2003-08-19
WO1994005789A1 (en) 1994-03-17
DE69333726T8 (de) 2006-04-27
EP0658200A1 (en) 1995-06-21
JPH08500737A (ja) 1996-01-30
US5919635A (en) 1999-07-06
AU5097493A (en) 1994-03-29
ATE285472T1 (de) 2005-01-15
DE69333726T2 (de) 2006-02-23
AU689078B2 (en) 1998-03-26
HU9500596D0 (en) 1995-04-28
NZ255922A (en) 1998-01-26
PL178685B1 (pl) 2000-06-30
DE69333726D1 (de) 2005-01-27
US5770445A (en) 1998-06-23
RU2184779C2 (ru) 2002-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219674B (hu) Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra
JP4411330B2 (ja) 腫瘍壊死因子関連リガンド
JP2001526532A (ja) オステオプロテゲリン結合性蛋白および受容体
JPH10511557A (ja) 血管内皮細胞増殖因子の変種、それらの使用およびそれらの生産法
JPH05508534A (ja) 昆虫ステロイドレセプターｄｎａ配列の同定及び発現
JP2002502589A (ja) ４５個のヒト分泌タンパク質
JP2002521055A (ja) ９８個のヒト分泌タンパク質
JP2000350582A (ja) 新規の７−トランスメンブランレセプター
JP2001512307A (ja) プロエキセンジンをコードするポリヌクレオチドならびにその作製方法および使用
KR20170138410A (ko) 비-천연 세마포린 3 및 이의 의학적 용도
JP2002539773A (ja) 分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸
JPH06503949A (ja) 新規インシュリン様成長因子結合タンパク質ｉｇｆｂｐ―５
US5776725A (en) Recombinant production of glucagon receptors
JPH10507930A (ja) プロスタグランジンレセプターｄｐ
JPH06503947A (ja) Ｉｇｆｂｐ―５をコードする遺伝物質
JPH06505157A (ja) ヒト濾胞刺激ホルモンの受容体
JPH08510921A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質
JP3521331B2 (ja) 新規ポリペプチド
JP2003510071A (ja) Ｐ−糖タンパク質およびその使用
JPH05502166A (ja) Ａｉｄｓ、ａｒｃおよびｈｉｖ感染の治療および予防のための免疫治療用組成物
JP2991640B2 (ja) ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質
KR20230148824A (ko) 핵산을 전달하기 위한 조성물 및 방법
JPH08228781A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質をコードするｄｎａ
JP2003235578A (ja) 酸性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター及びその遺伝子
JP2002085059A (ja) 新規なｔｓｐ１ドメイン含有ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVO NORDISK A/S, DK