HU230406B1 - Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására - Google Patents
Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására Download PDFInfo
- Publication number
- HU230406B1 HU230406B1 HU1500180A HUP1500180A HU230406B1 HU 230406 B1 HU230406 B1 HU 230406B1 HU 1500180 A HU1500180 A HU 1500180A HU P1500180 A HUP1500180 A HU P1500180A HU 230406 B1 HU230406 B1 HU 230406B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- aav
- sequence
- sequences
- seq
- capsid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 122
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 195
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 80
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 64
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 58
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 57
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 44
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 2
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims 1
- 230000003109 amnesic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 195
- 241001595741 Adeno-Associated Virus rh.8 Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 138
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 122
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 47
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 47
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 38
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 38
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 30
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 29
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 23
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 16
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 15
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 12
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 8
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 7
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 6
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- -1 paraphenes Chemical compound 0.000 description 5
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 3
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 3
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 3
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 3
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 101150017692 cnp gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 2
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 101100457884 Macaca mulatta MLN gene Proteins 0.000 description 2
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 description 2
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 2
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 2
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241000353355 Oreosoma atlanticum Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 201000003042 peeling skin syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JVJUWEFOGFCHKR-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl 1-(3,4-dimethylphenyl)cyclopentane-1-carboxylate;hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C(C)C(C)=CC=1C1(C(=O)OCCN(CC)CC)CCCC1 JVJUWEFOGFCHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- BFTGQIQVUVTBJU-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]dithiazole-3-thione Chemical compound C1CN2C(=S)SSC2=N1 BFTGQIQVUVTBJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101150079978 AGRN gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000425548 Adeno-associated virus 3A Species 0.000 description 1
- 241000958487 Adeno-associated virus 3B Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100040026 Agrin Human genes 0.000 description 1
- 108700019743 Agrin Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000004881 Amebiasis Diseases 0.000 description 1
- 206010001980 Amoebiasis Diseases 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100004393 Arabidopsis thaliana BHLH148 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 239000004970 Chain extender Substances 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 244000037364 Cinnamomum aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000014489 Cinnamomum aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 108010065152 Coagulase Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 241000255749 Coccinellidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 1
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 101100468640 Danio rerio rhcgl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 108700023218 Deoxyhypusine synthases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 206010053025 Endemic syphilis Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 1
- 208000010228 Erectile Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 208000004729 Feline Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000701925 Feline parvovirus Species 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000006353 Filariasis Diseases 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001066288 Gallus gallus GATA-binding factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102100033295 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010018693 Granuloma inguinale Diseases 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101001064282 Homo sapiens Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000837845 Homo sapiens Transcription factor E3 Proteins 0.000 description 1
- 241000720945 Hosta Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 101150108210 IX gene Proteins 0.000 description 1
- 208000028547 Inborn Urea Cycle disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 241000283162 Inia geoffrensis Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282564 Macaca fuscata Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 101000603739 Naja sputatrix Venom nerve growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000010803 Netrins Human genes 0.000 description 1
- 108010063605 Netrins Proteins 0.000 description 1
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004341 Octafluorocyclobutane Substances 0.000 description 1
- 241000150218 Orthonairovirus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 description 1
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 102100030655 Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 description 1
- 101150097169 RBBP8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 208000006257 Rinderpest Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 102100028507 Transcription factor E3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 241000826860 Trapezium Species 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010065441 Venous haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000028227 Viral hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 206010061418 Zygomycosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 210000002534 adenoid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000080 chela (arthropods) Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 229940060038 chlorine Drugs 0.000 description 1
- 235000017168 chlorine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000027326 copulation Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 101150083513 cup gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- PWZFXELTLAQOKC-UHFFFAOYSA-A dialuminum;hexamagnesium;carbonate;hexadecahydroxide;tetrahydrate Chemical group O.O.O.O.[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Al+3].[Al+3].[O-]C([O-])=O PWZFXELTLAQOKC-UHFFFAOYSA-A 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000009365 direct transmission Effects 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003976 gap junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 201000006592 giardiasis Diseases 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011423 initialization method Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 201000004614 iritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010069264 keratinocyte CD44 Proteins 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 241000238565 lobster Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000007524 mucormycosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108010081726 netrin-2 Proteins 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 229940090668 parachlorophenol Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001152 parietal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N phentermine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)([NH3+])CC1=CC=CC=C1 NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150035468 phi gene Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150053759 rhcg gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000000698 schizophrenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N sodium oxide Chemical compound [O-2].[Na+].[Na+] KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001948 sodium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid group Chemical group C(CCC(=O)O)(=O)O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000724775 unclassified viruses Species 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 101150112970 up gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030954 urea cycle disease Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2750/14162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/90—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates avian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Description
Eljár-ás adeno-ítsszoebllt vírus (AAV) szekvenciák tortektálásdoa és/vngy azunosbásárs, és az azzal szsaosbott üj ssek.veneidk Izulslldsára
Az adeno-asszoeiált vírus (AAV) a Earvovlrusok csalúdjának a tagja, és egy kicsi, btsrokíaian 5 IkozahedtAhs vírus egyláneá üneárts DNS-gen.o?s?nal, amely 4,7-6 klíobázis (kbj hosszúságú. Az AAV-t a Dependovh-usok nemzetségébe sorolták be», mert a vírust tisztított adenovfeus tenyészetek szennyezőjeként fedezték fel. Az AAV életciklusa, tartalmaz egy látens szakaszt, amelyben az AAV gennmja a fertőzés után iselyspeoífikusan mtegrálődik a gazda kronío»zomnjnh<j, és tartalmaz egy fertőző szakaszt, amelybe® áz adsnovlí-ussal vagy ffernes súspfes vírussal tulo fertőzést követően az integrálódott gewm kiszabadul, rephkálódík és fertőző vírusokba psfeeiődik. Az AAV-t a nem paíogén, tág gazdasp<?eiStás — beleértve neesa osztódó sejteket is......és a potenciális heiyspecífíkss kosmeszómálls íxsfegrúcíó sdtóáonságek vonzó eszközzé teszik génátoitel céljára.
írtabb vizsgálatok azt sugallják, begy az AAV vektorok lehetnek :a génterápia előnyös hordozóeszközei. Mostanáig: az AAV 6 különböző szerotípnsát izolálták emberből vagy nem ember tbemlősökbői 8ΝΕΠ3), és jól jellemezték azokat.. Ezek között a 2-es humán szerotípns az első AAV, amelyet génátviteli vektornak kifejieszfettek; széles körbej?: alkalmaztak hatékony génátviteli kísérletekben különböző «díszövetekbe?? és állati modellekben. Az AAV2-alapú vektorok kísérleti alkalmazásának klinikai vizsgálatai bizonyos emberi beiogségmodeliekhoB folyamatban vannak, mim például olyan betegségek esetében, mint cisztús bbrozis és bemobha 3.
Amire igény van, azok tsz AAV-aiapú génhejutiafesi koaélrukctók,
Egy megvalósítási utód szerint a találmány tárgya üj eljárás AAV szekvenciák detektálására és azonosítására különféle feutuáu és nem-humán főemlős (NKP) szövetek celluláris DWfeból biőlnfonnatikai elemzés, PCK-alapú génampliSkáeiő és klőr?om>.i technológia aikaúnazásával, az AAV látenciájának a ter?nészete alapján ^egitóvirnssal való együttes fertőzés hiány ?ba??
Egy másfe megvaiósüást snod szerint >i tubhnanv íargva < fjajás új AAV szekvenciák deleittálására a fenti találmány szerűül eljárás alkaimazasávai A 'találmány tárgyát: képezik továbbá eljárások vektorok előállítására ezen áj AAV szerotipusok alapját:, szero lógsz és génátviteli vizsgálatok céljára, csapán a kapszidgéa szekvenciáinak és a repAmp kapcsolódási szakaszok szerkezete alapján.
Egv még további megvalósítási mód szedni a találmány tárgya uj eljárás szeroiőgíní, epldemielögfei, btodisztrtbúeiős és transzmissziós mód vizsgálatok végrehajtására, t&láimany szerinti reagensek alkalmazásával, amelyek: közé. tartoznak: lánclnditók/próbák generikus készletei és kvantitatív valósidejű PCR.
Egy még másik megvalósítási mód szerin? a találmány tárgya eljárás új AAV szerotipusok teljes és fertőző genomjansk az Izolálására különböző eredetű eeltolárls DNS-ből RACE és más molekuláris módszerek alkalmazásával.
Egy további megvalósítási mód szénát a találmány tárgya eljárás AAV genomok áj szerotipusainak a kimentésére humán és NBP sejivonalakböi. különböző eredetű adenovlms segitövlrnsok sikahnuzásávat
Egy még további. snegvalósítási mód szerint & találmány tárgyát új AAV szerotipusok, az azokat tartalmazó vektorok és az írnokot alkalmazó eljárások képezik.
A. találmány ezen és más megvalósítási módjai nyilváavalóak a találmány alább? részletes lelrásáböi.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:
líőy-ő:*? it λ·ι
Az XÁ-1AAÁR. ábrákon az AAV szerotípusokböí legalább a esp fehérjét kódoló nukfeinsavszekvencíáh: egymás alá rendezéséi mutaljttk be. Bemutatják a teljes hosszúságú szekvenciákat — amelyek tartalmazzák az ITR-eket, a rep régiót és a kapszíd régiót......az új AAV ?~es szsrotipus: [i. azonositöszámú szekvencia] esetére, és a korábban nyilvánosságra hozott AAV'i [6,. azonosítószámú szekvencia), AAV2 [7.
azonosítószámú szekvencia] és AAV3 [8. azonosítószámú szekvenciái esetére. Az új AAV8 [4. azosositőszámá szekvencia] és AAV9 [5. azonosítószámú szekvencia'] AAV szerotípesok a jelen beieleniéssel egyívíóben: benyújtott bejelentések találmány tárgyát képezik. Az ebben az egymás alá rendezésben bemutatott takf raány szerinti:új kiónok az alábbiak:: 42-2: [9, azonosítószámú szekvencia), 42-8 [27. azonosítószámú szekvencia), 4215 [28. azonosítószámú szekvencia], 42-5b (29, azonosítószámú szekvencia), 42-lb (3ö, azonosítószámú szekvctíciaj; 42-13 131., azímostíószámú szekvencia],. 42-3s [32. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [33, azonosítószámú szekvencia), 42-5a [34.. azonosítószámú szekvencia], 42-10 [35. azonosítószámú szekvencia), 42~3b [3ó. azonosítószámú szekvencia], 42-1 1 (37. azonosítószámú szekvencia), 42-éb [38.. azonosítószámú szekvencia]:, 43-1 [39. azonosítószámú szekvencia], 43-5 [49, azonosítószámú szekvencia], 43-12 [41.. azonosírótszámú szekvencia], 43-20 [42, azonosítószámú szekvencia]:, 43-21 (43. azonosítószámú szekvencia],
43-23 (44. azonosítószámú szekvencia], 45-25 [45. azonosítószámú .szekvencia], 44.1 [47. azonosítószámú szekvencia], 44.5 [47. azonosítószámú szekvencia], 223,18 [98, azmsosüószánrá: szekvencia), 223.2 [49. azonosítószámú szekvencia), 223,4 (50. azonosítószámú szekvencia), 223.5 (51. azonosítószámú szekvencia], 223.6 [52, azonosítószámú szekvencia), 223,7 [53. azonosítószámú szekvencia], A3.4 (54. azonosítószámú szekvencia], A3.4 (55. azonosítószámú szekvencia], A3.7 (Sú, azonosítószámú szekvencia], A3.3 [57, azonosítószámú szekvencia], 42,12 [58. aztnostk»zámú szekvencia], 44,2 [59. szonoshószátnú szekvencia]. Az AÁVIO [117, azonosítószámú szekvencia), AAV11 1118. azotiosiíószámú szekvencia] és AAV-2 [119. azonosítószámú szekvencia) szrgnaíúra régióinak a múdeobd-szekveneiált is bemutatjuk az ábrán. As. AAV genonrok szerkezetének kritikus jellegzetességeit is feltüntetjük. A réseket pontokkal ábrázoljuk. Az AAV1 [ó, azonosítószámú szekvencia] Γ íTS-jét a közzétett szekvenciákkal azonos konúgnráeiöhae mutatják be, „TRS” jelentése terminális feloldási hely („terminál resolation síte”). Megjegyezzük, hogy az AAV7 az egyetlen olyan ismert AAV, amelyben CTG a W3 iniciációs koó.onja.
Λ 2A-2E ábrákon a a vpl kapszídfehérjék ammosav-ssekventááinak az egymás alá rendezexe- matatom be: a korábban nyilvánosságra hozott 1-es AAV szerotípns [64, azonosítószámú szckvenei.:], .AAV'2 | ?o. azonositószamú szekvencia], AAV3 (71. azonosítószámú szekvencia], AAV4 [63. azonosítószámú szekvencia,,
AAV5 [1:14, azonosítószámú szekvencia] és AAVó [65. azonosítószámú szekvencia] esetében, vsteáat a találmány szerinti új AAV szekvenciák esetében, amelyek az alábbiak: Cl (60. azonosítószámú szekvencia], C2 [61. azonosítószámú ^sekv«n«bj, €3 [62. azonosítószámú szekvencia), Á3-3 (óé. azonosítószámú szekvencia], A3-7 (67. azonosítószámú szekvencia], A3-4 [68. azonosítószámú sz?kve«»'u|, \3-5 (69. azonosítószámú szekvencia], 3.3b [62. azonosítószámú szekvencia], 223,4 (73. szonomwama szekvencia], 223-5 [74, azonosítószámú szekvencia), 223-19 [75. azonosítószámú szekvencia], 223-2 '”o azonosítószámú szekvencia], 223-7 [77,. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78. azonosítószámú szekvenemd. 44-1 [79. azonosítószámú szekvencia]. 44-5 (80. azonosítószámú szekvenciái, 44-2 [81. az.enosnó,-v'ama szekvencia], 42-15 (84. azonosítószámú szekvencia]., 42-8 [85. azonosfwszámó szekvencia), 42-13 (8b. azonosítószámú szekvenciái. 423.A [87. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88, azenosífószámú szekvencia]:, 42-5.A [89. azonosítószámú szekvenciaj, 42-lS (90, azonosító,számú szekvencia], 42-5B [91. azonosítószámú szekvencia], 43-1 [92.
azonosítószámú szekvenciák 43-12 [93, azonos dőszátsú szekvencia), 43-5 [94. azonosítószámú szekvencia), 4321 [96. azonosítöszámú. szekvencia), 43-25 [97. azonosítószámú szekvencia], 43-20: [90. azönosifószámú szekvencia], 24,1 [lói. azonosítöszámá szekvencia], 42.2 [102. azonosítószámú szekvencia], 7,2 [103. azonosítószámú szekvencia], 27.3 [104. azonosítószámú szekvencia], 16.3 1105. azonosítószámú szekvencia],
42. 10 [106. azonosítószámú szöktem -a], 42 JB 1 507. azonosítószámú szekvencia], 42 - í 5 [508. azonosítószámú szekvencia], FI [109. azonosuoszamn szekvencia], F5 [110. azonosítószámú szekvencia], F3 [Hl. azonosítószámú szekvencia], 42-6B [112. a/onedtoszámú szekvencia], 4,2-12 [í13, azanositószámá szekvencia). Az: új AAV8 üzemtípus [95; azonesfíóssámé szekvencia] és AAV9 [100. azonosítószámú szekvencia] egyidpiúleg benyújtott szabadalmi bejelentések tárgyút képezi.
A 3A-3C, ábrákon: az AAV7 rep fehérjék [3, azonesítoszántú szekveneia] smmosav-szekvenelájáí mutatjuk be.
A jelen találmány szerint olyan eljárást találtunk, amely kihasználja nz adeno-asszociáit vírus <AÁV>
azon képességét, heg) bejut a sejtmagba, és......segítő vírussal való együttes fertőzés hiányában.....integrálódik a eelhdáris DNS-he, es látens fertőzési hoz létre. Az eljárásban poíimeráz-láncreakciőn (FCR) alapuló stratégiát alkalmaznak az ÁAV-k szekvenciáinak a detektálásán. azonosítására és/vagy izolálására humán és nem humán, főemlősök szövetének 1 )\S-eből, valammt más forrásokból. Előnyősét· az eljárás alkalmas más integrálódott vitális és nem viráks szekvenciák detektálására,.azonosítására és/vagy izolálására is, amint alább ismertetjük.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárásokkal azonosított rmkleinsavszekveneiák is. Egy ilyen adenö-asszoeíáít virus egy új szeroíípus, amelyet a leírás szerinti érteledben. 7-es széföíípusnak (AAV7) nevezünk, A találmány tárgyát képező más oj adeno-asszosiált vírus szerodpusok. közé tartozik az AAV 10. AAV11 és AAY52. A találmány szerinti eljárásokkal azonosított még .további új AAV szeretípasefc is a találmány tárgyát képezik. Lásd az ábrákat és a székve-neialístái, arat hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány tárgyát képezik továbbá ezen AAV szekvenciák iragmensel Is, A külSoSsen előnyös
AAV-fragmensek: közé tartozik a vpl, vp2, vp3, a Inpervísriábilís régiók,: a rpp Mérjék,. mint például a zpp 78, rep 68, re/? 52 és rep 40, és; az ezeket a Íshéíjéket kódoló szekvenciák. Ezen íragmensek mindegyikét könnyedén alkaluíazhádúk különféle vektorrendszerekben és gazdasejtefcfees. Az ilyen, ffegmsnssket: alkalmazhatjuk egyedid, más AAV szekvenciákkal vagy fegmensekkel kombinálva, vagy más AAV vagy nem AAV virális szekvenciákból származó elemekkel kombinálva. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a vektor a találmány szerinti AAV épp és/vagy rpp .szekvenciákat tartalmazza.
A leírás szerinti értelemben az egymás alá rendezéseket különféle nyilvánosan vagy kereskedelmi forgalomban hozzáterhe-ö többszörös szekveneni egymás alá rendező programmal („Mnltíple Sequence M.cnment Program) mint poklául a H alkahrtaza^rtal hajthatjuk végre Mas megoldásképpen a ; <\ tor ,V77 programokat alksimazhapok. Szamos szakterületen ismert algoritmus van, amelyet alkalmazhatunk a
Uttkleötid-szekveuciák azonosságának a mérésem például a fenti prográmökban találhatókat. Egy másik példaként a polinukleotíd-székvenmákat a Eös/ő alkalmazásával hasonlíthatjuk össze, amely & GGG Version 61 programcsomagban található. A Artríű a keres® és kutatod szekvenciák legjobban átfedő régíéíuak az egymás alá rendezését és százalékos szekveseisnzonásságát: adja meg., Például a reukieissav-szekvetteiák közötti százalékos szekveneiaazonosságöt a Fdxto alkalmazásával hatúrcízhatjuk meg az alapérteltnezetf paraméterekkel (száméret 6 és NOPAM faktor az értékelő mátrixban), amint azok a GCC Version 6 1 programcsomagban
- 4 megtalálhatók, amely hivatkozás útján a kitaniíás részét képezi. Hasonló programok rendelkezésre állnak arnínosav-szekvnneiák esetére is, például a Cfasíal X program. Általában. ezen programok bármelyikét az alapértelmezett beállításokkal alkahnazzuk, habár a szakemter szükség szerint inegváiíozíatliaija ezeket a beállításokat. Más megoldásképpen a szakember másik algenhúnsi vagy számítógépi programot alkalmazhat, amely legalább ugyanazt az azonosságot vagy egymás alá rendezést biztosítja, mint a hivatkozott uferrnu ások és programok..
A „lényeges botpológia” vagy „lényeges hasonlóság” kifejezés alatt aukleinsav vagy feagntense vonatkozásában a leírás szerinti: értelemben azt értjük, hogy amikor optimálisan egymás alá rendezzék nukleotidek megfeleld inzereiújávai vagy deléciöjával egy másik nukteinsavval (vagy annak komplementer szálával), a nukleotiü-szekvescia azonosság legalább körülbelül 95-99% az egymás alá rendezett szekvenciák között, Előnyösen a bomolőgla a teljes hosszúságú szekvenciára vonatkozik vagy annak nyílt leolvasási iázisára, vagy egy másik megfelelő fmgmensre:, amely legalább 15 nnkleotid hosszúságú. A megfelelő íragmensek példáit bemutatjuk: a leírásbari.
A „lényeges homológja” vagy „lényeges hasonlóság” kifejezés: alatt aminosavak vagy feagmenseik vonatkozásában a leírás szerinti értelemben azt értjük, hogy amikor optimálist® egyjnás alá rendezzük sminosavak megfelelő inzereiöjaval vagy deléciöjával egy másik aminosawal, az arcnkmsav-szekvencia azonosság: legalább körülbelül 95-99% az egymás alá rendezett szekvenciák között. Előnyösen a homológta a teljes hosszúsága szekvenciára vagy fehérjém — például cnp fehérjére, rep fehérjére vagy azok legalább 8 sminosav, vagy előnyösebbe® legalább 15 aminosav hosszúságú íragmenséto — vonatkozik. A megfelelő feagmeíssek példáit feenmtaéiük a leírásban.
Az „erősen konzervált” kifejezés alatt legalább 80% azonosságot, előnyösen legalább 90% asouosságot és előnyösebben legalább 97% azonosságot értünk. Az, azonosságot a szakember könnyen meghatározhatja a szakember számára ismert algoritmusok és számítógépi programok alkalmazásával,
A „százalékos szokvenciaazonosság” vagy azonos'* kifejezés alatt ítukleinsav-pzekvenciák 25 vonatkozásában két: szekvencia azon oldalláncún értjük,, amelyek ugyanazok. amikor twdmáh's megegyezéssel egymás alá vannak rendezve. A szekvenciaazonosság összehasonlításának a hossza kivám.: esetben letet: a teljes hosszúságú genomra, a teljes hosszúságú kódoló szekvenciám, vagy legalább körülbelül 500-5080 nuldeötid humán feagtnensre vonatkoztatva. Azonban kisebb feagmensek, például legalább körülbelül kilenc sukleoíid, általában legalább körülbelül 20-24 nnkleotid, legalább körülbelül 28- ?2 nnkleotid, legalább körülbelül 3» vagy
3ö több nnkleotid hosszúságú fnigtaeosek közötti azonosságot. is meghatátcztóunk, Hasonlóképpen, a „százalékos szekvencíaazonosságöt” könnyedén meghatározhatjuk teitemv-szekvcnciák esetében is, a teljes hosszúságú tehérjére, vagy annak egy frágrúensére vonatkoztatva. Előnyösen egy fragmeos legalább körülbelül 8 atninosav hosszúságú, és akár 700 aunnosar hosszúságú is lehet. A megfelelő tragínensek példák bemutatjuk a leírásban.
.AzAAV szekvenciák és Iragmenselk hasznosak r.AAV előállítására, és ezenfelül hasznosak aníiszensz bejuttatásí vektoroknak, génterápiás vektoroknak, vagy vakcinavektoroknak. A találmány tárgyát képezik tovább nnkleinsav-moiekniák, génhejuttatásí vektorok, és olyas gazdasolíek, amelyek tartalmazzák a: találmány szerinti AÁV-szekvene.iákat.
Á. leirtís: szerinti értelemben a találmány szerinti AAV kapszidfeherjéket tartalmazó találmány szerintii vektorok különösen alkalmasak olyan alkalmazásokban, amelyekben semlegesítő ellenanyagok csökkentik a
- többi AAV-szerotipuson alapuló vektorok, valamint toás virális vőkkwök halékonyságát. A tsiálsütoy szerinti r AAV vektorok különösen előnyösek rAAV újbóli beadására és ismételt génterápiára.
A találmány ezen és más megvalósítási uródjáíf és előnyeit részletesebben is Ismertetjük az alábbiakban, A leírás és igénypontok szerinti érielemfeeti a „tartalmaz?’ kdejezés és variánsai alatt értendők más komponensek, elemek, egész számok, lépések es hastsolók is. Ezzel elleniéiben „.valamiből áll kifejezés és variánsai kizárjuk más'komportersek, elemek, egész számok, lépések ex hasonlók jelenlété?,
1. Találmány szerinti eljárások
Á. Szekvenciák detektálása molekuláris klónozással
Egy megvalósitási móri szerint s tfoáíanány tárgya eljárás célzóit mtklemsav-szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására mintában. Ez az eljárás különösen alkalmas olyan virális szekvenciák detektálására, ásnelyek: hriégridednak: egy sejt temoszómájáfea, példán! többek kozott ade&o-asszoeislt vírus (AAV) és reirovírusok detektálására. A leírásban az ÁAV-re hivatkozónk, ami csak szemléltető jellegit Azonban ezen információ alapján a szakember könnyedén végrehajthatja a taiáhnány szerinti eljárást többek között.
1S rvtrevíKiSökoa (például -macska leukémia vírus (EeLV), HTLV-í es HTEV-llI és lenih írásokon {például humán, ímninodefeleoeia vírus <HÍV% sajem immnodeficieímla vírus .(SÍV), macska immondeilcieneía vírus i'FlV), lő fertőző iméntin vírus és sgmn&viriosl)). Ezenfelül a találmány szerinti eljárást alkalmazhaijsk más vitális és nem, virális szekvenciák detektálására is, függetlenül átlók hogy integrálódva vannak-e vagy sess a gazdasejt genetpjába.
A leírás szentül értelemben snínte alatt hámülyen forrásból származó nnkleioxavsí ériünk, példán!
szövetből, szővenenyészetböl, sejtt«syészeibSl és biológiai folyadékokból, sem korlátozó példaként vizeiéiből és vérből származót. Ezek á ntskleinsav-székvönelák lehelnek plaznúdokból származó BMS vagy OS, htteilyett: forrásbők mint példán! baktériumokból, élesztőből vírusokból és magasabhreodő organizmusokból, mint póldáal növényekből vagy állatokból származó természetben előforduló DNS vagy kNS. A DNS-t vagy RNS-t o szakember szántára ismeri különféle módszerekkel extrabálhaíjuk a nüniábéb mint példán! a Ssmbrook és mtsai. (.foíoleeuiar Cionm.gr A Labonrioty Manual”, kiad.: New York: Coid Spring llárbor Lahoratory} állal leírtakkal, A nünte eredete és az az eljárás, amellyel a nukleinsavskat eiöáhitjuk a találmány szerinti eljárásban történő síkaítsazásm, pest korlátozó a találmány szempontjából. Adott cserben a találmány szerinti eljárást közvetlenül a DNS forrásán is végrehajthatjuk, vagy a forrásból származó- (például extrahált) nnkleinsavakom
A találmány szerinti eljárás magában foglalja a DNS-t tartalmazó minta araplifíkálását polimerázláuereakció (FCRj útján a kekszéin rmklemsav-szekveneiák egy első régiójára specifikus első lánsrindító-készfot alkalmazásával, ezáltal ampliííkált szekvenciákat előállítva.
A lékás szerinti értelemben a „régiók5' inmdegyikéí előre meghatározzuk iegsiíább két (például AÁY} szerotípus rmklernsav-székveítciájáríuk az egyórás alá rendezése alapján, ahol a régiók mindegyike erősen konzervált 5’ végi szekvenciákat, előnyösen, de sem szükségszerben. variábilis középső régiók és- erősen konzervált 3' véget tartalmaz, almi ezek mindegyike legalább két egymás alá rendezett AAV szeroílpushoz viszonyítva konzervált vagy variábilis 1 lou\»xe t az 5’ és/vagy 3’ vég erősen konzervált legalább körülbelül 8, és előnyösebben legalább körülbelül 18 bázlspsrra. (bp) vonatkoztatva. Azonban az. 5’ vagy 3' szekvenciák egyike vagy mísdkeítójhk lehet konzervált több mist: lő bp, több mist 25 bp, több mint. 38 bp, vagy több mint 58 bp esetében az 5’ végen. A variábilis régió tekintetében nincs előírva konzervált szekvenciák jelenléte, ezek a
-ό~ szekvenciák lehetnek vlszopylag komterváhak, vagy lehelnek kevesebb, mist 98, 88 vagy 78%~'b<m azonosak az egymás alá rendezett szerotípite.okra vagy :örzsékre vonatkoztatva,
A régiók mindegyike körülbelül 180 bp és körillbelül 18 kbp közötti hosszúságú tehet, Azonban kuionb\c:> cionsos ha a régió egy „Aígoteúra va/ eh in régió, amely elegendően e/y edi ahhoz, hogy $ pozitívan azo vsttsuk az ampliSkáit szekvenciái, intet a célforrásfeól származót. Például egy megvalósítást mód szerint az első régió kőrölbelől 258 bp hosszúságú, és elegendően; egyedi az AAY szekvenciák között ahhoz, hogy pozitívan azonosítsuk az amplifikák régiót, mint AAV-eredetűt Ezenfelül a régióban található variábilis szekvenciák elegendően egyediek ahhoz, hogy alkalmazhassuk azokat annak a szeroppussak az ^azonosítására, amelyből az aurpliíikált régió származik. Ha egyszer ampüftlíáitsk (és ezáltal detektáltuk}^ a. szekvenciákat azonosíthatjuk hagyományos restrikciós emésztés és a régió emésztési mistázatáuak az összehasonlításával az AAYi, AAY2, AAY3, AAV4,: AAVS vagy AAVő, vagy az AAY?, AAY18, AAVI1, AAYI2, vagy bármelyik, találmány szerhúi áj szeroripus álkahnazásával, amely előre meg van határozva, ős a találmány tárgyát képezi.
A. leírás szerinti uímmatás alapján a szakember könnyeden azonosíthat ilyen régiókat más integrálódott vírusokban, lehetővé téve ezen szekvenciák könnyé detektálását és azonosítását. Azután az erősen konzervált végeken található generikus lánc indítókat tervezhetünk, és tesztelhetjük azokat a kiválasztott régiónak mintákból történő hatékony amphrikáelájára. A találmány ezen megvalósítási módját könnyen adaptálhatjuk diagnosztikai resgenskésztethe a eélszekvencia (például AAY) jelenlétének detektálására, és az AA V szerotípus azonosítására, olyan standardok alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti AAY szerotipusok restrikciós mintázatát, vagy amelyeket találmány szerinti módszerekkel izoláittmk. béldául 8C&-termékek gyors
28: azonosílását vagy molekuláris: szerotípízálását elvégezhetjük a kCR-íermékek restrikciós emésztésével ős a restrikciós mintázatok összehasonlításával.
Ily módon egy megvalósítási mód szerint az .AAY „szignáturá régiója*' köriiihelül 28oC és kntuihelaí 3280 hp-nyl régiét Ível át az AAVI: (ő, azonosítószámú szekvencia} szektercnvban. és a megfelelő bp~eka< az AAV2. AAV3, AAV4, AAV5 és AAV6 szekvenciájában. Előnyösebben e Og.o kmúlóeiu: 250 op, cs a 23So es körülbelül 3143 bp pozíció között helyezkedik el az AAVI Í6. azonositós/amá »/ekvenemj «.teksenmumhá, és. i megfelelő bp-ok között az: AAV2 [7. azonosítószámú szekvencia}, AAY3 [3. azonoki.?szárnn székéeneúri cs a többi AAY szerotipus szekvenciájában (lásd a I. ábrás). Az: AAY gyors detektálásának lehetővé tétele érdekében az ezt a szignálóra régiót specifikusan amplifikáló láncindítókat alkalmazunk, Azonban a találmány nem korlátozódik a leírásban megadott AAY szignálóra régiók pontos szekvenciájára, minthogy a szakember számára könnyen módosítható ez: a régié, hogy a szignálóra régiók rövídebb vagy hosszabb íragmenseh tartalmazza,
A PCR-láncindítőkat a szakember számára ismert módszerek alkalmazásával állítjuk elő. A PCRláneisdító-készletek egy 5' ős egy 3’ láncindilöból állnak (lásd például Sambrook és mtsai., mint feni). A .„ίόπνιηώϊό kifejezés alatt olyan ollgonukleotidoí értünk, amely a szintézis kiindulási pontjai képezi, amikor olysrs kötülntesyek közé helyezzük, amelyek: kozott a láscmdltó mikieinsavval komplementer szálának meghosszabbított termékéugk szintézise indukálódik. A lánciudhó előnyösen egy szalu. Azonban ha kétszálú iáncindítőt alkalmazunk, azt kezeljék a meghosszabbított termék előállítására \nlo alkalmazását megelőzően, hogy szétválasszak a szálait. A. iáacmdhők .körülbelül 15^25 vagy több mikleetíd hosszúságúak lehetnek, ős előnyösen legalább 1S nukleotid hosszúságúak. Azonban bizonyos alkalmazások esetében: rővídehb, például 740 15 nukleotid hosszúságú lánőíndítókat alkalmazunk.
Ο'
A BöefodsióW ágy választjuk meg, hogy elegendően kmple®e»1»rek legyenek az egyes amplilkálattdö specifikus szekvenciák, különböző szálaihoz, hogy hibridizáljanakamegfelelö szálakkal Tehát a láncmdltö szekvenciának nem kell tükröznie az amplinkálattdő régió pontos szekvenciáját. Például egy ásás kontplemeníer nnkleotid-fragmensf kapcsolhatunk a lástodítö 5’ vegéhez, és a láncmdhó fennmarad© része teljeset! komplementer a szálisi. Más megoldiísképpett nem komplementer bázisokat vagy hosszabb szekvenciákat szórhatunk he a lánemdítőha, amennyiben a iátictád86: szekvenciája elegendően kotnplemetof az smpllfikáiandó szál szekvenciájával, hogy hiferldizáljon azzal, és terápiától alkosson a másik láncinditóval a insghösszahbtott termék szintéziséhez.
A tslálmátty szerinti sziguatüra régióhoz való PCfolántodííök két vagy több egymás alá rendezett szekvencia (például két vagy több AAV szekvencia) erősen konzervált szekvenciáján alapulnak. A lánemdkök ehűrik a pontosnál kisebb mértékű azonosságot a két vagy több egymás alá rendezett AAV szerotipos esetében az 5’ végen és középen. Azonban, a láneMtók ,3’ végén található szekvenciák a két vagy több egymás alá rendezett AAV szerodpus olyan régiójának léiéinek meg, amelyekben a pontos azonosság legalább 5, előnyösen legalább 9 és legelőnyösebben legalább Iá házaspár hosszúságé a láöcindíiő 3^ végén. Ily módon a láncisdltók 3’ vége sz egymás alá rendezett szekvenciák legalább S nukieofidjávat 100%-bas azonos szekvenciát tartatom. Azonban adott esetben egy, kettő vagy több degencrah. nukleotldot alkalmazhatunk a láncmdltö 3’ végéto.
Például az AAV' szignálóra, régiójára specifikus iánemdítót az A.AV kapszid egyedi régiója alapján terveztok; amint az alábbiakban Ismerteíiük Az 5' láncinditó az AAV2 (7. azonosltőszárstá szekvencia] 2áö72891, noktotidjain alapult, S’-GGTAATTCCTCCGGAAArrGGCATI'-d' (lásd az L ábrát), A3’ láneiodítő az AAV2. (7, azonosítószámú: szekvenciái 3096-3122. mtkföoiidjshr alapalt, S5GAGTCáTCAACAACAA€7T<íOGGATTC-3’. Azönhatr a szakember könnyedén tervezhet láncinditőkészleteket: áz AAV), AAV3, AAV4, AAV5, AAW megfeleld szekvenciái alapján, vagy' a mlálmátty szentül AAV7, AAV 10, AAV 11, AAV) 2, vagy más találmány szerinti áj AAV szekvenciája alapján, Ezenfelül még: torabb; lanctndüo-kcszfetekot tervezhetünk a szignálóm régió astplilkálásám, a szakember számára ismert módszerek alkaónazásat al
Ö cctóekseni. .o, izo.etoa
Amint ismertetjük, a találmány tárgya egy első láncmdité-készlot, amely specifikusan atnplitikálja a vdszekreacta pdtod egy zlÁV szeroiipns — szignómra régióját a célpont detektálása érdekében. Olyan esetben,, amikor további szekvenciákra van igény, például ha öj AAV szsrotipnst azonosítunk, a szlgnatéza régiót sseghosszabbtlimtjuk. ily módon a találmány szerbit alkalmazlmtuak egy vagy több további láncindf tö-készleteí.
Megfelelő módon ezeket a láncmdító-keszteteket ügy tervezzük, hogy tartalmazzák az első táneinditokészleí 5’ vagy 3’ láncmáltóját. és a második lásscmdké egyedi a láscmáító-készleteí tekintve, ily módos a láncmditó-késziet a szignálóra régióhoz képest 5' vagy 3’ helyzetű régiót amphükák amely aneilálodtk a szignálóra régié 5' vagy 3’ végéhez. Példán! az első láÍScináiíó-keszhtt El 5' iascmdltóböi és 02 3’ lárrcinöitóhól áll a szignálóra régi© atnpüEkálásám. A szignálóra régió- 3' végén lörtéttő megfötsszabhltásártt egy második lásaiodííó-készlsí a Pl láneítidítóbő! és a 14 3’ lánclndiiöböl áll, amely a szignálóra régiót és a szignálóm régiótól leolvasással megegyező irányban található folyamatos szekvenciákat ampltiikálja. A szignálóm régió 5’ végén történő meghosszabbításám egy harmadik ísncindhő-készleí a 13 5' lánc indítóból és a ,P2 tocmdltőbó! áll, amely a szignálóm régiót és a szignálóra régiótól leolvasással ellentétes Irányban található folyamatos szekvenciákat amplifikálja. Izeket a meghosszabbítási lépéseket megismételjük (vagy egyidejűleg bájtjuk
- 8 végre), szükség vagy Igény szerint Azután az ezen at55pbbkáelős lépések eredruénykeppen kapott termékeket hagyományos lépésekkel fiizloÍrnhaijak, hogy ki vúrh hosszúságú izolált szekvenciát állítsunk elő,
A második és harmadik láncindifó-készletet ágy tervezzük......az első íánciadltő-készlethez hasonlóan hogy az egymás alá rendezett szekvenciák erősen konzervált szekvenciája régióját ampliftkálják. A leírás szerinti értelemben a ..jjbásoáík”· vagy „harmadik” láseírsditó-készlot kifejezést csak a. tárgyalás kedvéért, alkalmazzak, cs bem tekinthető soireodíségnek, amelyben. ezeket a klneinmtokat a reakcióelegybe adjak, vagy' amphűkációra. alkalmazzuk. A második láncmáitö-keuzfettel amgli&ált régiót úgy választjuk meg, hogy az ampkfikáeté fólyamás sz 5’ végevéi anelláiődjon a szignálóra régió 3’ végéhez. Hasonlóképpen a harmadik iáncmdítő-késslettel auíphhkák régiét úgy választják meg, hogy az anmhSkáeiő felyamán a 3’ végével lő aoellúlődjou a szignálóra regié 5’ vegéhez. További láneimhtő-készieteket: tervezhetünk: oly módon, hogy az általuk atnphflkáh régiók asellálódjanak a második vagy harmadik láneíndiié-feészlet, vagy további iáncindstókészletek által kialakított tneghosszafcbtton tennék 5' vagy Γ végéhez
Például amikor AAV a célszekveneta, az első iáncínditó-készletet (Pl és P2) aWnxazznk a szigsatúrs régió mintából történő ampiiGkáiésara. E§y: előnyős megvalósítási mód szerint ez a szigsatúra régié az AAV kapsziáoa beiül található. Egy második lánciadíió-készletet (Pl és P4) alkalmaznak a szigmutha régié 3’ végének a meghosszabbítására az AAV szekvencia olyan helye kányában, amely éppen az AAV 3’ 1TR előtt található, azaz olyan sneghosszablhtott termeket eresiményez, amely taftahnazza az AAV hapszíd teljes 3 ’ végét, amikor a szlgnatúrs régiét horgonyként alkahrtszzak, Bgy megvalósítási mód szerint a P4 láncmhító az ÁAV2 (7. azonosítószámú szekvencia] -4435-44S2, nukteotldjámak, és: más: AAV szerotipusok megfeleld s&kíeotídjainak felel meg, Sz- egy körülbelül 1,6 kb méretű régió amphTrkáeíóját eredményezi, amely tartalmazza a 0,25 kb tuéreta szigaatúra régiót Egy batmadtk láncmdító-készletet: (P3 és P2j alkalmazunk a szignálóra régto 5' végének a meghosszabbítására az: AAV szekvencia olyan helye irányában, amely a ren .gének 3’ végén található, azaz olyan megbosszablntsh terméket eredményez,, -amely tartalmazza az AAV kapszid teljés 5’ végéi, atnlkor a szignatúra régiót horgonyként alkalmazzuk. Egy megvalósítást mód szerint a P3 láneindító az
AA.Y2 (?.. azonosítószámú szekvenciái 1384-1489:. nukleotidjaísak, és tttús AAV s/emtipusok megfelelő: nnkleotidjainak: felel meg.. Ez: egy körülbelül 1,7 kb méretű régió ampliflkációjat eredményezi, amely tartalmazza a.0(25 kb méretű szignatúra régiót. Adott esetben egy negyedik tóncmdttá-keszieiet alkalmazunk a meghosszabbított termék további meghosszabbítására, amely tartalmazza az AAV kapszid teljes 5' végét és tartalmazza s :mp szekvenciákat is. Egy megvalósítási inöd szerint a P5 lanctnditó az. AAV2 [7. azonosítószánm szekvenciái lók-13:3, ankiesikíjaínak, és más AAV szerotípuspk megfelelő tntkleö-tídj:aín:ak felel meg, és a. P2. iúneindhővaí együtt: alkalmazzuk..
A kívánt száma meghosszabbítási; lépést követően a különféle meghosszabbított termékeket feziortáháguk, a szignálóra régiót alkalmazva horgonyként vagy markéiként, hogy intakt szekvenciát állítsunk elő. A leírás szerinti példában minimálisan az Intakt AAV e«p gént tartalmazó AAV szekvenciákat állítunk elő.
Nagyobb wtoctteitfea; ts t ioat:'thahtnk a segrehajtotí meghosszabbítási lépések szántától függőén.
Megfelelő modote a meghosszabbított termékeket intakt AAV szekveitelává dilit juk Összes a Szakember számára ismert eljárások allmlmszásával. Például a meghosszabbított termeket megemészthetjük Draílí enzimmel, amely szignálóra régión belül található Dtafll helyet hasítja el, olyan restrikciós feagmenst előállítva, amelyet ajrsligákmk (mmimdhs esetben) ogy intakt AAV eap gént tartalmazó terméket előállítva. Azonban más:
alkalmas módszereket is alkalmazhatunk a meghosszabbított termékek intakt szekvenciává történő összeáílítesára (általában lásd Sambrook és mtsai., mint fent),
A. fent ismertetett többszörös meghosszabbítási lépések ahernabvajukení a találmány egy másik snegvalösítári médiának tárgyit egy 3/1 kb hosszúságú fragmeas közvetlen am pH ísfeáiúsa,· ami tehetővé teszi a
S teljes hosszúságú cnp szekveneísk izolálását, A 3,1 kb mérető teljés hosszúságú aj/> ímgmensMIP szövetből és vér DNSfitől történő közserien aíophfkakAam két másik erősen konzerváii régiót a/cmosfíötíunfe az AAV genomokbatr nagy fracmensok PCR-es. ampbfiLxiasáta. A rep gén közepén taialható konzervált régióban lévő iancÍBŰitdl (AV 1 ns: 5*-GCrGCGTCAACTGGAC€AA'fG AGAAC-3', 6. azonosítószámú szekvencia) alkalmazunk együtt a rup géntől leolvasással megegyező irányban található konzervált régióban, elhelyezkedő 3’
W láucindítővnl (AVSoas: .S’-CGCAGAGACCAAAGTTCAACTöAAACOA-y, 7. azonosítószámú szekvencia) a teljes hosszúságú AAV nop-ot tartalmazó AAV szekvenciák amplirikálásám. Tipíkussn az amplíiikácíőt követően a termékeket klónozzuk, és 99,9%-ná) pontosabb szefeveneiaelemzést végzünk. Ezen eljárás alkalmazásával legalább 50 kapszid klóm izoláltunk; amelyeket azt követően jellemeztünk. Ezek .között 37 klón származott £ta mórzígae szövetekből trh. l - rh.3?>, 6 felen .szármstzott Cv«Of»o/<>go«s majmokból <vy.l 15 cy.ő), 2 klón szármázott páviánokból (bb.,1 és bb.2) és 5 klón származott csimpánzokból (eh. I - cb,5). Ezeket a kiónokat máshol azonosítják a leírásban, együtt azzal az állatfajjal, amelyből azonosítottuk azokat, és: az állat ázott szövetével, amelyben ezek az új: szekvenciák elhelyezkednek.
C, Alternatív eljárás új AAV-k Izolálására
Egy másik megvalósítást mód szerint a találmány iárgya alternatív eljárás új AAV Izolálására sejtből.
Ess® éljárás szerint a sejtéi az AAV számára segítő funkciókat biztosító vektorai fertőzzük: meg; AAV~t taftalnrazó fertőző kfemokat izolálunk; az izolál· AAV-ket megszekvenáljuk; éa összehasonlítjuk az, izolált .AAV-k szekvenciáját ismert AAV szerotípusokkal, miáltal az izolált AAV és: az ismert AAV szerotípüsok szék véne iájának a különbségei jelzik az új AAV jelenlétét.
Egy raegr alósítási mód szerint, a segítő funkciói, biztosító vektor esszenciális adenovirus funkciókat biztosít, mini például Ela-í, Elb-í, E2&-Í, EdOREő-ct Egy megvalósítási mód. szerint a segítő funkciót adenovirussal biztosítják. Az adenevíras lehet vad típusú adenovírus, és tehet, humán vagy nem humán eredetű, előnyösen nem humán főemlős: (NHP) eredetű. Számos adeuavírus típus DHS-szekvencüg:a hozzáférhető: a öenbank-bói, köztük az Ad5-é is (Genbaak hozzáférési szám: M732ŐŐ). Az adenevírus: szekvenciákat bármilyen ismert adenovírus szerotípusból. elóállíthariuk, mmt például a 2-és, 3-as, 4-es, 7-es, I 2~es: és 4ö-es, és továbbá a jelenleg azonosítod humán típusok bármelyikéből ís (lásd például: Bönvltz, mini fent):, Hasonlóképpen nem humán állatokat (például csimpánzokat) ismert módon megfertőző adenovírusókat ís alkaimazbattmk a találmány szerinti vektörkonstrukeiőlíban (lásd például 083 71b. számú amerikai: egyesült államokbeli szabadalmi írat). A vad típusú aáenovteusek mellett a szükséges segíts funkciókat hordozó rekornbináns vírusokat vagy nem virátte vektorokat (például plazmidokat, őpiszőmakaí, stb.) is áikahsazhahmk,
Ilyen rekotnbináos vektorok ismertek a szakterőfeten, és közismert módszerekkel állíthatók elő (lásd például sz 5 871 982. és ő 351 677. számú amerikai egyesült államokbeli, szabadalmi iratekak, ^melyek iubríd Ad/AAV vírust tárnak tel). Az aáeooviras· típus: megválasztását sem tekintjük a találmányt koriaiezórak, Különféle ade.no vírus törzsek, besserezhsíek az 'American Type Cúhure Collectisn· intézettől (Manussas, Virgínia), vagy kérésre: hozzáférhetők különféle kereskedelmi vagy intézményi forrásokból. Ezenfelül sok: ilyen törzs szekvenciája hozzáférhető különféle adatbázisokból, mint például a. PabMsd vagy Genbauk adatbázisból.
- 10 Egy másik alfernallvaként fertőző AAV-ΐ izolálhatunk genontséta íechnológia alkalmazásával is [Steherl és mtsai,, Nuelelc Acid Researeh, 23,1087-1088, síd. (1995); Eriezner-Degen és mtsai,, I, Bioi, C'fesnr. 261,6972-6985. old, (1986); BD Biosclences Clontech, Pato Alio, eA21. A genornséla különösen alkalmas a inláimány szerinti eljárással asoaosifeti áj szekvenciákkal szcanszódos: szekvenciák azonosítására és izolálására.
S Például ezt a módszer hasznos lehet az új AAV szerotípus ferdített terminális ismétlődésének: 0Tfej Izolálására, a találmány szerinti eljárással azonosítsd új AAV kapszid és/vagy rrp szekvenciák alapján. Ez a módszer hasznos a találmány széria azospsitott: és izolált ntáa AAV és nem ..AAV szekvenciákkal szomszédos szekvenciák Izolálására ss (lásd a 3, és 4, példát).
A találmány szerinti: eljárásokat könnyedén alkalmazhattok különféle epidemiológiai vizsgálatokra,
1Ö hiedsszíribuiriós vizsgálatokra. AAV vektorokkal és más integrálódó vírusokból származó vektorokkal végzett génterápia követésére, ily módon az eljárások jól alkalmazhatók klinikusok. kutatók és epidemoségnsok által alkalmazható előregyártón reagenskészletekhen történd alkalmazásit.
11. Diagnosztikai resgenskészteí
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya diagnosztikai magéoskészlet ismert vagy ismeretien adeno-asszociálí vírus (AAV) detektálására mintában. Egy ilyen reagenskésztet 5' és 3' PCR'táncindítók egy első készletét tartalmazhatja, amely specifikus az. AAV n kk nsav-szekvencia szigmuúm régiójára. Más megoldásképpen......vagy ezenfelül .....az itvea reagensfcésJe; tartalmazhatja 5' és 3’ PCRláncínditók egy első készletét, amely specifikus arra a 3.) kb mereíu feagtaensre. amely tartslmazzs a találmány szerinti teljes hosszúságú AAV kapszid sokfeinsuv-szekvenelát (például az AViss és AV2cas láneipditókj,
Adott esetben a találmány szerinti reagenskészlet továbbá mrtalrnazbatja 5’ és 3' láneindhók és/vagy ECRprobák két vagy több további találmány szerinti készletét. Ezeket a. lárscistdítókat és próbákat alkaíomzbújuk a találmány szerint az egyes AAV szerötígüsók szlgmitúm régiójának sz amplifíkalásám, példáid kvantitatív PCR
A találmány iárgyá: képezi továbbá tstótotóy szerinti eljárással detektált AAV azeroílpus azonosítására ésfeagy új AAV ismén AAV-től történő megkülönböztetésére alkalmas: reagenskészlsi. Egy ilyen teagenskészlet továbbá tartalmazhat egy vagy több restrikciós enzimei, AAV szeroiípusok standardjáé, amelyek tartalmazzák a „jellemző restrikciós enzimes emésztési elemzésüket”, ós/vagy más eszközöket a detektált AAV ezerotíposának .a meghatáríjzásám.
Ezenfelül a találmány szerinti reagenskésztetek tartalmazhatnak utasításokat, negatív és/vagy pozitív
31) kontrollt, tartályokat, oldószereket és pufierekeí a minta számára, szinnalúra régiók összefeísonlhasám szolgáló: jelzoabrákat, eldobható kesztyűket, dekontamlnáhfei utasitásokgí, mmíaiblvivö pálcákat vagy tartályokat, és: mlatselókészitési edényeket, valamint bármilyen kívánt reagenst, beleértve tápközegei, mosóreagenseket és koncentrált reagenseket. Az ilyen reagenseket könnyedén kiválaszthatjuk a leírásban ismertetett és a hagy ontáísvosan alkalmazott kooeentráh reagensek közú t. Egy előnyös megvalősitásl mód szerint a mosóreagens izotönlás sócldat, amely fiziológiás pH-rá van puriereíve, mint például: leszfét-pufeeli: sáoldat (PB<), íz dumo* mugeus 7,4 M \aCl-t íaruitnazo PÖS, es koncentrált reagensek és eszközök. Példáid szakember számára nyilvánvaló, hogy olyan reagensek, mint például polietiléu-glikol (PEG) vagy (NH4hSO4 megfelelő lehet, és elvan eszközök, mini például szúró eszközök. Például egy lőö K membránnal ellátóit szúró eszköz koncentrálja a rAAV-h
- π A találmány szériád mgeestósztóek alkalmasak a teláimásy szeriníi eljárások végrehajtására, és biödiaztribúciö, epidennólógia és éj AAV szörotípnsok átviteli módjának fanslmányozására eiaWbes és NHPkbpn.
Ily módos a találmány szerinti eljárások és reagenskészíeték tehetővé teszik vitális célszekvencíák, különösen integrálódod rirális szekvenciák detektálását, azonosítását és izolálását. Az: eljárások és reagesskészletek különösen alkalmasak AAV szekvenciák detektálásában, azonosításában és izolálásába® töriésö alkalmazásra, amelyek tehetnek új AAV szerotipugok Is.
Egy említésre méltó példában a találmány szerinti eljárás: elősegítette klónozott AAV szekvenciák: elemzéséi, és feltárta a provirális szekvenciák heterogenitását kSlöhbözőAlkitokból klónozott fragmensek között, amelyek mindegyike különbözött a hat ismert .AAV sseroripus között, és a variációk többsége a kapsziá lekapó htpervariábiHs régiójában volt található. Az .AAV szekvenciák meglepő divergenciáját megfigyeltük egyedi szövet; forrásokból izolált kiónokban js, mint például egyetlen réznstnígomből származó nyirokcsomóból. Ezt a heterogenitást legjobban az AA\ szekvencia nyilvánvaló evolúciójával magyarázhatjuk meg az: egyedi állatokban, részben a kiterjedt homológ rekombináció minit a korlátozott számú, sgyidöbert fertőző szülőt vitás között. Ezek. a vizsgálatok azt sugallják, hogy a szekvencia evolúciója széles körben elterjesztette a vérest az AAV fertőzés természetes lefolyása sósán, és feltehetőleg „kvázifasok” rajainak kialakulásához vezet, amelyek egymástól a kapszíd hípervariábllls régiójában különbőznek. Ez az. első példa egy DNS-víhss gyors moleknlsris evolúciójára olyan módon, amelyről korábban azt gondolták, hogy csak az tfoíS-vímsokra jellemző.
Számos új AAV szerotipus szekvenciáját azoposltotmk & találmány szerinti eljárással, és a találmány tárgyát képezi ezeknek a szeredpaseknak a jellemzése,
01. Élj AAV szes'otipasok A, Nakteinsav-szekverteiák:
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással azonosított új AAV szerotspusok. nukleinsavssekvsnciái. lásd az !:,, 9-59.. és: 117-120. azonosítószámú szekvenciákat, amelyek hivatkozás útján a ki tanítás részét képezik, lásd még az t ábrát és: a szekvenciglisíáL
Az új AAV? szerotipus esetéhen a teljes hosszúságú .szekvenciát, amely tartalmazza az AAV 5’ ITE-jét,
k.’Pfc/dun, rep géniét és a 3 ’ ITte-jéf, az 1. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be,
A találmány szerinti új AAV szerodpusok esetében a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással Izolált megközelítőleg 3,1 kb hosszúságú fragsnens, Ez a fritgmens tartalmazza a teljes hosszúságú kapszld fehérjét kódoló szekveno iákat és a rep fehérje egészét vagy részletét kódoló szekvenciákat. Ezek közé a szekvenciák közé tanosmak az alább azonosított szekvenciák.
További új AAV szerotipnsíA esetében a találmány tárgyát képezi a kapszid fehérjét kódoló szignálóra régió, Fáidéul a találmány szerbül AAVIO nnkleinsav-szckvenciák közé tartoznak az: 1, ábrán beomtatottak tlásd a íl7. azöimskoszámú szekvenciát, amely 255 bázis hosszúsága], A tetálnsáuy szerinti AAVll nukteístsav-szekvencíák közé tartoznak az l. ábrán benüitatott feNS-szekvenciák [lásd a 118 azonosítószámú szekvenciái. amely 258 bázis hosszúságú}. A találmány szerimi AAV12 nuklemsav-szskversoiak ke te tartoznak az 1. ábrán bemnistott DNS-Szekveneiák (lásd a 119, azönsshószámó szekversciaí, amely 255 bázisból' állj,. A fest ismertetett módszer alkalmazásúval további. AAVIO, AAVll és AAV 12 szekvenciákat: könnyedén azonösííhaienk és alkalmnzhstosak különféle célokra, mist például amelyeket az AAV7~re és más új
4Ó szerotípnsokra ismertetúsfe a leírásban.
Áz L ábrán találmány szerinti ember főemlős (NHF) AAV nubeinsav-stecvenciábit mutatunk be egymás: alá rendezve korábban syitónosságra teáit AAV szemtte^kkal; AAV 1-gyei [6. azonosítószámú szekvencíaj, AÁY2-vel; [7.1. azonosítószámú szekvencia) és AAV3-rsal p, azonoshószámu szekvencia], Esek kosé .m új W szekvenciák közé tartósnak sz alábbi .t táblázatban bemntatoífak, amelyeket a klóitok számával azososítank;
1, Táblázat
AAV cup szekvencia | Rión száma | Forrás | Ssekv. az. s?Am (DNS) | |
W | Szövet | |||
Rh.l | Klón 9 (AA V9) | Rhesus | Szív | 5 |
Rh.2 | Kión 43,1 | Rhesus | MÉN | 39 |
Rh.3 | Klón 43,5 | Rhesus | MLN | 40 |
Rh.4 | Kión 43.12 | Rhesus | MI.N | 41 |
Hh,5 | Rión 43.20 | Rhesus | MÉN | 42 |
Rh.6 | Rien-M M | Rhesus | MLN | 43 |
RfeV | Klón 43.23 | Rhesus | MÉN | 44 |
RAS | Klón 43.25 | Rhesus | MIN | 45 |
R.h.9 | Klón 4a. 1 | Rhesus | Máj | 46 |
Rh.iO | Klón 44.2 | Rhesus | Máj | 59 |
Eh. 11 | Klón 44,5 | Rhesus | Mái | 47 |
Rh.12 | Klón 42. IB | Rhesus | MIN | 30 |
Rb.D | 42.2 | Rhesus | MÉN | 9 |
Rh, 14 | Klón 42.3A | Rhesus | MI.N | 32 |
Rh.l 5 | Klón 42.3B | Rhesus | MÉN | 36 |
Rh.16 | Klón 42.4 | Rhesus | MI.N | 33 |
R.h.17 | Klón 42.5A | Rhesus | MÉN | 34 |
Rh, 18 | Klón 42,5R | Rhesus | MÉN | 29 |
Rh.í9 | Kl0n.42.6B | Rhesus | MIN | 38 |
Rh.20 | Klón 42.8 | Rhesus | MÉN | 27 |
Rh.21 | Klón 42.10 | Rhesus: | MÉN | 35 |
Rh.22 | Klón 42.14 | Rhesus | MI.N | 37 |
Rh.23 | Klón 42.12 | Rhesus | MI.N | 58 |
Rb.24 | Klón 42.13 | Rhesus | MÉN | 31 |
Rb.25 | Klón 42.15 | Rhesus | MIN | 28: |
Rh.26 | Klón 223.2 | Rhesus | Máj | 49 |
Rh.27 | Klón 223.4 | Rhesus | Máj | 50 |
Rh.28 | Klón 223.5 | RlifiSoá | Máj: | 5.1 |
Rh.29 | Klór· 223.6 | Rhesus | Máj | 52: |
Sb.30 | Klón 223.7 | Rhesus | Máj | 53 |
Rh.3i | Klón 223.10 | Rhesus | Máj: | 48 |
-13:-
Rh.32 | Klón Cl | Rhesas | Lep, Duódén®!®, Vese, Máj: | 19 |
Rh.33 | Klón €3 | Rhesus | 20 | |
Rh.34 | KlónCS | Rhcsas | 21 | |
Rh.35 | Klón El | Rhestís | Máj | ·>··> X»«y |
RbJó | Klón F3 | Rhesus | 23 | |
Rb.37 | Klón E5 | Rhesns | 24 | |
CyJ | Kiön 1.3 | Cyno | Vér | 14 |
Cy.2 | Klón 13.3B | Cyno | Vér | 15 |
CyJ | Klón 24,1 | Cyno | Vér | ........ 16..............: |
CvA | Klón 27 J | Cyno | Vér | 17 |
Cy.5 | Kién 7,2 | Cyno | Vér | 13 | |
Cy.6 | Klón 16,3 | Cyno | Vér I 10 | |
bb.í | Klón 29. 3 | Pávián | Vér | 11 |
bb,2 | Klón 29,5 | Pávián | vér | 13 |
cii | KiőnAÜJ | Csimpánz | Vér | 57 |
Ch.2 | Κ1όπΛ3.4 | Csimpánz | Ver | .54 |
Ch.3 | Klón A3.5 | Csimpánz | Vér | 55 |
CM | Klón A3.7 | Csimpánz | Vér | 56 |
Egy új 'WO* kiónt allitöttank. éld két: csimpánz adenövírus kapszid: feagmensaek AAV2 «?ρ konsímkeióba történő beillesztésével:. Ezt az áj klósí, az ÁS.bet: Cb,5-sék is nevezzük [28, azonosítószámú szekvencia]:. Ezenfelül a találmány tárgyát képezi két humán AAV szekvencia is, amelyeket H6-sak [25, azosositdszátnú szekvencia] ás 02-®ek pb. azonosítószámú szekvencia] nevezünk.
A találmány szerinti AAV szekvenciák tartalmazzák az a további szálat is, amely komplementer az 1. ábrán es a szekvescjahslában banomtötr szál szekveaciáfával p., 2-52, 1í 7-i:2Ö:. azonosiiaszánm szekvenciáid, tníklelssáv-szekvesciák, valamint RbíS és cDNS szekvenciák, amelyek megfelelnek az 1. ábsásr és a szekveaci&hstában bemutatott szekvenciáknak [í,, 9-59, 117-128, azönosilnszáiná szekvenciáid és azok komplementer szálainak. A: táiálsnány szerinti üúfelélnsáv-székvenciák közé tartóznak az 1, ábrán és a szekveoci&listában bemmstott szekvenciáknak {;L, 9-59, 117-128. azsoosltöszánfe székvenelakj és azok templememer szálainak természetes variánsai. Az ilyen módosítások közé tartoznak példán! a szakterületen ismert jelölések, metilálás, és egy vagy több természetben eloferdaló nnkfemid. szubsztitúciója. degeneráh nnkleodddal.
Ezenfelül a találmány tárgyát képezik olya® sukteissav-szekvensiák, amelyek: több mini 85%-htm, előnyösen legalább körülbelül 88%-han, előnyösebben legalább körülbelül 95%-ban és legelőnyösebben legalább körülbelül 98-99%-han azonosak a találmány szerinti szekvenciákkal, beleértve az 1, ábrás és a szekveiKialistáfean bemutatott szekvenciákat [1,9-59,117-128. azonosítószámú szekvenciák]. Ezen kifejezések jelentése a leírásban áétlnlált.
A találmány tárgyéi képeztk a találmány szerinti eljárással azonosított új AAV szekvenciák iragatensei is, A megfelelő feagmensek legalább 1$ nakíeotíd hosszúságnsk, és fenkcíooális impotensek, azaz biológiáikig jelentős íragmensek. Egy megvalósítási mód szerint ezek a feagmensek. az 1. ábrán és a szekvencialisiáhsn
Ηbemutatott: Szekvenciák (1., 9-59,117-Ί2&, azonosbészámú szelreeuciák], azok kompfeotsmter szálakeöNS-ei és az azokkal kompletnemer RNS-ek feagmensei,
A megfelelő iragmensek példáit azok AAVl, AAV2 vagy AAV? szekvenciáját}· belüli elhelyézksdesével á$afc meg- Azonban a találmány szerihti egymás alá rendezés aíkaltöszásávsl (amelyet a OMő/ W program és az alapértelmezett beállítások alkalmazásával kaptunk), vagy a találmány szerinti aj szerotipnsekkal való egymás alá rendezés előállítására szolgáló hasonló módszerekkel a szakember könnyedén szososhbstja a. kívánt feígmsnsék start és stop koáonjaít.
A megfelelő feagmenssk közé tartoznak az AAV kapszid három variábilis fehérjéjét (vp) kódoló szekvenciák, amelyek alternatív splieíng variánsok; vpd (például a 825-3849, nskleoóöok az AAV7-ben, 1,
IS azonosítószámú szekvencia]; vp2 [például uz 1234-3849, stukléobdok az AAV7-ben, 1, azonosltőszsmd szekvenciaj; és vp3 [például az 1434-3049. unkleotídok az AAV7-bcu, 1, azonosítószámú szekvencia], Megjegyzendő, hogy az AAVT-beu a szokatlan GTG síartfcödon található. Néhány háztartási gén kivételével nem számoltak be korábban ilyen stertkodos jelenlétéről DNR-vírttsokban. A lobbi AAV szehóttpx® vpl, vp2 és vp3 génjének Aartkodonjaíről ágy gondolták, hogy olyanok, amelyek lehetővé teszik a gazdasejf celluláris neduom n-ramah Ixzsaspt v >2 o- spí i,'v jakét 10 - ?<ν λ >>- ,i g- ju’fc innak crdefebe’' logv lehetővé tegye a virion hatékony összeállúásá· Azonban az AAV virionról azt találtuk, hogy hatékonyan összoállittxhk még ezzel a ritka GTG startkodotmal ts. Ily módon ágy érezzük, hogy kívánatos a többi AAV szerotlpaa vp3 staríkodonjáuak a megváltoztatása, hogy ezt a ritka GTG startkodont tartalmazza, annak érdekében, hogy jafetsuk a pakolódás hatékonyságát, megváltoztassuk a virion szerkezetet és/vagy megváltoztassuk a többi AAV szerotipnsbas az epitöpok (például semlegesítő ellefssnyagok eplíópjainak) elhelyezkedését, A shutkodonokat hagyosnáuyoS: technológiák, mórt példánl helyspeetbkss amíagenezis alkalmazásával változtathatjuk taeg, öy mádon a laláfesány tárgykörébe tartoznék bármilyen szerotípusú wgváltoztatet: AAV vadonok, amelyek GTG-re változtatott síartködommí rendelkező vpA-feót és/vagy adott esetben vpl-bol es/vagy vp2-völ állnak,
Az AAV más megfelelő feagmensei tartalmazzák az: AAV kapszid fehérje startkodoojáí {például a 4683098, nukleotiáok az AAV?-ben, I. azonosítószámú szekvencia, 725-3898, nukfeorídőkaz AAV7-ben, 1. azono sböszánm szekvencia, és a megfelelő régiók a többi AAV szerotípssbas]. Az: AAV7 és a találmány szerinti eljárásokkal azonosított többi új AAV szerodpus még további feagmensei keze tartoznak a rep fehérjéket kódolok, ndat például a rop?k fpéldául a 334, nakleofedaál lévő inieiáetóskodon az: 1. ábrán az AAV7 esetében), rvp 68 [a 334. nukfeoíidnál lévő ímcsáeíö» kodon az I, ábrán az AAV? esetében], rep 52 :{az IbOő, núkleoíiduál lévő Inieiáetós kodon az I, ábrán az-AAV? esetében] és rop 48 [az 1Ö06. mikleoíídnál lévő irnciáeíős kodon az 1. ábrán az AÁV? esetében], Más jelentőséggel bíró íragroensek közé tartoznak az AAV 5' ferdifett terminális ismétlődések Sz ITR-ek [az 1-:107. nukleotid az 1. ábrán az A.AV7 esetében];: az AAV 3’ ITR-je [a 4704-4721. nukleotid az í. ábrán az AAV? esetében], Ρ19 szekvenciák, AAV 848 szekvenciák, a rep-kötö hely, és a terminális feloldási hely (TRfe):. Még más megfelelő feagmeusak nyilvánvalóak a szakember számára. A találmány szerinti lobbi új szerodpns meg felelő regiéit könnyen tneghaíarözhatfek az I, ábra alapján, vagy hagyományos egymás alá rendezési módszerek alkalmazásával a leírás szerinti szekvenciák segítségével.
Az ábrákon és a szekyenejaiístában megadott nuklehtssv-szekvenciák mellett a feiálíaáay tárgyát képezik olyan nuklemsav-mofekulák és szekvenciák, amelyeket a találmány szormti AAV szerotiptrsok aesmosav-szekveseiáíutdí, fehérjéinek. és pepsldjsinek. expresszáltatasára terveztünk, ily módon a találmány
- 15 tárgyát képezik olyan nuklelnSav-szekveíieiák, amelyek az alábbi új AAV aminosltv-szekvéríclákat kódolják: C ί [60. azonosítószámú szekvencia], C2 [61, .azonosítószámú szekvenciái, €5 (62. azonositószásnú szekvencia], A3-3 [66, azonosítószámú szekvencia], A3-7 [67. tizonosítoszátnú. szekvencia], A3-4 [68. azonosítószámú szekvencia j, ,V-5 [fok azonosnószane szeksersaa . Vb ,62 uzonosíms/amn s/efo énein;, ??V A3 azoixjsíiószámú szekvencia], 223-5 [74. azonositószámó szekvencia], .223-10 [75. azonosítószámú szekvencia]., 223-2 [76, azonosítószámú szekvencia], 223-7 (?7. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78. nzoimsltószántú .szekvencia], 44-1 [79. azonosítószámú szekvewM 34-5 [80. azonosítószámú szekvencia]:, 44-2 [81, azoriosítószámú szekvencia], 42-15 (84- ;móxiofoószámú szekvencia]:, 42-8 [SS, azonosítószámú szekvencia], 4213 [86. szorsositúszámú szekvencia], 42-3A [87. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88. azonosítószámú szekvencia], 42-SA [89, azonosítószámú szekvencia], 42-1B· [98, azonosítószámú szekvencia], 42-5B (91. ;szonoskóssánxú .szekvencia], 43-1. [92. azeníísiisszánrú szekvencia], 43- i2 [93. .azcáiosúószarnú szekvencia], 435 [94, íOíonosúószámú szekvencia], 43-2.1 [96. azonosítószámú, szekvencia],. 43-25 (97, azonosítószámú szekvencia], 43-20 (99. azonositószámú szekvencia], 24.5 [101, azonosítószámú szekvencia], 42.2 [102. azonosítószámú szekvencia]:, 7.2 [103. azonosítószámú szekvencia]. 27.3 [184. azom-sítószamú szekvencia],
IS. 16.3 [105. azonosítószámú szekvencia], 4248 [106. tizoansífoszámú szekvencia], 42-313 [107. azonosítószámú szekvencia], 42-11 (188. azonosrtósziírnú szekvencia], FI [189. azonosítószámú szekvencia], F5 [110. azonosítószámú szekvencia], F3 [II1. azonosítószámú szekvencia], 42-68 [112. azonosítószámú szekvencia] és/vagy 42-12 [113, azonosítószámú szekvencia], és mesterséges AAV szerotigusofe, amelyeket ezeknek a a szekvenciáknak és/vagy egyedi iragsnenseiknek az alkalmazásával álíitoítonk elő.
A leírás szennti értelemben a mesterséges AAV szokteneía aem kerláfozó példái kiszé tartozik a természetben nem előforduló kapszid tehéné· tartalmazó AAV. ilyen mesterséges kapsztdoí bármilyen •megfeleld módszenei elóúlkfeúmk, találmány szerion. ns A kV szekvencia alkalmazásával [például a vp-1 krw fehérje fragtneasévelK «gyútt olyan heteroíóg s/ekvuKiakkal, amelyek egy másik AAV szerotípushól όντ értnél vagy újbóli, ugyanannak az AAV szerotípn-n.?k nem ósszetuggó részlcteibói, nem AAV virális forrásból vagy nem \ iráíis: forrásból állíthatók eió, Egy mesterséges .AAV szeroilpus sem korlátozó példaként lehet kiméra AAV kapszid, rekombináns AAV kapszid vagy „hnínanizúií'’ AAV kapszid.
B, AAV aminosav -szekvenciák, fehérjék és peptidek
A találmány tárgyát képezik olyan fehérjék és azok iragtnensei, amelyeket a találmány szerinti új AAV szeroiipusok nukleinsav-szekvenciáí kódolnak, mim például az AAV7 [a 825-3849. nukleoíidok az AAV7-ixín,
1. azonosítószámú szekvencia] és más találmány szerit?·! új szerotíptisok. Ily módon a találmány szerinti új szermipusok kapszid fehérjéi. mint példán! a H6 [25. azonosítószámú szekvencia], H2 [26, azonosítószámú szekvencia], 42-2 [9, azonosítószámú szekvencia], 42-8 [27. azonosítószámú szekvencia]:, .421-4.5 [2.8. azonosítószámú szekve?mía].: 42-50 [29, azonosítószámú· szekvencia]:, 42-lb [30. azonosítószámú szekvencia]:
42- 13 (31, azonosítószámú szekvencia], 42-3» [32, azonosítószámú szekvenciái, 42-4 [33, azonosítószámú szekvencia], 42-5a [34. azonrtsífoszfoná szekvetteia], 42-10 [35. azonosítószámú szekvencia], 42-3b [36.
azonoshószátsú szekvéncis]:, 42-II [37, azonosítószámú szekvencia], 42-60 [38, azönosífoszántú szekvencia],
43- 1 [39. :aáonositö$zámú szekvencia], 43-5 [48. azoitosítószámú szekvencia], 43-12 (41, szooosltóssániú .szekvencia], 43-20 [42, azonosítószámú szekvencia], 43-21 [43, aMtósííúszámá. szekverteta]:, 43-23 [44. azonosítószámú szekvencia], 43-25 [45, azonosítószámú szekvencia], 44.1 [47. azonosítószámú szekvencia],
44.5 [47. azonosítószámú szekvencia], 223.18 [48. azonosítószámú szekvencia], 223,2 [49. azortpsitószánfo wteftökl, 223.4 [58. aammhtetaú szekvencia], 223.5 (5L azonosítószámú szekvencia], 223.8 [52, azonoshószámú szekvencia], 223.7 (53. :ason.oshösz;lmú szekvencia), A.3,4 (54·. azonosítószámú szekvencia], A3.5 [55. azonosítószámú szekvencia], A3.7 [36. azonosítószámú szekvencia], A3.3 [57.. azonotfiíószámú szekvencia], 42.12: [58, azonosttószájnú szekvencia];, and 44.2 [39, azonosítószámú szekvencia], könnyen eiöállíthatók hagyományos módszerek alkalmazásával a fent felsorol klonok nyót leolvasási fázisaiból.
A találmány tárgykörébe tóreezuak továbbá a találmány szenna áj A.W szeroúpusok szekvenciáinak alkalmazásával előállított AAV szereíípasok, amelyeket szintetikus, rekombínáss vagy szakember számára ismert más módszerekkel állítottunk dó, A találmány nem korlátozódik a találmány szerinti új AAV tHikfeinsav-szekverteiákfói expresszálodó új AAV aminosav-szekvéHeiákra, pepíidekíe és feltésjékre, btnetst a szakterületen ismert: más eljárásokkal, mint például kémiái szintézissel, más: szintetikus módszerekkel vagy más eljárásokkal előállított tmnnosay-szekveneiák, fehérjék és peptidek is a találmány tárgykörébe tartoznak. Béldání a Cl [88. azonosítószámú szekvencia], C2 [61. azonosítószámú szekvencia], €5 [82. azormsiiószámá szekvenciái, Ά3--3 [68, azonosítószámú szekvencia], A3-7 [67,. azonosítószámú szekvencia], A3-4 [68.. azonosítószámú szekvencia]:, A3-5 [69. azonosítószámú szekvencia), 3.3b (62, azonosítószámú szekvencia]:,
223.4 (73.. azonosítószámú szekvencia), 223-5 [74. azonosítószámú szekvencia]:, 223-10 [75. azonosítószámú szekvencia], 223-2 [78. azonosítószámú szekvencia], 223-7 [77. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78.. azonosítószámú szekvencia]:, 44-1 (79. azonosítószámú szekvencia], 44-5 [8:8, azonosítószámú szekvencia], 44-2 (81, azoBíísitószánrú szekvenciái:, 42-15 (84, azonosítószámú szekvencia), 42-8: (85. azonosítószámú szekvencia], 42-13 (86. azonosítószámú szekvencia], 42-3A [87, azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88.
azonosítószámú szekvencia], 42-5A [89, azonosítószámú szekvencia], 42-lS [98, azonosítószámú szekvencia], 42-513 [91. azonosítószámú szekvencia], 43-1 [92 a/ono^tószhnú szekvencia]. 43-12 [8?. azonosítószámú szekvencia], 43-5 [94. azejmsiíöszámá szekvencia] 43-21 [<«\ azonosítószámú szekvencia], 43-25 [97, azonosítószámú szekvencia], 43-26 [99. azonosítószámú szekvencia], 24.1 [181. azonosítószámú szekvencia], 42.2 [182, azonosítószámú szekvencia], 7.2 [183 Azooositösramú szekvenciái, 27.3 [184. <teesmsító«zámú szekvencia]:, Í6>3 [Iö5>: azsnositószáutó szekvencia], 42.18 [188, azonosítószámú szekvencia]:, 42-3B [187. azonosítószámú szekvencia], 42-11 [188. uzouosuoszamu szekvencia], FI [189, azonosítószámú szekvencia], F3 [116. azonosítószámú szekvencia), F3 [Ili. azonosítószámú szekvencia], 42-6S (1 12. azonrsshőszámú szekvencia) estoagy 42-12 fi 13. azonosítószámú szekvencia) szekvenciák: líármelyikeí könnyedén etösíhthsíluk kúiöntéle módszerek alkalmazásával.
Alkalmas előállítási módszerek jól ismertek,a szakember számára [lásd például Sambrook es mtsai., .Jkiolecular Cíonsng: A Laboratory Msnnaf. kiad: Cöld Spring Barbor Press, Coki Spríng Harbor, 8ÍY). Más megoldásképpen pepiidékor, megsxintetizál.hanmk a jól ismert peptidsziatózis-eljárások alkalmazásával is [Merrificíá, J, Am. Chem. Sec. 85, 21492149. old, (1962):; Síetvart és Vömig, ,,Sohd Pltase Pepííde ővníhesisA 27-62. old., kiad.: Freeman, San Francisco (1869)], Ezek ás más alkalmas előállítási eljárások a szakember számára ismertek, és nem korlátozzák a találmányt.
Különösen előnyös fehérjék közé tartóznak .sz AAV kapsziá fehérjék, amelyeket a fent említeti svkfcoíid-szekveneiák kódolnak. Több találmány szerinti kapszaí ichójjv s/ekveneieytt bemutatjuk egymás alá rendezve a 2, ábrás és/vagy a szekvmtclalistábíUt [2, és 66-115 azonosítószámú szekvenciák), mnslyek hivatkozás útján a kitanitás részér képezik. Az AAV kapszíd háromféle: febériéböl áll, a vpí, vp2 és vp.3 fehérjékből, amelyek alternatív splieing variánsok. Az ábrákon bemutatott teljes hosszúságú szekvencia a vpl szekvenciája. Az AAV? kapszid szekvenciája; (2, azonöritószáísú szekvencia) alapján a vp2 szekvenciája az .AAV? 138-737. ammosavait öleli föl, és a vp3 szekvenciája az AAV7 2Ö3-737. amínosavah öleli föl. Ezen irsformáció alapján a szakember könnyen sneghatározhatju a yp2 és vp3 fehérjék elhelyezkedését a találmány szerinti töfefer új szemtlpm esetében.
A kapszid fehérje rós előnyös. fehérjéi és Íragmensei közé tartoznak az állasdú és variábilis régiók, amelyek a hipereariábilis régiók íl-IPVj közön és magukban a ílPV szekvenciákban találhatók. Az AAV2 divergens szekveneiaterületeinek megha-ározására kifejleszted algoritmus 12 hiperv&nab-bs régtót (HVR) eredményezett, amelyek kezel 5 átfedő vagy része a korábban leírt: négy hipervariábiíís regien, k {Chiorini és mtsai,, X Vhol. 73, 1309-1319. föld. (1999); Rulledge és mtsaí, I. Víroí 72, 3Ö9-319. dd.}. Ezen algoritmus ctóvagy a leírásban ismcítetett egymás alá rendezési módszerek alkalmazásával meghatározzuk az áj AAV szerollpesok klVK-jest. Például az AA.V2 vpl [70. azonosítószámú szekvencia] számozása alapján a HVR-ek az alábbi módon helyezkednek eh íiVfti, 1^6-152. anúsosavafe; HVR2. 182-1.86, ámmosúvak; 1-1VR3, 262-204, annnosavah; HVR4, 361-383. aminosavak; HVR5, 450-474. aminosavak; HYRií 490-495; mmoossvak; BVR7, 500-504, aminosavak; .HVR8, 514-522, aminosavak; HYR9, 534-555, aminosavak: HVRIQ, 581-594, aadaosavak; BVRls, 658-662. aminosavak; és BVR.I2, 705-719. sminosavak, A hagyományos módszerek szerint elkészíted egymás alá rendezés és a találmmsy szerinti új: szekvenciák, (lásd például a 2. ábrát] alkalmazásával könnyeden meghaíámshaíjnk a. HVR elhelyezkedéséi: a találmány :szerln|j új AAV szeroripusokban. Például a 2, ábra alkalmazásával, meghatározhatjuk, hogy az: AAV7 [2. azortositószántú szekvenciái esetében a HVR2 a 146-152. aminosavaknál helyezkedik el; a tíVR2 a 182-187, ammosavaksál helyezkedik el; a BVS3 a 263-266. ashnösavaknál helyezkedik el; a 14VR4 a 383-385. aminosavakoúl helyezkedik eh a BVR5 a 451-475. aminosavaköál helyezkedik el; a MVRö a 491-496, amirtösavaksái helyezkedik el; a HVR? az 5:01-505. amlsosavaknál helyezkedik el; a BVS.8 az 513-521. aminosav&ksál helyezkedik eh 11VR0 az 533-554, .aminfösavaknál helyezkedik el; a BVR.10 az 583-596. antmosavaknál helyezkedik el; « HVR 11 a 660-669. amlnösavaknál helyezkedik el; a HVR 12 a 707-721. msinossvskhái helyezkedik el, A leírás szerinti Inlbrtuáció alkalmazásával a többi találmány szerinti ej szerotipus fíVR-jót is könnyen meghatározhatjuk.
Ezenfelül & kapszldbaa azonosság! ammosav-kazettákaf azonosítottunk. Ezek a kazetták különösen jelentősek, mivel hasznosak mesterséges szerotipusok létrehozására, például egy kiválasztoh szerotipus HV R1 kazettájának kicserélésével egy másik szerotipus: HV.Rl kazettájával. Ezen azonosság! kazetták némelyikéi bemutatjuk a.2. ábrán. A 2, ábrán......amelyen a C/móri A egymás alá rendezést mulatjuk be......egv számskálát mutatunk :be a szekvenciák alatt az eriö oldailanc 1. pozielőjáföl kezdve. Á. számskála felest; vonalat alkalmazzuk az érésért konzervált pozieiők: bejelölésére, Bárom karaktert (*, : , , 1 alkalmazunk, Á ,,*w jelöli azokat a pozíciókat, amelyeken egyetlen, teljesen konzervált oidálkme található. A,,;” jelöli azt, startkor egy „erős’' csoport teljesen kostzervák. A,,,” jelöl; azt, amikor egy „gyengébb” csoport teljesen konzervált. Ezek mind pozitív értékű csoportok, amelyek jelen vannak a „Bennet PatóSÖ” mátrixban. Az erős csoportokat >0,5 erős értékkel definiáljuk, és a gyenge csoportokat <0,5 gyenge értékkel definiáljak.
Ezenfelül az AAV kapszid más: alkalstas: íragmensei közé tartoznak.....az AAV 2 Í70. azonosítószámú szekvenciái számozása alapján — a 24-42. aminosavak; 25-28. aminosavak; 81-85. aminosavak; 133-165, sssluússvsk; 134-165. suüaosávak; 137-143, auunesavúk; 154-156. aminosavak; 194-208. ammosarak, 261274. anúnosayak:;: 262-274. aounosavak; 1.71-173, amiuossvak; 413-417, aminosavak; 449-478. aminosavak;
-18 494-525. anmtősavak;: 534-571, amlaosavsk; 581-őöl, sminosavakt 660-671. aminösavafo 709-723, ammosavak. Még további előnyös iragmensek közé tartoznak például az ÁAV7-ben a 2:. azonosítószámú szekvcncia 1-184. ammosavai; 179-259, aminosavaí; 274-259, aminosavaí; 603-259. armnosavaí; 67Ö-7Ö6. íusinossvak 724-736. átuinesavai; 1.85-198. asibsosavak 260-273, aminosavaí; 447-477, nannossvaí;, 447-662.
amínesavai; 666-659. ammosavat; és 707-723. amirmsaval. Még további előnyös régiók: -az. ÁAV7 (2. azonosítószámú szxAvencia] számozása alapján az alábbiak bármelyike; 185-198. aminosav-ak:; 2641-273. amlnosavak; 447-477,, ammosavak; 447-662, anrinosavsk; 660-669. ajninosavak; és 707-723. amísosavak. A leírás szerinti, idtoíré X program alapértelmezett beállításaival elkészített egymás alá rendezés alkalmazásával vagy kereskedelmi forgatómban vagy nyilvánosan beszerezhető egymás alá rendezési programok alapértelmezett
1*3 beúliüásamak az alkalmazásával a szakember könnyen meghatározhatja a találmány szerinti: új AAV kápszídok megfelelő ffagínenselt.
Más előnyös fehérjék az AAV r-φ fehérjék (az 1-623. aminosavak az AAV'7 3, £monnsítószám.ú szekvenciája szerint] és azx?k hmkc tonális fragmonsei, odúi például a 3, azonosítószámú szekveseín 1-171, ammossvai, 172-372. iutunosavai, 373-444, aminosavai, 445-623, aminosavak Megfelelő módon az ilyen
Iragmensek legalább: 8 amtoosay hosszúságúak, lásd a 3. ábrát. Összeh&sonlhhstó régiókat azonosithatunk a találmány szerinti többi új AAV fehérjében, a leirá» szerinti módszerek és a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Ezenfelül könnyedén a&slmazfeamak más kívánt hosszúságú fragmenseket is, Ilyen ftagstenseket rekombinánsan vágy más alkalmas módon úllíthatsmk elő, példán! kémiai szintézissel.
Találmány szerinti szekvenciákat, fehérjéket és fragmenseket bármilyen alkalmas módon állíthatunk
2.0 elő. például rekordbínáns termeléssel, kémiai szintézissel vagy más szintetikus módón. Áz Ilyen előállítási eljárások a szakember számára ismertek, és nesn korlátozzák a taláhnányt.
IV, lfj AAV kapszidot tartalmazó rAAV előállítása
A találmány tárgyát a találmány szerint azonosított új vad típusú AAV szerotípnsok képezik, amely vad dpusú AAV szeroíípasok szekvenciája nesn tartalmaz olyan DNS-t és sejtbeli anyagot, amellyé! ezek a vírusok kapcsolóiban állnak a termeszeiben. Egy másik megvalósítási snód szerint a találmány tárgyát olyan molekulák képezik, amelyek a találmány szerinti új AAV szekveaeiákaí......beleértve azok fragínenseit......alkalmazzák heterolög gén és más nakleinsav-szekveneíák eé'isepbe történő bejuttatására alkalmas molekulák előállítására.
A találmány szerinti, találmány szerinti új AAV szeroüpasok szekvenciáit tartalmazó molekulák: közé tartózik bármilyen olyan genetikai elem (vektor), amely bejuttatható gazdasejtbe, példáid csupasz DN S, piazmíd, ing, transzpozojí, kozmid, episzönia, aess virális bejuttató eszközben (példáid hpid-alapú hordozóban) található fehérje, vírus, stb., amely átviszi a rajta, hordozott szekvenciákat. A kiválasztott vektort bármilyen alkalmas eljárással bejuttathatjuk, beleértve: a imnszlekcíot, elsfcmoporáelőó hposzömás bejuttatást, msmbránfúziós módszereket, DNS-sel bevont nagysebességű sörétet, virális fertőzést és protoplaszt fúziói, A találmány bármelyik megvalósítási módjának előállítására alkalmazott eljárások ismertek a rsukleíssav-manipuláeiö területén járatos szakember számára, és ezek közé tartozik a génsebészet, .rekombináns manipuláció és szintetikus módszerek [lásd például Sambrook és mísai., ,A4o!eeular Cloning: A. Eaboraiory h-hmaul, kiad: Cőld Sprisg, Harbor Press, Cold Spring Hat-bor, NVj.
Egy megvalósítási mód szerint: a találmány szériád vektor a találmány szériád új AAV kapszidot [például AAV? kapszidóf, AAV 44-2 (rh.lS), AAVlö kapszidot, AAVíl kítpszidol, AAV 12 kapszidot], vagy
-19ezea AAV kapszidok kozni egyet vagy többet kódoló szekvenciákat tartalmaz. KW' ruegoláásképpeö a vektorok magát: a kapszld fehérjét, vagy aaask a feagínensét tartalmazhatják.
Adott esetbe» a találmány sxerisői vektorok AÁV rop fehérjéket kódoló szekvenciákat tartalmazhatnak. Ilyet? fep szekvenciák szártsazhatnak ugyanabból az .AAV .szerotípasböi, mint amelyből a c«p szekvenciák származnak. Más megoldásképpen a találmány tárgyát olyan vektorok képezik, amelyekben a rep szekvenciák olyan AAV szerotipasokbcl sBámazssk, amely különbözik azoktól, antelyekbol a ctg? szeksx;scíák számtaznak. Egy meg\ alósitásr ntöd szerit! t a rop és eap szekvenciákat: különbőzé ibrrásokból (például különálló vektorokról:, vagy gazdasejtböl és vektorról) eypresszáhatjak. Egy másik megvalósítási mért szerint ezeket a ?vp szfikvenciákat ugyanarról a íosrástól expresszáítatmk, mint a épp szekvenciákat. Ezen megyalősllási mórt szeri® a rop szekvenciákat fázisban fozionöitntnatjnk különböző AAV szerotspus épp szekvenciáival, fciméra .AAV vektort létrehozva, Adott esetben a találmány szénán vektorok továbbá minigént is tartalmasamat amely egy kiválasztott Eanszgént tartalmaz, amelyet 5’ AAV 1TR és 3’ AAV ITfe szekvenciák szegélyezitek.
ily módon egy megvalósítási mód szermi a találmány szerinti vektorok intakt .AAV kapszklot kódoló nnkletnsav-szekveneiákat tartalmaznak, amelyek. egyetlen AÁV xzeroíspasból (például AAV? vagy másik áj
15' .AAV xzeroíipnsból) származhatnak. Más megoldásképpen ezek a vektorok olyan mesterséges kapszidot kódoló szekvenciákat tartalmaznak, amely az AAV7 (vagy másik: új AAV) kapszírt egy vagy több Ssgmettséi heteroióg AÁV vagy nem AAV kapszid teltériéhez (vagy annak feagmensehez) feziosálttüva tartalmazzák. Ezeket a mesterséges kapszid lehósjéket az AAV? (vagy másik új AAV) kapszid nem ÖsszertíggS részletéből vagy más AAV seeroilpusok: kspszidjaiböl választják kí. Például kívánatos lehet az AAV vpl egy vagy több kódoló régiójának a módosítása, például egy vagy több hipervaríábilis régióban (azaz a BPVÍ -12~feen>, vagy a vp2-é es/vagy a νρ'3-é.. Egy másik példa szerint: kívánatos lehet a vp3 fehérje startkodonjái megváltoztatni GTG-re. Ezeket a módosítások® az expresszié, kitermelés növelésére végezhetjük, vagy a tisztítás javítására a. knaL-niod. extj’e''s’ios rends/e-ber vgv m<H ks$ «t „elool 'pe^u a rtopt unt4' nug>.<b<.vUía.\dn< ny, , semlegesítő ellenanyag epstópjaínak megváltoztatására).
A találmány szerinti vektorok— példáid egy plszmid — különféle célokra alkalmasaik, de kaiőnőses jól alkalmazhatók AAV szekvenciákat vagy azok feagmenselt tartalmazó rAAV előállítására. Ezek a vektorokat .....beleértve az rAAV-s......, az elemeiket, előállításukat· és alkalmazásukat részletesen ismertetjük a leírásban.
Egy megvalósítási mód. szerint a találmány tárgya -eljárás AAV? szetötípusé (vagy egy másik új AAV) kagsziddal vagy annak egy részletével rendelkező rekombináns adeno-asszoeiált vírus (AAV) előállítására. Ilyen eljárás: szerint olyan gazáasejW tenyésztünk, amely az alábbiakat kódoló nnkiemsavaí tartalmaz: adenoasszóciált vírus (AAV) 7-es szerötlpnsó (vagy másik új AAV) kapszid: fehérje, vagy annak fragrnense, amint a leírásban definiáljuk; möködöképes rep gén; mínigén, amely minimálisan: AAV feid&it fertstmáfe ismétlődésekből (ITR) és egy íranszgénböl áll: és elégséges segíts funkciókat, amelyek lehetővé feszik a minigén pakolását az AAV? (vagy másik áj .AAV) kapszid fehérjébe.
Az AAV mmigóanek AAV tetpszklha történő pakolásához szükséges, a gazdssejtben tenyésztendő komponensek transz helyzetben leijeinek: a gnzdasejtben. Más megoldásképpen a szükséges komponensek (például mimgém re/? szekvenciák, eap szekvenciák, és/vagy segltS femkelók) bármelyikét vagy többet is egy stabil gazdasejfben biztosíthatnak, amelyet gémsebészeti úton ágy módosítottnak, hogy tartalmazzon a szükséges komponensek közül egyet vagy többet a szakember számára ismert eljárások, alkalmazásával, Legalkalmasabb,
4Ö ha az ilyen, stabil gazdasejt a szükséges komponensíeklef indukálható proreoter szabályozása aktit: tartalmazza,.
- 20 AsKHtfeaa a szükséges komponenst eks állhatnak konstitutív promóter szabályozása akit is. Az alkalmas indukálható és konstitutív protnőtor-A poklait bemutat?A a leírásban, a trauszgénnei alkaimasbató szabályozó ©femeket tárgyaló észben. Egy még másik megvalosí-ásí mód -szerint, a kiválasztott gaztlaselt tartolmazhat kiválasztott kotoponessfekfet egy konstitutív promóter szabályozása alatt, és más kiválasztott tesgymens(ek)et egy vagy? több irtoukáiható promóter szabályozása alatt, Például elöállitbatuuk olyan stabil gazdasejteí, amely 293-áS: sejtekből (amelyek El segítő fenkclőt tartalmaznak konstitutív promóter szabályozása alatt) származik, de amely a rep és/vagy <w fehérjéket indukálható promötensk szabályozása alatt tartalmazza, A szakember még további stabil gazdasejteket is előállíthat.
A találmány szerinti rAAV elbállltásétez szükséges mmigém, rep szekvenciákat, esp sxtátoettctákaf és
El seghé funkciókat bármilyen olyan genetikai elemmel bejuttathatjuk a pakoló gazdasejtbe, amely átviszi a rajta hordozott szekvenciákat. A kiválasztott genetikai elemet bánrülyeíi alkalmas eljárássá! bejuitalhatjuk, mist például a leírásban tstnertelettokkel, A találmány bármelyik megvalósítási módjának előállítására alkalmazott ellátások ismerték a uukleíusav-matupaláciő területén járatos szakember szarnám, és ezek közé tartozik a génsebészet, rekemhisáas mamptdació és szintetikus módszerek (lásd például Sambrook és mtsaí., ,2döfeouiar
Cloning: A Láborattay Mádnál”, kiad: Goid Spring Harbor Press, Cöld Spring ilsrfeor, bí¥l, ífasoalóképpsm rAAV vsrionok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek, és az alkalmas eljárás kiválasztása rém korlátozza a találmányt [lásd például K. kisbér és mts;n„ I. ViroL 78» 528-532. old. (198.31 és az 5 478 745. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat].
A. A minigén
A tninigén minimálisan a íranszgénhöl és a szabályozó szekvenciáiból» és az 5’ és 3’ tbrdítotí terminális ismétlődésekből (FfK) áll, A mimgép az, ami a kapszid fehérjébe pakolódik, és bejut a klvájászíótbgazdasejtbe, í. A trattszgen
A transzgén olyan uuklemsav-szekveneia, amely heterolog a ttanszgéttt szegélyező vektor ssekvensiákfeez képest, és amely jelentőséggel btró polipeptidet, fehérjét, vagy más terméket kódol. A nukfeinsav kódoló szekvencia működőképesen kapcsolva van szabályozó komponensekhez oly módon, ami lehetővé tesz! a transzgén transzkripcióját transzlációját és.· vagy expressziójáf a gszdasejtbea,
A ttonszgén szekvenciák összetétele függhet attól az alkalmazástól, amelyben a kapott vektort alkalmazzuk. Példán! egyfajta transzáén szekvencia, jebtoszekvsnelát tartalmaz, amely ax expresszlöja után detektálható lelet produkál. Ilyen jelzőszekvenciák nem korlátozó példás közé tartoznak az alábbiakat kódoló feNS-szekveneiáác (1-fektamáz, p-galaktozidáz íLaeZ), aikahkes fes/ímáz, ómldhukisáz, zöld fluoreszcens fehérje (GÉP), klőramfeuikol-tjeeulíranszfcráz tCAT), kuniéra/, nrembránitotott fehérjék, mint példán! CD2, CB4, GD8, az: lalíuenza hemagghton.m lékébe, és a szakterüfeten jól isméid más fehérjék, amelyekhez léteznek vagy·' hagyományos úton efeáilühatok magas aftmitású ellenanyagok, és fúziós fehérjék, amelyek metohráttkotótt fehérjét tartalmaznak megfelelően fezlöttáliatva antigén-címke doménbez, többek között bemaggíutmlsbőí vagy yyc-ből.
Ezek a kódoló szekvenciák — amikor kapcsolódnak az expressxiójttkat irányító szabályozó ele/uekbez: ---- olyan hagyományos módszerekkel detektálható jelet biztosítanak, amelyek közé tartoznak emómatikus. radioaktív, kelorimetriás, Eupfeszeests vagy tpáslűle spektrográftás vizsgálati eljárások, fereszeeps aktivált sejíválogatási vizsgálati eljárások és tonsnaoiégrai. vizsgálati eljárások, köztük euzámkapcsolt mmumadszorhens vizsgálati eljárások (EE1S A), radioaktív inimmtolögiai vizsgálati eljárások (Rí A! és immujfeisztokémia, Például • 21 amikor a ntarkerszskvcncfe a LacZ gém a szignált hordozó vektor jefeniétet a β-galaktoztdáz aktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárással detektáljuk. Ahol a transzgétí a zöld finoreszcess feltétje vagy feeiferáz, a szignált hordozó vektort szín alapié® vizuálisa®, W htmisnméferben. fesrytezmelés alapján tnéridk.
Azonban: előnyösen: a transzáén, egy nettt-matker szekvencia, amely olyan. fennéket. kódol, amely hasznos biológiában vagy gyógyászatban, mim például fehérjék, peptidek, RNS, enzimek vagy katalitikus RNSek. Előnyös RNS-tnofeknlák kozó tartozik a íKNS, dsRNS,. Ahoszómális RNS, katalitikus RNS és antiszeusz RNS. Hasznos RNS-szekveneia egy példája olyan szekvencia, amely kioltja a célzott jmklemsav-szekveseia expressziöját a kezelt ália-feau.
Á íranszgéní génhibák kijavítására vagy enyhítésére alkalmazhatjük, amelyek közé íartezsak olyan lö hibák, amelyekben normális gének a normális szánt-alatt expresszálódoak, vagy olyan hibák, amelyekbe® & funkcionális géntennék sem expresszáíódik. A transzgén-szekvsncia előnyős típusa terápiás fehérjét vagy poEpeptidet kódol, amely expresszálódtk gazdasejiben. A találmány tárgyát képezi továbbá több tnmszgén alkalmazása, például iebb-alegységex fehérje által okozott génhiba kijavítására vagy enyhítésére.. Bizonyos helyzetekben kskihbóző traaszgéneket alkalmazhatunk a fehérje mindegyik alegységének kódolására, vagy különböző peptidek vagy fehérjék kódolására. Ez akkor előnyős,, amikor a fehérje-alegységet kódoló: DNS mérete nagy, például immunglobulin, véílemezke-eredetü ttövekedést faktor vagy bisztróim fehérje esetében. Atmak érdekében, hogy a sejt termelje a tőbb-afegységes fehérjét, a sejtet megfertőzzük a különböző alegységek ixsioáegyikét kódoló rekorabtoáös vírussal. Más megoldásképpen fehérje különböző alegységeit ugyanazon a transzgénen kódolhatjuk. Ebben az esetben egyetlen traaszgéo hatalmazza az egyes alegységeket kódoló DNS-t, és az egyes alegységek DNS~ét belső riboszóma-belépésl hely (ÍRES) választja el.. Ez akkor előnyős, amikor az egyes alegységekül kódoló DNS mérete kiesi, például amikor az alegységeket és az IRES-t kódoló DNS teljes mérete kisebb, mint 5 kb, Az: ÍRES altemtívájakéní a DNS-t 2A-peplióet kódoló szekvenciák választhatják el, amelyek, peszhírassziseiősan elhasalják salat magukat (lásd például M, 1, Donneliy és mtsai., X Gén, Virol. 78, 13-21, old, (19971' kűriét, S. és mtsai., Gene Tber. 8, 864-873. old. (2SÖtg Rfemp, H. és mtsai,, Szene Ther. 8,
811-817. óid. (2Őöl)J, Ez a 2Á-peptid szignifikánsan kisebb az iRESmél, ami jói alkalmazhatóvá teszi akkor, amikor a hely korlátozó tényező. Azonban a kiválasztod transzgén bármilyen, biológiailag aktív terméket vagy más terméket is kódolhat, példáid tanulmányozni kí vánt termeket.
Megfelelő transzgéneksá a szakember könnyen kiválaszthat. A transzgén kiválasztásai nem lekuojűk a találmányt korlátozónak.
3ó 2:. Szabályozó eleinek
A mínígén lent azonosított i® elemei melleit a vektor tartalmaz szükséges bagytanártyos szabályozó elemeket is, amelyek működőképesed kapcsolva vannak a tranazgénhez oly módon, ami lehetővé teszt annak transzkripcióját, transzlácíójá- és vagy evpresszupát a találmány szerint, előállított pl&zmsávekíocraí írauszfektáh, vagjf a találmány szerint előállított vírussal fertőzött sejtben. A leírás szerinti éberemben a ,,nrőköílők.ép«sen kapcsol;” szekvenciák közé tartoznak olyan expressziét? szabályozó szekvenciák, amelyek esybefeggöek a jelentőséggel bíró génnek es olyan szabályozó kontroll szekvenciák, amelyek franzz vagy távolt helyzetben: hatnak a jelentőséggel bíró gén szabályozására.
Az: expresszíős szabályozó szekvenciák köze tartoznak azok, amelyek megfelelő transzkripciós feídációs, termináciős, promóier és «tdtanszer szekvenciákat tartalmaznak.; itatékony RNS-feldolgozási szignálokat, mint például splictng és poliaáerníáoiós (polí-A) szignálokat tartalmadnak;: cifeplazntás RNS-t
Λ7 ...
stabilizáló szekveneiákat tartalmaznak; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciákat (például Kozák feoasaeaxas' szekvenciát) tariuhnaxuak; a foltérje stabilitását fokozó szekvenciákat tartalmaznak; és kívánt esetben olyan szekvenciákat, amelyek fokozzák a kódolt termék szekrécióját. Nagyszáma olyan expresszíős szabályozó szekvencia — beleértve prométereket Is — ismert a szakterületen es alkalmazható, amely natív, .5 koastitatív, fodttkáihtrto és/vagy szóvekspeerfikös.
A? alkalmazható konstitutív promóterek nem korlátozó példái közé tartozik a retrovirus Rous szarkőma vírus (&SVt ITR promótere (adott esetben az RSV enhanszetrei), a citomegaiovírus ÍCMV) promótere (adptí esetóenaCMV enhanszertei) (lásd például Boshtat és mtsal,, Cell41t 521-530. old. (1985)], az- SWÖprotoóter, a dihldrofoláf-redukíáz promóter, a β-aktin premőíer, a foszfogüeerin-kináz (FGKt promóter és az ΕΠα pj’ötnóier {iavíírogen].
Az iudukálhatő promóterek lehetővé teszik a géuespresszió szabályozását, ás külsőleg adott vegyüietekkel, környezeti tényezőkkel, mint például hőmérséklettel, vagy specifikus fiziológiás állapok mint például akut fázis meglétével, & sejt egy adott differenciálódási stádiumával, vagy csak rephkálédó sejtekben szabályozbafók, Indukálbato promóterek és fednkálhaío rendszerek beszerezhetők különféle kereskedelmi ferrásbék nem korlátoz»·» példaként az tnvlmigen, Clonteeh és Áriad cégektől. Sok más rendszert leírtak és megfelelően kiválaszthatok a szakember szamára. A kívülről adott: promőterefckel indukálható promóterek példái kőzó tartozik az Indukálható juh metailotíonm íMT) promóter, a dexatnetazon- (Dex) -inőukáif egér emlődaganat vírus (&ÍMTV) promóter, a T7 polimeráz promóter rendszer (WOWíOOSK számú nemzetközi közzétételi irat); az ekdizon rovur-promóter (No és tufeai., Proe. NaC Aead, Sei. USA 93, 3346-3351., old.
(1996)] , a íeiraekiiuneí represszálható rendszer (Gossen ésnntsai., Proc. borii. Aead. Sei. OS A 89, 5347-5551.
old. (1992)1, a tetrackimnel indukálható rendszer (Gossen és mtsal., Sciesse 265, 17x56-1709. old. (1995), lásd még Harvey és misaL Curr. öpin. Chem. Bioi. 2, 512-518. old. (1998)1, az RU486-tal mdukáiimtő rendszer [W&ag és mísak, Nat. Bioteeh, 15, 239-243. old, (1997) és Wsng és mtsal.. Gese Ther, 4, 432-441. oki, (1997)) és a rap&naeinnel indukálható rendszer [Magari és mtsal., .1 Clin hívest, 100, >805-2872. old. (Í99?)j. Az ebben a vonatkozásban hasznos más típusú, indukálható promóterek azok, amelyeket egy specifikus biológiai állapot szabályoz, mint például hőmérséklet, akut fázis, a sejt egy adott differenciáétós állapota, vagy csak replíkálódó sejtekben működik.
Egy másik nmgvaiósitási mód szerint a ttanszgón natív promóteréi alkahuazhírtjúk. A natív gremóíer előoyös lehet, amikor az kívánatos, hogy a trastszgén expresszíója utánozza a natív expressziéi. A natív promptért akkor alkaiötazharink, amikor a transzgeo expresszíóját időlegesen vagy·· fejlódésileg keli szabályoz®), vagy szővet-speeítíkns utódon, vagy specifikus ttanszkrípelös stímulusokra válaszul. Egy további megvalósítási mód szerint más natív expressziós szabályozó elemeket, mint például enhanszer elemekei, polladeiülácíös helyeket vagy K.ozak-fole konszenzus szekvenciákat is alkaknazhstunk a natív expresszió utánzására.
A transzgén egy másik megvalósítási mórija szerint a íranszgén működőképesen vasa kapcsolva szövet35 specifikus pronfoterhez, Például ha vámomban való expresszié kívánatos, az izomban aktív préméiért kell alkalmazni. Ezek közé tartoznak az azon génekből származó promőierek, amelyek az alábbiakat kódoljuk: vázizom amktítt, míozio óÁ-könnyűláne, disztrophrn, izom kreafin-kináz, vatemmi szintetíkns izom promóterek, atneiveknek magasabb az aktivitása, mint a lemtészefoen előforduló prontótereknek (lásd például Li és mtssi., Hót, Bioteeh.. 17, 241-243, old. (1999)]:. Szövet-specifikus promőierek példái többek között ismertek a májban (albuntítg Míyatake és ártsák, X. Vlrol, 71, 5124-5132, old. (1997); hepatíösz: B vírus magprosttóter, Símdig és
23mtsai., Eless Tber, 3, 1092-1609, old, {1996); alfe.-fefepíotóa (ÁFP), Arhuthnot és mtsai,, Ham. Gén© Ite. 1593-1514. ©id. (1996)j, esőst oszteokatoin [Stem és mtsai., Moll Blol, Aep. 24, 135-196. obi. (1997)]: csont szialoprotem [Öten és mtsai., 1 Bőse Mmer. Rés, 11, 554-564. old, (199óij, lisdtxdiákban [Cl>2, Hassal és mtsai,, Immtutol, 161, 1663-1068. old. (1998); tomíungiobnlitt nefeézláne; T-sejí-receptor s-lástc), idegi, mint például sesros-spedfikus enoláz (NSE) promóler [Aftáersea és mtsai... Cdl, Mól. Neurobiol, 13, 593-515, old. (1993)'). neurofdametanm kösnyüiánc gén (Piecioli és mtsai., Prne. Hall. .Acad, 5d. USA SS, 5611-561 $> ©Id. (1991:)] és a seuros-speetllkus vgf ges [Pleeieli és mtsai.., Neuron 15,373-384. old. (1995)1.
Adott esetben terápiásán hasznos transzgéneket hordozó plazmátok taríalsiaztatsak ssNekiáibaí© markereket vagy jelzögénekei is, amelyek többek között gesetfein, hiaromtan vagy parintidn rezisztenciát kódéinak. Az ilyen szelektálhatöjelzó- vagy örnrketgéneket (amelyek előnyösen a a találmányszerinti eljárással kimentendő virális genomon kívál találhatók) alkateazhattHik a plazmái bakteriális sejtekbe® való jelenlétének jelzésre» mint például amputálta rezisztenciát, A plazmid más komponense; közé tartozhat a repHkádós origó. Ezek és más ábakhíos pronrótsrek és vektoreiemek kiválasztása megszokott, és sok ilyen szekvencia áll resdelkezesre [lásd például Samhrook és mteak, mint fent» és az abfem idézett irodaion helyek].
A íranszgé®, grontóíerfeohanszer és 5 ' és 3’ ITR-ek koummáeiójás. „msagórasek” nevezzük: az arra való hivatkozások megkönnyítése érdekében, A leírás szerint; kítamtás segásegevel az ilyen minigén megtervezését hagyományos módszerekkel elvégezhettük.
3. Minigén bejuttatása pakoló gazdasejíbe
A mlsígési bármilyen olyan alkalmas vektoron, például piaznhdon szállíttatják, amely gazdasejtbe bejuttatható, A találmány szerint alkabmizbató plazsnídökat génsebészeti úton módosíthattuk úgy, hogy alkalmasak legyenek reglikáeíöra, és: adott esetben prekarléta sejtekbe, emlőssejtekbe, stb, történő integrálódásra. Ezek: a: plazmidok (vagy más vektorok, amelyek hordozzák: az: 5' AAV 1TR —- betérőkig: nmlekula — 3’ 1TR mmigssí) a minigén cnkadőtáktan. és/vamr prökariotákban való replikáclöját lehetővé tévő szekvenciákat tartalmaznak, és az ezekben a rendszerekbe® megfelelő szelekciós markereket, A szelektálható marketek vagy jelződének. többek között geuettois, higromfein vagy portaiéin rezisÁetteiáí kódoló szekvenciákat tartatmázhatnak, A plazsadok tartalmazhatnak továbbá bizonyos -olyan szelektálható jelző- vagy markergéaeket A, amelyek alkalmazhatok. a vektor jelenlétének jelzésére a bakteriális sejtekben, mint: példán! smpfeillm rezisztenciát, A glazmldok: egyéb komponensei köze tartozhat rephkáoiós origója és mnpiíkom miín például az Epstein-Barr vírus sejtmag! antigénjét alkalmazó atnpiikon rendszer.. Ez az ampllkos rendszer, vagy más hasonló amplik.es konrmtnensek lehetővé teszik a. mags fcoplaszsmá. episzotnális replikádét a sejtekben. Előnyösen a misigést hordozó molekulát trasszfektábuk a sejtbe, ahol az tranziensen létezhet. Más megotoásképpen a misigén (amely az 5’ irR--heterolőg molekula—3’ STR szerkezetei hordozza) stabilan integrálódhat a gazdasejt cenosgába, akár kromoszómáiban, akár episzómálisan. Bizonyos megvalósítási; jnodok szenm. a miaigés több kópiában, lehet jelem adott esetben fej-lej, fej-lárokvagy .fcok-íarok konkatemerekben. Megfelel© transzfektálásí módszerek ismertek, és könnyen alkalmazhatók a minigén gazdasejtbe torsén© bejuttatására.
Általában amikor a minigént tartalmazó vektort transzféktálással juttatjuk be, a vektort körtükéiül 5 pg és körülbelül 190 pg közötti mennyiségű DNS-ben juttatjuk: be, és előnyösen körülbelül 1.0 és körülbelül 50 pg közötti mennyiségit SNS-t juttatunk he körülbelül 1. x 1Ö* és körülbelül 1 x 10!5 közötti számú sejtbe* es előnyösen körülbelül 1ÖS sejtbe. Azonban a vektor DNS és a gazdasejt relatív mennyisége megváltoztattató.
-24figyelembe véve olyan fényezőket, mini példáéi a kiválasziött vektor, a bejultatásí eljárás és kiválasztott gazdaseji.
B, fecm és Ccp szekvenciák
A mlnigén melfett s gazáassjt tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek irányítják az új AAV 5 kapszíd fehérje (például az ÁAV'7 vagy másik új AAV kapszíd vagy mesterséges kapszíd fehérje, amely tartalmazza egy vagy több ilyen kapszldok iragmensót) expressmójái a gazáasejtben, és a mmígénbea található AAV LFR-rel megegyező szeretlpns rep .szekvenciák. Az AAV eap és mp-szekvcac iákat egymástól í&ggedeaöi állíthatjuk elő AAV lőrráslsól, amint fesd bírtak, és bejuttathatjuk azokat s gazdasejtbe a szakember számára ismert módon, amim feni: leírtuk. Ezenfelül amikor találmány szerinti új AAV kapszidöt pszeudotipizálauk, az
LÖ esszenciális rop fehérjék mindegyükét kódoló szekvenciák ugyanabból az· AAV: saerotípeshől származhatnak, vagy a rep fehérjéket kódoló szekvenciák különböző AAV szeröfipnsokből származhatnak (például AAV1, AAV2, AaV3, ÁAV'4, AAV5, AAVó, vagy a találmány szerinti új szmotípusek egyike), Példáíá a repWÖS szekvenciák származhatnak az AAV2-böl, míg a j-gp52/4Ö szekvenciák ssámmzhaiinak az AAVÍ-ból.
ügy megvalósítási mód szerint a gazdasejt stabilan tartalmazza, a kapszid fehérjét alkalmas promőtér, mini például a fent ismertetettek szabályozása alatt. Legelőnyösebben ezen meg valósítási mód szerint a kapszid fehérjét indukálható promóter szabályozása alatt expresszáltatjuk. Egy másik megvalösiiási mód szerint a kapszid fehérjét «hsz helyzetben biztosítjuk: a gasdasejt számára. Amikor iraxsz helyzetben Juttatjuk be a gazdasejtbe, a kapszid fehérjét olyas plazmidon juttathatjuk: be, amely tartalmazza a kiválasztott kapszid fehérjének a gazáasejtbes történő espresszáitatásához szükséges szekvenciákat. Amikor írrfusz helyzetben
2Ö juharjuk 'be, legelőnyösebben a kapszid fehérjéket hordozó piazotíd hordoz órás szekvenciákat is, amelyek szükségesek az rÁAY pakolásához, például a «?» szekvenciákat.
Egy másik: megvalósítási mód szerint a gazdasejt stabilan tartalmazza a rep szekvenciákat alkalmas promófer, mini például a fent ismertetettek szabályozása alatt. Legelőnyösebben ezen megvalósítási mód szerbit az esszenciális iéhérnAe- indukálható promóior szabályozása alatt expresszáltatjufe Egy másik megvalósítási mód szerint a λρ fehérjéket rtztsyz helyzetben biztosítjuk: a gazdasejt: számára.. Antikor feonaz helyzetbe» juítatjuk be a gazdagépbe, a rep fehérjét olyan plazmidsu jnísaihaijúk. he, amely tartalmazza a kiválasztott rcp fehérjének a gazdascjtben történő expresszájtaíásáhozszükségesszekvenciákat Amikor őomz helyzetben juttatjuk be, legelőnyösebben a kapszíd fehérjéket hordozó plazmid hordoz más szekvenciákat is, amelyek szükségesek az rA A V pakolásához, például a *ep és; c»p szekvenciákat.
3ö Ily módon egy megvalósítási mód szerint a rep és cap szekvenciákat egycöen nufeleínsttv-tuelekoíán íranszfektálhatjuk: be a gazdasejtbe, és epíszömaksnt stabilan létezhetnek a sejtben. Egy másik megvalósítási mód szerint a reg és csp szekvenciák stabilan integrálódva vannak a sejt geuornjábtm. Egy másik megvalósítási utod szerint a rtg? és szekvenciák tranziensen ezpresszáiodöak s gazdasejtben. Például az ilyen transzfektálásra alkalmas, nukfemsav-molekula S’~3' irányban az alábbiakat tartalmazza: promőtér, opcionális távtartó a prottmíer és a rep gén szekvenciájának starthelye között, AAV osp górt szekvencia, és AAV erp? gén szekvencia.
Adod esetben a rty> és/vagy sáp szekvenciákat olyan vektoron biztosíthatják, amely a gazdasejiekbe bejuttatandó más DNS-szekvencíákat is tartalmaz. Például a vektor taftalmazltapa a númgéut tartalmazó rAAY konstrukciót. A vektor tartalmazhat segítő feske lókat kódoló egy vagy több gént, például az adeiiovírus El, E2 és E4OSEŐ fehérjékéi, és a VAl RNS gémét.
25Előnyösen az ebben a konstrükciéban alkalmazott proasóter lehel a szakeírtber számára ismeri bármilyen konstitutív, indukálható vagy natív promöter, vagy amelyeket fent tárgyaltnak. Egy megvalósítási mód szerint ΛΑY P5 promótsr-szekveseiát alkalmszrsnk. Az AAV kiválasztása ezen szekvenciák biztosítására nem korlátozza a találmányt
Egy másik előnyős trtegvalösttásí mód szerint á rcp promótere indukálható proíuóter, amint fent tárgyaltuk a transzgének szabályozó elemeivel kapcsolatban. Egy előnyös promőtsr á rep «xpresszáliatása számára a T7 promóier,. A 17 promőter :s:odsályosáaa alatt állói ?up gént: és a. oup gént tartalmazó vektort olyan, sejtbe transzféktáljuk vagy imnsaiarcnáijok, amely fcmáhuirvan vagy índukállmtdan expresssálja a T7~ polintorázs (lásd a WO 98/11X0. számú nemzetközi közzétételi iratot H89S. március 1.2.)|
A távtartó opcionális elem a vektor szerkezetében. A távtartó a promőter és a rtg? gén ATG starthelye közé hedleszteü. DNS-szekvencia. A távtartó lehet humor, <~n '•rerkezetú; azaz lehet nukleotiőok véletlenszerű ον szekvenciája., vagy más megoldásképpen kódolhat geiúennéket, mist példáid markergént, A távtartó olyan géneket kódolhat, amelyek Epikusán start/stop és polí-A helyeket tartalmaznak, A távtartó lehet ptókarlóláből vagy eakariótáböl származó nem kódoló ONS-szekvenda. ismétlődő nem kődölő szekvencia, Iraószkripolős szabályozás nélküli kódoló szekvencia, vagy transzkripciós szabályozása alatt álló kódoló szekvencia. Két szemléltető forrás távtartó szekvenciákhoz a E lág: létraszekvenciái vagy az élesztő iéírsszékveneiáh amelyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, például többek között a Gibeo vagy Invkrogen cégektől. A távtartó bármekkora méreti! lehet, amely elegendő a r:?p78 és rcrpóS géatermékek expressziqjánák a csökkentésére úgy.
hogy a ?yp52, repO és -cap géntefttsékek: normális szítáén espresszálóának. Á távtartó hossza, lehat körülbelül bp és körtílbelül 18,8 kbp közötti lehel, előnyösen a körülbelül 100 bp és körülbelül k.8 kbp közötti tartományban. A rekombináció lehetőségének csökkentesére a távtartó előnyösen kevesebb, márt 2 kbp feosszűságú: azonban a találmány nem korlátozódik erre.
Habár a rop és eup szekvenciákat biztosító molekulák létezhetnek, tmnzkínsen a gazdsseiíben (azaz ttaoszfektalas áriánk előnyős ha a n?/> es «?φ fehérjék egyike vagy mindkettő, és az evpressziójnkat szabályozó promőterek stabilan ezprcssaálödrsak a gazdasejtben, például episzómán vagy a. gszdase-t krtmmszőmájába integrálódva, A találmány megvaiositast médiainak előállítására alkalmazod: eljárások bagyomásyos génsebészeti vagy rekombhtetís módszerek, mint amelyeket a fent hivatkozott .irixlalmi helyeken ismertetnék, Bár a leírásban bemutatjuk specifikus konstrukciók szemléltető példáit, a leírás szerbit! rníermásíó alkalmazásával a szakember kiválaszthat és megtervezhet megfelelő konstrukciókat, távtartók, PS-promóterek, és más elemek alkalrazzásávíth beleértve legalább egy transzlációs start és stop kedonk és poíisdeníláciős helyek opcionális alkalntazását.
A. találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rep és <?.<zp fehérjéket stabilan biztosítjuk a gazdasejtbes.
C. A segítő funkciók
A. pakoló gazdasciieknek szükségük van segítő funkciókra is a találmány szerinti rAÁV pakolásához. Adott esetben ezeket a iunkciókat herpeszvírassal biztosíthatjuk, Legelőnyösebben a szükséges: segítő funkciók mindegyikét: bontátr vagy nem barnán: főemlős sdenovírus forrásból biztosiunk, mint például: amelyeket fent ismertettünk .és/vagy különféle Ibrrásokbő .beszerezhetők, mint például a 'American TypeCslíure Cölleetioö’ hítézettől -(ATCC,. Manassas, VA, USA); Egy jelenleg előnyösnek tartóit megvalósítási tnod szerbit a gazdasejtet ellátjuk és/vagy az tartalmaz egy El a gétrterméket. egy Elh génterméket, egy E2a génterméket
-26és/vagy egy E4- 0RE6 géstorméket. A gazdasejt tertalmszfed: más arfaíovfets géneket is, mint például VAI RNS -f, áe ezek a gének sem szükségesek. Egy előnyős megvalósítási mód szerint nincsenek más adenovirus gének vagy gén&nkciók jelen a gazdasejtben.
Ág JBla géniemtékeí expresszáló adenovirus DNS·” kifejezés «te bármilyen Ela-t vagy El a részletet kódoló adenovirus szekvenciát értünk. Az E2á géntormékef expresszáló adenovirus DNS-t és az E4 ORE6 gémerméket expresszálő adenovirus DNS-t hasonlóan definiáljuk. A találmány tárgyát képezik az adenovirus gén vagy funkfonáKs részének bármilyen allélfet vagy más aródosüásai. Az ilyen móde-siíásoknt szándékosan építhetjük be hagyományos génsebészed vagy mutagenezís móds/etekkel. Siogy fokozzuk: az adeáovirux fenkeiót valamilyen módon, valamint lelteinek azok természetben előforduló uilélikus variánsok. Az ilyest adenovirus génfonforiók elérésére szolgáiét DNS-mődosrtó és manipulációs eljárások ismertek a szakember számára.
Az adenovirus El a, Elb, E2a és/vagy E4 ORE6 géntermékeket, valamint: bármilyen: más segítő funkciói biztosíthatunk bármilyen olyan eszköz alkalmazásával, amely lehetővé teszi azok expresszáltaíásáía sejtben. Az. ezeket a termékeket kódoló szekvenciák mindegyike leltet különálló vektort®, vagy egy vagy több gén leltet ugyanazon a. vektoron. Á; vektor leket bánpilyen szakterületen ismert vagy fen· ismerteiéit vektor, beleértve plazmidökat, kozmidokat: és vírusokat is, A vektornak gazdasejtbe történő bejuttatását a szakterületen ismert bármilyen vagy fent ismertetett módon elérhetjük, beleértve többek között a transzicktálást, fertőzést, elektroporációí, liposzómás bejuttatást, membráníuziós módszereket, DNS-sel bevont nagysebességű sőrtétet, vh'álls fertőzést és protoplaszí fúziói. Az adenovirus. gének egyikét vagy többet is stabilan integrálhatjuk a
2Ó gazáasejt genontjába, stabilan expresszáltofearink episzómaként, vagy tranziensen expresszáliafoatjuk. A géntermékek mindegyikét expmsszáh.foutuik tranziensen, episzómán vagy stabilan mtegsálva, vagy a gfeitermékek némelyikét stabilan, axpresszaliatbafjuk, míg inasokat teaszlensen expresszáltsthatmik. Bzesfclnl az egyes: adenovirus gének promőtereít egymástól függetlenül választhatjuk meg, és ezek lehetnek konstitutív premóterek, indukálható promóterek vagy natív adenovirus promóterek. A promótereket az organizmus vagy
2:5 sejt specifikus fiziológiás stádiuma (azaz a dlSerenciáctós stádium vagy nyugvó sejtekben való repEkálódás) szabályozhatja, vagy például kívülről származó faktorok,
D. Cazsiasejtek és pakoló sepvonalak
Maguk a gazdasejtek bármilyen biológiai organizmusból származhatnak, mint például prokarióta (például bakteriális) sejtek és eukariófa sejtek, mist például rovarsejtek, élesztőseitek és emlőssejtek. Különösétől) előnyös gazdasejtek a bármilyen emiősiájből száonazők, nem: korlátozó példaként, olyan sejtek, mint példáid az A5< W, 3T3, ÍÖTI/2, SÍIK, MDCR, COS 1, COS 7, BSC I, BSC 4ö, BMT lö, VERŐ, W138, HeLa, 295as sejtek (amelyek LtakeionáíN adenovirus El-et expresszálnak), Saos, C2O12, L-sejtek, ΕΓΓ1030, HepG2 és printer fsbrofjiasztok, emlős és: humán eredetű hegatocite és ralohiaszí sejtek, beleértve emberi, majom, egér, patkány, nyúl és hörcsög eredetiteket. A sejteket biztosító stnlős&j megválasztása nem korlátozza a találmányt;
se® o· emlőssejt típusa, m fíbreblasri, hepatöcife, daganatsejk. sífe A legelőnyösebb sejtek ne® tartalmaznak az: EL E2a és/vagy E4 OREŐ mellett semmilyen más adenovirus gént; és nem tartalmaznak semmilyen olyan más vírus gént, amely szennyező vírus homológ rekombinációját eredményezné az rÁA V előállítása folyamim; és: képes fertőzésre vagy DNS transzfekeíőjára és a iranszfektálf DNS expresszáiásárs. Egy előnyős megvalósítási mód szerint a gazdasejt olyan, amely stabilan transzferálva tartalmazza & «ρ és cop génekéi a sejtben.
•ν'·?
A találmány szériát hasznos gazdasejt olyan gazdagép, amely stabilan transzformálva van a «g? és: cm? tefe&jéket kódoló szekvenciákkal, és amely trasszfektálva van az adenovirus El, E2a és E4 OREó DNS-sei, és egy leni ismerteteti mínigést hordozó konstrukcióval, Hasonlóképpen alkalmazhatunk rop és· vagy <w géneket stabilút! exptesssálú sejivottsiskat is, mini például s ö-SO-ei (8(717(159809403, számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), vagy amelyeket az 5 658 785, számú amerikai egyesül· államokbeli szabadalmi iratban ismertetnek. Egy másik előnyös gszáaseji: minimális adenovíras I)fe$-t tartalmaz, amely elegendő az E4 ÖREó espresszálásához, Még más sejtvonalakat is előállíthatunk a találmány szerinti áj AAV wp-és/vagy új AAV cap szekvenelak alkalmazásával.
A találmány szerinti gassfesejiek előállítása olyan módszereket: foglal magában, mim: például kiválasztott DNS-sszekvenciák összeállítása.. Ezt az összeállítást hagyományos módszerek alkalmazásával végezhetjük el. Ilyen módszerek közé fertőzik oDHS és genomlálls klónozás, amelyek jól Ismertek, és Sambrook és mtsai. ismertetik (mint font), az adenovlms és AAV germtnok átfedő oligoaukleotidszekvenciáinak alkalmazása polímeráz-lánereakcíóval kombinálva, szirueokus eljárások, és bármilyen más alkalmas: eljárás, arneh r kívánt nukleotid-szskvenciát biztosítja, A molekulák (plazmidként vagy vírusként történő! be uth tását a gazdasejtbe szintén a szakember számára ismeri: módszerekkel bstjíhgtjuk végre, és amist a leírás tóm r elvén ismertetjük. Egy előnyős spegyalősriási mód szerbi szokásos transzfektálási módszereket: alkalmaznak, például CáPQ* tresszfektálást vagy elektroporációi, és/vagy hibrid adenovirusZAÁV vektorokkal történő fertőzést olyan sepvonafekban, mist például á BEK 293 humán embrionális vese sejtvonal (humáa vese sejt vonal, amely fonkekmális adenovlrus Él géneket tartalmaz, amelyek feonsz haló El fehérjéket
3Ö biztosítanak!,
A szakember által elkészített ezen új AAV-alapú vektorok hasznosak gének bejuttatására kiválasztod gazdssejiekbe és génterápiás páciensekbe, mivel sem taláitusk AAV7-et smnfegesilö ellenanyagokat az emberi populációban. Ezenfelül korai vizsgálatok, nem matatnák. ki semlegesítő ellenanyagokat üvso majom és csimpánz populációkban, és kevesebb, mim, 15% keresztreakclót mutassak Aőmms majokbas, abban a tájban, amelyből a szőrei jgust izoláltuk. A szakembóf könnyen eloállltet más rAAV virális vektorokat is, amelyek a találmány szerinti kapszid fehérjéket tartalmazzák, a szakember szarnám ismert különféle módszerek: alkalmazásával, Hasonlóképpen előállíthat még további rAAV virális vektorokat, amely AAV '· szekvenciát és tnás szeroílgnsu AAV kapszidjait tartalmazzák. Hasonló előnyöket biztosítanak a találtnam szerinti többi új AAV-u alapuló vektorok is.
ily módon a szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szermti: AAV7 szekvenciák könnyen adsíptálhstők ezekben és más virális vektmrendszerekben történő fe fefeo, ez vőv? vagy fe vöm génbejutsatási alkalmazásra. Hasonlóképpen a szakember könnyen kiválaszthatja a találmány szerinti új: AAV genom más fesgmeriselt: különféle rAAV és nem rAAV vekiorrendszerekben történő alkalmazásra, ilyet! vektorrendszerék közé tartoznak például többek között lemivirusok, rehovirusök, himlővífosok, Fhoeféfe városok ős adonovírus rendszerek. A vsktorrendsze? mégváfesztása nem korlátozó a találmány szempontjából.
Ily módon afeiáimáov tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti új AAV mtklemsav- és aminosavszekvenciáinak alkalmazásával, előállított vektorok. Ilyen vektorok különféle célokra alkalmazbafok, mint például terápiás molekulák bejuttatására és vakcloálásbau történő alkalmazásra, lérápiás molekulák bejuttatására különösen előnyösek a találmány szer inti áj AAV kapszidokat tartalmazó rekombisáns AAV-k,
Ezek— vagy a találmány szerinti áj AAV szekvenciákat tartalmazó más vektor-könstrukciók — alkalmazhatók vakcmáiásban, például, eltoklunöi együtt történő bejuttatásban, vagy magának az ímmmwgénnek a bejattatássm.
V. Rekombináns vítssak és azok alkalmazása
S A leírásban ismertetett módszerek alkalmazásával a szakember előállíthat olyan rAAV-ι, amelynek találmány szerinti új szerodpusú kapszidja vas, vagy találmány szerinti eljárással azonosított AAV szeroiípus egy vagy több új fragmeusét tartalmazó, kapszidja vám Egy megvalósítási mód szerint egyetlen szeroíipusbói származó- teljes hosszúságú kapsaídot alkalmazhatunk, például az A.AY?-h6! [2. azonoshőszánta szekvencia). Egy másik megvalósítási mód szerint olyan teljes hosszúságú kapszidőt állíthatok élő, amely találmány szerinti új szerotípus egv vagy több riagmonsét tartalmazza feziosáltatvu egy másik kiválaszsoít AAV szerotípuaból származó szekvenciákkal. Például az rAAV találmány szerinti AAV szeroíípas egy vagy több új hipervariábílis régióját tartalmazhatja. Más megoldásképpen a találmány szerinti egyedi AAV szerotipusokat alkalmazhatják más virálís: vagy nem vitális szekvenciákat tartalmazó könsSrnkcióklsm.
A. szakember számára nyilvánvaló egy megvalósítási mód, amelyben bizonyos találmány szerinti
1.5 szeroilpusok: különösen alkalmasak bizonyos alkalmazásokra. Például a találmány szerinti AÁ.V7 kapsziíiokön alapuló vektorok különösen alkalmasak izomban történe alkalmazásra; míg a. találmány szerinti rh. 18 (44-2} kspszidokon alapuló vektorok különösen alkalmasak tüdőben történő aik&latszásra. Az ilyen vektorok alkalmazásai nem korlátozottak, és a szakember alkalmazhatja ezeket, a vektorokat más sejttípusokba, szövetekbe vagy szervekbe történő bejmtíúásra, Széniéiül a: találmány szerinti kapszidokos alapuló vektorok alkalmazhatók ezekbe és más sejtekbe, szövetekbe: vagy szervekbe történő bejuttatásra,
A. Transzgén bejuttatása
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás transzgén bejuttatására gazdába, amely szerint kiválasztott gazdasagot transzfektáluak vagy megfertőzünk a találmány szerinti AAV szekvenciákkal előállított vektorral, A bejuttatás! eljárások a szakember számára ismertek, «& nem korlátozzák a találmányt,
Egy előnyös meg valósítási mód szerint a találmány tárgyé eljárás transzgén gazdába történő AAVközvetttett bejuttatására Ezen eljárás szerint kiválasztott gazdasejtet trausz&ktálnnk vagy megfertőzünk olyan rekombináns virális vektorral, amely tartalmam kiválasztott transzgém az annak és az AAV kapszid fehérjéknek a közvetlen expresszióját irányító szabályozó szekvenciák irányítása alatt.
Adott esetben a gazdából származó mintát először megvizsgálhatunk a kiválasztott AAV szsrotipus elleni ellenanyagok jelenlétére, Semlegesítő ellenanyagok detektálására szolgáld különféle vizsgálati eljárások jói ismertek a szakember számára. Az ilyen vizsgálati eljárás megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából (lásd például l’Aher es mtsai,, Natúré Med. 3, SOő-312. old. (1Ú07) és W. €, Manuing és mtsai,, Ihtman Oese Therapy 8, 477-4$ 5 töd. fl99§jj. A vizsgálati eljárás: eredményét aikahpszliaíjuk annak meghatározására, hogy melyik, adott szerotlpusá kapszld fehérjét tartalmazó AAV vektor előnyös a bejuttatásra, például zzon spee iflkus kapszid szeroíipus elleni semlegesítő ellenanyagok hiánya miatt.
Ezen eljárás egy megvalósítási módja szerint a kiválasztott. AAV knpszid fehérjéket tartabnazó vektor bejuttatását megelőzhet! vagy követheti egy gén ocmt utasa különbőzé szerotlpusá AA.V kapszid fehérjét: kírtnlmazó vektorral. Ihisordöképpem a találmány szenrtí sás AAV kapsztd fehérjét: tartalmazó vektor bejuítatását megelőzheti vagy követheti egy géa bejuttatása különböző szerotipasú AAV kapstrid fehérjét tartalmazó vektorral. Ily módon az rÁ.AV vektorokkal történő génbejuttatást ismételten alkalmazhatjuk
-29kiválasztott gazdasejtbe történő heitrttoíásra. Előnyösen a később beadott.rAAV vektorok ugy&B&zí a. trasszgésí hordozzak, mint az első rAAV vektor, de a később beadott vektorok az első vektor által hordozást szerodpnsö kapszid fehérjétől különböző kapszid fehérjéket teriaimaznsk.. Keldans ha az első vektorban AAV? kapszid fehérjék. (2, azonositószásná szekvencíuj vasssak, a később beadott vektorok a többi szerottposböl választolt kapszid fehérjéket taríaimazhatnak, mint például az alábbiak bármelyikét: AAV1, AAV2:, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, ÁAVIO, AAVH vagy AAV 12, vagy a. találmány szerint: azonosított többi: áj AAV kapszid bárnicsvikét, nesn korlátozó példaként: AU, K2, Hő, Cí. 02, 05, A3-3, A3-7, Λ3Α, A3-5, 3.3b, 223.4,223-5, 223-10, 223-2, 223-7, 223-6,44-1, 44-5, 44-2. 42-15,42-8, 42-13, 42-3A, 42-4,42-5A. 42-1B, 42-SB, 43-1.4312,43-5,43-21, 4J-25,43-20,24 í. 42 2. 2.2? 3 ío 3.42. tó. 42-33, 42-1 1, 11.1 5 53. 42-63 es vagy 42-12.
A fest ismertetett rekorabmans vektorokat ismert: eljárások szerint juttathatjuk be .gazdasejtekbe. A íAÁV-t,: előnyösen hziológissas kompat-hms hordozóban feíszuszpendálva, beadhatjuk ember vagy nem ember emlős paciensnek, Alkalmas hordozókat a χ/ákemhet könnyedén kiválaszthat azon indikáció függvényében, amelyre a transzfer vírus irányai. Például egv alkalmas hordozó a sőoláat, amelyet különféle: puíferelő oldatokkal (például íoszfát-pufféreli sootdatt szerelhetünk ki. Más szemléltető hordozók köze tartozik a steril sőoidat laktöz, szukróz, kalcmm-feszfát, zselatin,: dextran, agat, pekíia, földimogyoró-olaj:, szezámolaj és víz. A hordozó megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából.
Adott esetben a. találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak......az rAAV és a hordozö(k) mellen
...... más hagyományos gyógyászad alkotóelemeket is, mint példán! tartósítószereket vagy kémiát síafethzálószereköt. Alkalmas szemlelteid tartósítószerek közé tartozik a klbrbntannL, káliiam-szorbát, szorhmssv, kés-dtoxid, propil-gallát, parahének, eíilvamha, glicerin, fenol és paraklőr-feool. Alkalmas kémiai stahihzálöszerek közé tartozik a zselatin: és albumin.
A vitális vektorokat elegendő menny iségben adjtrk be a sejtek transzfektálásáte, ö?: hogy elegendő szintő génátviteli és expresszié! blztoshsanak terápiás: hatás biztosítására indokolatlan káros mellékhatások nélkül, vagy gyégyászatilag elfogadható fiziológiás hutással, amelyek meghatározhatók a gyógyászat területén járatos szakember által. A beadás hagyományos és gyögyászatiiag elfogadható útjainak nem korlátozó példás közé tartozik a közvetlen bejuttatás a tosamszíoü szervbe (például mímportális bejuttatás & májba), orális, hthaláció (beleértve az isíranazálls és totratrzeheáhs bejuttatást), mtraokulárís, mdavénás, intrarnnszkulárís, szubkusán. íntnuk-rcnáhs, és a beadas sná-. paíemerábs útjai. A beadási utakat kiránt cselben ketnbináihayuk.
A vitális vektor adagolása elsődlegesen olyan tenyezöklői függ, mint pékiául a kezelt áhapot, a páciens
3S kora, tömege és egészsége, és ily módon változhat a páciensek között. Például a vlrális vektor terápiásán hatásos barnán dózisa általában a körülbelül 1 és körülbelül 100 mi oldat közötti tartományban van, amelynek a koneemráctója körülhelfe 1 % ICE óx 1 x !Ö!Í> közötti vímsvektor-geitom. Egy előnyös humán dózis körülbelül 1 x 1ÖÍ;( és: 1 x tóió közötti AAV-gonsjra leltek Az adagolást mánsllhnaíjok, hogy kiegyensúlyozzuk a terápiás hasznosságot és· bármilyen mellékhatásokat, és az ilyen adagolások változhatnak a terápiás alkalmazástól függően, amelyre a rekombinátts: vektort alkalmazzak. A tenszgén expresszióján&k a szintjét követhetjük a mlnlgént tartalmazó vitális vektorok, előnyösen AAV vektorok beadási gyakmisagánsk a meghatározására. Adott esetben terápiás célokra leírt adagolási rendekhez hasonlókat alkalmazhatunk irnhnnnzálásra a találmány szerinti készifíKÓstyek aíkahsazasávak
A találmány szerinti ÁAV-taríahnű vektorokkal bejuttatható terápiás termékok ás tmmunogenikus termékek példáit ismertetjük alább. Ezeket a vektorokat különféle terápiás és vakoínálási rendekben fekalmazhaljak, amint a bírásban ismertetjük. Ezenfelül ezeket a vektofokítt egy vagy több további vektorral vagy hatóanyaggal együtt juttathatjuk be egy kívánt terápiás és/vagy vakcmálási rendben.
B, Terápiás transzgének
A írusszgétt által kódolt hosaos terápiás tennétek közé tartoznak Itortttenok és aöviekedési fektetek, amelyek nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiak: inzulin, ghítegon, növekedési termes (öli), pazaíítold termőn fPTHk növekedési termőn felszabadítást faktor (GRF’k fotlikafes stimuláló hormon (ESH), iutóhuzálö hormon (Ι.Κ). humán koriogonadotfopln (hCG). vaszkuláris endötéilális növekedési fektor (VEGE), angiopoietmek, angtosztatin, granalocita kolóniastímuláló faktor (ÖCSI' }- eritropoietm (EPtb, kölöszóvetl növekedést faktor (CTGF), bszikus fibrobiaszt növekedést faktor (bPGF), savas fibrobiaszt növekedési faktor (aFGE), enldermalrs növekedési faktor (EGE), transzformáló növekedési faktor « (TGFak vérlernezke-eredetü rfovekedésl faktor (FDGE), inzulin növekedési fektet 1 és lí (IGF-Í és föh-ffi, a transzformáló növekedési faktor β sznpemsalád bármelyik tagja, köztük a IGE β, aktivmek, iahibinefe vagy a esőst morfbgenikns fehérjék (BMP) bármelyike (BMP 1-15), a teraghdn/ítoureguim/ARIA'neu differeuciációs faktor (NBF) tevetedéat fektetők családjának bármelyik tagja, idegi növekedési faktor i NGF), agyi: eredeté néntetrofikus fektet (BBNE),
NT-3 és jNT-4/5 nemoírofmek, eibárís neurotrofikus fektet (CS 111, glia-sej ivónál eredetű neuretrofskus faktor fGDNE), neuj-tortn, agrin, szemafortn/koilapszin család bármelyik tagja, netriu~i és netrin-2, hepafoeita sövekedési fektof (BGF). cfónck, noggia, „Sonic bedgehog’ os tírozm-hidroxilsz.
hlás hasznos transzgén tennétek közé tartoznak, azok a fehérjék, amelyek az immunrendszert szabályozzák, nem kerlátezó példaként ohokinekés lirnfekinek, unni például tromtepoíetm íTPG}, mterteúkinok
2ö (IE) ÍL-l-toi ih-25-ig (beleértve IL-2, IE-4, iL-12 és 1L-1ST monocíla temoatímktáns fehérje, leukémia inhibitoros faktor, grasulöcüa-makrofeg kolöniastimuláló faktor, has ligamfem, temoraekrózis faktor « és β, interferon u, b és y, őssejt faktor, flk-2/flt3 Ugandám. Az immunrendszer által termel géntermák is alkaimaztetók a találmány szerint Ezek nem koriátezó példái közé tartoznak az IgG, ígM, IgA, IgD és. IgB imsmuglobulmok, kiméra ímmosglobuiinofe hnjoanizálí ellenaayugrsk, egyláneó ellenanyagok, I-sejt25 receptorok, kiméra T-sejt-raceptorok, egyláaeu T-sejt-receptorek, E és fi. osztályba tartozó MIK molekulák, valamim génsebészeti úton módosított immuaglübulinök és MHC-raolekulák. Hasznos géntermékek közé tartoznak a koraplmemer szabályozó fehérjék, mist például komplement-szabályozó fehérjék, membrán kofafetor fehérje (MCE), lebomlást gyorsító fekter (DXE), CRi, CE2 és CBSA
További hasznos géntermétek. közé tartoznak a különféle hormonok, növekedési faktorok, eítokfeek,
3ö: hmfekmek, szabályozó fehérjék és hmmmréndszeri fehérjék receptorai. A találmány tárgykörébe tartoznak a koies.'íerm .zabáiyoízásánnk a receptorai, mint például az. alacsony sűrűségű lipoproteú· (1-131-} receptor, magas sutoógt Itpoprorein (HBE) receptor, a nsgyon alacsony sűrűségű llpopreteln (VI.DE) receptor, és a „scavengeA receptor. A találmány tárgykörébe tartoznak olyan géntermékek, mint például a sstoroidhoitnoH-recepter sztípemsalúd tagjai, közöttük a glutokortiteid receptorok és öszmogén receptorok, B-vhamm. receptorok és más sejtmag! receptorok. Ezenfelül hasznos géntermékek közé tartoznak a transzkripciós faktorok, sünt például hm, jSmí, shx, mad, széramreakciös fekter (SRF), AF-f, AIF2, ette, MyoD és miogenfo, ETS-hoxot tartalmazó fehérjék, TFE3, E2E, A'EFE ATF2, ATF3, ATE4,.2F5, NFAT, CREB, BNF-4, C/ERF, SPE CCAAT-boxot kötö fehérjék, interferont szabályozó faktor (IBF-ly Wihus-tumörfehérju, ETS-kötb fehérje, STAT, GATAbosot kötő lehetjük, például GATA-3, és a számyashélix fehénék villásféjn családja.
Más hasznos^ géntermékek kasé tartozik a ksíbamoihszirttetáz-i, örnitúMrtmszkarbamiláz, m-gátoszukcinát-sziníeíáz, argiísosznksinát-liáz, arginás, femarilaeetaestát-hidroiáz, &ndafashn-hidröxiiáz, aifá-1 anhtripszia, glukorvő-ibsziáíáz, porfofeshnogéu-áeamlsáz, faktor Vili, faktor IX, eisztóíion-béta-azintaz, elágazod lánc kefoaosd-del'tórboztiáz, albumim izovaleHl-soA-debkhugenáz, proploml-CoA~karb<?xil.áz, meíd5 mslöxdl-CöA-xfiufe, glsxteríl-CoAMehidrogextáz, inzulin, béla-glakoridáz, pirőváí-karboxiláí, mái íosx&riiáz, feszlmtláz-kmáx, glieln-dekatboxiláz, El-fehérje, T-fehérj«. elsztás őbrozis iranszmembfáu regulator (C.FTR) szekveueiaés disztrotlh cDNS-szekveneia. Még további hasznos géatermekek közé tartoznak olyan extsúnek. amelyek hasznosak lehetnek enzittxheivettesito terápiában, amelyek hasznosak enzimes hiányos működéséből kővetkező különféle állapotokbati. Például azok az enzimek, amelyek maúaóz-ó-fbsziátot tartalmaznak, alkalmazhatók lizoszómális tárolási betegségek terápiájában jegy megfelelő get a ip-giukurtundázt kódoló gén (GUSBYj.
Más te» géntermékek közé tartoznak tentttészefben nem. előferáalő polipsptídek, mist példás! kimérák vagy hibrid pohpeptidek, amelyek természetben nem előfordul© amintxsav-szekvenciákat tartalmaznak, ammosavak mzereiőival, deléeiőival vagy szubsztitúcióival. Például génsebészed úton módosított egyláseú immunglobulinok hasznosak lehelnek bizonyos hibás immunrendszefe páciensekben. Más típusú természetben netn előforduló génszekvetxeiák közé tartoznak antlszensz molekulák és katalitikus nnkleinsavak, mint például ribozhsok, amelyek alkalmazhatók egy célpont túltermelésének csökkentésére.
Egy gén expressziójának csökkentése ésXagt modulálása különösen előnyős hiperproliféraíiv átlapolok kezelésére, amelyeket hiperproiiíéraio sejtek jellemeznek, úrim például rákok és pszoriázis. Á eéipobpeptídek közé tartoznak azok a poiipeptidek, amelyek kizárólag hiperprolífetáló sejtekben termelődnek, vagy normális sejtekkel összehasonlítva magasabb szinten termelődnek azokban A célantigét-ek közé tartoznak' onkogének — mint például mvh, mye, fyn — és srtmsxlokáetos gének.....ber-abl, xas, sic. P53, nem trk és EGRf — által kódolt polípeptldek. Az onkogének mellett a rákellenes kezelések és védő kezelések célpolipeptidjei közé tartoznak 'béla-sejtes limfómák áltól termeli ellenanyagok variábilis régiói és T-sejtes limfotnák T-sejí-receptemixtak variábilis regiói, amelyek bizonyos megvalósítási módok szerint szintén aikoimazhatok amoimmu® betegség céiantigénjekém. Daganattal kapcsolatos más pölipegtidekel is alkalruazfeatexk. eélpotipepíxdként, mint például azokat a polipepudeket, amelyek magasabb koneenteícíóban találhatunk meg daganatsebükben, beleértve a 1.7A1 moRokiosálls ellenanyag és föláikötö poiipeptidek által felismert poiipeptidek
Más alkalmas terápiás poiipeptidek és fehérjék közé tartoznak azok, amelyek hasznosak lehetnek:
atmferam betegségekben és rendellenességekben szenvedő személyek kezeléséré, és amelyek széleskörű védő immunválaszt biztosítanak olyan eéfeontok ellen, amelyek atstemmmmlással kapcsolatosak, beleértve sejtreseptoíöksk B olyan sejteket, amelyek saját atxyagok elles irányuló: ellenanyagokat termelnek. T-sejtkozvetited autoimmun betegségek közé tartozik a ívumsíoiá artrttisz (RA), szkiórőzás multiplex (MSE Sjogrem .szindróma, szcs.odo s inzuliuíuggö diabétesz tnellihrsz rtD13M), auíoimmua iíroiáííisz, reaktív ariribsz, összenövő szpota sht.sz szkleroderma, poiítniozítisz, derihatomiozdtóz, pszoriázisz, vaszkuiítisz, Wegerter-fele gmnulotPaiózls, Cndat-leie betegség és uleerabv kelkxsz. Ezen betegségek ndadegyikét olyan T-seji-reeepterok (s'SR) jelenléte jellemzi, amelyek endogén antigénekhez kötődnek, és az autoimmun betegséghez kapcsolódó gyulladásos kaszkádreakeiőf váltanak ki,
C. hxtmntiogemku» transzgének
- 32 Más mégoldásképpen ----- vagy ezeafeB —- a találmány szériád vektorok talátoásy szerinti AAV szefeenciákaí és olyan pepiidet, polipeptidet vagy fehérjét kódoló trasszgént tartalnucdlsinttk, amely egy kiválasztott ímmunogén elleni immunválaszt indukál Például az hmnunogének különféle vírusestoádokból szátwzhsfeak, Az előnyös vtasesaládok, amelyek elles előnyös az immunválasz, lehetnek Pteomavisneok, amelybe tartozik a Rklsovírusok nemzetsége, amelyek a közönséges meglázásos esetek körülbelül 50%-áért felelősék: az Enterövirnsök nemzetsége, amelybe tartoznak a Böllovírusók, Coxsackjevírusok, Echo vírusok és humán esferovírusok, mint például a hepatitisz A vírus; és Sz Aptlmvírusok, amelyek: a száj és körömfájás betegségekért felelések, elsősorban nem humán állatokban. A Pfeero&viruxök családjába tartozó vímsokhas s eéfení igének közé tartozik a VP1, VP2, VP'2, VP4 és VPí'l Egy másik vírusesalsd a Cafeivíresok családja, amelybe tartozik a vírusok Nortvalk csoportja, amelyek a járványos gasztroentendsz fontos kórokozói. Még másik viruse.salád áss mumínválsszí indukáló célartogénekkéní tortérte alkalmazásra emberekben és nem humán állatokban a Togavirusok családja, amelybe tartozik az Allavímsok nemzetsége, amelybe tartoznak a Sludhís vírusok, RossRíver vírus, es a Venezuelai, Relett és Nyugati kőeukelalitisz, és a Rubívirusok, köztük a Rubellá vírus, A Átourvöitoto családik tartoznak a dengue, sárgaláz, japán enkeiálltisz, St botos enketábiisz és falfestés
IS által hordozod: eehelhlítísz vírusok. Más eélantígéneket állkkabmk elő a Hepatitisz C vagy a Korosavírs» családból, amelyek tagjai közé· tartoznak különlele humán és nem humán vírusok, mint például fertőző broncbitisz vsrus (baromfi), sertés átvihető gasztroestcríkus vírus (sertés), sertés hemagglmlrtáctós enkefaiottneiifisz vírus (sertés), macska fertőző peníonltlsz vírus (macskák), macska cnterikus korosavírus (macska), kutya körooavírus (kutya) és humán respírtoörskus korona vonok, amelyek közönséges megfázást és/vagy nem· A, B vagy C hepatitiszt okozhatnak, A Koronavirus cs dadKm a cébmflgések közé tartozik sz El (más néven M vagy mátrix fehérje), E2 (más néven S vagy „Splké fehérje), E3 (más néven HE vagy hsmagglukíoeltetbz) glikoproteht ínhtes jelest mtodeo horöttsvístsktm} vagy N (sukfeokapszld}, Még trtás antigéneket is célozhatunk a Rhabdovíras család elten, amelyek közé tartozik a Vesíetoovirus család (például vezíkuiáris sztematitisz vírus), és a Eyssavírus nemzetség, (például veszettség). A Ehabdovíruv családban a megfelelő antigéneket a G fehérjéből vagy N fehérjéből száfrtraztalhtoiuk, A Eifefertd<re család, amelybe tartoznak a hemorráglás láz vírusok, mint például a Marburg: és Ebola vírus, antigének megfelelő forrásai lehetnek. A Paramyxovfrusok: családjába tartozik: a parasnfcenzavirus l-es típusa, parahrtluenzavlrus 3-as típusa, szarvasmarha partonBuenzavirus 3-as típusa, rabulavirus (mumpsz vírus, psratofluenzavirus 2-es típusa, paralnSaenzavlrus 4-endotéliáíis sejt típusa, Nervcasíle: betegség vírusa (csirkék), marhavész, mofhdEvrrusok, amelyek közé tartozik a kanyaró és szopornyica, és Pneumovírusök, amelyek közé tartozik a respiraíórtkus szmcítoális vírus, Az íuEuenzavímsí az öríhomyxovifosok családjába soroljuk, és antigének alkalmas forrása (például a HA fehérje, az Hl fehérje}, A Bnnyavlmsoh családjába tartoznak a Banyntoras (kaliforniai enkefabtísz, l..a Crosse), Phlefeovírus (Rlft Yalfey láz), ihmtavírtts (a puremnía, egyfajta hemorrágíás láz vírus). Nairovírus t Nairobi uibbetegség) nemzetségek, és kuleofefe nem osztályozott Bungavírosok. Az Arenavír-rsok
-családja LCM és Lassú láz vírusok ellem antigének lomha; A Reovistsok családjába tartoznak a Reevírus, Rotuvírtís (amely akut gasztroenterítíszt okoz gyermekekben), Grbfviras és Ctotivíros: (Colorado kullancs: láz, Eebombo (emberek), ló enkefálózis, kék nyelv) nemzetségek.
A retrovírusök családjába tartozik az ösoorívö-toto alcsalád, amely olyan homárt állatorvosi betegségeket tartalmaz, mim például macska leukémia vírus, ííTLV-i és HItV-lL a EentoAmo/ (amely (artafeuízza a komán immtmdeíkieííeis: vírust (HÍV), majom ímmundefiefencja urast (S1V), macska
- 33immnírdoflefenefe vírust (F1V), ló fertőző anémia vírust), és a 5>wav/r»tál A ffl'V és S1V között sok alkalmas antigéttt feltártak és könnyen kiválaszthatók. A mcgiefelo HÍV és S1V antigének nem korlátozó példái közé tartoznak a gag, poi,: Vifi Vpx, VER, Env, Tat és Rév fehérjék, valamint azok kúlöafele fragmenseL Ezenfelül ezen antigének, kálönfefe módosításait is ismertették, Aa erre » célra alkalmas antigének jól ismertek a.
szakember számára, Például kiválaszthatunk más fehérjék mellett egy gag, pöl, YiE esd Vpsr, Env, Tat vagy ífev fehéré? kodolö s»zcx\<.nea? Jusd példán, a node-men gag fehéret, atnthu az 55>7259ö.. számú amerikai egyesült áiiautökheli szabadalmi iratban, ismertetnek;: fesd még a. DM Barouch és mtsai. [1 Vhol, 75, 2462» 2467. old, (2081)1 és RA Asm és mtsai, [Science 392, 69-74. old, (208 i s által leírt IHV és S1V fehetjéket. Ezek a fehérjéket vagy alegységeiket egyedül juíiatbstfek he vagy kpjs&ínAtóbas, különálló vAtorokon. vagy egyetlen veksoroo.,
A Pspovavírus családba tartozik a Ifelyomavfeisok afesaláája (BRfe és JCU vírusok) és a Fstpllfemavirusok alcsaiádsa: (amelyek rákokkal és papíllőma rosszindulaté terjedésével kapcsolatosak), Az .Adenovírttsok családjában olyan vitások (EX, AD?„ ARD, O.E.) tartoznak, amelyek respiratórikas betegséget cfevagy enterittszí okoznak, A Parvovirasok csaladjába, tartozik a macska parvovírus (macska enterttisz), macska paníeuliepenia. vírus, knlya parvo vírus és sertés parvovírus. A Iferpeszvirus családba tartozik az: rtfettóámtpesrtrtmm alesaláá, amelybe: beletartozik a Sisnpfexvirus nemzetség (I3SV1, líSVIl), Varícehödrus nemzetség (álveszettség, ífettotffe wáer) és a amelybe beletartozik a Cylomegaloviras:
nemzetség: (HCMY, mmc-megalovirus) és a GaínmifemzícsvirtKoc alesaláá, amelybe beletartozik a Lyraplmeryptovírtis Mtiaetség, EBV (Burkítis-limlöma), fertőző rtsottscheíílsz, Marek-féíe betegség vírusa és a
Rhadsnovártts, A Poxvírus családba tartozik a CéeWop’orvfemíre alosalás, amelybe beletartozik az örthopokvlrus [Ifertofe (himlő) és Páecwt (tehénhimlő}]:, Parapoxvlrus, Avipoxvíms, Gaprlpoxvlrus, Itepörtpnxvhns, hutposvtrss nemzetség, és az E'nfemöpervó'tnöo alcsalád, A Bepttónavínts családba tartozik a .Hepatitisz 8 viras, Egy nem osztályozott vírus, amely alkalmas lehet antigének forrásaként a Hepatitisz: delta vírus. Még további vírnsfortásök közé tartozik a madár fertőző bmzálts betegség vírusa és a sertés .rexpiratérikux és reproduktív szindróma vírus. Az Alfevlrus családba tartozik a íö aneriúsz vírus és kúlnníele erkeíahtisz vírusok,
A találmány tárgyát képezik olyan immnnogének ts. amelyek hasznosak hantán vagy nem humán állat immunizálására más patogének ellen, mint például baktériumok, gombák, parazita nnfeoergmhzmosek vagy többsejtű paraziták ellen, amelyek; humán: és nem hnmán gerinceseket fertőznek meg, vagy ráksejtekből vagy daganatsebekből szúmmznak, A bakteriális patogénck példái közé tartó wk a patogén Gram-pozitiv kokkaszok, például pneumokoRknszok; sztaElokekknszek és sztreptekokkuszofc, Patogén öram-negatív kokkaszok közé tartoznak a meomgokokknsz; gonokokknsz. Patogén enterikus Grammegatív baelihtsök kézé tartoznak nz Ezífen?öí-íemz,’«t.eoe; Rmödíunottos-, A£i%etdbe&eifa és Ffeesdfe; Afeb'ö/dosfe; óöfeíenfefe; Thígfefe; őfeemppőífes; Von.tr-rtfe; 77 sincrevi (amely iágyfekéiyt okozt; őrnccife; TötoöASr mTömoA (amely túbrémíát okoz); féívfeát (TWenzdfe}; fezeptöböfeTEis .mmfebfemfei és ípirtEum; Gram-pozitiv baeillnsok, mint példán! Líxiet'iű! .WHtKtyíogeses; £ry.«/je/ö?ítm· ζ/ηοίορο,’ήύηη C»f>wéű<«er/w« dfe.feíWrá (dlfiéría); C&ofere; A, órtdwefe (Mtfax); donovanózis (Gt-mm/oam z»g.yt«ö&?) és bartoneíiózis. Patogén anaerob baktériumok által okozott betegségek közé tartozik a tetanusz; botelizmus: más Cios.vtofes-ok; tuberkulózis;: lepm, és más Mv:toK?tt;r®»s-ok. Patogén spiroclfeiá betegségek közé tartozik a szifilisz; trepesematózisok: ’yavíY’plnta^ és endemikus szifilisz; és leptosplrőzis, Más magasstbbrenátt baktériumok és patogén gombák által okozott
-34betegségek közé tartozik az akttsKustközís; tmkardiőzss; kripíokskkózis, btetomikózis, feztoplazmózís és: köksidiöidonrikőzis; kandidiázís, nszpergillózís és mukormjkbxis; sporotricbózis; parakokcidiodomikoizis, petríeliidiózís, törtdopszózis, micetóms és krontomikózis; és ócrmatnfifőzis, Jkekorisib-lertőzések közé tartozik a dfesz, kocky Mountaín fokos láz, Q láz és Afeáertsm-hsmlö, és fertőzések példái köze tartozik: 4fcígíkrt»Kí pn&nmeíwe: metem»»; pxzíkakőzís; és szöleíéskőrüii
Cáfemydm-féitőzesek. Pntogén enkaríóták közé tartoznak a patogéu egysejtűek és béitergek, és az általuk afeozott fertőzések közé tartózik: amebiázis; malária; teíshmaruAs tripanoszomtázis; wsopíazmózís;. /feaufsmyrtA cmésík ÍAeáíms; ídsöpfesmö go/feik bubezíoAs; giardiázis; öichiaózis; fiiariázis; schísíoszomiázis;. hengeresférgek; béigiliszták vagy mételyek; és galandférgek.
1.0 Ezen orea?dzmnsok. és/vagy tasinok közül sokat biológiai támadásokra alkalmasnak xiyílváriitott a ’ Centem fer Dísease Föntről’ intézet [(CDC), Deparimsm of Heath and hm Services, USA]. Például ezen biológiát ágensek közé tartozik. a Saerto tntffoacte (antrax), Cfesrridöím öoódimmr és a taxiuja (botuiizmas), Ikeő/íkí pertA (pestis), ífertofe ?mpor (bbníő), EA/nfesefez (ridsfemia), és virális hemorrágíás láz, amelyek mindegyikéi A kategóriás ágensnek sorolták be; C&xiePe Wwtó ÍQ láz); éteucelfe: fájok (bmcellózís),
IS $arkfeökfedö mfefei (takonykor), .kteöms amm és a ΐοχηρη (tieín toxlft), C7osmkto« pertrmgons és .» tompja (epszilon íoxis), .S'/eofe «»: fajok és a ioxiniaik (eníeroíoxln S), amelyek mindegyiket 8 kategóriás ágensnek sorolták be; és a Ntpan vrms és kanta vírusok, amelyek jelenleg C kategóriás ágensként vannak besorolva, Ezetsfelul más organizmusokat Is azonosíthatnak és/vaav alkalmazhatnak ilyen célra a jövőben» atnehok my vagy másképpen vannak ovtatye;\a, Nyh^nvaío. hogy a ’.dtlmanv vornu cuaks xekíooA <· más konstrukciók hasznosak ezekből az organizmusokból, vírusokból, toslnjaíkból vagy más nteiléktettnékeíkböl származó antigének bejuttatására, ami megelőzheti és/vagy kezelheti az: «fe» biológiai ágensek általi fertőzést vagy más káros reakciókat.
A találmány szerinti vektorok beadása a ?-se]:tek variábilis régiója elleni immnswének hejnrtatásám CTl..-eket magát» foglaló mnmmválaszt vált: ki ezen lAc; <Λ cáminálására. A. temnaioíd artritiszben (RA) T25 sejt íeccpiorok betegségben riszrtevo számos spemffeus variábilis muamd jellemeztek bzen ItR-ek kozó tartozik a V- 3, V- Μ, V · í't és V«-l 7. Ily módon az ezen pellpoptidek legalább egyikét kódoló nukieissavszekveuc ia bejuttatása oh an irmmmválaszt vált ki, amelyik az RA-bsm részt vevő T-sejtcket céloz. A szkierózis multiplexben (blS) TCR-ek betegségben résztvevő számos specifikus variábilis régióját jellemeztek. Ezen TCRekkőzé tartozik a V-7 és Ve-18, Ily módos az: ezen poüpeptldek legalább egyikél kódoló nukleínsav-azekvesKía bejuttatása olyan, immunválaszt vált ki, amelyik az MS-fcea feszt vevő T-spjfeket: céloz. A szkieredermáh;rn TCR-ek betegségben résztvevő számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR-ek közé tartozik a V-ő, V< V-14 és Va-lÓ, W3C, Vu~7,: Vn-14, VmlS, Vn-íő,: Vete2k és Vo-12, ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló snkfeÍÍ5suv-molefoda bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, .atróyík a szkierodennában részt vevő T-sejtekst céloz.
Adott esetben a találmány szerinti: AAV szekvenciákat: tartalmazó vektorokat bej oítmhamnk beindításmegerősítés rendszerben is. Különféle ííven adagolási rendeket írtak fe a szakirodalomban, amelyek közül könnyen választhatunk (lásd példáid n WÖ 80/11140. számú nemzetközi közzétételi iratot (közzétéve 2000. március 2,), amely hivatkozás utján a kitanitás részét képezi].
.Az ilyen belmtítás-megsrSsítés rendszerben tipikusan egy DfíS-alapú (például plazmíd) vektort adunk be az imnrnnrendszer beindítására egy snásodik, hagyományos antigénnel végzett megerősítő beadás szamára,
- 35 műit például fehérjével vagy ilyen antigént kódoló szekvenciákat hordozó r'ekösnbináns virussaí, Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy kiválasztott antigén: ellesi immunválasz beindítására és megerősítésére, amely szerint bejuttatjuk az antigén; hordozó plazmiíl-DNS vektort, majd: megerősítési végzünk például találmány szerisíi AAV szekvenciát íartalmázó vektormi,
5' Egy megvalósítási ssőd szerint a. belndhásosregerŐsltés rendszer magába® foglalja muhiprötem expresszáltatásáí a beindító és/vagy megerősítő hoídozőeszkőzrŐl [lásd példán! R.&.. Antant, Science 292, 69-74. old, (2001)]:, amely irodalmi helyen multsproíetn rendet ismertetnek SfV és SíV ellesi irmntmválasz létrehozására alkalmas féhéije-alegységek expresszáltasására. Példáid a beindító DNS bejuttathatja a Gag, Fel, \ u, VPX es Vpr e» lm. 1 at. es Rés géneket egyetlen franszkripUintoa. Mas megoldásképpen a Sí V Gag, Fel es ló HÍV* 1 £av géneket juttatjuk be.
Azonban a beinditás-megerőshés rendszerek nem korlátozódnak HÍV ellesi imnnmlzálásm vagy ezen antigének bejuttatására. Például a beindítás inasában foglalhatja egy találmány szerinti első csimpánz vektor bejuttatását, majd megerősítést egy' második csimpánz vektorral, vagy magát az: antigént fohátje formában: tartalmazó készítménnyel. Egy másik példában a beinditás-megerósiíes rendszer védd immunválaszt biztosíthat azon vírus, baktérium vagy más: organizmus ellen, amelyhói az antigén származik. Egy másik elöísyős megvalósítási mód szériát a beindiíás-megerösltés rendszer terápiás hatást bizfositluu. amelyet Imgyonrányos vizsgálati eljárásokkal mérhetünk azon áll apot jelenlétének detektálására, amelyre a terápiát alkalmazzuk.
A beindító vakcinát különféle helyekre adhatjuk he a testben dőzisítiggő módon, amely attól az antigéntől függ, amelyre a kívánt immunválaszt célozzuk. A találmány nem korlátozódik az injekcióik) mennyiségére és helyére, vagy a gyógyászati hordozóra. Annái inkább a heiuditásí lépés magában foglal olyas kezelési rendeket, amelyek egyetlen dózist tartalmaznak Őráskertg naponta, hetente vagy havonta, vagy évente beadva. Példánl az emlősök egy vagy' két beindító: injekciót kaphatnak, amelyek körülbelül 10 pg és kőrölbelsi 58 pg közötti mettnyisegll plazmidot íartaimfomak hordozóban. A beindító DNS-vakcí-ua-készilrnény előnyös: beindító mennyisége vagy dózisa körülbelül az 1 pg és körülbelül I0ÖÖÖ pg közötti mennyiségű DNS-vakciaa tartományai esik. Az adagolás változhat körülbelül 1 pg: és 1800: pg BNfotesiíömeg-kg mennyiség közön.. Az injektálás mennyiségét vagy helyéi előnyösen a vakcináit emlős fajától és állapotától függően választják ki..
Az antigén emlősbe történd bejuttatására alkalmas DNS-vskcfoa egységdóztsás ismertetjük a leírásban, A DNS-vakcinát gyógysszaíllag vagy fiziológiailag elfogadható hordozóban szuszpendálva vagy feloldva készítjük elő a beadásra, például izoíómás sóoldaíban, vagy olytín másfele kiszerelésben, amely nyilvánvaló az ilyen beadásban: járatos szakember számára, A megfelelő hordozó nyilvánvaló a szakember számára, és nagymértékben a beadás dijától függ. A találmány szerinti ke-zn menyeket a fent ismertetett utakon adhatjuk be emlősnek, fenntnripd fokwbsdtdssli kiszerelésben biedegmdábdis bibkmnpatíbilis polimer alkalmazásával, vagy helyszínre történő bejuttatással mieellák, gélek és liposzömák alkalmazásával,.
Adott esetben a találmány szerinti beinditási lépés magában foglalja adjuváns tnegfélelő mennyiségének
33: a beadását is a beindító DNS-vakcitta-késziíínénayei együtt, amist azt a leirásban definiáljuk,
Előnyösen a megerősítő készítményt körülbelül 2 ítél és kőrillhelltl 27 hét közötti idővel a beindító
DNS-vákcina beadása után adjuk be az emlős alanynak. A megerősítő készítmény beadását megerősítő vakeihakészhmény hatásos mennyiségének az alkalmazásával érjük el, amely a beindító: DNS~yakelnáyal megegt ezo antigént tartalmaz vagy annak bejuttatására képes, A megerősítő készítmény rekombínáns vitális vektorból állhat, amely azonos vitális forrásból származik. vagy egy másik forrásból származik. Más megoldásképpen a
-36ntegerősíío készítmény olyan. késztonétty lehet, amely a beindító DNS-vakoísa által kódolt antigénnel megegyezd antigént tartalmaz, de fehérje vagy peptid tormájában, amely készítmény immunválaszt indukál a gazdában. Egy másik megvaldsitási utód szerint a megerősítő vakcina-készítmény olyan készítményt tartalmaz, amely az antigént kódoló ÖNS-szskvencíat iartalmaz az expressziójái emlőssejtben irányító szabályozó szekvencia Irányítása alatt, mini például jól ismert bakteriális: vagy virális vektorokat. A megerősítő vakcinakészitntenryel szemben elsődleges követelmény az, hogy a vakeina-készittnényben lévő antigén ugyanaz az antigén, vagy keresztreagálé antigén legyen, mist a DNS-vakcina által kódolt antigén.
Megfelelő módón a. talúiraáoy szintén jól alkalmazható olyan rendszerekben, amelyekben nem AAV vektorokat, valamim: fehérjéket, peptideket és/vagy más biológiailag: Itasznos terápiás vagy immunogemkus vegynleteket alkalmazunk, Ezek a rendszerek különösen alkalmasak terápiás óéin génltejuttatásra, és immunizálásra, beleértve védő immunitás kialakítását. Az ilyen slkahuazások nyilvánvalóak szakember számára.
Ezenfelül a találmány szerinti vektor hatékony géífbejaítatő eszközt biztosit, amely egy kiválasztott transzgent képes bejutüttn; egy kiválasztott gazdasejthe.is tóvá vagy ov vrvo, még akkor is, ha az organizmusban
1.5 vannak semlegesítő ellenanyagok egy vagy több: AAV szerofipus éhen, Egy megvalósítási mód szerint a vektort (például rAAV) és a sejteket összekeverjük er rivo; a megfertőzöd sejteket tenyésztjük hagyományos módszerek alkalmazásával; és a transzdukált sejteket újra bejuttatjuk a páciensbe. Ezenfelül a találmány szerinti vektorok alkalmazhatók kívánt géntennék út víoyj előállítására Is, Az ;>< utón termeléshez á kívánt terméket (példán! fehérjét) előállíthatjuk egy ki vám tenyészetből, mintán gszöásejteket ttanszfektáhunk:.a kívánt terméket kódoló molekulát tartalmazó rAAV-vei. és tenyésztettük a sejttenyészetei olyas körülmények között, amelyek lehetővé teszik az expressziőt. Az expresszáhaiott termékei azután kívánság szerint megtisztíthatjuk: es izolálhatjuk. Tranvzfekfálásra, se jttenyésztesro, tisztításra és izolálásra alkalmas módszerek Ismertek a szakember számára.
Az alábbi példákkal szemléltetjük a találmány számos megvalósítási módját,
Szabadalmi példák
í. példa: l.tj AAV szekvene iák PC R -aínphtikálása, klónozása és jellemzése, htem humán főemlősökből származó szöveteket szkrinsltünk AAV szekvenciákra PCR-es eljárás alkalmazásával ismert AAV-k erősen konzervált: régióín aktpotó öligíuíekktötksokkal. Az AAV'l (6. azonosítószámú szekvesehét 2886-3143.. bp-jai közötti szakaszt: válasz mt te ki PC':R.-ajnphfíkálásra, antelybert a. kspssid fehérje (Cbu) konzervált szekvenciákkal szegélyezett: hspers naotks régiója található,. amely egyedi mtndets ismeri AAV sztoriátotssban, es mndyef a leírásban „szignálóra reme»te” nevezünk. Későbbi elemzésben kimutattuk erről a srigmünra régióról i ogy a 3-as Inper variábilis régiót lefedő katszerválí oldalláncúk között: helyezkedik el.
Számos nem humán főemlős lőj perifériás veiének kezded vizsgálata detektálható AAV-t tárt. léi olyan fájókból szártnaző állatok csoportjaiban, mint például majmok, C t majmok, csimpánzok: és páviánok, Azonbart nem detektáltunk AAV szekvenciákat más tesztelt állatokban, mini {tóidéul japán: makákókhan, sertéslárkú tnakákőkban és írtőknsisajmokban, Végrehajtottuk a vektoreloszlás: kiterjedtebb elemzését Aáosus majmokból származó, boneslásker szerzett: szöveteken a Pennsylvania Egyetem és Tttlaoe kolóniák majmain. Ez AAV szekvenciát mutatóit kt szövetek széles körében.
A, ArAdE sohmuhtór régié ufpp/ijSáátoso
Az AAV 1-6 és a libáitól és kacsából izolált AAV-k DNS-szekvtmoíák egymás alá rendeztek a ,X3ustal
-37W” program és se alapértelmezett beállítások alkalmazásával, Az AÁVI-fi egymás alá rmtdezéséf — az ú] AAV? ínfennáeiójás'al együtt — az 1, ábrán mutatjuk he. Ósszehasoolrtotúsk az AAV-k szekveneiabasonlöságait
Egy vizsgálatban az AÁVi [6. azonosítószámú szekvencia) 2886-3143,. nukleotidjai közötti 25? bp régiót és az AAV2-Ő genomok ennék megfelelő régiók pásd az: 1. ábrát} azonosítottuk. Ez a régié az AAV kapszid génben helyezkedik el, és erősen konzervált szekvenciákat tartalmaz az 5’ és 3’ végén is, és viszonylag variábilis szekvenciákat a közepén. Ezenfelül a régió tartalmaz egy Orsii? restrikciós enzim helyet (C/ACCACGTC. 15. azonosítószámú szekvencia). Azt találtuk, hogy ez a régió specifikus szignatűrakén· szolgál mindegyik ismert AAV DNS esetében. Más szóval, a PCR-reakeiőt, az ismeri szerotlpusokra specifikus
11) erídonnkleázokkal történő emésztést és géielek-roforézis elemzést követően ezt a régiót alkalmazhatjuk az amplifikált DNS egyértelmű azonosítására: mint: !-es>: 2-es, 3-as, 4-es, 5-Ös, 6-os vagy másik szerotipus.
Az ÁAV1, 2 és 5 DNS-kontrollok alkalmazásával tervezőik meg: és valídsiiuk: a íáueituiítökm, es oplnnalizáitok a PCR körülmények, A láueindítők az AAV2 szekvenciáin alapultak: 5 láncíndítö IS;: az AAV2 (7. azonosítószámú szekvenoiá) 2867-2891, imkleotidtai. és 3’ láucmdltó, ISas, az AAV2· (7, azonosítószámú szekvencia) 3095-3121. nukleotidjai.
Különböző REmm? majmok, különböző szöveteiből — mint például vér, agy, máj, tüdő. here, stb. -származó cdkdárís: DNS-f vizsgáltunk meg a fönt ismertefelt stratégia aíkateaaásávat. Az eredmények azt mulatták, hogy a Ráesss majmok különböző szöveteiből származó DNS-ck erős ECR-errsplilíkáelőt eredményeztek. A PCR-termékek további restrikciós elemzése azt jelezte, hogy minden közzétett AAV
2Ö szekvenciától különböző AAV szekvenciákról smpiífíkálödtak.
A különféle majom szövetek DNS-éböl származó, körülbelííl 255 bp méretű PCR-senackeket. megklősoztttk és megszekvemtltnk. Ezen áj AAV szekvenciák bioínibrínatikaí vizsgálata azt matatta, hogy azok a kapszid gén új AAV szekvenciái, és különböznek egymástól. Az 1. ábrán bemutatjuk az .AAV 10-12 új AAV szignómra régióinak az egymás alá rendezését [sorrendben a 117., 118. és 119, azonosítószámú szekvencia].
Többszörös szekvencia egymás alá rendezést bajtpttusk végre a Eötsöü 01:.81) program alkalmazásával, Az alábbi táblázatban matatjuk be az AAV1-7 és .AAVIO-O. gesomek szignatúra régiói közötti szekvenciaazooesság százalékát.
2« Táblázat Az elemzésbe isevont székwttdák
Szekvencia száma | AAV szerotíptts | Méret (bp) |
1 | AÁVi | 2 SS |
'>· | AAV2 | 255 |
3 | AAV 3 | 255 |
4 | AAV4 | 246 |
5 | AAV5 | 258 |
6 | AAV6 | 258 |
7 | AAV7 | 258 |
10 | AAV 10 | 255 |
Π | AAV11 | 258 |
ί > i ·* | AAVI2 | ...............258...................: |
-383, Táblázat hároskénü egymás alá rendezés (azonosság százaléka)
AAV2 | AAVŐ : | AAV4 | AAV5 | AAVŐ | AAV? | AAV 1Ó | AAVlt | AAV 5 2 | |
AAVI | 90 | 90 | 8i | 76 | 9? | 95 | 93 | <Í4 | 93 |
AAV2 | 93 | ?9 | '78 | 99 ί 90 | 93 | 93 | Q7 | ||
ÁÁV3 | 30 | 76 | 9:0 | <2. | 92 | 02 | 92 | ||
AAV4 | ?ő: | •8 i | 84 | 82 | 81 | 79 | |||
ÁAV5 | ........?5.......' | .......?8........ | 79 | 79 | .....76..... | ||||
AAVő | 91 | $2 | 94 | 94 | |||||
AAV? | 94 | 92 | 92 | ||||||
AAV 10 | 95 | 93 | |||||||
AAVH | « |
A kiválasztott 25? bp méretű régiót: átivelö új AAV szerötipas .szekvenciát tartalmazó több mint: 30ö klóm izoláltunk és szekvenálrunk, Ezen 380-nál több klón hioinSörmatikal elemzése azt sagaUja, hogy ez a '257 bp hosszúságú régió kritikus, mivel jó markéiként vagy szignálóra szekvoneiaként, szolgái új: AAV szerortpnsok gyors izolálását^ és azotmsiíásám:,
B. A szignóiéra fogó? AMst BCk-mWirtkúhísA?,
A 257 bp hosszúságú szignálóra régiót ídkaimazotk: FCR-tatgoaykéat a: EGK-amplifíkáeiók meghosszabbítására a genom 5' Irányába, hogy lefedjük a rep és gének kapcsolódást régióját (1398 bp 31:43 bp, 6. szono-míxzamú szekvencia): es a genom 3’ irányába, hogy előállítsuk a teljes. <o;j gén szekvmtcí^m
W (28őÓ bp - 4b08 bp, 0, azonosítószámú szekvemöa). A PCk-amphhfcíci.őkat a xaAsmjs körülmények közeli hajtottak végre, beleértve áenateálásí 95 X'-on 8,5-1 percen keresztül, aneilálast oú-n5 “C-ott 0.5-1 percen keresztül és kiterjesztést 72 :Χ-οη kb-orsként 1 percen keresztül, összesen 28-42 ampliízkáelós cikluson kérésziül.
Az: egymás alá rendezeti szekvenciák 'A’ részben ismertetett alkalmazásával: kél. másik viszonylag konzervált régiót ;rzonosiiottmA a rey gén 3’ vege és 25? bp hosszúságé: régió 5’ vége között található szekvenciában és a: o 25? bp iragmetssíől. leolvasással, megegyező irányban, de az AAV 3’ 1TR előtt található szekvenciáim. Két új láoemdirő-készfetet terveztünk és a optimalizállak a PCR körülményeket az ój AAV szerotípusok teljes kagszídjának és a rap szekvenciák egy részének, előállítására, Közelebbről, sz. 3’ antpiiükációhoz az 5' AViNs iáneinditó szekvenciája GC'TGCG'ÍCAACTGGACCAATGAöAAC [az AAVi (ő. azonosítószámú szekvencia) 1398-1423, nekleotidjai]' volt, és a 3’ iáaoínóító a férni ISas volt, A 3’ ampESkáciőhoz az 5’ Iáneinditó: a fend is volt, és a 3’ iáneinditó sz AV2Lns volt TCGTTfCAGTTGAACTTTGöTCTCTGCG [az AAV2 (7, azonosítószámú szekvencia) 4435-44Ő2, nuklectidjaij.
Ezekben a PCE-amphEkációkhan a 257 bp hosszúságú régiót alkalmaztak ECK-horgortyként és tájékozódási pontként átfedő feagmensek létrehozásához, amelyekből teljes kapszid gént állrsottok: eto a. szlgnatnra régióban található Ötálll helyen végzett mzíoriákmássak az itt ismertetett módon előállított 5' és 3' meghosszabbított fesgmensek ampiiKkálását követően, Közelebbről, az: intakt AAV? mg? géa előállításához három ampliükáciés terméket: (a) a szignálóra régió szekvenciáját; íbj az: 5’ kiterjesztés szekvenciáját; és (c) a 5' küenesztes szekvenciáját kionoztuk be a />CEa-7bpo [iro üregen] plaznndeermcbe a gsaoó utasítása· szernt
30: Azmáo a plaztaidokat megernészteítúk öraHI ettzhraoek és rekembínálhtk intakt rap gént ksaíakíivs.
-39Ehbsn -a munkában az AAV 7 és AAW kapszid szekvenciájának körülbelül 89%-áí izoláiütk és elemeztük. Egy új: szcretípttst, az AAV9-et fedeztünk fel a 2-es számú majomban.
A fest ismertetett PCR-feorSlmésyek alkalmazásával izoláltuk az AAV? rop génjének fennmaradó részét, és megklónozfe-k olyan láncmáltők alkalmazásával, amelyek az .AAV genom life. és Mól. bp-ja közötti szakaszát ampliSkáljék farmi: az AAV 2 {?.. azosrosliöszámó. szekvencia) számozása alapján szátnltoítímkj. Ezt a kiént megszekvenáhnk az il'R-ek nélküh sebes AAV? genom elöállitásához..
C. A 3,1 kb <:·«;? iragmens közvetlen amplíítkálása
A 3.1 kb meretü teljes hosszúságú G.y; iragmens NHP szövetből és vér DNS-bőí tönértó közvetlen atttpliitkálására két másik erősen konzervált régiói azonosúonunk az AAV genomokban «agy iragsrsensek PCR19 es ampliiikálására. A rep geo közepén találkatő koatzervált régióban lévő láneindítót választottunk (AVlnst 5’GCTöCöTGAÁCTGGÁGCAA.TöAGÁAC-3', a ö. azoriosiiőszátnú szekvencia 1398-1423, wWotMR.) együtt a cet? géntől leolvasással megegyező irányban találkatő konzervált régióban: elhelyezkedő 3’ láocmáitőval (AV2cas:: 5',-CöGAöAGÁCGAAAGIl'GAACTGAAACGA3\ ?. azonosítószámú szekvencia) a teljes hosszúsága eap bngmensek ampltbkálásánoz. A PCR-termékekeí Topo-klősoztttk a gyártó utasításai szerint lő (Invítrogen), -és elemeztük a szekvenciáját Dfegertgcnomfer alkalmazásával (Qiagesgextönxícs:, Seaítfe, WA> > 99,9% pomossúggaL Összesest 59 fatpszid klóra izoláltunk és jellemeztünk. Ezek kozott 37 klón származott Λ» majom szövetekből (rh.l - rh.37), 6 klón származott ébno.moíogotís' majmokból <sy.t -- cy.ö), 2 kión szánttazotí páviánokból (bb.l és bb.2) és 5 klón származott csimpánzokból (eh,! - sh,5j.
Annak a lehetőségnek kizárására, hogy az új AAV csatádon belöli szekvencia-tiiveeziíás nem a PCR.
tnülemtéks, mint például PCE-kőzvetítclt gén: splicmg különböző: homológ szekvenciákat tartalmazó részleges: DNS-tetnplátök között átfedő hosszabbítással, vagy bakténumok rekombinációs felyamatainsk: sz eredmérsye, végrehajtódunk egy kíséríetserozatoi azonos körülmények között VEI antpliltkslássra teljes cslfeláris: DNS alkalmazásával. Először intakt AAV7 és AAW pbzmidökat kevertünk össze azonos mőlaráttyban, majd sorozatban, meghígitottuk. A sorozatban meghíghoö keverékeket alkalmaztuk terápiáiként 3 ,1: kb mérető VPI
Ifegmensek PCR-amphffefeiéjába® univerzális: Ifetomditők Alkalmazásával és azonos PCE. körülmények között, mint amelyeket a DNS ampEEkálására aikalmazímtk, hogy lassúk, kelelkeznek-e hibrrd. PCfe-fermekek. A keveréket baktériumokba úanszferrnáltuk, és: traoszfermánsokat szolaltnak hibrid: Hónokat keresve, amelyek lehetséges módos bakteriális sejtekben zajló rekombinációból származnak. Egy másik kísérletben élbasttortnk az AAV? és AAV8 piazhxidökat blspí, Avul és kittel enzimekkel, asheiyek mindegyike többször több helyen.
éltetett* a gcnomokat, összekevertük az enfes/Atttemeke; különböző kombinációkban, és VEI fegmensek. FGE-astpliEkáciőiára. ttíkalmazmk azokat: azonos körülmények körön, hogy teszteljük, vajon kelétkezaek-e ECR-fermékek a részleges AAV szekvenciák átfedő meghosszabbhásstauk es eminenseképpen. Egy másik: kísérletben gélen megtisztított 5’ 1,5 kb AAV? VEI iragmens: és 3’ 1,7 kb AAW A ER üaemeas szignálóra régióban átfedő keverékét sorozatban tsegbigiíoítak, és lAlR-ampliSkacióra alkalmaztuk vban mttjran sejtvottaiből extrahált 299 ng colhtláris: DNS jelenlétébe® és Ittányábaa, amely nem tmtahmt-ott AAV szekvenciákat TögAfen elemzéssel vizsgálva. Ezen kísérletek egyike sem mutatta átfedő szekvenciák: hatékony FCR-kőzveiiteh: keletkezését a gexsotníáőx DNS cop atnphőkáeiójávai azonos körülmények között (adatokat nem köziünk). További megerősítésként 3 pár láscínditőt terveztünk, amelyek. különböző HVR-ekbett találhatók, és szekvencia-specifikusak voltak a F9.S3 jelű Mesw soájőmhói származó 42s klón variánsaira, különböző kenfelnációban amplifikálva. rovídebb iragmenseket abból az F953AŐ1 származó ínezentcrlkss nyirokcsomó
-40(MIN) DNS-feSI, amelyből & 42s klóul szölálbtk. A. teljes hosszúságú nap klóitokban azonosított összes: szekveneia-vaóánsl. megtaláltuk ezukben a rövid írégpsensekfee» (adatukat m köziüsk).
2, példa: Az adeno-asszoelált vírasök létíyeges evoiüeíóu mamsek keresztül a főemiösdkbes a természetes fertőzések folyamán
Kiválasztat AAV izolátornak szekvenelaeíentzéSe divergenelát tán fel a genomban, amely a fespszid fehérjék hipervariábllis régióiban a legkoticentráhabb. Az epidemiológiai adatok azt mmaíják. hogy minden ismert szerotípss endemlkös a főemlősükben, habár a klinikai izolátomok hantái! csecsemők anális és torok kenetesből származó AAV2-re és AAV3-ta, valamint barnát! kondilómás szemölcsből származó AAV5-re korlátozódlak. Nem kacsolódott egyetlen ismert klinikai következmény sem AAV fertőzéshez.
ló Annak megkísérlésére, hogy jobban megértsük: az ÁÁV bkdóglájáí, aem: humúts: íömlősöket alkalmaztsnk modellként a természetes fertőzések következményeinek a jellemzésére. Nem humán löemldsükból származó szöveteket, szkrmelttínk AAV szekvenciákra a találmány szériád ECfe-ss eljárás alkídmazásával ismert AAV-k: eresen konzervált régióin alapuló oligonukleoiidokkal (lásd az 1, példát). Az AAV1 jó., azonosítószámú szekvencia] 283Ő-3143, bp-jal közepi AAV szekvenciát választottak ki FÜRlő ajdpliőkálásm, amelyben konzervált szekvetfelákkal szegélyezett htoerváfíshilis régiója található, amely egyedi mlndea ismert AAV szerosipusban, és amelyet a leírásban ..szignálóm régiónak nevezünk.
Számos nem humán főemlős, táj.....min? például /iötutís majmok, Qrm/wo/ogoK? majmok, csimpánzok <·» o.o,szaró pentonaí- verjek kezdet! ssogalut.! detekíalhcto \ W-t tan fel modegyd, habot s/artna/v állatok csoportjaiban. Végrehajtottuk « vektoreloszüs kltetjedtebb elemzését 3?áí-ií«' majmokból származó, boncoláskor szerzett szöveteken a Pennsylvania Lgyetem és 'faltam kolóniák majmain. Ez AAV szekvenciát matatott ki szövetek széles köreben.
Az ampidskált szignálóra szekvenciákat szabklösezfek plazmtdokba, es elemeztük egyedi transzfessstástsok szekvenciáját. Ez lényeges variációt tárt fel a kslönbdző állatokból származó: klóitok nakfeotidszekvenciájában:. A szigítaíará szekvencia variációját mögfigyeifeeltük az egyedi állatokból előállítóit kiónok
2Ő közöd Is, Két állattól begyűjtött szöveteket.....amelyekben egyedi szignálóra, szekvenciákat azonosbotfenk (azaz a 98E844 vastagbele és a ÜSEOSö szive)......tovább elemeztünk a szekvencia meghosszabbításával az erősen konzervált szekvenciákra specifikus oilgonnkitsaüdrskar alkalmazó PCE-rel. ily módon teljes provirális szerkezeteket rekonstruáltunk mindkét szövetből származó viráhs genom esetében, amint: a leírásban ismertetjük. Ezek a pruvirusek különböznek a többi ismert AAV-tői, és a legnagyobb szekveneia-divergencú'it a cnp gén régiójában fig » éltük meg.
Tövürb kísérleteket bajtottonk végre annak igazolására, begy a. nem humán: főemlős .szövetekben állandóan megtalálható AAV szekvenciák olyan fertőző vírus provlráiis geoamját képviselik, amely kimenthető és víríönökaf képes alkotni., A 98EÖ5Ó számú állat rnmszőveíéből származó geriomiáiis: DNS-t — timeíyből AAVŐ szignálóra szekvenciát detekláifek..... megetné.szteímk olyan: endonuMeázzal, amelynek nines: hasítási
3ő helye az AAV szekveociábast, és tmöszfekíáltnk :283-as sejtekbe, amely humán adersovíras mos szerotípus £1dcletáií genernját tartalmazza a segítő bmkciők biztosítására. A kapott lízátumot 293-as sejtekben passzáimk még: egyszer, és a lízáíamot visszanyertük és elemztók az AAV nap fehérje jelenlétére cup feisésje elleni széles reagálő-képessegú poliklosálís ellenanyag alkalmazásával, és áz olyas: PCR-rel ampliőkdü AAV pzmzims szekvenciák jelenlétére és gyakoriságára, amelyből az AA V8 származott, Áz eodoudkloázzal megemésztett szív
DNS és áz adenovírus: segítő plazubd bttnszfekiálása sagy mennyiségű A.AV8 vírust eredményezett, amint azt: a ctip fehétjék Wesfertí-hfottal történő detektálásával és 293-as sejtenként íö* .AAV8 vektor genom jelenlétével áettíonsírálfuk, Llzámmot állt'íötttmk elő nagyléptékű preparálással, és az AAV-t megflsztítotmk eézíumos elépítéssel. A tisztított preparátum 26 öm-es ikosaítedrális szsakezetet mutatott, amely azonmtnák látszott az AAV 2-es szerotipusévál, Az adénóvíms segítővel önmagában végzett transztektáfe m credntényezett AAV fehérjéket vágj' genomokat, kizárva a szennyeződést mint a kimentett AAV forrását.
Az AAV szignálóra szekvenciák állatok közötti és állatokon belüli variációjának további jellemzésére kiválasztott szöveteket vetettünk alá kiterjesztett fiCR-nelc, hegy amplifikáljuk a teljes c<rp nyűt leolvasási felsokak
A kapott fragmettseket bakteriális plazmáinkba klónoztok, és egyedi ímnszformáusekaí izoláltunk, és lő teljesen megszekvenáltttk azokat .Ez az elemzés mezesterikns nyirokcsomókat faglah magában bárosi Efezm rosjoiíttői (Taiase/V223 — ó klón; I'ulane/T6i2 — 7 kién; Tul&rrf953 — 14 kiótfsntájai. két Ékeset majomtól (TulafeV251......3 kloa; Fesn/ö0fiö33 — 3 klón), lápét egy Sássav níajomtól (Pemtt9?fiő43 — 3 kiön), szivet egy Mew majomtól (IHGT/9 8 E946......1 lelőj·} és perifériás vért egy csimpánztól (New iherta/X133 — 5 klóul, hat Gynomofogons tmyosüól (Charles Ríver/A1378, .A3Ő99, A3388, A3442, A2821, Á3242 — összesen 6 klón) és egy páviántól (SFRB.· 8644 .....2 klón), A 15 állattól származó 59 megsxekvesálí klón közül 39-at tekintettünk nem rcdmxlávvvk. legalább 7 aminosavttyi különbsége! találva közöttük. A nem redundáns VF1 klónokat az izolálás sorrendiében sorszámozóik, előíagkén; jelezve azt a ttetn humárt főemlős fejt, smeiyből származtak. Ezen 3(3 sem redundáns klón és a korábban ismertetett 8 AAV szerotlpus közötti szerkezeti rokonságot a φόΐϊ/Α?!? program: alkalmazásával határoztuk meg (Húson:, B, H,, „SplitsTre©; ímaiyzing and visualizíng evrdutiosary data,”, Biöisibrntaties 14,68-73, old. (1998)) , a „spiít deeojtiposlttöu” eljárás implernejttáeíéjávah Az elumzés a szekvenciák közötti homoplázlát fűszert! hálózatként ábrázolja, és nem pedig kettéágazó fekést. fismek az az: előnye, hogy lehetővé teszi olyan csoportok dmekíáiássí, amelyek konvergencia eredményűi, és kimutatja a filogenetikai rokonságot, még akkor is, amikor azt párhuzamos események eltorzítják. Kiterjedt filogenetikai kutatásra lesz szükség annak érdekében, hogy megvilágítsuk az AAV evolúcióját, míg a jelen szásdék csapán a különböző: klánok csoportosításs á, szekvenciafeasonlóságttk alapj án,.
Annak megerősítésére, begy az új VR1 szekvenciák fertőző vitális genosxokból származtak, megemésztettük a vitális DJáS-t nagy ntennylségbes tartalmazó szövetekből származó ceMáris DNS-t olyat! eisdosukleázzal, amelynek sem kelless az AAV-a. belül hasítania, és 293-as sejtekbe transzfektáltuk, maid megfertőztük azokat adenovlrussál, fiz AAV gesomók kimentését és ampliükáeloját eredményezte két különböze alkutól szármázó szövetek PNS-eboí ^dalokat nem kéziünk!
Az új AAV-k Vfil szekvenciáit tovább jellemeztük az ummosav-szekveacla variáció természete és elhelyezkedése szempontjából, Mind a 30 Vfil kiest, amelyekről kimutattuk, hogy különböznek egymástól több mint IS antinosav-szekvenciaban, egymás alá rendeztük és értékeltük a variációra minden egyes oidallánenáh Á divergens szekveseisterületek meghatározására kifejlesztett algoritmus 12 hipervsriábilis régiót (BVK) eredményezett, amelyek közül 5 átfedő, vagy része a korábban leírt négy hipervarsáhills régiósak (Rotín, mint feni; Kutledge, mint: fent). A háromszoros közeit csúcsok: tartalmazzák a legnagyobb variabilitást (HVR5-10). Érdekes módon, a 2- és S-szőrös tengelyen elhelyezkedő burkok is intenzív variációt mutatnak, A HVR I és 2 a kapszid fehérje N-ferminális részében található, amely nem bontható fel a. röntgen szerkezetben, azt sugallva, hogy a VP1 fehérje N-tcnainalisa a váriéit felszínén található,
Valósidejű PCR-t alkalmaztak 21 Mess® majom szöveteiből származó AAV szekvenciák: mennyiségi •42 megfealározására Ismert AAV-k rap jegy készlet) és ρφ (két készlet) génjének erősen konzervált régiói ellent láncindliék és próbák alkalmazásával. Mindegyik adatpont egy egyedi állattól származó szöveti DNS elemzését reprezentálja. Ez, megerősítette az AAV szekvenciák széleskörű eloszlását, habár a mennyiségi eloszlás különbözött az egyes állatok esetében. Az állatok forrása és a kezelések korább! loöénste látszólag sem belólyáselta az: AAV szekvenciák eloszlását Űfens majmokban. Az AAV mennyiségi meghatározására alkalmazott láncindltók -és próbák bárom kíílőnbSzö készlete konzisztens eredméuyeket adóit. Az AAV legmagasabb szintjét konzisztensen a mezeniorlkas nyirokcsomókban találtuk» átlagosan 0,01 kópiát diploid germmorsként a 13 pozitív állatban. A máj és lép szintén .nagy mennyiségű vírus DNS-í tartalmazott. Voltak példák nagyon magas AAV-ta, mint például a 98B05Ő jelű majom szívében, a 97B04) jelű Átesne majom lépőben és az RQ44Ö? jelit Etem majom: májában, amelyek sorrendben 1,5, 3 és 20 kópia AAV Szekvenciát tartalmaztak diploid geanmonkérh:, Viszonylag alacsony szinté vírus DNS-t figyeltünk meg a perifériás mononúkleártS: sejtekben, ami azt sogzlljs, hogy a szövetek adata nem a benőnk található vér miatt van (adatokat nets közlünk), Megjegyzendő, hogy' ez az. eljárás nem szükségszerűen detektál minden, .ma humán főemlősben állandó AAV-t, mivel a detektáláshoz nagyfoka hmnotöglára van szükség: mind az ollgonákleotídokkal, mind a valósidejű PCR próbával. Az ÁÁ.V DNS-f nagy mennyiségben strrtakuazó állatoktól származó szöveteket tovább elemeztük a DNS molekuláris állapotára DNS-hibridtzálási módszerekkel, és azok celiutázis eloszlására, /» «/;; hibridizációval,
A különböző állatokból izolált és ugyanazon állatok szöveteiben lévő AAV provirális fragmsnsekben feltárt szekvencia-variáció fajtája emlékeztet -arra az evolúcióra, amely sok RNS r-frassal történik sz általános
2S járványok során vagy akár egy személy megfertőzésekor. Bizonyos helyzetekben, a vad típusú vírus fogalmát helyeticsítetíe a kvázlfajok rajainak létezése, amelyek a gyors replíkáeiö es mutációk eredményeképpen evolvstoak szelekciós nyomás jelenlétében. Egy példa a HÍV általi fertőzés, amely immunológiai és farmakológia! nyomásra, adott válaszkém evolvál. Számos mechanizmus hozzájárul az: RNS-vírusok magas mutációs: rátájához, beleértve a reverz-üanszkríptáz alacsony pontosságai: ás: hibajavító képessegének a hiányát, és a nem homológ és homológ rekombinációt.
Ebben a vizsgálatba» kimutattuk az: AAV kváziíajat: kialakulásának a bizonyítékát több klónozott proviráhs fragtaous: szisztematikus szekversulásával. Valóban, nem. találtunk azonos .szekvenciát az állatok kősóit vagy azokon, belül izolált egyik meghosszabbítót;: klánban sem. Ezen szekvencia-evolúció egyik fontos: tnechaníztnösáttak tűnik a homológ rekombináció magas aránya egy korlátozott számú szülői vírus között. Az összesiíeú eredmény a ctg? fehérje hipervariáhilis régióinak kiterjedi cseréje, ami kimerák olyan; halmazához vezet, amelyeknek különböző leket a tropizmesa és: szerológiai tulajdonságai: (azaz a képessege az immunválasz elkerülésére, külőrsösen tani a sesnlegesitő ellenanyagokat illeti). Nem egyértelműek azok a mechanizmusok, amelyekkel a homológ rekombináció végbemehet, Egy lehetőség az, hogy a különböző egyszálú .AAV geuomok ’ ésszálai tmeliálódmík arepiskáció folyamán, amint azt leírták az AAV rekomhisánsokkal történő fertőzés magas szittfie esetébert. Nem egyértelmű, hogy más sneebamzsnnsok is hozzájárulnak-e a?,: AAV' fertőzések: szekvencia-evolúciójához. ráz AAV rspíikáeiőja alatt bekövetkező általános mutációs ráta viszonylag aa^sutvjdK trk t.s v iónok mm muaihlk a vuhkae 's htlw na^s „vákortstg s Vo b tt í* \k\ genotrsuk jelentős: átrendeződését írták le a httkus fertőzés Ady unan, ami delétho teíeríensio részecskék kialakulásához vezet. Függetlenül a szekvencht-dlvergeuciáltoz vezető mechanizmusoktól, néhány kivétellel n
4Ö kváztíájok VP1 szerkezetei intaktak. maradiak lázisietolódások nonszensz mutációk nélkül, azt sugallva, hogy a43legplőnyösefeb alkalmassági profilú vírusok kompeíiíiv szelekciója hozzájárul a. populáció ómarínkájáboa.
Ezek á vizsgálatok jelentüséggel bírnák a biológia ás gyógyászat számos területén, A. vírusok gyors evolúciójának az elvet.....amelyről korábban azt gondolták, hogy csak az. RNS-vírusokra jellemző tulajdonság
......figyelembe keli venni a ÓvS-vírusok eseteken is, amelyeket klasszikusan szerológial vizsgalati eljárásokkal jellemeztek, A Farvtnárnsok esetében fontos lehet új eljárások kifejlesztése a vírus Májútok letsásarx amelsek mgatös·. foglalják azok szerkezeiének és biológiájának a komplexitását, mint például a HÍV eseteben, amelyeket hasonló szerkezetű és funkciójú általános családokba osztályoznak, amelyeket kiadóknak neveznek Wó alternatív stratégia az rzolátomok kategorizálásának a fitlytatása a szerolögía specifitás szempontjából, és krífefitímok kiaktkllása a szerológia csoportokon belüli variánsok leírására.
lö A példa: AA¥2 íTR-t tsrtalsnazó refeombmúns AAV genomok vektorológiája AAV2 rop és új AAV cop géneket tartalmazó piazmidok alkalmazásával sxerolőgiai és génátviteli vizsgálatokhoz különböző állati modellekben,
Kánéra pakoló konstrukciókat álfitnrsk elő AAY2 íyp és az új AAV szerofípnsok cap szekvenciái fezionáltaiásával, Ezeket: a kimérá pakoló kottstrnkctókaí alkalmazzak kezdetben az AAV2 ITR-t hordozó rekombínáns AAV genomok pszendotípizálására 2Ö3-as: sejtekben tripla trznszfeketöval, Add segítő plazmid alkalmazásúval. Ezeket a pszeudotípizált vektorokat alkalmazzuk a tehesrínsény értékelésére te&tsszdukcio-alapú szerotógiat vizsgálatokban, és értékeljük az új \A\ ^zeroisposok génátviteli hatékonyságát különböző állati modellekben, beleértse NHF-ket és rágcsálókat. ntAi voblnű ezeuó) szerotipasok intakt és fertőző vírusait, A-M-ÍÍCOTA
AAV2 plazmád, amely tartalmazza az AAV2 ITR-t, és zöld fluoreszcens .fehérjét expresszáil konstitutív promóter szabályozása alatt Ez a plazmid az alábbi elemeket tartalmazza: az AAV2 H'R, CM V promóter és a GÉP kódoló szekvenciák,
B. Tíwíss ákbíozdsa
A rekombináxos pszeudotipizalt AAV7 előállítására .szolgáló kunéra Pzortz-plazstíd előállításához a p5E18 plazmidot [Xiao és mtsai., 1 Virol 73, 3994-4003. old. (1999)] részlegesért megemésztettük Xhol enzimmel, begy ünearizáljúk a plazmidof csak a 31ő9„ bp-nál található Xhol helyen Azután az Xhol enzimmel elvágok végeket betöltöttük és vfészaiigálfek. fizi; a módosított p5El8 plaznndot elhass tottnk Xbal és Xboí enzimekkel teljes emésztésben, hogy altávolitsnk az AÁV2 cup génszékvenciát és helyettesítsük egy 22ő? bp hosszúságú SpeVXhoI fiaesnenssel, amely tártalnuízza az AAV? cop gém, amelyet a pGRAAY? 0-5+15-4 piáznúdból izoláltunk, .A kapott, utaznod tartalmazza az AAV2 «gr szekvenciákat a Rep73,fok-re az AAV2 PS ptúmöter szabályozása alatt, és az AAV2 np szekvenciákat: a Rep52/4Ü-re: az. AAV2 F19 promóter szabályozása alatt. Az .AAV? kapszid szekvenciák az AAV P40 promóter szabályozása alatt: állnak, sasely a rsp szekvenciákon beiül található. Ez a plazmid továbbá tartalmazza a. ?vp ŐRE 5’ távtartó szekvenciáját..
C, RrtCKíúíílpfedk ο-IP E BídőSfiásö
Az rAAV részecskéket (AAV2 vektor AAV7 kapszklhapt adenovírus-mentes eljárás alkalmazásával állítjuk dó. Rövidem a cfiz-plazmldot <pAAV2,1 ItteX plaznúd, amely AAV2 ITR-t tartalmaz), és a p€RAAV7 0-0+15-4 fenssz-plazmídot (amely tartalmazza az AAV2 rep és AAV? cop géneket) é$ segítő plazsnídot: egyidejűleg iranszfektálíunk 293~as sejtekbe 1:1:2 arányban kalcimn-feszfeíos kícsapássai.
- -44
A pAd segítő plazmátok éldállkásáihoz pOÖ'18 plázmidot vásároltak a Microfeix cégtó! (Cánada). Az L2~t és O-at tartalmazó RsrS fragmenst deletákuk a pBEÍö!8-feői, előállítva az első- segítő plazmidet,. a pAdAF:l3-a:. Az: AdAFI plazmídot az Asp?88foalt fragmens Bbessaipt-be történő klónozásával állítottuk elő PmcVSgf delécídval izolálva a pBííökö-bol. Az MLP,. L2, L2 és 13 géneket deletáhuk a pAdÁFl pluzmidhmt,
Egy 2,3 kb Nrul. fragmens és azt követően egy 8,5 kb RsriENru! fngnmns öeléeldjával «leállítottuk sorrendben a pAdAES és pAdAFő segítő: plazmídokat;, A segítő plazn: id - amely et pAFó pkiznhdnak nevezünk — biztosítja az esszenciális E2a és E4 OREő segítő funkciókat, amelyeket nem biztosít az Ebet ekpresszáló segítő sejt, de belelátva vannak belőle az adenovírus kapsztd lekérjék és tünkésonahs ΕI régiók.
Tipikusan 58 ug ONS-t (cfe?:/z«».sr:ségRö} öanszfoktaHunk egy 150 mm-es szövetfenyésztő csészére.
A 293-as sejteket 72 órával a transzlektálúsf követően gyújtottuk be, szonlkáltak és 8,5% nákímn-deovikoiáíial kezeltük (27 X'-on 18 percen keresztül), A sejdizátuinokat azután: két metafeeu dszriteítuk CsGl-gradiensen. Az rAAV vektort tartalmazó csúcs frakciókat őwegyüjiőttük, összeSsíötíük és PRS-se! szemben dlahzáltuk.
4« példa: Intakt új AAV szerotipusokat tartalmazó fertőző klánok létrehozása az alapvető virológia tanulmányozására humán és NNE-eredetü sejtvenalakbas, és az új AAV szerotlpusek pategenexísének értékelése NHP és egyéb alaki modellekben.
Ezen cél elérésére: a genomséta rendszert alkalmazzuk 3’ és 5” terminális szekvenciák (1TR) előállítására és az Intakt: új AAV szeroiipus genotsfrkat tartalmazó teljes kiónok előállítására.
Röviden, a kereskedelmi forgalomban beszerezhető őta-eram dtamne lltata O reagenskészletet (Ctöntechj alkalmazzuk AAV? szekvenciák jelenlétére pozitívnak azonosítót; majom szövekkól és sejtvonalakhől származó genomiálís DNS megemésztésére Dral, EcoRV, PvuH és Stoi endosakleázokkal, és ősszeligáljtík azokat a- ítaow taRta adaptortal, hogy négy kúlönálló ftao.nse tarite' könyvferat (GWL) állítsunk elő, A GWE-ekból származó DNS -; mmpkhként alkalmazva az AAV7 es az azl körülvevő gsnomíáh's szekvencláka: PCR-rel ampísíikáhuk az 1-es adaptor Sátanáltőval (API, a reagenskészlsl része) és egy AAV725 re specifikus 1-es láncindífoval, majd beágyazott PCR-rel a 2-es adaptpr iáneindítóvai (AF2) és egy másik ?VW7~re specifikus 2-es Sánc-indítóval, amely mindkettő belső helyzetű az első iáneíndhó-készíeteez képest, A beágyazod PCR fö FÜR-termékeit megklónozzuk -és jellemezzük szekvencia-elemzéssel
Ebben a kísérlete a generikus AAV genom 257 fep-ját vagy más szignáléra fotgmenst lefedő lándaditókat alkalmazunk a Immár; és NI1P-eredetű sejtvosalakból extrahált eellűlárls DNS ECR38 amplifkálására, hogy azonosítsuk és jellemezzük a látens AAV szekvenciákat. Az azonosított látens AAV genemokat kimentjük a pozitív selívonalakhól különböző fajok és törzsek adenovírus segítőinek az alkahnazasáv al,
A fertőző AAV kiónok NBF-e?ede:ü sejtvonalakból történd izolálásához beszerzőnk egy kívánt sejtvonalat az ATCC-íöl, és EGR-rel szkríneijük, hegy azonosítsak a 25? bp méretű ampkkont, azaz a találmány
3.-5 szerinti szignáléra régiót, A 257 bp méretű FGR-tetméket megktónozzuk és szerotípízáliuk szekvenciaelemzéssel. Az AAV? szekvenciát tartalmazó Ilyen sejtvdnafek. esetében a. sejteket megfertőzzük S V-15 -fel (egy ATCG-iőI beszerzett májon: adenovírus), hanta Ad5~tei vagy transzífektáljuk: az AAV segítő frakciókért felelős humán Ad géneket hordozó piazmíd koastrtíkeiőval. A fertőzés vagy trasszfektálás után 43 órával a sejteket begyűjtjük, és „11 irt DNS-t preparálunk az AAV? genom klónozásához Xziao és mtsai. |1 Víroi, 73,3894-4083:.
old. 11989)1 eljárását követ: e.
S. pétd® AAV vektorok előállítása aA 3. példában az AA\ 1*7 esetében alkalmazotthoz hasonló pszeudotipizaló stratégiát alkalmazüink AAV1, AAV5 és AAVd kapszid fehérjékkel pakolt A.AV2 vektorok előállítására. Rövidén, AAV2 ÍTR-t tartalmazó AAV gsPonsOkat pakoltunk 293-as sejtek tripla iranszíekeiöjá.vái etsz-plaztttiádai, aáónoviras segítő plazmáddal & tóméra pakoló konstrukcióval, amelyben az AA.V2 rgp gés fezionáltatva van áj AAV szerodpusok c&p génjével, .A kánéra pakoló konstrukctók előállításhoz a pSEl S plazorid 3169. hp-játtál találkatő Xhol. helyet eltávolttettuk, és a módosított plazsnldot megemésztettük Xbal és Xhoí enzimekkel teljes emésztésben, hogy eltávoltak az AAV2 οφ: gépiéi és helyettesítsük az AAV8 o«p gént tartalmazó 2267 bp méretű Spsl/Xhol tfetgmenssel (Xiae, W. és mtsai., 3, Virol 73,3994-4083. old. (1990)]. Hasonló klóstozásí stratégiát alkalmaztunk
AAV2G és AÁV2/S kimérs pakoló plazmátok létrehozásához. Az összes rekomhináns vektort szokásos CsCI kiépítési eljárással tisztítottak meg az AAV2/2 kivételével, amelyet egylépéses heparin kromatográfíával tisztítottunk.
Az: AAV vektorok genom-kópia (GC) tifereít TaqMegt elemzéssel határoztak meg korábban leirt, az SV40 pöli-A régióját célzó próbák ős láríeináítók alkalmazásával íGao, G. és misaí,, Hűm,. Gene Ther. 11, 28791$ 2091. old, (2800)1,
Számos in vto és ór vívó vizsgálatra szolgáló vektort áhitottank elő mindegyik szeroíipus esetében. Nyolc különböző transzgés-kazsiiái építettünk be a vektorokba, és rekombináns vidonokat állítottunk elő minden szerottpus esetébe® A vírusok: kitermelését a genom-kópia alpján az alábbi 4. táblázatban foglaljuk ossza. A vektorok kusrnxelése mindegyik, szeroíipns esetében magas volt, a szerottpus közötti konzisztens különbségek nélkül, A táblázatban bemutatott adatok átlagos genom-kópia kitermelések szórással x 10! ! szorzóval, .59' csészén (1 Síi mm) végzett transzfekeiő több előállítási kísérletéből.
6, példa: A pszendotipizáh vektorok szetolögial elemzése €578126 egereket öltöttünk be különböző szerotiptrsá AAV03Á1AT vektorokkal Intramuszkulárisan (5 x lŐí( OCX és 34 nappal később szémmmmtákat gyujföttönk. Az AAV egyes szerotípussi ellent szérumok semlegesítő és kereszt-semlegeslíő aktivitásának tesztelésére a szérumokat Iraeszdukclóo alapuló ellenanyagot; vizsgálati eljárásban elemeztük [ö;to, G, P. és mtsai,, J, Vóok 78, 8934-8943. old, (1996)]:, Közelebbről, a semlegesítő ellenanyaguk jelenlétét a szérum 34-31-es sejtek különböző szeretipusd jelzővimsok (AAVCMk f'GFP) általi transzdukcinjat gátló kepes&esenek megaliapítavrtai határoztak mag, Né/elcbbtvi az egyes szerotiposá AAVCMVEGí·Ρ jelző vírusokat [olyan fertőzési szánt (MO1) mellett, amely a jelzősejtek 90%-ának transzxíukálődásához vezetett! elöinkubáltak az AAV különböző szerotípusait kapott állatokból vagy naiv egerekből származó, hővel inaktivált szérummal, 37 ANon egy órán keresztül történő inkubáiás után a vírusokat bozzáadluk 84-31 sejtekbe?. Pő-utétSkeiyes iníkretíterletnezeken 48 vagy 72. órára, a vírus szerotipusáíöi függően. A GÉP espresszióíát őteíwönoge?· (Moieeular Dynamics} készüléken mértük, és az ősugsébíonr szoftverrel elemeztük. A semlegesítő ellenanyag-litereket azzal a legmagasabb széruethigitássai. adtuk meg, amely 508á-nál jöbhím gátolta a iranssiukeiőí,
A GEP-t expresszálo vektorok hozzáférhetősége leegyszerűsítette a semlegesítő ellenanyag vizsgálati
1.5 eljárásának a kifejlesstését. amely egy pemássziv sejtvoual (azaz AdS-ból szártnazo i/4-et stabilan eaprosszáló 293-as sejtek) transzdukcíójának a gátlásán alapul. A kiválasztott AAV szerei tnusok elleni szertanokat a rekombináns vírusok intmmuszkuiáris injekciójával álistotíuk elő. Az. antíszérntnok ! ?0 és I 80 hígításával történő AAV-tmnszdukeió semlegesítését értékeltük (lásd az alábbi 5. táblazatoi). Az A/\V5, A,-\V?, AW5 es ΛΛΥ5 dfen: aof'.szémm.nk semlegesítitek azon vzeroopus ;r.rr.»zdukmój.it, amely GLrt leire leitek hozva (az
AAV5 és AAV8 kevésbé, mini az AAV 1 és AAV2) , de nem a többi szeron'pusét (azaz nem volt bizonyíték olyan kereszt-semlegesítésre. amely azt Igazolta volna, hogy az AAV8 igazán egyedi szerotípns).
5. Táblázat. Áz áj AAV szarotípnsnk szerslőgiar elemzése
84-31 sejtek %-oiigoszaeeharid fertőzése AAVCMVEGFP vírussal | |||||||||||
AAV2/1 | ÁAV2/2 | AAV2/5 | AAV2/7 | AAV2/8 | |||||||
Szérumhlgltás | Széramhigitás | Szérttnmigiiás | Szcrumbígítás | Széfumhigitus | |||||||
Szérum | Immunizáló vektor | 1/20 | í/8ö | 1/20 | 1/80 | //20 | //80 | //20 | 1/80 | 1/20 | 7/fe? |
1.csoport | AÁV2/Í | Ö | 0 | 100 | 100 | 180 | 100 | 100 | 100 | 100 | ’ÍOÖ |
2, csoport | AAV2/2 | 100 | 100 | 8 | . 8 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 00 | 1.00 |
3, csoport | AAV2/S | 100 | 100 | 1.Ö0 | 1.00 | 16,5 | 16,5 | 100 | 100 | 108 | 100 |
4. csoport | AAV2/7 | ÍÖÖ | iöo | 100 | 1.00 | 100 | 100 | fel ,5 | 100 | 100 | 100 |
5, csoport | AAW8 | 500 | 100 | 180: | 100 | 180 | 100 | 100 | 100 | 26,3 | 66 |
52 egészséges személytől származó itutnán szérumot szknnehűsk semlegesóésre kiválasztott verna'pasuk ellen. Nem találtunk elvan mintát, amely scmiegesjteíte az AAV? ~ es \A\ 2 3 rektorokat, Kig az AAV2'2 és AAV2A vektorok semlegesítődtek a szérumok sorrendben 28%-ában és 18%-ában. 60800 egyedi minta gyűjteményét reorezeníá’ó összsSmöít humán IgG frakciója nem semlegesítette az AAV2/?-et és ÁAV2/8~<tf, míg az AAV2/2 és ÁÁV2/'Í vektorok setalegeslíődtek sorrendben 1/1288 és 17648 szérttintlteníek megfelelő mértékben,
X példíü AAV vektorok különböző szcfötípusainak őr m értékelése
Ebben a vizsgálatban 7 rekombináns AAV genomoí -- ÁAV2C®bÁlAT, AAV2.AlbhAl.A.T,
AÁVSCMVrhCG- AÁV2TBGrbCS, AÁV2TSGcRX ÁAVXMYW2 és AAV2TSGLseZ.......pskolftmk be
47különböző szeroti'pusok kapszid fehétjéivel, Mind s bét konslrtíkeióban AAV2 f ÍR-ek szegélyezték a mimgén kazettái:. liüísán re-ímtiíripszm (Af AT) (Xiao, W. ésmissk, 4,. Virof 73, 3994-4003. old, (1999)), Xánms majom korlogonadoíropin hormon (Cö) β-alegysége [Zolfiek, R. W, és Wilsön, -k M., Mól Tber, 2, 657-059. old. (2000)1, W» fatoof4X (W&ng, I, ós falsai, Proc Natl. Acad. ScL USA 94, 0563-11560. old.. (1.997)1 0s bakteriálisβ-galakíoziáaz (azaz taeZ) gépiének eDN5-ét sikálmazíuk jelzőgénként. A májba irányuló gőnátvltel esőiében vagy egér alhmsin gén pmmőterét (Aló) (Xiao, W, (1999), mint fesi], vagy Ónnál? tirosd hormont kötő gbbul&r gén pretnőserét (TBG) |Wasg (1997), mint lent} alkalmaztuk a jslzőgének máj-spemískus expresszáltatásának irányítására. Az izmnba irányuló génátviteli kisérleíekben vagy a eitezsegalovirus teái pronróterél (CMV), vagy a csirke β-aktm promöteréf a. CMV enhanszerrel (CB) alkalmaztuk a jelzősének expresszá itatásának: irányítására.
Az izomba irányai© génátvhel esetébe® a vektorokat 4-6 hetes csupasz NCR vagy €5713176 (Tatamié, Germantown,.NY) egerek jobboldali riófe&s aúréí'ányiába injektáltuk. A májba irányuló génátviteli vizsgálatok esetébe® a vektorokat 7-9 hetes esapasz NCR vagy C57BI76 {Tárnáié» Germantowa, NY) egerekbe infuzlonáhuk intraportálisaa. A vektor beadása után különböző: idópouíokbaa iníraorbitáíís szérurnrakríákaf gyuiíöítifek. IzoiH- és májszövefeket gyűjtöttünk be különböző időpontokba fagyasztva metszéshez és Xgal-os insziokéniiai festéshez a Iac2 vektorokat kapott állatokból. Az újra-beadásl. kísérlet esetében a C56BI./6 egerek kezdetben: AAV 2 1, 2/2, 2/5, 2/7 és 2/3 CBAiAT vektorokat kaplak mirarmiszkulárrsaí?, és azután követtük azokat A1AT génsxgressziőra 7 héten keresztül. Azután az AAVX/^TÖGeflX vektorral kezelt állatokat mtraportáhsan kezehnk. es juegvi/svahuk ΟΊΧ geoexpress/tora
BOSA-alapú vizsgálati eljárásokat hajtottunk végre korábban leírt módos a hAlAT, rí?CG és oFfX fehérjék szérumkoneentráciojának mennyiségi meghatározására föao, G. R. és mtsai., I. Várok 79, 8934-Ő943. oki. (199Ő); Zoltiek, F. W. és Wilson, J. M„ kiöl. Ther. 2, 657-659. old. (2ŐÖG); Waag, L. és mtsai., Proc. Nutl. Acad. Sri. USA 94, 11.563-11566. old, (1997)), A. kísérleteket akkor végeztük, amikor az állatokat feláldoztuk az szó?»- és májszövetek levétele, és DNS-estrakcló és a celszővetben jelen lévő vektorok genom-kópia számának mennyiségi meghatározása céijáiróf, Rímk/ím-nal és ugyanazon lánoinditók és próba aikahnazásávai, anteiyekel a vektor-készhinények bírálásakor alkalmaztunk [Zhang, Y; és isísak. Mól.. Ther. 3, 697-707, old, {2091}).
Az új szerobpusokon alapuló vektorok íeljeshntényét izomba és májba irányuló génáivitel egérmodellje alapján értékeltük, és az ismert AAVf, AAY2 és AAV5 xzerotígasoko® alapuló vektorokhoz hasonlítottuk, A szekreíáh fehérjéket [aBh-l-amúripszin (Á1.AT) és koriogíntadoiropm (CG)l espresszálő -veteorokst alkalmaztuk a különböző szeroripusok relatív transzdakriős hatékonyságának snenstyíségi tneghatározásra a szérumok EUSA-siapá elen?ezésével, A transzdakció sélszervheli eelhdáris eloszlását laeZ-r expresssulló vektorok és X.Az AAV vektorok vázizombeli íefjesitményét a í/Ő/ő&s mwiór izmokba történő közvetlen bejuttatást .35 kővetően eientezlnk. A vektorok ugyanazt az AA¥2-alzpá genomöi.: iurtalmazfák, e CMV azösináh korái génjének vagy a CMV-javítotf g-aktín promóterrel együtt, ami a trartszgén expresszióját irányította. Korábbi vizsgalatok azt mutatták, hogy óninunkourpetens G57BC/6 egerek korlátozod Immorális választ fejlesztettek ki a humán. A1AT fehérje ellen, amikor AAV vektorokról ezp'Css.'áíkaíák azokat iXGo, W. és sasai., J. Viroi 75,
3994-4003. old, (1999)).
Mindea törzsben sz AAVXÜ vektor termelte a legtöbb AlAT-t, és az AAY2/2 vektor a legkevesebbet.
- 48 és az AAV2/7 és AAV2/8 vetetek közbenső expressziös szksfet: mutattok, A GC csócsszintje 28 s&ppol amknu NCR egerek injekcióját kővetőét! az AAVX7 esetében matatta a legmagasabb, és az AAV2/2: esetében a legalacsonyabb szintet, és az AAV2/8 és AÁV2/I köztes szinten volt Az: AAV2/1 és AAV2/7 laeZ vektorok injektálása génexpressziot sredntenyvmed az injektálás helyén az összes szomrostbatt és lényegeset! kevesebb lacE-pozsítv rostot Egyeltünk meg az AAV2Z2 és AAV 2/8 vektorokkal. Ezek az adatok azt matatták, hogy az ÁAV2/7 vektorokkal történő transzdnkció hatékonysága vázizomhan hasonló az AAV2.'i-gyel kapotthoz, ami a korábban leírt szerottpusok váztzmában a leghatékonyabb [Xtao, W. (1999). mint fent: Chao. ii. és mtsat.. Mok Ther.. 4,217-222. old. (2001): Chao. H. és sasai., Mól. T'her. 2, 619-623, old. (2ÜOö)j.
Hasonló egerraodelleket alkalmaztunk: a. májba irányuló gésátviiel értékelésére. A genont-kóplák száma: alapján azonos mennyiségű vektort juttattunk be IntoziÓval olyan egerek pottáhs vénájába, amelyeket azután elemeztünk a transzgén espresszáolán!, A vektorok mindegyike AAV2-u alapuló grammot tartalmazott a .korábban Istnorteteh máj-speciSkas promóíorek alkalmazásával (azaz alhtmtm vagy tlnaid hormont: kötő glöhíihn) a trauszgén expressziójának az K r> u nora Közelebbről, C.MVCG és TBGCö minlgén kazettákat áikatmszhmk az izomba és májba irányaié oémvvUel céljából. Az: rbCG koncentrációját relatív egysegében (RÍJ
IS x 10Jj adüík meg. Az adatok a vektor beadását követő 28. napon gyűjtött szénunmlníák méréséből száramzíak (csoportonként 4 állat). Amim a 3. tábláztában henrutaíiuk, a kapszid fehérjék hatása az Α1ΑΓ vektorok su/nu és C57.8I7S egerekbe és CG vektorok C57BE/6 egerekbe történő tom/todukeioj attak bafekonyságára koszisztet volt (lásd a 6. táblázatot).
6. Táblázat. Ráesn-j? majom koriogontsdotropm (rhCG) ^alegységének expressziója
Vektor | Izom | Máj |
AAV2H | 4,5 * 2,1 | 1,6 X 1,0 |
AAV2 | :ÖJ±O,l | 0,7 X 0,3 |
AÁV2I5 | NIM | 4,6 4 0,6: |
AÁV2.-7 | 14,2 A 2,4 | 6,2 4.4,3 |
AAV2/8 | 4.0 .e 0,7 | 76,Ox 22,8 |
* nem Imare/tuk meg: ebben a kísérletben,
Minden esetben az AÁV2/8 vektorok erednréuyezték: a transzgén expressziójánafc a legmagasabb szintjét, asnely 16-Hö-szer nagyobb volt, mint amit az AAV2/2 vektorokkal értünk: eh az AAV2/5 és AAV2Z7 vektorokról való expressztö közepes volt. és az A.AV2/7 magasabb volt, mint az AÁV2/5, A megfelelő IncZ. vektort kapott állatok X-gal-taj megfestett rnáj metszeteinek elemzése korrelációt mutatott a transzdukáh sejtek száma és transzgén általános expressziós szintje között. Az Al AT vektorokat kapott C578L26 egerek májából extrahált ONS-t elemeztük a vektor-DNS gyakoriságára valósidejű PCR -technológia alkalmazásával
Az injektálás után 56 nappal a májban talált vefctor-DNS mennyisége korrelált a íranszgón expresszisjjának mértékével (lásd a 7. táblázatot). Ebben a kísérletben a vektor-genom $V4tt poli-A. régióját célzó próbát és l&seiadiíő-készletet alkalmaztunk a Jm/Aton PCS-hez. A bemutatott értékek károm: átlát:
átlagértékét és szórását jelentik. Az állatokat az Só. napot! feláldoztok, hogy májszövetet gyújtsunk DNS· extrahálásábez. Ezek a vizsgálatok art mulatják, hogy a towzdokáh heaptoeiták megnovekodett száma miatt az AAV8 a leghatékonyabb vektor májba Irásynlö gérsátviselhez.
7, Táblázat: AAV vektorok mestnyiségének valósidejű PCR elemzése au/a a egerek májában vektor I x IÓ!i genosn-kőpíájónak az injektálását követően.
AAV vectors/öose | Genonm Coptes per Ceil |
AAV2/ÍAÍbAlAT | 0,6 * 0;3ő |
AAV2AlbAlAT | 0.003 *0,001 |
AAV2Z5AlbAl:Áf | Ö,S3teö,64 |
AAV2/7AlbA:l.AT | 2,241,7 |
AAV2/8AlbAlAT | 1X411. |
A fent ismertetett szerológísi adatok azt sagalpák, hogy az AAV2/8 vektor «em semlegesltőáik fis; Wt» a többi szeroílgusssl: történő immunizálást követően. C57BE/6 egerek kutya iákíor-lX-et expresszálö AÁV2Á8 vektor iírtraporiális injekciók kapták (10'5 genomAopsa) Só nappal azután, hogy különböze szerotipnsó Ai ÁT vektorok intramoszkuláris injekciói; kapták, A faktor-LX magas szintű expressztóját értük el 14 nappal az AAV2/8 naiv állatokba történő infúzióját követően (i7 * 2 pgúni, n,í;4), -ami nem különbözött szignifikánsan az AAV2/1 vektorsai intntnnizdlf állatokban: megfigyelni <3.1 * 23 ggrtnt, H). AAV2/2 tlh ug/snl, n~2> és AAV2/7 (12 pg/ml, n~2}> Ez ellentmond annak, anttt az ÁÁV2/8 vektortól immun izéit állatokban figyeltünk meg, amelyek: AAV2/8 faktor-lX vektor infúAóí kaptak, és aínelyekben nens figyeltünk meg detektálható lektorló ÍX-et (< 0,1 pg. mk n--'4),
A oop gén: konzervált régiói elleni olígotmkleotktek egyedi AAV-ket reprezentáló szekvenciákat amplifikáltak ftw majmokból. Azonos oop szignálóm szekvenciákat találtunk legalább két különbőzé kolóniából származó Maw majmok lőbb szövetében. Tefies bosszúságé .rop és oop nyílt leolvasási fözísoknt: izoláltunk és: szekvenáltonk meg egyedi forrásokból. Csak az új AAV-k nyílt leolvasási fázisai voltak szükségesek vektorként való alkalmazás lehetőségének értékeléséhez, mivel az AAV7 vagy AAV8 kapszidokat tartalmazó: vektorokat állítottunk elő az AAV2-ből: származó JTR-efc és rop gén alkahnazásával, Ez leegyszerűsítette a különböző vektorok összehasonlítását is, mivel az aktuális vektor genom azonos a különböző vektor szerotipusok kozott. Valóban, az ezzel a ntegkozelííésí móddal léb-ehozott rekomblnáns vektorok kitermelése nem különbözött a szeroiiptisok között.
Az AAV?--en és AAVS-ou alapuló vektorok tmmunológiaílag különbözőnek tűnnek (azaz nem semiegesitődtíek a többi szeröílpas ellen létrehozott ellenanyagok által). Ezenfelül a humán szérumok nem semlegesítik az AAV? ős AAV8 vektorok traoszdukcióját, ami egy lényeges előny a jelenleg fejlesztett bmnán eredetit AAV-kkei szemben, amelyek ellen a barnán populáció szignifikáns részének meglévő immunitása van, amely semlegesítő hatású [Clfirmule, X. és: misat., Cfette Ther. ö,1574-1583. old. (1999)].
Az. egyes új vektorok tröpizmusa előnyös fe vívó alkahnazásob'ú. Az AAV2/7 vektorok ugyanolyan hatékonynak tűnnék, vázszom ftanszdrAálására, mist az ÁÁV2.T, amely a mostanáig tesztelt főemlős ÁÁV-k közül a vázizosnbasr legnagyobb mértékű transzdokeíőí okozó szerotipus (Xíao, W., mint leni; Chou (2001). mitrt fent; és Chotí (20ÖS), mini fent]. Jelentős., hogy az AAV2/8 lényeges előnyt biztosit a többi szerotspussaf szemben a májba irányuló génátvitel hatékonysága tekintetében, amely mindeddig viszonylag kiábrándító volt a stabilan transzdukált hepaíöciták számának tekintetében. .Az AAV2/8 konzisztensen lÖ-lÖÖ-szoíos jávklaat ért el a génátviteli hatékonyságban a lobbi vektorhoz viszonyítva. Az ÁAV2Í8 tokozott hatékonyságának az alapja nem egyértelmű, habár feltehetőleg a különböző receptor általi fölvétel miatt: van, amely aktívabb a bepatoeiták basolaterális felszínén. Ez a fokozott hatékonyság eléggé hasznos lehet májba : irányuló génátvitel kifejlesztésénél, amikor a transzdukált sejtek: száma kritikus, mint például az urea-cíklus rendellenességei és
58órökletes hiperkolesztermémla esetében.
Ily mtidon a. találmány tárgyát egy új: megközelítési mód képezi új AAV-k izolálására: genomlális szekvenciák PCS-es visszanyerése alapján. Az ampliSsálr szekvenciákat kömryen beépitostglk vektorokba és tesztelhetjük állatokban. Az: AAV7 elleni meglévő immunitás hiánya ék a vektorok kedvező izom itúttfi íropizmusa azt omíatja. hogy ok AAV7 alkalmas humán génterápiában és egyéb m Avo alkalmazásúk has történő alkalmaznom. Hasonlóképpen a találmány szerinti AAV szerohpusók ellesi meglévő immunitás hiánya és a tropízmusdk hasznossá teszt azokat terápiás molekulák és egyéb hasznos srolekdák bejuttatására,
9. példa: Szöveti íxopizmus vizsgálatok
Az áj AAV konstrukciók nagykapacitásó funkcionális szkrineiósí módszerének tervezésekor nagyon aktív, nem szövetspeelltkus CB promptért (CMA’-javhott csirke β-aktín promóter) válsszpipsrik egy könnyen detektálható és mennyiségileg meghatározható jetzögén. a humán n-aniüripszm gén impressziójának az irányítására. Ily módon az új AAV kiónok esetében csak egy-egy vektort kell előállítani a. génátviteli vizsgálatokhoz, amelyek 3 különböző szövetet, a májat, tüdőt és Izmot célozzák, hogy szkrtseijhk az egyes adóit AAV konstrukciók szöveti teopizruusát. Az alábbi táblázatban négy új AAV vektorral a szöveti trepizmas '1.5 vizsgálatakor előállított adatokat foglalunk össze (AAVCÖA IÁT), amelyek közöl egy új: AAV kapszid klómul, a 4a.2-ról azt találtuk. hogy nagyon hatásos génátviteli eszköz mlndhárotu szövetben, különösen nagy előnnyel a tüdőben. A 8 táblázatban a vizsgálat 14. papján mórt adatokat mutatlak be (pg ÁlATlmh szérum mértékegységekben).
§. Táblázat
Azután nébúus további kísérletet végeztünk az AAV 44.2 tildószövetben tapasztalt kiváló troplztousúrtak a mege'osaererr Először a toco ^necldkus expresszió céljából CClÖhAl AT nrimgéní hordozó AAV vektort psxeádnopu'áhnk új AAV-k kapszidjídval, es inupuadelteleps állaioknak (NCR csupasz egereknek) adtuk be: azok n a xusos memíVlségbea <58 jú eredeti preparátum, hígítás nélkül) iutrairaoheális injekcióval, amint az alábbi ufoiazatban bemutatjuk, A ö. íáblázadjaa. egerenként (NCR csupasz egér) 58 pl eredeti preparátumot: alkalmaztunk, a detektálási határ 28,833 peónia 28, napos.
9. Táblázat
Vektor | Összes G€58 pl | pg ÁlAT/nú 50 pl | pg A1A Tóni J Relatív géaátvitol ΐ rb.lO-hez (klón 44.2) |
vektorban | vektorban | Ix W* vektorba® | kasoníítva | |
2/5 | ........................ | 2,6 k 0.5 | 0,09 te 0,02 | 2,2 |
2/2 | 5,5x5 öu | <0.0? | <0.005 | <0,1 |
2/5 | tj-------- | 0,65*0,56 | 0.02 ± 0,004 | 0,5 |
2/7 | 4.2xl0:2 | I te 0,53 | 0,02 te 0,01 | 0,5 |
2-A | 7,5xTö?T | 0,9 te 0,7 | 0,(2 te 0,09 | 2,9 |
2-'cb.5 (A.3.1) | ' ÖxÜF | 1 z 0,7 | 0,04 te 0,030 | 0/24 |
2úhA (43.25) | 4.6xlÖk' | 26 te 21 | 0,56 te 0,46 | 137 |
2/rh.iO (44.2) | 2,8x1 Ö’5 | 115 ± 3-8 | 4,5 te 5,4 | 100 |
2/rb, 13(42.2) | 6x1 (F | 7,3 ζ 0,8 | 0,12 te 0,84 | 2,9 |
2úh.2l (42.50) | ——rs------ | 9 te 0,9 | 0,38 te 0,04 | 9,3 |
2.0h.22 (-42. Π) | 2,6<Gö’J | 6 v 0,4 | 0,23 ζ 0,02 | '................. 5.6- |
2/rh.24í42.i3) | :5.,5xíOi! | 0,4 te 0,3 | 0,4 te 0,3 | 1 |
A vektorokat beadtak immunkempetess altoknak ÍS: (CSTSUd egetek) szőttes ge&oavkópla szántban (1 x ICÉ’ GC), ámmí a 10. táblázatban bemutatják (5 x40:iíG€ állatoskétjí, C57OI26, 14. riap, detektálási határ 40,033 pgOsl).
50, Táblázat
AAV vektor | gg AÍAT/niS ixl0í! vektorban | Relatív génátvRd rlíJO-hez (kiás 44.2) basnslítv® |
2 1 | 0.076 te 0,031 | 2A |
2/2 | 0,1 te 0,09 | 0,4 |
2/5 | 0,0840,033 | 2-9..................... : |
2/7 | 0,33 α 0.01 | Π |
2/8 | 1,92 te i,3 | 2,9 |
2/ch.5 (Á.3.1) | 0,048 te 0,004 | t,6 |
2/--13.8 (43.25) | 1,7 te 0,7 | 58 |
2/rb, 10 (44.2) | 2,93 te 1,7 | 5:00 |
2/rb. i 3 (42.2) | 075- 0,15 | 15 |
2/rb.21 (42.101 | 0,86 te 0,32 | 29 |
2 rh-22 <42. Ϊ 51 | 0,38 te 0,18 | 13 |
2-dí.24 (42.13) | 0,3 V 0,19 | 10 |
A két kísérletből származó adaték megerősketíék a klón 44.2 kiváló trepízmusát: tüdőbe irányaid gésátvitelhen.
iö Érdekes, begy a klón 44.2 teljesítménye májba és: bomba irányuld gértáívúelhsm szitáén rendkívül jő veit, ntegközeihve a majái legjobban írartszdnkálót, az AAV8~a:t, essz izmot legjebbas femstokdiöí, az AAV Ιοί, azt sugallva, bogy ez az áj AAV érdekes bioiógj&í jelentőséggel bú.
., 52 ·
Az új AAV-k szeroídgiai tolaídbnságainak vizsgálatára pszsuántigizák ÁAVGFF vektorokat állítottunk elő nynlak bwunlzálására és 84-3 l-es sejtek wt vőw feanszdnkálására, kőlőnbőző kapszsdok elleni antiszértmtokjelenlétében és hiányában. Az adatokat az alább lakban fegfeljuk Össze:
Ha. Táblázni: Kereszt-sesífegestlö rtfeaaayag vizsgálati eljárás 8431 sejtekben és adettovírtis (Adv) égy öltés fertőzés. 8431 sejtek fertőzése (Λάν-al együtt fertőzve):
Az alábbiakkal imnranizáit nyálból származó szérűin | 10QGC | iO'OC | ioí!gc | 10lsGC |
r&./3 | rfe.2? | rá, 22 | r&>24 | |
AAV2/42.2 | ÁAV2/42.Í0 | AAV2 <’ 11 | AAV2/42.13 | |
AAV2/1 | 1/20 | V28 | 1/20 | Nincs NAB |
AAV2/2 | 1/640 | 1/1280 | 1/5120 | Nincs NAB |
A.AV2/S | Nincs NAB | :i/4Ö | 1/160 | Nincs N.AB |
AAV2/7 | ESI920 | 1/81020 | 1/40960 | 1/640 |
A.AV2.-8 | 1/640 | 1/640 | 1/320 | 1/5120 |
0.5 AAV2;A3 | 1/20 | 1/160 | 1/640 | 1/640 |
rOAAV? 45.25 | í/20 | 1/20 | 1/20 | 1/320 |
rfe/Ő AAV2 44.2 | Nsncs NAB | Nincs NAB | Nincs NAB | 1/5120 |
rfe/5 AAV2.-42.2 | 1 5120 | 1-5120 | 1/5120 | Nincs NAB |
rts.5/ 5ΛΊ242 10 | 1/5120 | 1/10240 | 1.-5Í20 | 1 2.0 |
rfe.22 AAV2Z42.il | i 204»; | 1-20430 | 1/40060 | Nincs NAB |
rfe24 ÁAV2/42.13 | Nincs NAB | 1/20 | 1 2ü | 1.5120 |
NAB ~ semlegesítő ellenanyag llfe, Táblázat: Kereszí-semlegesltö elfesanyag vtzsgúktd eljárás 8431 sejtekben és Adv együttes fertőzés. 8431 sejtek fertőzése (Adv-ai együtt fertőzve);
Az alábbiakkal .isnnúunzált nyálból származó száram | HfGC | 10’í:GC | lO^GC | W | nf gc |
rfe/2 | c.8,5 | r/í. 8 | rfe/6 | rfelfe | |
AAV2/42.1B | ÁAV2/A3 | AAV2-43.25 | AAV 2/44.2 | AAV2/42.8.2 | |
AAV20 | Nük-sNAB | 1/20480 | Nincs. NAB | 1/80 | ND |
AAV2/2 | Ϊ/20 | Nincs NAB | Nincs NAB | Nincs NAB | ND |
AAV2/5 | Nincs NAB | 1020 | NracsNAB | Nincs NAB : | ND |
AAV'2/7 | 1/2560 | 1/640 | BI6Ü | 1/81920 | ND |
AAV2/8 | 1/10240 | 1/2560 | 1/2560 | 1/81020 | ND |
cő.5 AAV2/AÍ | 0:280 | 1 10240 | ND | 1/5120 | I/B20 |
rU AAV2.-A3.25 | 1/1280 | ND | 1/20400 | i'5120 | 1/2560 |
rfe./ŐAAV2/44.2 | 1/5120 | ND | ND | 15120 | 1/5120 |
rfe/,? AAV2/42.2 | 1/20 | ND | ND | Nincs NAB | 1/520 |
rfe22 A.A.V2/42.10 | 1/20 | ND | ND | 140 | 1.-80 |
rtí,22AAV'2:42.!i | Nincs NAB | NI) | ND | ND | Nincs NAB |
j efo24AAV2/42,13 [ 1/5120 | ND | 1 NI) | | ND | 1/2560 |
Π. Táblázat
Nyálszsnim íhere | Megerősítés utáni ti tér | |||
Vektor | liter a 21. napon | |||
AAV2/A3 | 1/10240 | 1/40960 | ||
rá,# | AAV2/43.25 | i /20400 | 1 163840 | |
ffo/d AAV2/44.2 | 1/10240 | 1:527680 | ||
AAV2A2.2 | 1/5120 | 1/20960 | ||
r/U/ | AAV2/42.10 | i/20400 | 1/81920 | |
ét. 2 2 | AAV2.42.11. | 1/40960 | NI) | |
r/t.24 | AAV2/42.13 | 1-5120 | ND |
a. Tíihlázat: 8435 sejtek fertőzése (Adv-al egyóli fertőzve) GFP-vét
* 10' GC/ i mérőhely | lo’GC mérőhely | 10'·' GC mérőhely | 10' GC·' mérőhely | iö' GC mérőhely | nwi mérőhely | |
AAV2/Í | ÁÁV2~2 | ÁAV2.-7 | AAV2/8 | Nt.5 AAV2/A3 | ||
O.RJ száma; | 128 | >200 | 95 | 56 | 13 | 1 |
látótér | 83 | >2ÖÖ | 65 | 54 | 11 | 1 |
b- Táblázat: 8431 sejtek fertőzése (Adv-al egyí'itt fertőzve) GFP-vef
i:0vGC mérőhely | 10 GC. mérőhely | 10'GC/ mérőhely | 1Ó'''GC7 mérőhely | 10' GC mérőhely | ií?GC mérőhely | 3Cg(>' mérőhely | |
rő.8 | rő./P | NUJ | és. 21 | z/t.22 | ét.24 | rh.22 | |
AAV2/43.25 | AAV2/44.2 | AAV 2'42,2 | AAV2/42J0 | AAV2/42.Í· | AAV2/42.13 | AAV2-42.13 | |
GFJ szánta/ látótér | 3 | 13 | 54 | 62 | 10 | 3 | 18 |
2 | 12 | 71 | ......60............. | .......... 14.......... | .........2......... | 2,0 | |
48 | 47 | 16 | 3 | 12 |
10, példa; Az örökletes mperkeleszíermt-mm! egermcdelhe
Az alábbi kísérletben azt demonssxáljuL hogy a bdáhnány szeritől AAV2/7 konstrukció bejuttatja az
LDL-feceptsn és olyan mennyiségben expresszál í/DL-receptert, ami elégséges az örökletes Idperkolcsztcrinétnía állati modelljeiben a pt&zm:r-koleszlerte és íriglieeddek színijének csökkentésére, zí. Ftf.terök köastrtíkcíóm
AAV? és AAVS kapszid fehérjékkel rendelkező AAV vektorokat állítottunk elő psztmácfipizátö stratégia alkalmazásával p-ltldinger, Mi és nrtsai., 1 VtroL 7S, 619Ö-6203. old,- {2Ö01jj, AAV2 fordított terminális ismétlődéseket (l'TR) tartalmazó rekombináns .AAV genomokat pakoltunk 293-as, sejtek tripla, íranszfekíálás&val a dsz-plazmiddal, az. adenovírus segítő plazmádul és kítnéra pakoló konstrukcióval, ami az ói AAV szerotspösok kapszulának ész AAV2: #φ génjének a fóztoja. A kimérő pakold piazmidot korábban leírt
-54modorí állítottuk elő [Hildinger és mtsai.. mint fenti A rekotnbirsáns vektorokat szokásos CsCS Olepitési eljárással iíszdtottuk meg. A kitermelés megkaíározásáhrsK ArpAfou elemzést (Applied Biosysfems) végeztünk a vektorok SV4Ö polí-A régióját célzó próbák és lánciíidttók aikátiúazásával (Gao, G, B. és mtsai., ílum. Gége Ther. 11.2079-2091. old. (2.000)1, A kapott vektorok a hmuárí tiroiddtörttmui kötő globálist géniének promótere (TBC) szabályozása alatt evpresszáíják a trtrnszgém.
B. A/óízíÚ:
LDL-reeeptorrs nézve defefenx C57B1/Ó tölteni egereket vásároltunk a Jsekson Laboratory cégtől (Bár Bárkor, M'E, USA), és tsayészkolétriakésf tartottuk testi azokat Az egetek akadályozarlanüi kaplak vizet és magas zsírtartalmú ikhsferaí étrendet (ntagas koleszterin %>, bárom héttel a. vektor bemjektálását megelőzően kezdve. A ~7. és 0, napon vért: vettünk reirnorbstális véreztetéssel, és érieké link a lipidproSIt Az egereket: véfetleasaerüest bét csopsrrtra osztottuk: szét, A vektort iuiraportábs injekcióval injektáltuk be, korábban leírt módos. [Chert, S, J. es mtsai,, 'Mai, Therepy 2, 256-261. old. (2000)J. Röviden, az egereket, érzéstelenítettük ketsmmaal és xílazkmál, Basmetszést wgezta«U és fíkás-ntk a portál Is vénát. Egy 30g tű alkalmazásával 100 pl
BBS-hen: meghlgitort meglelek) dózisét i <. ektoj t injektáltunk közvetlenül a por-áiís vénába. Az injektálás helyére nyomást gyakoroltunk, hogy biztosítsuk a vérzés elállását. A bőrön ejtett sebei összezártuk. kendővel lefedtük., és sz egereket körültekintően ellenőriztük a következő napon. Hetenkénti vérvételt végeztünk a májba irányuló génátvlíel mám 14. naptól, kezdve a vériipjőek mérése eéijáböí. Csoportonként két állatot feláldoztunk a vektor injektálása utáni 6. héten és a 12. héten, hogy megvizsgáljuk az ateroszklerötikus plákkök méretei, vídamáut a receptor expressziöiát, A fennmaradó egerekét a 20. héten áldoztuk fel plakk-méréshez, és a tomszgén esprtíssziöjának meghatározásához.
14. Iá blúzai
l'í’B,·;;?' | BőzA | Ι « | |
i.csoport | ÁAV2,7-T®G-hI..DI..r | Is KT'gc | j n |
2. csoport | AAV2/7*IBG~hLPLr | 3x Kfogc | 12 |
3. esoporJ | AAV2/7 TBC hl. Bír | Ix lő^ge: | 12 |
4. csoport | A,AV2/8-TBG-bIDÍ.r | Ix Uf'gc | 12 |
5. csoport | AAV2A-TBG-hLf)i,r | ás Hl ge | 1 ° |
6. csoport | AAV2/8-TBG-hLDÍr | lx 10;igc | 12 |
7. csoport | AAV2/7-TBG- LacZ | Is lÖ'S’c 1 16 |
C óAözun-Abí^í'ofeíí?: és mátíhíífezá etönzáse
A vérmintákat a retreortailálA fonatból vettük ö órás koplalás után. A szérumot eeütrí&gáíásxal választottuk el a plazmától A plazma lipoproteiuek és máj íranszamfoázok szérembeli mennyiségét autoníabítál; klimkíts kémiai anah stomtí detektáltuk s'ACE, Settöpparelli Btosystems, Alpha Wassetmaim),
B. ,4 .írez.vgí n ,'»/»í,>,ííf5ná' dcieáidúisct
Az LDt-receptor evprssszlpját immuuiluoreszecas festéssel és Westert-blodal értékeltük. A Western30 bloshoz fagyasztott májszö«et«t homogenizáltunk irzís pufforben ( 20 aM Tris, pH 7,4, 130 mM NaCi,
Triton X 100, profeitöz inhibitor — komplett, EDTA-mesfos, Roebe, Mamfeeim, Crermaayj. A fehérjekoneentrá.eiót a .tWerp ,SC< fAtíeöt Avsuy Xwgw O reagenskészlet alkalmazásával határoztuk: meg
-55 (Pieree, Rockfwá, ít). 4Ö pg fehérjét feltsúmk meg 4-:15¾ Bfo-MC; géleken (Biorad, Hercufes, CA), és vittünk át nhrocellulöz membránra (fnvitroges). Aaíi-hhDE-reesptor ellenanyagok elöáliitásáhez nyulakat oltottunk intravénása» A«MJ3tr prepatárunumd (1 x 1813 6G). Négy héttel később levettük a ayáiszérnttrot és. Wesieru-htmban alkalmaztak. A szérum 1:180 hígítását alkalmaztuk elsődleges ellenanyagként, majd DRfovél könjugalt atús-nyúl-dgö-t és kemkmmaeszeeaojás detektálást afaknszltmfc t£Cí. R'estera Bfoí ZMfeebos XA, Ámersharo, Adiugtmr Heights, fí..k E, ííHJ»««Cfe>tó»fe
Az: LDL-reeepior expressziójának fogyttszíoit isújmeíszetekben történő tnegbatározásához mmnmhisztokémiaí elemzést hajtottunk végre. 18 gm-es khosztát metszeteket rögzitefomk 5 percen keresztül
1.8 aeetoshan, vagy rögzteienal hagytunk. A blokkolást 1 órás tttkuhálást időszakon keresztül végeztük 18% keesfeeszérummai, A metszeteket ezután egy órán kérésziül inkúbáltúk az elsődleges ellemmyaggal szobahőmérsékleten, Nyúl polulonalts arsti-humáa-LDE ellenanyagot (Bíoraedíeaí Teehnolegiss iné., Stonghíon, MA) alkalmaztunk a cyárto utasításai szerint sncgaigüva. A metszeteket megmostuk PSS-sel, és 1A88 arányban nwglhguott ílnoresgeeín-keeske-amí -nyúl - IgG ellenanyaggal Inkubáltuk {Sigsta, St. EouiS Mü).
A mmtákst végül megvizsgáltuk Arkoa Mroropkoz-rX? fluoreszcens mikroszkóp alatt. Minden esetben az hskáhátást alapos mosás követte PSS-sei, A. negatív kontrolokban PBS-sel történő elölnkohálást, az elsődleges ellenanyag elhagyását és az elsődleges ellenanyag izotipus-íllesztett sem immun kontroli ellenanyaggal. tőriénő helyettesítését alkalmaztuk, A lent említett három típusú kontrollt: minden kísérletben elvégeztük ugyanazon a napon.
X. GenfoviAz úoíéfemyságö
Májszővatet vettünk az egerek meghatározok időpontokban történő Sbiáldozása után. A szövetet hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -SŰ eC-on tároltak a további feldolgozásig, DNS-f extraháltunk a májszővetböi & QDixtKp DéM Mint A'h raagenskészle? (Q1AGEN Gmbkk Gerraany) alkalmazásával: a gyártó utasításai «szerint, A rnájszöveíben található A.AV vektorok, genom-kópiáit rbgá&ó: elemzéssel értékeltük az
SV4Ö pók--A fiatok elleni próbák és lánctndítők alkalmazásával, amint lém leírtuk.
G, Az őíeromkferoífot<xrfotkksk tséréro
Az egér aortában található aíeroszkleroíikus plakke-k mennyiségi meghatározásához az egereket érzéstelenítettük (10% ketamín és silazln. l.p.), a ntellürege? íemybe-ttuk, és a artériás rendszer; periündáiíattuk jéghideg foszfát-pufferelt sóoldaítal balkamrán keresztül. Azután az aortát kivettük, felhasítottuk a centrális középvonal tseraén az aoríaivíoi lefele a combartériáit irányába, és formaimban rögzítettük. A lipidekhen gazdag ateroszkierotíkus pkoÁe-tat megfestettuk Szudán-lV (Sígrua, Gerroany) aikahmuíásávak és az aortát fekete viaszos felszínre sst u,tettük, Λ kenet Sony DXC~9Őd szirtes: videokamerával rögzítettük. Á ptakkok területéh valamint a tebes mmin-felszim Ftee 5 /wsgfeg Ójístmns alkateumásával határoztuk meg (Media Cyberneties).
Kísérleti csoportonként két állatot teszteltünk. I !~'~tel jelzett LDL~t (Dán Rader. U. Fenn. nagylelkű ajándéka) juttatunk be snflizíőva! a forokvénán keresztül 38 másodpercen keresztül fi <108008 cptn 11 állatonként 180 pl steril PBS-ben meghigitea). Az injektálás utáni 3 perces, 38 perces, 1.5 órás, 3 órás, 6 órás időpontban vérmintát vettünk a rotroorbhális fonaton keresztül. A plazmát elválasztottuk a teljes vérbők és 18 pl plazmát ménünk meg gammaszámlálóban. Végezetül kiszámítottak a fcakeionáhs katalitikus sebességet a
- 5ö lípoprotein ktűtülésí adataiból.
Ífoiií /éíkiífíKöaódásÓRíik érfeáeküi?
Fagyasztott tnájroetSKetek oi.m<.íős-:fesíését Isajtottak végre a hpüd fehíaimozódásának: meglmtározásárs. A fagyasztott májmeíszeíeket röviden, teőhlítetfük desztillált vízzel, majd 2 percen, kérészből
Inkőbáltnk abszolút praplién-ghkolban. A metszeteket :azníán megíésíehük: olaj-vörös oldatost (0.5% proptlénglikoihan) 16 óránkeresztül, majd ellenfesíettük Mayer-féle hemmoxíkn oldattal 38: rnásodpereen keresztül, és fehselegtteh gíteín-zselé oldatba ágyaztak be,
A máj koleszterin- és trigheerid-fartalom mennyiségi meghatározásához májsnetszeteket houmgemzáltunk, és klotoSbravtnetanol (2:1) keverékben takubákuk éjszakán keresztül o,oS» FBSEU hozzáadása és 18 percen keresztüli cenrrhbgálás után a minták alsó rétegeit összegyűjtőd m, -ret aiikvsítm. osztottuk, és nbrogétt alatt bcszárltotink. A koleszterin méréséhez az első aíikvot beszáritott lipjdjeit fefoldohők kloroformban oldott l'S Triton X-löö-ban. Bá egyszer feloldódott, az oldatot beszáritottdk nitrogén alatt Á hpidek kétszer desztillált vízben történő feloldása és 38 percen 37 ''G-on keresztüli rnkuhálás mán megmértük a íein', kok's.kotn -nemv;oocri /kod tömhm't'nk λ;? oagenAeszkí tWakv Ihagnostscs» Jkalnrazásával. Á
IS második alíkvol esetében a beszáritott lipideket alkoholos KÖB-ban oldottuk fél, és 60 sC-on inkubálnik 38 percen keresztül. Azután 1 M MgCb-t adtunk hozzá, majd jégen inkubálnik 18 perces kérésziül, és leetmfrifegá&tk: 14080 rpm-on. 38 perceit kérésziül. A felőlőszőt végezetül érfekeittik tríglieeridre (Wako Dsagriosiles}.
Az AAV2/8 vagy AAV27? kapsziddal pszendöíipizáit vektorok mindegyike csökkentette a a korfeülhsiS: viszonyítva a teljes koleszterint LDL~t: és irigkeeridet Ezek a tesztvektorok szintén kijavftotlák dózistüggő módon a hiperköteszterinémiás fenoilpust. Az AAV21S and és AAV2.·'? egerek esetében megfigyeltük a plakkofc terűié tőnek: csökkenését a kezek egerekben az első teszt időpontjában (2 hónap), és a. hatás fennmaradását figyeltük meg: a kísérlet teljes Időtartama alatt (ő hónap).
10, példát Működőképes Faktsr-lX expresszáitatása és henrolffiá kijavítása
A. Aiíííöti' p, ás;?ri-ft<í ‘0 egerek
A funkoíönáhs í&kíor-TX. (FTXj expresszióját B-hemcfihás egerekben vizsgáltuk. AAV1S AAV2, AAVS. AAV? vagy AAV8 kapszklekai tartalmazó vektorokat áiliioííurik elő AÁV2 5' ÍTR máj-specifikus proméíer [LSP] — kutya FIX — atormota hepatitisz poszí-regulatarifer» elem (WPRE) ----- AAV2 3’ ÍTR konstrukció besuísttására, A vektorokat Wang: és mtsai, [Molecular Therapy 2, 1.54-158. old. (2808)} leírása szerint állifethrk elő a megfelelő kapszidok alkalmazásával.
A kiütött egereket Wang es mísaj ife-oc Xafi, Aead, Sm USA 115tA t í5oa (:«9”} leírása szerint állítottuk elő. Ez a modell teljeses hasonlít á B-hernofiliá humán tenmípssára.
Különböző szerotípusú vektorokat (AAVl, ÁAV2, -AAV5, AAV7 és AAV-8) juttatnak he egyetlen inttítporlábs mjefcetöban felnőtt hemofillás C57BE6 egerek májába I x 10! * GC euó? dózisban az őt különböző szerotlpns esetében, és egy csoport AAVS vektort kapott alacsonyabb. 1 χ 10 ” <,f egér dózisban. A kontroll csoportot 1 x 18:i OC AAV2AÍ T.BG Lac23 vektorral oltottuk. Mindegyük csoport 5-18 isim és nőstény egeret tartalmaz. Az egereket a vektor beadása után kéthetente véreztettük,
1, ££Z$d
A kutya FIX kmreenüáciáját az egér plazmában a kutya. lakíor-fX-re specifikus BLISA vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg, amelyet lényegében Aseirod és írásai, (kroc, Nash Aead; Sel USA 37,
-575173-517?, old, {199ö)'j leírása szerint végeztünk, módosításokkal. íuh antí-katya-fektor~ÍX-et (Eszyme Research Laboratories) alkalmaztunk elsődleges ellenanyagként, és nyúl a®iÍ-k®tya-fektoiAX~et (Enzyme Research Laboratories) alkalmazóink másodlagos ellenanyagként. Az injektálás után két hét elteltével kezdődően megnövekedetí FIX plaznrakoncentfációt detektáltunk mindegyik fesztvektor esetéhen, A megnővekedetí koncentráció terápiás szintes maradt a kísérlet folyamán, azaz a 12, hétig, A terápiás szintnek a normális szint 5%-fo tekintjük, azaz körülbelül 230 ag/mi-í,.
Az expresszié Isgmagasafeo szintjét az AAV3/8 esetében (IÖ!! dózisnál) és AAV2/7 konstrukciók esetében figyeltük meg, szuperfizíolőgiás eblX szintet fenntartva (a. normális szintnél tízszer magasabb szint). Az AAV2/8 (1Ö!') expresszíós színije megközelítőleg lö-szer magasabb volt, mint az AAV2/2 és AAV2/8 (IO50) esetében otegOgyelt. A. legalacsonyabb expresszíós szintet — habár még tinódig a terápiás szint felett......az
AAV2/5 esetében figyeltük meg,
2. fn vio'ö ííkiivdO rósc/cgcx rfOfahopfes:ríín-á:/d ι'νΕΓΓΐ vóxgtí/od c/ófedr
A llX-kiüföít egerek plazmájának funkcionális faktor-lX aktivitását ás Asm aktíváit részleges tromboplasztín-ldö (aPTT) vizsgálati eljárás slkahuazásával határoztak meg. Egér vérmintákat gyüjtodünk a retro-örbítáhs fonatból 1/10 térfogat citráí-puffetbe. Az aFTT vizsgálati eljárást: Wáng és tstot (Froc. Kati, Acad. Sci. USA. 84, 11563-11566. old. t19971] áínd leírt módon hajtottuk végre.
A vektorral injektált egerek misdegyske píazmamintámak aPTT vizsgálati eljárással mért aívadási ideje a normális tartományban volt (megközelítőleg 60 másodpere), atníkor az injektálás után két héttel mértük, és az alvodsst idő megmaradt a normális vagy tmrtnáltsnál rőt ioetíb tartományban a vizsgálati időszak (Íz hét) folyamán.
A. legalacsonyabb aívadási időt: az AAY2/8 (lőlí) és AAV2/7 vektort kapott állatoknál figyeltük meg, A 12, hétre az AAV2/2 is az AAY2/8-hez és AA¥2/7-hez hasonló aívadási időket fedukált. Azonban sem figyeltük meg ezt a lecsökkent aívadási idol: az AAY2/2 esetében a 12, hétig, míg lecsökkent alvadhat időt (a 254b másodperc tartományban) figyeltünk meg az AAV2/0 és ÁAV2/7 esetében a második héttol kezdve,
Jelenleg zajlik a kezelt: egerek némelyikétől begyűjtött májszövetek ínmmnhlsztokémlaí festése. A hepatoeiíák körülbelül 70-$ö%~a festődön pozitívnak a kutya ΕΙΧ-re az A.AV2/8.eRX vektorral öltolt egerekben.
B. B-áem<y?hd.x fogyná
Az F.IX gén. katalitikus doméfeeben pontnioiációf amely a modellezési vizsgálatok alapján instabillá teszik a fehérjét.....tartalmazó kutyák B-hettínfeitaban szenvednek (Ewds és mtsai.. Eroc, Háti Acad. Seb Uh,
86, 18Ó95-10099. old. (1989)1. llyeí?. kutyák egy kolóniáját tartották fenő több mim két évtizeden keresztól az University oí Nórát Cnrolina (Chapel ifill) egyeteme®. Ezen kutyák: homeosztarikas paraméí-emit tészk-tesen leírták, amelyek közé tartozik «plazma E.1X amigénhiánya, a lelje» véralvadási ideje több mint 60 pere, míg a normális kutyáké 6-8 perc, es Sb-hÖ másodpercre elnyfoíoít aktivált részleges írombeplasztin-idő, msg a normális kutyáké 13-28 másodperc.. Ezek a u kutyák visszatér® spontán vérzésektől szenvednek. Tipikusan a szignifikáns vérzéseket sikeresen kezelik Ifi mkkg normális kutya plazma egyetlen. intravénás infúziójával: alkalomadto ismételt infáziöra van szükség a vérzés megállításához.
Négy kutyát uhunk he intraports&an AAVAFIX vektorral az alábbi rend szörítít, Egy első kutya egyetlen AAV2 2 cl IX injekciót kap v7 \ 10 * genom-kópia (Gt'Ukg JnJwai Lgy második kutya eg> cNo
4ö ÁAV2/2,cElX injekciói kap (.2,8 x 10'1 GC/kg), majd egy második AAV2/7.cFlX injekciót (2,3 x fÖw GC/kg)
- 58 az ‘ISO. napon. Egy harmadik kutya egyutlss AAVddheFIX injekciót kap 4,6x Ib1’ GC/kg dózissal. A negyedik kutya egy AAV2-'2,«FIX injekciót kap (2,8 x IO;U GC/kg) és egy másik mjekeiót a 995. napim AAV2/7.cf 1.X (5 x IO,; GC/kg) dózissal.
A heutofíltás kutyák hasátaszeptikusán fodtéiíleg felnynjtik általános érzéstelenítés mellett, cs a vektor egyetlen. infúzióját adjuk be a portálta vénába. A állatok vérzését megakadályozzuk az. Operáció korall ídbszakban normál kutya plazma intravénás beadásával. A kutyát nyugtatjuk, foíabáljuk az általános érzéstelenítés Indükálásához, és a basát leborotváljuk és előkészítjük. Mintán a hasüreget íetoyÍíottnk, a léget az. operáció tájára húzzuk. Lokalizáljuk a lepvénáí, és lazán egy varratot: helyezőnk a vénán tett egy díszialís kis: bemetszés közelében. Gyorsan egy tűt vezetünk be a vénába, és azután: a varratot meglazítjuk és egy 5F kanált lö tizünk be intravénásait a portállá véna közelében annak elágazása mellett. Mintán csillapítottuk a vérzést és egy katéter ballont letoljunk, rnegközehtőleg 5,0 :n;:l, FRS-liea megltigított vektort jaííattrok be 5 percen keresztül in&síevai a portába vénába. A vektor iuinzíojái 5,0 túl sóotóat istfeidja kövek. Azután a ballont leeresztjük, a kiürült étövolüjük, és a vénás vérzést megáHltjok. Azután u légei visszahelyezzük, a vérző ereket kiégetjük, és a műtéti sebet lezárjuk. Az: állatot extobáljak, miután jól toleráltá a műtét; eljárást, A vórntlutákat leírt módon elemezzük. (Wáng és mtsai,, Moleenlar Ttierapy 2, 154-156, old, (2000)), konok K ! , rgv rCVí CgCx -< i . V, oi nutefo e ,\ün. nvcket \<>r Ά. ÍZ \ \\ 2 Ά-ví\ ne ’
A leírásban idézett mindegyik publikáció hivatkozás útját; a kífctnhás részét képezi. Míg a taláknányt különöset; előnyös megvalósítási módokra történő hivatkozással irtuk le. nyilvánvaló, hogy végretogthatok módosítások anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől. Az ilyen módosítások szinten az mellékelt igenvpojttök oltalmi körébe esnek.
A szek^tteítoAtábaa található szabad szövegek fordítása <2íö> 46
- 22 A- lehet a. c. c sagy s <2IO> 75 <223> bármilyen aminosav lehet
3ö
Claims (12)
1. Adeno-asszoeiálí Árus (AAV), amely tarfelmaz olyan. AAV kapszidol, amely a 9.5. ;monosítószámó. szekvencia 1-738. aminosavai szerinti AAV8 atnuiosav-szsfeesciát vagy aszal legalább 95%-bas azonos
5 szekvenciái tartalmaz; ás olyan miaigént, amely AAV ferdíiolttemrlsáíis ismétlődésekéi (ITR) és betérőkig gént tartalmaz, amely annak gazdasejtben való expresszióját irányító szabályozó szekvenciákhoz van srtákódőképeses kapcsolva.
2. Az 1, igénypont: szerinti AAV, ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid iéhérjét, kapszid fehérét és vp3 kapszid fehérjék azzal jellemezve, hogy a vpl kapáidé fehérjének olyan a szekvesciája, amely
19 legalább 95%~ban azonos a 95, aabnosítteSsiá szekvencia 1 -738, atmnosavaíval,
3. Az 1, vagy 2, sgénypom szerinti AAV, ahol az aminesav-szekveneia legalább 99%-ban azonos a 95, azonosítószámú szekvencia 1-733. smmossvsivat
4. Az 1-3, igénypontok, bármelyike szerinti AAV, ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid. fehérjét, yp2 kapszid fehérjét ás vp3 kapszid fehérjéi, azzal jellemezve, hogy a vpl kapszid fehérje amfeosav15 szetefistteiája a 95. azorsositássámn: szekvencia 1-738, amúmsavai,
5. Az 1-4. igénypontok: bármelyike szerinti AAV, ahol sz AAV vp2 kapszid fehérje ammosavsxekvescíáfe a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738. amínosavíd.
ó, A 3-5, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az AAV vp3 kapszid fehérje amlsosavszekvencíája a 95. azonosítószámú szekvencia 293-738. rmhaosaval.
29 7. Az 1 ~§, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az ϊ'1'R-ek AAV2-bdi származnak.
8. Adeno-asszociah vírus (AAV), amely tartalmaz olyant AAV kapszídos, amely legalább a 95, azonosítószámú szekvencia 283-738, aminosavai szerinti aozinosav-szekvenesájú AAVS vp3-at vagy azzal legalább 95%-baa azonos szekvenciát tartalmaz; és olyan minigént, amely AAV fordított terminális Ismétlődéseké· (ITR) és heteroiög gént tartalmaz, amely annak gazdasejtben való expresszié^ irányító
25 szabályozó szekvenciákhoz van működőképesen kapcsolva,
9. A 3. igénypont szenna AAV. ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid fehérét, vp:2 kapszid fehérjéi és vp3 kapszid fehérjét, azzal jellemezve, hogy vp3 kapszid fehérjének, olyan a szekvenciája., amely legalább 93%-ban azonos a 95. azonosítószámú szekvencia 293-738, ansirsosavaival.
18. A 8, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az .AAV vp3 kapszid fehérje amirtosav38 szekvenciája; a 95, azonosítószámú szekvencia 283-338, aminosavai.
11, A 8-ÍO. Igénypontok bármelyiké szerinti .AAV, ahol az AAV vp2 kapszid fehérje aminosavszekveneíája a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738. aminosavai,
12. Készítmény, amely 1-1L igénypontok bármelyike szerinti: ,4AV-t: és iizlológiásan kompatibilis hordozót tartalmaz,
3.5 1' Izol.ih hap\,od tehetio, amely AÁ8 fehérjéi tartalmaz. amely az alábbiak bármelyike:.
kap^/td fehege, a 95. azonesbószámú szekyeneía 1-738, amtnosavai;:
vp2 kandid tehege,, a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738, mmnosavd; és xp3 kapvsd tekerje, a:95,:azonoaÍlószámúszekvencia293-?38, amínosavaí:,
14. Izolált vagy szintetikus sakícínsav-molekala, amely 13. igénypont szerinti fehérjét kódol.
- 6015. Izolál; vagy szintetikus ítnkteinsav-psölskala, amely 8-as sderso-asszoeiáit toros tapszid fehérje feagmenséí kódolja, amely nakieinsav-moleknla az alábbiak bármelyike:
18. Eljárás. AAV § szeretlpúsú kíipszkiöt tartalmazó takosfethámi adeno-asszoeláb vírus (AAV) 10 előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazó gazdasejtet tenyésztőnk: (a) 14-16, igénypontok bármelyike szerinti molekulát, amely adeno-asszociált vírus kapszidot kódol; tb) működőképes rep gént; (ej AAV fordított íemrmátis ismétlődéseket (1TR) és transzgént tartalmazó mínigént; és. (dj elégséges segitó fonkciókat, amelyek lehetővé teszik a mnúgénnek az AA V tapszid fehérjébe történő pakolódásáí.
19 , .I s vitro gazdssejí, amely l-ll. igénypontok: bárénelyike szerinti adens-assztítoáli. torost vagy 13-16. 15 íséoyponmk bártrtelyíke szerinti nmlekulát tartalmaz.
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US35060701P | 2001-11-13 | 2001-11-13 | |
US60/350,607 | 2001-11-13 | ||
US34111701P | 2001-12-17 | 2001-12-17 | |
US60/341,117 | 2001-12-17 | ||
US37706602P | 2002-05-01 | 2002-05-01 | |
US60/377,066 | 2002-05-01 | ||
US38667502P | 2002-06-05 | 2002-06-05 | |
US60/386,675 | 2002-06-05 | ||
PCT/US2002/033629 WO2003042397A2 (en) | 2001-11-13 | 2002-11-12 | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU230406B1 true HU230406B1 (hu) | 2016-04-28 |
Family
ID=27502639
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0600229A HU229379B1 (en) | 2001-11-13 | 2002-11-12 | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
HU1500180A HU230406B1 (hu) | 2001-11-13 | 2002-11-12 | Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0600229A HU229379B1 (en) | 2001-11-13 | 2002-11-12 | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (15) | US20030138772A1 (hu) |
EP (4) | EP2338900B1 (hu) |
JP (6) | JP4677187B2 (hu) |
KR (2) | KR101014207B1 (hu) |
CN (6) | CN103555677B (hu) |
AT (2) | ATE317916T1 (hu) |
AU (1) | AU2002361573B2 (hu) |
BR (3) | BR122016004944B8 (hu) |
CA (8) | CA2406745C (hu) |
DE (1) | DE60209193T2 (hu) |
DK (1) | DK1310571T3 (hu) |
ES (3) | ES2439515T3 (hu) |
HK (2) | HK1056198A1 (hu) |
HU (2) | HU229379B1 (hu) |
IL (11) | IL161827A0 (hu) |
MX (3) | MX346493B (hu) |
NO (4) | NO334379B1 (hu) |
NZ (7) | NZ532635A (hu) |
PH (2) | PH12014501487B1 (hu) |
PL (4) | PL222683B1 (hu) |
SG (5) | SG10201506627PA (hu) |
WO (1) | WO2003042397A2 (hu) |
ZA (1) | ZA200403360B (hu) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10693918B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-06-23 | Palo Alto Networks, Inc. | Radio access technology based security in service provider networks |
US10708306B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-07-07 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
US11722532B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-08-08 | Palo Alto Networks, Inc. | Security for cellular internet of things in mobile networks based on subscriber identity and application identifier |
US11805153B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-10-31 | Palo Alto Networks, Inc. | Location based security in service provider networks |
US11838326B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-12-05 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile equipment identity and/or IoT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
Families Citing this family (509)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4645697A (en) | 1996-09-11 | 1998-04-02 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Aav4 vector and uses thereof |
JP4060531B2 (ja) | 1998-05-28 | 2008-03-12 | アメリカ合衆国 | Aav5ベクターおよびその使用 |
US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
WO2004060278A2 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
NZ532635A (en) | 2001-11-13 | 2007-05-31 | Univ Pennsylvania | A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method |
PT1453547T (pt) | 2001-12-17 | 2016-12-28 | Univ Pennsylvania | Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas |
JP4769417B2 (ja) | 2001-12-17 | 2011-09-07 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス(aav)血清型9の配列、それを含むベクターおよびその使用 |
JP3943048B2 (ja) | 2002-04-29 | 2007-07-11 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組織の細胞dnaからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法 |
US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
US7220577B2 (en) * | 2002-08-28 | 2007-05-22 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Modified AAV |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
WO2005017101A2 (en) | 2003-05-19 | 2005-02-24 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH | Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof |
DK3235827T3 (da) | 2003-06-19 | 2021-04-19 | Genzyme Corp | Aav-virioner med reduceret immunreaktivitet og anvendelser deraf |
US9233131B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-01-12 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
US9441244B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-09-13 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
US8529885B2 (en) * | 2003-09-01 | 2013-09-10 | Academisch Medisch Centrum | AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis |
AU2010201278B2 (en) * | 2003-09-01 | 2012-11-15 | Academisch Medisch Centrum | AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis |
US20120122099A1 (en) | 2003-09-11 | 2012-05-17 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of bacteria |
US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
AU2011250849B2 (en) * | 2003-09-30 | 2013-09-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor |
ES2648241T3 (es) * | 2003-09-30 | 2017-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos |
WO2005056807A2 (en) * | 2003-12-04 | 2005-06-23 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health | Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
ES2361000T3 (es) * | 2004-04-28 | 2011-06-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado. |
EP1742657B1 (en) | 2004-04-28 | 2013-11-06 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost |
EP2458619B1 (en) | 2004-05-24 | 2017-08-02 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
WO2006073496A2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-07-13 | Targeted Genetics Corporation | Recombinant aav based vaccine methods |
US7309589B2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-12-18 | Vironix Llc | Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing |
WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
MX2007003922A (es) * | 2004-10-05 | 2007-06-07 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Nuevas propenonas ciclicas y aciclicas para tratar trastornos del sistema nervioso central. |
US20060205040A1 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
ES2525067T3 (es) | 2005-04-07 | 2014-12-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de incremento de la función de un vector de AAV |
WO2006119432A2 (en) * | 2005-04-29 | 2006-11-09 | The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services | Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes |
AU2006272776B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
EP1957678B1 (en) * | 2005-11-28 | 2012-06-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses |
WO2007120542A2 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Aav capsid library and aav capsid proteins |
ES2400235T3 (es) | 2006-04-28 | 2013-04-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de producción escalable de AAV |
JP5623740B2 (ja) * | 2006-07-25 | 2014-11-12 | セラドン・コーポレーション | 遺伝子治療用アデノ随伴ウイルスベクターの長期順行性の心外膜冠動脈注入 |
AU2007353877B2 (en) | 2006-09-14 | 2012-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
JP5680304B2 (ja) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 迅速な法医学的dna分析法 |
PL2191001T3 (pl) | 2007-04-09 | 2017-01-31 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Kompozycje wektora RAAV mające białka kapsydu zmodyfikowane tyrozyną i sposoby ich zastosowania |
US9611302B2 (en) | 2007-04-09 | 2017-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use |
US9725485B2 (en) * | 2012-05-15 | 2017-08-08 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy |
WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
EP2058401A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
EP2315833B8 (en) | 2008-05-20 | 2015-05-27 | Eos Neuroscience, Inc. | Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use |
US9217155B2 (en) | 2008-05-28 | 2015-12-22 | University Of Massachusetts | Isolation of novel AAV'S and uses thereof |
US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
EP2344893B1 (en) | 2008-09-16 | 2014-10-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and methods |
EP2349549B1 (en) | 2008-09-16 | 2012-07-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system |
EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
PL2425000T3 (pl) | 2009-04-30 | 2019-08-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Kompozycje do kierowania komórek przewodzących do dróg oddechowych zawierające konstrukty wirusów związanych z adenowirusami |
US8734809B2 (en) | 2009-05-28 | 2014-05-27 | University Of Massachusetts | AAV's and uses thereof |
WO2010143761A1 (ko) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | (주)바이오니아 | 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법 |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
WO2011008972A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent identification |
WO2011041502A1 (en) | 2009-10-01 | 2011-04-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav vectors expressing sec1o for treating kidney damage |
ES2628739T3 (es) | 2009-10-15 | 2017-08-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación por desplazamiento múltiple |
US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
CA2793633A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
DK2826860T3 (en) | 2010-04-23 | 2018-12-03 | Univ Massachusetts | CNS targeting AAV vectors and methods for their use |
WO2011133874A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Multicistronic expression constructs |
WO2011133901A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Aav-based treatment of cholesterol-related disorders |
US9309534B2 (en) | 2010-07-12 | 2016-04-12 | Universidad Autonoma De Barcelona | Gene therapy composition for use in diabetes treatment |
US8663624B2 (en) | 2010-10-06 | 2014-03-04 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof |
US20140031418A1 (en) | 2011-04-20 | 2014-01-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Regimens and Compositions for AAV-Mediated Passive Immunization of Airborne Pathogens |
EP3318635A1 (en) | 2011-04-21 | 2018-05-09 | University of Massachusetts | Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies |
PL3254703T3 (pl) | 2011-04-22 | 2020-10-05 | The Regents Of The University Of California | Wiriony wirusa towarzyszącego adenowirusom z różnymi kapsydami i sposoby ich zastosowania |
EP3795581A3 (en) * | 2011-08-24 | 2021-06-09 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | New avv capsid proteins for nucleic acid transfer |
US20130136729A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-30 | University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group | Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors |
CA2864879C (en) * | 2012-02-17 | 2021-07-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues |
US10093947B2 (en) * | 2012-02-28 | 2018-10-09 | Cornell University | AAV-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation |
US10004811B2 (en) * | 2012-04-13 | 2018-06-26 | Cornell University | Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction |
US10294281B2 (en) | 2012-05-15 | 2019-05-21 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use |
EP2692868A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-05 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue |
WO2014124282A1 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Enhanced aav-mediated gene transfer for retinal therapies |
SI3889173T1 (sl) | 2013-02-15 | 2023-11-30 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimiran gen dejavnika VIII |
US8957044B2 (en) | 2013-03-01 | 2015-02-17 | Wake Forest University Health Sciences | Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM) |
JP6591956B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-10-16 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | Mps1を治療するための組成物および方法 |
WO2015012924A2 (en) | 2013-04-29 | 2015-01-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof |
CA2907799A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus variants and methods of use thereof |
WO2015013313A2 (en) | 2013-07-22 | 2015-01-29 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues |
CA3228845A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Bag3 and uses thereof in the treatment of heart failure with reduced ejection fraction |
GB201403684D0 (en) | 2014-03-03 | 2014-04-16 | King S College London | Vector |
US10072251B2 (en) | 2014-02-19 | 2018-09-11 | University Of Massachusetts | Recombinant AAVS having useful transcytosis properties |
SI3116900T1 (sl) | 2014-03-09 | 2021-02-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Sestavki uporabni pri zdravljenju pomanjkanja ornitin transkarbamilaze(OTC) |
CA2942776C (en) | 2014-03-17 | 2023-01-24 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Polyneucleotide cassette and expression vector for expression of a gene in cone cells using truncated m-opsin promoter |
EP3750907A3 (en) | 2014-03-18 | 2021-04-28 | University of Massachusetts | Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
HRP20231077T1 (hr) | 2014-03-21 | 2023-12-22 | Genzyme Corporation | Genska terapija za pigmentni retinitis |
EP2933335A1 (en) | 2014-04-18 | 2015-10-21 | Genethon | A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases |
ES2876409T3 (es) | 2014-04-25 | 2021-11-12 | Univ Pennsylvania | Variantes del RLBD y su uso en composiciones para reducir los niveles de colesterol |
WO2015164723A1 (en) | 2014-04-25 | 2015-10-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain |
US10975391B2 (en) | 2014-04-25 | 2021-04-13 | University Of Massachusetts | Recombinant AAV vectors useful for reducing immunity against transgene products |
MY186389A (en) | 2014-05-13 | 2021-07-22 | Univ Pennsylvania | Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof |
WO2015187825A2 (en) | 2014-06-03 | 2015-12-10 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for modulating dysferlin expression |
WO2015191508A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-17 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
EP2960336A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Genethon | Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies |
BR112016030730B1 (pt) | 2014-07-03 | 2023-05-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Composto |
CA2961523A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Genzyme Corporation | Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma |
EP4012035A1 (en) | 2014-09-16 | 2022-06-15 | Genzyme Corporation | Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma |
WO2016054554A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | University Of Massachusetts | Heterologous targeting peptide grafted aavs |
JP6842410B2 (ja) | 2014-10-03 | 2021-03-17 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | 新規の高効率ライブラリーにより同定されるaavベクター |
CN107073051B (zh) | 2014-10-21 | 2021-08-24 | 马萨诸塞大学 | 重组aav变体及其用途 |
MX2017005834A (es) | 2014-11-05 | 2017-11-17 | Voyager Therapeutics Inc | Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson. |
CN112375760A (zh) | 2014-11-14 | 2021-02-19 | 沃雅戈治疗公司 | 调节性多核苷酸 |
AU2015346162B2 (en) | 2014-11-14 | 2022-02-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
WO2016094783A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scaav |
WO2016110518A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-14 | Universitat Autònoma De Barcelona | Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes |
EP3245221A4 (en) | 2015-01-16 | 2018-06-13 | Voyager Therapeutics, Inc. | Central nervous system targeting polynucleotides |
US10429288B2 (en) | 2015-01-20 | 2019-10-01 | Genzyme Corporation | Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles |
US20180030096A1 (en) | 2015-02-03 | 2018-02-01 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof |
EP3256487A4 (en) | 2015-02-09 | 2018-07-18 | Duke University | Compositions and methods for epigenome editing |
AU2016219396B2 (en) | 2015-02-10 | 2022-03-17 | Genzyme Corporation | Variant RNAi |
SG10201907399RA (en) | 2015-02-10 | 2019-09-27 | Genzyme Corp | Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex |
EP3256170B1 (en) | 2015-02-13 | 2020-09-23 | University of Massachusetts | Compositions and methods for transient delivery of nucleases |
KR20170137730A (ko) | 2015-03-02 | 2017-12-13 | 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 망막 추상체에 폴리뉴클레오타이드의 유리체 내 전달을 위한 조성물 및 방법 |
CA2978917A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Recombinant glut1 adeno-associated viral vector constructs and related methods for restoring glut1 expression |
AU2016235163B2 (en) | 2015-03-24 | 2022-03-24 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus variants and methods of use thereof |
TWI707951B (zh) | 2015-04-08 | 2020-10-21 | 美商健臻公司 | 過大腺相關載體之製造 |
CA3019315A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | University Of Massachusetts | Modulation of aav vector transgene expression |
US11046955B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-06-29 | University Of Massachusetts | Modified AAV constructs and uses thereof |
JP6851319B2 (ja) | 2015-04-27 | 2021-03-31 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | ヒト疾患のCRISPR/Cas9媒介性の修正のためのデュアルAAVベクター系 |
GB201508026D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Capsid |
WO2016200543A2 (en) | 2015-05-13 | 2016-12-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav-mediated expression of anti-inluenza antibodies and methods of use thereof |
US11896651B2 (en) | 2015-05-16 | 2024-02-13 | Genzyme Corporation | Gene editing of deep intronic mutations |
KR102415896B1 (ko) | 2015-06-23 | 2022-06-30 | 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 | 변형된 인자 ix, 및 세포, 기관 및 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물, 방법 및 용도 |
WO2017015637A1 (en) | 2015-07-22 | 2017-01-26 | Duke University | High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies |
ES2929110T3 (es) | 2015-08-25 | 2022-11-24 | Univ Duke | Composiciones y métodos para mejorar la especificidad en ingeniería genética usando endonucleasas guiadas por ARN |
CA2995733A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav-epo for treating companion animals |
RU2727411C2 (ru) | 2015-09-24 | 2020-07-21 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Композиция и способ для лечения заболевания, опосредованного комплементом |
PL3356390T3 (pl) | 2015-09-28 | 2021-07-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Sposoby i kompozycje dla wektorów wirusowych unikających przeciwciał |
WO2017062750A1 (en) | 2015-10-09 | 2017-04-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful in treating stargardt's disease and other ocular disorders |
US11970710B2 (en) | 2015-10-13 | 2024-04-30 | Duke University | Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells |
CA3002980A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | University Of Massachusetts | Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors |
DK3364997T3 (da) | 2015-10-22 | 2024-04-22 | Univ Massachusetts | Aspartoacylase genterapi til behandling af canavans sygdom |
EP4316512A3 (en) | 2015-10-28 | 2024-04-24 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy |
US20180230489A1 (en) | 2015-10-28 | 2018-08-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Regulatable expression using adeno-associated virus (aav) |
EA201891066A1 (ru) | 2015-10-30 | 2018-10-31 | ЭнБиИ-ТЕРАПЬЮТИКС АГ | Антитела к ror1 |
CA3006569A1 (en) | 2015-12-02 | 2017-06-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Assays for the detection of aav neutralizing antibodies |
FR3044926B1 (fr) | 2015-12-09 | 2020-01-31 | Genethon | Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine |
US11015174B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
CA3008142A1 (en) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia |
US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
US11098286B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
EP3992283A1 (en) | 2015-12-11 | 2022-05-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aavrh10 |
CA3007330A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Composition for treatment of crigler-najjar syndrome |
WO2017106202A2 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for ocular disorders |
RU2742612C2 (ru) | 2015-12-15 | 2021-02-09 | Джензим Корпорейшн | Векторы на основе аденоассоциированного вируса для лечения муколипидоза типа ii |
WO2017127664A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-27 | The Scripps Research Institute | Ror1 antibody compositions and related methods |
JP7217630B2 (ja) | 2016-02-01 | 2023-02-03 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 最適化第viii因子遺伝子 |
US11826433B2 (en) | 2016-02-02 | 2023-11-28 | University Of Massachusetts | Method to enhance the efficiency of systemic AAV gene delivery to the central nervous system |
CA3012195A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i |
CA3012344A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-17 | University Of Massachusetts | Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization |
US10729789B2 (en) * | 2016-03-01 | 2020-08-04 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells |
WO2017176929A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-10-12 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression |
EP3443001A4 (en) | 2016-04-11 | 2020-04-29 | Obsidian Therapeutics, Inc. | REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS |
SG11201808812RA (en) | 2016-04-15 | 2018-11-29 | Univ Pennsylvania | Novel aav8 mutant capsids and compositions containing same |
JP7171439B2 (ja) | 2016-04-15 | 2022-11-15 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | ムコ多糖症ii型を処置するための遺伝子療法 |
EP3452103A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration |
EP3442597A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-02-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating hemophilia b |
US11413356B2 (en) | 2016-04-15 | 2022-08-16 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating metabolic imbalance |
RU2762257C2 (ru) | 2016-04-15 | 2021-12-17 | Зе Трастис Оф Зе Юниверсити Оф Пенсильвания | Генная терапия для лечения гемофилии a |
WO2017184463A1 (en) | 2016-04-17 | 2017-10-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates |
EP3448987A4 (en) | 2016-04-29 | 2020-05-27 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
GB201608046D0 (en) * | 2016-05-09 | 2016-06-22 | Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The | Treatment of complement-mediated disorders |
CN115925999A (zh) | 2016-05-13 | 2023-04-07 | 4D分子治疗有限公司 | 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法 |
SG11201809699XA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
RU2764587C2 (ru) | 2016-05-18 | 2022-01-18 | Вояджер Терапьютикс, Инк. | Способы и композиции для лечения хореи гентингтона |
CN109313018B (zh) * | 2016-06-08 | 2021-12-10 | 索尼公司 | 成像控制装置和方法、以及车辆 |
US11882815B2 (en) | 2016-06-15 | 2024-01-30 | University Of Massachusetts | Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells |
KR20190096329A (ko) | 2016-07-05 | 2019-08-19 | 유니버시티 오브 매사추세츠 | 녹내장에서 신경보호 요법으로서 sfasl의 aav2-매개된 유전자 전달 |
KR20230062878A (ko) | 2016-07-08 | 2023-05-09 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | Rdh12가 연루된 장애 및 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물 |
WO2018022511A1 (en) | 2016-07-25 | 2018-02-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof |
JP6994018B2 (ja) | 2016-07-26 | 2022-01-14 | バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 新規アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質 |
MX2019001276A (es) | 2016-07-29 | 2019-06-13 | Univ California | Viriones de virus adenoasociados con cápside variante y métodos para su uso. |
TN2019000047A1 (en) | 2016-08-15 | 2020-07-15 | Genzyme Corp | Methods for detecting aav |
US11298041B2 (en) | 2016-08-30 | 2022-04-12 | The Regents Of The University Of California | Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same |
US10457940B2 (en) | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
EP3518985A4 (en) * | 2016-09-29 | 2020-08-05 | University of Florida Research Foundation, Incorporated | AAVRH.10 VARIANTS WITH HOST ANTIBODY EXHAUST CAPACITIES AND MODIFIED TISSUE TARGETING PROPERTIES |
US11578340B2 (en) | 2016-10-13 | 2023-02-14 | University Of Massachusetts | AAV capsid designs |
WO2018075798A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Modified aav capsids and uses thereof |
EP3548065B1 (en) | 2016-12-01 | 2022-11-09 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Pharmaceutical compositions for the treatment of retinal degenerative diseases |
WO2018112225A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | The J. David Gladstone Institutes | Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (dip) |
BR112019013576A2 (pt) * | 2016-12-30 | 2020-02-04 | Univ Pennsylvania | terapia genica para o tratamento da fenilcetonuria |
CA3042467A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Treatment of krabbe disease with umbilical cord blood transplantion (ucbt) and increased galactocerebrosidase (galc) expression |
WO2018152485A1 (en) | 2017-02-20 | 2018-08-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia |
JOP20190200A1 (ar) | 2017-02-28 | 2019-08-27 | Univ Pennsylvania | تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي |
SG11201907611WA (en) | 2017-02-28 | 2019-09-27 | Univ Pennsylvania | Influenza vaccines based on aav vectors |
RS65241B1 (sr) | 2017-02-28 | 2024-03-29 | Univ Pennsylvania | Vektor adeno-asociranih virusa (aav) iz podgrupe f i njegove upotrebe |
CA3054136A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for ocular disorders |
EP3589311A1 (en) | 2017-03-02 | 2020-01-08 | Genethon | Method for removing anti-aav antibodies from a blood-derived composition |
JP7307480B2 (ja) | 2017-04-05 | 2023-07-12 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | ミニ遺伝子療法 |
WO2018189208A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Genethon | Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies |
KR20190139951A (ko) | 2017-04-14 | 2019-12-18 | 리젠엑스바이오 인크. | 인간 뉴런 또는 신경교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 이두로네이트-2 설파타제(ids)를 이용한 뮤코다당증 ii형의 치료 |
US11879133B2 (en) | 2017-04-24 | 2024-01-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for ocular disorders |
JP2020518258A (ja) | 2017-05-05 | 2020-06-25 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症(als)治療組成物および方法 |
SG11201909868YA (en) | 2017-05-05 | 2019-11-28 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating huntington's disease |
WO2018208972A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-11-15 | University Of Massachusetts | Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
WO2018209205A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
CN108103058A (zh) * | 2017-05-12 | 2018-06-01 | 北京五加和分子医学研究所有限公司 | 一种i型糖尿病的基因治疗药物 |
CA3099990A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | University Of Massachusetts | Viral vector production |
CA3098592A1 (en) | 2017-05-31 | 2018-12-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating peroxisomal disorders |
MX2019014760A (es) | 2017-06-06 | 2020-08-03 | Univ Massachusetts | Vectores de aav autoregulables para la expresión segura de mecp2 en el síndrome de rett. |
EP3638316A4 (en) | 2017-06-14 | 2021-03-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
AU2018288863A1 (en) * | 2017-06-22 | 2020-01-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof |
AU2018298133A1 (en) | 2017-07-06 | 2020-01-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | AAV9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I |
CA3069045A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Genethon | Novel polynucleotides encoding a human fkrp protein |
CN111132626B (zh) | 2017-07-17 | 2024-01-30 | 沃雅戈治疗公司 | 轨迹阵列引导*** |
KR20200044793A (ko) | 2017-08-03 | 2020-04-29 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법 |
SG11202000846WA (en) | 2017-08-07 | 2020-02-27 | Nbe Therapeutics Ag | Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability |
EP3676373A4 (en) * | 2017-08-28 | 2021-06-09 | The Regents of The University of California | CAPSID VARIANTS OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHOD OF USING THEREOF |
WO2019060454A2 (en) | 2017-09-20 | 2019-03-28 | 4D Molecular Therapeutics Inc. | CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE |
US11819539B2 (en) | 2017-09-22 | 2023-11-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating Mucopolysaccharidosis type II |
WO2019060686A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | University Of Massachusetts | NEW DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND USES THEREOF |
KR20200056428A (ko) | 2017-09-22 | 2020-05-22 | 젠자임 코포레이션 | 변이체 RNAi |
CN112501208A (zh) * | 2017-10-03 | 2021-03-16 | 普利维尔治疗公司 | 用于溶酶体障碍的基因疗法 |
WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
JP2021502060A (ja) | 2017-10-16 | 2021-01-28 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症(als)の治療 |
KR20200067195A (ko) | 2017-10-18 | 2020-06-11 | 리젠엑스바이오 인크. | 완전-인간 번역후 변형된 항체 치료제 |
MX2020003945A (es) | 2017-10-18 | 2020-11-09 | Regenxbio Inc | Tratamiento de enfermedades oculares y cancer de colon metastasico con vegf-trap humano modificado post-traduccionalmente . |
EP3697764A4 (en) * | 2017-10-18 | 2021-07-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | GLUTAMINASE INHIBITOR THERAPY |
ES2946747T3 (es) | 2017-11-27 | 2023-07-25 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Variantes de cápsides de virus adenoasociado y su utilización para inhibir la angiogénesis |
WO2019108857A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for mucopolysaccharidosis iiia |
US11723989B2 (en) | 2017-11-30 | 2023-08-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for mucopolysaccharidosis IIIB |
BR112020012336A2 (pt) | 2017-12-19 | 2021-03-30 | Akouos, Inc. | Administração de anticorpos terapêuticos mediada por aav para o ouvido interno |
US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
WO2019161365A1 (en) | 2018-02-19 | 2019-08-22 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for restoring f8 gene function and methods of use thereof |
EP3762500A1 (en) | 2018-03-06 | 2021-01-13 | Voyager Therapeutics, Inc. | Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes |
JP2021519065A (ja) | 2018-03-23 | 2021-08-10 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | 骨障害を処置するための遺伝子治療法 |
JP7406677B2 (ja) | 2018-04-03 | 2023-12-28 | ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド | 抗体を回避するウイルスベクター |
EP3784290A4 (en) | 2018-04-27 | 2022-03-23 | University of Massachusetts | AAV CAPSIDS IDENTIFIED BY SELECTING AN IN VIVO LIBRARY |
WO2019212922A1 (en) | 2018-04-29 | 2019-11-07 | Regenxbio Inc. | Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles |
CA3098565A1 (en) | 2018-04-29 | 2019-11-07 | Claire G. ZHANG | Scalable clarification process for recombinant aav production |
EP3790394A4 (en) | 2018-05-08 | 2022-07-27 | Rutgers, the State University of New Jersey | POLYMERIZING PROTEINS AAV-COMPATIBLE LAMININ LINKER |
SG11202010830WA (en) | 2018-05-09 | 2020-11-27 | Biomarin Pharm Inc | Methods of treating phenylketonuria |
TW202005978A (zh) | 2018-05-14 | 2020-02-01 | 美商拜奧馬林製藥公司 | 新穎肝靶向腺相關病毒載體 |
SG11202011296VA (en) | 2018-05-15 | 2020-12-30 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease |
US20210230632A1 (en) | 2018-05-15 | 2021-07-29 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
US20210214749A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-07-15 | Voyager Therapeutics, Inc. | Directed evolution |
WO2019222441A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav serotypes for brain specific payload delivery |
EP3806888B1 (en) | 2018-06-12 | 2024-01-31 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
EP3807404A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production |
AU2019285186A1 (en) | 2018-06-14 | 2021-01-07 | Regenxbio Inc. | Anion exchange chromatography for recombinant AAV production |
CN112567035A (zh) | 2018-07-02 | 2021-03-26 | 沃雅戈治疗公司 | 肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗 |
GB201811368D0 (en) | 2018-07-11 | 2018-08-29 | Ucb Biopharma Sprl | Antibody |
US20210355454A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-11-18 | Voyager Therapeutics, Inc. | Systems and methods for producing gene therapy formulations |
JPWO2020026968A1 (ja) * | 2018-07-30 | 2021-08-12 | 株式会社遺伝子治療研究所 | Aavベクターによる遺伝子発現を増強する方法 |
EP3830265A1 (en) | 2018-08-03 | 2021-06-09 | Genzyme Corporation | Variant rnai against alpha-synuclein |
CN112567027A (zh) | 2018-08-10 | 2021-03-26 | 再生生物股份有限公司 | 用于重组aav生产的可扩展方法 |
BR112021003897A2 (pt) | 2018-08-30 | 2021-05-25 | Tenaya Therapeutics, Inc. | reprogramação de células cardíacas com miocarina e asci1 |
EP3856226A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-08-04 | President and Fellows of Harvard College | Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration |
KR20210068068A (ko) | 2018-09-28 | 2021-06-08 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | 조작된 프로모터를 갖는 프라탁신 발현 구축물 및 그의 사용 방법 |
CN113164625A (zh) | 2018-09-28 | 2021-07-23 | 哈佛大学的校长及成员们 | 用于基因表达的突变体反向四环素反式激活因子 |
CA3114175A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis |
US20210348242A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-11-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles |
TW202028458A (zh) | 2018-10-05 | 2020-08-01 | 美商航海家醫療公司 | 編碼腺相關病毒(aav)生產蛋白之經基因工程化核酸構築體 |
US20210371470A1 (en) | 2018-10-12 | 2021-12-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
JP2022504740A (ja) | 2018-10-12 | 2022-01-13 | ジェンザイム・コーポレーション | 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のpkuを処置するための改善されたヒトpahの生成 |
UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
EP3867389A1 (en) | 2018-10-15 | 2021-08-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system |
WO2020081415A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Regenxbio Inc. | Method for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses |
US20210363509A1 (en) | 2018-10-22 | 2021-11-25 | University Of Rochester | Genome Editing by Directed Non-Homologous DNA Insertion Using a Retroviral Integrase-Cas9 Fusion Protein |
EP3870600A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-09-01 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
EP3650956A1 (fr) | 2018-11-07 | 2020-05-13 | Tissot S.A. | Procede de diffusion d'un signal acoustique |
CN113271982A (zh) | 2018-11-16 | 2021-08-17 | 安斯泰来制药株式会社 | 通过靶向肌营养相关蛋白基因来治疗肌营养不良的方法 |
EP3880823A4 (en) * | 2018-11-16 | 2022-08-17 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | THERAPEUTIC ADENO-ASSOCIATED VIRUS FOR THE TREATMENT OF PUMP DISEASE |
WO2020112967A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | University Of Massachusetts | Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors |
WO2020140007A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | University Of Rochester | Gene therapy for best1 dominant mutations |
CN113518628A (zh) | 2019-01-04 | 2021-10-19 | 阿尔特拉吉尼克斯制药公司 | 治疗威尔逊病的基因疗法构建体 |
MX2021008487A (es) | 2019-01-14 | 2021-11-12 | Univ Rochester | Escisión y poliadenilación del arn nuclear dirigido con crispr-cas. |
AU2020208467A1 (en) | 2019-01-18 | 2021-08-05 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods and systems for producing AAV particles |
KR20210130158A (ko) | 2019-01-31 | 2021-10-29 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | Aav 캡시드의 전사 의존적 유도 진화를 사용하는 방법 |
US20220054655A1 (en) | 2019-02-22 | 2022-02-24 | University Of Massachusetts | Oxr1 gene therapy |
US20220136008A1 (en) | 2019-02-22 | 2022-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration |
CR20210444A (es) | 2019-02-25 | 2021-11-02 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para tratar distrofia cristalina de bietti |
WO2020174369A2 (en) | 2019-02-25 | 2020-09-03 | Novartis Ag | Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy |
US20220118108A1 (en) | 2019-02-26 | 2022-04-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful in treatment of krabbe disease |
EP3930694A1 (en) | 2019-02-28 | 2022-01-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics |
JP2022526526A (ja) | 2019-03-25 | 2022-05-25 | ジェネトン | オーバーラップaavベクターを使用する大きいサイズのクアシジストロフィンの産生 |
EP3946467A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-02-09 | REGENXBIO Inc. | Gene therapy for eye pathologies |
TW202102526A (zh) | 2019-04-04 | 2021-01-16 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 重組腺相關病毒及其用途 |
US20220275358A1 (en) | 2019-04-11 | 2022-09-01 | Regenxbio Inc. | Methods of size exclusion chromatography for the characterization of recombinant adeno-associated virus compositions |
BR112021020668A2 (pt) | 2019-04-17 | 2022-01-11 | Codiak Biosciences Inc | Composições de exossomos e aav |
JP2022529002A (ja) | 2019-04-19 | 2022-06-16 | レジェンクスバイオ インコーポレーテッド | アデノ随伴ウイルスベクター製剤及び方法 |
CN114144197A (zh) * | 2019-04-24 | 2022-03-04 | 再生生物股份有限公司 | 完全人类翻译后修饰的抗体治疗剂 |
BR112021020545A2 (pt) * | 2019-04-29 | 2022-01-04 | Univ Pennsylvania | Capsídeos de aav e composições contendo os mesmos |
TW202106879A (zh) | 2019-04-29 | 2021-02-16 | 美商航海家醫療公司 | 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法 |
WO2020227515A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation |
EP3976631A1 (en) * | 2019-05-24 | 2022-04-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified viral particles and uses thereof |
WO2020241903A1 (en) | 2019-05-28 | 2020-12-03 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene |
WO2020257684A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for improved gene editing |
JP2022538497A (ja) | 2019-07-02 | 2022-09-02 | エム6ピー セラピューティクス (スイッツァランド) ゲーエムベーハー | ライソゾーム蓄積症を処置するためのベクター組成物およびそれを使用する方法 |
US20220251567A1 (en) | 2019-07-10 | 2022-08-11 | Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) | Methods for the treatment of epilepsy |
EP3997214B1 (en) | 2019-07-11 | 2023-08-02 | Centre National de la Recherche Scientifique | Chemically-modified adeno-associated virus |
EP3997226A1 (en) | 2019-07-11 | 2022-05-18 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors |
US10557149B1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-02-11 | Vigene Biosciences, Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus |
US10653731B1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-05-19 | Vigene Biosciences Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency |
EP4004206A1 (en) | 2019-07-23 | 2022-06-01 | University of Rochester | Targeted rna cleavage with crispr-cas |
EP4004214A1 (en) | 2019-07-26 | 2022-06-01 | RegenxBio Inc. | Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof |
EP4007814A1 (en) | 2019-07-26 | 2022-06-08 | Akouos, Inc. | Methods of treating hearing loss using a secreted target protein |
EP4010465A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-06-15 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors |
EP4013770A4 (en) * | 2019-08-14 | 2023-12-13 | University of Florida Research Foundation, Incorporated | AAV CAPSID VARIANTS FOR GENE THERAPY |
WO2021041373A1 (en) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | Regenxbio Inc. | Treatment of diabetic retinopathy with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab |
US20220364114A1 (en) | 2019-08-26 | 2022-11-17 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
TW202118873A (zh) | 2019-08-27 | 2021-05-16 | 美商維泰克斯製藥公司 | 用於治療與重複性dna有關之病症之組合物及方法 |
WO2021046155A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
CN114555814A (zh) | 2019-09-13 | 2022-05-27 | 罗特格斯新泽西州立大学 | Aav相容的层粘连蛋白-连接子聚合蛋白 |
CA3149449A1 (en) | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Evelyne GICQUEL | Gene therapy expression system alleviating cardiac toxicity of fkrp |
WO2021062092A1 (en) | 2019-09-26 | 2021-04-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Trans-activated functional rna by strand displacement and uses thereof |
US11492622B2 (en) | 2019-09-26 | 2022-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | MicroRNA-based logic gates and uses thereof |
WO2021067598A1 (en) | 2019-10-04 | 2021-04-08 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Methods for improved therapeutic use of recombinant aav |
CA3156984A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | Regenxbio Inc. | Adeno-associated virus vector pharmaceutical composition and methods |
WO2021076656A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-22 | University Of Massachusetts | Rna editor-enhanced rna trans-splicing |
EP4045664A1 (en) * | 2019-10-16 | 2022-08-24 | Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. | A novel aav variant |
CA3157700A1 (en) | 2019-10-17 | 2021-04-22 | Stridebio, Inc. | Adeno-associated viral vectors for treatment of niemann-pick disease type c |
WO2021097157A1 (en) | 2019-11-14 | 2021-05-20 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of hereditary angioedema with liver-specific gene therapy vectors |
US20230016983A1 (en) | 2019-11-19 | 2023-01-19 | lNSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MÉDICALE) | Antisense oligonucleotides and thier use for the treatment of cancer |
US20230270886A1 (en) | 2019-11-28 | 2023-08-31 | Regenxbio Inc. | Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof |
CA3164189A1 (en) | 2019-12-10 | 2021-06-17 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease |
TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
BR112022014563A2 (pt) | 2020-01-22 | 2022-09-13 | Regenxbio Inc | Método para tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose i (mps i) |
AU2021214174A1 (en) | 2020-01-29 | 2022-08-18 | Regenxbio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2-sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells |
KR20220133900A (ko) | 2020-01-29 | 2022-10-05 | 리젠엑스바이오 인크. | 점액다당류증 iva의 치료 |
US20230348624A1 (en) | 2020-01-30 | 2023-11-02 | Umoja Biopharma, Inc. | Bispecific transduction enhancer |
CA3165057A1 (en) | 2020-02-02 | 2021-08-05 | James M. Wilson | Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis |
WO2021158982A2 (en) | 2020-02-07 | 2021-08-12 | University Of Rochester | Targeted translation of rna with crispr-cas13 to enhance protein synthesis |
KR20220141829A (ko) | 2020-02-07 | 2022-10-20 | 유니버시티 오브 로체스터 | 리보자임-매개 rna 조립 및 발현 |
BR112022015921A2 (pt) | 2020-02-14 | 2022-10-04 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc | Terapia gênica para tratar o transtorno de deficiência de cdkl5 |
EP4114421A1 (en) | 2020-03-02 | 2023-01-11 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas |
CN115667298A (zh) | 2020-03-27 | 2023-01-31 | Ucb生物制药有限责任公司 | 自主凸起结构域肽 |
WO2021195519A1 (en) | 2020-03-27 | 2021-09-30 | University Of Rochester | Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13 |
EP4127170A1 (en) | 2020-03-27 | 2023-02-08 | University of Rochester | Crispr-cas13 crrna arrays |
EP4127189A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-02-08 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Gene therapy for treating propionic acidemia |
MX2022012279A (es) | 2020-03-31 | 2023-02-23 | Univ Massachusetts | Variantes de capsides de aav y usos de los mismos. |
AR122409A1 (es) | 2020-04-03 | 2022-09-07 | Biomarin Pharm Inc | Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas |
EP4132955A2 (en) | 2020-04-10 | 2023-02-15 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of protein aggregation disorders |
BR112022020753A2 (pt) | 2020-04-15 | 2022-12-20 | Voyager Therapeutics Inc | Compostos de ligação a tau |
EP4143215A2 (en) | 2020-04-28 | 2023-03-08 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of tdp-43 proteinopathies |
KR20230023637A (ko) | 2020-05-12 | 2023-02-17 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 크라베병의 치료에 유용한 조성물 |
US20230304034A1 (en) | 2020-05-12 | 2023-09-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for drg-specific reduction of transgene expression |
EP4165194A2 (en) | 2020-05-13 | 2023-04-19 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss |
CA3183171A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss |
WO2021230385A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene |
WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
CA3183251A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-12-09 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of synucleinopathies |
US20230220069A1 (en) | 2020-06-17 | 2023-07-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of gene therapy patients |
CN115996758A (zh) | 2020-06-19 | 2023-04-21 | 吉尼松公司 | 使sgcg在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达*** |
BR112023000305A2 (pt) | 2020-07-10 | 2023-03-21 | Genethon | Promotor, sistema de expressão e composição farmacêutica |
US20240018524A1 (en) | 2020-07-10 | 2024-01-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and compositions for treating epilepsy |
US20230270884A1 (en) | 2020-07-13 | 2023-08-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease |
JP2023534464A (ja) | 2020-07-15 | 2023-08-09 | ユニバーシティ オブ ロチェスター | dCas13-RNase融合タンパク質による標的RNAの切断 |
WO2022017630A1 (en) | 2020-07-23 | 2022-01-27 | Ucl Business Ltd | GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF |
WO2022026410A2 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
US20230227802A1 (en) | 2020-07-27 | 2023-07-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
EP4192514A1 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors |
AU2021320902A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-04-06 | Spacecraft Seven, Llc | Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using AAV vector |
US20240043494A1 (en) | 2020-08-07 | 2024-02-08 | Amicus Therapeutics, Inc. | Vesicle Targeting Proteins And Uses Of Same |
CN114075610B (zh) * | 2020-08-11 | 2023-11-17 | 北京荷塘生华医疗科技有限公司 | 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用 |
JP2023537625A (ja) | 2020-08-14 | 2023-09-04 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 新規aavカプシド及びそれを含む組成物 |
CA3190399A1 (en) | 2020-08-24 | 2022-03-03 | James M. Wilson | Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases |
GB202013194D0 (en) | 2020-08-24 | 2020-10-07 | Combigene Ab | Gene therapy for lipodystrophy |
CA3189107A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | James M. Wilson | Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration |
US20220096606A1 (en) | 2020-09-09 | 2022-03-31 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy |
CA3188763A1 (en) | 2020-09-10 | 2022-03-17 | Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen | Engineered aav vectors |
WO2022060915A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Regenxbio Inc. | Vectorized lanadelumab and administration thereof |
EP4214242A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | RegenxBio Inc. | Vectorized antibodies for anti-viral therapy |
US20230383278A1 (en) | 2020-09-18 | 2023-11-30 | The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services | Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency |
EP4217376A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-08-02 | University of Massachusetts | Aav vectors encoding nf1 and uses thereof |
AU2021355481A1 (en) | 2020-10-01 | 2023-06-08 | Genzyme Corporation | Human pah expression cassette for treatment of pku by liver-directed gene replacement therapy |
WO2022076591A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Regenxbio Inc. | Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation |
IL301643A (en) | 2020-10-07 | 2023-05-01 | Regenxbio Inc | Gene therapy for ocular manifestations of CLN2 disease |
WO2022076750A2 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery |
AU2021358048A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-05-25 | Regenxbio Inc. | Formulations for suprachoroidal administration such as high viscosity formulations |
TW202228646A (zh) | 2020-10-07 | 2022-08-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 諸如凝膠調配物之用於脈絡膜上投與之調配物 |
EP4225777A2 (en) | 2020-10-07 | 2023-08-16 | RegenxBio Inc. | Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy |
US11781156B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-10-10 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
WO2022076803A1 (en) | 2020-10-09 | 2022-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of fabry disease |
AU2021359874A1 (en) | 2020-10-18 | 2023-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor |
WO2022094078A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful in treatment of rett syndrome |
WO2022094157A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | Regenxbio Inc. | Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof |
CN116528892A (zh) | 2020-10-28 | 2023-08-01 | 再生生物股份有限公司 | 用于眼部适应症的载体化抗TNF-α抗体 |
EP4236974A2 (en) | 2020-10-29 | 2023-09-06 | RegenxBio Inc. | Vectorized factor xii antibodies and administration thereof |
IL302282A (en) | 2020-10-29 | 2023-06-01 | Regenxbio Inc | Vectored TNF-alpha antagonists for ocular indications |
US20230414648A1 (en) | 2020-11-06 | 2023-12-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and Methods for Treatment of DM1 with SLUCAS9 and SACAS9 |
CN112322791B (zh) * | 2020-11-27 | 2023-10-27 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 |
PE20240115A1 (es) | 2020-12-01 | 2024-01-22 | Akouos Inc | Construcciones de anticuerpos anti-vegf y metodos relacionados para el tratamiento de los sintomas asociados al schwannoma vestibular |
MX2023006445A (es) | 2020-12-01 | 2023-08-10 | Univ Pennsylvania | Composiciones y usos de estas para el tratamiento del síndrome de angelman. |
AR124216A1 (es) | 2020-12-01 | 2023-03-01 | Univ Pennsylvania | Composiciones nuevas con motivos selectivos específicos del tejido y composiciones que las contienen |
AU2021403076A1 (en) | 2020-12-16 | 2023-06-29 | Regenxbio Inc. | Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle |
TW202241943A (zh) | 2020-12-29 | 2022-11-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途 |
EP4271419A1 (en) | 2020-12-29 | 2023-11-08 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss |
CA3205209A1 (en) | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Regenxbio Inc. | Improved production of recombinant polypeptides and viruses |
EP4284821A1 (en) | 2021-01-27 | 2023-12-06 | Umoja Biopharma, Inc. | Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor |
US20240091380A1 (en) | 2021-02-01 | 2024-03-21 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
WO2022173605A2 (en) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | Regenxbio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids) |
GB202101958D0 (en) | 2021-02-12 | 2021-03-31 | Ucl Business Ltd | Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome |
WO2022182957A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9 |
TW202246510A (zh) | 2021-02-26 | 2022-12-01 | 美商維泰克斯製藥公司 | 以crispr/slucas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法 |
BR112023016983A2 (pt) | 2021-02-26 | 2023-11-07 | Takeda Pharmaceuticals Co | Vetor de vírus adeno-associado recombinante, método para tratar doença de fabry, composição farmacêutica, célula, e, método de expressão da enzima ¿-gal em uma célula |
US20240141378A1 (en) | 2021-03-03 | 2024-05-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
WO2022187473A2 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
CN117460832A (zh) | 2021-03-22 | 2024-01-26 | 建新公司 | 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析 |
WO2022204476A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing |
EP4323520A1 (en) | 2021-04-12 | 2024-02-21 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Compositions useful for treating spinal and bulbar muscular atrophy (sbma) |
KR20240000580A (ko) | 2021-04-23 | 2024-01-02 | 유니버시티 오브 로체스터 | 레트로바이러스 인테그라제-Cas 융합 단백질을 이용한 직접 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집 및 치료 방법 |
WO2022226263A1 (en) | 2021-04-23 | 2022-10-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same |
EP4329821A1 (en) | 2021-04-26 | 2024-03-06 | RegenxBio Inc. | Microdystrophin gene therapy administration for treatment of dystrophinopathies |
WO2022229851A1 (en) | 2021-04-26 | 2022-11-03 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences |
WO2022235614A2 (en) | 2021-05-04 | 2022-11-10 | Regenxbio Inc. | Novel aav vectors and methods and uses thereof |
WO2022234519A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences |
WO2022241030A1 (en) | 2021-05-11 | 2022-11-17 | Regenxbio Inc. | Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof |
WO2022272297A1 (en) | 2021-06-25 | 2022-12-29 | Oxford Biomedica Solutions Llc | Adeno-associated virus packaging systems |
CA3225985A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Indapta Therapeutics, Inc. | Engineered natural killer (nk) cells and related methods |
WO2023279073A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Amicus Therapeutics, Inc. | Neurotensin variants and tagged proteins comprising neurotensin or sortilin propeptide |
KR20240032971A (ko) | 2021-07-08 | 2024-03-12 | 테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 유전자 요법을 위한 최적화된 발현 카세트 |
WO2023004331A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-26 | New York University | Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease |
WO2023010133A2 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn) |
AU2022318664A1 (en) | 2021-07-30 | 2024-02-29 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) |
WO2023018637A1 (en) | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Gene editing of regulatory elements |
WO2023019226A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy |
AU2022325955A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions |
WO2023019229A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy |
WO2023019227A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions |
WO2023039444A2 (en) | 2021-09-08 | 2023-03-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy |
WO2023056329A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss |
WO2023056436A2 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of hereditary angioedema with aav gene therapy vectors and therapeutic formulations |
WO2023056399A1 (en) | 2021-10-02 | 2023-04-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel aav capsids and compositions containing same |
WO2023060113A1 (en) | 2021-10-05 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Compositions and methods for recombinant aav production |
WO2023060272A2 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery |
WO2023060269A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery |
WO2023060221A2 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of proteopathies |
WO2023060248A1 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers |
AU2022371442A1 (en) | 2021-10-21 | 2024-04-18 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hypoimmune cells |
WO2023077092A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Regenxbio Inc. | Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof |
WO2023087019A2 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for drg-specific reduction of transgene expression |
WO2023102442A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Jaguar Gene Therapy, Llc | Gene therapy methods for treatment of diabetes |
WO2023102517A1 (en) | 2021-12-02 | 2023-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of fabry disease |
WO2023111348A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Centre National De La Recherche Scientifique | Peptides and methods for use in treating pain |
TW202338086A (zh) | 2022-01-10 | 2023-10-01 | 賓州大學委員會 | 有用於治療異染性白質失養症之組成物 |
AR128239A1 (es) | 2022-01-10 | 2024-04-10 | Univ Pennsylvania | Composiciones y métodos útiles para el tratamiento de trastornos mediados por c9orf72 |
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023133593A2 (en) * | 2022-01-10 | 2023-07-13 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Aav5 capsid variants |
EP4215614A1 (en) | 2022-01-24 | 2023-07-26 | Dynacure | Combination therapy for dystrophin-related diseases |
WO2023147304A1 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver |
WO2023150647A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2023150142A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Akouos, Inc. | Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms |
TW202346599A (zh) | 2022-02-08 | 2023-12-01 | 美商航海家醫療公司 | Aav衣殼變異體及其用途 |
WO2023158836A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Sana Biotechnology, Inc. | Engineered cd47 proteins and uses thereof |
WO2023156530A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Lysogene | Gene therapy for neurodegenerative diseases |
WO2023172926A1 (en) | 2022-03-08 | 2023-09-14 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy |
WO2023172927A1 (en) | 2022-03-08 | 2023-09-14 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Precise excisions of portions of exon 44, 50, and 53 for treatment of duchenne muscular dystrophy |
WO2023173123A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells and compositions and uses thereof |
TW202346590A (zh) | 2022-03-13 | 2023-12-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 經修飾之肌肉特異性啟動子 |
WO2023178220A1 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | Regenxbio Inc. | Compositions and methods for recombinant aav production |
WO2023183623A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Regenxbio Inc. | Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy |
WO2023187728A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Gene therapy for diseases with cns manifestations |
WO2023196873A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Regenxbio Inc. | Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration |
US20230365968A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-11-16 | Genzyme Corporation | Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy |
WO2023196892A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors |
TW202345913A (zh) | 2022-04-06 | 2023-12-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物 |
TW202404651A (zh) | 2022-04-06 | 2024-02-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物 |
WO2023196893A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treating her2 positive metastatic breast cancer and other cancers |
WO2023196851A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | President And Fellows Of Harvard College | Reversing aging of the central nervous system |
WO2023201207A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus with engineered capsid |
WO2023198652A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Centre National De La Recherche Scientifique | Chemically-modified adeno-associated viruses |
US20230346977A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-11-02 | Universitat Autònoma De Barcelona | Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein |
WO2023201277A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery |
WO2023201308A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for treating an ocular disease |
WO2023205606A1 (en) | 2022-04-18 | 2023-10-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver |
WO2023215806A2 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Regenxbio Inc. | Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof |
WO2023215807A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Regenxbio Inc. | VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS |
WO2023214346A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides |
WO2023227731A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Tafalgie Therapeutics | Peptides and methods for use in treating pain |
WO2023239627A2 (en) | 2022-06-08 | 2023-12-14 | Regenxbio Inc. | Methods for recombinant aav production |
WO2023240236A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders |
WO2024006770A1 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Astellas Gene Therapies, Inc. | Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophies |
WO2024006741A1 (en) | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
WO2024007020A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Indapta Therapeutics, Inc. | Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods |
WO2024011112A1 (en) | 2022-07-06 | 2024-01-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
WO2024015881A2 (en) | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation |
WO2024020352A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing |
WO2024017990A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods and compositions for treating chronic pain disorders |
WO2024026377A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors |
CN115354049A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-11-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种基因递送***在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用 |
WO2024044725A2 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof |
WO2024042485A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Composition for use in the treatment of fabry disease |
WO2024054983A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
WO2024064863A2 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors |
WO2024064856A1 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors |
WO2024073669A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Regenxbio Inc. | Treatment of ocular diseases with recombinant viral vectors encoding anti-vegf fab |
WO2024081746A2 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | Regenxbio Inc. | Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof |
CN116622908B (zh) * | 2023-04-13 | 2024-02-06 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用 |
Family Cites Families (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8929110D0 (en) * | 1989-12-22 | 1990-02-28 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides and dna encoding therefor |
US5449616A (en) | 1990-05-23 | 1995-09-12 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein |
US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
CA2046745A1 (en) | 1991-07-10 | 1993-01-11 | Isaac Neuman | Article including a container containing at least one precious stone |
US6174666B1 (en) | 1992-03-27 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
US6204059B1 (en) | 1994-06-30 | 2001-03-20 | University Of Pittsburgh | AAV capsid vehicles for molecular transfer |
US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
US6001650A (en) * | 1995-08-03 | 1999-12-14 | Avigen, Inc. | High-efficiency wild-type-free AAV helper functions |
JPH11514853A (ja) * | 1995-09-08 | 1999-12-21 | ジエンザイム コーポレイション | 遺伝子治療のための改良されたaavベクター |
ATE264398T1 (de) * | 1995-12-01 | 2004-04-15 | Crucell Holland Bv | Regulierte expression von proteinen in stabil transformierten säugetierzellen |
US6083716A (en) | 1996-09-06 | 2000-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
US20020037867A1 (en) * | 1999-02-26 | 2002-03-28 | James M. Wilson | Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy |
EP0950111A1 (en) * | 1996-09-06 | 1999-10-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses |
EP1696036B1 (en) * | 1996-09-06 | 2010-04-21 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Use of recombinant adeno-associated virus in the manufacture of a medicament for gene therapy via muscle cells |
US5866552A (en) * | 1996-09-06 | 1999-02-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for expressing a gene in the absence of an immune response |
WO1998010088A1 (en) | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase |
AU4645697A (en) * | 1996-09-11 | 1998-04-02 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Aav4 vector and uses thereof |
ES2215222T3 (es) * | 1996-12-05 | 2004-10-01 | Crucell Holland B.V. | Modificacion genetica de celulas cepa de repoblacion hematopoyeticas de primates. |
US6039942A (en) * | 1996-12-20 | 2000-03-21 | Novo Nordick A/S | Phytase polypeptides |
US6156303A (en) | 1997-06-11 | 2000-12-05 | University Of Washington | Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom |
US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
CA2303768C (en) * | 1997-09-19 | 2009-11-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav |
WO1999015677A1 (en) | 1997-09-19 | 1999-04-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein |
EP1015619A1 (en) | 1997-09-19 | 2000-07-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses |
ES2235470T3 (es) | 1998-03-20 | 2005-07-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes. |
US6953690B1 (en) | 1998-03-20 | 2005-10-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
JP4060531B2 (ja) | 1998-05-28 | 2008-03-12 | アメリカ合衆国 | Aav5ベクターおよびその使用 |
US6210663B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-04-03 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting |
US6759237B1 (en) * | 1998-11-05 | 2004-07-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same |
JP4573437B2 (ja) * | 1998-11-05 | 2010-11-04 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス血清型1核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞 |
US6387368B1 (en) * | 1999-02-08 | 2002-05-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
JP4693244B2 (ja) * | 1999-03-18 | 2011-06-01 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法 |
WO2000075353A1 (en) | 1999-06-02 | 2000-12-14 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses |
CA2382483A1 (en) * | 1999-08-20 | 2001-03-01 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries |
US6365394B1 (en) | 1999-09-29 | 2002-04-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus |
EP1218035A2 (en) | 1999-09-29 | 2002-07-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Rapid peg-modification of viral vectors |
US6821512B1 (en) | 1999-12-03 | 2004-11-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals |
AU1796801A (en) | 1999-12-03 | 2001-06-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals |
AU4565401A (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-24 | Thomas Jefferson University | Production of chimeric capsid vectors |
US6468524B1 (en) * | 2000-03-22 | 2002-10-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | AAV4 vector and uses thereof |
US6855314B1 (en) | 2000-03-22 | 2005-02-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells |
US7056502B2 (en) * | 2000-04-28 | 2006-06-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids |
JP2004520812A (ja) * | 2000-08-30 | 2004-07-15 | ハプロゲン・エルエルシー | 対立遺伝子を決定するための方法 |
US7749492B2 (en) | 2001-01-05 | 2010-07-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | AAV vectors and methods |
US20020159978A1 (en) * | 2001-02-06 | 2002-10-31 | James Allen | Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions |
NZ532635A (en) | 2001-11-13 | 2007-05-31 | Univ Pennsylvania | A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method |
PT1453547T (pt) | 2001-12-17 | 2016-12-28 | Univ Pennsylvania | Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas |
JP4769417B2 (ja) | 2001-12-17 | 2011-09-07 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス(aav)血清型9の配列、それを含むベクターおよびその使用 |
AU2002367943A1 (en) | 2001-12-18 | 2003-12-22 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Improved reagents and methods for producing parvoviruses |
US20040002159A1 (en) * | 2002-04-05 | 2004-01-01 | Weidong Xiao | Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof |
JP3943048B2 (ja) * | 2002-04-29 | 2007-07-11 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組織の細胞dnaからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法 |
DK3235827T3 (da) | 2003-06-19 | 2021-04-19 | Genzyme Corp | Aav-virioner med reduceret immunreaktivitet og anvendelser deraf |
ES2648241T3 (es) * | 2003-09-30 | 2017-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos |
US20090054823A1 (en) | 2004-09-30 | 2009-02-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules |
ES2525067T3 (es) | 2005-04-07 | 2014-12-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de incremento de la función de un vector de AAV |
US7788045B2 (en) | 2005-09-01 | 2010-08-31 | Meditasks, Llc | Systems and method for homeostatic blood states |
ES2400235T3 (es) | 2006-04-28 | 2013-04-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de producción escalable de AAV |
JP2009102988A (ja) | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Toyota Motor Corp | 内燃機関の燃料噴射装置 |
EP2271762B1 (en) | 2008-03-14 | 2016-12-07 | Humanzyme Limited | Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems |
US20090280103A1 (en) | 2008-04-04 | 2009-11-12 | Martin Flueck | Regulation of muscle repair |
US8729041B2 (en) | 2008-12-03 | 2014-05-20 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for treating hepatic neoplasia |
DK2826860T3 (en) | 2010-04-23 | 2018-12-03 | Univ Massachusetts | CNS targeting AAV vectors and methods for their use |
DK2731470T3 (da) | 2011-07-15 | 2017-11-20 | Kaercher Gmbh & Co Kg Alfred | Rotationsbørste og fejemaskine med en rotationsbørste |
US9434928B2 (en) | 2011-11-23 | 2016-09-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides |
CA2864879C (en) | 2012-02-17 | 2021-07-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues |
JP6385920B2 (ja) | 2012-05-09 | 2018-09-05 | オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー | アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター |
US9819463B2 (en) | 2016-02-18 | 2017-11-14 | Huawei Technologies Co., Ltd. | Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system |
RS65241B1 (sr) | 2017-02-28 | 2024-03-29 | Univ Pennsylvania | Vektor adeno-asociranih virusa (aav) iz podgrupe f i njegove upotrebe |
-
2002
- 2002-11-12 NZ NZ532635A patent/NZ532635A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 BR BR122016004944A patent/BR122016004944B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 NZ NZ60012102A patent/NZ600121A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 NZ NZ578982A patent/NZ578982A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 EP EP20100178970 patent/EP2338900B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 PL PL409838A patent/PL222683B1/pl unknown
- 2002-11-12 CA CA 2406745 patent/CA2406745C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 NZ NZ61829802A patent/NZ618298A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 DE DE2002609193 patent/DE60209193T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 AT AT02257826T patent/ATE317916T1/de active
- 2002-11-12 ES ES10178940T patent/ES2439515T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 KR KR1020107001837A patent/KR101014207B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-12 ES ES02257826T patent/ES2258601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 MX MX2015000026A patent/MX346493B/es unknown
- 2002-11-12 AU AU2002361573A patent/AU2002361573B2/en not_active Expired
- 2002-11-12 CN CN201310326905.3A patent/CN103555677B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 EP EP20100178940 patent/EP2341068B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 SG SG10201506627PA patent/SG10201506627PA/en unknown
- 2002-11-12 NZ NZ591012A patent/NZ591012A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 MX MX2017003704A patent/MX359371B/es unknown
- 2002-11-12 CA CA2864537A patent/CA2864537C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 AT AT02797050T patent/ATE520707T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 CA CA2945734A patent/CA2945734C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2465868A patent/CA2465868C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA3159060A patent/CA3159060C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201310326627.1A patent/CN103555676B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201110081897.1A patent/CN102181480B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201310326869.0A patent/CN103589692B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 SG SG10201912509RA patent/SG10201912509RA/en unknown
- 2002-11-12 JP JP2003544211A patent/JP4677187B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2915124A patent/CA2915124C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 JP JP2002328852A patent/JP3958191B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 EP EP20020257826 patent/EP1310571B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 KR KR20047007245A patent/KR101015854B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-12 IL IL16182702A patent/IL161827A0/xx unknown
- 2002-11-12 EP EP02797050A patent/EP1456419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 BR BR122016004546A patent/BR122016004546B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 CA CA2756866A patent/CA2756866C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 HU HU0600229A patent/HU229379B1/hu unknown
- 2002-11-12 SG SG10202108118RA patent/SG10202108118RA/en unknown
- 2002-11-12 SG SG200904776-2A patent/SG168422A1/en unknown
- 2002-11-12 WO PCT/US2002/033629 patent/WO2003042397A2/en active Application Filing
- 2002-11-12 PL PL373864A patent/PL217623B1/pl unknown
- 2002-11-12 DK DK02257826T patent/DK1310571T3/da active
- 2002-11-12 CA CA3066428A patent/CA3066428C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 ES ES10178970T patent/ES2455126T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201310326978.2A patent/CN103555678B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 IL IL270065A patent/IL270065B2/en unknown
- 2002-11-12 PL PL397823A patent/PL220644B1/pl unknown
- 2002-11-12 CN CN201610112637.9A patent/CN105671005B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 HU HU1500180A patent/HU230406B1/hu unknown
- 2002-11-12 NZ NZ564506A patent/NZ564506A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 US US10/291,583 patent/US20030138772A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-12 BR BRPI0214119A patent/BRPI0214119B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 SG SG200603024-1A patent/SG157224A1/en unknown
- 2002-11-12 PL PL404537A patent/PL221877B1/pl unknown
-
2003
- 2003-11-11 HK HK03108160A patent/HK1056198A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-05-04 ZA ZA2004/03360A patent/ZA200403360B/en unknown
- 2004-05-06 IL IL161827A patent/IL161827A/en active IP Right Grant
- 2004-05-13 MX MXPA04004600 patent/MXPA04004600A/es active IP Right Grant
- 2004-05-26 NO NO20042183A patent/NO334379B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-25 HK HK05101633.6A patent/HK1068925A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-23 NZ NZ548094A patent/NZ548094A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-11-14 US US11/985,096 patent/US8906675B2/en active Active
-
2008
- 2008-08-18 IL IL193525A patent/IL193525A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-04-21 JP JP2009102988A patent/JP5140627B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-12-08 US US12/962,793 patent/US8524446B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-06-28 IL IL213810A patent/IL213810A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-08-23 IL IL221602A patent/IL221602A/en active IP Right Grant
- 2012-09-12 JP JP2012200500A patent/JP5669795B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2012-10-03 US US13/633,971 patent/US9790472B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-08-08 IL IL227866A patent/IL227866A/en active IP Right Grant
- 2013-10-14 NO NO20131359A patent/NO336468B1/no not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-06-13 JP JP2014122390A patent/JP5969547B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2014-06-26 IL IL233391A patent/IL233391A/en active IP Right Grant
- 2014-06-26 PH PH12014501487A patent/PH12014501487B1/en unknown
- 2014-08-11 IL IL234063A patent/IL234063A/en active IP Right Grant
- 2014-08-14 NO NO20140988A patent/NO336801B1/no not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-02-10 NO NO20150196A patent/NO338362B1/no not_active IP Right Cessation
- 2015-12-02 US US14/956,934 patent/US10041090B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-02-08 JP JP2016021585A patent/JP6212142B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2016-11-03 IL IL248724A patent/IL248724B/en active IP Right Grant
- 2016-12-22 PH PH12016502583A patent/PH12016502583A1/en unknown
-
2017
- 2017-05-02 US US15/584,674 patent/US10508286B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-06-27 US US15/633,906 patent/US10308958B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-10-13 US US15/782,980 patent/US10526617B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-04-08 IL IL25854518A patent/IL258545B/en active IP Right Grant
- 2018-09-28 US US16/145,848 patent/US10544432B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-11-13 US US16/682,712 patent/US11041171B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2019-11-21 US US16/691,227 patent/US11034976B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2019-11-27 US US16/698,412 patent/US11034977B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2021
- 2021-05-13 US US17/319,564 patent/US20210285012A1/en not_active Abandoned
- 2021-10-12 US US17/499,555 patent/US11377669B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2021-10-12 US US17/499,531 patent/US11499167B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10693918B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-06-23 | Palo Alto Networks, Inc. | Radio access technology based security in service provider networks |
US10708306B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-07-07 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
US11122435B2 (en) | 2017-06-15 | 2021-09-14 | Palo Alto Networks, Inc. | Radio access technology based security in service provider networks |
US11722532B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-08-08 | Palo Alto Networks, Inc. | Security for cellular internet of things in mobile networks based on subscriber identity and application identifier |
US11805153B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-10-31 | Palo Alto Networks, Inc. | Location based security in service provider networks |
US11838326B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-12-05 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile equipment identity and/or IoT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
US11916967B2 (en) | 2017-06-15 | 2024-02-27 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile user identity and/or sim-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU230406B1 (hu) | Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására | |
CN108137655B (zh) | 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物 | |
JP7378417B2 (ja) | 増強されたヒト膵臓トロピズムを有する新規な組換えアデノ随伴ウイルスキャプシド | |
JP5649529B2 (ja) | アデノ随伴ウイルス(aav)血清型8の配列 | |
CN109661470A (zh) | 新型aav8突变衣壳和含有其的组合物 | |
CN1856576B (zh) | 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 | |
JP5136766B2 (ja) | キメラベクター | |
ES2857773T3 (es) | Nuevas proteínas de la cápside de AAV para la transferencia de ácidos nucleicos | |
Mays et al. | Mapping the structural determinants responsible for enhanced T cell activation to the immunogenic adeno-associated virus capsid from isolate rhesus 32.33 | |
KR20210006357A (ko) | 항체-회피 바이러스 벡터 | |
KR20230029616A (ko) | 종간 호환가능한 아데노-관련 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법 | |
CN117203222A (zh) | 靶向t细胞的aav载体 | |
CN101426935A (zh) | 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法 |