JP4767420B2 - 目的の組換えポリペプチドを含有するデンプン顆粒、それを得る方法、及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、目的の組換えポリペプチドを含有するデンプン顆粒、それを得る方法はもとより、その用途、特に医薬組成物におけるそれに関する。
【0002】
デンプンは、世界で最も重要な多糖類源の一つであって、特に植物(トウモロコシ、バレイショ、コムギ、コメ、オオムギ等々)、藻類、微藻類等々に産する。デンプンは、水に不溶である顆粒の形態で出現し、その大きさは、その起源(植物、藻類または微藻類)、さらには目的の植物の遺伝子型に応じて、直径0.1μmから数10μmまで変動し得る。したがって、これらの顆粒の大きさは、直径0.1μmから直径50μmを越えるまでに変動する。さらに、これらの顆粒の結晶化度は、0%(アミロースに富む顆粒について)から30%を越えるまでの範囲にある。3または4種類の結晶型(A、B、C、V)が存在する。顆粒は、デンプン顆粒の中心から始まり、交互に無定形層および半結晶質層の敷設によって成長する。
【0003】
デンプンは、α−1,4で結合し、α−1,6で分枝するグルカンで構成される、いくつかの別個の多糖類画分を含有する。より詳しくは、デンプンは、2種類のグルコース重合体、すなわち一方でのアミロース、すなわち低分子量で、僅かにのみ分枝している(<1%のα−1,6結合)、顆粒の少数画分(約20〜30重量%)と、他方でのアミロペクチン、すなわち高分子量で、高度に分枝している(5%のα−1,6結合)、顆粒の主要画分(70〜80重量%)からなる。アミロースは、デンプン顆粒の結晶化度の発達には必要でなく;デンプン顆粒の結晶化度の原因となるのはアミロペクチンであることが、現在では知られている。
【0004】
生物学的用語においては、厳密に言えば、デンプンは、植物界にのみ、より特定的には真核植物細胞の葉緑体、または非光合成顆粒に出現するにすぎない。2種類のデンプンが、植物によって合成される:すなわち、一時的または光合成デンプン(その合成は、葉緑体のレベルで行われる)、および貯蔵デンプン(その合成は、アミロプラストのレベルで行われる)である。
【0005】
植物におけるデンプンの合成は、前駆体ADP−グルコースの生合成に参加する一揃い酵素の全体、アミロースおよびアミロペクチン分子の組立、最後にデンプン顆粒の分解を伴う。
【0006】
デンプンの生合成の第1段階は、2種類の酵素、すなわちホスホグルコムターゼ(PGM)およびADP−グルコースピロホスホリラーゼ(AGPアーゼ)が関与する、前駆体ADP−グルコースの生成である。
【0007】
デンプン顆粒の生合成の第2段階も、アミロースおよびアミロペクチンの合成に主として参加する、2種類の酵素:すなわちデンプン合成酵素(すなわちアデノシン二リン酸グルコースα−1,4−グルカンα−4−グルコシルトランスフェラーゼ)および分枝酵素(すなわちα−1,4−グルカン−6−グルコシルトランスフェラーゼ)が関与する。デンプン合成酵素は、ADP−グルコースからグルカンの成長する鎖への、α−1,4型のO−グリコシド結合の形成によるグルコース残基の転移を触媒する。次いで、分枝酵素が、伸長するグルカンのα−1,4結合を加水分解し、次いでこうして遊離された断片を、α−1,6結合によってグルカンの残余に結合する。
【0008】
デンプンの分解に関しては、分解酵素の二つの主要な群:すなわち一方では、加水分解性の酵素(加水分解酵素)、たとえばα−アミラーゼ(エンドミラーゼ)、β−アミラーゼ(エキソミラーゼ)、γ−アミラーゼ(アミログルコシダーゼ)、D−酵素(グルコシルトランスフェラーゼ)、R−酵素(脱分枝酵素)、α−グルコシダーゼ(マルターゼ)、他方では、加リン酸分解酵素(またはデンプンホスホリラーゼ)が存在する。
【0009】
高等植物では、デンプン合成酵素のいくつかのイソ型が一緒に出現する。これらのイソ型の間の主な相違は、その溶解度(すなわち、植物の色素体の基質に溶解する)、またはデンプン顆粒に結合するという事実に関係する。
【0010】
デンプン顆粒に結合したデンプン合成酵素(またはGBSS:顆粒結合デンプン合成酵素)は、デンプンと密接に結びついて出現する。GBSSのいくつかのイソ型は、トウモロコシ、エンドウマメ、バレイショまたはコムギで単離されている〔MacDonald & Preiss, 1985;Smith, 1990;Dry et al., 1992;Denyer et al., 1995〕。すべての事例で、GBSSIは、主要なイソ型であって;このイソ型がデンプン顆粒の生合成で果たす役割は、アミロースの形成である〔Tsai, 1974;Hovenkamp-Hermelink et al., 1987;Delrue et al., 1992;Denyer et al., 1995〕。穀類のWX、バレイショのAMF、およびエンドウマメのLAMという遺伝子座での突然変異は、GBSSIの消滅を、デンプンのアミロース画分の完全な崩壊と結び付ける。「ろう状タンパク質」(言語の誤用から、用語「ろう状タンパク質」は、植物におけるGBSSIを指し、こうして、それを他のGBSSから区別するのに用いられている)に対応するcDNAが、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、コメ、バレイショおよびエンドウマメで単離されている。タンパク質の相対配列の比較から、異なる種間で相当の相同性が存在することが示されている〔Ainsworth et al., 1993〕。
【0011】
GBSSIは、デンプン顆粒に結合した唯一のデンプン合成酵素ではない。他のイソ型も、エンドウマメ、バレイショ、トウモロコシまたはコムギではデンプン顆粒に結合されるのが見出されている〔Smith, 1990;Dry et al., 1992;Mu et al., 1994;Denyer et al., 1995〕。しかし、これらの様々なイソ型の役割は、未だ明らかではない。さらに、それらのほとんどは、可溶相でも見出される。
【0012】
可溶性デンプン合成酵素(SS)は、デンプン顆粒には結合せずに、植物の色素体基質で可溶形態で見出される。結合形態と同様に、いくつかの形態の可溶性デンプン合成酵素が、高等植物で出現する。たとえば、可溶性デンプン合成酵素の三つのイソ型(SSI、SSIIおよびSSIII)がバレイショの塊茎で検出されている。
【0013】
様々な形態の可溶性デンプン合成酵素に対応するcDNAが、高等植物でクローニングされている〔Baba et al., 1993;Dry et al., 1992;Edwards et al., 1995;Abel et al., 1996;Marshall et al., 1996;Gao et al., 1998〕。これから導き出される配列比較から、単一の種内であれ、高等植物の種間であれ、イソ型にわたって高度に保存された3領域の存在が明瞭に示されている。
【0014】
本発明者らによる最近の研究は、クラミドモナス・ラインハルティイ(Chlamydomonas reinhardtii)からの可溶性デンプン合成酵素II(SSII)が、アミロペクチン分枝の結晶の形成に主として関与することを確定するのを可能にした。
【0015】
一方、GBSSIは、アミロペクチンの結晶の構築には参加しない。GBSSI活性は、可溶相では検出されたことがない。GBSSIは、デンプン顆粒と密接に関連する。しかし、アミラーゼとは対照的に、デンプンの単位結合は、これまで記載されたGBSSI配列に見出されている。したがって、デンプン顆粒とのGBSSIの結合を制御する機序は、未知である。
【0016】
デンプン合成酵素は、これらの酵素が、目的の組換えペプチドを、デンプン顆粒の生合成が行われる色素体へと輸送するのを可能にしている可能性があるという点で、特に関心が持たれる。そのため、デンプン合成酵素と目的のペプチドとの間の融合ペプチドをコードしている配列による、植物の形質転換は、デンプン顆粒を大量に獲得し、そこから該目的のペプチドが回収できることを可能にすると思われる。
【0017】
国際公開特許第WO98/14601号公報(Exseed Genetics)の著者らが、可溶性デンプン合成酵素I、IIおよびIII(SSI、SSII、SSIII)、顆粒結合デンプン合成酵素(GBSS)、分枝酵素I、IIaおよびIIBb、ならびにグルコアミラーゼを含む群から選ばれるデンプン合成酵素のアミノ末端に目的のポリペプチドが結合された、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を記載したのは、これを目的としてであった。しかし、この出願に記載された配列を用いて植物を形質転換し、したがってまた該配列によって形質転換されたデンプン顆粒を得る方法の詳細は、全く例示されていない。
【0018】
本発明は、目的のポリペプチドがデンプン合成酵素のカルボキシル末端に結合した、融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列による植物の形質転換のみが、該目的のポリペプチドを含有するデンプン顆粒を得るのを可能にすることの本発明者らによる立証から生じた。
【0019】
本発明の目的の一つは、目的のペプチドを、(藻類または微藻類の細胞を包含する)植物細胞におけるデンプン顆粒の生合成の部位へと輸送できる融合タンパク質をコードしている、新規なヌクレオチド配列を提供することである。
【0020】
本発明のもう一つの目的は、上記のヌクレオチド配列を用いて形質転換された、目的のポリペプチドを含有するデンプンを産生する植物を提供することである。
【0021】
本発明のもう一つの目的は、目的のポリペプチドを含有するデンプン顆粒を提供することである。
【0022】
本発明のもう一つの目的は、これらのデンプン顆粒を製造する方法を提供することである。
【0023】
本発明のもう一つの目的は、これらのデンプン顆粒から始めて、目的の組換えポリペプチドを製造する方法を提供することである。
【0024】
本発明のもう一つの目的は、上記のデンプン顆粒を含有する組成物、特に製剤または食料のためのそれを提供することである。
【0025】
本発明のもう一つの目的は、用いられる該目的のペプチドがデンプンを形質転換できるときに、デンプン顆粒を生体形質転換する方法を提供することである。
【0026】
以下、本発明を、図面を援用して解説する。
【0027】
本発明は、アデノシン二リン酸グルコースα−1,4−グルカンα−4−グルコシルトランスフェラーゼ、またはデンプン合成酵素(EC2.4.1.21)、もしくはこの酵素から、特に一つ以上のアミノ酸の抑制、付加もしくは置換によって誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を、5′→3′の方向に含み、該デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質が、植物細胞内でのデンプン顆粒の生合成、またはデンプン顆粒への付着の部位へと移動する特性を有し、該酵素または上記タンパク質をコードしている該ヌクレオチド配列が、目的のペプチドもしくはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の上流に位置することを特徴とする、いかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【0028】
上記または下記において、デンプン合成酵素とは、上記の組換えヌクレオチド配列がコードしている、該デンプン合成酵素と該目的のポリペプチドとの融合ポリペプチド内に、その酵素活性をそれが保存していると否とにかかわらず、植物細胞内でのデンプン顆粒の生合成、またはデンプン顆粒への付着の部位へと移動する特性を有するいかなるタンパク質も意味するものとする。
【0029】
好ましくは、デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりの誘導されたタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、特に植物、藻類もしくは微藻類に産するデンプン顆粒GBSSに結合しているデンプン合成酵素、はるかに好都合には、上記に定義されたとおりのイソ型GBSSI、またはこのGBSSもしくはGBSSIから誘導されるタンパク質をコードしているものから選ばれる。
【0030】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、より詳しくはGBSS、特にGBSSIをコードしているヌクレオチド配列が、この酵素を有すると思われる細胞、特に植物、藻類または微藻類の細胞から調製されたcDNAライブラリーを、該ライブラリー内の1種類以上のcDNAがコードしている該デンプン合成酵素を特異的に認識する抗体を含む抗血清を用いて、該デンプン合成酵素が適切なクローニングベクターによって発現されたときに、スクリーニングすることによって得られるようなそれであり、該抗血清が、動物、たとえばウサギを上記細胞から抽出されたデンプンで免疫化することによって得られことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換ヌクレオチド配列にも関する。
【0031】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、
【0032】
−そのうちの3′末端の1,696塩基対が図1に示される、約2,900〜3,100塩基対のcDNAのヌクレオチド配列であって、
【0033】
・そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列:ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV、またはALDIVMVAAEVAPWSKTGGLGDVに相当し、そのカルボキシル末端が、図1に示されるアミノ酸の系列に相当する、約640〜680アミノ酸、特に約660アミノ酸からなるクラミドモナス・ラインハルティイChlamydomonas reinhardtiiのGBSSIをコードしており、
【0034】
・クラミドモナス・ラインハルティイの細胞から調製されたcDNAライブラリーを、クラミドモナス・ラインハルティイの上記の細胞から抽出したデンプンでウサギを免疫化することによって得られた抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得られるヌクレオチド配列、または
【0035】
−クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチドフラグメントであって、該GBSSIのアミノ末端部分の全体を含み、図1に示されるアミノ酸配列の第25〜238位のうち一つ、もしくは第118〜238位のうち一つに位置するアミノ酸によってそのカルボキシル末端が画定されているペプチドフラグメントをコードしている、上記cDNAのヌクレオチドフラグメント、または
【0036】
−上記cDNAのヌクレオチド配列、もしくはその上記のヌクレオチド配列フラグメントの遺伝子コードの縮重によって誘導され、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSI、もしくはその上記のペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【0037】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSI、もしくはその上記のペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードし、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約50%以上、好ましくは約70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【0038】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に下記に定義するハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズできるヌクレオチド配列
から選ばれ:
【0039】
デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりのフラグメント、もしくはそれから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できることであって、それは、下記の手法:たとえば下記に詳述する方法による、デンプン顆粒からのタンパク質の抽出、および該デンプン合成酵素、または上記に定義されたとおりのフラグメント、もしくはそれから誘導されるタンパク質の存在の、特に下記に詳述する手法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出によって測定できることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなるヌクレオチド配列にも関する。
【0040】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質をコードしている上記のヌクレオチド配列が、より詳しくは、
【0041】
−別途与えられる配列表の配列番号1に相当する、クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、図2に示されるcDNAのヌクレオチド配列、
【0042】
−図2に示されるヌクレオチド配列である配列番号1の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、その5′末端のヌクレオチドが、配列番号1の第1〜186位のうち一つに位置するものに相当し、その3′ 末端のヌクレオチドが、配列番号1の第1,499〜3,117位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に:
【0043】
・図2に示されるペプチド配列の第1および708位に位置するアミノ酸によって画定される、708アミノ酸のプレタンパク質(配列番号3)の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、配列番号1の第15〜2,138位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号2、
【0044】
・図2に示されるペプチド配列の第58および708位に位置するアミノ酸によって画定される、651アミノ酸の成熟タンパク質(配列番号5)の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、配列番号1の第186〜2,138位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号4、
【0045】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の第58および495位に位置するアミノ酸によって画定される、438アミノ酸のフラグメント(配列番号7)をコードしている、配列番号1の第186〜1,499位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号6、
【0046】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の第58および588位に位置するアミノ酸によって画定される、531アミノ酸のフラグメント(配列番号9)をコードしている、配列番号1の第186〜1,778位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号8、または
【0047】
−上記ヌクレオチド配列の遺伝コードの縮重によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記GBSSI、もしくはその上記ペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【0048】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記GBSSIから誘導されるか、またはその上記ペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードしており、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約50%以上、好ましくは約70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【0049】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたとおりのハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
から選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなるヌクレオチド配列にも関する。
【0050】
本発明は、より詳しくは、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしている組換えヌクレオチド配列が、生物学的活性であるペプチド、特に治療目的のか、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【0051】
本発明は、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしている組換えヌクレオチド配列が、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−1,4−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、アミラーゼ、および特に40℃を越える温度で活性である古細菌のような好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素を包含する、デンプンを形質転換できる酵素、たとえば、α−グルカンと相互作用する酵素コードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【0052】
本発明は、デンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列と、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との間に位置し、切断部位をコードしているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【0053】
例示として、切断部位をコードしているヌクレオチド配列は、酸性のpHで非常に不安定である、アスパルチル−プロリン型のペプチド配列、またはプロテアーゼが特異的に認識する小さいペプチド配列、たとえばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、コラゲナーゼ、トロンビン、アラズブチリシン、もしくは臭化シアンのような化学的化合物が認識するそれをコードしている配列から選ばれる。
【0054】
本発明は、デンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターはもとより、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の下流に位置する転写終結シグナルをコードしている配列も含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる組換えヌクレオチド配列にも関する。
【0055】
本発明の範囲内で用いるのに適する転写プロモーターのうちでは、
−原核生物のプロモーターのためには、LacまたはT7プロモーターを、
−高等植物型の真核生物のプロモーターのためには、プロモーター35SCaMV、または植物起源のいかなる種類のプロモーターも列挙することができ、
−微藻類の形質転換の場合は、用い得るプロモーターは、アルギノコハク酸リアーゼをコードしているARG7遺伝子のそれ、または硝酸還元酵素をコードしているNIT1遺伝子のプロモーターである。
【0056】
本発明は、その複製に不可欠ではない部位に挿入された、上記に定義されたとおりの本発明による組換えヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、いかなる組換えベクター、特にプラスミド、コスミドまたはファージ型のそれにも関する。
【0057】
本発明は、上記に定義されたとおりの組換えベクターによって形質転換され、本発明による少なくとも一つの組換えヌクレオチド配列を含む、いかなる細胞性宿主、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンスAgrobacterium tumefaciensのようないかなる細菌にも関する。
【0058】
本発明は、
【0059】
−N末端位に、植物細胞内のデンプン顆粒の生合成の部位へと移動し、該デンプン顆粒に付着する特性を有する、デンプン合成酵素、または該酵素から、特に一つ以上のアミノ酸の抑制、付加もしくは置換によって誘導されるタンパク質を、また
【0060】
−C末端位に、目的のペプチドまたはポリペプチドを
含み、こうして、
該デンプン合成酵素、または誘導されるタンパク質のアミノ酸配列のC末端部分が、目的のペプチド配列のN末端部分に結合されていて、該融合ポリペプチドが、本発明による上記に定義されたとおりの組換えヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とする、いかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0061】
本発明は、より詳しくは、N末端位に、特に植物、藻類または微藻類に産するGBSS、より詳しくはイソ型GBSSI、または上記に定義されたとおりのそれから誘導されるタンパク質を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0062】
本発明は、より詳しくは、デンプン合成酵素が、
【0063】
−そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列:ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV、またはALDIVMVAAEVAPWSKTGGLGDVに相当し、そのカルボキシル末端が、図1に示されるアミノ酸の系列に相当する、約640〜680アミノ酸からなるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIであって、該GBSSIが、クラミドモナス・ラインハルティイの細胞から調製したcDNAライブラリーを、クラミドモナス・ラインハルティイの上記の細胞から抽出したデンプンでウサギを免疫化することによって得た抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得られる、ヌクレオチド配列によってコードされているGBSSI、または
【0064】
−クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチドフラグメントであって、該ペプチドフラグメントが、該GBSSIのアミノ末端部分全体を含み、そのカルボキシル末端としては、図1に示されるアミノ酸配列の、第25〜238位のうち一つ、または第118〜238位のうち一つに位置するアミノ酸によって画定されるペプチドフラグメント、または
【0065】
−上記のペプチド配列またはフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有し、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの約60%以上、好都合には約80%以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【0066】
クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSI、またはフラグメント、もしくはそれから誘導される、上記に定義されたとおりのタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、上記の手法によって測定できることであることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0067】
本発明は、より詳しくは、上記に定義されたとおりのデンプン合成酵素が、より詳しくは、下記のもの、すなわち
【0068】
−図2の第1〜708位に位置するアミノ酸によって画定され、708アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIに相当するペプチド配列である配列番号3、
【0069】
−図2に示されたペプチド配列である配列番号3からの、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、そのアミノ末端のアミノ酸が、配列番号3の第1〜58位のうち一つに位置するものに相当し、そのカルボキシル末端のアミノ酸が、配列番号3の第495〜708位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に:
【0070】
・651アミノ酸の成熟タンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIに相当する、配列番号3の第58〜708位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号5、
【0071】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の438アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号3の第58〜495位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号7
【0072】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の531アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号3の第58〜588位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号9、または
【0073】
−上記のペプチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有するペプチド配列であって、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの好ましくは約60%以上、好都合には約80%以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【0074】
クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSI、またはフラグメント、もしくは上記に定義されたとおりの、それから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、および上記の手法によって測定できることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0075】
本発明は、より詳しくは、目的のポリペプチドが、生物学的活性であるペプチド、特に治療目的のペプチド、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしているものから選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0076】
本発明は、目的のポリペプチドが、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−1,4−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、アミラーゼ、および特に40℃を越える温度で活性である古細菌のような好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素を包含する、デンプンを形質転換できる酵素、たとえば、α−グルカンと相互作用する酵素から選ばれることを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0077】
本発明は、一方でのデンプン合成酵素、またはそれから誘導されるタンパク質と、他方での目的のポリペプチドとの間に位置する、上記のとおりの切断部位を含むことを特徴とする、上記に定義されたとおりのいかなる融合ポリペプチドにも関する。
【0078】
本発明は、上記のとおりの一つ以上の組換えヌクレオチド配列を、そのゲノムに組み込まれてか、またはその細胞質に安定的な方式で維持されて含む、デンプンを産生できる植物、藻類または微藻類から選ばれ、遺伝的に形質転換された植物細胞にも関する。
【0079】
本発明は、その細胞内に含まれるデンプン顆粒中に、上記に定義された1種類以上の融合ポリペプチドを含有する、上記に定義されたとおりのトランスジェニック植物細胞にも関する。
【0080】
本発明は、より詳しくは、そのうちの3′末端の1,696塩基対が図1に示される、約2,900〜3,100塩基対のcDNAのヌクレオチド配列を含む、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしているか、または上記のcDNAからの上記の通りのフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、組換えヌクレオチド配列で形質転換された、上記のトランスジェニック植物細胞に関する。
【0081】
本発明は、はるかに詳しくは、
【0082】
−クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、図2に示されるcDNAヌクレオチド配列、
【0083】
−図2に示されるヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、または
【0084】
−上記のヌクレオチドはれからの、上記に定義されたとおりの誘導されたヌクレオチド配列、もしくは
【0085】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズできるヌクレオチド配列
で形質転換された、上記のトランスジェニック植物細胞に関する。
【0086】
本発明は、上記に定義されたとおりの少なくとも一つの組換えヌクレオチド配列を、それを構成する細胞の、ゲノムに組み込まれてか、または細胞質に安定的な方式で維持されて有する、遺伝的に形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分、特に花、果実、葉、茎、根、種子、もしくは断片にも関する。
【0087】
本発明は、上記の通りの一つ以上の融合ポリペプチドを、それを構成する植物細胞に含まれたデンプン顆粒中に有する、遺伝的に形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の上記に定義されたとおりの部分もしくは断片にも関する。
【0088】
本発明の範囲内で形質転換された植物、藻類または微藻類のうちでも、主として、コムギ、トウモロコシ、バレイショ、コメ、オオムギ、アマランス、クラミドモナス属の藻類、特にクラミドモナス・ラインハルティイ、クロレラ属の藻類、特にクロレラ・ブルガリスChlorella vulgaris、またはドゥナリエラ属の単細胞藻類〔論文「Dunaliella: Physiology, Biochemistry, and Biotechnology (1992), Mordhay Avron and Ami Ben-Amotz Publishers, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida、米国」に記載されたとおり〕が列挙され得る。
【0089】
本発明は、より詳しくは、そのうちの3′末端の1,696塩基対が図1に示される、約2,900〜3,100塩基対のcDNAのヌクレオチド配列を含む、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしているか、または上記のcDNAの上記されたようなフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、組換えヌクレオチド配列で形質転換された、上記のトランスジェニックな植物、藻類もしくは微藻類に関する。
【0090】
本発明は、はるかに詳しくは、
【0091】
−クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、図2に示されるcDNAヌクレオチド配列、
【0092】
−図2に示されるヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、または
【0093】
−上記のヌクレオチド配列の、上記に定義されたとおりの誘導されたヌクレオチド配列、または
【0094】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
で形質転換された、上記のトランスジェニックな植物、藻類もしくは微藻類に関する。
【0095】
本発明は、上記に定義された一つ以上の融合ポリペプチドを含み、表現「形質転換されたデンプン顆粒」または「グルコソーム」によってさらに示される、デンプン顆粒にも関する。
【0096】
本発明は、より詳しくは、上記の約640〜680アミノ酸のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIを含み、そのアミノ末端が、アミノ酸の下記の系列:ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV、またはALDIVMVAAEVAPWSKTGGLGDVに相当し、そのカルボキシル末端が、図1に示されるアミノ酸の系列に相当する、上記に定義された融合ポリペプチド、またはクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIの上記のようなフラグメント、もしくは誘導されるポリペプチドを含む、上記のデンプン顆粒に関する。
【0097】
本発明は、より詳しくは、図2の第1〜708位に位置するアミノ酸によって画定され、708アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている配列を有する、上記に定義された融合ポリペプチド、または図2に示されるペプチド配列の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、特にアミノ末端のアミノ酸が、図2の第1〜58位のうちの一つに位置するものに相当し、カルボキシル末端のアミノ酸が、図2の第495〜708位のうちの一つに位置するものに相当するいかなる配列、たとえば上記のフラグメントも含む、上記のデンプン顆粒に関する。
【0098】
好都合には、上記のデンプン顆粒は、約0.1μm〜数10μmの直径を有し、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約0.1〜1%であることを特徴とする。
【0099】
本発明は、必要ならば、生理学的に許容され得る担体と組み合わせて、上記に定義されたとおりの形質転換されたデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、上記に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とするいかなる医薬組成物にも関する。
【0100】
好都合には、本発明の上記の医薬組成物は、非経口的に、特に静脈内に投与できる形態をなすか、または経口的に投与できる形態をなす。
【0101】
好ましくは、非経口的に投与できる上記の医薬組成物は、デンプン顆粒の直径が、約0.1〜数10μm、特に約0.1〜10μmであり、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約0.1〜1%であることを特徴とする。
【0102】
融合ポリペプチドの重量割合が約0.1〜1%である、約0.1〜約10μmの小さい直径を有する上記の通りのデンプン顆粒は、好都合には、
【0103】
−本発明の範囲内で形質転換され、上記のデンプン顆粒を天然に産生する特性について選別された、特にコメおよびアマランスから選ばれる植物、もしくは植物の細胞、または
【0104】
−本発明の範囲内で形質転換された植物の、上記のデンプン顆粒を天然に産生する部分、たとえば植物の葉、または
【0105】
−本発明の範囲内で形質転換され、上記のとおりの小さい直径のデンプン顆粒を産生するような突然変異を有する植物、特にBuleon, A. et al., 1998に記載された突然変異植物から選別された植物、もしくは植物の細胞、または
【0106】
−本発明の範囲内で形質転換され、植物細胞でのADP−グルコースの合成に必要とされるADP−グルコースピロホスホリラーゼをコードしている遺伝子の全部もしくは一部のアンチセンスヌクレオチド配列を援用して形質転換された植物から、特にMueller-Roeber, B. et al., 1992による論文に記載された形質転換植物から選ばれた植物、もしくは植物の細胞
から得られる。
【0107】
好都合には、非経口的に投与することができる、上記の医薬組成物の場合、デンプン顆粒は、好ましくは、それが患者の血中で含有する融合ポリペプチドの急速な放出を得ようと望む場合は、無定形構造のものから選ぶか、逆に融合ポリペプチドを血中に漸進的に放出しようと望む場合は、結晶質構造のものから選ぶ。
【0108】
例示するならば、無定形デンプン顆粒は、発芽期に本発明に従って形質転換された種子からか、またはShannon, J. & Garwood, D., 1984に記載されたような特定の突然変異植物から、特にトウモロコシの「アミロース増量体」のような突然変異栽培品種、または実際は、そのデンプンがアミロースに富むようにした植物、藻類もしくは微藻類のすべての突然変異栽培品種から得ることができる。
【0109】
本発明による結晶質構造のデンプン顆粒は、好都合には、約30〜35%の結晶を有し、成熟に際して収穫したばかりの穀類か、もしくはShannon, J. & Garwood, D., 1984に記載されたような突然変異植物から、特にトウモロコシの「ワキシー」のような突然変異栽培品種、または実際には、そのデンプンがアミロースを欠く植物、藻類もしくは微藻類のすべての突然変異栽培品種から得ることができる。
【0110】
本発明は、必要ならば、生理学的に許容され得る担体と組み合わせて、1種類以上の上記に定義されたとおりの融合ポリペプチドを含むことを特徴とし、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有する。
【0111】
本発明は、上記に定義されたとおりの形質転換されたデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、上記に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工の分野で使用可能であることを特徴とする、上記のいかなる食品組成物にも関する。
【0112】
本発明は、上記に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチド中を含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工分野で使用可能であることを特徴とする、上記の通りのいかなる食品組成物にも関する。
【0113】
本発明は、植物細胞を(植物、藻類および微藻類から)、かつ必要ならば、上記に定義されたとおりの少なくとも1種類のヌクレオチドによって形質転換された、全植物、藻類または微藻類から得る方法であって、
【0114】
−植物細胞を、本発明による一つもしくはそれ以上の組換えヌクレオチド配列を、これらの細胞のゲノムに組み込むか、またはその細胞質中に安定的な方式で維持するようにして形質転換し、これらの形質転換された細胞をin vitroで栽培すること、
【0115】
必要ならば、上記の形質転換された細胞から、形質転換された植物を生産すること
を含むことを特徴とするいかなる方法にも関する。
【0116】
本発明の上記の方法の一実施態様によれば、植物細胞の形質転換は、葉緑体中の本発明の組換えヌクレオチド配列の、特にKrens et al., 1982による論文に記載された方法による2価の陽イオン(Ca2+)の存在下で、ポリエチレングリコール(PEG)の溶液中で温置した後の、転移によって実施することができる。
【0117】
植物細胞の形質転換は、特にFromm et al., 1986による論文に記載された方法による、電気穿孔によっても実施することができる。
【0118】
植物細胞の形質転換は、遺伝子銃を用い、本発明による組換えヌクレオチド配列で被覆した金属粒子を、それによって高速度で推進し、こうして遺伝子を、特にSanford, 1988による論文に記載された手法に従って細胞核の内部に送達しても、実施することができる。
【0119】
植物細胞の形質転換のもう一つの方法は、De La Penna et al., 1987による論文に記載されたとおり、細胞質または核の微量注入の方法である。
【0120】
本発明の上記の方法の特に好適な実施態様によれば、植物細胞を、上記のとおり、本発明によるベクターで形質転換した細胞性宿主の存在下に置き、該細胞性宿主が、該植物細胞に感染して、上記ベクターのゲノム中に当初含まれた、本発明の組換えヌクレオチド配列を、そのゲノムに組み込むか、またはその細胞質中に安定的な方式で維持できることによって形質転換する。
【0121】
好都合には、用いられる上記の細胞性宿主は、特にBevan, 1984およびAn et al., 1986の論文に記載された方法による、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であるか、または特にJouanin et al., 1987による論文に記載された方法による、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)である。
【0122】
本発明の範囲内で形質転換することができる植物細胞のうちでも、主として、コムギ、トウモロコシ、バレイショ、コメ、オオムギ、アマランス、クラミドモナス・ラインハルティイ、クロレラ・ブルガリスを列挙し得る。
【0123】
本発明の上記の方法の一実施態様によれば、本発明に従って形質転換された植物細胞は、特にBrodelius, 1988による論文に記載された方法によるバイオリアクター内で、液体媒体中でか、またはBrodelius et al., 1979による論文に記載された方法に従って、固定化された形態でか、またはDeno et al., 1987による論文に記載された方法に従って、in vitroで形質転換された根の培養によって、in vitroで栽培する。
【0124】
本発明の上記の方法の好適実施態様によれば、植物細胞の形質転換の後、該形質転換された細胞を適する培地中で培養し、必要ならば、先行する段階で得た植物を受精させ、種子を回収、これらの種子を栽培して、次世代の植物を得ることによって、形質転換された植物を得る段階を実施する。
【0125】
本発明に従って形質転換された種子は、上記の形質転換された植物から収穫されるが、これらの植物は、T0世代のもの、すなわち、適する培地上での本発明の形質転換された細胞の培養から得られるもの、または好都合には先行世代の植物の自家受精によって得られ、本発明の組換えヌクレオチド配列が、メンデルの法則、もしくは染色体外遺伝の法則に従って複製された、次世代(T1、T2等々)のもののいずれかである。
【0126】
本発明は、上記のとおり形質転換されたデンプン顆粒を製造する方法であって、形質転換された植物細胞もしくは植物、またはその部分、特に花、果実、葉、茎、根、もしくは上記のとおり形質転換されたこれらの植物の断片からの、デンプン顆粒の、特に後述する条件での沈降による、抽出の段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【0127】
好ましくは、本発明によるデンプン顆粒は、上記の形質転換された植物、藻類もしくは微藻類からか、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の、上記に定義されたとおりの部分もしくは断片からの、特に以下に記載する条件での沈降による抽出によって得たものである。
【0128】
デンプン顆粒を回収するのに用いられる形質転換された植物は、T0世代のもの、または好都合には上記の次世代(T1、T2等々)のものである。
【0129】
本発明は、上記に定義されたとおりの融合ポリペプチドを製造する方法であって、上記の形質転換されたデンプン顆粒からの融合ポリペプチドを、特に後述する条件で回収し、必要ならば精製する段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【0130】
本発明は、目的のペプチドを製造する方法であって、上記のとおりの切断部位を有する融合ポリペプチドをコードしている上記ヌクレオチド配列で植物細胞を形質転換することによって実施される、本発明による植物の細胞、または形質転換された植物を得るための、上記のとおりの方法を実施する段階を含み、該融合ポリペプチドを、適切な試薬を用いて切断し、次いで必要ならば、目的のポリペプチドを精製する段階をさらに含むことを特徴とする方法にも関する。
【0131】
本発明は、デンプン顆粒の生体形質転換の方法であって、
【0132】
−上記のとおりのデンプンを形質転換できる酵素をコードしている、1種類以上のヌクレオチド配列を含む上記の宿主細胞を援用して、上記に定義されたとおり植物細胞を形質転換し、
【0133】
−そのゲノムが上記の1種類以上のヌクレオチド配列を含むようにして、上記の形質転換された植物細胞のin vitroでの培養によって、形質転換された植物、藻類または微藻類を生産し、
【0134】
−必要ならば、先行する段階で得た植物を受精させ、その種子を回収し、これらの種子を培養して、次世代の植物を入手し、
【0135】
−上記の形質転換された植物、藻類もしくは微藻類、またはその部分、特に花、果実、葉、茎、根、もしくはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の断片から、特に後述する条件での沈降によって、デンプン顆粒を抽出し、
【0136】
−必要ならば、該デンプン顆粒を、上記の融合ポリペプチドの目的のペプチドが活性であることができる温度まで加熱する
段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【0137】
好ましくは、上記の方法を、植物細胞の形質転換によって実施するときは、これらを、約2,900〜3,100塩基対のcDNAヌクレオチド配列を含み、そのうちの3′末端の1,696塩基対が図1に示される、上記のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている上記の組換え配列、より詳しくは、図2に示されるヌクレオチド配列、または図2に示されるヌクレオチド配列の上記のとおりのフラグメント、もしくは誘導された配列を含む、上記の組換え配列で形質転換する。
【0138】
本発明は、与えられた植物、藻類または微藻類に結合したデンプン合成酵素を特異的に認識する抗体を、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法にも関する。
【0139】
従って、本発明は、より詳しくは、与えられた植物、藻類または微藻類の、GBSSIを特異的に認識する抗体を、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法に関する。
【0140】
本発明は、より詳しくは、与えられた植物、藻類または微藻類からのGBSSI以外のGBSSのイソ型を特異的に認識する抗体を、GBSSIの発現が抑制されるような突然変異、たとえば、下記:すなわちクラミドモナス・ラインハルティイにおけるsta2-29::ARG7〔上記のDelrue et al., 1992が記載〕、バレイショにおけるamf〔上記のHovenkamp-Hermelink et al., 1987が記載〕、トウモロコシ、コメおよびコムギにおけるwx〔上記のTsai, 1974が記載〕、エンドウマメにおけるtam〔上記のDenyer et al., 1995が記載〕から選ばれる突然変異を有する、該植物、藻類または微藻類から得られたデンプンによる、動物、特にウサギの免疫化によって製造する方法にも関する。
【0141】
本発明は、デンプン合成酵素、たとえばGBSS、より詳しくはイソ型のGBSSIを、与えられた植物、藻類または微藻類から、この酵素を含有できる該与えられた植物、藻類または微藻類の細胞から調製したcDNAライブラリーを、該ライブラリーからの1種類以上のcDNAがコードしている該酵素を、該酵素が適切なクローニングベクターによって発現されたときに特異的に認識する抗体を含有する、上記の方法に従って得られる抗血清を用いて、スクリーニングすることによって得る方法にも関する。
【0142】
本発明は、下記のもの、すなわち
【0143】
−別途与えられる配列表中の配列番号1に相当する、クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、図2に示されるcDNAヌクレオチド配列、
【0144】
−図2に示されるヌクレオチド配列である配列番号1の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、その5′末端のヌクレオチドが、配列番号1の第1〜186位のうち一つに位置するものに相当し、その3′末端のヌクレオチドが、配列番号1の第1,499〜3,117位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に
【0145】
・図2に示されるペプチド配列の第1および708位に位置するアミノ酸によって画定される、708アミノ酸のプレタンパク質(配列番号3)の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、配列番号1の第15〜2,138位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号2、
【0146】
・図2に示されるペプチド配列の第58および708位に位置するアミノ酸によって画定される、651アミノ酸の成熟タンパク質(配列番号5)の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、配列番号1の第186〜2,138位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号4、
【0147】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の第58および495位に位置するアミノ酸によって画定される、438アミノ酸のフラグメント(配列番号7)をコードしている、配列番号1の第186〜1,499位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号6、
【0148】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の第58および588位に位置するアミノ酸によって画定される、531アミノ酸のフラグメント(配列番号9)をコードしている、配列番号1の第186〜1,778位に位置するヌクレオチドによって画定される配列である配列番号8、または
【0149】
−上記ヌクレオチド配列の遺伝コードの縮重によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記GBSSI、もしくはその上記ペプチドフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、または
【0150】
−上記のヌクレオチド配列もしくはフラグメントから、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導され、クラミドモナス・ラインハルティイの上記GBSSIから誘導されるか、またはその上記ペプチドフラグメントから誘導されるペプチド配列をコードしており、デンプン顆粒に付着する特性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントとの約50%以上、好ましくは約70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または
【0151】
−上記ヌクレオチド配列もしくはフラグメントの一つと、特に上記に定義されたとおりのハイブリダイゼーションの厳格な条件下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
から選ばれる、デンプン合成酵素、または誘導されたタンパク質をコードしているヌクレオチド配列にも関する。
【0152】
本発明は、下記のもの、すなわち
【0153】
−図2の第1〜708位に位置するアミノ酸によって画定され、708アミノ酸のプレタンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIに相当するペプチド配列である配列番号3、
【0154】
−図2に示されるペプチド配列である配列番号3の上記に定義されたとおりのいかなるフラグメント、より詳しくは、そのアミノ末端のアミノ酸が、配列番号3の第1〜58位のうち一つに位置するものに相当し、そのカルボキシル末端のアミノ酸が、配列番号3の第495〜708位のうち一つに位置するものに相当するいかなる配列、特に:
【0155】
・651アミノ酸の成熟タンパク質の形態のクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIに相当する、配列番号3の第58〜708位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号5、
【0156】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の438アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号3の第58〜495位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号7
【0157】
・図2に示されるクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列の531アミノ酸のフラグメントに相当する、配列番号3の第58〜588位に位置するアミノ酸によって画定される配列である配列番号9、または
【0158】
−上記の配列もしくはペプチドフラグメントから、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、デンプン顆粒に付着する特性を有するペプチド配列であって、好ましくは、上記のペプチド配列もしくはフラグメントとの好ましくは約60%以上、好都合には約80%以上の相同性を有するペプチド配列
から選ばれ、
【0159】
クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSI、またはフラグメント、もしくは上記に定義されたとおりの、それから誘導されるタンパク質が保有する特性が、デンプン顆粒に付着できること、および上記の方法によって測定できることであるポリペプチドにも関する。
【0160】
本発明は、上記ポリペプチドに対して導かれた、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
【0161】
本発明を、クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている遺伝子のクローニング、および該GBSSIとの融合ポリペプチドを含む形質転換されたデンプン顆粒の入手の下記の詳細な説明によって、またクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしている、CD142クローンのcDNA挿入断片から推測されるヌクレオチド配列およびタンパク質配列(下線を施した配列は、すべてのデンプンおよびグリコーゲン合成にわたって高度に保存された3領域のうちの一つに相当し、おそらく、ADP−グルコースという基質の固定に関与する)を示す図1によって、さらに例示することにする。
【0162】
(I)クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIの構造遺伝子に相当する、cDNA(相補的DNA)およびgDNA(ゲノムDNA)のクローニング
(A)cDNAのクローニング
クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIの構造遺伝子に相当するcDNAをクローニングするために開発された戦略は、ポリクローナル抗血清を用いた、発現ライブラリーのスクリーニングを利用する。抗血清は、適当なクローニングベクターから発現されるcDNAがコードしている、ポリペプチド配列を認識することができる。
【0163】
(a)抗血清の製造
GBSSIまたはクラミドモナス・ラインハルティイを特異的に認識することができる抗血清を製造するために野生型株(137C)から得たデンプンを、アルビノNew Zealand系雑種のウサギに3回にわたって注射した。同様の実験で、STA2およびSTA3の遺伝子座での二重突然変異株(IJ2)からの残余のデンプンを、同じ条件でウサギに注射した。
【0164】
詳細なプロトコル
−クラミドモナス・ラインハルティイの株の遺伝子型:
137C:mt-nitl nit2
IJ2:mt-nitl nit2 sta2-29::ARG7 sta3-1
137C株は、クラミドモナス・ラインハルティイで実施されたデンプン代謝のすべての研究のための参照株である。IJ2株は、1994年にMaddeleinらが完全に記載した。このSTA2およびSTA3の遺伝子座での二重突然変異株では、GBSSIおよびSSIIの活性が、同時に不在である。STA2座での突然変異は、pARG7というプラスミド〔Meggelein, et al., 1994〕を用いた遺伝子遮断によって形成し、デンプン顆粒からのGBSSIの完全な消滅へと導くのに対して、STA3 遺伝子の突然変異対立遺伝子は、X線による突然変異形成によって形成した〔Fontaine et al., 1993〕。
【0165】
−培養、デンプンの抽出および精製条件
5x104細胞/mlからの接種材料からの細胞を、TAP培地で3日間、連続的に照明(3,000ルクス)しつつ培養した。細胞濃度が、約2x106細胞/mlに達したとき、主培養を停止した。
【0166】
TAP培地の組成(培地1リットルに対する値)
【0167】
【表1】
【0168】
TAP−N培地は、同じ組成を有したが、この培地は、塩化アンモニウムの形態で供給される窒素の不在が第一のものとは異なり、これを同じ濃度での塩化ナトリウムで置き換えたが;細胞が、TAP培地で培養された細胞のそれの20倍まで表す量のデンプンを蓄積するのは、これらの条件においてである。この場合、培養は、5x105細胞/mlで接種した培養体から出発して、連続光で5日間実施した。
【0169】
次いで、細胞を、遠心分離によって2〜4x108細胞/mlまで濃縮し(トリス/酢酸緩衝液、pH7.5、50mM;EDTA10mM;DTT2.5mM)、次いで約703kg/cm2(10,000psi)でのフレンチプレスの作用に付した。圧力の解除で得られた抽出物を、4℃、5,000Gで15分間遠心分離した。デンプンを含有する堆積物を、水1容に再懸濁させ、Percoll(Pharmacia, Uppsala、スウェーデン国)9容をこれに加えてから、4℃、100,000Gで30分間遠心分離した。Percollは、遠心分離の間に密度勾配を形成する。高い密度(1.3〜1.5)を有するデンプンは、遠沈管の底に沈澱するが、低密度の脂質その他の細胞砕片は、Percoll勾配の表面に「キャップ」を形成する。次いで、デンプンの沈澱を、脱イオン水で3回洗浄し、次いで、洗浄からの最後の上清をそれから除去した後、4℃で貯蔵した。
【0170】
−ウサギの免疫化の条件、抗血清の採取および調製
この実験に用いたウサギは、アルビノNew Zealand系雑種のウサギである。精製したデンプンを水500μlに懸濁させて、3回の注射を3週間の間隔で連続して実施した。標準フロインドアジュバント500μlを、この懸濁液に加えた。最後の注射の3週後に、ウサギから血液サンプルを採取した。4℃での凝集の24時間後の血液の一回の遠心分離によって、血清を調製した。137CおよびIJ2株のデンプンの注射によって生成した抗血清は、下記では、それぞれ、「抗血清SA137C」および「抗血清SAIJ2」という指定によって特定される。
【0171】
(b)cDNAライブラリーの調製およびスクリーニング
cDNAライブラリーは、クラミドモナス・ラインハルティイの野生株から精製したmRNAから生成した。λZAP発現ベクターを用いた。
【0172】
詳細なプロトコル
−クラミドモナス・ラインハルティイの完全なRNAの調製
この方法は、シロイヌナズナArabidopsis thalianaの葉からRNAを抽出するのに用いた方法の適応である。1〜2x106細胞/mlの培養体の細胞を、3,500G、4℃で15分間の遠心分離によって収穫した。次いで、細胞を約200μlの体積を有するアリコートに分割した。この段階で、細胞は、液体窒素中に凍結し、−80℃で数ヶ月貯蔵することができる。下記の組成の「Z6」緩衝液400μlを、凍結した細胞200μlに加えた:
【0173】
【0174】
混合物を、数分間非常にはげしく攪拌し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合物(25v/24v/1v)400μlを加え、混合物を再び数分間はげしく攪拌した。全体を、13,000G、4℃で10分間遠心分離した。回収し、上清の体積を測定した後、酢酸1/20容を1Mで、100%エタノール0.7容とともに加えた。核酸は、この時点で加えて、−20℃で少なくとも30分間沈澱させた。13,000G、4℃で15分間遠心分離した後、ペレットを、3Mの酢酸ナトリウム(pH5.6)400μlに再懸濁させ、次いで13,000G、4℃で10分間遠心分離した。次いで、ペレットを、70%エタノールで2回洗浄し、乾燥し、最後に、DEPCで処理した水50μlに溶解した。核酸の量は、分光光度計で260nmで決定した(OD260=1は、約40μg/mlの核酸と等価である)。
【0175】
λZAPベクター中でのcDNAライブラリーの構築
ポリAのテイルを有するRNA(特にmRNA)を、Promega(Madison, WI、米国)が市販するキットである「ポリA牽引mRNA単離システム」を用いて、総RNA調製物から単離した。cDNAの合成、λZAPベクター中での結合、およびキャプシド内でのパッケージングは、Stratagene(La Jolla, CA、米国)が市販するキットである「cDNA合成キット、ZAP−cDNA合成キット、およびZAP−cDNAギガパックIIゴールドクローニングキット」を用いて実施した。従った手順は、該キットとともに供給された指示説明書に対応した。
【0176】
発現ベクター中でのcDNAライブラリーの免疫学的スクリーニング
クラミドモナス・ラインハルティイからのλZAPのcDNA発現ライブラリーのスクリーニングは、以前に得られた(上記を参照されたい)抗血清を用いて実施した。約100,000の溶菌プレートを、細菌増殖培地、および適応させた抗生物質を含有する数個のペトリ皿に、Top-寒天の手法によって展開した。37℃で3時間の温置の後、あらかじめIPTG10mMの溶液に浸積し、乾燥しておいた、ニトロセルロースフィルター(Protan BA85, Schleicher & Schnell, Dassel、ドイツ国)をTop-寒天の表面に貼付した。ペトリ皿を、再び37℃で3時間温置してから、4℃で30分間貯蔵した。次いで、ニトロセルロースフィルターを、寒天表面から注意深く除去した。λZAPライブラリーのスクリーニングの際は、大腸菌XL1-blue株を用いた。そうして、フィルター展開のためのプロトコルは、ウエスタンブロット分析に用いたのと同じである(ウエスタンブロット分析を扱うセクションを参照されたい)。
【0177】
その陽性の性質を確認かつ精製するために、陽性の溶菌領域を、同じ抗血清による一連のスクリーニングに2回連続して付した。3回のスクリーニングの終了時に、溶菌領域が陽性であると判明したとき、目的の挿入断片を含むプラスミドpBluescript SK+の配列を、λファージからin vivoで切り出した。λZAPファージによるSOLR株の同時トランスフェクションに用いたのは、「ExAssistヘルパーファージ」である。このようにして、本発明者らは、ファージミドを入手し、これを、目的のcDNAを有する二本鎖プラスミドのpBluescript SK+の回復へと導く株XL1-Blue MRF′を感染するのに用いた。
【0178】
SA137C抗血清で実施されたこの種のスクリーニングは、3回のスクリーニングの後に、単一陽性クローンの生成へと導いた。本発明者らは、このクローンを「CD142」と指定した。CD142の挿入断片は、1,696bpという大きさを有する(図1で配列を参照されたい)。
【0179】
(c)CD142の挿入断片の配列分析
タンパク質配列ライブラリーを、cDNAクローンの「CD142」から誘導される配列で調べたとき、高等植物のGBSSIで、最高の類似性が得られた。このcDNAの起源の最初の表示は、高等植物の主要GBSSIに対比される、コーディング配列のカルボキシル末端での、119アミノ酸の伸長(約14kDa)の存在によって補強される。実際、SDS−PAGEによって決定された、クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIの分子量は、植物中の対応するタンパク質のそれより、平均して10〜15kDa大きい。119アミノ酸の伸長は、ことなる起源のGBSSI間の分子量におけるこの差を説明する可能性がある。これとは別に、コーディング配列のこの伸長は、他の公知の種類のポリペプチド配列とはいかなる類似性も共有しない。
【0180】
第717位におけるUAAという停止コドンの存在は、946bpの非常に長い非コーディング領域の出発の前触れとなる。3′末端位におけるこれらの非コーディング領域は、クラミドモナスの核遺伝子にはしばしば出現するが、特にメッセンジャーを安定化することが意図されていると思われる。
【0181】
(B)gDNAのクローニング
CD142クローンに関連するgDNAを、コスミドにおける索引付きgDNAライブラリーをスクリーニングした後に単離した〔Zhang et al., 1994〕。c2RBから誘導されたコスミドベクターに構築された、このgDNAライブラリーを、120枚の96穴微量滴定プレートに収容した。各ウェル(プレートの方向付けを容易にするため、2ウェルを隔てた)は、単一のコスミドを輸送する細菌クローンを含んだ。したがって、ライブラリー全体は、挿入断片の平均した大きさが約38kbである、11,280のクローンを表す。そのため、クラミドモナス・ラインハルティイの核ゲノムは、統計的には約4倍してここに表される。
【0182】
CD142クローンに対応するプローブによるこのライブラリーのスクリーニングは、18B1と指定されるゲノムDNAクローンの単離へと導いた。この単一コスミドに存在する挿入断片を、より詳しく解析した。NotIによる制限、次いでCD142プローブによるハイブリダイゼーションの後、約9kbのバンドのみが陽性のままであったにすぎず、CD142クローンに相当するすべての情報が、このフラグメントに存在することを示した。CD142クローンに相当するゲノム配列を、下記に提示する。
【0183】
詳細なプロトコル:
−スクリーニング用ナイロンフィルターの調製:
ナイロンフィルター(Hybond N, Amersham Buchler, Braunschweig、ドイツ国)を、適切な抗生物質(本事例ではアンピシリン)で強化した富裕細菌増殖培地を含む、ペトリ皿上に注意深く置いた。次いで、ライブラリーに含まれる各大腸菌クローンを、複写装置を用いて、ナイロンフィルターに直接複写し、こうして調製されたペトリ皿を、37℃で終夜温置した。次いで、フィルターを寒天表面から取り外し、下記の処理に付した:
【0184】
(1)変性用溶液(NaOH、0.5M;NaCl、1.5M)で2分間、
(2)中和溶液(トリス/HCl、pH7.0、0.5M;NaCl、1.5M)で2分間、
(3)洗浄溶液(緩衝液2xSSC)で2分間。
最後に、フィルターを、乾燥キャビネット内で80℃で2時間温置した。
【0185】
−フィルターの前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション:
前ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液中、42℃で少なくとも4時間実施した。ハイブリダイゼーションは、32Pで標識したヌクレオチドプローブの存在下で、42℃で終夜実施した。膜を、洗浄溶液中、60℃で洗浄し、適用したい厳密度まで調整した。洗浄浴の交換の時間および頻度は、厳密度、膜で検出された放射能に応じて変化する。一般的には、浴は、10分ごとに更新し、洗浄は、低厳密度の洗浄緩衝液で開始し、より高い厳密度の緩衝液で終了する。陽性クローンを検出するために、KodakのX-OMAT ARフィルムを、最後に、−80℃でフィルターに露光させた。
【0186】
溶液および緩衝液の組成:
緩衝液SSCx20:水800mlにNaCl175.3gおよびクエン酸ナトリウム88.2gを溶解する。NaOHの10Nの溶液数滴でpHを7.0に調整する。水で1リットルにする。
【0187】
ハイブリダイゼーション緩衝液:
ホルムアミド 50%
デンハート溶液 x5
SDS 0.5%
リン酸Na緩衝液、pH7.0 50mM
サケ***のDNA 100μg/ml
ウシ血清アルブミン 0.5%
【0188】
デンハート試薬x100(水中500mlのための量):
フィコール400 10g
ポリビニルピロリドン40(PV40) 10g
BSA 10g
【0189】
1Mでのリン酸緩衝液、pH7.0(緩衝液100mlのための量):
Na2HPO4、1M 57.7ml
NaH2PO4、1M 42.3ml
【0190】
洗浄緩衝液:
低厳密度 SSCx2;SDS0.2%
中厳密度 SSCx1;SDS0.5%
高厳密度 SSCx0.5;SDS0.5%
SSCx0.1;SDS0.5%
【0191】
−32Pによるヌクレオチドプローブの調製および標識化:
ヌクレオチドプローブとして役立てるフラグメントは、一般的には、細菌プラスミドの多重クローニング部位に挿入する。そのため、初めに、適切な制限エンドヌクレアーゼでそれを消化し、次いでプラスミドの残余から目的のフラグメントを、TAE緩衝液x1で緩衝化した1%アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次いで、目的のフラグメントに相当するバンドを、ゲルから切り出し、BIO 101 Inc.(La Jolla, CA、米国)が市販するキットの「GENECLEAN IIキット」を用いて、DNA抽出を実施した。初めに、アガロースの小片を、6Mのヨウ化ナトリウム溶液に溶解した。溶液が完成したならば、DNA分子を、「ガラスミルク」と名付けたシリカマトリックスで捕獲した。DNA分子は、NaIというカオトロピックな薬剤の存在下では、シリカビーズに特異的に吸着される。塩、および溶解したアガロースを除去した後、DNA分子を、滅菌水の存在下でシリカビーズから溶離させた。
【0192】
32Pによるヌクレオチドプローブの標識化は、Boehringer(Mannheim、ドイツ国)からの「ランダムプライムDNA標識化キット」を用いて達成した。その原理は、配列の可能な組合せのすべてを表すヘキサヌクレオチドの混合物を用いた、クレノウDNAポリメラーゼによる延長反応のランダムプライミングである。放射性元素は、〔α−32P〕−dCTP(3,000Ci/mmol)から出発して組み込み、その50μCiを各標識化反応に用いた。最後に、放射能標識化したプローブを、95℃で4時間変性させた後に、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。
【0193】
(C)クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子座は、GBSSIの構造遺伝子を表す
下記の分析は、クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子が、GBSSIの構造遺伝子に相当し、CD142クローンが、この遺伝子座から生じるcDNAを表すことを正式に立証した。実際、BamHIというエンドヌクレアーゼによって消化したゲノムDNAの制限解析は、遺伝子遮断〔Delrue et al., 1992〕によって生成された、STA2遺伝子座での突然変異BAFR1株における制限像の顕著な変化を明らかにした。同じ変化は、Maddeleinらが、BAFR1株をsta3−1という突然変異株と交雑させることによって生成した、STA2およびSTA3遺伝子座での二重突然変異IJ2株でも観察された。
【0194】
さらに、クラミドモナス・スミティイC. Smithiの「CS9」株と融合させた、IJ2株の減数***子孫における、制限像のこの変化は、下記の交雑で追跡することができた。
【0195】
【表2】
【0196】
この交雑の結果得られた352の分離体を精製し、増幅し、それらのデンプン蓄積の表現型を解析した。54の減数***組換え体に、制限分析を実施した:遺伝子型がsta2-29::Arg7/+のもの21、遺伝子型が+/sta3-1のもの19、および野生型14であった。遺伝子型がsta2-29::Arg7/+の21分離体に関しては、BamHIによる消化によって得られ、CD142プローブとハイブリダイズさせたその制限像は、依然として、親株IJ2と同じ変化を有した。このことから、本発明者らは、STA2遺伝子とCD142プローブとが、遺伝的に非常に強く関連すると推論する。CD142クローンの性質については、もはやいかなる疑いもなく、それは、GBSSIの構造遺伝子(STA2遺伝子座)を表している。
【0197】
詳細なプロトコル
交雑の実施:
反対の性的極性を有する細胞の融合を実施する前に、融合に好都合である状態にそれらを置くことが必要である。そのため、最初に、細胞を配偶子へと分化させてから、直接接触させなければならない。配偶子形成は、クラミドモナス属では、強い光源(5,000ルクス)の存在下で、細胞を窒素欠乏に付すことによって誘導される。このためには、富裕寒天培地で培養した新鮮な細胞(5日未満の培養)を、TAP−N培地2ml中に懸濁させ、強い光の中に少なくとも12時間、攪拌なしに放置した。細胞の状態を、光学顕微鏡で検査してから、接触させた。配偶子への分化の後、細胞は、非欠乏培養の場合より小さく、特にはるかに活性に富んだ。それぞれの性的極性の細胞の同等量を、混合した。融合は、常に強い光の中で実施した。接触1時間後に、細胞融合は、既に光学顕微鏡で可視的であった。減数***分離体の分析は、細胞融合の産物を富裕培地に4%寒天で沈積させることからなると思われる。こうして得られた皿を、散乱光の中で15時間温置し、次いで、全暗中に少なくとも1週間貯蔵した。これによって、接合子の成熟、および4%寒天中でのそれらの「被嚢形成」が可能になる。暗中でのこの温置期間の後、皿を、明所に戻し、その後の段階を可及的速やかに実施した。可能な限り最大数の融合しなかった栄養細胞を除去するため、寒天の表面を、剃刀の刃で非常に軽く削り取った。双眼拡大鏡で観察して、約50の接合子を含む領域を区別し、これらを富裕培地の新鮮な皿に寒天1.5%で移転した。残留栄養細胞の消滅を確実に完了させるため、皿を、クロロホルム蒸気に45秒〜1分間付した(他の細胞とは対照的に、接合子は、クロロホルム蒸気とのこの程々の時間の接触に耐えられる)。光の存在は、接合子の減数***の開始を不可逆的に誘発することになる。その発芽(1.5%寒天を含有する培地の、より高い含水量によって促進される)の際に、接合子は、4個の一倍体の娘細胞(四分子)を放出し、これが、有糸***によって増殖し、皿内にコロニーを形成することになる。減数***産物の分析は、二通りの方法で実施することができる。第一は、交雑の結果生じる少なくとも200の分離体の無作為調査からなる。分離体の精製の後、その性質を、異なる選択培地での複写によって調べることができる。
【0198】
ゲノムDNAの抽出の手法:
総DNAの抽出のために採用したプロトコルは、Rochaixら(1991)が記載したものであり、ここに詳細を示す:
【0199】
(1)細胞培養体10mlを、15ml入りのボトル内で3,500Gで10分間、3〜5x106細胞/mlまで遠心分離した。
【0200】
(2)次いで、細胞のペレットを、下記の緩衝液350μlに再懸濁させた:
トリス/HCl、pH8.0 20mM
EDTA 50mM
NaCl 100mM
【0201】
(3)2mg/mlの原液からのプロテイナーゼK50μlを加えた(利用できるならば、プロナーゼを10mg/mlで用いることができる)。
【0202】
(4)20%のSDS25μlを加え、55℃で2時間温置した。
【0203】
(5)ジエチルピロカルボネート(DEPC)2μlを加え、70℃で15分間温置した。
【0204】
(6)管を氷中で短時間冷却し、酢酸カリウム5Mの溶液50μlを加えた。
【0205】
(7)管を適正に振盪することによって混合し、氷上に少なくとも30分間放置した(管を冷蔵室内で氷中に放置するならば、この時点で抽出を停止し、翌日再開することができる)。
【0206】
(8)1.5ml入りエッペンドルフ管に移し、ミニ遠心機内で(約13,000Gで)15分間遠心分離した。
【0207】
(9)上清を回収して、新たなエッペンドルフ管に移した。
【0208】
(10)上清を、下記の混合物1容で抽出した:
フェノール(TE:トリス/HCl、pH8.0、10mM、EDTA、1mMで飽和) 25容
クロロホルム 24容
イソアミルアルコール 1容
【0209】
(11)抽出後、100%エタノール1mlを室温にて加えた。抽出が上首尾ならば、沈澱が、「エンジェルヘアー」の形態で出現するのが認められるはずである。この時点から、DNA分子が破損しないよう、操作は、注意深く、静かでなければならない。
【0210】
(12)ミニ遠心機内で(約13,000Gで)5分間遠心分離した。
【0211】
(13)ペレットを70%エタノールで洗浄し、ミニ遠心機内で3分間遠心分離した。
【0212】
(14)(13)の操作を一回または二回反復して、塩を適正に除去した。
【0213】
(15)ペレットを、37℃で5分間乾燥し、次いで、ウシ膵臓RNアーゼを1μg/mlで含有するTE50μlに溶解した。
【0214】
分子ハイブリダイゼーションおよびサザンブロット分析:
DNA25μgを、適切な制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。次いで、制限産物を、0.8%アガロースゲル、TBEx1中での電気泳動によって分離した。次いで、ゲルを、脱プリン溶液中で15分間、変性溶液中で30分間連続して温置した。次いで、変性したDNAを、SSC緩衝液x20を有する毛細管によって「Porablot NYplus」というナイロン膜(Macherey-Nagel GmbH, Duren、ドイツ国)に移した。移転後、膜を、空気の不在下、80℃で2時間温置して、DNAフラグメントをナイロン膜の表面に固着させた。前ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液中、42℃で少なくとも4時間実施した。ハイブリダイゼーションを、あらかじめ調製した標識化されたプローブの存在下、42℃でまる一晩で達成した。膜を、洗浄に適用すべき厳密度まで調整した、洗浄緩衝液中で60℃で洗浄した。洗浄浴の交換の時間および頻度は、厳密度、および膜に存在する放射能のレベルに応じて変動する。一般的には、洗浄浴は、10分ごとに更新し、洗浄は、低厳密度の洗浄緩衝液で開始して、より高い厳密度の緩衝液で終了する。最後に、KodakのX-OMAT ARフィルムを、−80℃で膜に接触させて、ハイブリダイゼーション領域を明らかにさせた。
【0215】
(II)デンプン顆粒とのGBSSIの結合の研究
(A)sta2-1突然変異対立遺伝子の分析
クラミドモナス・ラインハルティイのSTA2遺伝子座に発生したすべての突然変異対立遺伝子のうち、一つだけが、76kDaの野生型単に代えて58kDaの断端GBSSIの産生へと導く。これが18B株のsta2-1対立遺伝子である。Delrueら(1992)は、ポリアクリルアミドゲルから抽出したGBSSIの微細配列決定によって、野生株(137C)のタンパク質のアミノ末端ペプチド配列と、突然変異株(18B)のそれとが同一であることを立証することができた。
【0216】
アミノ末端配列:
@137C株のGBSSI: ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV
@18B株のGBSSI: ALDIVMVAAEVAPGGKTGGLGDV
【0217】
したがって、sta2-1突然変異対立遺伝子が産生するタンパク質は、カルボキシル末端の位置で断端されており、ADP−グルコースについてのKmは、6倍ほど増大される。しかし、このカルボキシル末端配列の不在は、図1に示されるとおり、顆粒でのタンパク質固定の特性を変化させない。
【0218】
詳細なプロトコル
デンプン顆粒からのタンパク質の抽出およびSDS−PAGEの手法:
デンプン0.3〜1mgから、タンパク質を、抽出緩衝液60μl;β−メルカプトエタノール5体積%;SDS2体積%により100℃で5分間抽出した。13,000Gで10分間の遠心分離の後、上清を回収し、ペレットについて操作を1回反復した。二つの上清を併せ、サンプルを、10μlの下記の装荷緩衝液:トリス50mM、グリシン384mM、20%グリセリン、SDS0.1%、ブロモフェノールブルー0.001%を再び加えた後、ゲルのウェルに装荷することができる。移動を、室温で、150Vで1.5時間(ブロモフェノールブルーがゲルを離れるまで)実施した。タンパク質は、クーマシーブルーによる染色、または免疫検出(下記のウエスタンブロット分析に関するセクションを参照されたい)によって顕示した。クーマシーブルーによる染色の際は、ゲルを、下記の溶液中で30分間温置した:2gのクーマシーブリリアントブルーR250、0.5gのクーマシーブリリアントブルーG250、エタノール425ml、酢酸100ml、1,000mlに充分な水。次いで、ゲルを、下記の溶液を用いて、脱色した:
【0219】
・脱色機Iに15〜30分:エタノール450ml、酢酸50ml、水で1,000mlにする。
【0220】
・脱色機IIに一晩:酢酸80ml、メタノール50ml、水で1,000mlにする;この脱色機IIは、ゲルの非特異的な着色を除去する。
【0221】
・脱色機III(酢酸240ml、メタノール200ml、水で1,000mlにする)は、必要ならば、ゲルの完全な脱色を許す。
【0222】
(B)顆粒に結合したタンパク質の量の決定
デンプン顆粒に結合したタンパク質の量を、異なる培養条件で、様々な遺伝子ライブラリー内で決定した。そのためには、細胞を、デンプンの大量蓄積の条件(窒素欠乏培地)、または混合栄養増殖の条件(窒素の存在)に置いた。次いで、顆粒から抽出したタンパク質を、変性条件(SDSの存在)下でポリアクリルアミドゲルに沈積させた。移動の後、タンパク質を、クーマシーブルーで染色することによって顕示させた。この実験の際は、STA1遺伝子座での突然変異株である、I7株を用いた。この突然変異は、Van den Koornhuyseら(1996)によって、その後Van de Walら(1998)によって詳しく記載された。STA1遺伝子座は、ADP−グルコースピロホスホリラーゼの大調節サブユニットの構造遺伝子に相当する。X線突然変異形成の際に生成される、sta1-1突然変異は、3−ホスホグリセリン酸、すなわちそのアロステリックな活性剤に対するこの酵素の不感受性へと導いた。その結果、I7株は、デンプンの正常量の5%未満を蓄積した。顆粒に結合したGBSSIの量の推定は、137Cおよび18B株に対する窒素欠乏の条件下での、デンプンの重量の約0.1%であった。この値は、混合栄養の条件下では1%に達した。I7株の場合、培養条件にかかわらず、GBSSIは、デンプン顆粒の重量の1%より多くを占めた。この分析に用いた手法は、先行段落に記載したものと同じであった。
【0223】
(C)ウエスタンブロット分析での免疫応答の分析
ウサギであらかじめ得られたSA137CおよびSAIJ2抗血清の抗原性を試験するため、様々な培養条件下で培養した異なる株から得られた、新鮮なデンプン100μgから抽出したタンパク質を、免疫移転の手法(ウエスタンブロット分析)による分析に付した。野生株(137C)からのデンプンの注入の際に、GBSSIに関して生成された免疫応答は、sta2-1突然変異株での断端タンパク質の場合でさえ、非常に特異的かつ強力であることが判明した(タンパク質は、わずか100μgの新鮮なデンプンから抽出されている)。デンプン顆粒に結合したタンパク質の量は、SA137C抗血清によって示されたGBSSIより多い、大量バンドの存在が示すとおり、窒素欠乏培養の際のI7突然変異株では、より多いものと思われた。このことは、SAIJ2抗血清で実施したウエスタンブロット分析によって確認され、窒素欠乏で培養されたI7株のデンプンから抽出されたタンパク質により、最強の免疫応答が検出された。
【0224】
対照の目的で、本発明者らは、Abelら(1995)によって得られたPA55という抗血清を用いて、同じ形式の実験を実施した。ウサギで産生されたこの抗血清は、その共通配列が、高等植物の、可溶性であれ、デンプン顆粒に結合してであれ、すべてのデンプン合成において強く保存されたカルボキシル末端の領域に相当する、ペプチドに対して導いたものである。この抗血清は、顆粒に存在するときの、クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIを特異的に認識する。さらに、PA55抗血清は、18Bという突然変異株(sta2-1)が産生する断端タンパク質も認識する。したがって、カルボキシル末端の位置で高度に保存された配列は、断端タンパク質に依然として存在すると思われる。
【0225】
詳細なプロトコル
デンプン顆粒からのタンパク質の抽出およびSDS−PAGEの手法:
これらの手法は、クーマシーブルーによる染色(本事例では省かれている)は別として、先行セクションに記載されたのと同じである。
【0226】
移転、および抗血清による検出の手法:
SDS−PAGE上での移動が終了したとき、ゲルを、メタノールを20%含有する「ウエスタン」緩衝液x1中で30分間温置した。次いで、タンパク質を、電気移転装置(Multiphor II, LKB-Pharmacia, Bromma、スウェーデン国)を用い、下記の条件下、すなわち前に用いた緩衝液により250mAで45分間で、4℃でニトロセルロース膜(Protan BA 85, Schleicher & Schuell, Dassel、ドイツ国)に電気移転した。ニトロセルロース膜へのタンパク質の移転のこの段階の後、膜を、3%のBSAを含有するTBST緩衝液中、室温で1時間温置した。次いで、膜を、TBST緩衝液中で3回洗浄してから、TBS緩衝液で希釈した、ウサギの一次抗血清中、4℃で終夜温置した。膜を、再び、TBST緩衝液で3回洗浄し、次いで、ウサギ抗血清に対して導かれた、TBS中に1/500に希釈したビオチニル化された二次抗体とともに、室温で1時間温置した。TBST緩衝液でさらに3回洗浄した後、膜を、TBS緩衝液中1/3,000の希釈でのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体とともに、室温で30分間温置した。最後に、TBST緩衝液中で3回の洗浄の後、膜を、アルカリ性ホスファターゼの基質:すなわちNBTおよびBCIPを含有するジエタノールアミン緩衝液中での温置によって顕色した(温置時間は、反応の強さに応じて変化した)。用いた検出キットは、Amersham Buchler(Braunschweig、ドイツ国)が提供したもの:すなわち「ウサギ抗体用ブロット検出キット」であった。
【0227】
【0228】
(III)デンプン顆粒中の融合タンパク質のターゲッティング
クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIの特異的なカルボキシル末端の伸長は、前の実験で本発明者らが立証できたとおり、デンプン顆粒へのタンパク質のin vivoでのターゲッティングには必要とされない。約16kDaの伸長は、目的のペプチド配列と置き換えることができ、こうして、それがデンプン顆粒のまさに核心を標的とするのを可能にする。
【0229】
この方法を高等植物に適用するために構築できる、様々な種類のベクターは、下記のものからなった:
【0230】
−プラスミドを適当な細菌株内で増幅できるための、細菌セレクター遺伝子、および細菌の複製起点、
【0231】
−形質転換体の植物の容易な選別を許すと思われるセレクター遺伝子、
【0232】
−GBSSIのコーディング配列と目的のポリペプチド配列との間の翻訳上の融合。二つの主要な種類の翻訳融合を考慮することができ:第一の場合は、目的の配列と融合したGBSSIからの58kDaの断端配列であり、第二の場合は、GBSSIの完全な配列を用いる。
【0233】
−融合は、強力な構成的植物プロモーター、または誘導できる植物プロモーター、次いで直ちに、葉緑体への融合タンパク質の輸送を促進する、適切な通過ペプチドの制御下に置くことができる。
【0234】
(IV)顆粒結合デンプン合成酵素の活性を決定するためのプロトコル
下記の反応混合物100μlにデンプン20μgを加える:
【0235】
反応は、30℃で15分間実施し、次いで、70%エタノール3mlの添加によって停止した。得られた沈澱を、「ワットマンガラス繊維」フィルター(Whatman, Maidstone、英国)によって減圧下で濾過し、70%エタノール4x5mlで洗浄した。フィルターを、シンチレーション液3.5mlを含むカウント用バイアルに入れた後、ベックマンカウンターを用いて、放射能をカウントした。
【0236】
(V)デンプンの抽出および精製の方法は、下記のとおり:
−クラミドモナス・ラインハルティイのような単細胞緑藻類の場合(上記の方法を参照されたい)
【0237】
−高等植物の種子、塊茎その他のあらゆる器官の場合:
植物から採取した器官または形式を、(摩砕後に)適正に均質化した。こうして得られた微粉化した材料を、(Miracloth: Calbiochem, La Jolla, CA、米国のような)フィルター布越しに水洗した。次いで、濾液を、2時間立て掛けておき、デンプン顆粒を沈澱させた。沈澱を、初めに、水数容で、次いで0.1MのNaCl溶液数容で洗浄した。沈澱をもう一度濾過し、次いで、エタノールで2回洗浄してから、乾燥した。
【0238】
【表3】
【0239】
【表4】
【0240】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1】 クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのカルボキシル末端をコードしているcDNAを示す図である。
【図2】 クラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIをコードしているcDNA、およびクラミドモナス・ラインハルティイのGBSSIのペプチド配列を示す図である。
【配列表】
Claims (26)
- 目的のペプチドもしくはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の上流に位置する配列番号6または配列番号8から選択されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、組換えヌクレオチド分子。
- 目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、
− 治療目的のペプチド、もしくは農業および食品工業に用い得るペプチドをコードしている配列、または
− α−グルカンと相互作用する酵素をコードしている配列
から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の組換えヌクレオチド分子。 - α−グルカンと相互作用する酵素が、様々な加水分解酵素、ホスホリラーゼ、α−1,4−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、またはアミラーゼから選択される、請求項2記載の組換えヌクレオチド分子。
- α−グルカンと相互作用する酵素が、好極限性細菌から得られる耐熱性加水分解酵素から選択される、請求項2記載の組換えヌクレオチド分子。
- 配列番号7または配列番号9のアミノ酸配列からなるデンプン合成酵素をコードしているヌクレオチド配列と、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との間に位置し、切断部位をコードしているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子。
- デンプンを産生することができる、植物、藻類または微藻類の細胞から選ばれる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を、そのゲノムに組み込まれてか、またはその細胞質に安定的な方式で維持されて有するトランスジェニック植物細胞。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を、それを構成する細胞の、ゲノムに組み込まれてか、または細胞質に安定的な方式で維持されて有するトランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分。
- 部分が、トランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類の花、果実、葉、茎、根、種子、もしくは断片から選択される少なくとも1つである、請求項7記載のトランスジェニック植物、藻類もしくは微藻類の部分。
- N末端位に、配列番号7または配列番号9のアミノ酸配列からなるデンプン合成酵素、かつ
C末端位に、目的のペプチドまたはポリペプチド
を含むことを特徴とする、融合ポリペプチド。 - 一方ではデンプン合成酵素と、他方では目的のポリペプチドとの間に位置する切断部位を有することを特徴とする請求項9記載の融合ポリペプチド。
- 請求項9または10に定義された1種類以上の融合ポリペプチドを含むことを特徴とするデンプン顆粒。
- 生理学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて、請求項11記載のデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、請求項9または10に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とする医薬組成物。
- 非経口的に投与できる形態をなすか、または経口的に投与できる形態をなし、デンプン顆粒の直径が、約0.1〜数10μmであり、これらの顆粒中の融合ポリペプチドの重量割合が、約0.1〜1%であることを特徴とする、請求項12記載の医薬組成物。
- 非経口的投与が、静脈内投与である、請求項13記載の医薬組成物。
- 生理学的に許容され得るビヒクルと組み合わせて、請求項9または10に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、定義された治療効果を保有することを特徴とする、医薬組成物。
- 請求項11記載のデンプン顆粒を含有し、該顆粒が、請求項9または10に定義されたとおりの1種類以上の融合ポリペプチドを含有し、該融合ポリペプチド中の目的のペプチドが、食品加工の分野で使用可能であることを特徴とする、食品組成物。
- 請求項11記載のデンプン顆粒を製造する方法であって、下記の工程:
− 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド分子を含む組換えベクターによって形質転換された、細胞性宿主による植物細胞の形質転換、
− 上記の形質転換された植物細胞のin vitroでの培養によって、そのゲノムが、請求項1〜5のいずれか一項に記載の1種類以上のヌクレオチド分子を有するようにして形質転換された植物、藻類または微藻類を得ること、
− 形質転換された植物、藻類または微藻類からか、またはこれらの植物、藻類もしくは微藻類の部分からの、沈降によるデンプン顆粒の抽出
を含むことを特徴とする方法。 - 細胞性宿主が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)である、請求項17記載のデンプン顆粒を製造する方法。
- 組換えベクターが、プラスミド、コスミドまたはファージ型から選択される、請求項17または18記載のデンプン顆粒を製造する方法。
- 形質転換された植物、藻類または微藻類の部分が、これら植物、藻類または微藻類の花、果実、葉、茎、根、またはフラグメントから選択されるすくなくとも1つである、請求項17〜19のいずれか一項に記載のデンプン顆粒を製造する方法。
- 請求項9または10に記載の融合ポリペプチドを製造する方法であって、請求項17〜20のいずれか一項記載の方法の実施を包含し、該方法が、デンプン顆粒からの融合ポリペプチドの回収を含むことを特徴とする方法。
- 目的のペプチドを製造する方法であって、請求項17〜21のいずれか一項記載の方法の実施を包含し、該方法が、請求項5記載のヌクレオチド分子による植物細胞の形質転換によって実施され、得られた融合ポリペプチドの適当な試薬による切断の追加的工程を包含することを特徴とする方法。
- デンプン顆粒を生体形質転換する方法であって、下記の工程:
− デンプンを形質転換することができる酵素をコードしている請求項2記載の組換えヌクレオチド分子を含む組換えベクターによって形質転換された、細胞性宿主による植物細胞の形質転換、
− 上記の形質転換された植物細胞のin vitroでの培養によって、そのゲノムが、上記の1種類以上のヌクレオチド配列を有するようにして形質転換された植物、藻類または微藻類を得ること、
− 形質転換された植物、藻類または微藻類からか、またはこれら植物、藻類または微藻類の部分からの、沈降によるデンプン顆粒の抽出、
を含むことを特徴とする方法。 - 細胞性宿主が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)である、請求項23記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
- 組換えベクターが、プラスミド、コスミドまたはファージ型から選択される、請求項23または24記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
- 形質転換された植物、藻類または微藻類の部分が、これらの植物、藻類または微藻類の花、果実、葉、茎、根、またはフラグメントから選択される少なくとも1つである、請求項23〜25のいずれか一項に記載のデンプン顆粒を生体形質転換する方法。
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