JP2001505412A

JP2001505412A - ポリペプチドのデンプンマトリックスへの被包

Info

Publication number: JP2001505412A
Application number: JP51677798A
Authority: JP
Inventors: キーリング，ピーター; グアン，ハンピン
Original assignee: エクシード・ジェネティックス・エル・エル・シー
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2001-04-24
Also published as: WO1998014601A1; US6107060A; KR20000048782A; CA2265514A1; AU730427B2; CN1239514A; ATE389725T1; AU4803097A; NZ334637A; DE69738587D1; EP0935665B1; RU2268301C2; BR9713242A; RU2268301C9; DE69738587T2; IL129158A0; EP0935665A1; US7141659B2; US20040185114A1; CN1195861C

Abstract

(57)【要約】ハイブリッドポリペプチドが、アナボリックタンパク質をコードする遺伝子由来の被包領域を用い形成され、提供される。より詳細には、本発明は、結合するタンパク質をマトリックス内に被包する遺伝子をコードする組換え核酸分子に関連し；好ましくは、これらの遺伝子は望ましい（「荷重」）ポリペプチドをデンプン内、およびより明確にはデンプン粒マトリックス内に被包する。これらの組換え核酸分子を含む発現ベクター、およびこうしたベクターにより形質転換された、その宿主、およびより明確にはこうした宿主のデンプン産生部分もまた、提供される。好ましくは、デンプン内に被包された外来タンパク質を含む、哺乳動物、魚およびトリ食餌を産生するのに有用な穀粒が提供される。本発明はまた、デンプンおよび特にデンプン粒から精製タンパク質を産生する方法、およびこうしたタンパク質の産業的使用も含む。

Description

【発明の詳細な説明】ポリペプチドのデンプンマトリックスへの被包関連出願に対するクロス・リファレンス本出願は、1996年9月30日に提出された仮特許出願第60/026,855号に優先権を主張する。前記仮出願は、矛盾のない程度に、本明細書に援用される。発明の背景多糖酵素原核および真核細胞はどちらも、多糖酵素を貯蔵保存物として使用する。原核細胞では、主な貯蔵多糖はグリコーゲンである。グリコーゲンは、ほとんどの維管束植物に見られるデンプンに似ているが、鎖の長さおよび重合度が異なる。多くの植物では、デンプンが主要な貯蔵多糖として用いられる。デンプンは、デンプン産生植物のさまざまな組織に貯蔵される。デンプンは、ほとんどの場合、２つの構成要素により作られる；１つはアミロースであり、そして１つはアミロペクチンである。アミロースは直鎖グルカンとして形成され、そしてアミロペクチンはグルカンの分枝鎖として形成される。典型的なデンプンは、25％のアミロースに対し、75％のアミロペクチンという比率を有する。植物におけるアミロース対アミロペクチン比率の多様性は、デンプンの特性に影響する可能性がある。トウモロコシ（maize）デンプンおよびジャガイモ（potato）デンプンは、リン酸基の存在または欠如のために、異なるようである。ある種の植物のデンプン特性は、植物ゲノムに導入された突然変異により異なる。突然変異デンプンは、トウモロコシ、コメ（rice）およびエンドウ（pea）などでよく知られている。デンプン分枝またはデンプン構成要素の比率が変化する結果、異なるデンプン特質が生じる。デンプン特質の１つに、デンプン粒（starch granule）の形成があり、これは特に葉、根、塊茎および種子で形成される。これらの顆粒はデンプン合成過程の間に形成される。ある種のデンプンシンターゼ、特に顆粒結合デンプンシンターゼ、可溶性デンプンシンターゼおよび分枝酵素は、形成される際、デンプン粒の中に「被包」される（encapsulated）タンパク質である。動物および細菌のグリコーゲンシンターゼのcDNAクローンの使用が、国際特許出願公開第GB92/01881号に記載されている。グリコーゲンシンターゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、文献より知られる。例えば、大腸菌（E.coli）のグリコーゲンシンターゼをコードするglgA遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbank/ EMBL（SWISSPROT）データベース、寄託番号JO2616（Kumarら，1986，J．Biol．C hem.，261:16256-16259）から得ることが可能である。大腸菌グリコーゲン生合成酵素構造遺伝子もまた、Okitaら（1981，J．Biol．Chem.,256(13):6944-6952 ）によりクローンされている。グリコーゲンシンターゼglgA構造遺伝子はネズミチフス菌（Salmonella typhimurium)LT2から、Leungら（1987,J.Bacteriol.，16 9(9):4349-354）によりクローンされた。ウサギ骨格筋（Zhangら，1989,FASEB J .,3:2532-2536）およびヒト筋肉（Brownerら，1989,Proc．Natl.Acad．Sci.，86 :1443-1447）由来のグリコーゲンシンターゼ配列もまた知られている。植物可溶性デンプンシンターゼのcDNAクローンの使用が報告されている。エンドウ可溶性デンプンシンターゼアイソフォームＩおよびIIのアミノ酸配列は、Dr yら（1991，Plant Journal，2:193-202）により公表されている。コメ可溶性デンプンシンターゼのアミノ酸配列は、Babaら（1993，Plant Physiology,）に記載された。この最後の配列（コメ SSTS）はＮ末端配列を誤って引用しており、そしてしたがって誤解を招く。おそらくこれは、プロテアーゼ分解または抽出された酵素のその他の固有な不安定性に関連する、何らかの抽出エラーによるものであろう。正しいＮ末端配列（AELSRで始まる）は、彼らがコメ SSTSの輸送ペプチド配列と呼ぶものに存在する。トウモロコシ分枝酵素Ｉ配列は、Babaら，1991，BBRC，181:8794により研究された。トウモロコシ内胚乳由来のデンプン分枝酵素IIはFisherおよびShrable（1 993，Plant Physiol.，102:1045-1046）により研究された。植物、細菌および動物分枝酵素のcDNAクローンの使用が報告されている。細菌分枝酵素（BE）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、文献より知られる。例えば、Kielらは分枝酵素遺伝子glgBを、シアノバクテリア・シネココックスsp(Cyanobacterium synechococcus sp)PCC7942（1989,Gene(Amst),78(1):918）およびバシラス・ステアロテルモフイルス(Bacillus stearothermophilus)(Kielら，1991，Mol.Gen. Genet.,230(12):136-144)からクローンした。S.セレビシエ（S.cerevisiae）のg lc3およびgha1は対立遺伝子であり、そしてグリコーゲン分枝酵素（Rowanら，19 92，Mol．Cell Biol.，12(1):22-29)をコードする。Matsumomotoらはアカパンカビ(Neurosporacrassa)(1990，J．Biochem.，107:118-122)由来のグリコーゲン分枝酵素を調べた。Genbank/EMBLデータベースにも、分枝酵素をコードする大腸菌 glgB大腸菌遺伝子の配列が含まれている。デンプンシンターゼ（EC 2.4.1.11）は、デンプン分子を伸長し、そしてアミロースおよびアミロペクチン双方に働くと考えられている。デンプンシンターゼ（STS）活性は、顆粒およびプラスチドのストロマに関連して見られる可能性がある。結合デンプンシンターゼ酵素のデンプン結合能は、よく知られている。デンプン生合成に関与するさまざまな酵素は、Mu-Forsterら（1996，Plant Phys.1 11:821-829）に記載されるように、結合に関して異なる傾向を有することが現在知られている。顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSTS）活性は、waxy遺伝子産物と強く相関している(Shureら,1983,Cell35:225-233)。トウモロコシ、コメおよびジャガイモなどの多くの種のアミロース合成は、この遺伝子の発現に依存することが示されている(Tsai，1974，Biochem Gen 11:83-96;Hovenkamp-Hermelink ら，1987，Theor.Appl．Gen．75：217-221)。Visserらはジャガイモ由来の顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子の分子クローニングおよび部分的性質決定を記載した(1989,PlantSci.64(2):185-192)。Visserらはまた、ジャガイモにおける、アンチセンス構築物による顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子発現阻害も記載している(1991,Mol.Gen.Genet.225(2):289-296)。他のSTS酵素は、FrydmanおよびCardiniの先駆的な仕事（FrydmanおよびCardin i,1964,Biochem.Biophys.Res.Communications 17:407-411)の後、可溶性デンプンシンターゼとして知られるようになった。最近、「可溶性」という用語が適切かどうかが疑問視され始めた。これは、これらの酵素が可溶相に存在すると共に、顆粒とも結合している（Denyerら，1993，Plant J．４:191-198;Denyerら，19 95，Planta 97:57-62；Mu-Forsterら，1996，Plant Physiol．111: 821-829）ことが発見されたという見地による。一般的に、アミロペクチンの生合成は、可溶性デンプンシンターゼおよびデンプン分枝酵素の相互作用が関与していると考えられている。可溶性デンプンシンターゼの異なるアイソフォームは、エンドウ(DenyerおよびSmith,1992,Planta 186:609-617:Dryら,1992,PlantJou rnal,2:193-202)、ジャガイモ(Edwardsら，1995,Plant Physiol 112:89-97;Mars hallら，1996,Plant Cell 8:1121-1135)およびコメ（Babaら，1993,PlantPhysio l．103:565-573）で同定され、そしてクローンされている。一方、オオオムギ（ barley）は、複数のアイソフォームを含み、そのうちのいくつかはデンプン分枝酵素に結合しているようである(TyynelaおよびSchulman,1994,Physiol.Plantaru m89:835-841)。STSクローンに共通する特徴は、酵素のADP-Glc結合部位だと考えられているKXGGLGDVコンセンサス配列が存在することである(Furukawaら，1990 ，J Biol Chem 265:2086-2090;Furukawaら，1993，J.Biol.Chem.268:23837-2384 2)。トウモロコシでは、アイソフォームＩおよびIIとして知られる２つの可溶性型 STSが同定されている（MacdonaldおよびPreiss，1983，Plant Physiol.73:175-1 78;BoyerおよびPreiss，1978，Carb.Res.61:321-334;PollockおよびPreiss，198 0,Arch Biochem.Biophys.204:578-588;MacdonaldおよびPreiss,1985,Plant Phys iol.78:849-852;DangおよびBoyer,1988,Phytochemistry27:1255-1259;Muら，199 4，Plant J．6:151-159）が、これらはいずれもクローンされていない。トウモロコシ内胚乳のSTSI活性は、最近、可溶性および顆粒結合分画双方に見られる76 kDaポリペプチドとの相関関係が証明されている(Muら，1994，Plant J.6:151-15 9)。STSIIのポリペプチド同一性は、未知のままである。STSIおよびIIは異なる酵素特性を示す。STSIはプライマー独立活性を示す一方、STSIIは、グルコシル転移を触媒するのにグリコーゲンプライマーを必要とする。可溶性デンプンシンターゼは、デンプン沈着にも共同作用する高い流動調節を有し(Jennerら，1993, Aust.J.Plant Physiol.22:703-709:Keelingら，1993,Planta 191:342-348)、そして高温で異常な力学特性を有する（Keelingら，1995，Aust.J.Plant Physiol ．21：807-827）ことが報告されている。トウモロコシのそれぞれのアイソフォームは、温度最適条件および安定性双方で有意な違いを示す。植物デンプンシンターゼ（および大腸菌グリコーゲンシンターゼ）配列には、 ADPG結合ドメインであることが知られる配列KTGGLが含まれる。こうしたデンプンシンターゼタンパク質はいずれも、本発明に従って、構築物に用いてもよい。分枝酵素[α1,4D グルカン:α1,4D グルカン 6D（α1,4D グルカノ）トランスフェラーゼ（E.C．2.4.1.18）]は時にQ-酵素と呼ばれるが、アミロースをアミロペクチンに変換する。α1,4D グルカン鎖の部分は、類似のグルカン鎖における第一水酸基に転移する。細菌分枝酵素遺伝子および植物配列が報告されている(コメ内胚乳:Nakamuraら，1992，Physiologia Plantarum，84:329-335およびNakamuraおよびYamanouchi ，1992，Plant Physiol.,99:1265-1266;エンドウ:Smith，1988,Planta，175:270 -279およびBhattacharyyaら，1989，J．Cell Biochem.，Suppl.13D:331;トウモロコシ内胚乳:SinghおよびPreiss，1985，Plant Physiology,79:34-40;VosScher perkeuterら,1989,Plant Physiology,90:75-84;ジャガイモ:Kossmannら，1991,M ol.Gen.Genet.，230(12):39-44;キャッサバ(cassava):SalehuzzamanおよびVisse r,1992,Plant Mol Biol,20:809-819)。多糖酵素の領域では、さまざまな植物種の多くのデンプン合成遺伝子を用いた、植物のデンプン経路における操作修飾のためのベクターの報告がある。これら多糖酵素のいくつかがセルロースまたはデンプンまたはグリコーゲンに結合するのは、よく知られている。多糖酵素を特定の特許に使用した一例では、グリコーゲン生合成酵素の植物デンプン修飾への使用が示されている。Shewmakerに対する米国特許第5,349,123号では、DNAを含むベクターが、植物細胞内でグリコーゲン生合成酵素を形成することが解説される。特にこの特許は、これら酵素の導入によるジャガイモデンプンの変化に言及する。他のデンプン合成遺伝子およびそれらの使用もまた、報告されている。ハイブリッド（融合）ペプチドハイブリッドタンパク質（「融合タンパク質」とも呼ばれる）は、共に融合して、単一のポリペプチドになった２つまたはそれ以上のタンパク質からなるポリペプチド鎖である。しばしば、タンパク質の１つは、特定の受容体細胞に結合するリガンドである。融合ペプチドをコードするベクターは、主に、微生物の発酵を通じて外来タンパク質を産生するのに用いられる。産生された融合タンパク質はその後、アフィニティークロマトグラフィーにより精製してもよい。ポリペプチドの１つの結合部分を使用し、ハイブリッドポリペプチドをアフィニティーマトリックスに結合させる。例えば、融合タンパク質は、カラムに結合することが可能なベータガラクトシダーゼと共に形成してもよい。この方法は、ウイルス抗原を形成するのに使用されている。別の使用法は、ハイブリッドポリペプチドのポリペプチドの１つを回収することである。融合ペプチドを切断する化学的および生物学的方法が知られている。ペプチド間に酸で不安定なアスパルチル−プロリン結合が用いられており、そしてペプチドが酸に影響を受けないのであれば、低pHを使用して、ペプチドを切断してもよい。ホルモンは臭化シアンにより分解されてきた。さらに、部位特異的タンパク質分解による切断が報告されている。イオンクロマトグラフィーなどの他のタンパク質精製法は、ポリアルギニンテールを使用することにより増強されてきた。ポリアルギニンテールはタンパク質全体の塩基性を上昇させ、したがってイオン交換カラムへの結合を増強する。多くの特許が、ハイブリッドペプチド、または特定の使用を標的とする特定のハイブリッドペプチドの作成法の改善を略述している。Pastanらに対する米国特許第5,635,599号は、ハイブリッドタンパク質の改良を略述している。この特許は、ハイブリッドペプチドの一部として循環置換されるリガンドを報告する。このリガンドは特異性および優れた結合親和性を持つ。ハイブリッドタンパク質のその他の改良は、Kuliopulosに対する米国特許第5,648,244号に報告されている。この特許は、キャリアーペプチドを持つハイブリッドペプチドの産生法を記載する。この核酸領域は、制限エンドヌクレアーゼによって認識されると、非パリンドロームの３塩基突起を生成する。これによりベクターが切断される。特異的に標的となるハイブリッドタンパク質の例が、米国特許第5,643,756号に報告されている。この特許は、細胞内でのグリコシル化タンパク質発現のためのベクターを報告する。このハイブリッドタンパク質は、HIVのgp120の適切な免疫反応性における使用に適用されている。この報告されたベクターにより、非常にグリコシル化されたgp120ドメインの単離が増強される。米国特許第5,202,247号および第5,137,819号は、多糖結合ドメインを有するハイブリッドタンパク質、および多糖マトリックスに結合することが可能なハイブリッドタンパク質を調製する方法および組成物について論じている。米国特許第 5,202,247号は特に、関心事のペプチドのセルラーゼ結合領域に結合するハイブリッドタンパク質について解説している。当該特許は、ハイブリッドタンパク質は、細菌宿主で発現された後、セルロース上のアフィニティークロマトグラフィーにより、精製してもよいと明記している。遺伝子工学技術の発展により、さまざまな生物および植物由来の遺伝子を、他の生物または植物に移すことが可能になった。デンプンは過去、形質転換および突然変異誘発により改変されてきているが、まださらにデンプンを修飾する必要がある。この目的に向け、望ましいアミノ酸またはペプチドのデンプン内そして特にデンプン粒内への被包を提供するベクターが望まれる。その結果生じるデンプンは修飾されており、そしてベクターを有する植物由来の組織は修飾されている。発明の概要本発明は、荷重（payload）ポリペプチドに融合したデンプン結合酵素由来のデンプン被包領域（SER）を含むハイブリッドポリペプチドを提供する。ここで荷重ポリペプチドは、前記デンプン被包領域に内因性でなく、すなわちデンプン被包領域に天然に結合しない。ハイブリッドポリペプチドは荷重ポリペプチドを含む修飾デンプンを作成するのに有用である。こうした修飾デンプンを使用して、ある種のアミノ酸が豊富な穀物食料を提供するのに使用してもよい。こうした修飾デンプンはまた、ホルモンおよび他の薬物、例えばインシュリンなどのポリペプチドを、胃酸による分解に抵抗性を持つようデンプン被包型で提供するのに有用である。ハイブリッドポリペプチドはまた、荷重ポリペプチドを容易に精製できる形で産生するのにも有用である。例えば、細菌発酵により、または穀粒または動物中で産生されたこうしたハイブリッドポリペプチドは、当業界で知られる技術により、結合している修飾デンプンから単離し、そして精製してもよい。「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、複数の同一または異なるアミノ酸を意味し、そしてまたタンパク質も含む。「ハイブリッドポリペプチド」という用語は、少なくとも２つの異なる産生源由来のぺプチドまたはポリペプチドにより構成されるポリペプチド、例えばデンプン結合酵素のデンプン被包領域が、ホルモンなどの他のポリペプチドに融合しており、ハイブリッドポリペプチドの少なくとも２つの構成要素部分が天然には共に融合しない、前記ポリペプチドを意味する。「荷重ポリペプチド」という用語は、デンプン被包領域に内因性でなく、当該荷重ポリペプチドを含む修飾デンプンを発現するのに、このデンプン被包領域と関連した発現が望ましい、前記ポリペプチドを意味する。荷重ポリペプチドを用いて、修飾デンプン中の特定のアミノ酸のアミノ酸含量を高める際、好ましくは:Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile 、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、TyrおよびValからなる群より選択される異なるタイプのアミノ酸３つより多くからならない。荷重ポリペプチドを用いて、生物学的に活性があるポリペプチドを、宿主生物または他の生物に供給する際、荷重ポリペプチドは生物学的に活性のあるポリペプチド、例えばインシュリンなどのホルモン、例えばソマトトロピンなどの成長因子、抗体、酵素、免疫グロブリン、または染色剤（dye）であってもよく、また、当業界で知られるように、その生物学的活性断片であってもよい。ポリペプチドが生物学的活性を有する限り、天然に発生するポリペプチドである必要はなく、突然変異していても、切断されていても、または別の修飾をされていてもよい。こうした生物学的に活性があるポリペプチドは、生物学的に活性があるポリペプチドの生物学的活性部分のみを含む、修飾ポリペプチドであってもよい。これらはまた、生物学的活性を保持する、天然発生生物学的活性アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列（好ましくは少なくとも約75％相同）であってもよい。ハイブリッドポリペプチドのデンプン被包領域は、当業界で知られるいかなるデンプン結合酵素のデンプン被包領域でもよい。例えば、可溶性デンプンシンターゼＩ、可溶性デンプンシンターゼII、可溶性デンプンシンターゼIII、顆粒結合デンプンシンターゼ、分枝酵素Ｉ、分枝酵素IIa、分枝酵素IIBbおよびグルコアミラーゼポリペプチドからなる群より選択される酵素である。ハイブリッドポリペプチドを用いて、荷重ポリペプチドを純粋なまたは部分的に精製した形で産生する際、ハイブリッドポリペプチドは、好ましくはデンプン被包領域および荷重ポリペプチドの間に切断部位を含む。その後、精製荷重ポリペプチドを単離する方法には、ハイブリッドポリペプチドを切断部位に特異的な切断剤と接触させる段階が含まれる。本発明はまた、ハイブリッドポリペプチドをコードする組換え核酸（RNAまたはDNA）分子を提供する。こうした組換え核酸分子は、好ましくは選択された宿主中でのハイブリッドポリペプチド発現に適応した調節配列を含む。「調節配列」という用語には、プロモーター、イントロン、特定の宿主生物に好まれるコドン配列、および特定の宿主においてDNAまたはRNA発現に影響することが当業界で知られる他の配列が含まれる。デンプン被包領域および荷重ポリペプチドをコードする核酸配列は、天然発生核酸配列でも、またその生物学的活性断片でもよく、またこうした配列に相同な、好ましくはこうした配列に少なくとも約75％相同である生物学的活性配列であってもよい。宿主生物には、細菌、植物および動物が含まれる。好ましい宿主は植物である。単子葉植物および双子葉植物はどちらも、本発明のハイブリッドポリペプチドを発現するのに有用な宿主である。本発明はまた、本発明のハイブリッドタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。これらの発現ベクターは、宿主生物を当該核酸により形質転換するのに用いられ、そしてまた、宿主生物中の核酸発現を助ける配列を含んでもよい。発現ベクターは、プラスミド、修飾ウイルス、またはDNAまたはRNA分子、または当業界で知られる形質転換系に有用な他のベクターであってもよい。本発明の方法により、形質転換された細胞は、本発明のハイブリッドポリペプチドを発現することが可能な組換え核酸分子を含み、産生される。これらは、単細胞生物、植物または動物由来の原核または真核細胞でもよい。それらが細菌細胞であって、そこからハイブリッドポリペプチドを採取してもよい。または、それらが植物細胞であって、それを植物に再生してもよく、そこからハイブリッドポリペプチドを採取してもよい。または、こうした植物細胞を、ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を含む種子を持つ結実能力のある植物に再生してもよい。好ましい態様において、こうした種子は、荷重ポリペプチドを含む修飾デンプンを含む。「修飾デンプン」という用語は、天然発生デンプンが荷重ポリペプチドを含むよう修飾されていることを意味する。荷重ポリペプチドの、消化過程の特定の段階に対する消化を標的する（target ing）方法、例えば、動物の胃における荷重ポリペプチドの分解防御などもまた、荷重ポリペプチドを含む本発明の修飾デンプンを動物に与えることにより、当該ポリペプチドが動物の胃における分解からデンプンにより防御されることを含み、提供される。また別に、荷重ポリペプチドを胃で放出するため、デンプンは胃で消化されることが知られるものであってもよい。本発明の好ましい組換え核酸分子は、本明細書中の表に説明されるデンプン合成遺伝子配列から選択されるデンプン被包領域をコードするDNAを含む。本発明の好ましいプラスミドは、特定の宿主での使用に適応する。プロモーター、プラスチド標的配列、デンプン被包領域をコードする核酸配列、およびターミネーター配列を含むプラスミドが、本発明によって提供される。こうしたプラスミドは選択された宿主で発現させるため、荷重ポリペプチドおよびデンプン被包領域をコードするDNA配列の挿入に適している。本発明のプラスミドは、所望により、SERをコードする核酸および荷重ポリペプチドをコードする核酸の間の融合部位近傍に、スペーサーまたはリンカー単位を含んでもよい。本発明は、原核または真核宿主に適応したプロモーターを含むプラスミドを含む。こうしたプロモーターはまた、単子葉植物または双子葉植物での発現に特異的に適応していてもよい。本発明のペプチド修飾デンプンを形成する方法には：デンプン被包領域をコードする核酸配列と結合したプロモーターを有するプラスミドを供給し、デンプン被包領域をコードする核酸配列を荷重ポリペプチドをコードする核酸領域と連結し、そして宿主がペプチド修飾デンプンを発現するよう宿主をプラスミドにより形質転換する、段階を含む。本発明はさらに、デンプン産生穀物であって：胚、栄養組織；および、修飾されていない前記穀物のデンプン粒に内因性でないタンパク質を中に被包する修飾デンプン粒を含む、前記穀物を含む。こうしたデンプン産生穀物は、胚がトウモロコシ胚、コメ胚、またはコムギ（wheat）胚である穀物でもよい。本明細書中に言及されるすべての文献は、矛盾のない程度に、本明細書に援用される。図面の簡単な説明図1aは、StratageneのpBSKにサブクローンされた合成GFP（グリーン蛍光タンパク質）を含む、プラスミドpEXS114を示す。図1bは、プラスミドpEXS115を示す。図2aは、商業的に入手可能なプラスミドにサブクローンされたwaxy遺伝子を、制限酵素部位と共に示す。図2bは、pEXS115由来のGFP断片がサブクローンされた、Novagenから商業的に入手可能なpET-21Aプラスミドを示す。図3aは、pEXSWXにサブクローンされたpEXS114、およびGFP-FLWXマップを示す。図3bは、GFP-Bam HIWXプラスミドを示す。図４は、pEXSWXにサブクローンされたpEXS115のSGFP断片、およびGFP-NcoWXマップを示す。図５は、単子葉植物の使用に適応したプラスミドを直線状に示す。図６は、プラスミドpEXS52を示す。図７はpEXS51およびpEX560を形成するのに用いた６つの導入プラスミドを示す。図7aはpEXS adhlを示す。図7bはpEXS adhl-nos3'を示す。図7cはpEXS33を示す。図7dはpEXS10zpを示す。図7eはpEXS10zp-adhlを示す。図7fはpEXS10zp-adhl-n os3'を示す。図8aおよび8bは、それぞれ、デンプン可溶性シンターゼ遺伝子であるMS-SIII 遺伝子を含む、pEXS50およびpEXS51を示す。図9aは、pEXS50に示されたイントロンを除くプラスミドpEXS60を示し、そして図9bは、pEXS60に示されたイントロンを除くプラスミドpEXS61を示す。詳細な説明本発明は、広く、ハイブリッドポリペプチド、ハイブリッドポリペプチドを作成する方法、およびハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を提供する。ハイブリッドポリペプチドは、共に融合し単一のペプチド鎖になる２つまたはそれ以上の下位部分（subpart）からなる。下位部分は、アミノ酸またはぺプチドまたはポリペプチドであってもよい。下位部分の１つは、デンプン被包領域である。ハイブリッドポリペプチドはしたがって、ハイブリッドポリペプチドを発現する生物により産生されるデンプン粒を標的としてもよい。細胞内でハイブリッドポリペプチドを作成する方法には、結合DNAの発現産物をデンプン粒に結合させるよう機能する配列をコードするDNAの少なくとも断片を含むDNA構築物を、関心事のポリペプチド（荷重ポリペプチド）をコードするD NA配列に連結させる調製が含まれる。この構築物は、真核または原核細胞中で発現される。ハイブリッドポリペプチドを使用して、精製タンパク質を産生してもよいし、またデンプン粒の防御中で、関心事のタンパク質を固定してもよいし、また外来アミノ酸またはペプチドを含む穀粒を産生してもよい。本発明にしたがったハイブリッドポリペプチドは、３つの領域を有する。Ｘは関心事のいかなるアミノ酸またはペプチドでもよい。^* 所望による構成要素Ｘの遺伝子は、以下に記載されるDNA構築物中の５'または３'位に置かれてもよい。 CSは中央部位であり、当業界で知られるように、脱離（leaving）部位、切断部位、またはスペーサーであってもよい。切断部位は、切断酵素により認識される。切断酵素は、ペプチドを特定の部位で切断する酵素である。ポリペプチドを切断するために使用されている化学物質および酵素の例には、トロンビン、トリプシン、臭化シアン、ギ酸、ヒドロキシルアミン、コラゲナーゼ、およびアラサブチリシン（alasubtilisin）が含まれる。スペーサーは、ハイブリッドポリペプチドを含むペプチドにつながるペプチドである。通常は、ペプチドにつながり、またはある最小限の距離を保持し、またはタンパク質のフォールディング、電荷または水の受容に影響する以外には、いかなる特定の活性も持たない。スペーサーは、ハイブリッドポリペプチドの生物学的活性に干渉しない、いかなるペプチド配列であってもよい。デンプン被包領域(SER)は、デンプンに結合親和性を有する、主題のポリペプチドの領域である。通常、SERは、植物のデンプンシンターゼおよび分枝酵素のデンプン結合領域を含むペプチドからなる群より選択されるが、グルコアミラーゼおよびそれに匹敵するものなどの他の産生源由来のデンプン結合領域を含んでもよい。本発明の好ましい態様において、SERには、デンプン合成経路で天然に発生する遺伝子のペプチド産物が含まれる。この好ましいSERの小群は、デンプン形成被包領域（SFER）と定義される。本発明において好ましい、さらなるSER 小群は、デンプン産生植物の、特異的酵素デンプンシンターゼ(STS)、顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSTS）および分枝酵素（BE）由来の特異的デンプン被包領域（SSER）である。この中で最も好ましい遺伝子産物はGBSTSである。さらに、デンプンシンターゼＩおよび分枝酵素IIは有用な遺伝子産物である。好ましくは、SER（および上述のすべての小群）は全長デンプン合成酵素遺伝子の切断型であって、切断された部分にデンプン被包領域を含む。宿主中でハイブリッドポリペプチドを発現するDNA構築物は、広く、以下の通りである： ^*所望による構成要素。他の所望による構成要素も、使用してもよい。当業界で知られるように、プロモーターは転写を調節するDNA領域である。異なる宿主には、異なるタイプのプロモーターが選択される。LacおよびT7プロモーターは原核細胞でうまく働き、35S CaMV プロモーターは双子葉植物でうまく働き、そしてポリユビキチンプロモーターは多くの単子葉植物でうまく働く。かなり多くの異なるプロモーターが当業界で知られており、そして本発明の範囲内で使用してもよい。また当業界で知られるように、イントロンは遺伝子産物をコードしない遺伝子中のヌクレオチド配列である。単子葉植物での発現をしばしば上昇させるイントロンの一例は、Adh1イントロンである。構築物のこの構成要素は所望による。輸送ペプチドコード領域は、タンパク質のプラスチドのような細胞内小器官への移動をコードするヌクレオチド配列である。輸送ぺプチドを使用する宿主で認識され、そして共存できる輸送ペプチドを選択することが好ましい。本発明において、好まれるプラスチドはアミロプラストである。ハイブリッドポリペプチドは、アミロプラスト中でデンプンを合成し、そしてアミロプラストにデンプンを貯蔵する植物細胞などの細胞のアミロプラスト中に局在するのが好ましい。宿主が、アミロプラストを含まない細菌またはその他の細胞である場合、輸送ペプチドコード領域がある必要はない。ターミネーターは転写を終結させるDNA配列である。Ｘは荷重ポリペプチドのコード領域であり、関心事のいかなるポリペプチドまたはアミノ酸鎖であってもよい。既知のポリペプチドの全配列までを有してもよく、またその有用な断片を含んでもよい。荷重ポリペプチドは、ポリペプチド、その断片、または酵素、ホルモン、成長因子、免疫グロブリン、染色剤などの生物学的に活性があるタンパク質であってもよい。本発明中で使用されてもよい荷重ポリペプチドのいくつかの例には、限定されるわけではないが、プロラクチン (PRL)、血清アルブミン、成長因子および成長ホルモン、すなわちソマトトロピンが含まれる。血清アルブミンには、ウシ、ヒツジ、ウマ、トリおよびヒト血清アルブミンが含まれる。成長因予には、上皮成長因子(EGF)、インシュリン様成長因子I(IGF-I)、インシュリン様成長因子II(IGF-II)、繊維芽細胞成長因子(FGF )、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-アルファ)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-ベータ)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、および組換えヒトインシュリン様成長因子Ｉ（rHuIGF-I ）およびII（rHuIGF-II）が含まれる。本発明を実施するのに使用してもよいソマトトロピンには、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、トリおよびヒトソマトトロピンが含まれる。ブタソマトトロピンには、欧州特許出願公告第104,920号（Biogen）に記載され、そして請求されるデルタ-7組換えブタソマトトロピンが含まれる。好ましい荷重ポリペプチドは、ソマトトロピン、インシュリンＡおよびＢ鎖、カルシトニン、ベータエンドルフィン、ウロガストロン、ベータグロビン、ミオグロビン、ヒト成長ホルモン、アンジオテンシン、プロリン、プロテアーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、およびセルラーゼである。ハイブリッドポリペプチド、SER領域および荷重ポリペプチドはまた、当業界で知られる翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アシル化、およびポリペプチドの望ましい活性に干渉しない他の修飾を含んでもよい。ハイブリッドポリペプチドの開発 SER領域は、デンプン合成に関与する遺伝子に存在する。こうした遺伝子を単離する方法には、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーからのスクリーニングが含まれる。遺伝子は切断し、そして連結、突然変異誘発剤、消化、制限および他のこうした方法により改変してもよく、例えばManiatisら，Molecula r Cloning，Cold Spring Harbor Labs，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに略述されている。SER領域を入手するのに優れた開始材料の例には、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：デンプンシンターゼＩ、II、II I、IV、分枝酵素Ｉ、IIAおよびＢおよび顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSTS）である。これらの遺伝子は、コメ、トウモロコシ、エンドウ、ジャガイモ、コムギ、およびそれに匹敵するものなどのデンプン産生植物に存在する。ゲノムDNA またはcDNAまたはmRNAから作成されたSERプローブまたはSERに対して作成された抗体を使用することにより、クローニングのため有用な遺伝子の単離および同定が可能になる。デンプン酵素コード配列は、SER領域が結合するポリペプチドを被包する能力に干渉しない限り、修飾されてもよい。デンプン粒に被包されるタンパク質をコードする遺伝子の位置が決定されている場合、当業界で知られるように、SER単離にはいくつかの方法を使用してもよい。１つの方法は、遺伝子をさまざまな部位で制限酵素により切断し、Ｎ末端から部位を欠失させ、そしてその結果生じるタンパク質を発現させることである。発現された切断（truncated）タンパク質はその後、デンプンゲル上に泳動させ、残ったタンパク質の結合および解離定数を評価する。当業界で知られるマーカー遺伝子、例えばグリーン蛍光タンパク質遺伝子を切断タンパク質に結合させ、そしてデンプン粒中のマーカー遺伝子の存在を決定するのに用いてもよい。ひとたびSER遺伝子配列領域が単離されれば、デンプンに被包される荷重ポリペプチドを発現するであろう遺伝子断片配列を作成するのに用いてもよい。SER 遺伝子配列および荷重ポリペプチドをコードする遺伝子配列は共に連結してもよい。その結果生じた融合DNAはその後、多くの宿主中で発現するための多くのベクター構築物中に置かれてもよい。好ましい宿主はプラスチド中にデンプン粒を形成するが、SERの試験は、大腸菌のような細菌宿主中で容易に行うことが可能である。荷重ポリペプチドをコードする核酸配列は、DNA、RNA、ゲノムDNA、cDNA、mRN A由来でもよく、また全体または部分的に合成されていてもよい。荷重ポリペプチド配列は、生物学的機能が維持される限り、産生されるタンパク質が新規の突然変異タンパク質であるような突然変異を含むよう操作されていてもよい。荷重ポリペプチドをコードする核酸配列が、SERコード配列に連結される際、荷重ポリペプチドの遺伝子配列は好ましくはＮ末端をコードするSER配列の末端に結合する。Ｎ末端が好ましいが、荷重ポリペプチドがSERのＮ末端またはＣ末端どちらに結合していても、本発明には重要ではないようである。明らかに、本発明の組換え核酸分子を形成する方法は、合成によってまたはクローニングおよび連結によってのどちらの場合も、本発明には重要ではない。ハイブリッドポリペプチドの中央領域は所望による。本発明のいくつかの適用には、ハイブリッドポリペプチドを発現するのに用いられる組換え核酸分予のこの領域に、都合のよいプロテアーゼ切断部位をコードするDNAを導入するのは、大変有用でありうる。また別に、中央領域を形成するように、pH感受性であるアミノ酸配列をコードするDNAを導入するのも有用でありうる。本発明の使用が、プロテアーゼまたはそれに匹敵するものにより、デンプン粒から抽出されそして放出されることが可能な純粋なタンパク質を開発するためであるならば、プロテアーゼ切断部位が有用である。さらに、タンパク質が動物内で消化されるべきものであれば、プロテアーゼ切断部位は、酵素が動物の消化管でデンプンからタンパク質を放出させるのを助けるのに有用でありうる。他の適用および多くの消化における使用において、切断部位は不必要であろう。中央領域部位はスペーサーを含んでもよい。スペーサーはハイブリッドポリペプチドを含むタンパク質につながるペプチドを指す。通常は、タンパク質につながり、ある最小限の距離を保持し、ハイブリッドポリペプチドのフォールディング、電荷または疎水または親水性に影響する以外には、いかなる特定の活性も持たない。構築物の開発ひとたびハイブリッドポリペプチドをコードする連結DNAが形成されれば、ハイブリッドポリペプチドを発現する宿主にDNAを移すことが可能なクローニングベクターまたはプラスミドが調製される。本発明の組換え核酸配列は、都合のよいクローニングベクターまたはプラスミドに挿入される。本発明に好ましい宿主は、デンプン粒を産生する宿主である。しかし、細菌宿主もまた使用してもよい。特に有用なのは、植物のデンプン合成遺伝子のいくつかまたはすべてを含むよう形質転換されている細菌宿主である。一般的な当業者は、プラスミドが宿主に適応していることを理解するであろう。例えば、細菌宿主における、転写制御プロモーターには、lac、TAC、trpおよびそれに匹敵するものが含まれる。さらに、輸送ペプチドをコードするDNAは使用されない可能性が最も高く、そしてポリペプチドを培地に出すために構造遺伝子の上流にある分泌リーダーが使用されてもよい。また別に、産物が宿主中に保持され、そして宿主が溶解され、そしてデンプン抽出法または成分のデンプンマトリックス（またはアミロースまたはアミロペクチン、グリコーゲンまたはそれに匹敵するものなどのデンプン様マトリックス）への結合により、産物を単離し、そして精製してもよい。好ましい宿主は植物であり、そしてしたがって好ましいプラスミドは植物で有用であるよう適応している。プラスミドはプロモーターを含んでいるべきであり、好ましくは、植物のデンプンを含む組織中でのタンパク質発現を標的とするのに適したプロモーターである。プロモーターは種子、根、塊茎およびそれに匹敵するものなど、さまざまな組織に特異的であってもよく；または植物の組織全体で遺伝子発現する、恒常的プロモーターであってもよい。よく知られるプロモーターには、10kD ゼイン（トウモロコシ）プロモーター、CABプロモーター、パタスチン(patastin)、35Sおよび19Sカリフラワーモザイクウイルスプロモーター( 双子葉植物で大変有用)、ポリユビキチンプロモーター（単子葉植物で有用）が含まれ、そしてそれらの増強および修飾が当業界で知られている。クローニングベクターは、プラスミドを正しい位置に向かわせるよう、輸送ペプチドのコード配列を含んでもよい。輸送ペプチドコード配列の例は、配列表中に示される。他の輸送ペプチドのコード配列を使用してもよい。宿主で天然に発生する輸送ペプチドが使用されるのが好ましい。トウモロコシの好ましい輸送ペプチドコード領域が、本明細書の表および図中に示される。輸送ペプチドの目的はペクターを正しい細胞内領域に向けることである。輸送ペプチドコード配列に結合するのは、荷重ポリペプチドのＮ末端をコードするDNA配列である。荷重ポリペプチドをコードする配列の方向は、センスまたはアンチセンス転写のどちらが望ましいのかによって異なる。本明細書に特に記載される本発明のDNA構築物は、Ｎ末端に荷重ポリペプチドをコードする配列を有するが、SERコード領域もまたＮ末端にあって、そして荷重ポリペプチド配列が続いてもよい。DNA構築物の終わりはターミネーター配列である。こうした配列は当業界でよく知られている。クローニングベクターは宿主に形質転換される。クローニングベクター、好ましくはプラスミドの宿主への導入は、当業界で知られる多くの形質転換技術によりなされてもよい。これらの技術は宿主により異なってもよいが、これらには、微小粒子衝撃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム（Agrobacteriu m）形質転換、「ひげ(whiskers)」技術(米国特許第5,302,523号および第5,464,7 65号)、エレクトロポレーションおよびそれに匹敵するものが含まれる。宿主が植物であれば、細胞を再生させ植物を形成させてもよい。植物再生法は、当業界で知られている。ひとたび宿主が形質転換され、そしてタンパク質がそこで発現されれば、宿主に荷重ポリペプチドをコードするDNAが存在することを確認できる。発現されたタンパク質の存在は、ウェスタンブロットまたはELISAにより、または植物または細胞の変化の結果として確認してもよい。被包されたタンパク質の使用本発明には多くの適用がある。ハイブリッドポリペプチドは純粋な状態でデンプンから切断してもよく(切断部位を含んでもよく)、そして純粋なタンパク質を回収してもよい。また別に、デンプン内の被包荷重ポリペプチドは、未精製（ra w）型で使用して、消費する動物（「動物」には哺乳動物、トリおよび魚を含む）の消化管のさまざまな部分にタンパク質を運搬してもよい。例えば、成分が被包されているデンプンが消化に抵抗性があるならば、タンパク質は徐々に動物の腸で放出されるであろうし、したがって価値のあるタンパク質の胃での分解が避けられる。メチオニンおよびリジンのようなアミノ酸を被包し、直接動物が与えられる穀物に取りこませ、したがって他の形でこれらのアミノ酸を食餌に補う必要を省いてもよい。本発明は、ホルモン、酵素、タンパク質、タンパク質性栄養素およびタンパク質性薬剤が、動物の消化管の特定の消化領域を標的とできるようにする。通常上部消化管で消化されるタンパク質がデンプンに被包されると、消化されない様式で胃を通過し、そして損なわれず（intact）または部分的に腸で吸収されることが可能になる。腸壁を通過することが可能であれば、動物にワクチン接種し、または動物に利用可能な栄養素を増やすために、荷重ポリペプチドを使用して動物を薬剤で治療してもよく、また成長因子、すなわちソマトトロピンなどのホルモンを供給してもよい。使用されるデンプンが胃での消化に抵抗性がない場合(例えば糖性（sugary）２デンプンは非常に消化されやすい)、添加されたタンパク質は、動物の上部消化管に吸収されることを標的としてもよい。これは、修飾デンプンを産生するのに使用される宿主が、糖性２型デンプンを作成するよう突然変異するかまたは形質転換される必要がある。本発明は、修飾デンプンを形成する突然変異生物を宿主として使用することを含む。これらの突然変異宿主のいくつかの例には、糖性 1、糖性2、脆性(brittle)、縮性(shrunken)、ろう状(waxy)、アミロース伸長性、鈍性(dull)、不透明(opaque)、および粉末状（fourly）突然変異、およびそれに匹敵するものを有する、コメおよびトウモロコシおよびそれに匹敵するものが含まれる。これらの突然変異デンプンおよび異なる植物源由来のデンプンは、異なるレベルの消化可能性を有する。したがって、DNA発現のための宿主および修飾デンプンを与える動物を選択することにより、ハイブリッドポリペプチドは標的とする場所で消化されることが可能である。異なるタンパク質は体の異なる部分で、最も効率的に消化される。選択的消化性を有するデンプンにタンパク質を被包することにより、当該タンパク質を消化管全体のどの部位にも、そして消化過程の特定の時期に供給することが可能である。本発明の別の利点は、望ましいポリペプチドのグリコシル化レベルが異なるのを阻害する、または異なるよう発現する能力である。被包過程は、タンパク質が他のDNA分子により発現されるのと異なるグリコシル化状態で、顆粒中に発現されることを可能にしてもよい。グリコシル化は、被包量、使用される宿主およびポリペプチド配列に依存するであろう。上述の特性を有する改良作物は、他の好ましい特性を持つことが知られる植物を遺伝的に操作することにより産生してもよい。デンプン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を操作することにより、植物で産生される重要なアミノ酸、タンパク質またはペプチドの量を改変することが可能になる。植物、真菌、細菌または動物起源でもよい、１つまたはそれ以上の遺伝的に操作された遺伝子構築物は、有***配または形質転換によって植物ゲノムに取り込ませてもよい。操作された遺伝子は、野生型遺伝子の付加的なコピーを含んでもよく、または新たな特性を持つ、修飾されたまたは対立遺伝子のまたは代替（alternative）酵素をコードしてもよい。こうした遺伝子構築物の取りこみは、導入された（センスまたはアンチセンス方向）遺伝子の量およびタイプによりさまざまな効果を有する可能性がある。植物が特定のタンパク質、ペプチドを産生する能力を上昇させる、または改良されたアミノ酸バランスを提供する可能性がある。デンプン生合成に関与する酵素のクローニング本発明のDNA構築物を提供するのに、既知のクローニング技術を使用してもよい。本発明に使用される特別な型のSSTS、GBSTS、BE、グリコーゲンシンターゼ( GS)、アミロペクチン、または他の遺伝子の産生源は、デンプンまたはグリコーゲンを作成することが可能ないかなる生物であってもよい。潜在的なドナー生物がスクリーニングされ、そして同定される。その後、２つの方法が可能である：（a）本明細書に記載されるプロトコルにしたがって酵素精製および抗体／配列生成を使用する方法；（b）SSTS、GBSTS、BE、GS、アミロペクチンまたは他のcD NAを異種プローブとして使用し、関与する生物由来のライブラリーにおいて、SS TS、GBSTS、BE、GS、アミロペクチンまたは他のデンプン被包酵素のゲノムDNAを同定する方法である。遺伝子形質転換、植物再生および試験プロトコルは当業界で知られている。この場合、デンプン形成中の発現を確実にする制御配列を含む、形質転換のための遺伝子構築物を作成する必要がある。これらの制御配列は、多くの小穀粒および塊茎および根に存在する。例えば、これらの制御配列は、トウモロコシ内胚乳中の、顆粒結合デンプンシンターゼ(GBSTS)、可溶性デンプンシンターゼ(SSTS)または分枝酵素(BE)または他のトウモロコシ内胚乳デンプン合成経路酵素をコードするDNAで、容易に入手可能である。内胚乳由来のこれらの制御配列は、正しい発生時期でのタンパク質発現を確実にする(例えばADPGピロフォスフォリラーゼ)。この方法において、我々はデンプン結合タンパク質のデンプン結合定数を、適切な濃度の炭水化物、グリコーゲンまたはアミロペクチンなどの存在下で、未変性タンパク質電気泳動を用いて測定する。デンプン被包領域は、部位特異的突然変異誘発および当業者に知られる他の遺伝子操作法を用いて解明することが可能である。新規のペプチドまたはアミノ酸の組み合わせを有する、新規の遺伝的に操作されたタンパク質は、本明細書に記載された方法を用いて評価することが可能である。実施例実施例１: デンプン被包タンパク質の同定法デンプン粒タンパク質単離 12.5ｇの穀粒を25mlの抽出緩衝液(50mM Tris酢酸、pH7.5、１mM EDTA、１mM D TT)中で、各混合の間に１分間隔を開け、ワーリング・ブレンダー(Waringblende r)を用いて20秒間３回、ホモジェナイズする。試料は氷上に置く。ミラ・クロス（mira cloth）でろ過し、そして6,000rpmで30分遠心分離する。上清を捨て、そして白いデンプン沈殿に上層する変色した沈殿を掻き落とす。沈殿を25mlの緩衝液に再懸濁し、そして再度遠心分離する。洗浄をもう２回繰り返す。洗浄した沈殿を−20℃アセトンに再懸濁し、−20℃で沈殿させる。繰り返す。デンプンを空気の流れにより乾燥させる。−20℃で保存する。タンパク質抽出 50mgのデンプンをエッペンドルフチューブ中で１mlの2％SDSと混合する。ボルテックスし、4℃で18,000rpm、５分間スピンする。上清を捨てる。２回繰り返す。１mlの試料緩衝液（4ml再蒸留水、１mlの0.5M Tris-HCl、pH6.8、0.8mlのグリセロール、1.6mlの10％SDS、0.4mlのβメルカプトエタノール、0.2mlの0.5％ブロモフエノールブルー）を加える。ふたに穴を開けたエッペンドルフチューブを 10分間煮沸する。冷却し、10,000rpmで10分遠心分離する。上清を新たなエッペンドルフチューブにデカントする。標準マーカーと共に４分間煮沸する。冷却する。 SDS-Pageゲル：（未変性） 10％分離 4％スタックアクリル／ビス 40％ストック 2.5ml 1.0ml 1.5M Tris pH8.8 2.5ml - 0.5M Tris pH8.8 - 2.5ml 10％SDS 100μl 100μl 水 4.845ml 6.34ml 脱気15分、以下を加える。 1O％過硫酸アンモニウム 50μl 50μl （新たに調製したもの） TEMED 5μl 10μl Mini-Protean II Dual Slab Cellには；ゲル当たり3.5mlの分離緩衝液を使用する。4％スタックを上に注ぐ。ゲルを200V定圧で泳動する。10ｘ泳動緩衝液(25 0mM Tris、1.92Ｍグリシン、1％SDS、pH8.3)。デンプン被包領域測定法溶液：抽出緩衝液 50mM Tris 酢酸、pH7.5、10mMEDTA、10 ％ショ糖、2.5mM DTT(新たに調製したもの）スタック緩衝液 0.5M Tris-HCl、pH6.8 分離緩衝液 1.5M Tris-HCl、pH8.8 10ｘ下部電極緩衝液 30.3ｇTris＋144ｇグリシンを1Lに調製( pHは〜8.3、調整しない)。使用時に希釈上部電極緩衝液下部と同じショ糖溶液 18.66ｇショ糖+100mldH₂O 30％アクリル／ビスストック（2.67％ 146ｇアクリルアミド+4ｇビス+35ml dH₂ C） O。500mlにする。ろ過し、そして4℃暗所で１か月まで保存可能。 15％アクリル／ビスストック(20％C) 6gアクリルアミド+1.5gビス＋25ｍｌdH₂ O。50mlにする。ろ過し、そして4℃暗所で１か月まで保存可能。リボフラビン溶液 1.4ｇリボフラビン＋100mldH₂O。暗所で１か月まで保存可能。 SS検定混合液 25mMクエン酸ナトリウム、25mMビシン− NaOH(pH8.0)、２mMEDTA、１mM DTT(新たに調製したもの)、１mMアデノシン５'ジホスホグルコース（新たに調製したもの )、10mg/mlウサギ肝臓グリコーゲンIII 型（新たに調製したもの）ヨウ素溶液 2gヨウ素+20ｇKI、0.1NHCIで1Lにする。抽出・ 4ml抽出緩衝液+12g内胚乳。ホモジェナイズ。・ミラ・クロスまたは４層のチーズクロスでろ過、20,000g（14,500rpm、SM -24ローター）で4℃、20分間スピン。・ガラスのピペットを用いて上清を除く。・ 0.85ml抽出物+0.1mlグリセロール+0.05ml0.5％ブロモフェノールブルー。・ボルテックスし、そして５分間微量遠心器を用い最速でスピンする。そのまま使用するかまたは液体窒素で凍結し、そして−80℃で最長２週間まで保存する。ゲル成型（cast） Gel Bond PAGフィルム（FMC Industrles、メイン州ロックランド）を外部ガラスプレート（の内部に）両面スコッチテープを用いて、親水側が上になるよう、付着させる。テープおよびフィルムは、プレートの底部になるべく近く均一に並べる。フィルムはプレートよりわずかに小さい。フィルムおよびプレートの間を水でぬらし、フィルムを接着させる。ティッシュを用いて余分な水を押し出す。プレートを通常のようにセットし、その後プレートの底部を粘着性テープでシールする。灰色のゴムを成型スタンドから除けば、カセットは成型スタンドにはまり込むであろう。ゲルはフィルムと共に重合し、そして続くすべての操作の間中、付着したままになる。 4.5％Ｔ分離ミニゲル成型（0.75ｍｍ）： 2.25mldH₂O ＋3.75mlショ糖溶液＋2.5ml分離緩衝液＋1.5ml 30％アクリル／ビスストック＋それぞれのゲルにさまざまな量のグリコーゲン（すなわち0-1.0％）15 分脱気。＋50μl 10％APS ＋5μl TEMED 30分または一晩重合。 3.125％Ｔスタック成型： 1.59mldH₂O ＋3.75mlショ糖溶液＋2.5mlスタック緩衝液＋2.083ml 15％アクリル／ビスストック脱気しない。＋15μl 10％APS ＋35μlリボフラビン溶液＋30μl TEMED 白熱電球近くで2.5時間重合。コームを抜く前に、4℃で冷却する。コームを使用しなくともよく、そしてスタックを１センチだけ成型してもよい。上述の方法は：・異なる温度で泳動してもよい；ゲルおよび溶液を前もってインキュベーションする。・ 15分、20OVで予備泳動する。・ゲルに装填（load）する：１ウェル当たり7μl、またはコームなしの場合 115μl。・染色剤の線が底部にくるまで140Vで泳動する。ゲル装置全体をウォーターバスに入れることにより、さまざまな泳動温度が達成される。時々止めて、ゲルに温度計を挿入してもよい。・酵素検定：ゲルを染色剤の線で切る。SS中でインキュベーションする。混合物を一晩室温で穏やかに震蕩し、検定する。ゲルを水でリンスする。I2/K I溶液で浸す。・ライトボックス上でゲルの写真を取り、写真を測定する。Rm＝ゲル上端から活性バンドまでのmm／ゲル上端から切断した（染色剤の線があった）ゲル底部までのmm。％グリコーゲンに対し1/Rmをプロットする。Ｘ軸と線が交わる点（y=0の場所）が-Ｋである。 SER領域の長さを試験しそして評価するプロトコル： SER領域を選択するため上記の方法に従うには、４つの基本的な段階を必要とする。まず、デンプン被包領域を有するタンパク質をコードするDNAを選択しなければならない。これは既知のデンプン合成遺伝子またはデンプン結合遺伝子、例えばアミラーゼの遺伝子などから選択してもよい。当該タンパク質を抽出しなければならない。多くのタンパク質抽出技術が当業界でよく知られている。当該タンパク質をプロテアーゼで処理して、異なる長さのタンパク質断片を形成ｌしてもよい。好ましい断片は、主にタンパク質のＮ末端領域からの欠失を有する。 SER領域はＮ末端よりＣ末端近くに位置する。当該タンパク質を上述のゲルで泳動し、そしてゲルマトリックスへの親和性を評価する。親和性がより高いことは、タンパク質のその領域がマトリックスをより好むことを示す。この方法により、異なるタンパク質を比較し、天然または合成タンパク質のデンプン被包領域の同定を可能にする。実施例２: SER融合ベクター：次の融合ベクターは、大腸菌での使用に適している。これらのベクター中でSE Rと思われるものに結合する融合遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質（GFP）をコードした。タンパク質およびポリペプチドをコードする異なる遺伝子がいくつベクターに結合していてもよかった。融合ベクターは、waxyトウモロコシのSERに第二の遺伝子または遺伝子断片、この場合はGFPが融合したものを有するよう構築された。 pEXS114(図1aを参照されたい):合成GFP(SGFP)はプラスミドHBT-SGFP(Jen Shee n;Dept.of Molecular Biology;Wellman 11,MGH;Boston MA 02114より)より、プライマーEXS73(5'-GACTAGTCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3')[配列番号1]およびEXS 74(5'-CTAGATCTTCATATG CTTGTACAGCTC GTC CAT GCC-3')[配列番号2]を用いて、P CR増幅した。PCR産物の末端は、TDNAポリメラーゼで削り、平滑末端を生成し；その後、PCR産物をSpeIで消化した。このSGFP断片はpBSK（Stratagene、11011 N orth Torrey PinesRd．La Jollla，Ca.）のEcoRV-SpeI部位にサブクローンし、p EXS114を生成した。 pEXS115(図1bを参照されたい):合成GFP(SGFP)はプラスミドHBT-SGFP(Jen Shee nより)より、プライマーEXS73(上記を参照されたい)およびEXS75(5'-CTAGATCTTG GCCATGGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3')[配列番号3]を用いて、PCR増幅した。PCR産物の末端は、TDNAポリメラーゼで削り、平滑末端を生成し；その後、PCR 産物をSpeIで消化した。このSGFP断片はpBSK（Stratagene）のEcoRV-SpeI部位にサブクローンし、pEXS115を生成した。 pEXSWX（図2aを参照されたい）：トウモロコシWXはpET-21a（図2bを参照されたい）のNdeI-NotI部位にサブクローンした。mRNA配列が生成可能であるゲノムD NA配列および関連するアミノ酸を下記の表1aおよび1bに示している。そしてまた別に、続く表に記載されたDNAを用いてもよい。表1a トウモロコシのwaxy遺伝子の DNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号４および配列番号５］表1b コメのwaxy遺伝子のDNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号６および配列番号７］表２トウモロコシの可溶性デンプンシンターゼIIa遺伝子の DNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号８および配列番号９］表３トウモロコシの可溶性デンプンシンターゼIIb遺伝子の DNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号10および配列番号11］表４トウモロコシの可溶性デンプンシンターゼＩ遺伝子の DNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号12および配列番号13］表５トウモロコシ分枝酵素II遺伝子および輸送ペプチドの mRNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号14および配列番号15］表６トウモロコシ分枝酵素Ｉおよび輸送ペプチドの mRNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号16および配列番号17］表７トウモロコシの可溶性デンプンシンターゼＩ遺伝子（153bp）の輸送ペプチド領域のコード配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号18および配列番号19］ GFP構築物： 1．pET-21a中にGFPのみ： pEXS115をNdeIおよびXhoIで消化し、そしてSGFPコード配列を含む740bp断片を pET-21a(Novagen,601 Science Dr.Madison WI)のNdeIおよびXhoI部位にサブクローンする。 2．全長成熟ＷＸの5'末端にインフレームでGFPをサブクローン： pEXS114由来のSGFPを含む740bpのNdeI断片をpEXSWXのNdeI部位にサブクローンする(図3aのGFP-FLWXマップを参照されたい)。 3．Ｎ末端で切断されたWXの5'末端にインフレームでGFPをサブクローン： WXはＮ末端で700bp切断される。 pEXSWX由来のWXのＣ末端をコードする１kbのBamHI断片をpEXS115のBglII部位にサブクローンする。その後、全SGFP-切断WX断片をNdeI-HindIII断片としてpET 21aにサブクローンする（図3bのGFP-BamHIWXマップを参照されたい）。 4．切断されたWXの5'末端にインフレームでGFPをサブクローン： WXはＮ末端で100bp切断される。 pEXS115由来のSGFPを含む740bpのNdeI-NcoI断片をpEXSWXのNdeIおよびNcoI部位にサブクローンする（図４のGFP-NcoWXマップを参照されたい）。実施例３細菌へのプラスミド形質転換大腸菌コンピテント細胞調製： 1．望ましい大腸菌株の単一コロニーを2.5mlのLB培地に接種する：選択された株はStratageneのXLIBLUE DL2IDE3であり；適切な抗生物質を含む。37℃、250 rpmで一晩増殖させる。 2．一晩培養したものを、適切な抗生物質を含むLB培地100mlに1:50希釈で接種する。OD₆₀₀=0.3-0.5になるまで37℃、250rpmで増殖させる。 3．培養物を無菌遠心ビンに移し、そして氷上で15分間冷却する。 4．3000xgで５分間遠心分離する(4℃)。 5．沈殿を８mlの氷冷形質転換緩衝液に再懸濁する。氷上で15分間インキュベーションする。 6．3000ｘｇで５分間遠心分離する(4℃)。 7．沈殿を８mlの氷冷形質転換緩衝液２に再懸濁する。分注し、液体窒素中で瞬時凍結し、そして−70℃で保存する。形質転換緩衝液１ RbCl 1.2ｇ MnCl₂4H₂O 0.99ｇ酢酸カリウム 0.294ｇ CaCl₂2H₂O 0.15ｇグリセロール 15ｇ dH₂O 100ml pHを0.2M酢酸で5.8に合わせるろ過滅菌形質転換緩衝液２ MOPS（10ｍＭ） 0.209ｇ RbCl 0.12ｇ CaCl₂2H₂O 1.1ｇグリセロール 15ｇ dH₂O 100ml pHをNaOHで6.8に合わせるろ過滅菌大腸菌の形質転換は塩化ルビジウム熱ショック法による：Hanahan,D.(1985)、 DNAcloning：a practical approach(Glover，D.M.監修)中、pp．109-135，IRLPr ess。 1．1-5μｌのＤＮＡを150μlの大腸菌コンピテント細胞と氷上で30分インキュベーションする。 2．42℃で45秒熱ショックをかける。 3．直ちに氷上に２分置く。 4．600μlのLB培地を加え、37℃で１時間インキュベーションする。 5．適切な抗生物質を含むLB寒天上にまく。このプラスミドは細菌中でグリーン蛍光タンパク質を含むハイブリッドポリペプチドを発現するであろう。実施例４: 大腸菌における構築物の発現： 1．関心事のプラスミドを含む大腸菌を３mlのLBに接種する。適切な抗生物質を含む。37℃、250rpmで一晩培養する。 2．２ｍｌの一晩培養したものを100mlのLBに接種する。適切な抗生物質を含む。 37℃、250rpmで増殖させる。 3．OD₆₀₀が約0.4-0.5になったら室温に置き、200rpmにする。 4．OD₆₀₀が約0.6-0.8になったら100μlの1M IPTGで誘導する。最終IPTG濃度は１ mMである。 5．室温で200rpm、4-5時間増殖させる。 6．細胞を遠心により回収する。 7．液体窒素中で瞬時に凍結し、そして−70℃で使用時まで保存する。細胞はdH₂Oに再懸濁し、ＵＶ光下（λ_max=395nm）で固有の蛍光を見てもよい。また別に、細胞を超音波処理し、そして細胞抽出物のアリコットをSDS-PAGEで分離し、そしてＵＶ光下で見てGFP蛍光を検出してもよい。使用されたタンパク質がグリーン蛍光タンパク質である場合、溶解された物質中にタンパク質が存在するかを、ライトボックス中で395nmのＵＶ下で評価してもよく、そして顕著な緑の発光を同定してもよい。実施例５: 細菌からのプラスミド抽出次に示すのは、本発明を実施するのに有用な、多くの一般的なアルカリ溶解プラスミド精製プロトコルの１つである。 1．上述のプラスミドの１つにより形質転換された大腸菌の単一コロニーを100- 200mlのLB培地に接種する。適切な抗生物質を含む。37℃、250rpmで一晩増殖させる。 2．5,000ｘｇで10分間遠心分離する(4℃)。 3．細胞を10mlの水に再懸濁し、15mlの遠心管に移し、そして遠心分離を繰り返す。 4．沈殿を５mlの0.1M NaOH、0.5％SDSに再懸濁する。氷上で10分間インキュベーションする。 5．2.5mlの３M酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、穏やかに逆さにし、そして氷上で10分間インキュベーションする。 6．15,000-20,000ｘｇで５分間遠心分離する(4℃)。 7．上清を同体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1 ）で抽出する。 8．6,000-10,000ｘｇで10分間遠心分離する(4℃)。 9．水相をきれいなチューブに移し、そして１体積のイソプロパノールで沈殿させる。 10．12,000ｘｇで15分間遠心分離する(4℃)。 11．沈殿を0.5mlのTEに溶解し、20μlの10mg/mlRNaseを加え、そして37℃で１時間インキュベーションする。 12．フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で２回抽出する。 13．クロロホルムで１回抽出する。 14．水相を１体積のイソプロパノールおよび0.1体積の３M酢酸ナトリウムで沈殿させる。 15．沈殿を１回、70％エタノールで洗浄する。 16．SpeedVacで沈殿を乾燥させ、そしてTEに沈殿を再懸濁する。このプラスミドはその後、他の宿主に挿入してもよい。表８ pEXS52由来のデンプンシンターゼコード領域の DNA配列および推定されるアミノ酸配列［配列番号20および配列番号21］実施例６: この実験はトウモロコシプロモーター、トウモロコシ輸送ペプチド、デンプンシンターゼＩ遺伝子由来のデンプン被包領域、およびそれに結合する連結された遺伝子断片を有するプラスミドを使用する。図６に示されるプラスミドは、表８に記載されるDNA配列を含む。プラスミドpEXS52は、次のプロトコルにしたがって構築された。トランスジェニックプラスミドの構築に用いられた成分は以下の通りである：プラスミドpBluescript SK- プラスミドpMF6（nos3'ターミネーターを含む）プラスミドpHKH1（トウモロコシadh1イントロンを含む）プラスミドMstsI(6-4)(トウモロコシstsI輸送ペプチドを含み、stsI輸送ペプチドを外に出すPCRのテンプレートとして用いる） pBluescript SK-中のプラスミドMtstIII どちらもstsI輸送ペプチドのPCRに用いられる。どちらもトウモロコシ10KDゼインプロモーターのPCRに用いられる(ジャーナル：Gene 71:359-370[1988])。トウモロコシA632ゲノムDNA(トウモロコシ10KDゼインプロモーターのPCRのテンプレートして用いる)。段階１：トウモロコシ10KDゼインプロモーターをpBluescriptSK-にクローニングする(pEXS10zpと名付ける)。１．1.1Kbトウモロコシ10KDゼインプロモーターをPCRする。プライマー：EXS31、EXS32 テンプレート：トウモロコシA632ゲノムDNA 2．1.1Kbトウモロコシ10KDゼインプロモータPCR産物をpBluescriptSK-プラスミドのSacIおよびSacII部位にクローニングする(図７を参照されたい )。段階２： pEXS10zpのNdeI部位を欠失させる(pEXS10zp-NdeIと名付ける)。 NdeI部位は、埋め込みおよび平滑末端連結によりpBluescriptSK中のトウモロコシ10KDゼインプロモーターより除去する。段階３：トウモロコシadh1イントロンをpBluescriptSK-にクローニングする(p EXSadh1と名付ける)。トウモロコシadhIイントロンをプラスミドpHKH1のXbaIおよびBamHI部位より放出させる。トウモロコシadh1イントロン（XbaI/BamHI断片）をpBluescriptSK-の XbaIおよびBamHI部位にクローニングする(図７を参照されたい)。段階４：トウモロコシ10KDゼインプロモーターおよびトウモロコシadh1イントロンをpBluescriptSK-にクローニングする(pEXS10zp-adh1と名付ける)。トウモロコシ10KDゼインプロモーターを、プラスミドpEXS10zp-NdeIのSacIおよびSacII部位より放出させる。トウモロコシ10KDゼインプロモーター（SacI/Sa cII断片）を、プラスミドpEXSadh1（トウモロコシadh1イントロンを含む）のSacIおよびSacII部位にクローニングする(図７を参照されたい)。段階５：トウモロコシnos3'ターミネーターをプラスミドpEXSadh1にクローニングする(pEXSsadh1-nos3'と名付ける)。トウモロコシnos3'ターミネーターを、プラスミドpMF6のEcoRIおよびHindIII 部位より放出させる。トウモロコシnos3'ターミネーター（EcoRI/HindIII断片）を、プラスミドpEXSadh1のEcoRIおよびHindIII部位にクローニングする(図７を参照されたい)。段階６：トウモロコシnos3'ターミネーターをプラスミドpEXS10zp-adh1にクローニングする(pEXS10zp-adh1-nos3'と名付ける)。トウモロコシnos3'ターミネーターを、プラスミドpEXSadh1-nos3'のEcoRIおよびApaI部位より放出させる。トウモロコシnos3'ターミネーター（EcoRI/ApaI断片）は、プラスミドpEXS10zp-adh1のEcoRIおよびApaI部位にクローニングする( 図７を参照されたい)。段階７：トウモロコシSTSI輸送ペプチドをプラスミドpEXS10zp-adh1-nos3'にクローニングする(pEXS33と名付ける)。 1． 150bpのトウモロコシSTSI輸送ぺプチドをPCRする。プライマー：EXS29、EXS35 テンプレート：MSTSI(6-4)プラスミド 2． 150bpのトウモロコシSTSI輸送ペプチドPCR産物をプラスミドpEXS10zp -adh1-nos3'のEcoRIおよびBamHI部位にクローンする(図７を参照されたい)。段階８： pEXS33中のトウモロコシSTSI輸送ぺプチドに部位特異的突然変異誘発を行う(pEXS33(m)と名付ける)。プラスミドpEXS33のトウモロコシSTSI輸送ペプチドには突然変異（終止コドン）がある。部位特異的突然変異誘発を行い、終止コドンを非終止コドンに変える。新たなプラスミド（トウモロコシ10KDゼインプロモーター、トウモロコシSTSI 輸送ペプチド、トウモロコシadh1イントロン、トウモロコシnos3'ターミネーターを含む）はpEXS33(m)と名付けられる。段階９： pEXS33(m)中のNotI部位を欠失させる(pEXS50と名付ける)。 pEXS33より埋め込み、平滑末端連結によりNotI部位を欠失させ、pEXS50を形成する(図８を参照されたい)。段階10： pEXS33(m)中のトウモロコシadh1イントロンを欠失させる(pEXS60と名付ける)。トウモロコシadhlイントロンは、NotI/BamHI消化により除去し、クレノウ（Kl enow）断片による埋め込み、平滑末端連結によりpEXS60を形成する(図９を参照されたい)。段階11： pEXS50、pEXS60にトウモロコシSTSIIIをクローンする。トウモロコシSTSIIIを、プラスミドpBluescriptSK-中のプラスミドトウモロコシSTSIIIのNdeIおよびEcoRI部位より放出させる。トウモロコシSTSIII（NdeI-Ec oRI断片）を、別々にpEXS50、pEXS60にクローニングし、pEXS51、pEXS61と名付ける(それぞれ図８および９を参照されたい)。段階12：表８の遺伝子をpEXS51のNdeI/NotI部位にクローニングし、pEXS52を形成する。他の同様のプラスミドも他の遺伝子（STSI、II、WX、glgA、glgB、gl gC、BEI、BEIIなど）をpEXS51、pEXS61のNdeI/NotI部位にクローニングすることで作成してもよい。プラスミドEXS52はコメに形質転換された。pEXS52で形質転換された再生コメ植物は印をつけ、そして深紅色の箱に置いた。深紅色の箱より、２つの同胞（sibling）各系統を選択し、そして土混合物（上層土はピートーバーミキュライトが50/50）を満たした2.5インチ（6.35cm）の鉢に移した。鉢は水槽（魚の水槽）に半インチの水を満たして置いた。上部は、高湿を保つため覆った(熱の放出を助けるため、穴をいくつか開けた)。温度計により温度をモニターした。水槽は蛍光下に置いた。最初の週には肥料を使用しなかった。光周期は、午前６時から午後８時、最低14時間の光とした。温度は夜は最低68°Ｆ(20℃)、日中は80°-90°Ｆ（26.7-32.2℃）とした。必要な場合は、加熱マットを水槽の下に置いて使用し、根の成長を助けた。植物は上記の条件に１週間置いた。（注：光強度が低いため、苗（seedling）は高く成長し始めた）最初の１週間後、水槽の上を開放し、そしてコメ形質転換体を高湿および高光強度の成長箱に３週間、移した。また別に、温室で水混合物を使用し、高湿を維持してもよい。植物は３週間成長させた。その後、植物を土混合物（上層土およびピート−ベット(Vet)、50/50 ）の入った６インチ（15.2cm）の鉢（最低５インチ(12.7cm)の鉢）に移した。鉢は、半インチの水を満たした皿の中に置いた。15-16-17（N-K-P）を植物への肥料として(250ppm)、１週間に１度または植物の外見から必要に応じて用いた。植物は午前６時から午後８時まで14時間(最低)、高光強度に置かれ、温度は日中85 °-90°F(29.5-32.2℃)、夜は70°F(21.1℃)に維持された。植物はコメ穀粒を形成し、そしてコメ穀粒を採取した。これらの採取した種子から、デンプンを抽出し、そして種子中のデンプンにおける連結されたアミノ酸Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、Ｅ[配列番号27]の存在を分析してもよい。実施例７：植物のためのSERベクター：図６に示されるプラスミドは単子葉植物、すなわちトウモロコシの使用に適している。プラスミドpEXS52（図６）はプロモーター、輸送ペプチド(トウモロコシ由来)、およびアミノ酸配列ＣＶＡＥＬＳＲＥ[配列番号27]をコードする連結遺伝子断片(TGC GTC GCG GAG CTG AGC AGG GAG)[配列番号26]を有する。この遺伝子断片は、トウモロコシ可溶性デンプンシンターゼ（MSTSI）遺伝子のＮ末端近傍に天然発生する。表８に示されるように、およそアミノ酸292位で、当該デンプンシンターゼのSERは開始する。このベクターは好ましくは、トウモロコシ宿主に形質転換される。当該輸送ペプチドはトウモロコシに適しており、それゆえこれが好ましい宿主である。明らかに、輸送ペプチドおよびプロモーターは、必要であれば、望ましい宿主植物に適するよう改変してもよい。「ひげ」技術（米国特許第5,302,523号および第5,464,765号）による形質転換後、形質転換された宿主細胞を当業界で知られる方法により再生し、形質転換体を受粉させ、そしてその結果生じた穀粒（kernel）を回収し、そしてデンプンおよびデンプン粒におけるペプチドの存在を分析してもよい。以下の好ましい遺伝子をトウモロコシで使用して食餌を改善してもよい：フィターゼ遺伝子、ソモトトロフィン（somototrophin）遺伝子、次の鎖状アミノ酸：AUGAUGAUGAUGAUGAUGAUGAUG[配列番号28];および／またはAAGAAGAAGAAGAAGAAGA AGAAGAAGAAGAAGAAG[配列番号29]；および／またはAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号 30]；または鎖中にリジンアミノ酸をコードするコドンの組み合わせ、またはリジンおよびメチオニンコドン両方をコードする組み合わせ、またはこれらアミノ酸の２つまたは３つの組み合わせすべてである。鎖は、過度に長いものであるべきではないが、鎖の長さは重要ではないようである。したがって、当該アミノ酸は、植物宿主のデンプン産生部分で形成されるデンプン粒に被包され、またはデンプン中に結合するであろう。このプラスミドは、プラスミドをほとんどまたはまったく修飾せずに、コメ、コムギ、オオムギ、オートムギ(oat)、モロコシ(sorghum)、またはアワ（millet ）に形質転換させることが可能である。プロモーターは配列が公表されているwa xy遺伝子プロモーターであってもよく、または当業界で知られる他のゼインプロモーターであってもよい。さらにこれらのプラスミドは、過度の実験なしに、ジャガイモ、サツマイモ(s weet potato)、タロイモ(taro)、ヤムイモ(yam)、ミヤコグサ(lotus)、キャッサバ、ピーナッツ(peanut)、エンドウ、ダイズ(soybean)、インゲン(bean)、またはヒヨコマメ（chickpea）などの双子葉植物に形質転換してもよい。プロモーターは特定の双子葉植物または塊茎作物のデンプン貯蔵領域を標的とするよう選択してもよい。例えば、パタチン（patatin）プロモーターをジャガイモ塊茎に使用してもよい。単子葉植物および双子葉植物を形質転換するさまざまな方法が当該産業に知られており、そして遺伝子を形質転換する方法は、本発明に重要ではない。プラスミドはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に、Anら((1988)Binary Vectors,Plant Molecular Biology Manual A3中,S.B.Ge lbinおよびR.A．Schilperoot，監修（オランダ・ドルドレヒト：Kluwer Academic Publishers），pp.1-19）の凍結融解法により導入してもよい。構築物を含むアグロバクテリウムの接種材料の調製および植物成分の接種、新芽(shoot )の再生、および新芽の発根は、Edwardsらの”Biochemical and molecularchara cterization of a novel starch synthase from patatoes,”Plant J.8,283-294 (1995)に記載されている。多くの被包領域が、多くの異なる遺伝子に存在する。たんぱく質がデンプン粒内に被包される（顆粒被包）されるのが好ましいが、非顆粒デンプン内の被包もまた、「被包」という用語において、本発明の範囲内に含まれる。次のタイプの遺伝子は、この目的に有用である。グリコーゲンシンターゼのデンプン被包領域の使用：大腸菌グリコーゲンシンターゼは、大きいタンパク質ではない：構造遺伝子は長さ1431塩基対で、477アミノ酸のタンパク質を指定し、概算分子量は49,000である。細菌遺伝子を植物ゲノムに挿入する場合、コドン用法の問題が起こることが知られているが、一般的にこの問題は、大腸菌遺伝子の場合、バシラスなど他の細菌由来のものほど大きくない。大腸菌由来のグリコーゲンシンターゼは、トウモロコシ遺伝子と多く共通するコドン用法プロフィールを有するが、既知の方法により、翻訳開始点配列をより植物コンセンサス配列と適合するものに改変することが好ましい： glgA GATAATGCAG[配列番号31] consAACAATGGCT[配列番号32] 可溶性デンプンシンターゼのデンプン被包領域の使用：植物可溶性デンプンシンターゼのcDNAクローンは、上記の背景の項に記載されており、本発明に使用してもよい。こうしたSSTSタンパク質の遺伝子はいずれも、本発明にしたがって構築物中に使用してもよい。分枝酵素のデンプン被包領域の使用：植物、細菌および動物分枝酵素のcDNAクローンは、上記の背景の項に記載されており、本発明に使用してもよい。分枝酵素[1,4D グルカン：1,4D グルカン6D(1,4D グルカノ)トランスフェラーゼ（E.C．2.4.1.18）]は、アミロースをアミロペクチンに変換し、（1,4D グルカン鎖の部分は類似のグルカン鎖の第一水酸基に転移される）時にQ酵素と呼ばれる。トウモロコシ分枝酵素Ｉの配列は、Babaら（1991）BBRC，181:87-94によって研究された。トウモロコシ内胚乳由来のデンプン分枝酵素IIは、Fisherら（1993 ）Plant Physiol，102:1045-1046によって研究された。BE遺伝子構築物は、アミロプラストへ正しく局在するために、アミロプラスト輸送ペプチドの存在を必要とする可能性がある。GBSTSタンパク質のこれらの分枝酵素の遺伝子はいずれも、本発明にしたがって構築物に用いてもよい。顆粒結合デンプンシンターゼのデンプン結合ドメインの使用：植物顆粒結合デンプンシンターゼのcDNAクローンの使用は、Shureら（1983），Cell 35:225-233およびVisserら（1989）Plant Sci．64(2):185-192に記載されている。Visserらはまた、ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼのアンチセンス構築物による発現阻害も記載している((1991)Mol.Gen.Genetic 225 (2):289-296;(1994)The Plant Cell 6:43-52)。Shimadaらはコメにおけるアンチセンスを示している((1993)Theor．Appl．Genet．86:665-672)。Van der Leijらは、野生型waxyジャガイモ遺伝子を形質転換した後、低アミロースジャガイモのアミロース合成が回復することを示している((1991)Theor.Appl.Genet.82:289-2 95)。例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、キャッサバ、エンドウ、またはオオムギ由来の顆粒デンプンシンターゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列がよく知られている。これらGBSTSタンパク質の遺伝子はいずれも、本発明にしたがって構築物中で用いてもよい。植物形質転換ベクターの構築：本発明の方法において使用する植物形質転換ベクターは、標準的な方法を用いて構築してもよい。輸送ペプチド配列の使用：いくつかの遺伝子構築物は、アミロプラストに正しく局在することを確実にするため、アミロプラスト輸送ペプチドの存在を必要とする。葉緑体輸送ペプチドは同様の配列を有すると考えられている(Heijineらは、(1991)Plant Mol．Biol. Reporter,9(2):104-126に葉緑体輸送ペプチドのデータベースを記載している)。本発明に有用な、その他の輸送ペプチドは、ADPGピロホスホリラーゼ((1991)Pla nt Mol．Biol．Reporter，9:104.126)、S（small）サブユニットRUBISCO、アセト乳酸シンターゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよび亜硝酸レダクターゼである。多くの遺伝子型のSサブユニットRUBISCOの輸送ペプチドのコンセンサス配列は、以下の配列を有する：トウモロコシ（corn）SサブユニットRUBISCOは以下の配列を有する：トウモロコシ由来の葉グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの輸送ペプチドは以下の配列を有する：トウモロコシ内胚乳結合デンプンシンターゼの輸送ペプチド配列は以下の配列を有する：トウモロコシ内胚乳可溶性デンプンシンターゼの輸送ぺプチド配列は以下の配列を有する：デンプン被包タンパク質へ新たなアミノ酸またはペプチドを挿入する操作：本発明に用いられるデンプン結合タンパク質は、新たなアミノ酸の組み合わせを取りこむために、当業者に知られる方法により修飾してもよい。例えば、デンプン結合タンパク質配列を修飾し、天然レベル以上のリジン、メチオニンまたはトリプトファンを発現させてもよい。こうしたレベルは、天然レベル以上に有用に上昇し、そしてこうしたタンパク質は、穀類などの作物の栄養素の上昇を提供する。アミノ酸バランスを改変することに加え、デンプン結合タンパク質を、価値あるペプチドがデンプン結合タンパク質に取りこまれてもよいように操作することも可能である。荷重ポリペプチドをデンプン結合タンパク質のＮ末端に結合させることにより、ペプチド断片を付加し、そしてなおデンプン結合能を維持する既知の媒体が提供される。荷重ポリペプチドがデンプン被包領域に結合する部位に、特定のプロテアーゼ切断部位を取りこませることで、さらなる改善を行ってもよい。プロテアーゼは異なるアミノ酸結合に好ましい特異性を有することが当業者によく知られている。こうした特異性を使用して、動物およびヒトの消化管の異なる領域に価値あるペプチドを輸送する運搬手段（vehicle）を提供してもよい。本発明のさらに別の態様において、デンプン粒の精製および加工の後、荷重ポリペプチドを放出してもよい。デンプン分解および／またはゼラチン化法を用いると、デンプン粒に結合したタンパク質が放出され、またはタンパク質分解できようになる可能性があることが知られている。したがって、デンプン粒マトリックスからの商業量のタンパク質およびペプチドの回収が可能になる。本発明のさらに別の態様において、デンプン粒をさまざまな異なる方法で加工し、デンプンの消化可能性を改変する手段を提供することが可能である。この方法論を用いると、デンプン粒中に捕らえられたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の生物学的利用能を変化させることが可能である。前述の発明は、明確さおよび理解の目的で例示および例による方法で詳細に記載されているが、本発明の解説という見地から、ある種の変化および修飾は、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく行うことが可能であることが、通常の当業者には容易に認められるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年４月１６日（１９９８．４．１６）【補正内容】荷重ポリペプチドを用いて、修飾デンプン中の特定のアミノ酸のアミノ酸含量を高める際、好ましくは：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、 Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、TyrおよびValからなる群より選択される３つ以上の異なるタイプのアミノ酸からなる。荷重ポリペプチドを用いて、生物学的に活性があるポリペプチドを、宿主生物または他の生物に供給する際、荷重ポリペプチドは生物学的に活性のあるポリペプチド、例えばインシュリンなどのホルモン、例えばソマトトロピンなどの成長因子、抗体、酵素、免疫グロブリン、または染色剤（dye）であってもよく、また、当業界で知られるように、その生物学的活性断片であってもよい。ポリペプチドが生物学的活性を有する限り、天然に発生するポリペプチドである必要はなく、突然変異していでも、切断されていても、または別の修飾をされていてもよい。こうした生物学的に活性があるポリペプチドは、生物学的に活性があるポリペプチドの生物学的活性部分のみを含む、修飾ポリペプチドであってもよい。これらはまた、生物学的活性を保持する、天然発生生物学的活性アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列（好ましくは少なくとも約75％相同）であってもよい。ハイブリッドポリペプチドのデンプン被包領域は、当業界で知られるいかなるデンプン結合酵素のデンプン被包領域でもよい。例えば、可溶性デンプンシンターゼＩ、可溶性デンプンシンターゼII、可溶性デンプンシンターゼIII、顆粒結合デンプンシンターゼ、分枝酵素Ｉ、分枝酵素IIa、分枝酵素IIBbおよびグルコアミラーゼポリペプチドからなる群より選択される酵素である。ハイブリッドポリペプチドを用いて、荷重ポリペプチドを純粋なまたは部分的に精製した形で産生する際、ハイブリッドポリペプチドは、好ましくはデンプン被包領域および荷重ポリペプチドの間に切断部位を含む。その後、精製荷重ポリペプチドを単離する方法には、ハイブリッドポリペプチドを切断部位に特異的な切断剤と接触させる段階が含まれる。 1．（a）デンプン被包領域；（b）前記デンプン被包領域に融合する荷重ポリペプチド：を含むハイブリッドポリペプチド。 2．前記荷重ポリペプチドが：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His 、 Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValからなる群より選択される３つ以上の異なるタイプのアミノ酸からなる、請求項１のハイブリッドポリペブチド。 3．前記荷重ポリペプチドが生物学的に活性のあるポリペプチドである、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 4．前記荷重ポリペプチドが、ホルモン、成長因子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、酵素、免疫グロブリン、染色剤およびそれらの生物学的活性断片からなる群より選択される、請求項３のハイブリッドポリペプチド。 5．前記デンプン被包領域が、可溶性デンプンシンターゼI、可溶性デンプンターゼII、可溶性デンプンシンターゼIII、顆粒結合デンプンシンンシターゼ、分枝酵素Ｉ、分枝酵素IIa、分枝酵素IIBbおよびグルコアミラーゼポリペプチドからなる群より選択される酵素のデンプン被包領域である、請求項１のハイブリッドポリペプチト。 6．前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドの間に切断部位を含む、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 7．請求項１のハイブリッドポリペプチドをコードする組換え核酸分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1．（a）デンプン被包領域；（b）前記デンプン被包領域に融合する荷重ポリペプチド：を含むハイブリッドポリペプチド。 2．前記荷重ポリペプチドが：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、H is、Ile、Leu，Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValからなる群より選択される異なるタイプのアミノ酸の３つより多くからならない、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 3．前記荷重ポリペプチドが生物学的に活性のあるポリペプチドである、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 4．前記荷重ポリペプチドが、ホルモン、成長因子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、酵素、免疫グロブリン、染色剤およびそれらの生物学的活性断片からなる群より選択される、請求項３のハイブリッドポリペプチド。 5．前記デンプン被包領域が、可溶性デンプンシンターゼＩ、可溶性デンプンシンターゼII、可溶性デンプンシンターゼIII、顆粒結合デンプンシンターゼ、分枝酵素Ｉ、分枝酵素IIa、分枝酵素IIBbおよびグルコアミラーゼポリペプチドからなる群より選択される酵素のデンプン被包領域である、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 6．前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドの間に切断部位を含む、請求項１のハイブリッドポリペプチド。 7．請求項１のハイブリッドポリペプチドをコードする組換え核酸分子。 8．細菌宿主において前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドを発現するのに適した調節配列を含むＤＮＡ分子である、請求項７の組換え分子。 9．植物宿主において前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドを発現するのに適した調節配列を含むＤＮＡ分子である、請求項７の組換え分子。 10．前記調節配列が、単子葉植物において前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドを発現するのに適している、請求項９の組換え分子。 11．前記調節配列が、双子葉植物において前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドを発現するのに適している、請求項９の組換え分子。 12．前記調節配列が、動物宿主において前記デンプン被包領域および前記荷重ポリペプチドを発現するのに適している、請求項９の組換え分子。 13．請求項７の組換え分子を含む発現ベクター。 14．前記ＤＮＡ分子を発現可能な、請求項７の組換え分子を含むよう形質転換された細胞。 15．植物細胞である、請求項14の細胞。 16．請求項15の細胞から再生された植物。 17．前記組換え分子を発現可能な、請求項16の植物由来の種子。 18．前記荷重ポリペプチドを含む請求項14の細胞由来の修飾デンプン。 19．動物の消化系の選択された部位に荷重ポリペプチドの消化を標的する方法であって、前記荷重ポリペプチドを消化管の選択された部位で消化されるよう選択されたデンプンマトリックスに含む請求項18の修飾デンプンを、前記動物に与えることを含む、前記方法。 20．請求項１のハイブリッドポリペプチドから純粋な荷重ポリペプチドを産生する方法であって：（a）前記ハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡにより宿主生物を形質転換し；（b）前記ハイブリッドポリペプチドを前記宿主内で発現させ；（c）前記ハイブリッドポリペプチドを前記宿主から単離し； (d) 前記ハイブリッドポリペプチドから前記荷重ポリペプチドを精製することを含む、前記方法。