ES2857773T3 - Nuevas proteínas de la cápside de AAV para la transferencia de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside, en donde la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas proteínas de la cápside de AAV para la transferencia de ácidos nucleicos

Introducción

El contenido descrito en la presente memoria se refiere a la selección in vitro e en vivo de secuencias de una biblioteca de secuencias que codifican proteínas de la cápside viral de virus adeno-asociados (AAV) recombinantes y a métodos para generar las bibliotecas. El contenido también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas de las bibliotecas y a las proteínas de la cápside de AAV codificadas por estas secuencias, y a su utilidad como proteínas de la cápside en vectores de AAV recombinantes para diversas aplicaciones de transferencia de ácidos nucleicos. El contenido se refiere a plásmidos y virus que comprenden las secuencias identificadas, que proporcionan preferiblemente una alta eficiencia de transducción y un bajo nivel de neutralización por parte del sistema inmune humano.

Antecedentes

En los últimos años se han desarrollado y ensayado en ensayos clínicos múltiples vectores de transferencia de genes recombinantes basados en diferentes tipos de virus. Los vectores de transferencia de genes basados en virus adenoasociados (AAV), es decir, los vectores de AAV se han convertido en vectores favorecidos debido a características tales como la capacidad para transducir diferentes tipos de células en división y no en división de diferentes tejidos y la capacidad para establecer una expresión transgénica estable a largo plazo. Si bien los vectores basados en otros virus, tales como los adenovirus y retrovirus, pueden poseer ciertas características deseables, el uso de otros vectores se ha asociado con toxicidad o algunas enfermedades humanas. Estos efectos secundarios no se han detectado con vectores de transferencia génica basados en AAV (Manno et al., Nature Medicine, 12(3):342 (2006)). Además, se ha desarrollado la tecnología para producir y purificar los vectores de AAV sin un esfuerzo excesivo.

Se han identificado, clonado, secuenciado y convertido en vectores al menos once serotipos de AAV, y se han aislado al menos 100 nuevas variantes de AAV de no primates, primates y seres humanos. Sin embargo, la mayoría de los datos preclínicos hasta la fecha que implican vectores de AAV se han generado con vectores basados en el serotipo AAV-2 humano, considerado el prototipo de AAV.

Los vectores de AAV-2 usados actualmente presentan varias desventajas. Por ejemplo, varios tipos de células y tejidos clínicamente relevantes no se transducen eficazmente con estos vectores. Además, un gran porcentaje de la población humana es inmune al AAV-2 debido a una exposición previa al virus AAV-2 de tipo salvaje. Se ha estimado que hasta el 96 % de los seres humanos son seropositivos para AAV-2, y hasta el 67 % de los individuos seropositivos portan anticuerpos anti-AAV-2 neutralizantes que podrían eliminar o reducir en gran medida la transducción por los vectores de AAV-2. Además, se ha informado que AAV-2 causa una respuesta inmune mediada por células en pacientes cuando se administra por vía sistémica (Manno et al., Nature Medicine, 12(3):342 (2006)).

Se han propuesto métodos para superar las limitaciones de los vectores de AAV-2. Por ejemplo, se ha propuesto mutagenizar aleatoriamente la secuencia de nucleótidos que codifica la cápside de AAV-2 mediante PCR propensa a errores como un método para generar mutantes de AAV-2 que puedan escapar de los anticuerpos neutralizantes que afectan al AAV-2 de tipo salvaje. Sin embargo, se espera que sea difícil generar variantes de AAV-2 significativamente mejoradas con mutaciones puntuales aleatorias únicas, ya que los serotipos de origen natural tienen, como máximo, solo aproximadamente un 85 % de homología en la secuencia de nucleótidos de la cápside.

También se han desarrollado métodos para usar una mezcla de construcciones de serotipos de AAV para vectores de AAV. Los vectores quiméricos resultantes poseen proteínas de la cápside de diferentes serotipos e, idealmente, tienen propiedades de los diferentes serotipos usados. Sin embargo, la relación de las diferentes proteínas de la cápside es diferente de un vector a otro y no puede controlarse o reproducirse de manera consistente (debido a la ausencia de moldes genéticos), lo cual es inaceptable para uso clínico y no es satisfactorio para uso experimental.

Un tercer enfoque para modificar la cápside de AAV-2 son las bibliotecas de inserción de péptidos, en las que se incorporan oligonucleótidos aleatorios que codifican hasta 7 aminoácidos en una localización definida dentro de la cápside de AAV-2. La presentación de estos péptidos en la superficie de la cápside de AAV-2 se puede aprovechar para volver a dirigir las partículas a células o tejidos que de otro modo serían refractarios a la infección con el virus AAV-2 de tipo salvaje. Sin embargo, debido a que el conocimiento de la estructura de la cápside atómica es un requisito previo para este tipo de modificación de AAV, este método generalmente se restringe al serotipo 2 de AAV. Además, las bibliotecas de inserción de péptidos normalmente no pueden abordar los problemas de inmunogenicidad de las partículas de AAV o la eficiencia de la transducción.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos vectores de AAV y un método para generar nuevos vectores de AAV. En particular, existe la necesidad de vectores basados en AAV que se puedan usar eficazmente con una variedad de tipos de células y tejidos, y que no reaccionen con una inmunidad humana anti-AAV preexistente que podría neutralizar o inactivar los vectores. También se necesitan vectores que transduzcan diferentes tipos de células in vivo e in vitro y que ofrecen una biodistribución más restringida o una biodistribución más promiscua, dependiendo del uso pretendido. En particular, sigue existiendo la necesidad de vectores capaces de transducir una variedad de tipos de células, tales como células madre hematopoyéticas o células madre embrionarias, además de tener propiedades deseables.

Un vector de AAV recombinante conocido como "AAV-DJ" se ha informado y descrito en la Solicitud de Patente de EE. UU. con número de serie 12/538.791, publicada como US 20100047174. EP2298926 describe secuencias de cápsides de virus adeno-asociados, tales como AAV3-3, y vectores y células huésped que contienen estas secuencias. US7749492 también describe vectores de virus adeno-asociados con proteínas de la cápside modificadas y materiales y métodos para su preparación y uso.

Los ejemplos anteriores de la técnica relacionada y las limitaciones relacionadas con la misma pretenden ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de la técnica relacionada resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la memoria descriptiva y el estudio de los dibujos.

Breve resumen

Los siguientes aspectos y realizaciones de los mismos, descritos e ilustrados a continuación, pretenden ser ejemplares e ilustrativos, no limitativos en su alcance.

En un aspecto, se proporcionan proteínas de la cápside recombinantes y métodos para generar proteínas de la cápside recombinantes. Las proteínas de la cápside incluyen regiones o dominios que se derivan de diferentes serotipos de AAV. Los serotipos de AAV pueden ser humanos o no humanos. También se proporcionan AAV recombinantes que comprenden las proteínas de la cápside y los plásmidos que codifican las proteínas de la cápside.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside, en donde la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO: 4. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una secuencia de proteína de la cápside definida por una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 99 % a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 31, secuencia que, como parte de una partícula de AAV que codifica eGFP bajo el control de un promotor hEF1, confiere a la partícula de AAV una capacidad para transducir células Huh7.5 al menos 10 veces mejor que una partícula de AAV correspondiente que comprende la cápside AAV-DJ descrita en US2010/0047174.

La proteína de la cápside puede comprender una primera secuencia de aminoácidos similar o idéntica a una secuencia de aminoácidos contigua de un primer serotipo de AAV, y una segunda secuencia de aminoácidos similar o idéntica a una secuencia de aminoácidos contigua de al menos un segundo serotipo de AAV.

La proteína de la cápside puede comprender adicionalmente una secuencia de residuos de aminoácidos similar o idéntica a una secuencia de aminoácidos contigua de un tercer serotipo de AAV.

Las secuencias de aminoácidos en la primera secuencia, en la segunda secuencia y en la tercera o secuencia adicional, pueden ser cada una una secuencia de aminoácidos contigua del primer serotipo de AAV, del segundo serotipo de AAV, del tercero y / o de serotipos de AAV adicionales. La secuencia de aminoácidos contigua puede formar un conjunto conservado de residuos de aminoácidos, teniendo el conjunto conservado al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 96 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 97 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con el serotipo de AAV de una secuencia contigua en su serotipo de AAV respectivo.

En la presente memoria se describe una proteína de la cápside codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en las SEQ ID NO: 1 -28, o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las mismas.

En una realización, la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos identificada por la SEQ ID NO: 4.

En algunas realizaciones se contempla una partícula viral que comprende una secuencia de proteína de la cápside como se ha descrito anteriormente. En la presente memoria se describe un género de partículas virales que comprenden las proteínas de la cápside codificadas por las secuencias de nucleótidos identificadas por las SEQ ID NO: 1-28 del listado de secuencias, o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con dichas secuencias.

También se describe un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en las SEQ ID NO: 1-28, o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las mismas.

También se describe un vector de AAV recombinante (AAVr), que comprende una proteína de la cápside que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en las SEQ ID NO: 1-28, o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las mismas.

Se describe un método para expresar un gen de interés en un mamífero. La presente descripción también proporciona un método de transferencia de un ácido nucleico de interés a un mamífero, que comprende introducir un vector de AAV recombinante en un mamífero, codificando el vector de AAV recombinante un gen de interés que está encapsidado en una proteína de la cápside codificada por una secuencia de nucleótidos. seleccionada del grupo de secuencias que consiste en las SEQ ID NO: 1-28, o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las mismas.

Según un aspecto adicional, se proporciona una composición para su uso en la transferencia de un gen de interés a un mamífero, que comprende un vector de AAV recombinante que codifica el gen de interés que está encapsidado en una proteína de la cápside codificada por la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria.

Según un aspecto adicional, se proporciona una composición para su uso en la transferencia de un gen de interés a un mamífero, que comprende un vector de AAV recombinante que codifica el gen de interés que está encapsidado en una proteína de la cápside que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria.

Se describe un método para generar una biblioteca de plásmidos de AAV recombinantes, comprendiendo el método: aislar secuencias de nucleótidos de la cápside de AAV de dos o más serotipos de AAV; digerir las secuencias de nucleótidos de la cápside de AAV en fragmentos; reensamblar los fragmentos usando PCR para formar productos de PCR; y clonar los productos de PCR reensamblados en plásmidos para generar una biblioteca de plásmidos de AAV recombinantes.

La presente descripción también proporciona un método para generar una biblioteca de plásmidos de AAV recombinantes, que comprende (a) aislar secuencias de nucleótidos de la cápside de AAV de dos o más serotipos de AAV; (b) digerir las secuencias de nucleótidos de la cápside de AAV en fragmentos; (c) reensamblar los fragmentos usando PCR para formar productos de PCR; y (d) clonar los productos de PCR reensamblados en un genoma viral de tipo salvaje para generar una biblioteca de vectores de AAV recombinantes (AAVr).

El método puede comprender transfectar células con los plásmidos para producir una biblioteca viral, preferiblemente una biblioteca viral de AAV. El método puede comprender además (e) infectar células in vitro con los AAVr; (f) subcultivar los AAVr seleccionados en las células in vitro en presencia de una condición astringente e identificar una cápside de AAVr que sobrevive a dicho subcultivo; y, opcionalmente, (g) repetir (b) a (f) una o más veces. El método puede comprender además (h) infectar un mamífero de laboratorio in vivo con los AAVr seleccionados; (i) subcultivar los AAVr seleccionados en un mamífero de laboratorio in vivo capaz de infectar y propagarse en dicho mamífero de laboratorio e identificar una cápside de AAVr que sobreviva a dicho subcultivo; y, opcionalmente, (j) repetir (h) e (i) una o más veces.

El adenovirus tiene una amplio rango de huéspedes, es decir, puede infectar muchas líneas celulares o células primarias humanas y de otros mamíferos, incluyendo células tanto replicativas como no replicativas. Algunas líneas celulares linfoides pueden ser más resistentes a la infección por adenovirus y, por lo tanto, pueden necesitar grandes cantidades de virus para lograr niveles de infección suficientes. Los tipos de células que pueden usarse en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no están limitadas a, células CHO, monocitos, células dendríticas (DC), DC mieloides de sangre humana recién aisladas, DC plasmocitoides y DC derivadas de monocitos, células de Langerhans y DC dérmicas, células DND-41 de leucemia de células T humanas, células cancerosas deficientes en p53, células tumorales que retienen p53 de tipo salvaje, células tumorales con estado de p53 desconocido, células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinómicas, también conocidas como "células A549", células KB humanas, células de riñón bovino de Madin Darby (MDBK), fibroblastos embrionarios de ratón (células MEF), células endoteliales de la arteria pulmonar humana (hPAEC), células NIH-3T3, células Huh-7.5, células Hep G2, células HEp-2, células HeLa, células Dempsey, células 293 de riñón embrionario humano (también conocidas como "HEK 293" o "células 293"), células de riñón de mono rhesus fetal (FRhK-4), células H4TG de hepatoma de rata, células epiteliales de hepatoma de pollo LMH, hepatocitos humanos primarios y queratinocitos humanos primarios . En algunos aspectos, el AAVr se usa para infectar células 293. En algunos aspectos, el AAVr se usa para infectar células hPAEC. En algunos aspectos, el AAVr se usa para infectar células Huh-7.5. En algunas realizaciones se usa un adenovirus auxiliar.

Los ratones FRG humanizados se pueden transfectar con una biblioteca seleccionada de AAV in vitro. Alternativamente, los ratones FRG no humanizados se pueden transfectar una biblioteca seleccionada de AAV in vitro.

El método puede incluir adicionalmente, después de la transfección, el subcultivo de la biblioteca viral en un tipo celular seleccionado en presencia de una condición astringente, y la selección de las cápsides de AAV que sobrevivan al subcultivo. El subcultivo puede ser para varios o múltiples subcultivos, por ejemplo, entre 2-5 o 2-10 subcultivos.

El método puede incluir adicionalmente, después de transfectar un modelo animal, el subcultivo de la biblioteca de AAV a través de modelos animales adicionales, para la selección posterior de aislados de AAV particulares.

Una condición astringente puede comprender la presencia de inmunoglobulina humana.

Se describe una biblioteca preparada según los métodos descritos anteriormente. La biblioteca puede estar compuesta por plásmidos de genes de la cápside de longitud completa mezclados y puede estar compuesta por partículas virales obtenidas transfectando toda o una parte de la biblioteca de plásmidos en una célula seleccionada, opcionalmente en combinación con un plásmido auxiliar adenoviral. Las nuevas proteínas de la cápside de AAV seleccionadas descritas en la presente memoria son útiles para aplicaciones ex vivo o en vivo de transferencia de genes, terapia génica y edición del genoma, por ejemplo.

También se describe una biblioteca preparada según estos métodos.

Además de los aspectos y realizaciones ejemplares descritos anteriormente, otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes por referencia a los dibujos y mediante el estudio de las siguientes descripciones.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un esquema que muestra un proceso para generar una biblioteca de AAV recombinante;

La Fig. 2 es un diagrama de flujo que resume un método para generar una biblioteca de cápsides de AAV usando la selección de la biblioteca combinada de AAV.

La Fig. 3 muestra las rondas 1 y 2 de la selección de la biblioteca combinada de AAV in vitro;

La Fig. 4 muestra las rondas 2 y 3 de la selección de la biblioteca combinada de AAV in vitro;

La Fig. 5 muestra las rondas 3 y 4 de la selección de la biblioteca combinada de AAV in vitro;

La Fig. 6 compara la proporción de clones en la biblioteca con la proporción en cada ronda de selección in vitro; La Fig. 7 compara porciones de varios serotipos de AAV y una proteína de la cápside de AAV recombinante en la biblioteca (AAV-PAEC);

Fig. 8: compara las sustituciones de aminoácidos en dos AAVr;

Fig. 9: muestra varias vistas de una estructura 3-D predicha de AAV-PAEC;

Fig. 10: ilustra un diseño experimental de un proceso usado para cribar una biblioteca combinada de AAV in vivo; Fig. 11: ilustra un experimento real usado para cribar una biblioteca combinada de AAV in vivo;

Fig. 12: muestra aislados amplificados por PCR del cribado de la biblioteca combinada de AAV in vivo;

Fig. 13: compara las proporciones de clones individuales en la biblioteca con la proporción de clones individuales en la selección de las rondas 1 y 4 de in vivo;

Fig. 14: muestra sustituciones de aminoácidos en un AAVr seleccionado (AAV-LK01);

Fig. 15: muestra varias vistas de una estructura predicha de AAV-LK01;

Fig. 16: compara residuos implicados en la unión de heparina en AAV-2 con residuos en nuevos AAVr;

Fig. 17: compara varios serotipos de AAV con varias proteínas de la cápside de AAVr aisladas usando selección in vivo; Fig. 18: muestra sustituciones de aminoácidos en un AAVr seleccionado (AAV-LK02);

Fig. 19: muestra varias vistas de una estructura predicha de AAV-LK02;

Fig. 20: muestra sustituciones de aminoácidos en un AAVr seleccionado (AAV-LK03);

Fig. 21 y 22: comparan la relación de los AAVr seleccionados con los AAV de tipo salvaje en el nivel de ADN y el nivel de aminoácidos, respectivamente;

Fig. 23A y 23B: muestran las titulaciones en hibridación sobre mancha de los AAVr en comparación con los AAV de tipo salvaje;

Fig. 24A y 24B: comparan las titulaciones de transducción de los AAVr con los AAV de tipo salvaje en células Huh7.5; Fig. 25A, 25B y 25C: comparan la eficiencia de la transducción por genoma de vector de AAV (vg) de los AAVr con los AAV de tipo salvaje en células Huh7.5;

Fig. 26: compara la eficiencia de la transducción de los AAVr con los AAV de tipo salvaje en células 293;

Fig. 27: compara la eficiencia de la transducción de los AAVr con los AAV de tipo salvaje en células NIH3T3;

Fig. 28: compara la eficiencia de la transducción de aislados de AAVr seleccionados con los AAV de tipo salvaje en células MEF;

Fig. 29: muestra las titulaciones en hibridación sobre mancha de ciertos aislados de AAVr en comparación con los AAV de tipo salvaje;

Fig. 30: ilustra los efectos neutralizantes del factor de crecimiento de hepatocitos en algunos aislados de AAV y AAVr. Fig. 31: muestra la eficiencia de la transducción de hepatocitos humanos primarios por aislados de AAV de tipo salvaje y AAVr seleccionados;

Fig. 32: compara los niveles de expresión del factor IX humano recombinante (FIX) en ratones C57/BL6 inmunocompetentes a los que se inyectan varios AAV que expresan FIX;

Fig. 33: compara la capacidad de aislados de AAVr seleccionados y de AAV de tipo salvaje para evitar la neutralización por inmunoglobulina humana (IVIG);

Fig. 34: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células 293; Fig. 35: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células Huh 7.5; Fig. 36: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células PAEC; Fig. 37: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en queratinocitos humanos primarios;

Fig.38: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células DND-41; Fig. 39: compara la eficiencia de la transducción de aislados de AAVr particulares con los AAV de tipo salvaje en células DND-41;

Fig. 40: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células 3T3; Fig.41: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células HeLa; Fig. 42: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células MEF; Fig.43: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células H4TG; Fig. 44: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células LMH; Fig.45: compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células FRhK-4; Fig. 46: compara la transducción de varias líneas celulares por varios serotipos de AAV de tipo salvaje y recombinante; Fig. 47: muestra la relación de los AAV de tipo salvaje con los aislados de AAVr obtenidos por selección en células PAEC humanas a nivel de ADN y nivel de aminoácidos; y

Fig. 48: muestra la titulación y la eficiencia de la transducción de los aislados de AAVr obtenidos por selección en células PAEC humanas en comparación con los AAV de tipo salvaje.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC.

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK01.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK02.

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK03.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK04.

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK05.

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK06.

La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK07.

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK08.

La SEQ ID NO: 10 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK09.

La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK10.

La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK11.

La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK12.

La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK13.

La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK14.

La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK15.

La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK16.

La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK17.

La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK18.

La SEQ ID NO: 20 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -LK19.

La SEQ ID NO: 21 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC2.

La SEQ ID NO: 22 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC4.

La SEQ ID NO: 23 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC6.

La SEQ ID NO: 24 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC7.

La SEQ ID NO: 25 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC8.

La SEQ ID NO: 26 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC11.

La SEQ ID NO: 27 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC12.

La SEQ ID NO: 28 es una secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de la cápside de AAV recombinante, denominada en la presente memoria AAV -PAEC13.

La SEQ ID NO: 29 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 2 (AAV-LK01).

La SEQ ID NO: 30 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 3 (AAV-LK02).

La SEQ ID NO: 31 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 4 (AAV-LK03).

La SEQ ID NO: 32 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 5 (AAV-LK04).

La SEQ ID NO: 33 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 6 (AAV-LK05).

La SEQ ID NO: 34 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 7 (AAV-LK06).

La SEQ ID NO: 35 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 8 (AAV-LK07).

La SEQ ID NO: 36 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 9 (AAV-LK08).

La SEQ ID NO: 37 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 10 (AAV-LK09)

La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 11 (AAV-LK10)

La SEQ ID NO: 39 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 12 (AAV-LK11)

La SEQ ID NO: 40 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 13 (AAV-LK12)

La SEQ ID NO: 41 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 14 (AAV-LK13)

La SEQ ID NO: 42 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 15 (AAV-LK14)

La SEQ ID NO: 43 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 16 (AAV-LK15)

La SEQ ID NO: 44 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 17 (AAV-LK16)

La SEQ ID NO: 45 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 18 (AAV-LK17)

La SEQ ID NO: 46 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 19 (AAV-LK18)

La SEQ ID NO: 47 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 20 (AAV-LK19)

La SEQ ID NO: 48 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 1 (PAEC).

La SEQ ID NO: 49 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 28 (PAEC-13).

La SEQ ID NO: 50 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 25 (PAEC-8).

La SEQ ID NO: 51 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 27 (PAEC-12).

La SEQ ID NO: 52 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 23 (PAEC-6).

La SEQ ID NO: 53 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 24 (PAEC-7).

La SEQ ID NO: 54 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 26 (PAEC-11).

La SEQ ID NO: 55 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 22 (PAEC-4).

La SEQ ID NO: 56 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 21 (PAEC-2).

Debe entenderse que cada una de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria puede traducirse para predecir una secuencia de aminoácidos que representa una proteína de la cápside de AAVr.

Descripción detallada

Varios aspectos de la presente descripción se describen con detalle a continuación en la presente memoria. Estos aspectos pueden tomar muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitados a los aspectos expuestos explícitamente en la presente memoria. Más bien, estos aspectos se proporcionan para que esta descripción sea minuciosa y completa, y transmita completamente el alcance de la presente descripción a los expertos en la técnica. I. Definiciones

Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que también se describe específicamente cada valor interviniente, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a no ser que el contexto indique claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese rango. Cada rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor interviniente en un rango establecido y cualquier otro valor establecido o interviniente en ese rango establecido está englobado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el rango, y cada rango en el que ninguno o ambos límites están incluidos en los rangos más pequeños también está englobado dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los rangos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

Debe observarse que, tal y como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a no ser que el contexto indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye más de una proteína y la referencia a "un compuesto" incluye más de un compuesto. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.

Un polinucleótido se compone típicamente de una secuencia específica de cuatro bases de nucleótidos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); y timina (T) (uracilo (U) por timina (T) cuando el polinucleótido es ARN). A menos que se defina específicamente, los nucleótidos abreviados pueden ser ribonucleósidos o 2'-desoxirribonucleósidos. Los nucleósidos pueden especificarse como ribonucleósidos o 2'-desoxirribonucleósidos de forma individual o agregada. Cuando se especifica sobre una base individual, la abreviatura de una letra está precedida por una "d" o una "r", donde "d" indica que el nucleósido es un 2'-desoxirribonucleósido y "r" indica que el nucleósido es un ribonucleósido. Por ejemplo, "dA" designa 2'-desoxirriboadenosina y "rA" designa riboadenosina. Cuando se especifica sobre una base agregada, el ácido nucleico o polinucleótido particular se identifica como una molécula de ARN o una molécula de ADN. Los nucleótidos se abrevian añadiendo una "p" para representar cada fosfato, así como si los fosfatos están unidos a la posición 3' o a la posición 5' del azúcar. Por lo tanto, los nucleótidos 5' se abrevian como "pN" y los nucleótidos 3' se abrevian como "Np", donde "N" representa A, G, C, T o U. Cuando las secuencias de ácido nucleico se presentan como una cadena de abreviaturas de una letra, las secuencias se presentan en la dirección 5 '^ 3' de acuerdo con la convención común, y los fosfatos no están indicados. Por tanto, el término secuencia de polinucleótidos es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética puede introducirse en bases de datos en un ordenador que tenga una unidad central de procesamiento y usarse para aplicaciones bioinformáticas tales como genómica funcional y búsqueda de homología.

Una molécula de "polinucleótido aislado" es una molécula de ácido nucleico separada y discreta del organismo completo con el que se encuentra la molécula en la naturaleza; o una molécula de ácido nucleico desprovista, total o parcialmente, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas asociadas con ella.

También se conocen en la técnica técnicas para determinar la "identidad de secuencia" de ácidos nucleicos y aminoácidos. Típicamente, dichas técnicas incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótidos o aminoácidos) determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. El porcentaje de identidad también puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencias usando el programa informático avanzado BLAST, incluyendo la versión 2.2.9, disponible en los Institutos Nacionales de Salud. El programa BLAST se basa en el método de alineamiento de Karlin y Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) y como se discute en Altschul et al., J. Mol. Biol.

215: 403-410 (1990); Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993); y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997). Brevemente, el programa BLAST define la identidad como el número de símbolos alineados idénticos (es decir, nucleótidos o aminoácidos), dividido por el número total de símbolos en la secuencia más corta de las dos. El programa se puede usar para determinar el porcentaje de identidad sobre la longitud completa de las proteínas que se comparan. Se proporcionan parámetros por defecto para optimizar las búsquedas con secuencias de búsqueda cortas , por ejemplo, en blastp con el programa. El programa también permite el uso de un filtro SEG para enmascarar los segmentos de las secuencias de búsqueda según lo determinado por el programa SEG de Wootton y Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993). Los rangos de grados deseados de identidad de secuencia son aproximadamente del 80 % al 100 % y valores enteros entre ellos. Típicamente, las identidades porcentuales entre una secuencia descrita y una secuencia reivindicada son al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 %.

Alternativamente, el grado de similitud de secuencia entre polinucleótidos puede determinarse mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena única y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN o de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente un 80-85 %, preferiblemente un 85-90 %, más preferiblemente un 90-95 % y lo más preferiblemente un 98-100 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia sobre una longitud definida de las moléculas, como se determina usando los métodos anteriores. Tal y como se usa en la presente memoria, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o polipéptido especificada. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones astringentes, como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del conocimiento de la técnica.

En células huésped de mamíferos, se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, una secuencia codificante puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse luego en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar péptidos en huéspedes infectados. (p. ej., véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Alternativamente, se puede usar el promotor de vaccinia 7.5 K, (véase, p. ej., Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et a l, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931).

En la presente descripción, se proporciona una biblioteca de vectores de AAV recombinantes. Mientras que los AAV de tipo salvaje (en los que se basa la biblioteca) pueden replicarse en las células, los aislados seleccionados in vitro e in vivo de la presente descripción son no replicables y no infecciosos. En otras palabras, los virus en la biblioteca contienen solo los genes Rep y Cap de los virus de tipo salvaje y no contienen ninguna otra secuencia informadora tal como GFP. Después de la selección del virus de interés según los métodos establecidos en la presente memoria, los genes Cap recombinantes de los nuevos aislados se clonan en plásmidos para expresar las proteínas Cap recombinantes y empaquetar y producir vectores no replicantes y no infecciosos (un proceso también conocido como "vectorización").

II. Cápside quimérica de AAV

En la presente memoria se describen proteínas de la cápside con regiones o dominios o aminoácidos individuales que se derivan de dos o más serotipos diferentes de AAV. Una proteína de la cápside puede tener una primera región que se deriva de o que tiene altos niveles de similitud o identidad de secuencia con un primer serotipo de AAV o proteína de la cápside de AAV recombinante conocida (p. ej., AAV-DJ), una segunda región derivada de manera similar o que tiene niveles altos de similitud o identidad de secuencia con un segundo serotipo de AAV o proteína de la cápside de AAV recombinante conocida, así como regiones tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava, etc. derivadas de o que tienen altos niveles de similitud o identidad de secuencia con otro serotipo de AAV o proteína de la cápside de AAV recombinante conocida. Los serotipos de AAV pueden ser serotipos de AAV humanos o serotipos de AAV no humanos, tales como serotipos de AAV bovinos, aviares y caprinos. En particular, pueden usarse los serotipos de AAV de mamíferos no primates, tales como las secuencias de AAV de roedores (p. ej., de ratones, ratas, conejos y hámsteres) y carnívoros (p. ej., de perros, gatos y mapaches). Mediante la inclusión de aminoácidos individuales o regiones de múltiples serotipos de AAV en una proteína de la cápside, se pueden obtener proteínas de la cápside que tienen múltiples propiedades deseadas que se derivan por separado de los múltiples serotipos de AAV.

Se describe una proteína de la cápside, denominada en la presente memoria "AAV-DJ", que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una primera región que se deriva de un primer serotipo de AAV (AAV-2), una segunda región que se deriva de un segundo serotipo de a Av (AAV-8) y una tercera región que se deriva de un tercer serotipo de AAV (AAV-9). La proteína de la cápside AAV-DJ se identificó a partir de una biblioteca de proteínas de la cápside, usando un método que se describe a continuación, así como en la Solicitud de Patente de EE. UU. con número de serie 12/538.791, publicada como Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20100047174. Se apreciará que la proteína AAV-DJ es simplemente un ejemplo de las proteínas de la cápside beneficiosas que se pueden obtener a partir de una biblioteca generada según las enseñanzas de la presente memoria, donde las proteínas de la cápside beneficiosas tienen preferiblemente múltiples propiedades deseadas que se derivan de múltiples serotipos de AAV.

AAV-DJ tiene cuatro faltas de concordancia con los dos epítopos de células T en AAV-2 que se han identificado recientemente como implicados en una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) anti-AAV en seres humanos. Por tanto, los vectores de AAV recombinantes que incluyen la proteína de la cápside AAV-DJ o un derivado de la misma son probablemente menos inmunogénicos en los seres humanos que los vectores de AAV-2 que incluyen la cápside de AAV-2.

Se realizaron estudios para confirmar que se pueden formar partículas virales infecciosas con AAV-DJ como cápside. En un primer estudio, la secuencia de nucleótidos de AAV-DJ se insertó en un plásmido auxiliar de AAV que también expresa el gen rep de AAV-2. Después, se cotransfectaron células de riñón 293 con el plásmido auxiliar de AAV y un plásmido auxiliar adenoviral, así como un plásmido de vector que expresa gfp. A modo de comparación, se usaron dos versiones diferentes de un auxiliar de AAV-2 (denominado AAV-2 "antiguo" y AAV-2 "nuevo") que difieren en los niveles de expresión de proteínas virales. T res días después de la cotransfección, la transferencia Western (con 303.9 (Rep) y B1 (proteína de la cápside)) de los extractos de células 293 reveló la presencia de proteínas Rep y de la cápside a niveles comparables a los encontrados en las células cotransfectadas con plásmidos que expresan las proteínas de la cápside de AAV-2, AAV-8 o AAV-9.

En otro estudio, se comparó la infectividad de las partículas y la capacidad de evitar la neutralización por la inmunoglobulina humana (IVIG) del clon AAV-DJ con los tipos salvajes AAV-2, AAV-8 y AAV-9. Se usaron dos versiones diferentes de un auxiliar de AAV-2 (denominado AAV-2 antiguo y AAV-2 nuevo) que difieren en los niveles de expresión de proteínas virales. Los AAV recombinantes con las cápsides AAV-DJ, a AV-2, AAV-8 o AAV-9 se produjeron mediante la triple transfección de células con un plásmido que codifica gfp flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, un plásmido que codifica genes auxiliares adenovirales y un plásmido que codifica el gen Rep de AAV-2 y la proteína de la cápside AAV-DJ, AAV-2, AAV-8 o AAV-9, y lisando después las células por congelación-descongelación. A continuación, cada lisado que contenía virus se neutralizó usando una dosis alta (volumen 1:1) de dos lotes diferentes de inmunoglobulina humana (IVIG1 e IVIG2) (células 293); (células Huh-7)), o tres dosis menores decrecientes (1:2 (alta), 1:10 (media) y 1:25 (baja) de antisuero/virus) de los dos lotes diferentes de inmunoglobulina humana (IVIG1 e IVIG2), o un anticuerpo monoclonal A20 (células 293), o un suero policlonal anti-AAV-8 ("A8"). El A20 es un anticuerpo monoclonal que se generó contra las cápsides de AAV-2 ensambladas y el anti-AAV-8 es un suero de conejo policlonal generado contra las cápsides de AAV-8 ensambladas. Se usaron como control lisados tratados con PBS. Los lisados que contienen virus se neutralizaron incubando los lisados con la inmunoglobulina humana o el anticuerpo durante un período de tiempo (una hora a temperatura ambiente (20-25 °C)) e infectando después las células en presencia de adenovirus auxiliar. La actividad restante de los virus después del período de neutralización se determinó titulando las unidades de expresión de gfp en las células.

En ausencia de IVIG1, IVIG2 y A20, el virus AAV-DJ fue al menos tan infeccioso en las células 293 como el AAV-2 y varias veces más infeccioso que el AAV-2 en las células Huh-7. Se demostró que el virus AAV-DJ y AAV-8 pudieron escapar parcialmente de la neutralización por IVIG, mientras que AAV-2 no. El AAV-9 tuvo resultados de IVIG intermedios en relación con AAV-DJ/AAV-8 y AAV-2, y se neutralizó con dosis altas de IVIG. El AAV-2 fue neutralizado por el anticuerpo A20, pero el anticuerpo A20 no afectó significativamente a AAV-DJ, AAV-8 o AAV-9. El antisuero policlonal anti-AAV-8 neutralizó las cuatro cápsides en dosis altas o medias, mientras que AAV-2 y AAV-DJ escaparon parcialmente de la neutralización con la dosis baja.

En resumen, se descubrió anteriormente que el virus AAV-DJ era más infeccioso para las células Huh-7 que el AAV más eficiente conocido anteriormente en las células Huh-7 (AAV-2), incluso en presencia de altas concentraciones de inmunoglobulina humana. Además, se encontró que el virus AAV-DJ tiene una resistencia mejorada a la neutralización por inmunoglobulina humana en relación con AAV-2. Dicha resistencia es razonable, dado que la cápside de AAV-DJ se seleccionó de una biblioteca basándose parcialmente en su capacidad para producir virus que resistan la neutralización por inmunoglobulina humana. Sin embargo, la resistencia mejorada del virus AAV-DJ al anticuerpo A20 fue sorprendente e inesperada, porque (i) no era parte del esquema de selección descrito a continuación que se usó para aislar AAV-DJ; y (ii) AAV-DJ comparte una identidad sustancial con AAV-2, que es neutralizado por el anticuerpo A20.

En otro estudio más usando células de melanoma humano, la infectividad in vitro de vectores que expresan gfp del gen de la cápside de AAV-DJ se comparó con la infectividad in vitro de ocho AAV de tipo salvaje de uso común, AAV-1, AAV-2, a Av -3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-8 o AAV-9. Las células de melanoma se infectaron con 2 x 109 partículas de AAV recombinantes de cada serotipo y la expresión de gfp se visualizó tres días después. Los resultados se cuantificaron, expresados como la expresión de gfp en UI/ml, a partir de la titulación del virus en las células de melanoma (en placas de 96 pocillos) y el vector AAV-DJ fue superior a los vectores de tipo salvaje y, notablemente, sustancialmente mejor que AAV-2.

Varias líneas celulares se infectaron con diluciones seriadas de diez veces de cada serotipo, o AAV-DJ o el mutante de heparina DJ DJ/8, discutido a continuación, que expresan un gen informador gfp. Las preparaciones de vector se normalizaron para contener 2x109 partículas totales (que contienen ADN del vector) por mL antes de la infección. Tres días después, se contaron las células que expresaban gfp y se determinaron las titulaciones infecciosas, teniendo en cuenta el factor de dilución. Los vectores de AAV-DJ mostraron la mayor infectividad en muchas líneas celulares, y las relaciones de partículas totales a infecciosas estuvieron frecuentemente muy por debajo de 500, destacando la eficiencia extrema de AAV-DJ in vitro, y sugiriendo su particular utilidad para las aplicaciones de transferencia génica ex vivo.

También se ensayaron vectores preparados con la cápside AAV-DJ in vivo para la expresión de un gen de interés. En un primer estudio, se produjeron los AAV que expresan el factor IX humano recombinante (FIX) con las cápsides AAV-DJ, AAV-2, AAV-8 o AAV-9 mediante una técnica de transfección triple. Se inyectaron periféricamente dosis de 5 x 1010, 2 x 1011 y 1 x 1012 (bajo, medio y alto, respectivamente) partículas virales recombinantes en ratones inmunocompetentes (C57/BL6) y se monitorizó el hFIX plasmático hasta cuatro meses después de la inyección. Los niveles plasmáticos de la proteína FIX se cuantificaron mediante ELISA.

Los niveles de FIX superiores al 1 % se consideran terapéuticos en hemofílicos. Los vectores de AAV-8, -9 o -DJ superaron el nivel del 100 % ya en la dosis más baja. Se observó una expresión dependiente de la dosis de la cápside de AAV-DJ a niveles equivalentes a AAV-8 y -9, los dos AAV identificados de forma natural informados en el hígado. Los tres virus superaron fácilmente al prototipo de AAV-2 en cualquier dosis y expresaron más del 100 % de los niveles normales de hFIX a partir de una inyección intravenosa de 5 x 1010 partículas, mientras que la expresión de AAV-2 superó el 100 % de los niveles normales de hFIX solo a una dosis de 1 x 1012.

En otro estudio, se prepararon AAV que expresan alfa-1-antitripsina humana recombinante (hAAT), a partir de las cápsides de AAV-DJ, a Av -2, AAV-8 o AAV-9. El gen hAAT estaba bajo un promotor RSV. Se inyectaron a los ratones (C57/BL6) mediante infusiones en la vena de la cola de 2 x 1011 partículas y los niveles plasmáticos de hAAT se determinaron mediante ELISA específico 3, 7 y 14 días después de la inyección. AAV-8, AAV-9 y AAV-DJ se expresaron de manera eficiente e igualmente superaron al vector con una cápside de AAV-2.

En otro estudio in vivo, se cuantificó la transducción hepática en presencia de suero humano, para evaluar la capacidad de AAV-DJ para evadir la neutralización in vivo. Los ratones se inmunizaron pasivamente con 4 o 20 mg de IVIG antes de la infusión de AAV-2, -8, -9 o -DJ que expresaban hFIX. Los niveles plasmáticos de hFIX para cada serotipo de AAV se expresaron como porcentaje del nivel de virus correspondiente en ratones de control tratados con disolución salina tamponada con fosfato en lugar de IVIG en función del tiempo después de la infusión. La expresión de AAV-2 se suprimió por completo, sin embargo, la transducción con AAV-DJ, -8 o -9 se inhibió de una manera dependiente de la dosis, con AAV-DJ mostrando una resistencia intermedia en la dosis alta y evasión eficiente (similar a AAV-8 y AAV-9) a la dosis baja de IVIG. Estos resultados se confirmaron con un segundo lote de IVIG independiente de otro proveedor (Carimune 12 %, Behring AG, datos no mostrados).

En otro estudio, se evaluó la viabilidad de administrar repetidamente los diferentes virus a ratones, para evaluar la neutralización cruzada de la cápside. No se observó expresión génica tras la reinfusión de cualquiera de las cápsides en animales ya tratados con el mismo serotipo. Sin embargo, AAV-8 y -9 también se bloquearon eficientemente entre sí, lo que corrobora los datos previos (Gao, G. et al., J. Viro!., 78: 6381-6388 (2004)). Este resultado podría oponerse al uso de vectores basados en estos tipos salvajes en los protocolos de readministración, aunque podrían combinarse con AAV-2. Por el contrario, la infusión primaria de AAV-DJ permitió la expresión posterior (hasta un 18 %) de AAV-2, -8 o -9, probablemente debido al hecho de que AAV-DJ solo comparte un número limitado de epítopos con cada virus de tipo salvaje. En el experimento inverso, los vectores de AAV-DJ se inhibieron en animales inmunizados con AAV-8 o -9, mientras que proporcionaban una expresión detectable en ratones tratados con AAV-2. Esto implicaba una respuesta inmune más fuerte o más amplia a partir de la infusión primaria de los serotipos 8 o 9. AAV-DJ fue más resistente a los correspondientes sueros de ratón en cultivo. Se observó una menor reactividad cruzada entre AAV-8 y -9.

AAV-DJ, así como otras cápsides de proteínas recombinantes identificadas en la biblioteca discutida a continuación, retuvo un dominio de unión a heparina (HBD) del AAV-2 parental. Este dominio funciona en la unión al proteoglicano del sulfato de heparina del receptor primario de AAV-2 (Summerford, C. et al., J. Viro!., 72: 1438-1445 (1998)). Para investigar el papel del HBD de AAV-DJ, dos residuos de arginina cruciales (Kern, A. et al., J. Viro!., 77: 11072-11081 (2003)) se mutaron a los residuos respectivos en AAV-8 o -9, y se denominan en la presente memoria AAV-DJ/8 y AAV-DJ/9. La expresión de gfp se redujo en varios órdenes de magnitud y fue tan baja como la observada con los serotipos AAV-8 o AAV-9.

Se demostró que la caída de la infectividad se correlacionaba con una unión reducida a las células. Una titulación de las partículas infecciosas en células de riñón 293 ilustró el papel del HBD para la infección en cultivo, como se ve por la reducción de la infectividad en los mutantes de HBD AAV-DJ/8 y AAV-DJ/9. Se prepararon y ensayaron mutantes adicionales, y se identifican en la presente memoria como AAV-2/8 (HBD negativo), AAV-8/2 (HBD positivo) y AAV-9/2 (HBD positivo). Los ensayos de unión celular confirmaron el papel del HBD en la unión a las células cultivadas, donde la caída en la unión con los mutantes se correlacionó con los datos de transducción. Los mutantes de AAV-8 y AAV-9 positivos para HBD se unieron varias veces más eficientemente que AAV-2 en células HeLa, pero se transdujeron menos eficientemente. Por tanto, la unión a las células por sí sola no puede explicar la infectividad inusual de AAV-DJ. En su lugar, se contempla un efecto sinérgico de compartir propiedades beneficiosas de los AAV-DJ parentales, lo que da como resultado la mejora de múltiples etapas en la transducción de AAV-DJ. También se mostró que el HBD influye en la biodistribución, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Transducción relativa de tejidos no hepáticos con vectores de AAV

Pulmón Corazón Riñón Bazo Cerebro Páncreas Intestino Músculo

1e12 nd 0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,2 ± 0,0 nd nd nd nd AAV-2

7e12 nd 1,5 ± ,03 2,0 ± 0,3 1,0 ± 0,2 nd nd nd nd 1e12 0,5 ± 0,0 1,2 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,3 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,7 ± 0,1 AAV-8

7e12 2,5 ± 0,3 2,5 ± 0,2 2,6 ± 0,3 1,5 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,9 ± 0,2 1e12 0,7 ± 0,1 1,3 ± 0,2 1,1 ± 0,2 0,4 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,8 ± 0,1 AAV-9

7e12 2,6 ± 0,3 3,6 ± 0,4 3,8 ± 0,4 1,5 ± 0,2 1,8 ± 0,2 1,3 ± 0,2 1,9 ± 0,2 3,0 ± 0,3 1e12 0,2 ± 0,0 1,3 ± 0,2 0,8 ± 0,2 0,5 ± 0,1 nd 0,1 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0 AAV-DJ

7e12 0,6± 0,1 2,3 ± 0,2 2,1 ± 0,2 1,5 ± 0,2 0,4± 0,0 0,5 ± 0,0 0,5 ± 0,0 0,8 ± 0,1

AAV-DJ 1e12 0,6 ± 0,0 1,3 ± 0,2 0,8 ± 0,2 0,2 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,7 ± 0,1 /8 7e12 2,6 ± 0,3 2,5 ± 0,3 2,3 ± 0,3 1,6 ± 0,3 1,8 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,2 2,0 ± 0,2

El número de copias de los vectores (por equivalente genómico diploide) se determinó mediante análisis de barrido de Phosphoimager de transferencias Southern. Se analizaron al menos tres ratones independientes por dosis. Los números de copias se muestran en porcentaje (redondeados a un decimal, más desviaciones estándar) en relación con los del hígado dentro de cada grupo, lo que permite la comparación entre vectores y dosis. Para AAV-2, la mayoría de las señales estaban por debajo del límite de detección de los análisis de transferencia Southern (~ 0,03 copias de ADN de AAV bicatenario por célula), lo que evita el cálculo de la transducción relativa en estos casos (nd = no determinado). Las sombras grises resaltan las dosis/tejidos en los que la transducción relativa de AAV-DJ difiere en al menos 2 veces de los serotipos 8 y 9, así como del muíante AAV-DJ de HBD.

AAV-8 y -9 (negativos para HBD) demostraron un tropismo no restringido, transduciendo fácilmente todos los tejidos ensayados a 1 x 1012 partículas por ratón. En contraste llamativo, AAV-2 e igualmente AAV-DJ (ambos positivos para HBD) estaban restringidos al hígado y, en menor grado, al corazón, riñón y bazo, y cerca o por debajo del límite de detección en otros tejidos. La cuantificación del ADN del vector bicatenario (usando el hígado como estándar interno en cada grupo) mostró que AAV-DJ transducía pulmón, cerebro, páncreas e intestino de 2 a 4 veces menos eficientemente que los tipos salvajes 8 o 9. El efecto del HBD en el tropismo viral se ejemplificó mejor comparando AAV-DJ con el mutante DJ/8: la deleción de HBD alivió la restricción hepática y expandió la transducción a tejidos no hepáticos, idénticos a AAV-8 y -9, e incluyendo el cerebro. Estos hallazgos corroboran y explican una serie de informes sobre la amplia diseminación tisular de vectores basados en serotipos naturales negativos para HBD (AAV-1 y -4 a -9) en ratones, perros y monos, en contraste con el AAV-2 positivo para HBD. Notablemente, AAV-DJ también transdujo tejidos no hepáticos a la dosis máxima de 7 x 1012 partículas, pero aún en menor grado que los virus negativos para h Bd , en particular AAV-9. Incluso con esta dosis, la transducción del cerebro y también del pulmón permaneció marginal.

Si bien los aspectos descritos anteriormente se refieren principalmente a una proteína de la cápside de AAVr, se reconoce que se pueden usar y contemplar cápsides que tienen secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos que son similares en secuencia y que tienen la misma función. En un aspecto, se contempla una proteína de la cápside recombinante que tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia, además al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 95 % de identidad, al menos aproximadamente un 96 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 97 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos identificadas en el listado de secuencias.

Se apreciará que las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden estar en la secuencia polipeptídica, para lograr proteínas que tengan, por ejemplo, un 60 %, 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, y preferiblemente con retención de la actividad de la secuencia nativa. Las sustituciones conservativas de aminoácidos, como se conocen en la técnica y como se hace referencia en la presente memoria, implican la sustitución de aminoácidos en una proteína con aminoácidos que tienen cadenas laterales similares en términos de, por ejemplo, estructura, tamaño y/o propiedades químicas. Por ejemplo, los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos pueden intercambiarse con otros aminoácidos del mismo grupo: aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, que incluyen glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; aminoácidos que tienen cadenas laterales no aromáticas que contienen hidroxilo, tales como serina y treonina; aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida, que incluyen glutamina y asparagina; aminoácidos básicos, que incluyen lisina, arginina e histidina; aminoácidos que tienen cadenas laterales de anillos aromáticos, que incluyen fenilalanina, tirosina y triptófano; y aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre, que incluyen cisteína y metionina. Además, los aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico, se consideran en la presente memoria intercambiables con aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida, tales como asparagina y glutamina.

Se ha desarrollado un sistema modelo de ratón que es severamente inmunodeficiente. Estos ratones con deficiencia de fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah) se pueden pretratar con un adenovirus que exprese uroquinasa y luego injertar en gran medida (hasta un 90 %) con hepatocitos humanos de múltiples fuentes, incluyendo biopsias de hígado. Además, las células humanas se pueden trasplantar en serie de donantes primarios y repoblar el hígado durante al menos cuatro rondas secuenciales. Las células expandidas mostraron el típico metabolismo de los fármacos en seres humanos. Este sistema proporciona una plataforma sólida para producir hepatocitos humanos de alta calidad para el cultivo de tejidos. También puede ser útil para ensayar la toxicidad de los metabolitos de fármacos y para evaluar patógenos que dependen de las células hepáticas humanas para su replicación. (Azuma, et al., (2007) Nature Biotech. 25: 903-910).

Se ha diseñado un modelo de ratón humanizado, conocido como ratones FRG (Yecuris Corporation, Portland, OR), para permitir que los investigadores crezcan y expandan poblaciones de hepatocitos humanos in vivo para investigación y ensayo de fármacos. El modelo FRG tiene los genes Fah, Rag e ilrg inactivados. La inactivación de Fah produce daño hepático en el ratón, la ausencia de Rag elimina la parte del sistema inmune innato que rechaza otras células de ratón y la inactivación de Ilrg inactiva la parte del sistema inmune que evitaría el injerto de células de otras especies, incluyendo los seres humanos. Por tanto, el ratón FRG puede repoblarse con células de donante humano de elección o repoblarse a partir de un grupo de donantes precalificados. Los animales pueden recibir hepatocitos humanos que oscilan entre el 5-95 % de la masa total del hígado. Los ratones FRG no repoblados también están disponibles para su uso como controles de estudio.

La proteína de la cápside de AAV recombinante puede estar compuesta por una primera secuencia de residuos de aminoácidos de un primer serotipo de AAV y al menos una segunda secuencia de residuos de aminoácidos de un segundo serotipo de AAV. La primera secuencia es un conjunto conservado de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos contigua del primer serotipo de AAV. La segunda secuencia es un conjunto conservado de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos contigua del segundo serotipo de AAV. Un "conjunto conservado" de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos contigua que es idéntica o muy homologa a una secuencia de aminoácidos en el serotipo de AAV. En una realización, la homología cercana significa al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia. En una realización, la homología cercana significa al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia. Una secuencia de aminoácidos contigua en dicho grupo conservado puede tener una longitud de 2 a 500, 2 a 400, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100 o 2 a 50 residuos de aminoácidos.

También se apreciará que los vectores recombinantes descritos en la presente memoria se contemplan para su uso en métodos para expresar un gen de interés en una variedad de células y en un mamífero. La transducción en líneas celulares además de las líneas celulares descritas en la presente memoria son ejemplares, y se contemplan otras líneas celulares, particularmente células madre. En términos del uso in vivo, el método comprende preferiblemente introducir un AAV recombinante (AAVr) en un mamífero, el vector de AAV recombinante que codifica el gen de interés y comprende una proteína de la cápside que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias identificadas en el listado de secuencias que acompaña a la presente descripción. El vector que expresa un gen de interés se introduce en el mamífero, típicamente mediante inyección, por vía intravenosa, subcutánea, parenteral o similar. El gen de interés puede ser cualquier gen, y un experto en la técnica identifica fácilmente muchos genes adecuados para la expresión con fines terapéuticos o no terapéuticos. La secuencia de nucleótidos del gen de interés está típicamente "unida operativamente" a una o más de otras secuencias de nucleótidos, que incluyen, pero no están limitadas a, el gen de una proteína de la cápside seleccionada, un promotor y potenciador, y similares.

Un gen está "unido operativamente" a otra secuencia de nucleótidos cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, si una secuencia codificante está unida operativamente a una secuencia promotora, esto generalmente significa que el promotor puede promover la transcripción de la secuencia codificante. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son típicamente contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, dado que los potenciadores pueden funcionar cuando están separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden tener una longitud variable, algunas secuencias de nucleótidos pueden estar unidas operativamente pero no ser contiguas. Además, como se define en la presente memoria, se pretende que una secuencia de nucleótidos se refiera a una matriz lineal y secuencial natural o sintética de nucleótidos y/o nucleósidos, y derivados de los mismos. Los términos "que codifica" y "codifica" se refieren al proceso mediante el cual una secuencia de nucleótidos, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, proporciona la información a una célula a partir de la cual una serie de aminoácidos se puede ensamblar en una secuencia de aminoácidos específica para producir un polipéptido.

III. Generación de una biblioteca de nuevas cápsides de AAV

Se describe un método para generar una biblioteca de nuevas cápsides de AAV. También se describe un método para aislar un plásmido de AAV recombinante que incluye una nueva cápside de AAV.

La presente descripción proporciona un método para generar una biblioteca de nuevas cápsides de AAVr, que incluye las figuras y el listado de secuencias. Los ácidos nucleicos aislados que codifican genes de la cápside se obtienen usando cebadores diseñados para incluir una parte específica de serotipo fusionada con regiones distintivas comunes que flanquean la secuencia de ácido nucleico de la cápside. Después, los ácidos nucleicos aislados se digieren o fragmentan, tal como con DNAsel, en fragmentos de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1,0 kb. A continuación, los fragmentos se vuelven a ensamblar en piezas más grandes mediante la realización de PCR, como con la polimerasa Taq, en ausencia de cebadores adicionales. Debido a la naturaleza relacionada de los genes fragmentados, los fragmentos de genes tienen regiones superpuestas de homología que permiten que los fragmentos se autoceben en ausencia de un cebador adicional. Después de múltiples rondas de PCR, se obtienen productos que tienen una longitud aproximadamente igual a la de los genes de la cápside original. Los productos de PCR incluyen productos híbridos que contienen nuevas regiones de la cápside de AAVr.

Los productos de PCR de longitud completa se amplifican entonces por PCR, con polimerasa Platino Pfx u otra polimerasa, usando cebadores que se unen a las regiones distintivas que están contenidas en los productos de PCR de longitud completa porque estaban presentes en los cebadores originales usados para aislar las secuencias de ácido nucleico de la cápside. Los productos de PCR de esta etapa de amplificación se clonan entonces en un plásmido convencional, para proporcionar una biblioteca de nuevos genes de cápside de AAV. Los genes de la cápside se pueden clonar en un plásmido de AAV que contiene una ITR de rep, para crear posteriormente la biblioteca viral real.

Un método para aislar un AAV recombinante que incluye una nueva cápside de AAV recombinante, es decir, se aísla una "cápside de AAVr" como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de la cápside híbrida se clonan en un plásmido que es capaz de producir un genoma de AAV infeccioso, tal como un plásmido que comprende el gen rep de AAV-2, así como las dos ITR de AAV-2. La biblioteca de plásmidos se puede transfectar en células con un plásmido auxiliar adenoviral para producir virus. A continuación, el virus se amplifica en células en presencia de un virus auxiliar, como el virus auxiliar adenovirus-5 de tipo salvaje. El virus puede amplificarse en presencia de una o más formas de presión selectiva, tal como en presencia de inmunoglobulina humana. Los virus que sobreviven a múltiples subcultivos bajo presión selectiva se eligen para su posterior estudio o uso.

Este enfoque se usó para generar una biblioteca para la selección in vitro en células hPAEC. Brevemente, el gen de la cápside de diez serotipos diferentes de AAV (AAV-1, AAV-2, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-8, a Av -9, AAV aviar y AAV bovino ) se fragmentó y los productos de PCR se clonaron romos en el plásmido pCR4-TOPO, disponible en Invitrogen. Se secuenciaron veinticuatro (24) subclones para confirmar que se crearon secuencias de cápside que son un híbrido de diferentes serotipos. Las secuencias de los diez serotipos estaban representadas en los subclones. Típicamente, las secuencias de la cápside híbrida incluían secuencias de al menos dos, y con frecuencia, más de seis, de los serotipos. Las secuencias de la cápside en el plásmido pCR4-TOPO se subclonaron entonces en un plásmido que comprendía el gen rep de AAV-2, así como las dos ITR de AAV-2, que se usó entonces para transformar bacterias. Se estima que se obtuvo aproximadamente una biblioteca de 3 x 104 variantes de genes de la cápside híbridos de AAV a partir de una sola reacción y de 10 placas de bacterias. El aumento de escala (incluyendo la siembra en placas en 100 placas de bacterias) dio como resultado una biblioteca de plásmidos de aproximadamente 6,9 x 105 clones. Esta biblioteca de plásmidos se cotransfectó a continuación en células de riñón embrionario humano 293 junto con un plásmido auxiliar adenoviral, para producir una biblioteca viral de partículas híbridas de AAV.

Se incubaron diversas cantidades de AAV mezclado purificado con células PAEC en un rango de MOl (multiplicidad de infección), y posteriormente se infectaron con el virus auxiliar necesario para la replicación del AAV (en este caso, adenovirus humano de tipo salvaje). Idealmente, el adenovirus lisaría las células en tres días, proporcionando al AAV tiempo suficiente para replicarse y que el virus Ad recién sintetizado se liberara en el medio. El medio se recogió 3 días después de la infección y se usó directamente para el análisis por transferencia Western usando anticuerpos específicos para las proteínas CAP de AAV VP1, VP2 y VP3. Con el fin de evitar el empaquetamiento cruzado (un fenómeno específico de los AAV estrechamente relacionados), se seleccionó la muestra con el nivel más bajo, pero detectable, de proteínas VP sobre la base de la transferencia Western, para la siguiente ronda de selección. Esto ayudó a optimizar la astringencia de la biblioteca en cada ronda de amplificación, al garantizar que se administrara un único genoma viral a cada célula y, posteriormente, se empaquetara en la cápside expresada a partir de su propio genoma. Antes de la siguiente ronda de selección, el sobrenadante se calentó a 65 °C durante 30 minutos, para inactivar el virus Ad más sensible a la temperatura sin afectar los AAV presentes en la muestra.

La biblioteca seleccionada de variantes de la cápside de AAV se coinfectó entonces con el virus auxiliar adenovirus-5 de tipo salvaje y se amplificó con éxito en varias líneas celulares posibles conocidas en la técnica. La amplificación exitosa de la biblioteca viral se confirmó mediante transferencias Western de extractos de células completas usando el anticuerpo B1 que reconoce un epítopo de ocho aminoácidos que se conserva en gran medida en la mayoría de los serotipos de AAV conocidos y, por lo tanto, debería estar presente en la mayoría de los AAV híbridos descritos en la presente memoria. Se detectaron partículas replicantes de AAV en todas las líneas celulares ensayadas durante hasta cinco subcultivos consecutivos. Se usaron extractos de células completas de congelación-descongelación para infectar células frescas cada vez. Hasta la fecha, la biblioteca viral también se ha subcultivado con éxito seis veces en hepatocitos humanos primarios, que son notoriamente difíciles de infectar con vectores basados en AAV de tipo salvaje.

La biblioteca viral también se amplificó en células Huh-7 humanas en presencia de inmunoglobulina humana (IVIG). Se encontró que la IVIG específica usada (IVIG Gamimune®N 10 % de Bayer) contenía abundantes anticuerpos neutralizantes frente a AAV-2 y AAV-3, así como algunos anticuerpos frente a AAV-1, AAV-4, AAV-5 y AAV-6. Por lo tanto, la amplificación en células Huh-7 humanas en presencia de IVIG proporcionó una presión selectiva para los híbridos de AAV que comprenden dominios de diferentes serotipos, ya que la selección para una infección de alta eficiencia de las células Huh-7 favorece los dominios de AAV-2, mientras que la selección para escapar de la neutralización por IVIG favorece los dominios de AAV-8 y AAV-9. La selección fue exitosa, ya que se encontró que con subcultivos crecientes de la biblioteca, se conseguía una tolerancia creciente a IVIG. Después del cuarto subcultivo, el virus superviviente pudo amplificarse en presencia de 500 pL de IVIG, mientras que después del primer subcultivo, el virus superviviente sólo pudo amplificarse en presencia de aproximadamente 10 pL de IVIG.

Después del 5° subcultivo, las secuencias de la cápside híbrida se amplificaron por PCR y se clonaron romos en pCR4-TOPO. Se secuenciaron las secuencias de la cápside de 96 colonias y se encontró que eran idénticas. La secuencia de la cápside híbrida es la secuencia de AAV-DJ descrita anteriormente.

Por lo tanto, se creó una biblioteca de plásmidos usando el mezclado de familias de ADN (Crameri et al., Nature, 391: 288-291 (1998)) de los genes de la cápside de AAV parental. Posteriormente, se generó una biblioteca viral, mediante la transfección de la biblioteca de plásmidos en células junto con un plásmido auxiliar adenoviral. Esta segunda biblioteca viral se sometió entonces a presión de selección para aislar candidatos específicos. A partir de ellos, se aislaron y subclonaron genes de la cápside mezclados seleccionados en un plásmido auxiliar de AAV, para producir vectores de AAV recombinantes que comprenden la cápside híbrida. Más particularmente, se usó el mezclado de familias de ADN para crear una biblioteca compleja de partículas híbridas de diez tipos salvajes diferentes. La amplificación en serie en células humanas enriqueció híbridos de una multitud de serotipos de AAV. Se descubrió que la quimera AAV-2-8-9 a la que se hace referencia como AAV-DJ es superior a los AAV naturales en células cultivadas y superó al prototipo de AAV-2 en tejido in vivo. Los vectores con una cápside de AAV-DJ fueron superiores in vitro y proporcionaron un rendimiento sólido y específico in vivo y proporcionaron la capacidad de evadir la neutralización humoral por el suero humano. Además, se encontró que varios aislados de las bibliotecas de AAV seleccionados in vitro e in vivo generadas según los métodos descritos en la presente memoria superan a la cápside de AAV-DJ descrita anteriormente.

Después de varias rondas de selección, se observó un solo clon. Este nuevo aislado de AAV se denominó "AAV-PAEC". Posteriormente, se aislaron AAV-PAEC adicionales, y en la presente memoria se identifican los aislados de AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12 y AAV-PAEC13 .

También se cribó la biblioteca de AAV in vivo en ratones FRG humanizados. Se inyectaron a los animales diferentes cantidades de biblioteca de AAV, seguido de una inyección de una cantidad fija de virus Ad5 de tipo salvaje. Después de tres días, los animales se sacrificaron y sus hígados se extrajeron, homogeneizaron y congelaron en partes alícuotas. Se usó una parte alícuota de cada animal para el análisis por transferencia Western usando el anticuerpo anti-VP1-2-3 CAP para la detección. Una vez que se identificó al animal con la señal más baja, pero detectable, se procesó otra parte alícuota congelada del hígado de ese animal y se inyectó lisado de hígado aclarado en diferentes cantidades en otro grupo de animales. Como en el experimento in vitro descrito en el Ejemplo 1, con el fin de inactivar el hAd5 presente en el lisado, el lisado de hígado se incubó a 65 °C durante 30 minutos, antes de la inyección en otra cohorte de animales.

Con cada ronda de selección, se secuenciaron 100-150 clones. El ADN de AAV se aisló del lisado de hígado y se usó para secuenciar los genes CAP presentes en el conjunto. Se descubrió que la biblioteca era muy variable en las etapas tempranas de selección in vivo, mientras que en las últimas rondas de selección, se produjo claramente una selección positiva para ciertos clones de AAV en la biblioteca de AAV.

Se identificaron y secuenciaron varios AAVr nuevos con alta eficiencia. También son valiosos los nuevos serotipos específicos de AAVr seleccionados in vitro en células endoteliales arteriales pulmonares humanas.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos son de naturaleza ilustrativa y de ninguna manera pretenden ser limitantes. Para los procedimientos técnicos, se puede hacer referencia a la Solicitud de Patente de EE. UU. con número de serie 12/538.791, publicada como US 20100047174, así como a Grimm, D. et al., (Blood, 102: 2412-2419 (2003)).

Ejemplo 1

Generación de bibliotecas de cápsides de AAV

A. Plásmidos para la generación de bibliotecas de cápsides de AAV

Se obtuvieron plásmidos que contenían genes de cápside (cap) de longitud completa de diez serotipos diferentes de AAV de tipo salvaje (wt), a saber, AAV-1, -2, -3B, -4, -5, -6, -8, -9, AAV aviar y bovino y AAV de cabra, que se sintetizó parcialmente (GeneArt, Regensburg, Alemania) como un fragmento de 888 nt (nt 1023 a 1910). Este subclon abarca toda la mitad derecha de la proteína de la cápside de AAV de cabra, que comprende las 42 diferencias reportadas entre AAV de cabra y AAV-5. Estos genes cap se amplificaron inicialmente mediante PCR y se subclonaron en pBlueScript II SK (Stratagene). (Véase la Figura 1). El propósito era flanquear todos los genes cap con sitios para las enzimas de restricción únicas Pac I (5') o Asc I (3'), para facilitar la clonación posterior de genes cap "mezclados" en un plásmido de AAV de tipo salvaje. Todos los cebadores también contenían un sitio Hind III (5') o Spe I (3'), para permitir la clonación dirigida en pBlueScript (ninguna de las cuatro enzimas de restricción corta en ningún gen cap parental). Se insertó una región de firma de 20 nt entre los dos sitios de restricción en cada cebador, para proporcionar sitios de unión del cebador conservados para la posterior amplificación por PCR de genes mezclados.

En paralelo, se preparó por ingeniería un plásmido receptor de cap de tipo salvaje para contener los elementos de empaquetamiento (ITR) de AAV-2 que flanquean el gen rep de AAV-2 (que codifica proteínas de replicación de AAV), junto con los sitios Pac I y Asc I para la clonación de cap, y el sitio de poliadenilación de AAV-2. Por lo tanto, el rep de AAV-2 (nt 191 a 2189) se amplificó por PCR usando cebadores que contenían sitios Bgl II y luego se subclonó en pTRUF3 (que portaba las ITR de AAV-2 con sitios Bgl II adyacentes).

B. Mezclado de familias de ADN de genes de la cápside de AAV

Para el mezclado de ADN de los genes de la cápside de AAV, se usó un protocolo de 2 etapas en el que los genes parentales se fragmentaron primero con la enzima ADNasa I y luego se reensamblaron en nuevos genes de longitud completa mediante PCR sin cebador. Esto fue seguido por una segunda PCR que incluía cebadores que se unían fuera de los genes cap, lo que permitió su subclonación en el plásmido ITR/rep receptor de tipo salvaje para empaquetarlo en una biblioteca de AAV. Inicialmente, todos los genes cap se aislaron de los subclones mediante digestión con Hind III/Spe I (Eco RI para AAV de cabra) y luego se optimizaron las condiciones de reacción como sigue. Se ensayaron varias concentraciones de ADNasa I y tiempos de incubación, con el objetivo de obtener un conjunto de fragmentos con un tamaño de entre 0,2 y 1,0 kb . Las condiciones óptimas encontradas fueron: 1 pg por gen cap, 1 pL de ADNasa I prediluida 1:200 (10 U/pL, Roche), Tris Cl 50 mM pH 7,4, MgCl² 1 mM, volumen total de 50 pL. La reacción se incubó durante 2 min a temperatura ambiente y luego se detuvo mediante inactivación por calor a 80 °C durante 10 min. Se aislaron fragmentos de los tamaños deseados ejecutando toda la reacción en un gel de agarosa al 1 % (volumen final total ~60 pl). La reacción de PCR de reensamblaje se optimizó entonces ensayando varias ADN polimerasas (Pfx Platinum, Stratagene; DeepVent, NEB; Taq, Amersham) y las condiciones respectivas. Los mejores resultados se obtuvieron usando Lechos de PCR PuReTaq Ready-To-Go (Amersham) y las siguientes condiciones: 25 pL de fragmentos de cap purificados, programa: 4 min 95 °C, 40 ciclos (1 min 95 °C, 1 min 50 °C, 3 min 72 °C), 10 min 72 °C, 10 min 4 °C. El análisis en gel de agarosa (1 %) de 1 pL de esta reacción mostró típicamente una mancha de hasta 5 kb y sin bandas distintas. A continuación, se evaluaron las mismas tres polimerasas anteriores para la segunda PCR que contiene el cebador, y se encontró que las siguientes condiciones eran óptimas: 1 pL de Pfx Platinum, 2 pL de producto de la primera PCR, MgSO4 1 mM, 1 pg de cada cebador (véase más abajo) , 0,3 mM cada dNTP, volumen total 50 pL, programa: 5 min 94 °C, 40 ciclos (30 seg 94 °C, 1 min 55 °C, 3 minutos 68 °C), 10 min 68 °C, 10 min 4 °C. Los cebadores usados se unieron a las regiones de firma de 20 nt descritas en el capítulo anterior. Esta reacción proporcionó una banda de cap de longitud completa de ~2,2 kb distinta (gel de agarosa al 1 %), que se purificó (60 pL en total) y se clonó (4 pL) usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (con células TOP10 electrocompetentes) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Esta etapa de clonación intermedia mejoró significativamente el rendimiento de genes cap mezclados, en comparación con los esfuerzos para clonar directamente el producto de PCR por medios convencionales (datos no mostrados). A continuación, los genes cap mezclados se liberaron del plásmido TOPO mediante una doble digestión con Pac I y Asc I y se clonaron en el plásmido receptor ITR/rep digerido de forma apropiada. Realizando estas reacciones en condiciones mínimas (volúmenes y cantidades), se obtuvo una biblioteca de aproximadamente 3 x 104 colonias bacterianas. El aumento de escala de cada etapa (incluido la siembra el placas final en placas de 100 x 15 cm) dio como resultado una biblioteca final de ~6,9 x 105 clones de plásmido. Su integridad, diversidad genética y funcionalidad se confirmaron por secuenciación de ADN y estudios de expresión a pequeña escala. A partir de estos últimos, se determinó por extrapolación que la biblioteca viral (a continuación) retuvo >90 % de viabilidad.

C. Amplificación selectiva in vitro de la biblioteca de cápsides

Diseño experimental:

Se incubaron diversas cantidades de AAV mezclado purificado con diferentes líneas celulares (en placas de 6 cm), junto con cantidades variables de adenovirus auxiliar tipo 5. Idealmente, el adenovirus lisaría las células en tres días, proporcionando al AAV tiempo suficiente para replicarse. Las cantidades de AAV se ajustaron para obtener señales mínimas en los análisis de transferencia Western de extractos celulares. Esto ayudó a optimizar la astringencia de la biblioteca en cada ronda de amplificación, al garantizar que se administrara un único genoma viral a cada célula y, posteriormente, se empaquetara en la cápside expresada a partir de su propio genoma.

En el presente estudio, las células de interés (células PAEC) se infectaron con una biblioteca de AAV en un rango de MOl (multiplicidad de infección) y posteriormente se infectaron con el virus auxiliar necesario para la replicación de AAV (en este caso, adenovirus humano de tipo salvaje). La replicación de AAV depende de la replicación del virus Ad. El virus Ad conduce a la lisis celular y a la liberación de virus Ad recién sintetizado en el medio. Este proceso libera también virus AAV recién sintetizados. El medio se recogió 3 días después de la infección y se usó directamente para el análisis de transferencia Western usando anticuerpos específicos para las proteínas CAP de AAV VP1, VP2 y VP3. Con el fin de evitar el empaquetamiento cruzado (un fenómeno específico de los AAV estrechamente relacionados), se seleccionó la muestra con el nivel más bajo, pero detectable, de proteínas VP sobre la base de la transferencia Western para la siguiente ronda de selección. Antes de la siguiente ronda de selección, el sobrenadante se calentó a 65 °C durante 30 minutos, para inactivar el virus Ad más sensible a la temperatura sin afectar los AAV presentes en la muestra.

D. Análisis de proteínas de AAV

Los análisis de transferencia Western e inmunofluorescencia se llevaron a cabo como se ha reportado (Grimm, D. et al., Blood, 102: 2412-2419 (2003)) usando el anticuerpo monoclonal B1 para la detección de proteínas de la cápside de AAV inmovilizadas, útil porque su epítopo de ocho aminoácidos está conservado en gran medida en los serotipos de AAV conocidos.

En la Figura 3 se muestran las transferencias Western de la Ronda-1 y la Ronda-2 de la selección de la biblioteca de AAV en células PAEC humanas. En el cribado se usaron dos bibliotecas de AAV, llamadas "Biblioteca 1" o "Lib1" y "Biblioteca 2/3" o "Lib2/3". La Biblioteca 1 tuvo una titulación significativamente más baja que la Biblioteca 2/3. En la Fig. 3, los números sobre cada carril indican la cantidad en microlitros [pI] de cada biblioteca usados por 500 pI de infección total, y "+ Ad" y "- Ad" indican (-)Grupos de control de biblioteca tratados (+ ) o no tratados (-) con Ad, respectivamente. Las muestras seleccionadas para las siguientes rondas de selección de la biblioteca de AAV se indican mediante cuadros, así como en negrita y subrayado.

De manera similar, la Figura 4 muestra las transferencias Western de la Ronda-2 y la Ronda-3 de la selección de la biblioteca de AAV. Se puede ver que la señal específica en las muestras de la Biblioteca 2/3 es débil, mientras que la señal específica en las muestras de la Biblioteca 1 es fuerte. La Figura 5 muestra los datos de la Ronda-3 y la Ronda-4 final de la selección de la biblioteca AAV en células hPAEC.

En cada ronda de selección, el sobrenadante recogido se usó para aislar el ADN de AAV para el análisis por secuenciación de los genes CAP presentes en el conjunto. Se secuenciaron de veinticinco a treinta clones aleatorios en cada ronda, incluyendo la Biblioteca 1 inicial. Los resultados se muestran en la Figura 6, que indica el porcentaje del conjunto que representa cada clon diferente, en cada ronda de selección. Como puede verse en la Fig. 6, los veinticinco clones secuenciados de la Biblioteca 1 eran diferentes, mientras que con cada ronda de selección se puede observar la acumulación específica de un solo clon. Después de la Ronda-4, los treinta clones secuenciados tenían una secuencia idéntica. Este nuevo aislado de AAV se denominó "AAV-PAEC".

Las Figuras 7 y 8 muestran la relación del AAV-PAEC con los serotipos de AAV de tipo salvaje. La Figura 7 ilustra que el AAV-PAEC está más estrechamente relacionado con AAV1 y AAV6, con la mayor parte de la región 5' del gen CAP (o región N de la proteína) derivada de AAV-3B. AAV1 y AAV6 son muy similares entre sí a nivel de aminoácidos y, por lo tanto (como se ilustra en la Fig. 8), es posible considerar AAV-PAEC como si se derivara de AAV-3B y AAV1, o de AAV-3B y AAV6; en cada caso, tres aminoácidos difieren en AAV-PAEC en comparación con AAV1 o AAV6.

La Figura 9 muestra una estructura 3D predicha de AAV-PAEC (basada en la estructura resuelta de parte de la proteína VP3 de AAV2), asumiendo que AAV-PAEC está compuesto por secuencias de AAV3B y AAV6 (véase la Figura 8). Las 3 mutaciones en las posiciones 418, 531 y 584 están sombreadas en gris.

Ejemplo 2

Estudios in vivo

La biblioteca de AAV generada según el ejemplo anterior y cribada para seleccionar nuevos aislados de AAV in vitro en células endoteliales de la arteria pulmonar humana (hPAEC) se cribó entonces in vivo en ratones FRG humanizados, según los métodos descritos a continuación.

Diseño experimental de la selección de bibliotecas de AAV in vivo

Similar al esquema de selección de AAV in vitro descrito en el Ejemplo 1, la biblioteca combinada de AAV se cribó en ratones FRG. Como se muestra en la Figura 10, a los animales se les inyectaron diferentes cantidades de biblioteca de AAV, seguido de la inyección de una cantidad fija de virus Ad5 de tipo salvaje. Después de tres días, los animales se sacrificaron y sus hígados se extrajeron, homogeneizaron y congelaron en partes alícuotas. Se usó una parte alícuota de cada animal para el análisis por transferencia Western usando el anticuerpo anti-VP1-2-3 CAP para la detección. Una vez que se identificó al animal con la señal más baja, pero detectable, se procesó otra parte alícuota congelada de hígado de ese animal y se inyectó lisado de hígado aclarado en diferentes cantidades en otro grupo de animales. Como en el experimento in vitro descrito en el Ejemplo 1, con el fin de inactivar el hAd5 presente en el lisado, el lisado de hígado se incubó a 65 °C durante 30 minutos antes de la inyección en otra cohorte de animales.

El diseño experimental que se muestra en la Figura 10 se modificó para que en cada ronda de selección se usaran uno o dos animales FRG humanizados (Figura 11). Los lisados de hígado de cada animal en la selección de AAV in vivo se analizaron mediante PCR específica de CAP. Como puede verse en la Figura 12, la banda específica de CAP (~2,2 kb) estaba presente en todos los animales FRG humanizados usados en el estudio, y la intensidad de la señal es fuerte en todas las muestras. En los animales FRG de control no humanizados, la señal específica de CAP se pierde después de 3 rondas de selección, lo que indica que no se observó una amplificación específica de AAV en esos animales (esto era de esperar, ya que el virus Ad5 humano requerido para la replicación de AAV no infecta/replica en células de ratón, sino solo en células humanas, apoyando así la replicación de AAV solo en hepatocitos humanos presentes en animales FRG humanizados). Este control muestra además que en animales FRG humanizados la selección de AAV tuvo lugar en hepatocitos humanos pero no en células de ratón.

Con cada ronda de selección, el ADN de AAV se aisló del lisado de hígado y se usó para secuenciar los genes CAP presentes en el conjunto. La Figura 13 compara los datos para (1) la biblioteca de AAV inyectada en el primer animal, (2) el lisado obtenido del primer animal y (3) el lisado del cuarto animal. En cada ronda, se secuenciaron 100-150 clones. La mayoría de los clones secuenciados de la biblioteca y de Ratón-1 eran diferentes entre sí, mostrando una alta variabilidad de la biblioteca en las primeras etapas de la selección in vivo (se identificó un número tan grande de clones diferentes en la biblioteca y en Ratón-1 que se representan como una barra negra sólida en la representación gráfica que se muestra aquí). En Ratón-4, sin embargo, más del 24 % de los clones secuenciados tenían una secuencia idéntica, mostrando una selección positiva para ciertos clones de AAV presentes en la biblioteca de AAV.

Después de la selección in vivo de serotipos de AAVr en hepatocitos humanos en un ratón con un hígado humanizado, se identificaron y secuenciaron varios AAVr nuevos con alta eficiencia. También son valiosos los nuevos serotipos específicos de AAVr seleccionados in vitro en células endoteliales arteriales pulmonares humanas (tales como, por ejemplo, pero sin limitarse a, los aislados de AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12 y AAV-PAEC13) .

La Figura 14 ilustra una reconstrucción de la relación genealógica entre uno de los aislados in vivo, AAV-LK01 y los AAV de tipo salvaje usados para generar la biblioteca (tal como se muestra en la Figura 1). AAV-LK01 está más estrechamente relacionado con AAV8. La parte inferior de la Fig. 14 representa gráficamente el origen predicho de diversas regiones del nuevo aislado basándose en la identidad de ciertos residuos de aminoácidos en estas regiones que corresponden a residuos dentro de los AAV de tipo salvaje.

La Figura 15 muestra una estructura 3-D predicha de AAV-LK01 (basada en la estructura resuelta de parte de la proteína VP3 de AAV2). Las mutaciones puntuales indicadas en la Figura 14 están sombreadas en gris en el modelo 3D.

Con el fin de predecir mejor las características de los nuevos aislados de AAV seleccionados in vivo y para obtener información sobre el receptor usado por dichos aislados para unirse a/entrar en las células, comparamos sus secuencias con las de AAV-2 de tipo salvaje, observando específicamente los aminoácidos responsables de la unión de heparina. Los residuos implicados en la unión de heparina en AAV2 se compararon con residuos en los nuevos aislados AAV-PAEC y AAV-LK01. Las fuentes de AAV de los aminoácidos en los nuevos AAV en las posiciones indicadas se proporcionan entre paréntesis en la Figura 16. La región completa del AAV-LK1 donde se encuentran esos residuos se derivó de AAV8, y por lo tanto, se puede predecir que AAV-LK01 se parecerá mucho a AAV8 cuando se trata de la elección de un receptor. AAV-PAEC, por otro lado, difería significativamente de AAV2, y cada uno de los residuos podría haberse derivado de varios otros AAV, con AAV1 y AAV6 contribuyendo a cada uno de los 6 residuos implicados en la unión de heparina. Por tanto, podría predecirse que AAV-PAEC usará el mismo receptor o un receptor similar que AAV1 y/o AAV6.

La Figura 17 muestra una reconstrucción de la relación genealógica entre los tres primeros aislados seleccionados in vivo, AAV-LK01, AAV-LK02 y AAV-LK03 y los AAV de tipo salvaje usados para generar la biblioteca. Se encontró que AAV-LK01 estaba más estrechamente relacionado con Aa V8, a Av -LK02 con AAV1 y AAV6, y AAV-LK03 con AAv 3b .

La Figura 18 representa gráficamente la secuencia de AAV-LK02 y la identidad de los residuos de aminoácidos correspondientes en el nuevo aislado en comparación con los diversos AAV de tipo salvaje. AAV-LK02 parece derivar principalmente de AAV1 (o AAV6, - debido a un % de homología muy alto entre AAV y AAV6), con la excepción de una región hipervariable de 50 aminoácidos (aa) entre los aminoácidos no. 450-500. La tabla muestra cada una de las mutaciones en la región de 50 aa en la columna de la izquierda, e indica el AAV de tipo salvaje parental posible del que se derivó este residuo en la columna de la derecha. Varias mutaciones no se pueden rastrear hasta ninguno de los AAV parentales, y muy probablemente fueron causadas por mutaciones aleatorias durante la PCR usada para generar la biblioteca, o se introdujeron durante la replicación viral y, por lo tanto, son el resultado de un proceso de evolución viral natural.

La Figura 19 muestra una estructura 3-D predicha de AAV-LK02 (basada en la estructura resuelta de parte de la proteína VP3 de AAV2). Las mutaciones puntuales identificadas en la Figura 18 están sombreadas en gris en este modelo 3-D.

La Figura 20 representa gráficamente la secuencia de AAV-LK03 y la identidad de los residuos de aminoácidos correspondientes en el nuevo aislado en comparación con los diversos AAV de tipo salvaje. AAV-LK03 parece derivarse principalmente de AAV3B con la excepción de una región hipervariable en el 5" del gen y una mutación puntual única en el extremo 3' del gen. La tabla muestra cada una de las mutaciones en el lado izquierdo columna, e indica el posible AAV de tipo salvaje parental del que se derivó este residuo. Varias mutaciones no se pueden rastrear hasta ninguno de los AAV parentales, y muy probablemente fueron causadas por mutaciones aleatorias durante la PCR usada para generar la biblioteca, o se introdujeron durante la replicación viral y, por tanto, son el resultado del proceso de evolución viral natural.

La Figura 21 presenta una reconstrucción de la relación genealógica (a nivel de ADN) entre los AAV identificados durante la selección de la biblioteca in vivo, y los AAV de tipo salvaje usados para generar la biblioteca.

La Figura 22 presenta una reconstrucción de la relación genealógica (a nivel de aminoácidos) entre los AAV identificados durante la selección de la biblioteca in vivo, y los AAV de tipo salvaje usados para generar la biblioteca.

Las Figuras 23A y 23B muestran una comparación de los nuevos aislados (de la selección en células PAEC, así como de la selección in vivo), que fueron vectorizados (es decir, empaquetados en vectores recombinantes no infecciosos, no replicantes) y estudiados más a fondo en una comparación paralela. Cada aislado de AAV y los diez AAV de tipo salvaje usados para generar bibliotecas se produjeron en tres producciones independientes a pequeña escala (n = 3) y la titulación de cada vector se determinó extrayendo el ADN del vector y cuantificándolo mediante hibridación sobre mancha usando una cantidad conocida. de ADN como estándar. Se determinaron las titulaciones por hibridación sobre mancha para los aislados, así como para los AAV de tipo salvaje. La Figura 23B presenta estos datos en forma gráfica.

Como se muestra en la Figura 24A, los aislados de AAV vectorizados y los AAV de tipo salvaje preparados en las tres producciones independientes a pequeña escala se usaron para transducir células Huh7.5 y se determinaron las titulaciones de la transducción. Los vectores expresaban eGFP bajo un promotor hEF1. La titulación de la transducción se calculó usando la siguiente fórmula: (% GFP/100)*factor de dilución*numero de células. La Figura 24B presenta una representación gráfica de las titulaciones de la transducción en células Huh7.5. A partir de los datos, se puede ver que AAV-DJ es significativamente mejor en la transducción de células Huh7.5 que cualquiera de los AAV de tipo salvaje. De los nuevos aislados, se encontró que AAV-LK03 transduce células Huh7.5 al menos 10 veces mejor que AAV-DJ, y casi dos logs mejor que cualquiera de los AAV de tipo salvaje. AAV-PAEC también es significativamente mejor en la transducción de células Huh7.5 que cualquiera de los AAV de tipo salvaje.

La titulación por hibridación sobre mancha es una titulación física que no depende del tipo de célula, sino que representa el número de partículas de AAV intactas que contienen el genoma de AAV en la preparación del vector. Usando la titulación por hibridación sobre mancha y el número de pi de cada preparación usados para transducir las células, se puede calcular la eficiencia de la transducción por número de genomas virales usados para la transducción (titulación de la transducción/vg). Con el fin de comparar mejor la eficiencia de la transducción de los nuevos aislados de AAV en células Huh7.5, se normalizó la eficiencia de la transducción con respecto a las titulaciones de vector obtenidas a partir de una hibridación sobre mancha. Los resultados se presentan en la Figura 25A. Los resultados también se pueden representar normalizando uno de los vectores a un valor de 1 (asignando un valor de 1 al vector con la transducción/vg más baja). Los resultados representados de esta manera se muestran en la Figura 25B. La Fig.

25B es una representación gráfica de la transducción/vg en células Huh7.5 normalizadas con respecto al vector con la transducción/vg más baja (en este caso AAV-LK04). Así presentado, el gráfico de la Fig. 25B muestra las veces de incremento en la transducción/vg en comparación con AAV-LK04 al que se le asignó el valor 1. La Figura 25C es una representación gráfica de la transducción/vg para los aislados de AAV y los AAV de tipo salvaje, sin normalizar el aislado más débil. A partir de estos datos, se puede ver que AAV-LK03 es 30 veces mejor para transducir células Huh7.5 que AAV-DJ.

La Figura 26 es una representación gráfica de la transducción/vg para diversos aislados de AAV y los AAV de tipo salvaje en células 293 (los datos se muestran sin normalizar con respecto al aislado más débil). Estos datos muestran que AAV-LK06 es 30 veces mejor para transducir células Huh7.5 que AAV-DJ.

La Figura 27 es una representación gráfica de la transducción/vg para aislados de AAV y los AAV de tipo salvaje en células NIH3T3 (los datos se muestran sin normalizar con respecto al aislado más débil). Estos datos muestran claramente que AAV-DJ y AAV-PAEC son los vectores más eficientes para transducir células NIH3T3.

La Figura 28 es una representación gráfica de la transducción/vg para aislados de AAV seleccionados y los AAV de tipo salvaje en células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (los datos se muestran sin normalizar con respecto al aislado más débil). Estos datos muestran claramente que AAV-DJ es el vector más eficiente para transducir células MEF. Los resultados de otra titulación por hibridación sobre mancha de varios aislados de AAVr en comparación con los AAV de tipo salvaje se presentan en la Figura 29.

En la Figura 30 se ilustran los efectos neutralizantes del factor de crecimiento de hepatocitos en algunos AAV y aislados de rAAV.

La Figura 31 muestra la eficiencia de la transducción de hepatocitos humanos primarios por aislados de AAV de tipo salvaje y AAVr seleccionados.

La Figura 32 compara los niveles de expresión del factor IX humano recombinante (FIX) en ratones C57/BL6 inmunocompetentes a los que se inyectaron diversos AAV que expresaban FIX.

La Figura 33 compara la capacidad de los aislados de AAVr seleccionados y los AAV de tipo salvaje para evitar la neutralización por la inmunoglobulina humana (IVIG).

La Figura 34 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células 293.

La Figura 35 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células Huh 7.5.

La Figura 36 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células PAEC.

La Figura 37 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en queratinocitos humanos primarios.

La Figura 38 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células DND-41.

La Figura 39 compara la eficiencia de la transducción de aislados de AAVr particulares con los AAV de tipo salvaje en células DND-41.

La Figura 40 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células 3T3.

La Figura 41 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células HeLa.

La Figura 42 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células MEF.

La Figura 43 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células H4TG.

La Figura 44 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células LMH.

La Figura 45 compara la eficiencia de la transducción de ciertos aislados de AAVr con los AAV de tipo salvaje en células FRhK-4.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside, en donde la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO: 4.

2. Una secuencia de proteína de la cápside definida por una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 99 % a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 31, cuya secuencia, como parte de una partícula de AAV que codifica eGFP bajo el control de un promotor de hEF1, dota a la partícula de AAV con una capacidad para transducir células Huh7.5 al menos 10 veces mejor que una partícula de AAV correspondiente que comprende la cápside de AAV-DJ descrita en US2010/0047174.

3. Una secuencia de proteína de la cápside definida por la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

4. Una partícula viral que comprende una secuencia de proteína de la cápside definida por la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

5. Un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

6. Un vector de AAV recombinante, que comprende una proteína de la cápside que tiene una secuencia de aminoácidos de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

7. Una composición para su uso en la transferencia de un gen de interés a un mamífero, que comprende un vector de AAV recombinante que codifica el gen de interés que está encapsidado en una proteína de la cápside codificada por la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

8. Una composición para su uso en la transferencia de un gen de interés a un mamífero, que comprende un vector de AAV recombinante que codifica el gen de interés que está encapsidado en una proteína de la cápside que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.