JP2001506967A

JP2001506967A - 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法

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Publication number: JP2001506967A
Application number: JP50808998A
Authority: JP
Inventors: ロソック，メイ・ジョアン; イェルトン，デイル・イー
Original assignee: ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー; ロソック，メイ・ジョアン
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2001-05-29
Also published as: CA2262405A1; WO1998005787A1; AU3968897A; DE69738522T2; DE69738522D1; EP0918872A1; ATE386809T1; EP0918872B1; ES2300113T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者における免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、患者に免疫グロブリンまたはＩｇ融合タンパク質分子を投与することを含み、該免疫グロブリン分子は可変領域および定常領域を有し、該免疫グロブリン分子は投与前に該定常領域の少なくとも一部の不活化により修飾されていることを特徴とする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法本明細書を通じて種々の刊行物が言及されている。これら刊行物は、本発明が関係する技術分野の状態を一層詳細に記載するために、その全体の開示を本明細書中に参照のため引用する。発明の技術分野本発明は、治療またはインビボ診断の結果としての免疫グロブリン誘発毒性を抑制または低減する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、未修飾の抗体または組換え結合タンパク質をインビボで使用する代わりに、投与したときに免疫グロブリン誘発毒性が低減または抑制されるように定常ドメインの構造を変化させた修飾抗体または組換え結合タンパク質の使用を提供する。発明の背景長年の間、研究者は免疫系を治療に利用することを企ててきた。免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は免疫系の重要な部分を構成するが、（１）多様なリガンドファミリーと反応すること、（２）種々のエフェクター機能を有すること、および（３）生物学的に非常に重要であることのために高い関心を集めている。その潜在能力にもかかわらず、他の問題の中でも免疫グロブリン免疫療法に付随する一貫した問題は、正常細胞および疾患細胞の両者ともに認識する抗体を用いることによる正常細胞に対する毒性作用であった。この問題は解決には程遠い。なぜなら、現在利用できる抗体の大部分が正常細胞および疾患細胞の両者の表面に位置する標的を認識するからである（スラビン−チオリニ（Slavin−Chiorini）ら、In t．J.Cancer ５３：９７〜１０３（１９９３））。定常領域は、抗体依存補体媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）により細胞死を促進しうる。定常領域の一部、とりわけＣＨ₂ドメインを欠失させても抗原結合機能は保持しうる（イェルトン（D.Yelton）、シャーフ(M.Scharf)、生物学的機能の変化した変異モノクローナル抗体、J.Exp.Method s １５６：１１３１〜１１４８（１９８２））。他の研究者はＣＨ₂欠失抗体を作成した（ミューラー（Mueller）、Proc.Natl. Acad.Sci.USA ８７：５７０２〜５７０５（１９９０））。彼らの知見は、ＣＨ₂ 欠失抗体が対応する完全な抗体に比べて腫瘍保持マウスの血液からはるかに速やかに除去されることを示している。他のインビボの知見もまた、ＣＨ₂欠失抗体（ｃｈ１４.１８ＤＣＨ２と称する）が、その免疫原性の減少、標的特異性の増大、および循環血流からの速やかな除去のためにヒト腫瘍の放射性免疫検出のために潜在的に有用な試薬であることを確認している（ミューラーら、Proc.Natl. Acad．Sci.USA ８７：５７０２〜５７０５（１９９０））。一般に全抗体分子は、共有結合（ジスルフィド）および非共有相互作用により一緒にされた２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる。各鎖は可変領域（Ｖ）および定常領域（Ｃ）を含む。２本の鎖のアミノ末端にある可変領域は抗原結合領域を形成する。Ｈ鎖の定常領域は３つの成分またはドメインを有する。第一の定常領域ドメイン（ＣＨ₁）とＬ鎖のＣ領域とは、イソ型に依存して、場合によっては疎水的な相互作用により、一般にはジスルフィド結合により相互作用する。つぎのＣ領域ストレッチは、２本のＨ鎖の間に安定に導入された蝶番の作用をするジスルフィド結合である。第二の定常領域ドメイン（ＣＨ₂）はヒンジ領域に隣接する。ＣＨ₂は、補体結合やＦｃ受容体結合のための配列などのように抗体のエフェクター機能にとって重要な配列を含む。第三の定常領域ドメイン（ＣＨ₃）はＨ鎖のカルボキシル末端に位置し、Ｈ鎖の集合および幾つかのＣ領域機能において重要な役割をしていると考えられている。今日、臨床試験における多くの抗体は腫瘍関連抗原に対するものである。大抵の腫瘍関連抗原は腫瘍特異的ではなく、幾つかの正常な非腫瘍原性細胞の細胞表面にも一般に認められる。腫瘍関連抗原に対する幾つかの抗体の臨床的使用は、その使用に付随する毒性のために限られている。それゆえ、疾患治療（たとえば、腫瘍、腎臓疾患の治療など）およびインビボ診断の分野において免疫グロブリンの使用に伴う毒性を抑制する方法に対する必要性が存在する。本発明者らは、免疫グロブリンが疾患細胞および正常細胞の両者を認識する免疫グロブリン免疫療法またはインビボ診断に一般的に付随する正常細胞に対する毒性を抑制または低減する方法を発見することにより、この必要性と取り組んだ。本発明者らの発見は、免疫グロブリン誘発毒性を抑制または低減させる、定常領域の構造を変化させた免疫グロブリン分子またはＩｇ融合タンパク質を作成することを含む。発明の要約本発明は、公知の免疫グロブリン分子またはＩｇ融合タンパク質分子の定常領域の構造を変化させて、その結果得られる構造の変化した免疫グロブリン分子またはＩｇ融合タンパク質分子がそれらの出発材料となった非修飾分子に比べてインビボでの毒性が低減または抑制されるようにすることによる、免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法を提供する。定常領域の構造変化は、免疫グロブリン誘発毒性が低減または抑制される結果となる限り、多くの方法により行うことができる。本発明の実施に従えば、定常領域の構造変化は定常領域の全体を欠失させることにより行う。他の態様においてはＣＨ₂ドメインのみを欠失させる。他の態様においては、Ｆｃ受容体と結合するＣＨ₂ドメインの部分のみを欠失させる。さらに他の態様においては、補体成分Ｃ１ｑと結合するＣＨ２ドメインの部分のみを欠失させる。別のやり方として、他の態様においては、別個のＦｃ受容体結合ドメインおよび補体成分結合ドメイン中において複数の欠失を生成させる。別のやり方として、アミノ酸の挿入および置換などのＣＨ₂ドメインでの単一または複数の変異により構造変化を生成させる。これら変異は、免疫グロブリン誘発毒性を抑制する結果とならなければならない。一例として、定常領域内の複数の毒性関連ドメイン中のアミノ酸を変化させて、ＡＤＣＣを媒介したり補体を活性化したりできないようにし、それによって免疫療法の結果としての免疫グロブリン誘発毒性を抑制させることができる。別のやり方として、単一の毒性関連ドメイン中の複数のアミノ酸を変化させることができる。さらに別のやり方として、イソ型を変換させて、毒性を誘発しないかまたは若干の限られた毒性を誘発はするが有害な作用は呈しないように変化した免疫グロブリン分子とすることにより構造変化を生成させることができる。たとえば、イソ型の変換は、ＣＤＣやＡＤＣＣ応答または毒性を媒介する他の活性を媒介できないような定常領域となりうる。図面の簡単な説明図１は、キメラＢＲ９６およびｃＢＲ９６−２の定常領域変異体を用いた高Ｌｅ^Y発現イヌでの血漿クリアランスを示す線グラフである。図２は、キメラ（ｃ）ＢＲ９６−軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）を含むｐＴＷＤ−ｃＪＶＫ.Ｌ１と称するプラスミドの模式図である。図３は、ヒト（ｈ）ＢＲ９６−軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）を含むｐＤ１６ｈＪ１.Ｌ１と称するプラスミドの模式図である。図４は、ｈＢＲ９６−２Ａ（すなわち、Ｈ1、Ｈ２およびＨ３変異およびＣＨ₂ 欠失を有するヒト変異体ＢＲ９６（１９９６年３月６日に公開されたＰＣＴ出願第９５／３０５４４４号））のプラスミド（ｐＤ１７−ｈＪｍ１４−ｄＣＨ２. Ｈ１と称する）の模式図である。図５は、ｃＢＲ９６−Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）（すなわち、ＣＨ₂欠失を有するキメラＢＲ９６（１９９６年３月６日に公開されたＰＣＴ出願第９５／３０５４４４号））のプラスミド（ｐＤ１７−ｃＪ−ｄＣＨ２.Ｈ１と称する）プラスミドの模式図である。図６は、ｃＢＲ９６のプラスミド（ｐＤ１７−ｃＪ.Ｈ１と称する）の模式図である。図７は、（１）Ｌｅ^yに対するｈＢＲ９６−２Ａ−Ｄｏｘ（黒塗りの菱形）、（２）Ｌｅ^yに対するｈＢＲ９６−２Ａ（９６：０００６Ａ２Ｒ／Ａ）（黒塗りの四角）、（３）Ｌｅ^yに対するｈＢＲ９６−２Ａ（９６：０００６ＢＲ／Ａ）（黒塗りの三角）、およびＬｅ^yに対するＢＲ９６−Ｄｏｘ（×）のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す線グラフである。図８は、（１）Ｌｅ^yに対するＢＲ９６−Ａ−Ｄｏｘ（黒塗りの菱形）、（２）Ｌｅ^yに対するｃｈｉＢＲ９６（黒塗りの四角）、（３）Ｌｅ^yに対するｃＢＲ９６−Ａ（９６：０００３Ｒ／Ａ）（黒塗りの三角）、およびＬｅ^yに対するｃＢＲ９６−Ｄｏｘ（×）のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す線グラフである。図９ａ−ｃは、ＣＨ₂ドメインを欠失させるための工程を示す模式図である。図１０ａ−ｃは、ＢＲ９６ＩｇＧ１ＣＨ₂ドメイン点変異の構築を示す模式図である。図１１は、ｐＮｇ１／１４ベクターの構築を示す模式図である。図１２は、ｐＤ１７−ｈＢＲ９６−２の構築を示す模式図である。図１３は、ｐＤ１７−ｈＪｍ１４−ｄＣＨ２.Ｈ１の構築を示す模式図である。図１４は、図５に示すＣＨ₂欠失を有するキメラＢＲ９６プラスミドであるｐＤ１７−ｃＪ−ｄＣＨ２.Ｈ１の核酸配列である。図１５は、Ｌｅ^yで全ｃｈｉＢＲ９６と欠失ＣＨ₂ｃｈｉＢＲ９６とを比較するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す線グラフである。図１６は、７つの構造変化を記載したものである。図１７は、ｐＤ１７−ｈＧ１ｂと称するプラスミドの模式図である。図１８は、ｐＤ１７−ｈＪｍ１４.Ｈ１の核酸配列である。図１９は、ｐＤ１７−ｈＧ１ｂの核酸配列である。図２０は、補体依存細胞傷害を示す線グラフである。凡例において、黒塗りの四角はｈＢＲ９６−１；黒塗りの菱形はｈＢＲ９６−２Ｂ；黒塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ｃ；黒塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｄ；白塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ｈ；白塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ａおよび白塗りの三角は２Ｂ８、抗−シュードモナス・アエルギノーサ鞭毛ｂ型モノクローナル抗体、負の対照である。図２１は、抗体依存細胞媒介細胞傷害を示す線グラフである。凡例において、黒塗りの四角はｈＢＲ９６−１；黒塗りの菱形はｈＢＲ９６−２Ｂ；黒塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ｃ；黒塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｄ；白塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ｈ；白塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ａおよび白塗りの三角は２Ｂ８、抗− シュードモナス・アエルギノーサ鞭毛ｂ型モノクローナル抗体、負の対照である。図２２は、Ｌｅｙ−ＨＳＡでのｈＢＲ９６−２定常領域変異体の結合活性を示す線グラフである。凡例において、黒塗りの菱形はｈＢＲ９６−１；黒塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ａ（ＣＨ２欠失）；黒塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｂ（２３５、２３７変異）；白塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ｃ（３１８、３２０、３２２変異）；白塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ｄ（３３１変異）；および白塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｈ（２３５、２３７、３１８、３２０、３２２、３３１変異）である。図２３は、ＬＮＦＰＩＩＩ−ＨＳＡでのｈＢＲ９６−２定常領域変異体の結合活性を示す線グラフである。ＬＮＦＰＩＩＩは、ラクト−Ｎ−フコペンタソース、付加的な乳糖スペーサーを有するルイスＸ三炭糖（ブイ・ラブズ（V Labs）、コビントン、ルイジアナ）である。凡例において、黒塗りの菱形はｈＢＲ９６− １；黒塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ａ（ＣＨ２欠失）；黒塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｂ（２３５、２３７変異）；白塗りの四角はｈＢＲ９６−２Ｃ（３１８、３２０、３２２変異）；白塗りの丸はｈＢＲ９６−２Ｄ（３３１変異）；および白塗りの三角はｈＢＲ９６−２Ｈ（２３５、２３７、３１８、３２０、３２２、３３１変異）である。図２４Ａおよび２４Ｂは、ＲＰＣＲにより複数の変異を導入するための戦略を示す。（Ａ）ヒンジ、ＣＨ₂およびＣＨ₃ドメインを囲んで示した１.４ｋｐｂＩｇＧ重鎖領域の模式図。ＣＨ₂のＬ１、Ｌ２およびＬ３位に導入すべき部位特異的突然変異は変異体ＰＣＲプライマーの相補的セット（Ａ１とＡ２；Ｂ１とＢ２；およびＣ１とＣ２）によりコードされる。星印（＊）は各Ｌ位に導入されるアミノ酸変化の数を示す。２つのＰＣＲプライマー、Ｒｓ（組換え−センス）およびＲａ（組換え−アンチセンス）はＥｃｏ−４７−III制限部位をフランキングし、ベクター末端との相同組換えを媒介する。オリゴヌクレオチドの３'末端は矢頭で示す。（Ｂ）断片ＲｓＡ２、Ａ１Ｒａおよび線状化ベクター間での三者間相同組換えによりＬ１変異体ＩｇＧが生成される。２つの遠位の変異体セット（Ｌ１およびＬ２）は、ＲｓＡ２、Ａ１Ｂ１、Ｂ１Ｒａとベクターとの間の四者間組換えに示すように組換えＰＣＲ産物の数を増加させることにより同時に導入される。図２５は、複数のＰＣＲ断片のＲＰＣＲにより生成したコロニーから調製したＤＮＡのＥｃｏ−４７−III制限エンドヌクレアーゼ分析を示すゲルである。レーンＭ：１ｋｂラダ−ＤＮＡマーカー（ギブコ／ＢＲＬライフ・サイエンス・テクノロジー（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Life Science Technology））。レーン１〜１２：四者間相同組換えから得られた１２のランダムに選択したコロニーを用いてプラスミドを調製し、Ｅｃｏ４７−IIIで消化した。コロニー１、２、６および９は、完全に集合した１.４ｋｐｂ挿入を含む。図２６は、ｈＢＲ９６−２重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。図２７は、ｈＢＲ９６−２Ａ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。図２８は、ｃｈｉＢＲ９６重鎖可変領域およびＣＨ₂ドメインを欠失したヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を示す。本発明の詳細な説明定義本明細書において使用する「免疫グロブリン誘発毒性を抑制する」とは、免疫グロブリンまたはＩｇ融合タンパク質療法により引き起こされる毒性、たとえばＦｃ受容体のエフェクター機能により媒介される毒性に一般に付随する症状を低減または緩和することを意味する。たとえば、ＢＲ９６抗体は、胃腸管においてあるレベルで認められ腫瘍において高レベル（正常組織の胃腸管と比較して）で認められるＢＲ９６抗原を認識し結合する。ＢＲ９６抗体のＢＲ９６抗原へのインビボでの結合は、胃腸管毒性に付随する症状を引き起こす。これら症状には、しばしば血液を伴う嘔吐の速やかな開始、および悪心が含まれる。ヒトでは出血は胃底部に限られ、胃表面粘膜の糜爛を引き起こす。創傷の病理は限られており、消散する。しかしながら、制吐剤によっても軽減されない悪心および嘔吐の激しい性質は、それを用量制限性毒性として規定する。中枢神経系（ＣＮＳ）、肝臓および他の部位に認められる非常に高レベルの他の抗原については、毒性は上記以外の症状を特徴とするであろう。本明細書において使用する「免疫グロブリン分子」は、Ｂ細胞により、または組換え技術によりまたは化学的合成手段により製造できる。免疫グロブリン分子の例としては、（１）抗体、たとえばポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、および（２）結合タンパク質を含む組換えＩｇ、たとえばＩｇ融合タンパク質が挙げられる。結合タンパク質を含む組換えＩｇには、Ｉｇテールが結合した、細胞表面タンパク質、たとえばＣＤ抗原（一つの態様においてＣＴＬＡ４）が含まれる。本明細書において使用する「構造を変化させる」または「構造変化」とは、定常領域を操作して、その結果得られる分子またはタンパク質が毒性を誘発する能力が低減するようにすることを意味する。構造変化は、化学的修飾、タンパク質加水分解による変化または組換え遺伝学的手段により生成させることができる。組換え遺伝学的手段としては、これらに限られるものではないが、アミノ酸残基の欠失、挿入および置換が挙げられる。本明細書において使用する「複数の毒性関連ドメイン」とは、１を越える別個の毒性関連ドメインを意味する。免疫グロブリン分子には少なくとも２つの毒性関連ドメイン、すなわちアミノ酸２３１〜２３８あたりに位置するものとアミノ酸３１０〜３３１あたりに位置するものとが存在するように思われるので、複数の毒性関連ドメインの構造変化は、これらドメインの両者におけるアミノ酸の挿入、置換または欠失を含む。この定義は、単一の毒性関連ドメインをターゲティングする構造変化を排除するものである。単なる例として、免疫グロブリン分子の定常領域は該分子がもはやＣＤＣ応答やＡＤＣＣ応答を媒介できないように構造を変化させることができる。しかしながら、本発明の方法は、ＣＤＣ応答またはＡＤＣＣ応答を媒介するか否かに拘わらず構造変化した免疫グロブリン分子の使用を包含する。第一の要件は、変化した分子が免疫グロブリン誘発毒性を抑制しなければならないことである。構造変化は種々の仕方で行うことができる。たとえば、構造変化は全定常領域を欠失させることにより行うことができる。別のやり方として、構造変化は定常領域の全ＣＨ₂ドメインを欠失させることにより行うことができる。この場合には、全ＣＨ₂ドメインの欠失により該分子は、（１）Ｆｃ受容体に結合することができず、それゆえ抗体依存細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力がなくなり、（２）Ｃ１ｑに結合することができず、または（３）補体を活性化することができない。別のやり方として、構造変化は、Ｆｃ受容体または補体に結合するＣＨ₂の部分のみを欠失させることにより行うことができる。さらに別のやり方として、置換や挿入などの単一の変異または複数の変異をＣＨ₂ドメイン内に行うことができる。これらのいずれの変異においても第一の要件は、それが免疫グロブリン誘発毒性を抑制、低減または阻止できなければならないことである。たとえば、このことは、変化した分子がＣＤＣ応答やＡＤＣＣ応答を媒介したり補体を活性化したりできないように定常領域を変異させることにより行うことができる。別のやり方として、構造変化は、変化した分子が患者内で毒性を誘発しないようにイソ型を変換する（クラススイッチとしても知られる）ことによっても行うことができる。一つの態様において、免疫グロブリンの定常領域は、それがもはやＦｃ受容体や補体成分と結合せず、たとえば分子のＩｇＧイソ型がＩｇＧ１からＩｇＧ４に変換されるように構造を変化させる。イソ型の変換は種によらずに行うことができる、すなわち、非ヒトからのイソ型はヒトからのイソ型を用いて変換することができる（フィンケルマン（E.D.Finkelman）ら（１９９０）Annu. Rev.Immunol．８：３０３〜３３３；ホンジョー（T.Honjo）ら（１９７９）Cell 18：５５９〜５６８；ホンジョーら、「免疫グロブリン遺伝子」中、１２４〜１４９頁、アカデミックプレス、ロンドン）。本明細書において「Ｉｇ融合タンパク質」とは、構造を変化させうる定常領域を有する、組換えにより製造した抗原またはリガンド結合ドメインをいう。本明細書において「細胞傷害性薬剤」には、代謝阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質、有糸***阻害剤、および化学療法剤が含まれる。これらグループに含まれる具体例としては、これらに限られるわけではないが、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール（taxol）、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、サポリン（supporin）、ゲロニン（gelonin ）、ＰＥ４０、ブリオジン（bryodin）、ジヒドロキシアントラシンジオン（dih ydroxy anthracin dione）、アクチノマイシンＤ、および１−デヒドロテストステロンが挙げられる。本明細書において「ＢＲ９６］とは、ＰＣＴ９５／３０５４４４号（１９９６年３月６日公開）に開示された全ＢＲ９６モノクローナル抗体、（２）ＰＣＴ９５／３０５４４４号（１９９６年３月６日公開）に開示されたキメラＢＲ９６モノクローナル抗体、または（３）ＰＣＴ９５／３０５４４４号（１９９６年３月６日公開）に開示されたＢＲ９６変異体分子をいう。本明細書において「治療」とは、（１）腫瘍が所定の期間触診できないように腫瘍の寛解をもたらすこと（標準的な腫瘍測定法に従う（ミラー（A,B,Miller）ら、「癌治療の結果報告」、Cancer ４７：２０７〜２１４（１９８１）））；（２）疾患を安定化させること、または（３）臨床的に有益な何らかの効果をもたらすことをいう。本明細書において「有効量」とは、細胞を殺し、または細胞の増殖を抑制する抗体、イムノコンジュゲートまたは組換え分子の量をいう。本明細書において「投与」とは、患者への経口投与、坐剤投与、局所接触投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与または皮下投与としての投与、またはミニオスモティックポンプ（miniosmotic pump）などの除放デバイスの移植をいう。本明細書において「薬理学的に許容しうる担体」には、抗体と併用したときに該抗体の特異性または効能を保持し、患者の免疫系と非反応性の物質が含まれる。例としては、これらに限られるわけではないが、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤化剤などの標準的な薬理学的担体が挙げられる。他の担体として、滅菌溶液、コーチング錠を含む錠剤およびカプセルも含まれる。一般に、かかる担体には、デンプン、乳、糖、ある種のクレイ、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは脂肪油、ガム、グリコールまたは他の公知の賦形剤などの賦形剤が含まれる。かかる担体にはまた、香料および着色添加剤または他の成分も含まれる。かかる担体を含む組成物は、よく知られた従来法により製剤化される。本明細書において「変異」とは、たとえば相同的組換え、誤りを起こしがちなＰＣＲ、または部位特異的突然変異誘発など、いかなる手段によるものであれ、単一のアミノ酸もしくは核酸変異または複数の変異をいう。本明細書に記載の本発明がより一層理解されるように以下の記載を開示する。本発明の方法本発明は、治療またはインビボ診断での免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性を抑制する方法を提供する。たとえば、本発明の方法は、放射性標識抗体を用いた腫瘍造影の間または後に免疫グロブリンの使用に長期間臨床的に暴露されることに伴う毒性を最小限にするのに有用である。本発明の実施によれば、患者には、これらに限られるものではないが、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、およびトリの患者が含まれる。他の温血動物もまた本発明に包含される。本発明の方法は、免疫グロブリン分子を患者に投与することを含む。免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡであってよい。ＩｇＧが好ましい。本発明の一つの態様において、免疫グロブリン分子はＬｅ^yを認識し結合する。他の態様において、免疫グロブリンはＬｅ^xを認識し結合する。さらに他の態様において、免疫グロブリンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２に１９８９年２月２２日に寄託されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１００３６を有するハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体ＢＲ９６である。さらに他の態様において、免疫グロブリンは、ＡＴＣＣ、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２に１９９０年５月２３日に寄託されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４６０を有するハイブリドーマにより産生されたキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６である。本発明の実施によれば、免疫グロブリンは、２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する２特異的抗体であってよく、これら抗原のうちの一つはＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６が結合する抗原である。本発明の実施によれば、免疫グロブリンは抗イディオタイプ抗体であってよい。本発明が要求するところによれば、免疫グロブリン分子の定常領域の少なくとも一部の構造を変化させる。構造変化は多くの手段により行うことができる。一つの態様において、全定常領域、すなわちＣＨ₁、ＣＨ₂およびＣＨ₃ドメインを欠失させることができる。他の態様において、ＣＨ₂ドメインのみが免疫グロブリン分子から欠失される（たとえば、ｃＢＲ９６−Ａ（図５）、ｈＢＲ９６−２Ａ（図４））。この態様において、ＣＨ₂ドメインの欠失はＦｃ受容体または補体成分と結合できない分子という結果となる。他の態様において、補体成分Ｃ１ｑと結合するＣＨ₂ドメインの部分のみを欠失させる。さらに他の態様において、ＣＨ₂ドメイン中の特定の部分のみに変異を起こさせる。たとえば、免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように定常領域中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させることにより免疫グロブリンを修飾することができる。かかる変異の詳細は以下にも記載する。手段のいかんに拘わらず、定常領域の構造変化の第一の要件は免疫グロブリン誘発毒性が実質的に低減または抑制されることである。一つの態様において、免疫グロブリン誘発毒性の抑制は、ＣＤＣ応答またはＡＤＣＣ応答を媒介および／または補体カスケードを活性化する能力が妨害または抑制されるように定常領域の構造を変化させることにより行う。分子がＣＤＣ応答を抑制しうるか否かを決定する方法はよく知られており、たとえば、一つの方法は⁵¹Ｃｒ遊離試験を含む（ガリグ（H.Garrigues）ら、Int.J.Cancer ２９：５１１（１９８２）；ヘルシュトローム（I．Hellstrom）ら、ＰＮＡＳ８２：１４９９（１９８５））。分子がＡＤＣＣ応答を抑制しうるか否かを決定する方法はよく知られている（ヘルシュトロームら、ＰＮＡＳ８２：１４９９（１９８５））。分子が補体を活性化しうるか否かを決定する方法はよく知られている。本発明の他の態様において、本発明の方法は、構造を変化させた定常領域を有するＩｇ融合タンパク質を患者に投与することを含む。定常領域の構造変化には、構造変化した分子がもはやＦｃ受容体や補体成分に結合できないように全Ｃ領域またはその一部を欠失させること、たとえばＣＨ₂ドメインを変化させることが含まれる。本発明はさらに、患者における免疫療法の結果生じる免疫グロブリン誘発毒性を抑制する方法を提供する。この方法は、上記のように定常領域の少なくとも一部の構造が変化するように修飾した抗体を患者に投与することを含む。一つの態様において、該抗体はＬｅ^yを認識および結合する。他の態様において、該抗体はＬｅ^xを認識および結合する。本発明の実施によれば、該抗体はＡＴＣＣに寄託したＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体ＢＲ９６であってよい。別の態様によれば、該抗体はＡＴＣＣに寄託したＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマによって産生されたキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６であってよい。さらに、該抗体は、２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する２特異的抗体であってよく、該抗原の一つはＡＴＣＣに寄託したＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体ＢＲ９６が結合するものである。さらに、本発明は、患者の疾患の免疫療法の結果生じる免疫グロブリン誘発毒性を抑制する方法を提供する。疾患は結合すべき抗原に応じて様々であろう。疾患の例としては、これらに限られるわけではないが、免疫疾患、癌、心血管疾患、神経系疾患、皮膚疾患または腎臓疾患が挙げられる。この方法は以下の工程を含む。工程１は標的とする抗体を選択することである。一般に、該標的は疾患と関連し、該標的に向けられた抗体は知られている。たとえば、該標的はＢＲ９６抗原であってよく、選択した抗体はＢＲ９６である。この方法の工程２は、免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるようにかくして選択した抗体の定常領域の構造を変化させることである。たとえば、不活化は、かくして選択したＩｇタンパク質の定常領域のＣＨ₂ドメイン中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させることにより行うことができる。この方法の工程３は、工程２の該構造を変化させた抗体が該標的を認識し、かかる結合が該疾患と関連する症状を直接または間接に緩和する条件下で該抗体を患者に投与することである。本発明によれば、一つの態様において、工程１は標的に対するＩｇ融合タンパク質を選択することである。さらに、この方法は、上記と同じ手段によりＩｇタンパク質の定常領域のＣＨ₂ドメインの構造を変化させることにより、かくして選択したＩｇ融合タンパク質を変異させることを提供する。本発明はさらに、ヒト癌を治療する方法を提供する。たとえば、上記免疫グロブリン、抗体またはＩｇ融合タンパク質を標準的な従来の治療方法、たとえば化学療法、放射線療法と併用することができ、または治療剤を癌の部位に送達するために治療薬剤、または毒素並びにリンホカインまたは腫瘍抑制増殖因子とコンジュゲートまたは結合させることができる。治療剤を免疫グロブリンにコンジュゲートさせる技術はよく知られている（たとえば、アーノン（Arnon）ら、「癌療法における薬剤の免疫標的のためのモノクローナル抗体」、モノクローナル抗体および癌療法中、レイスフェルド（Reis feld）ら（編）、２４３〜５６頁（アラン・アール・リス（Alan R.Liss,Inc.）（１９８５））；ヘルシュトロームら、「ドラッグデリバリーのための抗体」、制御されたドラッグデリバリー（第２版）中、ロビンソン（Robinson）ら（編）、６２３〜５３頁（マーセル・デッカー（Marcel Dekker,Inc.）（１９８７））；ソープ（Thorpe）、「癌療法における細胞傷害剤の抗体担体：評論集」、モノクローナル抗体’８４：生物学的および臨床的応用中、ピンチェラ（Pinchera）ら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５）中；およびソープら、「抗体−毒素コンジュゲートの調製および細胞傷害特性」、Immunol.Rev.６２：１１９〜５８（１９８２）を参照）。別の態様において、構造変化させた抗体またはＩｇ融合タンパク質は高エネルギーの放射能剤、たとえば¹³¹Ｉなどの放射性同位体に結合させることができ、該剤は腫瘍部位に局在したときに幾つかの細胞直径（diameters）の死亡という結果となる（たとえば、オーダー（Order）、「癌療法における放射性標識抗体の治療学的使用の分析、結果および未来の展望」、癌の検出および治療のためのモノクローナル抗体、ボールドウィン（Baldwin）ら（編）、３０３〜１６頁（アカデミックプレス、１９８５）中を参照）。さらに他の態様によれば、構造変化させたＢＲ９６抗体は、シーガル（Segal）の米国特許第４，６７６，９８０号に記載されているように第二の抗体にコンジュゲートさせて腫瘍の治療のための抗体ヘテロコンジュゲートを生成させることができる。本発明の構造変化させた抗体またはＩｇ融合タンパク質のさらに他の治療学的応用には、プロドラッグを細胞傷害薬剤へ変換させうる酵素にたとえば組換えＤＮＡ法またはタンパク質化学的方法によりコンジュゲートまたは結合させること、および該抗体−酵素コンジュゲートをプロドラッグとともに使用して該プロドラッグを細胞傷害薬剤へ腫瘍部位にて変換させることが含まれる（たとえば、センター（Senter）ら、「抗体−アルカリホスファターゼの抗腫瘍作用」、Proc.N atl.Acad.Sci.USA、８５：４８４２〜４６（１９８８）；「モノクローナル抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートによるリン酸化マイトマイシンＣおよびエトポシド誘導体のインビトロおよびインビボ抗腫瘍活性の増大」、 Cancer Research ４９：５７８９〜５７９２（１９８９）中；およびセンターら、「抗体−酵素コンジュゲートによるプロドラッグの活性化：癌治療の新アプローチ」、ＦＡＳＥＢＪ．４：１８８〜１９３（１９９０）を参照）。それゆえ、本発明が、構造を変化させたＣＨ₂ドメインを有する免疫グロブリン分子、抗体およびＩｇ融合タンパク質を含む医薬組成物、およびヒト癌の治療方法におけるその使用を包含することは明らかである。たとえば、本発明は、薬理学的に有効な量の構造を変化させたＢＲ９６および薬理学的に許容しうる担体を含む、ヒト癌の治療に使用するための医薬組成物を包含する。該組成物は、未修飾であるかまたは治療剤（たとえば、薬剤、毒素または第二の抗体）にコンジュゲートした、構造を変化させた抗体またはＩｇ融合タンパク質または抗体断片を含んでいてよい。該組成物はさらに、癌を治療するための他の抗体またはコンジュゲートを含んでいてよい（たとえば、抗体カクテル）。本発明の組成物の投与は、髄腔内、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内投与または腫瘍中への直接投与を含む（これらに限られるものではない）常法を用いて行うことができる。静脈内投与が好ましい。本発明の組成物は、液体の溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマー性のマイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、および注射または注入用液剤を含む（これらに限られるものではない）種々の剤型にすることができる。好ましい剤型は、投与方法および治療学的な応用に依存する。本発明の組成物はまた、当該技術分野で知られた通常の薬理学的に許容しうる担体および賦形剤、たとえばヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、硫酸プロタミンなどの塩または電解質を含むのが好ましい。本発明の実施によれば、医薬担体は液体担体であってよい。液体担体はリン脂質であってよい。さらに、液体担体は脂肪酸であってよい。液体担体はまた界面活性剤であってよい。本明細書において界面活性剤とは、液体の表面張力を変える、一般的には表面張力を下げる物質である。本発明の一つの例において、界面活性剤は非イオン界面活性剤であってよい。非イオン界面活性剤の例としては、これらに限られるものではないが、ポリソルベート８０（トウィーン８０またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られる）、ブリジおよびトリトン（たとえば、トリトンＷＲ−１３３９およびトリトンＡ−２０）が挙げられる。別の態様において、界面活性剤はイオン界面活性剤であってよい。イオン界面活性剤の例としては、これに限られるものではないが、アルキルトリメチルアンモニウムブロマイドが挙げられる。さらに本発明によれば、液体担体はリポソームであってよい。本出願において「リポソーム」とは、本発明のいずれかの分子またはその組み合わせを含む膜結合小胞である。本発明の組成物の最も有効な投与方法および投与計画は、疾患の重篤度および経過、患者の健康状態および処置に対する応答および治療に当たる医師の判断に依存する。種々のサイズおよび種の動物とヒトとのｍｇ／ｍ²表面積ベースでの投与量の相互関係は、フライライヒ（Freireich,E.J.）ら、Cancer Chemother.,Rep.５０（４）：２１９〜２４４（１９６６）に記載されている。投与計画の調節は、腫瘍細胞増殖抑制応答および腫瘍細胞殺傷応答を最適化するように行うことができ、たとえば、投与量を１日単位で分割し投与することができるし、投与量を状況に依存して比例して低減させることができる（たとえば、幾つかの分割した投与量を毎日投与するかまたは特定の治療状況に依存して比例して低減させることができる）。本発明の分子本発明は構造を変化させたＢＲ９６またはＢＲ９６Ｉｇ融合タンパク質を提供する。構造を変化させたＢＲ９６抗体またはＩｇ融合タンパク質は、ＢＲ９６の可変領域と修飾した定常領域とを有する。この修飾は、構造を変化させたＢＲ９６抗体またはＩｇ融合タンパク質に免疫グロブリン誘発毒性を抑制する能力を付与するものである。種々の態様の構造を変化させたＢＲ９６またはＢＲ９６Ｉｇ融合タンパク質を調製した。ｃＢＲ９６−Ａと称する一つの態様において、ｃＢＲ９６の全ＣＨ₂ドメインを欠失させた。ｃＢＲ９６−Ａは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示す配列を有するプラスミドにより発現される。ｃＢＲ９６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示す配列を有するプラスミドにより発現される。ｈＢＲ９６−２Ａと称する他の態様において、ｈＢＲ９６の全ＣＨ₂ドメインを欠失させた。ｈＢＲ９６−Ａは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示す配列を有するプラスミドにより発現される。ｈＢＲ９６は、ＰＣＴ出願第９５／３０５４４４号（１９９６年３月６日公開）に記載されたＨ1、Ｈ２およびＨ３変異を有する変異体ＢＲ９６である。ｈＢＲ９６−２Ｂと称するさらに他の態様においては、２３５位アミノ酸に位置するロイシン残基がアラニンに変異している。さらに、２３７位アミノ酸に位置するグリシンがアラニンに変異している。使用したアミノ酸位の番号付けは、カバット（Kabat）ら、免疫学的に興味のもたれるタンパク質の配列、第５版（１９９１）、米国健康・福祉省（Department of Health and Human Services)に記載されている。さらに、ｈＢＲ９６−２Ｃと称する他の態様において、標準プロトコールを用い（アレクサンダー（Alexander R.）およびグレグ・ウインター（Greg Winter ）、「ＩｇＧ上のＣ１ｑの結合部位」、Nature ３３２：７３８（１９８８））、３１８位のグルタミン酸残基がセリンに変異し、３２０位のリジン残基がセリンに変異し、３２２位のリジン残基がセリンに変異している。さらに、ｈＢＲ９６−２Ｄと称する他の態様において、３３１位のプロリン残基がアラニンに変異している（タオ（Ｍ−Ｈ．Tao）ら、「補体活性化においてイソ型特異的な差異を決定するヒト免疫グロブリンＧの構造的特徴」、J.Exp.Me d．１７８：６６１〜６６７（１９９３）；シュ（Y.Xu）ら、「ＩｇＧ１ドメインおよびＩｇＧ４ドメインの３３１位の残基は、補体結合および活性化の特異な能力に貢献する」、J.Biol．Chem.２６９：３４６９〜３４７４（１９９４））。ｈＢＲ９６−２Ｅと称する別の態様において、２３５位のロイシン残基がアラニンに変異し、２３７位のグリシン残基がアラニンに変異し、３１８位のグルタミン酸残基がセリンに変異し、３２０位のリジン残基がセリンに変異し、３２２位のリジン残基がセリンに変異している（モーガン（A.Morgan）ら、「キメラヒトＩｇＧ１抗ＨＬＡ−ＤＲのＣＨ₂ドメインのＮ末端はＣ１ｑ、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩおよびＦｃ（ガンマ）ＲIII結合に必要である」、Immunol．８６：３１９〜３２４（１９９５））。ｈＢＲ９６−２Ｆと称するさらに他の態様において、２３５位のロイシン残基がアラニンに変異し、２３７位のグリシン残基がアラニンに変異し、３３１位のプロリン残基がアラニンに変異している。ｈＢＲ９６−２Ｇと称するさらに他の態様において、３１８位のグルタミン酸残基がセリンに変異し、３２０位のリジン残基がセリンに変異し、３２２位のリジン残基がセリンに変異し、３３１位のプロリン残基がアラニンに変異している。ｈＢＲ９６−２Ｈと称する他の態様において、２３５位のロイシン残基がアラニンに変異し、２３７位のグリシン残基がアラニンに変異し、３１８位のグルタミン酸残基がセリンに変異し、３２０位のリジン残基がセリンに変異し、３２２位のリジン残基がセリンに変異し、３３１位のプロリン残基がアラニンに変異している。構造を変化させたＢＲ９６抗体または融合タンパク質は、その形態に依存してモノクローナル抗体などの単機能抗体、または２特異的抗体やヘテロ抗体などの２機能抗体であってよい。構造を変化させたＢＲ９６の用途、すなわち治療剤や診断剤としての用途が、作成した構造を変化させたＢＲ９６の種々の形態を決定するであろう。抗体の発現については幾つかのオプションが存在する。免疫発現ライブラリーをトランスフェクトーマ（transfectoma）法と組み合わせることができる、すなわち、免疫グロブリン遺伝子からのＦａｂ分子の遺伝子を所望の定常ドメインエクソンと連結することができる。ついで、これら組換え遺伝子をトランスフェクションし、トランスフェクトーマ中で発現させれば抗体分子が分泌されるであろう。本発明のポリペプチドが産生されたら誘導体分子を生成するために分子内のアミノ酸修飾により修飾することができる。そのような誘導体分子は該ポリペプチドの機能的な特性を保持しているであろう、すなわち、かかる置換を有する分子は依然としてＢＲ９６抗原やその一部に該ポリペプチドが結合することを可能にするであろう。タンパク質のコンホメーションや機能を変えることなく該タンパク質中に「保存的アミノ酸置換」と称するある種のアミノ酸置換を頻繁に行いうることはタンパク質化学の充分に確立された原則である。アミノ酸置換には、必ずしもこれに限られるものではないが、当該技術分野で「保存的」として知られるアミノ酸置換が含まれる。かかる変更には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）のいずれかをこれら疎水性アミノ酸のいずれかで置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）で置換することおよびその逆；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）で置換することおよびその逆；およびセリン（Ｓ）をトレオニン（Ｔ）で置換することおよびその逆が含まれる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して保存的とされうる。たとえば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは相互に交換可能であり、アラニンとバリン（Ｖ）ともそうである。メチオニン（Ｍ）は比較的疎水性であるが、ロイシンおよびイソロイシンとしばしば相互に交換可能であり、ときにバリンとも相互に交換可能である。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）とは、アミノ酸残基の有意の特性がその荷電にあり、これら２つのアミノ酸残基間でのｐＫの差異が有意でない位置においてはしばしば相互に交換可能である。さらに他の変更も特定の環境においては「保存的」と認められる。本発明の一つの態様において、ポリペプチドは実質的に純粋である、すなわち、該ポリペプチドの標的への結合を抑制または低減させる他のアミノ酸残基を含んでおらず、抗体療法の間または後に通常示される胃腸毒性を抑制または低減させる。本発明をコードする核酸分子ＢＲ９６の可変領域および定常領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は知られている。該免疫グロブリン定常領域の配列は知られており、図１８に示してある。ＢＲ９６抗体の定常領域中で特定の変異を行った。上記７つの変異体（ｈＢＲ９６−２ＢからｈＢＲ９６−２Ｈ）をコードする核酸分子は以下の通りである。ｈＢＲ９６−２Ｂにおいて、２３５位および２３７位アミノ酸におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｃにおいて、３１８位、３２０位および３２２位におけるセリンはＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡまたはＵＧＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｄにおいて、３３１位におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｅにおいて、２３５位および２３７位におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。３１８位、３２０位および３２２位におけるセリンはＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡまたはＵＧＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｆにおいて、２３５位、２３７位および３３１位におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｇにおいて、３１８位、３２０位、３２２位におけるセリンはＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡまたはＵＧＧによりコードされている。さらに、３３１位におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。ｈＢＲ９６−２Ｈにおいて、２３５位、２３７位および３３１位におけるアラニンはコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによりコードされている。さらに、３１８位、３２０位、３２２位におけるセリンはＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡまたはＵＧＧによりコードされている。上記のいずれも、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、たとえば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）であってよい。イムノコンジュゲートイムノコンジュゲート（全抗体またはＩｇ融合タンパク質を有する）は、葉酸や、ドキソルビシン（ＤＯＸ）（ヤング（Young）およびライスフェルド、「ヒトメラノーマ関連プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体と結合したドキソルビシンはヌードマウスにおける株化腫瘍異種移植片の増殖を抑制する」、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：１１８９〜１１９３（１９８８））、ダウノマイシン（アーノン（Arnon）およびシーラ（Sela）、「抗腫瘍抗体とのダウノマイシンのコンジュゲートのインビトロおよびインビボ効果」、Immunol.Rev.６５：５〜２７（１９８２））、およびモルホリノドキソルビシン（ミューラー（Mueller）ら、「モルホリノドキソルビシンおよび酸開裂性リンカーとの抗体コンジュゲート」、Bioconjugate Chem.，１：３２５〜３３０（１９９０））を含むアントラサイクリン類（ピーターソン（Peterson）ら、「実験系およびヒト白血病におけるアントラサイクリンの輸送および貯蔵」、癌療法におけるアントラサイクリン抗生物質、マッギア（Muggia）ら（編）、１３２頁（マーチナス・ニジュホフ・パブリッシャーズ（１９８２）；スミス（Smyth）ら、「モノクローナル抗体を用いたクロラムブチルの腫瘍への特異的ターゲティング」、J.Natl．Cancer Ins t.，７６：５０３〜５１０（１９８６）））などの広範囲の化学療法剤を用いて構築することができる。ＢＲ９６はドキソルビシンとコンジュゲートされ、ある種の癌または癌腫の治療に有効であることが示されている（トレイル（Trail，P.A.）、ウィルナー（W illner,D.）、ラッシュ（Lasch,S.J.）、ヘンダーソン（Henderson,A.J.）、カサザ（Casazza,A.M.）、ファイアーストーン（Firestone,R.A.）、ヘルシュトローム（Hellstrom,I.）およびヘルシュトローム（Hellstrom,K.E.）、ＢＲ９６− ドキソルビシンイムノコンジュゲートによる異種移植したヒト癌の治癒、Sience ，２６１：２１２〜２１５、１９９３）。本発明の実施によれば、構造を変化させたＢＲ９６は、非還元ＩｇＧ、還元し構造を変化したＩｇＧ、および融合タンパク質を含む形態で用いることができる（１９９６年３月６日公開のＰＣＴ出願第９５／３０５４４４号）。イムノコンジュゲートの製造に使用するのに適した治療剤としては、天然のＰＥかまたはＬｙｓＰＥ４０のいずれかの形態のシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）が挙げられる。ＬｙｓＰＥ４０は、コンジュゲーションの目的でリジン残基を含む遺伝子的に修飾したアミノ末端を含む切断した形態のものである。ドキソルビシンもまた適した治療剤である。治療剤の他の例としては、これらに限られるものではないが、代謝阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質、および有糸***阻害剤が挙げられる。代謝阻害剤としては、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シトラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（decarbazine）が挙げられる。アルキル化剤としては、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（lomustine）（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（II）（ＤＤＰ）シスプラチンが挙げられる。アントラサイクリン類としては、ダウノルビリン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン（本明細書ではアドリアマイシンとも称する）が挙げられる。他の例としては、ミトザントロン（mitozantrone）およびビサントレン（bisa ntrene）が挙げられる。抗生物質としては、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ）が挙げられる。代謝阻害剤としては、ビンクリスチンおよびビンブラスチン（一般にビンカアルカロイドと呼ばれている）が挙げられる。他の細胞傷害剤としては、プロカルバジン、オキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、マイトタン（mytotane）（Ｏ，Ｐ'−（ＤＤＤ））、インターフェロンが挙げられる。他の細胞傷害剤としては、これらに限られるものではないが、リシン、ブリオジン、ゲロニン、サポリン、ドキソルビシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、１−デヒドロテストステロン、およびグルココルチコイドが挙げられる。かかる治療剤および細胞傷害剤の類似体および同族体は、明らかに本発明により包含される。たとえば、化学療法剤のアミノプテリンには相関的な改良された類似体、すなわちメトトレキセートがある。さらに、ドキソルビシンの改良された類似体はＦｅキレートである。また、１ −メチルニトロソ尿素の改良された類似体はロムスチンである。さらに、ビンブラスチンの改良された類似体はビンクリスチンである。また、メクロレタミンの改良された類似体はシクロホスファミドである。本発明の分子の製造方法免疫グロブリン分子のＣＨ₂ドメイン中で部位特異的突然変異誘発を行うには複数のアプローチが存在する。一つのアプローチは、変異を有するＣＨ₂ドメインをＰＣＲ増幅し、ついで該変異したＣＨ₂を所望の免疫グロブリンを含むベクター、たとえばｈＢＲ９６−２中に相同組換えすることである。たとえば、ｈＢＲ９６−２ＢおよびｈＢＲ９６−２Ｄはこの方法により作成した。他のアプローチは一本鎖ＤＮＡの部位特異的突然変異により変異を導入することである。たとえば、ベクターｐＤ１７−ｈＧ１ｂはＩｇＧ１の定常領域のみを含み、ｈＢＲ９６のＶドメインを含まないが、ｆｌ複製起点を有している。このことは該ベクターにファージミドとしての特性を付与し、バイオ−ラドムタージーン（Muta−Gene）ファージミドインビトロ突然変異キットバージョン２により提供されるようにクンケル（Kunkel,T．A.）らの方法（クンケル、ロバーツ（J. D.Roberts）およびザクール（R.A．Zakour）、１９８７ Methods Enzymol．１５４：３６７〜３８３）に従って突然変異実験を行うことができる。本発明をより一層理解できるようにするため、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明のためにのみ例示するのであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものでないことが理解されなければならない。実施例１以下の標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いた。材料：イムロン２９６ウエルプレートおよびジェネティック・システムズ・スペシメン・ダイルーエント・コンセントレイト（Genetic Systems Specimen Diluent Concentrate）（×１０）；抗体コンジュゲートは、ジェネティック・システムズ・スペシメン・ダイルーエント（×１）中のヤギ抗ヒトカッパ−ＨＲＰマウスアドソーブド（Goat Anti Human Kappa−ＨＲＰ Mouse Adsorbed）（１：１０，０００）であった；ジェネティック・システムズ・ＥＩＡ・クロモジェン・リージェント（Genetic Systems ＥＩＡ Chromogen Reagent）（ＴＭＢ）（１：１００）；ジェネティック・システムズ・ＥＩＡ・バッファード・サブストレイト（Genetic Systems ＥＩＡ Buffered Substrate）（×１）；一次抗体または抗原はアフィニピュア・Ｆ（ａｂ’）₂・フラグメント・ゴート・アンチ・ヒューマン・ＩｇＧＦｃ・フラグメント・スペシフィック（Affini Pure F（ａｂ’）₂Fragment Goat Anti Human ＩｇＧＦｃ Fragment specific（ジャクソン・イムノ・リサーチ）、ゴート・アンチ・ヒューマン・カッパ−ＵＮＬＢ（Go at Anti Human Kappa−ＵＮＬＢ）（サザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ）、Ｌｅ^y−ＨＳＡ（アルバータ・リサーチ・カウンシル（Alberta Researc h Council））であった。方法：一次抗体または抗原を０．０５Ｍ Carb/Bicarb緩衝液中に１．０μｇ／ｍｌに希釈する。ウエル当たり１００μｌの該希釈液をイムロン２プレートに加える。プレートを密封し、４℃で一夜インキュベートする。プレートを軽く指ではじき（flicking）、ペーパータオルにブロットすることによりプレートをブロッキングする。２００μｌ／ウエルのジェネティック・システムズ、スペシメン・ダイルーエント・コンセントレイト（×１）を加える。室温で少なくとも１時間インキュベートし、プレートの中身を捨てる。プレートを食塩水／トウィーンで３回洗浄する。ブロットして乾燥させる。プレートを室温で乾燥させる（４５分から１時間）。プレートを密封し、４℃で貯蔵する。試験サンプルは以下のようにして調製する。試料および標準をスペシメン・ダイルーエント中で１：１０に希釈する。別個の丸底プレートで系列希釈を行う。最終の希釈液１００μｌ／ウエルを抗原コーティングアッセイプレートに移し、ついで４℃で一夜インキュベートする。プレートを食塩水／トウィーンで３回洗浄する。コンジュゲーションのため、ジェネティック・システムズ・コンジュゲート・ダイルーエント（×１）中の抗体−ＨＲＰコンジュゲート１００μｌ／ウエルを加える。プレートを室温にて６０分間インキュベートする。プレートを食塩水／トウィーンで３回洗浄する。ＥＩＡ・バッファード・サブストレイト（×１）中のジェネティック・システムズ・ＥＩＡ・クロモジエン・リージェント（ＴＭＢ）（１：１００）１００μ ｌ／ウエルを加える。室温で１５分間インキュベートし、１ＮＨ₂ＳＯ₄１００ μｌ／ウエルで停止させる。プレートをＥＩＡプレートリーダー中で４５０／６３０ｎｍで読み取る。実施例２ＣＨ₂欠失ＢＲ９６分子の構築ＣＨ₂ドメインを欠失させるための戦略：ＣＨ₂欠失ＢＲ９６分子を構築するため、ヒンジドメイン、ＣＨ₂ドメインおよびＣＨ₃ドメインを非コード領域でのＥｃｏ４７−III制限消化によりキメラＢＲ９６およびヒト化ＢＲ９６９６−２ＩｇＧ１分子から除いた。ＣＨ₂ドメインが欠失したヒトＩｇＧ１（ｐＮγ１．１４）分子からヒンジドメインおよびＣＨ₃ ドメインをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。ＩｇＧ１定常領域のＥｃｏ４７−III部位を保存する両側の部位の配列に相同な２つのオリゴヌクレオチド（センス４９ｍｅｒ、アンチセンス５０ｍｅｒ）を合成した。増幅したヒンジドメインおよびＣＨ₃ドメインのＰＣＲ断片を、ＢＲ９６ＩｇＧ１分子のＥｃｏ４７−III部位にインビボ相同組換えにより加えた（バペック（P.Bupec k）ら、Nucl.Acids Research（１９９３）２１：３６０１〜３６０２）。新たに作成されたＢＲ９６ＩｇＧ１分子を制限マッピングおよびシークエンシングにより確認した。ＣＨ₂欠失ヒトＩｇＧ１（ｐＮγ１．１４）の構築のため、ソーイング（sewin g）ＰＣＲ法を用いた（ロバート・ホートン（Robert M.Horton）ら（１９９０） Biotech ８（５）Ｐ．５２８）。ＣＨ₁ドメインを、センスオリゴヌクレオチド（プライマーＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（プライマーＢ）を用いて線状化ヒトＩｇＧ１定常領域ベクター（ｐＮγ１．７）から５８０ｂｐの断片として増幅させた。このＰＣＲ断片は、ＣＨ₁ドメインの５'末端のＨｉｎｄ−III部位（太字）からＣｅｌ−II、Ｓａｌ−Ｉ、Ｄｒａ− III、Ｋｐｎ−Ｉ、６ｂｐヌクレオチドのスペーサーおよび３’末端のＭｒｏ− Ｉ部位（太字）にわたっている。ついで、ＣＨ₃ドメインをセンスプライマー（プライマーＣ）およびアンチセンスプライマー（プライマーＤ）を用いて線状化ヒトＩｇＧ１定常領域ベクター（ｐＮγ１．７）から（Ｘｂａ−Ｉ部位へ）部分的に増幅させた。Ｓａｌ−Ｉ、Ｄｒａ−III、Ｋｐｎ−Ｉ、６ヌクレオチドスペーサーおよびＭｒｏ−Ｉ部位（太字）（その５ '末端）を有するＰＣＲ断片（約１５０ｂｐ）はＣＨ₃ドメイン内のＸｂａ−Ｉ部位（太字）にのみわたっている。ＣＨ₁ＰＣＲ断片およびＣＨ₃部分ＰＣＲ断片をプライマーを用いることなくＰＣＲで結合させた。反応は変性およびアニーリングのサイクルを２回完全に行い、３'末端の相同領域で結合させた。プライマーＡおよびＤ（上記）を反応液に加え、ＰＣＲサイクルを完了させた。ポリメラーゼはＤＮＡをプライマーＡおよびプライマーＤで伸長させ、完全長の（６６０ｂｐ）ＰＣＲ断片を得た。この新たに伸長されたＰＣＲ断片は、５'末端から３'末端に順に以下のように配置されている：Ｈｉｎｄ−III−ＣＨ₁−Ｃｅｌ−II−Ｓａｌ−Ｉ−Ｄｒａ−III−Ｋｐｎ−Ｉ−６ｂｐスペーサー−Ｍｒｏ−Ｉ−ＣＨ₃部分−Ｘｂａ−Ｉ。ついで、結合したＰＣＲ断片（ＣＨ₁ドメインおよび部分ＣＨ₃ドメインを有する）を平滑末端ライゲーションによりｐＥＭＢＬ１８ベクターのＳｍａ−Ｉ部位にクローニングし、配列をジデオキシ配列決定法（サンガーら（１９７７）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７４：５４６３〜５４６６）により確かめた。ＣＨ₁および部分ＣＨ₃を哺乳動物発現ベクターに移すため、ｐＥＭＢＬ１８およびｐＮγ１．７ベクターをともにＨｉｎｄ−IIIおよびＸｂａ−Ｉで消化した。このＨｉｎｄ−IIIおよびＸｂａ−Ｉ断片を線状化ｐＮγ１．７ベクターの同部位にライゲートした。このＣＨ₁ドメインおよび完全なＣＨ₃を有する新たな構築物をｐＮγ１．１０ベクターと称した。ヒンジ断片は、ヒンジエクソンにフランキングするように設計されＳａｌ−ＩおよびＤｒａ−IIIクローニング部位を各末端に有するプライマーを用い、Ｈｉｎｄ−III消化したｐＮγ１．７ベクターから増幅させた。これらの部位はまた、ｐＮγ１．１０構築物のＣＨ₁ドメインとＣＨ₃ドメインとの間にも存在する。６ｂｐスペーサーおよびＳａｌ−Ｉクローニング部位（太字）を有するセンスオリゴヌクレオチドおよび６ｂｐスペーサーおよびＤｒａ−IIIクローニング部位（太字）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてヒンジ断片（２５０ｂｐ）の増幅を行った。このヒンジ領域ＰＣＲ断片をｐＥＭＢＬ１８のＳｍａ−Ｉ部位に平滑末端ライゲーションによりクローニングした。ヒンジドメインを有するｐＥＭＢＬ１８およびＣＨ₂ドメインとＣＨ₃ドメインを有するｐＮγ１．１０の両者をＳａｌ−ＩおよびＤｒａ−IIIで消化した。消化したヒンジ断片をｐＮγ１．１０ベクターのＳａｌ−ＩおよびＤｒａ−III線状化部位へクローニングした。このようにしてＣＨ₁ドメイン、ヒンジドメインおよびＣＨ₃ドメインを有する新たな構築物をｐＮγ１．１１と称した。最終的なＣＨ₂欠失ヒトＩｇＧ１構築物を作成するため、ｐＮγ１．１１構築物およびｐＮγ１．１１ベクターの両者をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。ＣＨ₁ドメイン、ヒンジドメインおよびＣＨ₃ドメインを含む断片を線状化ｐＮγ１．１１ベクター中にクローニングした。この新たな定常領域ＩｇＧ１構築物はＣＨ₂ドメインを欠失しており、ｐＮγ１．１４と称した（図１１）。ＢＲ９６ＩｇＧ１をＥｃｏ４７−IIIで消化するため、ヒンジドメイン、ＣＨ₂ ドメインおよびＣＨ₃ドメインを有する制限断片を、キメラ分子およびヒト化分子の両者でＢＲ９６ＩｇＧ１ベクターの定常領域配列上で同定した。この断片の５'末端はＢＲ９６ＩｇＧ１分子のＣＨ₁とヒンジとの間のイントロン内にあり、３'末端はＣＨ₃イントロン内にある。ヒンジドメイン、ＣＨ₂ドメインおよびＣＨ₃ドメイン（１．３６８ｋｂ断片）をＥｃｏ４７−III制限消化によりＢＲ９６ＩｇＧ１分子から除去した。Ｅｃｏ４７−IIIは平滑末端で切断する。この酵素で消化したＢＲ９６ＩｇＧ１ＤＮＡはクローニングの前にいかなる前処理をも必要としない。図１２は、クローニングに用いたＥｃｏ４７−III部位を示すｐＤ１７−ｈＢＲ９６−２ベクターの模式図である。ついで、ＣＨ₂の欠失したＢＲ９６ＩｇＧ１を以下のようにして構築した。ヒンジドメインおよびＣＨ₃ドメインを、Ｅｃｏ４７−III部位（太字）の５'末端のＩｇＧ１定常領域配列に相同なセンスオリゴヌクレオチドおよびＥｃｏ４７−III部位（太字）の３'末端のＩｇＧ１定常領域配列に相同なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＣＨ₂欠失Ｌ６ＩｇＧ１（ｐＮγ１．１４）構築物から増幅させた。ｐＮγ１．１４構築物の３'末端のＥｃｏ４７−II部位はクローニング手順の間に修飾する。このようにしてＥｃｏ４７−III部位をアンチセンスプライマー中に導入し、ヒンジドメインおよびＣＨ₃ドメインの増幅に用いる。ｐＤ１７−ＢＲ９６ＩｇＧ１ベクターをＥｃｏ４７−IIIで消化し、ヒンジドメイン、ＣＨ₂ドメインおよびＣＨ₃ドメインを除去した。線状化したｐＤ１７− ＢＲ９６ＩｇＧ１ベクターを等モル量のヒンジＰＣＲ断片およびＣＨ₃ＰＣＲ断片と混合した。ＰＣＲ断片と線状化ＤＮＡとを大腸菌ＤＨ５ａコンピテント菌体に同時形質転換すると、細菌における相同組換えを媒介として組換え分子が得られた。この構築物はＢＲ９６ＩｇＧ１分子のＣＨ₂ドメインを欠失しており、ｐＤ１７−ＢＲ９６−ｄＣＨ２と称した（図１３）。８９Ｌの培養上澄み液から１．９ｇのＣＨ₂欠失キメラＢＲ９６が原料として得られた。実施例３ＣＨ₂欠失キメラＢＲ９６の毒性、局在およびクリアランスを以下のようにしてインビボで試験した。３匹のイヌにキメラＢＲ９６のＣＨ₂欠失変異体であるｃＢＲ９６−Ａを４００ｍｇ／ｍ²与え、２匹のイヌにキメラＢＲ９６を与えた。両分子とも穏やかに還元されアルキル化されていた。このことは欠失変異体が二量体化して４価の形態となるのを防ぐために必要である。対照のイヌは両者ともに典型的な消化管毒性を経験したが、変異体を与えられた３匹のイヌはいかなる毒性をも示さなかった。対照のイヌおよび被験イヌのうちの２匹を１時間後に屠殺して十二指腸組織を得、抗体の局在化を測定した。対照のイヌはともに肉眼で認められる消化管病理を有していたが、被験イヌは正常な外観の消化管組織を有していた。第三のイヌは毒性の兆候を示すことはなかった。結果：有意の量のＣＨ₂欠失ｃＢＲ９６（ｃＢＲ９６−Ａ）の局在が４００ｍｇ／ｍ² で処理したイヌの消化管において生じたが、完全なｃｈｉＢＲ９６の局在の方がわずかに良好であった。これら局在レベルは、完全なｃＢＲ９６およびＣＨ₂欠失ｃＢＲ９６のほぼ等量がこれらイヌの消化管に送達されたことを示している。表５：消化管組織へのｃＢＲ９６の局在群動物特異的な局在平均＃２７１１５５ｃＢＲ９６１３５＃２７２１１４＃２７３１２６ｃＢＲ９６−Ａ８９＃２７４５２特異的な局在の平均を用いると、ｃＢＲ９６の少なくとも６６％に匹敵する量のｃＢＲ９６−Ａが毒性の標的臓器である十二指腸に送達されていた。ｃＢＲ９６でイヌにて行った範囲の投与量に基づけば（幾つかの臨床的な毒性兆候は１０ｍｇ／ｍ²の投与量で認められる）、この差異が本当だとしても有意の毒性と無毒性との差異を説明することはできず、今日の評価では顕微鏡による組織学的な検討によりｃＢＲ９６−Ａで処理したイヌが毒性を有しないことが示されている。この評価は、１匹のイヌ当たり２つの凍結組織塊および一つの組織塊当たり２つの切片の分析に基づいていた。複製（Replicates）は極めて良好であった。本発明者らはまた、天然のｃＢＲ９６またはＦ(ａｂ)２／ＢＲ９６で処理したイヌからの組織学的凍結組織についても試験を行い、これら組織についての局在レベルはそれぞれ１１０および０であり、本発明者らの以前のデータと一致した。わずかに高い（×２）投与量のｃＢＲ９６−Ａで毒性がないとすれば、これらデータはＣＨ₂ドメインが急性の胃腸疾患と関連していること、およびこのドメインを除去することによりＢＲ９６により媒介される胃腸疾患を防ぐことができることを示している。この研究はまた、Ｆ(ａｂ')₂がイヌモデルにおいて毒性でなく、毒性が定常領域によって媒介されることを示す結果を確認している。ＣＨ₂欠失変異体は薬剤を臨床的にターゲティングするための候補である。キメラＢＲ９６の非常に長い半減期のため、変異体の半減期の若干の低下は許容されうるものである。図１は高Ｌｅ^Y発現イヌでのｃＢＲ９６−Ａのクリアランスの測定を示す。この研究ではキメラとｃＢＲ９６−２の定常領域変異体とを用いた。ＣＢＲ９６−２はキメラＢＲ９６よりも確かに一層速やかに除去された。ｃＢＲ９６−Ａの胃腸管上皮への局在は、この一層速やかなクリアランスによって影響されない。十二分のｃＢＲ９６−Ａが局在して毒性を引き起こした。検討：キメラＩｇＧの定常領域は、たどえばｃｈｉＢＲ９６−ｄｏｘを用いた場合の臨床試験で認められる消化管毒性の原因である。イヌモデルで認められる消化管毒性は臨床毒性に極めて近いものである。ヒトおよびイヌの両方において、非コンジュゲート抗体の投与は、しばしば出血を伴う嘔吐の速やかな発症を特徴とする急性消化管毒性を媒介する。ヒトでは出血は胃底部に限られ、胃の表面粘膜の糜爛を引き起こす。創傷の病理は限られており消散するが、制吐剤によっても軽減されない悪心および嘔吐の激しい性質は、それを用量制限性毒性として規定する。この毒性はヒトおよびイヌにおいて抗体分子単独によって媒介される。高投与量の抗体−ドキソルビシンコンジュゲートでは、おそらくドキソルビシンによると思われる付加的な毒性がイヌモデルにおいて認められる。ＢＲ９６の完全なＩｇＧはイヌおよびヒトにおいて毒性を引き起こすが、Ｆ(ａｂ')２分子（２価で定常領域のみを欠失している）はイヌにおいて毒性を有しない。この知見は高レベルでの本発明者らの試みを促し、腫瘍抗原に対するＢＲ９６の親和性および特異性を改善している。ＣＨ₂ドメインは補体結合およびＦｃＲ結合を媒介することが知られている。このＣＨ₂ドメインの構造変化が免疫グロブリン誘発毒性の抑制となることは知られていなかった。ｈＢＲ９６−２Ｂの毒性研究：高ルイスＹ発現イヌ（ｎ＝２）でのｈＢＲ９６−２Ｂの毒性試験は、ＢＲ９６が吐血および血便の一方または両者の兆候を一貫して引き起こしたのとは対照的に、４００ｍｇ／ｍ²の投与量においてこれら両兆候のいずれをも引き起こさないことを示した。２４時間後に屠殺したイヌは消化管の正常な肉眼所見を有し、この場合も出血性病変および粘膜の糜爛を引き起こすキメラＢＲ９６とは極めて対照的であった。実施例４ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、免疫グロブリン遺伝子の増幅およびその後の修飾のために広く用いられる用途の広い技術である。抗体遺伝子をインビトロで迅速かつ正確に修飾しうることにより、一揃いの新規な抗体遺伝子が作成され、新規な抗体が作成されている。たとえば、ＰＣＲ法は抗原に対する親和性の増大した抗体を作成するため、抗体を「ヒト化する」ため、およびエフェクター機能を調節するために用いられている（マークス（Marks，J.D.）、グリフィス（A．D.Griffiths）、マームクビスト（M.Malmqvist）、クラックソン（T.Clack son）、バイ（J.M.Bye）およびウィンター（G.Winter）、１９９２、免疫の迂回：鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体、Bio/Technology １０：７７９〜７８３；ロソク（Rosok,M.J.）、イェルトン（D.E.Yelton）、ハリス（L.J.Harris）、バジョラス（J.Bajorath）、ヘルシュトローム、ヘルシュトローム、クルツ（G.A.Cruz）、クリステンソン（K.Kristensson）、リン（H .Lin）、ヒューズ（W.D.Huse）およびグレーザー（S.M.Glaser）、１９９６、抗腫瘍ＢＲ９６Ｆａｂの迅速なヒト化のためのコンビナトリアルライブラリー法、 J.Biol.Chem.２７１：２２６１１〜２２６１８；モーガン（Morgan,A.N.）、ジョーンズ（D.Jones）、ネスビット（A.M.Nesbitt）、チャップリン（L.Chaplin ）、ボドマー（M.W.Bodmer）およびエムテージ（S.Emtage）、１９９５、キメラヒトＩｇＧ１抗ＨＬＡ−ＤＲのＣＨ２ドメインのＮ末端はＣ１ｑ、ＦｃｙＲＩおよびＦｃｙＲＩIII結合に必要である、I mmunology ８６：３１９〜３２４）。より包括的な研究の一部として、本発明者らはヒトＩｇＧ１のＣＨ₂定常ドメイン中に種々の部位特異的突然変異を導入することを望んだ。ＣＨ₂ドメイン内に存在し免疫エフェクター機能においてある種の役割を果たすことが以前に同定されている６つの特定のアミノ酸残基を突然変異誘発の標的としてマークした（モーガン、ジョーンズ、ネスビット、チャップリン、ボドマーおよびエムテージ、１９９５、キメラヒトＩｇＧ１抗ＨＬＡ−ＤＲのＣＨ２ドメインのＮ末端はＣ１ｑ、ＦｃγＲＩおよびＦｃｙＲＩIII結合に必要である、I mmunology ８６：３１９〜３２４；ダンカン（Duncan,A.R.）およびウィンター、１９８８、ＩｇＧ上のＣ１ｑ結合部位、Nature ３３２：７３８〜７４０；タオ、スミスおよびモリソン、１９９３、補体活性化におけるイソ型特異性の差異を決定するヒト免疫グロブリンＧの構造的特徴、J.Exp.Med．１７８：６６１〜６６７）。これら６残基のうちの５つを２つの群に分けた。第一の群は２残基からなり、２アミノ酸は離れており（位置１またはＬ１）、第二の群は５アミノ酸の配列にわたる３残基からなる（Ｌ２）。残りのアミノ酸位置（Ｌ３）で全６残基を構成する。本発明者らは各Ｌ変異自体並びに他のＬ変異との組み合わせからなる変異体ＣＨ₂ ドメインＩｇＧのパネル（たとえば、Ｌ１；Ｌ１およびＬ２；Ｌ１、Ｌ２およびＬ３など）を構築することに関心があった。ＰＣＲを用いて遠位に位置する部位特異的突然変異を遺伝子の配列内に同時に導入する種々のインビトロ法が記載されている（ホ（Ho，S.N.）、ハント（H.D. Hunt）、ホートン（R.M.Horton）、プレン（J.K.Pullen）およびピーズ（L.R.Pe ase）、１９８９、重複伸長による部位特異的突然変異誘発、Gene ７７：５１〜５９；ゲ（Ge,L.）およびルドルフ（P.Rudolpf）、１９９６、重複伸長ＰＣＲを用いた複数の変異の同時導入、Bio Techniques ２２：２８〜３０）。別法として、組換えＰＣＲ（ＲＰＣＲ）と称するインビボ法もまた遠位に位置する部位特異的突然変異を迅速かつ有効に生成させるために首尾よく用いられている（ジョーンズ（Jones,D.H.）およびウィニストーファー（S.C.Winistorfer）、１９９３、組換え構築物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用、２４１〜２５０頁、ホワイト（B.A.White）（編）、Methods in Molecular Biology、Vol．１５、ヒューマナプレス、トトワ（Totowa,NJ）、ジョーンズおよびハワード（B.H .Howard）、１９９１、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡ上に相同末端を作成することによる組換えおよび部位特異的突然変異誘発の迅速な方法、Bio Tech niques １０：６２〜６６）。ＲＰＣＲは、大腸菌の組換え装置を用いてトランスフェクションした線状ＰＣＲ生成産物の混合物と線状化ベクターから完全な環状組換えプラスミドを生成させる。インビボ組換えは、ベクターによりコードされるＤＮＡ配列に相同なように５'末端を設計した両ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列の組み合わせによって媒介される。この報告で本発明者らは、変異の複雑な組み合わせを抗体ＣＨ₂ドメイン中に同時に導入するためのＲＰＣＲ法の拡張を記載する。ヒト化ＢＲ９６可変領域重鎖および軽鎖遺伝子は以前にクローニングされＭ１３ファージ発現ベクターで組み立てられたＦａｂフラグメントとして同時発現されているが、これが出発物質を提供した（ロソク、イェルトン、ハリス、バジョラス、ヘルシュトローム、ヘルシュトローム、クルツ、クリステンソン、リン、ヒューズおよびグレーザー、１９９６、抗腫瘍ＢＲ９６Ｆａｂの迅速なヒト化のためのコンビナトリアルライブラリー法、J.Biol.Chem.２７１：２２６１１〜２２６１８）。重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子をＰＣＲにより一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ鋳型から増幅し、インビトロ組換え（ジョーンズおよびハワード、１９９１、ポリメラーセ連鎖反応を用いてＤＮＡ上に相同末端を作成することによる組換えおよび部位特異的突然変異誘発の迅速な方法、Bio Techniques １０：６２〜６６）によりベクターｐＤ１７−ｈＧ１ａおよびｐＤ１６−ｈＣκ中にサブクローニングしてｐＢＲ９６−ｈＧ１ａおよびｐＢＲ９６−ｈＣκをそれぞれ生成した。ｐＤ１７−ｈＧ１ａおよびｐＤ１６−ｈＣκは、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、サンジエゴ、カリフォルニア）に由来する真核生物免疫グロブリン発現ベクターである。プラスミドｐＢＲ９６−ｈＧ１ａは、免疫グロブリンのヒンジ−ＣＨ₂ −ＣＨ₃メインをフランキングする２つのＥｃｏ４７−III制限部位を標準法を用いて導入する部位特異的突然変異誘発によりさらに修飾した。ついで、レシピエントベクターを、ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａをＥｃｏ４７−IIIで消化し、アガロースゲル電気泳動によりベクター骨格を単離し、ついでキアジェンゲルエクストラクションキット（Qiagen Gel Extraction kit）（キアジェン、チャットワース、カリフォルニア）を用いて切り出したゲルスライスからベクターＤＮＡを抽出することにより調製した。図２４に示す免疫グロブリンＣＨ₂遺伝子内に複数の変異を導入する戦略は、幾つかの独立に増幅させたＰＣＲ産物と互いの間およびｐＢＲ９６−ｈＧ１ａベクターＤＮＡとの間のインビボ相同組換えに依存する。２つの遠位の位置に変異を導入するため、２つのＰＣＲ産物を合成した（図２４Ｂ）。各ＰＣＲ産物の一方の末端は線状ベクターの相同末端と組換えを起こすためのものであり、所望の変異をコードする他方の末端は隣接するＰＣＲ産物と組換えを起こすためのものである。図２４Ｂに示すように、ＰＣＲ産物の数を比例して増やしていくことにより標的配列中に遠位変異をさらに導入することができる。隣接するＰＣＲ産物の組換えは常に所望の変異を含む領域を介して起こるので、これら末端をコードするオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、Ａ１、Ａ２）は相補的な変異残基を含む。変異をもたらすＰＣＲプライマーは、重合反応を開始させるかまたは組換えを媒介するために変異残基の各側にフランキングする少なくとも１５ヌクレオチドの野生型配列を含む。２つの４９ヌクレオチド長のＰＣＲセンスおよびアンチセンスプライマー（ＲｓおよびＲａ）は、Ｅｃｏ４７−IIIで消化したｐＢＲ９６−ｈＧ１ａベクターの末端領域と組換えを起こすための配列を含む。各Ｌ変異を別々のＰＣＲ反応において増幅した。反応条件は、１００μｌの反応容積中の２５０ｎｇの完全ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａＤＮＡ鋳型、１０μｌの１ ×Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーン、サンジエゴ、カリフォルニア）、１０ナノモルのｄＮＴＰ、各２００ｎｇの適当なＰＣＲプライマー、１０％ジメチルスルホキシド（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド）および２.５単位のクローニングＰｆｕＤＮＡポリメラーゼであった。試料をパーキン−エルマーＤＮＡサーマルサイクラー（ノーウォーク、コネチカット）中でまず９５℃で５分間変性し、４５℃に５分間冷却し、７２℃で１分間伸長し、ついで９４℃で４５秒間の変性、４５℃で４５秒間のアニーリング、７２℃で１分／ｋｂでの伸長を２５サイクル、ついで最後の伸長を７２℃で７分間行った。増幅した産物を１％アガロースゲルから精製し、キアジェンゲルエクストラクションキットで抽出し、ついで回収したＤＮＡを定量した。５０ｎｇの各ＰＣＲ産物を２５ｎｇのＥｃｏ４７− III消化ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａベクターと混合し、製造業者の手順（ギブコＢＲＬ／ライフ・テクノロジーズ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）に従ってマックス（Max）コンピテント大腸菌ＤＨ５α中にトランスフェクションし、全トランスフェクション反応物を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する選択ＬＢアガープレートにプレーティングした。幾つかのクローニング実験の結果を以下の表にまとめて示してある。一般に形質転換により８０〜２００の細菌コロニーが生成された。個々のコロニーを、ミニプレッププラスミドＤＮＡ（キアジェン）を単離しＥｃｏ４７−III制限エンドヌクレアーゼマッピングによる分析のため２ｍｌ液体培地で一夜増殖させた。三重の相同組換え事象（２つのＰＣＲ産物およびベクター）から分析した２４の独立した形質転換体のうち、１１のクローンが予想された１．４ｋｂｐのＤＮＡ挿入を含んでいた。図２５は、四重の相同組換え事象（３つのＰＣＲ産物およびベクター）から得られたクローンから調製したＤＮＡの試料診断制限分析を示す。四重の組換えから得られたクローンの別のサンプリングからは２９％のクローニング効率（挿入を含む７つのクローン／サンプリングした２４のクローン）が得られた。この点に関し、本発明者らは、サンプリングのサイズが小さいため、三重および四重の組換え事象間で観察されたクローニング効率の差異が意味があるか否か知らない。ＣＨ₂変異体ＩｇＧのＬｅ^γ結合活性の発現を評価するため、予想された診断Ｅｃｏ４７−III制限パターンを示す三重の組換え反応由来の６クローンおよび四重の組換え反応由来の６クローンからミニプレップＤＮＡを単離し、ｐＢＲ９６−ｈＣκＤＮＡと混合し、ＣＯＳ７細胞を同時トランスフェクションするのに用いた。３ｍｌの培養液から４８時間を経た上澄み液を、記載に従って（イェルトン、ロソク、クルツ、コサンド（W.L.Cosand）、バジョラス、ヘルシュトローム、ヘルシュトローム、ヒューズおよびグレーザー、１９９５、コドンベースの突然変異誘発によるＢＲ９６抗腫瘍抗体の親和性成熟、J．Immnunol．１５５：１９９４〜２００４）酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＩＡ）により全ＩｇＧ産生およびＬｅ^γ結合活性についてアッセイした。１２のすべての培養液が約２〜３ μｇ／ｍｌのＬｅ^γ反応性ＩｇＧを分泌することがわかった。Ｌｅ^γ結合活性のスペクトルは天然のヒト化ＢＲ９６ＩｇＧのものと同様であり、相同組換えを行った抗体が抗原結合に影響を及ぼすような著しい変異は獲得しなかったことを示していた。所望のＣＨ₂変異が導入されたことを確認するため、および誤って導入されたヌクレオチドについて組換え遺伝子を評価するため、機能性の抗体を産生するクローン４つについてシークエナーゼバージョン２ＤＮＡシークエンシングキット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ（United States Bioche micals））を用いてシークエンシングした。一つのクローンは、ベクターＤＮＡとの組換えを媒介するのに用いたフォアウォードＰＣＲプライマー内に単一のヌクレオチド変化を含んでいることがわかった。本発明者らは、この誤りが該オリゴヌクレオチドプライマーの化学合成の際に生じたのか、それとも校正活性を有する熱安定性のポリメラーゼを用いたにもかかわらずＰＣＲ反応の際の誤導入の結果であるのか確かでない。操作したＩｇＧ分子の迅速な構築のために３つまでの別個のＰＣＲ生成変異抗体配列産物の真核細胞発現ベクター中への相同組換えのためのＲＰＣＲ法を記載する。この方法の利点は、１回のＰＣＲにより合成されたＰＣＲ産物を用いて複数の遠位に位置する変異を同時に導入することができることである。妥当に高いクローニング効率および正しいヌクレオチド配列の忠実さで組換えＤＮＡが産生される。幾つかの別個のＰＣＲ産物を効率的に再結合できることは、複雑に変異したタンパク質を構築するため並びに所望の変異の数および位置を広げるためのコンビナトリアル戦略を可能とするに違いない。複数フラグメントＲＰＣＲにより生成した形質転換体の分析構築した反応中のＨＲ^a事象分析したクローニング変異ＩｇＧＰＣＲ断片コロニー効率^b ２２三重２４４５％２３四重２４３３％ ^a ＨＲ−相同組換え^b クローニング効率（１．４ｋｂｐ挿入を含むコロニーの数／コロニーの総数）実施例５本実施例は、ヒトＩｇＧ１定常領域含有ベクターのＣＨ２ドメイン中に部位特異的変異を導入するための２つの方法を提供する。一つの方法は、定常領域の１または複数のセグメントのＰＣＲ増幅を含み、変異は適当に構築されたオリゴヌクレオチドを用いることにより導入される。断片を受け入れる側のベクターを制限酵素で消化してベクターを線状化する。ＰＣＲ増幅プライマーは、ＰＣＲ断片の５'末端がベクターのＤＮＡ配列にハイブリダイズしうるように設計されている。１を越えるＰＣＲ断片を増幅するなら、２つの断片に共通する配列をオリゴヌクレオチドにより導入する。細菌をＰＣＲ断片および消化後のベクターでトランスフェクションする。断片とベクターとは細菌の組換え装置を用いて相同組換えにより組換えることができる。細菌コロニーを選択し、ベクターと断片とが正しく組換えられたことの予備的な決定としてＤＮＡをサイズおよび制限マップにより分析する。変異を有する断片の正しい挿入はジデオキシヌクレオチド配列分析により確認される。ついでＣＨ２欠失抗体について記載したのと同様にしてＤＮＡを哺乳動物細胞中に導入し、発現された抗体を結合活性および機能活性について分析する。一例として、ＣＨ２中の残基２３５におけるＬｅｕからＡｌａへの変異および残基２３７におけるＧｌｙからＡｌａへの変異を実施例４に開示した方法により導入した。この手順に用いた重鎖ベクターはｐＤ１７−ｈＧ１ａであり、３つの親和性変異（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３変異）を有するヒト化Ｖ領域（ロソク、イェルトン、ハリス、バジョラス、ヘルシュトローム、ヘルシュトローム、クルツ、クリステンソン、リン、ヒューズおよびグレーザー、１９９６、J.Biol.Chem.２７１：２２６１１〜２２６１８）を置換した他は本明細書に記載したｐＤ１７− ＢＲ９６ベクターと同様であった。ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａは、Ｉｇヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをフランキングする２つのＥｃｏ４７−III制限部位を含む。受け入れる側のベクターの調製を、（１）ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａをＥｃｏ４７−IIIで消化し、（２）該ベクターをアガロースゲル電気泳動により単離し、ついで（３）キアジェンゲルエクストラクションキット（キアジェン、チャットワース、カリフォルニア）を用いてベクターＤＮＡを切り出しゲルスライスから抽出することにより行った。位置２３５や２３７などの単一の位置に変異を導入するため、２つのＰＣＲ産物を合成した。２３５、２３７、３３１に変異を有する変異体Ｆ（本明細書ではｈＢＲ９６− ２Ｆとも称する）などのように２つの遠位に位置する変異を導入するためには３つのＰＣＲ産物が必要である。隣接するＰＣＲ産物の組換えは所望の変異を含む領域を介して起こるので、これら末端をコードするオリゴヌクレオチドプライマーは相補的な変異残基を含んでいる。変異をもたらすＰＣＲプライマーは、重合反応を開始させるかまたは組換えを媒介するために変異残基の各側にフランキングする少なくとも１５ヌクレオチドの野生型配列を含む。２つの４９ヌクレオチド長のＰＣＲセンスおよびアンチセンスプライマーは、Ｅｃｏ４７−IIIで消化したｐＢＲ９６−ｈＧ１ａベクターの末端領域と組換えを起こすための配列を含む。ＰＣＲ増幅には、１００μｌの反応中の２５０ｎｇの完全ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａＤＮＡ鋳型、１０μｌの１×Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーン、サンジエゴ、カリフォルニア）、１０ナノモルのｄＮＴＰ、各２００ｎｇの適当なＰＣＲプライマー、１０％ジメチルスルホキシド（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド）および２．５単位のクローニングＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、サンジエゴ、カリフォルニア）であった。試料を９５℃で５分間変性し、４５ ℃に５分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長し、ついで９４℃で４５秒間の変性、４５℃で４５秒間のアニーリング、７２℃で１分／ｋｂでの伸長を２５サイクル、ついで最後の伸長を７２℃で７分間行った。増幅した産物を１％アガロースゲルから精製し、キアジェンゲルエクストラクションキットで抽出し、ついで定量した。５０ｍｇの各ＰＣＲ産物を２５ｎｇのＥｃｏ４７−III消化ｐＢＲ９６−ｈＧ１ａベクターと混合し、製造業者の指示（ギブコＢＲＬ／ライフ・テクノロジーズ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）に従って大腸菌マックス（ＭＡＸ）エフィシャンシーＤＨ５α^TM中にトランスフェクションした。全トランスフェクション反応物を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢアガープレートにプレーティングした。細菌コロニーを選択し、２ｍｌ液体培地中、３７℃で一夜増殖させた。ＤＮＡを単離し、Ｅｃｏ４７−III制限エンドヌクレアーゼマッピングにより分析した。正しいサイズの挿入を有するクローンについてシークエンシングを行った（シークエナーゼバージョン２、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ）。ヒトＩｇＧ１のＣＨ₂ドメイン中に部位特異的突然変異を導入する第二の方法は、クンケルの方法を含む（１９８７Methods Enzymology、上掲）。この手順ではＦｌ複製起点を有するｐＤ１７−ｈＧ１ｂＤＮＡを製造業者の指示に従ってエレクトロポレーションによりエレクトロコンピテントな（electrocompetent）大腸菌ＣＪ２３６ｄｕｔ−ｕｎｇ−（バイオーラド・ラボラトリーズ（Bio−Rad L aboratories）、ハーキュールズ、カリフォルニア）中に導入した。ｐＤ１７− ｈＧ１ｂは、定常領域を有するが可変領域を有しないベクターである。このＦｌ複製起点部位は、ベクターをファージミドとして処理することを可能にする。プラスミドを含む細菌をアンピシリン耐性により選択した。一本鎖ウリジン化ＤＮＡの調製をムタージーンファージミドインビトロムタジェネシスバージョン２（Muta−Gene Phagemid In Vitro Mutagenesis Version ２）プロトコール（バイオーラド）を用いて行った。変異の導入は、適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発により行った。１を越える位置に変異を有する分子の場合は、変異の導入は上記２つの方法のいずれかにより行った。一つの方法は、（１）一つの変異体、たとえば残基３１８、３２０、３２２に変異を有する変異体２Ｃ（本明細書ではＢＲ９６−２Ｃとも称する）を伴成し、（２）ｓｓＤＮＡを単離し、ついで（３）適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた第二の変異のセットを導入することである。第二の方法は、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを同じウリジン化ｓｓＤＮＡとアニーリングし、両セットの変化を有する変異体をスクリーニングすることである。変異体２Ｈ（ｈＢＲ９６−２Ｈ）もまたこれら方法の組み合わせにより調製した。ヒト化ＢＲ９６−２重鎖のＶ領域を、上記相同組換え法によりｐＤ１７−ｈＪｍ１４.Ｈ１中に導入した。ｐＤ１７−ｈＪｍ１４.Ｈ１プラスミドはＨ１／Ｈ２／Ｈ３変異を有するＢＲ９６ヒト化可変領域を含み、このプラスミドを用いて変異体配列を哺乳動物細胞中にトランスフェクションした。Ｆｃ変異を含むｐＤ１７Ｇ１ｂベクターをＮｈｅＩで３７℃で３時間消化し、ＤＮＡを上記方法により単離した。ベクター中へのＶ領域の挿入をサイズおよび制限酵素マッピングにより決定し、配列分析により確認した。全抗体の一過性の発現をＣＯＳ細胞のトランスフェクションにより行った。抗体の産生のためには、ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションを行った（欠失ＣＨ２変異体の記載を参照）。すべての変異体をＣＨＯ培養上澄み液からプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。ベクターに相同で定常領域の変異を導入するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：ベクター配列に相同なオリゴヌクレオチド： Sens（センス）ＣＨ２Ｅ４７−３−５：ＤＣＨ２Ｅ４７−３Ａ（アンチセンス）：Ｌｅｕ２３５をＡｌａに変異させＧｌｙ２３７をＡｌａに変異させるオリゴヌクレオチド（下線を施した配列は変異の部位を示す）： Antisense ＣＨ２Ｌ２３５−Ｇ２３７／ａａ： Sens ＣＨ２Ｌ２３５−Ｇ２３７／ＡＡ：Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３２２をＳｅｒに変異させるオリゴヌクレオチド： Antis（アンチセンス）ＣＨ２ＥＫＫ／ＳＳＳ−２：Ｐｒｏ３３１をＡｌａに変異させるオリゴヌクレオチド： Antis ＣＨ２Ｐ３３１／Ａ／３：Sens ＣＨ２Ｐ３３／Ａ：部位特異的変異により３３１にＡｌａを導入する他のアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＣＨ２Ｐ３３１Ａ：Ｇｌｕ３１８をＳｅｒに、Ｌｙｓ３２０をＳｅｒに、Ｌｙｓ３２２をＳｅｒに、およびＰｒｏ３３１をＡｌａに変異させるオリゴヌクレオチド： Antis ＣＨ２ＥＫＫＰ／ＳＳＡ−６： Sens ＣＨ２ＥＫＫＰ／ＳＳＡ−６：変異体のインビトロアッセイＣＤＣの結果は、変異体ｈＢＲ９６−２Ｂが対照のｈＢＲ９６−１（２つの親和性変異、一つはＨ２中で一つはＨ３中、以前の特許（図２０）を参照）に比べて活性が約１０倍低いことを示した。補体の存在下で細胞を殺傷する能力の最も低い変異体は、３１８、３２０および３２２位に３つの変異を有するｈＢＲ９６ −２Ｃ、および３つの異なる位置に６つのすべての変異を含むｈＢＲ９６−２Ｈ変異体（パネルにおいて最も細胞傷害性の低い抗体）であった。ＡＤＣＣ活性はＣＨ２の欠失したｈＢＲ９６−２分子により最も影響を受けた（図２１）。ｈＢＲ９６−２ＢおよびｈＢＲ９６−２Ｈはエフェクター細胞の存在下で殺傷する活性を１００倍から１０００倍喪失していた。ＡＤＣＣアッセイにおいてもｈＢＲ９６−２Ｂ分子は活性を約１０倍喪失していた（図２１）。図２６〜図２８は、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３変異を有するキメラＢＲ９６およびヒト化ＢＲ９６の両者の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。軽鎖可変領域のアミノ酸配列は知られており、該アミノ酸配列を得る方法はＰＣＴ出願第９５／３０５４４４号に記載されている。さらにＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列もまた提供される。定常領域中の変異は印を付してある。

【手続補正書】【提出日】平成１１年４月６日（１９９９．４．６）【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通り補正する。（２）明細書第２頁８行にある「（１９９０））。」の後に以下の文言を挿入する。『シュライバー（G．J．Schreiber）ら（「非修飾抗癌腫抗体ＢＲ９６はヌードマウス中のヒト腫瘍に局在しヒト腫瘍の増殖（Outgrowth）を抑制する」、Cance r Res ．５２：３２６２〜３２６６（１９９２））は、ＢＲ９６のＩｇＧ１クラススイッチした変異体およびＦ(ab')₂フラグメントの使用を報告している。ギリーズ（S．D．Gillies）およびウエソロフスキー（J．S．Wesolowski）（「ヒト腫瘍特異性を有する操作した変異体キメラ抗体の抗原結合性および生物学的活性」、Hum ．Antibod．Hybridomas １：４７〜５４（１９９０））は、毒性を減ずるためのキメラ抗体のＦ(ab')₂フラグメントの使用を報告している。ウエイナー（G．J．Weiner）ら（「抗ＣＤ３Ｘ抗腫瘍２特異的抗体療法におけるＴ細胞活性化の役割」、J ．Immunol．１５２：２３８５〜２３９２（１９９４））は、免疫療法に用いた２特異的な抗ＣＤ３Ｘ抗腫瘍Ｆ(ab')₂抗体フラグメントを報告している。』（３）同第３頁１２行にある「本発明の実施」を『本発明の一つの態様の実施』と補正する。（４）同第５頁５行にある「図１４」を『図１４Ａ〜Ｊ』と補正する。（５）同第５頁１１行にある「図１８」を『図１８Ａ〜Ｆ』と補正する。（６）同第５頁１２行にある「図１９」を『図１９Ａ〜Ｎ』と補正する。（７）同第６頁１１行および最下行にある「１．４ｋｐｂ」を『１．４ｋｂｐ』と補正する。（８）同第６頁２０行にある「Ａ１Ｂ１」を『Ａ１Ｂ２』と補正する。（９）同第７頁３行にある「ヒトＩｇＧ１」を『ＣＨ₂ドメインを欠失したヒトＩｇＧ１』と補正する。（１０）同第１６頁３〜５行にある「トウィーン８０……トリトンＡ−２０」（１１）同第１７頁７行にある「ｈＢＲ９６−Ａ」を『ｈＢＲ９６−２Ａ』と補正する。（１２）同第２４頁２行にある「アドソーブド」を『抗体』と補正する。（１３）同第２４頁２〜３行にある「Adsorbed」を『Antibody』と補正する。（１４）同第２５頁下から２行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）』を挿入する。（１５）同第２６頁２行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）』を挿入する。（１６）同第２６頁１０行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）』を挿入する。（１７）同第２６頁１２行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）』を挿入する。（１８）同第２７頁１２行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）』を挿入する。（１９）同第２７頁１５行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）』を挿入する。（２０）同第２７頁１９行にある「ＣＨ₂ドメイン」を『ＣＨ₁ドメイン』と補正する。（２１）同第２８頁１４行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）』を挿入する。（２２）同第２８頁１７行にある「３'」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）』を挿入する。（２３）同第３６頁１０行にある「ＥＩＡ」を『ＥＬＩＳＡ』と補正する。（２４）同第３９頁３行にある「５０ｍｇ」を『５０ｎｇ』と補正する。（２５）同第４０頁２３行にある「ＣＡＧＡ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）』を挿入する。（２６）同第４０頁２６行にある「ＴＧＣＴＴ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）』を挿入する。（２７）同第４１頁１行にある「……ＴＧＡＧＧ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）』を挿入する。（２８）同第４１頁３行にある「……ＴＣＴＴＣ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）』を挿入する。（２９）同第４１頁７行にある「……ＴＣＡＧＣＣ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）』を挿入する。（３０）同第４１頁１０行にある「……ＧＡＧＧＧＣ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）』を挿入する。（３１）同第４１頁１２行にある「……ＡＣＣＡＴＣ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）』を挿入する。（３２）同第４１頁１６行にある「……ＴＴＴＧ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）』を挿入する。（３３）同第４１頁２１行にある「……ＡＴＴＣＡＧ」の後に『ＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）』を挿入する。（３４）同第４１頁最下行にある「……ＡＣＣＡＴＣ」の後に『（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）』を挿入する。（３５）同第５９頁に記載された配列のつぎに以下の文言を挿入する。（３６）同第４４頁１７行にある「配列の長さ：３９」を『配列の長さ：４０』と補正する。（３７）同第４４頁２１行にある配列番号６に係る配列を以下の通り補正する。（３８）同第４８頁１７行にある「配列の長さ：８３２７」を『配列の長さ：８３２１』と補正する。（３９）同第４８頁〜第５１頁にある配列番号１０に係る配列を以下の通り補正する。請求の範囲１．免疫グロブリン分子を患者に投与することを含む、患者における免疫グロブリン免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該免疫グロブリン分子は可変領域と定常領域とを有し、該免疫グロブリン分子は免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように該定常領域中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させることによって投与前に修飾されており、該修飾免疫グロブリン分子がＦ(ab')₂またはＦabフラグメントにおいては欠失しているＦｃ領域の少なくとも一部を含むことを特徴とする方法。２，_該定常領域中の複数の毒性関連ドメインが、該定常領域がＡＤＣＣ応答の媒介または補体の活性化をできないように修飾されている、請求項１に記載の方法。３．Ｉｇ融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該Ｉｇ融合タンパク質は、一定常領域中に構造の変化した複数の毒性関連ドメインを有し、ＩｇＧ１免疫グロブリン分子に由来するものであり、Ｆ(ab')₂またはＦabフラグメントにおいては欠失しているＦｃ領域の少なくとも一部を含むことを特徴とする方法。４．_ＣＨ₂ドメイン内に構造変化した複数の毒性関連ドメインが存在する、請求項３に記載の方法。５．該方法が疾患のための免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性を予防するためのものであり、該抗体の投与を、該構造を変化させた免疫グロブリンが_標的を認識および結合するような条件下で行うことにより該疾患に関連する症状を緩和させる、請求項１に記載の方法。６．_疾患のための免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性が予防され、投与すべき該Ｉｇ融合タンパク質として標的を認識し結合するものを選択し、該標的は該疾患と関連するものであり、該構造を変化させたＩｇ融合タンパク質を、該Ｉｇ融合タンパク質が該標的を認識および結合するような条件下で患者に投与することにより該疾患に関連する症状を緩和させる、請求項４に記載の方法。７．構造変化した該定常領域の部分がＣＨ₂ドメインである請求項１、２、３または５に記載の方法。８．免疫グロブリン分子がＩｇＧである請求項１または５に記載の方法。９．免疫グロブリン分子がＩｇＭである請求項１または５に記載の方法。１０．免疫グロブリン分子がＩｇＡである請求項１または５に記載の方法。１１．該抗体が抗原Ｌｅ^yを認識および結合する請求項２に記載の方法。１２．該抗体が抗原Ｌｅ^xを認識および結合する請求項２に記載の方法。１３．投与する該抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体から修飾した抗体である、請求項２に記載の方法。１４．投与する該抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６のアミノ酸配列を有する抗体から修飾した抗体である、請求項２に記載の方法。１５．該免疫グロブリンが抗原Ｌｅ^yを認識および結合する請求項１または５に記載の方法。１６．該免疫グロブリンが抗原Ｌｅ^xを認識および結合する請求項１または５に記載の方法。１７．該免疫グロブリンが、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体から修飾した抗体である、請求項１または５に記載の方法。１８．該免疫グロブリンが、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生される_ＣｈｉＢＲ９６のアミノ酸配列を有するキメラ抗体から修飾した抗体である、請求項１または５に記載の方法。１９．該Ｉｇ融合タンパク質が抗原Ｌｅ^yを認識および結合する請求項３、４または６に記載の方法。２０．該Ｉｇ融合タンパク質が抗原Ｌｅ^xを認識および結合する請求項３、４または６に記載の方法。２１．該Ｉｇ融合タンパク質が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列から１またはそれ以上の保存アミノ酸の冒換により変ヒしたアミノ酸配列を有し、該保存アミノ酸の置換が、（１）イソロイシン、バリンおよびロイシン以外の疎水性アミノ酸の代わりのこれらアミノ酸のいずれか、（２）グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸およびアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸、（３）アスパラギンの代わりのグルタミンおよびグルタミンの代わりのアスパラギン、および（４）トレオニンの代わりのセリンおよびセリンの代わりのトレオニンよりなる群から選ばれる、請求項３、４または６に記載の方法。２２．該Ｉｇ融合タンパク質が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６のアミノ酸配列から１またはそれ以上の保存アミノ酸の置換により変化したアミノ酸配列を有し、該保存アミノ酸の置換が、（１）イソロイシン、バリンおよびロイシン以外の疎水性アミノ酸の代わりのこれらアミノ酸のいずれか、（２）グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸およびアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸、（３）アスパラギンの代わりのグルタミンおよびグルタミンの代わりのアスパラギン、および（４）トレオニンの代わりのセリンおよびセリンの代わりのトレオニンよりなる群から選ばれる、請求項３、４または６に記載の方法。２３．薬理学的有効量の構造の変化した免疫グロブリンおよび許容しうる担体を含む医薬組成物であって、該構造の変化した免疫グロブリンが（１）癌と関連した標的を認識および結合し、（２）該医薬組成物中の該免疫グロブリンの投与の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性を抑制するように変えられたＣＨ₂ ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。２４．薬理学的有効量の構造の変化したＩｇ融合タンパク質および許容しうる担体を含む医薬組成物であって、該構造の変化したＩｇ融合タンパク質が（１）癌と関連した標的を認識および結合し、（２）医薬組成物中の該構造の変化した融合タンパク質の投与の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性を抑制するように変えられたＣＨ₂ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。２５．請求項２３または２４に記載の組成物の薬理学的有効量を患者に投与することを含む、インビボでの癌腫の増殖を阻止または抑制する方法。２６．該組成物中の該_免疫グロブリンが検出可能なシグナルを直接または間接に生成するように放射性標識、酵素、色原体、化学ルミネッセンス物質および蛍光物質よりなる群から選ばれた化合物で標識してある、請求項２３に記載の組成物。２７．該組成物中の該Ｉｇ融合タンパク質が検出可能なシグナルを直接または間接に生成するように放射性標識、酵素、色原体、化学ルミネッセンス物質および蛍光物質よりなる群から選ばれた化合物で標識してある、請求項２４に記載の組成物。２８．該抗体が細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項２または５に記載の方法。２９．該免疫グロブリンが細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項１に記載の方法。３０．該Ｉｇ融合タンパク質が細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項３、４または６に記載の方法。３１．該細胞傷害性薬剤が、アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質および有糸***阻害剤_よりなる群から選ばれる、請求項２８、２９または３０に記載の方法。３２．癌細胞を殺す方法であって、該癌細胞は細胞表面に腫瘍関連抗原を有する一群の細胞として特徴付けられ、該癌細胞を殺すために癌を患う患者に細胞傷害性薬剤と結合した請求項２３または２４に記載の組成物の癌殺傷量を該結合分子が該細胞表面上の腫瘍関連抗原と結合_することを可能にする条件下で投与して該癌細胞を殺すことを含む方法。３３．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６とは構造の変化したアミノ酸配列を有する抗体の薬理学的有効量および許容しうる担体を含み、該構造の変化した抗体が免疫グロブリン誘発毒性を抑制するように変えられたＣＨ₂ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。３４．_増殖型疾患に関連する細胞を殺す方法であって、該疾患はＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６により特異的に結合されうるＢＲ抗原を細胞表面に有する細胞によって特徴付けられ、該細胞を有する患者にドキソルビシンと結合した請求項３３に記載の組成物の有効量を投与して該ドキソルビシンに結合した請求項３３に記載の組成物が該細胞表面上の抗原と結合して該細胞を殺すことを含む方法。３５．修飾したＢＲ９６分子を患者に投与することを含む、患者における免疫グロブリン免疫療法の結果引き起こされる、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６により誘発された毒性の抑制方法であって、該修飾が、補体媒介毒性およびＦｃ受容体媒介毒性が抑制されるように、アミノ酸３１０〜３３１に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換またはアミノ酸２３１〜２３８に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換を含むことを特徴とする方法。３６．患者における癌のための免疫療法の結果引き起こされる、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６により誘発された毒性の予防方法であって、（ａ）補体およびＦｃ受容体媒介免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように、アミノ酸３１０〜３３１に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換およびアミノ酸２３１〜２３８に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換によってＢＲ９６ポリペプチドを変異させ、ついで（ｂ）工程（ａ）の変異ＢＲ９６ポリペプチドを、該ペプチドが癌関連Ｌｅ^y抗原を認識および結合し、それによって癌に関連する症状を緩和させる条件下で患者に投与し、その際、該毒性関連ドメインの変異が患者におけるＢＲ９６毒性を予防することを特徴とする方法。３７．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するキメラ抗体であって、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインは有するがＣＨ２ドメインは有せず、ＣｂＲ９６−Ａと称するキメラ_抗体。３８．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示す配列を有するプラスミドにより発現される、請求項３７に記載のキメラ_抗体。３９．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、定常領域がＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインは存在するがＣＨ２ドメインは存在しないように構造を変化させてあり、ｈＢＲ９６−２Ａと称するモノクローナル抗体。４０．ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示す配列を有するプラスミドにより発現される、請求項３９に記載のモノクローナル抗体。４１．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｂと称するモノクローナル抗体。４２．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｃと称するモノクローナル抗体。４３．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６− ２Ｄと称するモノクローナル抗体。４４．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｅと称するモノクローナル抗体。４５．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｆと称するモノクローナル抗体。４６．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｇと称するモノクローナル抗体。４７．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６のアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であって、構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｈと称するモノクローナル抗体。４８．請求項３７、３９、および４１〜４７のいずれかに記載の_抗体をコードする核酸分子。４９．ｃＤＮＡである請求項４８に記載の核酸分子。５０．請求項４８に記載の核酸分子を含むプラスミド。５１．適当な宿主細胞中に請求項５０に記載のプラスミドを含む宿主ベクター系。５２．宿主中にタンパク質を産生するように請求項５０に記載のプラスミドによりコードされるタンパク質が発現される条件下で請求項５１に記載の宿主ベクター系の宿主細胞を増殖させ、ついでかくして産生されたタンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ａ (72)発明者イェルトン，デイル・イーアメリカ合衆国98112ワシントン州シアトル、ナインティーンス・アベニュー・イースト2307番

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫グロブリン分子を患者に投与することを含む、患者における免疫グロブリン免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該免疫グロブリン分子は可変領域と定常領域とを有し、該免疫グロブリン分子は免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように該定常領域中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させることによって投与前に修飾されていることを特徴とする方法。２．構造を変化させた抗体を患者に投与することを含む、患者における免疫グロブリン免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該構造を変化させた抗体は可変領域と定常領域とを有し、該定常領域中の複数の毒性関連ドメインは該定常領域がＡＤＣＣ応答の媒介または補体の活性化をできず、それゆえ免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように修飾されていることを特徴とする方法。３．Ｉｇ融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該Ｉｇ融合タンパク質は定常領域中に構造の変化した複数の毒性関連ドメインを有することを特徴とする方法。４．Ｉｇ融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法であって、該Ｉｇ融合タンパク質は修飾された定常領域を含み、該修飾はＣＨ₂ドメイン内の複数の毒性関連ドメインの構造変化であることを有することを特徴とする方法。５．患者における疾患のための免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の予防方法であって、（ａ）標的を認識し結合する免疫グロブリンを選択し、その際、該標的は該疾患と関連するものであり、（ｂ）かくして選択した免疫グロブリンの定常領域中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させて構造の変化した免疫グロブリンを生成させることにより該免疫グロブリンを変異させ、ついで（ｃ）工程（ｂ）の構造を変化させた免疫グロブリンを、該構造を変化させた免疫グロブリンが該標的を認識および結合することにより該疾患に関連する症状を緩和させる条件下で患者に投与し、その際、該定常領域の構造変化が患者における免疫グロブリン誘発毒性を予防することを特徴とする方法。６．患者における疾患のための免疫療法の結果引き起こされる免疫グロブリン誘発毒性の予防方法であって、（ａ）標的を認識し結合するＩｇ融合タンパク質を選択し、その際、該標的は該疾患と関連するものであり、（ｂ）かくして選択したＩｇタンパク質の定常領域のＣＨ₂ドメイン中の複数の毒性関連ドメインの構造を変化させ、ついで（ｃ）工程（ｂ）の構造を変化させたＩｇ融合タンパク質を、該構造を変化させたＩｇ融合タンパク質が該標的を認識および結合することにより該疾患に関連する症状を緩和させる条件下で患者に投与し、その際、該ＣＨ₂ドメインの構造変化が患者における免疫グロブリン誘発毒性を予防することを特徴とする方法。７．該定常領域の部分がＣＨ₂ドメインである請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。８．免疫グロブリン分子がＩｇＧである請求項１または５に記載の方法。９．免疫グロブリン分子がＩｇＭである請求項１または５に記載の方法。１０．免疫グロブリン分子がＩｇＡである請求項１または５に記載の方法。１１．該抗体がＬｅ^yを認識および結合する請求項２に記載の方法。１２．該抗体がＬｅ^xを認識および結合する請求項２に記載の方法。１３．該抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６である、請求項２に記載の方法。１４．該抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６である、請求項２に記載の方法。１５．該免疫グロブリンがＬｅ^yを認識および結合する請求項１または５に記載の方法。１６．該免疫グロブリンがＬｅ^xを認識および結合する請求項１または５に記載の方法。１７．該免疫グロブリンが、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６である、請求項１または５に記載の方法。１８．該免疫グロブリンが、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６である、請求項１または５に記載の方法。１９．該Ｉｇ融合タンパク質がＬｅ^yを認識および結合する請求項３、４または６に記載の方法。２０．該Ｉｇ融合タンパク質がＬｅ^xを認識および結合する請求項３、４または６に記載の方法。２１．該Ｉｇ融合タンパク質が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１００３６の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体ＢＲ９６の誘導体である、請求項３、４または６に記載の方法。２２．該Ｉｇ融合タンパク質が、ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０４６０の同定特性を有するハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６の誘導体である、請求項３、４または６に記載の方法。２３．薬理学的有効量の構造の変化した免疫グロブリンおよび許容しうる担体を含む医薬組成物であって、該構造の変化した免疫グロブリンが（１）標的を認識および結合し、該標的は癌と関連したものであり、（２）不活化されたＣＨ₂ ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。２４．薬理学的有効量の構造の変化したＩｇ融合タンパク質および許容しうる担体を含む医薬組成物であって、該構造の変化したＩｇ融合タンパク質が（１）標的を認識および結合し、該標的は癌と関連したものであり、（２）不活化されたＣＨ₂ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。２５．請求項２３または２４に記載の組成物の薬理学的有効量を患者に投与することを含む、インビボでの癌腫の治療方法。２６．該組成物中の該構造の変化した免疫グロブリンが検出可能なシグナルを直接または間接に生成するように放射性標識、酵素、色原体および蛍光物質よりなる群から選ばれた化合物で標識してある、請求項３０に記載の方法。２７．該組成物中の該Ｉｇ融合タンパク質が検出可能なシグナルを直接または間接に生成するように放射性標識、酵素、色原体および蛍光物質よりなる群から選ばれた化合物で標識してある、請求項２４に記載の方法。２８．該抗体が細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項２または５に記載の方法。２９．該免疫グロブリンが細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項１に記載の方法。３０．該Ｉｇ融合タンパク質が細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている請求項３、４または６に記載の方法。３１．該細胞傷害性薬剤が、代謝阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質、有糸***阻害剤および化学療法剤よりなる群から選ばれる、請求項２８、２９または３１に記載の方法。３２．癌を患う患者の治療方法であって、該癌は細胞表面に腫瘍関連抗原を有する一群の細胞として特徴付けられ、該患者に細胞傷害性薬剤と結合した請求項２３または２４に記載の組成物の癌殺傷量を該結合分子が該細胞表面上の腫瘍関連抗原と結合し、かくして結合した細胞を殺傷して患者を治療することを可能にする条件下で投与することを含む方法。３３．薬理学的有効量の構造の変化したＢＲ９６抗体を含み、該構造の変化した抗体が不活化ＣＨ₂ドメインを有することを特徴とする医薬組成物。３４．細胞表面にＢＲ９６抗原を有する細胞によって特徴付けられる増殖型疾患を患う患者の治療方法であって、該患者にドキソルビシンと結合した請求項３３に記載の組成物の有効量を投与して該イムノコンジェゲートが該ＢＲ９６抗原と結合して該細胞を殺傷し、それによって患者を治療することを含む方法。３５．ＢＲ９６を患者に投与することを含む、患者における免疫グロブリン免疫療法の結果引き起こされるＢＲ９６（ＡＴＣＣ：ＨＢ１００３６）誘発毒性の抑制方法であって、該ＢＲ９６分子は投与前に修飾されており、該修飾が、補体媒介毒性またはＦｃ受容体媒介毒性が抑制されるように、アミノ酸３１０〜３３１に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換またはアミノ酸２３１〜２３８に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換を含むことを特徴とする方法。３６．患者における癌のための免疫療法の結果引き起こされるＢＲ９６（ＡＴＣＣ：ＨＢ１００３６）誘発毒性の予防方法であって、（ａ）補体およびＦｃ受容体媒介免疫グロブリン誘発毒性が抑制されるように、アミノ酸３１０〜３３１に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換およびアミノ酸２３１〜２３８に局在する毒性関連ドメイン内の少なくとも１のアミノ酸残基の欠失または置換によってＢＲ９６ポリペプチドを変異させ、ついで（ｂ）工程（ａ）の構造を変化させたＢＲ９６ポリペプチドを、該ペプチドが癌関連Ｌｅ^y抗原を認識および結合し、それによって癌に関連する症状を緩和させる条件下で患者に投与し、その際、該毒性関連ドメインの構造変化が患者におけるＢＲ９６毒性を予防することを特徴とする方法。３７．ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインは有するがＣＨ２ドメインは有しない構造の変化した定常領域を有し、ｃＢＲ９６−Ａと称するキメラＢＲ９６抗体。３８．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示す配列を有するプラスミドにより発現される、請求項３７に記載のキメラＢＲ９６抗体。３９．ヒト化可変領域および定常領域を有し、該定常領域がＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインは存在するがＣＨ２ドメインは存在しないように構造を変化させてあり、ｈＢＲ９６−２Ａと称するＢＲ９６抗体。４０．ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示す配列を有するプラスミドにより発現される、請求項３９に記載のＢＲ９６抗体。４１．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｂと称するＢＲ９６抗体。４２．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、ｈＢＲ９６ −２Ｃと称するＢＲ９６抗体。４３．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｄと称するＢＲ９６抗体。４４．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｅと称するＢＲ９６抗体。４５．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｆと称するＢＲ９６抗体。４６．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｇと称するＢＲ９６抗体。４７．構造の変化した定常領域を有し、アミノ酸位２３５におけるロイシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位２３７におけるグリシンがアラニンに変異しており、アミノ酸位３１８におけるグルタミン酸がセリンに変異しており、アミノ酸位３２０におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３２２におけるリジンがセリンに変異しており、アミノ酸位３３１におけるプロリンがアラニンに変異しており、ｈＢＲ９６−２Ｈと称するＢＲ９６抗体。４８．請求項３７、３９、および４１〜４７に記載のＢＲ９６抗体をコードする核酸分子。４９．請求項４８に記載のｃＤＮＡ。５０．請求項４８に記載の核酸分子を含むプラスミド。５１．適当な宿主細胞中に請求項５０に記載のプラスミドを含む宿主ベクター系。５２．宿主中にタンパク質を産生するように請求項５１に記載の宿主ベクター系を増殖させ、ついでかくして産生されたタンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。