JP2000342279A - モノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、モノクローナル抗体産生細胞、特
にモノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞（例えば、ハイ
ブリドーマなど）によるモノクローナル抗体の産生効率
を増大させることが可能な新規方法によるモノクローナ
ル抗体の製造方法、並び該製造方法により得られる新規
モノクローナル抗体産生細胞を提供することを目的とす
る。 【解決手段】 特定のモノクローナル抗体を産生する不
死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）に、該モノクローナル抗
体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸
配列をコードする遺伝子を導入して組換えハイブリドー
マを作製することにより、該細胞の培養液中から有意に
増大した量の該モノクローナル抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体を製造する方法、特には細胞からの該モノクローナル
抗体の分泌量を増大させる方法、並びに該方法により製
造される細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の生体は、生体の恒常的維持に
とって有害であり種々の疾患の発症または増悪の原因
（病原）となる種々の抗原（例えば、外来性抗原（ウイ
ルス、細菌毒素及び化学物質等）あるいは自己抗原（例
えば、自己反応性リンパ球；腫瘍細胞；過剰の生体内因
子（サイトカイン、ホルモン若しくは成長因子等）な
ど）を特異的に捕捉し生体から排除する防御システムで
ある体液性免疫を有している。この体液性免疫において
は、いわゆる抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）が主
役を演じている。

【０００３】抗体（免疫グロブリン）は、２本の長いポ
リペプチド鎖（免疫グロブリン重鎖；IgH鎖）と２本の
短いポリペプチド鎖（免疫グロブリン軽鎖；IgL鎖）と
の４本ののポリペプチド鎖により構成されるＹ型の基本
構造を有する。このＹ型構造は、ジスルフィド結合によ
り架橋した２本のIgH鎖の各々にIgL鎖が１つずつジスル
フィド結合により結合して構成される。

【０００４】この抗体の生体にとって有害な抗原（病
因）の捕捉・排除という機能から、早くから抗体の医薬
品として利用された。初期の抗体医薬は、いわゆる抗血
清と呼ばれるものであり、特定の抗原（例えば、細菌毒
素やヘビ毒など）に対する様々なタイプの抗体が混在す
る血清自体（即ちポリクローナル抗体）である。しかし
ながら、この抗血清の取得方法は、血清からの回収によ
る方法に限られていることからその供給は必然的に限り
があった。また、様々なタイプの抗体が混在するこの抗
血清から特定の抗原特異性を有する単一のタイプの抗体
分子、即ちモノクローナル抗体を単離することにおいて
も多大な困難性を有していた。

【０００５】これらの問題は、1975年のケーラー及びミ
ルシュタインらによるいわゆるハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の作製の成功（Nature, Vol.256, p.4
95-497,1975）により解決へと導かれた。この方法は、
即ち、抗原により免疫感作された非ヒト哺乳動物から採
取した特定のタイプのモノクローナル抗体を産生する細
胞（脾臓細胞等のＢ細胞）をミエローマ細胞と細胞融合
させ不死化させることにより不死化Ｂ細胞（ハイブリド
ーマ）を得、該ハイブリドーマを培養することにより細
胞培養液中から該モノクローナル抗体を精製、取得を可
能にするものであった。この方法のみでは、所望のモノ
クローナル抗体の大量製造が必ずしも達成されないもの
の、所望のモノクローナル抗体を所望の折に取得できる
という点では画期的技術であった。この技術により、モ
ノクローナル抗体の抗体医薬としての利用への道が開か
れた。

【０００６】モノクローナル抗体は、上述のような抗血
清（ポリクロナール抗体）に比べ、その抗原特異性や安
定性などにおいて特段に優れること、並びに疾患の発症
あるいは増悪に関与する抗原（例えば、ウイルスや細菌
毒素等の外来性抗原；サイトカイン、ホルモン若しくは
成長因子等の種々の生体内因子；並びに受容体、細胞接
着分子及びシグナル伝達分子などの細胞表面分子など）
に特異的に結合することにより、該抗原の生物活性を調
節（活性阻害、活性増強、シグナル伝達阻害、リガンド
に代わるシグナル伝達、あるいは細胞間接着の阻害な
ど）することができることから、これまでに種々の疾患
の予防及び治療のための極めて有用な医薬品として用い
られている。

【０００７】一方、上述のハイブリドーマによるモノク
ローナル抗体の産生量は、必ずしも高いものとは言え
ず、該ハイブリドーマを培養して、その細胞培養液中か
ら該モノクローナル抗体を精製、単離する方法のみで
は、該モノクローナル抗体の大量製造に困難性を伴うも
のであった。従って、医薬品として極めて有用なモノク
ローナル抗体を、十分に且つ安価に供給するために、ハ
イブリドーマからより多くの量のモノクローナル抗体を
製造する方法が検討されている。

【０００８】例えば、ヒト抗体産生ハイブリドーマをイ
ンターロイキン−２を添加した培地で培養することによ
り抗体の産生量が増大する旨の報告がされている（Cell
ularimmunology, Vol.115, p.325-333, 1988)）。ま
た、遺伝子工学技術を用いた試みとして、オチ（Ochi）
等らは、下記のような報告をしている（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA vol.80, p.6351, 1983）。ハプテン（TN
P；2,4,6-trinitrophenyl）特異的なマウスIgMモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマSp6からクローニ
ングした該抗TNPモノクローナル抗体のIgH鎖及びIgL
（κ）鎖各々をコードするIgH鎖遺伝子（μ）とIgL鎖遺
伝子（κ）を、該抗TNPモノクローナル抗体とは異なる
未知の抗原に対するIgGモノクローナル抗体を産生する
プラズマ細胞腫X63Ag8に導入して得た組換え細胞が、該
IgG抗体とともに該抗TNP抗体を産生する。また、該ハイ
ブリドーマSp6に由来する変異株であり、該TNP抗体の軽
鎖であるκ鎖のみを分泌し重鎖を発現せず結果として該
抗TNP抗体を分泌しない細胞株に、該抗TNP抗体の重鎖を
コードするIgH遺伝子を導入して得た組換え細胞が、該
抗TNP抗体を産生する。しかしながら、このオチらの実
験の結果では、上記各々の組換え細胞により産生される
抗TNP抗体の量は、該ハイブリドーマSp6からサブクロー
ニングされたハイブリドーマSp603が産生する抗TNP抗体
の量の10乃至25％程度であり、目的のモノクローナル抗
体の分泌量を上げることには失敗している。

【０００９】一般に、ハイブリドーマや抗体遺伝子を組
み込んだ宿主細胞によりモノクローナル抗体を大量に生
産させる手段として、培養液当たりの細胞数を増加させ
る方法と、細胞当たりの物質生産を向上させる方法が検
討されている。培養液当たりの細胞数を増加させること
は好ましい方法であるが、細胞数の増加が必ずしも抗体
の高生産につながるとは限らず、むしろ抗体生産性の高
い単一の細胞株を選別、単離し、該単一の細胞株を培養
することが重要である。この抗体生産性の高い細胞株
（ハイブリドーマや組換え細胞など）の選別、単離には
多大の労力を有すものの、所望のモノクローナル抗体の
生産性を上げる目的においては、極めて重要なファクタ
ーである。

【００１０】一方、遺伝子組換え細胞を用いた所望の蛋
白質の製造においては、該組換え細胞に導入された該所
望の蛋白をコードする遺伝子の発現効率を高めるため、
該組換え細胞に該所望の蛋白をコードする遺伝子ととも
にジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子やグルタミ
ン酸合成酵素（GS）遺伝子を導入し、該所望の蛋白の遺
伝子のコピー数を増幅することにより、該所望の蛋白の
産生量を増大される方法が利用されている（国際特許出
願公開WO81/02426号、及び同WO87/04462号など）。DHFR
遺伝子を例に挙げれば、これらの方法は、即ち、所望の
蛋白をコードする遺伝子の近傍にDHFR遺伝子を挿入した
発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形
質転換した後、該宿主細胞を薬剤（例えば、メソトレキ
セイト（MTX）、ホスフィノトリシン、メチオニンスル
ホキシミン等）の存在下で培養して薬剤耐性株を選択す
る。得られた薬剤耐性株では、導入されたdhfr遺伝子の
コピー数が増大（遺伝子増幅）すると同時に、その近傍
に隣接する遺伝子も遺伝子増幅される。所望の蛋白をコ
ードする遺伝子のコピー数を増幅される結果、該所望の
蛋白を産生量の増大が期待される。

【００１１】抗原により免疫感作させた哺乳動物から単
離したモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を不死化して得ら
れる不死化Ｂ細胞（例えば、前述の該Ｂ細胞とミエロー
マ細胞との融合により得られるハイブリドーマ）におい
ては、再配列された免疫グロブリン遺伝子（IgH遺伝
子）及び再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子（IgL
遺伝子）はともにゲノム中に組み込まれている。上述の
遺伝子増幅遺伝子により該IgH遺伝子及びIgL遺伝子を増
幅するためには、該各々の遺伝子のゲノム上における存
在位置を同定し、且つ各々の遺伝子の近傍に該遺伝子増
幅遺伝子を挿入する必要がある。しかしながら、この方
法は理論的には可能性を有するが、多大な時間と労力を
有する上、該不死化Ｂ細胞のゲノム上の所望の位置に正
確に該遺伝子増幅遺伝子をターゲティングすることは現
実には不可能である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、より簡便な
操作で確実に、抗体産生細胞、特に不死化Ｂ細胞（ハイ
ブリドーマ）によるモノクローナル抗体の産生効率を増
大させることを目的とする。即ち、これまで困難とされ
てきた該不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）によるモノク
ローナル抗体発現効率を増大することができる新規な方
法を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ハイブリ
ドーマによるモノクローナル抗体生産においては、免疫
グロブリン軽鎖遺伝子（IgL鎖遺伝子）の発現に比べ、
免疫グロブリン重鎖遺伝子（IgH鎖遺伝子）の発現がし
ばしば不安定であり、場合によっては抗体分子の分泌が
停止すること着目し、抗体分子の分泌量は、IgH鎖遺伝
子の発現量に依存するものと発想した。

【００１４】本発明者らは、この発想に基づき、IgH鎖
遺伝子の発現を改善（増強）することにより抗体分子の
分泌量を増大させる方法に関しで鋭意研究を行った結
果、特定のモノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞
（ハイブリドーマ）に、該ハイブリドーマからクローニ
ングした該モノクローナル抗体の重鎖ポリペプチドをコ
ードする再配列された内在性IgH遺伝子と同一の塩基配
列を有するIgHコーディングcDNAを導入して得た組換え
ハイブリドーマにおいては、該モノクローナル抗体の分
泌量が有意に増大すること、また、該ハイブリドーマに
該IgHコーディングcDNAとともにDHFR遺伝子などの遺伝
子増幅遺伝子を導入することによっても、該モノクロー
ナル抗体の産生量が増大することを見出し本発明を完成
するに到った。

【００１５】本発明の方法を用いれば、モノクローナル
抗体産生細胞による該モノクローナルの産生量を有意に
増大することができる。即ち、本発明のモノクローナル
抗体の製造方法並びに該方法により製造される細胞は、
医薬品として有用なモノクローナル抗体の製造において
極めて有用である。即ち、本発明は下記のとおりの方法
及び細胞である。

【００１６】（１） モノクローナル抗体の製造方法で
あって、下記工程： （ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及
び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有
し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫
グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリ
ン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチ
ドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該
免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
を導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転
換細胞を得る工程；及び（ｂ）該形質転換細胞を培養
し、細胞培養液中に分泌された該モノクローナル抗体を
取得する工程、からなることを特徴とするモノクローナ
ル抗体の製造方法。 （２） 該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸
配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、該内
在性免疫グロブリン重鎖遺伝子と同一の塩基配列を有す
る遺伝子であることを特徴とする前記(1)に記載の製造
方法。 （３） 該細胞が、哺乳動物のＢ細胞に由来する不死化
Ｂ細胞であることを特徴とする前記(1)または前記(2)に
記載の製造方法。 （４） 該不死化Ｂ細胞が、該Ｂ細胞をミエローマ細胞
または組換えミエローマ細胞と融合することにより得ら
れる融合細胞であることを特徴とする前記(3)に記載の
製造方法。 （５） 該哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特
徴とする前記(3)または前記(4)に記載の製造方法。 （６） 該哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする前
記(3)または前記(4)に記載の製造方法。 （７） 該哺乳動物が、ヒト抗体を産生する能力を有す
るトランスジェニック非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記(3)または前記(4)に記載の製造方法。 （８） 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が、ヒト免
疫グロブリン重鎖遺伝子であることを特徴とする前記
(1)乃至前記(4)、前記(6)または前記(7)のいずれかに記
載の製造方法。 （９） 該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ヒト免
疫グロブリン軽鎖遺伝子であることを特徴とする前記
(1)乃至前記(4)、前記(6)または前記(7)のいずれかに記
載の製造方法。 （10） 該モノクローナル抗体が、非ヒト哺乳動物のモ
ノクローナル抗体であることを特徴とする前記(1)乃至
前記(5)のいずれかに記載の製造方法。 （11） 該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル
抗体であることを特徴とする前記(1)乃至前記(4)、前記
(6)または前記(7)のいずれかに記載の製造方法。 （12） 該外来性ＤＮＡが、さらに遺伝子増幅遺伝子を
含むことを特徴とする前記(1)乃至前記(11)のいずれか
に記載の製造方法。 （13） 該遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（DHFR）遺伝子であることを特徴とする前記(12)に
記載の製造方法。 （14） 前記(1)乃至前記(13)のいずれかの方法により
製造される形質転換細胞。

【００１７】以下、本発明で用いる語句の意味及び本発
明の具体的態様を明らかにすることにより本発明をさら
に詳細に説明する。

【００１８】本発明において「哺乳動物」とは、ヒト、
ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスタ
ー、モルモット、及びマウスなどの哺乳動物を意味し、
さらに後述する「ヒト抗体を産生する能力を有するトラ
ンスジェニック非ヒト哺乳動物」も包含する。本発明に
おいて「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を
意味し、具体的には、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサ
ギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなど
の哺乳動物を意味し、さらに後述する「ヒト抗体を産生
する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」
も包含する。

【００１９】本発明において「抗原」とは、上記に哺乳
動物の生体における免疫担当細胞が、非自己と認識する
任意の物質を意味し、該生体にとって外来である外来性
抗原及び該生体が自己抗体を産生し得る該生体の任意の
内因性物質を包含する。該外来性抗原としては、例え
ば、種々のウイルス、細菌、細菌毒素及び化学物質が挙
げられ、また、該生体が、特定の哺乳動物である場合に
は、該生体と異なる個体あるいは異なる動物種に由来す
る任意の物質（例えば、組織、細胞、蛋白質、それらの
断片、体液など）が包含される。内因性物質としては、
場合によっては該生体中で過剰に産生される種々のサイ
トカイン、成長因子、ホルモン、細胞表面分子（例え
ば、受容体、チャンネル分子、シグナル伝達分子な
ど）、自己反応性リンパ球などが挙げられる。

【００２０】本発明において「モノクローナル抗体」と
は、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル
抗体である。該「モノクローナル抗体」は、前記の抗原
を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいは
ウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、後
述する遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノ
クローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト型モノクローナ
ル抗体（ヒト型抗体；CDR-grafted抗体）、並びにヒト
抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得
るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含する。ま
た、ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを
有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、
ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）またはＩｇＭである。

【００２１】本発明における「モノクローナル抗体を分
泌する細胞」とは、再配列（rearranged）された内在性
（endogenous）免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列さ
れた内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有し、該内在性
免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン重
鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子
に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなる
モノクローナル抗体を分泌する任意の細胞である。好ま
しくは、下記に詳述される任意の「モノクローナル産生
不死化Ｂ細胞」であり、より好ましくはモノクローナル
抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞などと細胞融合して得
られるハイブリドーマである。

【００２２】本発明における「モノクローナル抗体産生
不死化Ｂ細胞」とは、上述の哺乳動物の生体が抗原によ
り免疫感作されることにより該生体中に生ずる該抗原に
対するモノクローナル抗体を産生するＢ細胞、並びに該
Ｂ細胞を所望の方法によって不死化することにより製造
される不死化Ｂ細胞を意味する。この「モノクローナル
抗体産生Ｂ細胞」及び「モノクローナル抗体産生不死化
Ｂ細胞」は、既存の一般的な製造方法によって製造する
ことができる。即ち、例えば、抗原を、必要に応じてフ
ロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）ととも
に、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスタ
ー、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウ
マ、ウシあるいは後述のヒト抗体産生トランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物のような他の動物由来の抗体を産生す
るように作出されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物
に免疫する。免疫は、該哺乳動物の皮下内、筋肉内、静
脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射
するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通
常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を
行って、さらに必要に応じ、モノクローナル抗体産生細
胞の採取の前日または前々日にも免疫を行う。

【００２３】前述の如く免疫感作された哺乳動物から常
法に従って、脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好
ましくは脾臓から、抗体産生細胞であるＢ細胞を回収す
る。この抗体産生Ｂ細胞を、ケーラー及びミルシュタイ
ンらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)及び
それに準じる修飾方法に従って、好ましくはマウス、ラ
ット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の
哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由
来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合
させて不死化してハイブリドーマとすることにより抗体
産生不死化Ｂ細胞を得る。細胞融合に用いられるミエロ
ーマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63
-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1
（NS-1）、NSO、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14
（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0、BW5147、ラット由来ミエロ
ーマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、G
M1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM
-T15を使用することができる。

【００２４】上述のようにして作製されたモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ（モノクローナル抗体
産生不死化Ｂ細胞）のスクリーニングは、ハイブリドー
マを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増
殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作
で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばRIAやELISA
等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なう
ことができる。

【００２５】本発明における「ヒト抗体」あるいは「ヒ
ト免疫グロブリン」とは、前述した免疫グロブリンを構
成するＨ鎖の可変領域（V_H）及びＨ鎖の定常領域（C_H）
並びにＬ鎖の可変領域（V_L）及びＬ鎖の定常領域（C_L）
を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする
遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれ
ば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽
鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものであ
る抗体を意味する。ヒト抗体は、常法に従って、例え
ば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等
のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより
作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作
することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法
と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体
を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Nature
Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Nature Genetic
s, Vol.7, p.13-21, 1994; 表平4-504365号公報；国際
出願公開WO94/25585号公報；日経サイエンス、６月号、
第４０〜第５０頁、１９９５年；Nature, Vol.368, p.8
56-859, 1994; 及び特表平6-500233号公報）に記載の方
法に従って作製することができる。

【００２６】本発明のモノクローナル抗体の製造方法
は、下記工程（ａ）及び（ｂ）の工程からなる。 （ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及
び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有
し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫
グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリ
ン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチ
ドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該
免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
を導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転
換細胞を得る工程。 （ｂ）該形質転換細胞を培養し、細胞培養液中に分泌さ
れた該モノクローナル抗体を取得する工程。

【００２７】ここで「免疫グロブリン重鎖ポリペプチド
のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝
子」とは、前述したモノクローナル抗体を産生する細胞
（好ましくは、抗体産生Ｂ細胞、抗体産生不死化Ｂ細胞
（ハイブリドーマなど））が有する内在性免疫グロブリ
ン重鎖遺伝子によりコードされる免疫グロブリン重鎖ポ
リペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子（好ましくはcDNA）であり、該cDNAは、既
知の細胞工学技術及び遺伝子組換え技術を用いて常法に
従って下記のようにして調製することができる。

【００２８】（１）所望のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマから、市販の試薬（例えば、FastTrac
k2.0kit(INVITROGEN製）など）を用いて常法に従ってPo
lyA⁺RNAの抽出、精製する。具体的には、例えば、下記
のとおりである。凍結して保存しておいたハイブリドー
マを、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、市販
の細胞溶解試薬（例えば、POLYTRONなど）により細胞を
破壊し、可溶化する。該可溶化物を適切な温度（例え
ば、約45℃）でインキュベーションした後、Oligo(dT)
celluloseを加え適切な時間（例えば、約1時間）緩やか
に振盪する。次いで、Oligo(dT) celluloseを洗浄後、P
olyA⁺RNA をEllution Bufferで溶出させる。溶出したPo
lyA⁺RNAをエタノール沈殿させ、適切量のTris-EDTA緩衝
液に溶解する。得られたPolyA⁺RNAの濃度を、適切な波
長（例えば、260nm）での吸光度を測定することにより
決定する。

【００２９】（２）得られたPolyA⁺RNAを鋳型とし、市
販の試薬（例えば、Marathon cDNA Amplification Kit
（CLONTECH製）など）を用いてRACE-PCR法により常法に
よりcDNAを合成する（「遺伝子増幅PCR法・基礎と新し
い展開」、1992年第２刷、共立出版株式会社発行、p.13
-15）。具体的には下記のとおりである、適切量の精製P
olyA⁺RNA（例えば約1乃至5μg）を鋳型として、1st str
and cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成する。該ｃDNA
を、フェノール／クロロホルム／イソアミノアルコール
並びにクロロホルムを用いて抽出に供する。次いで、cD
NAをエタノール沈殿させ、アダプターDNAに連結する。
得られたDNA反応物を適切な濃度に希釈（例えば、1/25
0）したものを鋳型とし、該ハイブリドーマが産生する
モノクローナル抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列を
コードする塩基配列を基に設計したプライマー及び該ア
ダプターＤＮＡの塩基配列を基に設計したプライマーを
用いて、常法によりPCRを行う。得られたPCR産物をアガ
ロースゲル電気泳動で分画し、cDNAを回収する。

【００３０】（３）得られた該モノクローナル抗体の重
鎖の全長あるいは一部のアミノ酸配列をコードするcDNA
の塩基配列を市販の試薬（例えば、Dye Terminator Cyc
le Sequence Kit（PE-Applied Biosystems製）、及びPR
ISM377 DNA Sequencer（PE-Applied Biosystems製））
を用いて決定する。 （４）該モノクローナル抗体の重鎖の一部のアミノ酸配
列をコードするcDNAの塩基配列を基に、PCRにより該重
鎖ポリペプチドのアミノ酸配列の全長をコードするcDNA
が可能なように一対のプライマーDNAを合成し、該一対
のプライマーを用いて、前記の精製PolyA⁺RNAを鋳型と
して前記と同様にPCRを行し、該重鎖ポリペプチドの全
長をコードするcDNAを得る。

【００３１】本発明のモノクローナル抗体の製造方法
は、上記で詳述した「免疫グロブリン重鎖ポリペプチド
のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝
子」を、該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドからなるモ
ノクローナル抗体を分泌する細胞（好ましくは該遺伝子
の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ自体、即ち、上述のモノクローナル抗体産
生Ｂ細胞あるいは不死化Ｂ細胞と同義）に、常法に従っ
て遺伝子工学技術を用いて導入し、該遺伝子により形質
転換された形質転換細胞を選別、単離し、該形質転換細
胞を培養することにより細胞培養液中から該モノクロー
ナル抗体を精製、取得することからなる。

【００３２】該細胞への該遺伝子（例えば、cDNA）の導
入は、該遺伝子を常法に従って該遺伝子が宿主細胞中で
発現可能なようにプラスミドベクター組み込み発現ベク
ターを作製し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換す
ることにより行う。プラスミドにcDNAを組み込む方法と
しては、例えばManiatisらの方法（Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring
Harbor Laboratory, p.1.53, 1989）に記載の方法など
が挙げられる。プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco
nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.1.7
4, 1989）に記載の塩化カルシウム法または塩化 カルシ
ウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等
が挙げられる。

【００３３】本発明で使用されるベクターとしては、宿
主細胞（好ましくは真核細胞）内で複製保持または自己
増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベ
クターおよびファージベクターが包含される。具体的に
は、プラスミドとしては例えば、pLS407、pBR322、pBR3
25、pUC12、pUC13、pUC19、pSH19、pSH15、pUB110、pTP
5、pC194、pcD2、pBSV、CMD、pSV2、さらにpMAL C2、pE
F-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid
Research）、第１８巻、第５３２２頁、１９９０年等）
あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブッ
ク」、１９９２年等）等などが例示される。また、ファ
ージとしては、λファージなどのバクテリオファージ
が、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多
角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、
インビトロゲン製）が例示される。

【００３４】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、並びに上述の所望の免
疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子、終止
コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構
成される。宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を
用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、
開始コドン、上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH
鎖）をコードする遺伝子、終止コドンを含んでいること
が好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ、エンハンサー配列、上述の所望の免疫グロブリン重
鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子をコードする遺伝子の
５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域また
は複製可能単位などを含んでいてもよい。さらに、目的
に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子を含んでいて
もよい。

【００３５】哺乳動物細胞等の真核細胞で上述の所望の
免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発
現させるためのプロモーターとしては、例えば、ニワト
リ由来のβアクチンプロモーター、SV40由来のプロモー
ター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショック
プロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ニワトリ
由来のβアクチンプロモーター、SV40由来のプロモータ
ー、SV40、レトロウイルスのプロモーターである。しか
しながら、特にこれらに限定されるものではない。ま
た、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
り、好ましいエンハンサーとしてはCMVエンハンサーが
挙げられる。細菌中で上述の所望の免疫グロブリン重鎖
（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現させるためのプロ
モーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレ
ーター及びShine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、AAGGな
ど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌
の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、
recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモータ
ー、tacプロモーターなどを含むものが例示される。酵
母中で上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコ
ードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとして
は、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモー
ター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属
菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、pe
nPプロモーターなどが挙げられる。

【００３６】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ATG）が例示される。終止コドンとしては、常用
の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示され
る。ターミネーター領域としては、通常用いられる天然
または合成のターミネーターを用いることができる。

【００３７】複製可能単位とは、宿主細胞中でその全Ｄ
ＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言
い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド
（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメン
ト）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラス
ミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、
もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限
酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母
では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡ
が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 371
98、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV
-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149等
があげられる。

【００３８】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使
用されるものを用いることができる。上述の発現ベクタ
ーの作製は、上述のプロモーター、開始コドン、上述の
IgH鎖をコードする遺伝子及び／またはターミネーター
領域などを連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結
することによって調製することができる。またこの際、
所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いる
ライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメン
ト（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を
用いることができる。

【００３９】上述の発現ベクターで形質転換された宿主
細胞、即ち形質転換細胞の選別は、該発現ベクターに所
望の選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子など）を挿
入しておき、該形質転換細胞を、該薬剤の存在下で培養
することにより可能である。選択マーカーとしては、通
常使用されるものを常法により用いることができる。例
えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイ
シン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。

【００４０】上述の本発明のモノクローナル抗体の製造
方法には、上記発現ベクターに挿入された上述した所望
のモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチドをコードする
遺伝子とともに、遺伝子増幅遺伝子を挿入しておくこと
により、該重鎖ポリペプチドをコードする遺伝子のコピ
ー数を増幅させることにより、該形質転換細胞による所
望のモノクローナル抗体の産生効率をさらに増大させる
態様も本発明の態様として包含する。

【００４１】本発明において使用され得る遺伝子増幅遺
伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝
子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、グルタミン酸合成酵素（GS）遺伝子、アデノシンデ
アミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝
子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等
を例示することができる。好ましくは、DHFR遺伝子また
はGS遺伝子である。

【００４２】本発明のモノクローナル抗体の製造方法に
おいて、上記で詳述した「免疫グロブリン重鎖ポリペプ
チドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする
遺伝子」により形質転換される細胞（宿主細胞）は、即
ち、「該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドからなるモノ
クローナル抗体を分泌する細胞」であれば、いかなる細
胞でも良いが、特に好ましくは該遺伝子の調製において
ソースとしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ自
体（即ち、上述のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞あるい
は不死化Ｂ細胞と同義）である。

【００４３】当該ハイブリドーマ以外の宿主細胞の例と
しては、当該所望のモノクローナル抗体を産生する限
り、天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など
種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチル
ス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属な
ど）、動物細胞または昆虫細胞などのいずれをも包含す
る。当該所望のモノクローナル抗体を産生する細胞であ
れば、当該細胞の起源が、例えば、大腸菌（DH5α、TB
1、HB101等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2/
0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞（PC12,PC12
h)、ハムスター由来細胞（BHK及びCHO等）、サル由来細
胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由
来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエ
ローマ細胞およびHepG2等）などのいずれであっても良
い。

【００４４】上述した該所望の免疫グロブリンの重鎖を
コードする遺伝子が挿入された発現ベクターの宿主細胞
への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を
用いて行うことができる。例えば、動物細胞の場合は、
例えばGrahamの方法（Virology, Vol.52, p.456,1973）
に従って、細菌（E.coli、Bacillus subtilis 等）の場
合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., Vol.69, p.2110, 1972）、プロトプラスト法（Mo
l. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979）やコンピテン
ト法（J.Mol. Biol., Vol.56, p.209, 1971）によっ
て、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnen
らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1
927,1978）やリチウム法（J. Bacteriol., Vol.153, p.
163, 1983）によって、昆虫細胞の場合は、例えばSumme
rsらの方法（Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165,
1983）によってそれぞれ形質転換することができる。

【００４５】上述した本発明のモノクローナル抗体の製
造方法における「形質転換細胞」であって、上述の所望
の免疫グロブリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換
された形質転換細胞の培養は常法によって下記のように
行うことができる。当該培養により、細胞培養液中から
所望モノクローナル抗体を得ることができる。

【００４６】該所望の免疫グロブリンの重鎖をコードす
る遺伝子で形質転換される細胞が、該遺伝子の調製にお
いてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ自体（上述のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞あるいは
不死化Ｂ細胞と同義）であり、即ち、得られる形質転換
細胞が、組換えハイブリドーマである場合には、通常の
ハイブリドーマの一般的な培養方法と同様にして行うこ
とができる。

【００４７】具体的には、該組換えハイブリドーマを、
インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハム
スターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラッ
ト、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行
い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離
することにより行うことができる。インビトロで培養す
る場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及
び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを
増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル
抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地
あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄
養培地を用いて実施することが可能である。

【００４８】基本培地としては、例えば、Ham'F12培
地、MCDB153培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の
低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培
地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カ
ルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じ
て、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または
種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。

【００４９】該組換えハイブリドーマからのモノクロー
ナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水
を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カ
プロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラ
フィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラ
ムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラム
クロマトグラフィーに供すること等により行うことがで
きる。

【００５０】一方、該所望の免疫グロブリンの重鎖をコ
ードする遺伝子で形質転換される細胞が、上述した組換
え蛋白の製造において一般的に使用される例えば、ＣＨ
Ｏ細胞などの宿主細胞である場合には、組換え蛋白の製
造における一般的な培養方法と同様にして行うことがで
きる。

【００５１】即ち、該形質転換細胞を栄養培地で培養す
ることによって製造することができる。栄養培地は、宿
主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素
源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素
源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性
デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素
源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミ
ノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示され
る。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例え
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイ
クリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン
等）など）を含んでいてもよい。培養は当業界において
知られている方法により行われる。培養条件、例えば温
度、培地のｐＨおよび培養時間は、該形質転換細胞から
本発明の所望のモノクローナル抗体が大量に生産される
ように適宜選択される。

【００５２】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれら
に限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵
母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液
体培地が適当である。好ましくは、pHが５〜８である培
地である。宿主がE. coliの場合、好ましい培地としてL
B培地、M9培地（Millerら、 Exp.Mol. Genet、Cold Spr
ing Harbor Laboratory, p.431, 1972）等が例示され
る。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しなが
ら、通常14〜43℃、約３〜24時間行うことができる。宿
主がBacillus属菌の場合、必要により通気、撹拌をしな
がら、通常30〜40℃、約16〜96時間行うことができる。

【００５３】宿主が酵母である場合、培地として、例え
ばBurkholder最小培（Bostian, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙げられ、pHは５〜
８であることが望ましい。培養は通常約20〜35℃で約14
〜144時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこと
もできる。宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約
５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, Vol.12
2, p.501, 1952）、 DMEM培地（Virology, Vol.8, p.39
6, 1959）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.1
99, p.519, 1967）、199培地（proc. Soc. Exp. Biol.
Med., Vol.73, p.1, 1950）等を用いることができる。
培地のpHは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約
30〜40℃で約15〜72時間行なわれ、必要により通気や撹
拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば
胎児牛血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA, Vol.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、そのpH
は約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約20〜40℃
で15〜100時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行う
こともできる。本発明における所望のモノクローナル抗
体は、そのようにして培養された形質転換細胞の培養上
清中から上述したモノクローナル抗体の一般的な精製方
法により得ることができる。

【００５４】

【実施例】以下、実施例を以って本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに
限定されるものではないことは言うまでもない。

【００５５】実施例１ モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマの調製 既報に記載されるヒトIL-8に対するヒトモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを以下の試験において用
いた（Nature genetics Vol.15, p.146-156, 1997、及
び国際特許出願公開WO96/33735号公報）。なお、該ハイ
ブリドーマは、下記のように製造された。マウスの重鎖
及び軽鎖の各々の内在性遺伝子座を不活性化し、且つヒ
ト免疫グロブリンの重鎖（Cμ及びCγ₂）及び軽鎖
（κ）の各々遺伝子座を含むDNAをマウスの内在性ゲノ
ムに組み込むことにより作製したヒトIgG₂/κモノクロ
ーナル抗体を産生する既報のトランスジェニックマウス
を被免疫動物として用いた(Nature Genetics, Vol.15,
p.146-156, 1997; Nature Genetics, Vol.7, p.13-21,
1994; 表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号
公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１
９９５年；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 及び特
表平6-500233号公報）。

【００５６】該ヒトIgG₂/κ抗体産生トランスジェニッ
クマウス（8乃至10週齢）に、組換えヒトIL-8（25μg）
を完全フロインドアジュバントとともに腹腔内投与して
初回免疫した。初回免疫から2週間毎に、該IL-8を不完
全フロインドアジュバントとともに追加免疫（3回）
し、以下の細胞融合の4日前に最終免疫した。最終免疫
の後、該被免疫マウスの脾臓及びリンパ節を採取してリ
ンパ球（抗体産生Ｂリンパ球を含む）を回収した。該抗
体産生リンパ球を、常法に従って、いずれの自己抗体を
も産生しないマウスミエローマ細胞（NSO-bsl2細胞株）
と細胞融合した。細胞融合により得られるハイブリドー
マを常法に従ってHAT選択法により選別した。得られた
ハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体のヒ
トIL-8に対する反応性の有無を、常法に従ってELISAに
より測定し、抗ヒトIL-8ヒトモノクローナル抗体を産生
する複数のハイブリドーマを得た。各々のハイブリドー
マは凍結保存された。

【００５７】実施例２ モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマからの内在性IgH遺伝子の単離 上記のようにして調製した抗ヒトIL-8ヒトIgG₂/κモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ（クローン：K2.2.
1）の凍結細胞を、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に
溶解し、POLYTRONにより細胞を破壊し、可溶化させた。
次いで、該細胞可溶化物から、市販のRNA抽出キット（F
astTrack2.0kit(INVITROGEN製））を用いてPolyA⁺RNAを
抽出、精製した。該細胞可溶化物を45℃でインキュベー
ションした後、Oligo(dT) celluloseを加え約1時間緩や
かに振盪した。次いで、Oligo(dT) celluloseを洗浄
後、PolyA⁺RNA をEllution Bufferで溶出させた。溶出
したPolyA⁺RNAをエタノール沈殿させ、Tris-EDTA緩衝液
に溶解した。得られたPolyA⁺RNAの濃度を、260nmの波長
での吸光度を測定することにより決定した。

【００５８】得られたPolyA⁺RNAを鋳型とし、市販のMar
athon cDNA Amplification Kit（CLONTECH製）を用いた
RACE-PCR法により常法によりcDNAを合成した（「遺伝子
増幅PCR法・基礎と新しい展開」、1992年第２刷、共立
出版株式会社発行、p.13-15）。即ち、該ハイブリドー
マから精製したPolyA⁺RNA（1乃至5μg）を鋳型として、
1st strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成した。
該ｃDNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミノア
ルコール並びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ抽出
に供した。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、該キッ
トに付属のアダプターDNAに連結させた。得られたDNA反
応物の希釈物を鋳型とし、合成プライマーを用いて常法
により5'RACE-PCRを行い内在性免疫グロブリン重鎖ポリ
ペプチドの一部をコードするcDNAを調製した。該PCRに
は免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を基に設計したプライマーHG2-3-437（配
列番号３）及び該アダプターDNAの塩基配列を基に設計
したプライマーを用いた。

【００５９】PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分画
し、DNAを回収した。得られたcDNAの塩基配列の決定
を、市販のDyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit（P
E-Applied Biosystems製）及びPRISM377 DNA Sequencer
（PE-Applied Biosystems製）を用いて行った。なお、
本配列決定のためのSequencing Primerは、前述のPCRに
おいて使用したプライマーを使用した。決定した該免疫
グロブリンの重鎖ポリペプチドの一部をコードするcDNA
の塩基配列（翻訳開始点の付近の塩基配列を含む）を基
に、一対のプライマーVH4-21（配列番号４）及びCG2-1
（配列番号５）を合成した。この一対のプライマーを用
いて、上述と同様にしてさらにPCRを行った。得られたP
CR産物から上述と同様にして得たcDNAの塩基配列を上述
と同様にして決定し、該ハイブリドーマK2.2.1が産生す
る抗ヒトIL-8ヒトモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチ
ド（IgH）の全長をコードするcDNAを得た（塩基配列：
配列番号１、及びアミノ酸配列配列番号２）。

【００６０】実施例３ ハイブリドーマK2.2.1へのIgH
cDNAの導入、及び組換えハイブリドーマによるモノクロ
ーナル抗体の製造 前記で得たハイブリドーマK2.2.1が分泌する抗ヒトIL-8
ヒトモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチド（IgH）の
全長をコードするcDNA（配列番号１）を、常法に従って
DNAリガーゼを用いて、CMVエンハンサー／ニワトリBア
クチンプロモーター及びDHFR遺伝子を保持するプラスミ
ドpLS407のEcoRI制限酵素部位に挿入、連結し、発現ベ
クターpDH502を作製した（図１）。該DHFR遺伝子は、マ
ーカー遺伝子であると同時に遺伝子増幅遺伝子であり、
該遺伝子の存在により該発現ベクターによる形質転換細
胞の選別は、該細胞をメソトレキセイト（MTX）存在下
で培養することにより可能となる。該IgH遺伝子発現ベ
クターpDH502を、エレクトロポレーションによりハイブ
リドーマK2.2.1に導入した。次いで、該ハイブリドーマ
を、選択培地（IMDM (JRHBIOSCUENCE)；10%FBS及び300m
M MTXを含有）中で培養し、生育した約100個の形質転換
体（組換えハイブリドーマ）を選別、取得した。該選別
した各々の組換えハイブリドーマを、96ウェルマイクロ
プレート中で培養した。

【００６１】各ウェル中で培養されている各々の形質転
換体（組換えハイブリドーマ）の培養上清中に産生され
るヒトモノクローナル抗体（IgG₂）の量を常法に従っ
て、サンドイッチELISAにより測定した。なお、固相抗
体（一次抗体）として抗ヒトIgG(Fc)（Organon Teknika
製）を、検出抗体（二次抗体）として西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（HRP）で標識した抗ヒトIgκ抗体（PROTOS
IMMUNORESEARCH製）を用いた。また、対照標準品として
ヒトIgG/κ（The Binding Site）を用いた。結果を図２
に示す。その結果、親株ハイブリドーマであるK2.2.1の
ほとんどのクローンのモノクローナル抗体の産生量が極
めて低い値であるのに対し、組換えハイブリドーマのほ
とんどのクローンにおいて、有意なモノクローナル抗体
の産生量の増大が認められた。また、該組換えハイブリ
ドーマのいくつかのクローンのモノクローナル抗体の産
生量を表１に示す。

【００６２】

【表１】

【００６３】次に、組換えハイブリドーマクローンの中
で、特に高濃度のモノクローナル抗体の産生を示したク
ローン（クローンNo.12、15、41、89）を、限界希釈法
によりサブクローニングしてサブクローンド（sub-clon
ed）組換えハイブリドーマを得た（クローンNo.12-6、1
5-4、15-12、41-2、及び89-5）。各々のsub-cloned組換
えハイブリドーマのモノクローナル抗体の産生量を、上
述と同様のELISAにより測定した。結果を表２（上段）
に示す。

【００６４】

【表２】

【００６５】その結果、各々のsub-cloned組換えハイブ
リドーマのモノクローナル抗体の産生量は、親組換えハ
イブリドーマのそれに比べ有意に高い値であった。例え
ば、親組換えハイブリドーマ（No.15）の抗体産生量
は、約37.3μg/mlであったのに対し、該親株からサブク
ローニングした組換えハイブリドーマ（No.15-4）の抗
体産生量は、約95.3μg/mlに増大した。

【００６６】実施例４ 遺伝子増幅を施した組換えハイ
ブリドーマからのモノクローナル抗体の製造 DHFR遺伝子によるIgH遺伝子の増幅のモノクローナル抗
体の産生効率上昇に対する効果の有無を検討した。前記
で作製したsub-cloned組換えハイブリドーマ（クローン
No.12-6、15-4、15-12、41-2、及び89-5）の各々を、
１、２または５μMのメトトレキセート（MTX）を含む栄
養培地中でさらに培養してMTX耐性細胞株を選択、取得
した。各々のsub-cloned組換えハイブリドーマから、下
記MTX耐性細胞株を取得した。 ＜クローンNo.12-6＞ クローンNo.12-5μ-96-8 ＜クローンNo.15-4＞ クローンNo.15-1μ-82-1 ＜クローンNo.15-12＞ クローンNo.15-1μ-87-4 ＜クローンNo.41-2＞ クローンNo.41-2μ-75-4 ＜クローンNo.89-5＞ クローンNo.89-2μ-2-5、及び
89-2μ-33-12 各々のMTX耐性組換えハイブリドーマクローンのモノク
ローナル抗体の産生量を、前記と同様のサンドイッチEL
ISAにより測定した。結果を前記表２（下段）に示し
た。その結果、MTX選択した各々の組換えハイブリドー
マの１細胞数当りのモノクローナル抗体の産生効率は、
MTX選択する前（DHFRによる遺伝子増幅前）のそれに比
べ低いものの、IgH遺伝子で形質転換する前の野生型親
ハイブリドーマK2.2.1のモノクローナル抗体の産生量が
極めて低い（図２）ことを考慮すると、該MTX選択した
組換えハイブリドーマのモノクローナル抗体の産生効率
は、該野生型親ハイブリドーマのそれに比べ有意に増大
していた。

【００６７】

【発明の効果】以上述べたように、本発明の方法を用い
れば、医薬品として有用なモノクローナル抗体の製造に
おいて、モノクローナル抗体産生細胞によるモノクロー
ナル抗体の産生量を簡便に有意に増大させることが可能
となる。特に、モノクローナル抗体の製造において一般
的に用いられるモノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞
（ハイブリドーマ）のモノクローナル抗体の産生効率
が、内在性IgH遺伝子の発現の不安定さまたは低発現性
に依存して低い場合には、本発明の方法を用いることに
より該親ハイブリドーマのモノクローナル抗体の分泌量
を有意に増大させることが可能である。従って、本発明
のモノクローナル抗体の製造方法及び該方法により得ら
れるモノクローナル抗体産生形質転換細胞（組換え細
胞）は、抗体医薬品の製造において極めて有用な手段で
ある。

【００６８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco Inc <120> A Process To Produce Monoclonal Antibody <130> J1-A0001Y1 <140> <141> <150> JP11-087929 <151> 1999-03-30 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1507 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (12)..(1400) <400> 1 gaattcggct t atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctc ctg gtg gca gct 50 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtt cag cta cag cag tgg ggc gca gga 98 Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly 15 20 25 ctg ttg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt 146 Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly 30 35 40 45 ggg tcc ttc agt ggt tac tac tgg acc tgg atc cgc cag ccc cca ggg 194 Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly 50 55 60 aag ggg ctg gag tgg att ggg gaa atc att cat cat gga aac acc aac 242 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ile His His Gly Asn Thr Asn 65 70 75 tac aac ccg tcc ctc aag agt cga gtc tcc ata tca gtt gac acg tcc 290 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser 80 85 90 aag aac cag ttc tcc ctg aca ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg 338 Lys Asn Gln Phe Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 95 100 105 gct gtg tat tac tgt gcg aga ggg gga gca gtg gct gcg ttt gac tac 386 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ala Val Ala Ala Phe Asp Tyr 110 115 120 125 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc 434 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc 482 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg 530 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 160 165 170acg gtg tcg tgg aac t
ca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc 578 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 175 180 185 cca gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg 626 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 190 195 200 205 acc gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta 674 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa 722 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg 770 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 240 245 250 tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc 818 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 255 260 265 cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac 866 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 270 275 280 285 ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 914 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg 962 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag 1010 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 320 325 330 tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 1058 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 335 340 345 acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc 1106 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 350 355 360 365 ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1154 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1202 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg 1250 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 400 405 410 gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag 1298 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 415 420 425 agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1346 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 430 435 440 445 gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt 1394 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 aaa tga gtgccacggc cggcaagccc ccgctcccca ggctctcggg gtcgcgtgag 1450 Lys gatgcttggc acgtaccccg tgtacatact tcccaggcac ccagcaaagc cgaattc 1507 <210> 2 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ile His His Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ala Val Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, HG2-3-437 <400> 3 gtgtaggtct gggtgccgaa gtt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, VH4-21 <400> 4 atgaaacacc tgtggttctt cct 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, CG2-1 <400> 5 gctgggtgcc tgggaagtat gta 23

【００６９】「配列表フリーテキスト」 配列番号：３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列HG2-3-437。 配列番号：４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列VH4-21。 配列番号：５ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列CG2-1。

【００７０】

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターpDH502の構造及び制限酵素地図を
模式的に示す図。

【図２】組換えハイブリドーマによる抗ヒトIL-8モノク
ローナル抗体の産生量を示す図。縦軸は、モノクローナ
ル抗体の産生量を示し、横軸はマイクロプレート中の各
ウェルの各組換えハイブリドーマクローンの種類を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 16/18 15/00 Ｃ (72)発明者 福嶋 淳 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−２ 日 本たばこ産業株式会社医薬探索研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA41 BA56 CA04 DA02 DA06 DA07 DA12 EA04 FA02 FA06 FA10 FA13 GA03 GA14 GA18 4B064 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA92X AA99X AB01 AB05 AC10 AC14 AC20 BA03 BA08 CA25 CA44 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モノクローナル抗体の製造方法であっ
   て、下記工程： （ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及
   び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有
   し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫
   グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリ
   ン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチ
   ドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該
   免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一
   のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
   を導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転
   換細胞を得る工程；及び（ｂ）該形質転換細胞を培養
   し、細胞培養液中に分泌された該モノクローナル抗体を
   取得する工程、からなることを特徴とするモノクローナ
   ル抗体の製造方法。
2. 【請求項２】 該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのア
   ミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子と同一の塩基配
   列を有する遺伝子であることを特徴とする請求項１に記
   載の製造方法。
3. 【請求項３】 該細胞が、哺乳動物のＢ細胞に由来する
   不死化Ｂ細胞であることを特徴とする請求項１または請
   求項２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 該不死化Ｂ細胞が、該Ｂ細胞をミエロー
   マ細胞または組換えミエローマ細胞と融合することによ
   り得られる融合細胞であることを特徴とする請求項３に
   記載の製造方法。
5. 【請求項５】 該哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であるこ
   とを特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方
   法。
6. 【請求項６】 該哺乳動物が、ヒトであることを特徴と
   する請求項３または請求項４に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 該哺乳動物が、ヒト抗体を産生する能力
   を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であること
   を特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方
   法。
8. 【請求項８】 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が、
   ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子であることを特徴とする
   請求項１乃至請求項４、請求項６または請求項７のいず
   れかに記載の製造方法。
9. 【請求項９】 該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、
   ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子であることを特徴とする
   請求項１乃至請求項４、請求項６または請求項７のいず
   れかに記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 該モノクローナル抗体が、非ヒト哺乳
    動物のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求
    項１乃至請求項５のいずれかに記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 該モノクローナル抗体が、ヒトモノク
    ローナル抗体であることを特徴とする請求項１乃至請求
    項４、請求項６または請求項７のいずれかに記載の製造
    方法。
12. 【請求項１２】 該外来性ＤＮＡが、さらに遺伝子増幅
    遺伝子を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項１１
    のいずれかに記載の製造方法。
13. 【請求項１３】 該遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸
    レダクターゼ（DHFR）遺伝子であることを特徴とする請
    求項１２に記載の製造方法。
14. 【請求項１４】 請求項１乃至請求項１３のいずれかの
    方法により製造される形質転換細胞。